RU2790295C2 - Complex systems of transposome bound on surface - Google Patents
Complex systems of transposome bound on surface Download PDFInfo
- Publication number
- RU2790295C2 RU2790295C2 RU2021108087A RU2021108087A RU2790295C2 RU 2790295 C2 RU2790295 C2 RU 2790295C2 RU 2021108087 A RU2021108087 A RU 2021108087A RU 2021108087 A RU2021108087 A RU 2021108087A RU 2790295 C2 RU2790295 C2 RU 2790295C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequence
- transposon
- transposome complex
- solid support
- fragments
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ВКЛЮЧЕНИЕ ЛЮБЫХ ПРИОРИТЕТНЫХ ЗАЯВОК ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИINCLUDING ANY PRIORITY APPLICATIONS BY LINK
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/791,509, поданной 11 января 2019 г., и предварительной заявке на патент США 62/840,610, поданной 30 апреля 2019 г., которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. [0001] This application claims priority from U.S. Provisional Application No. 62/791,509, filed January 11, 2019, and U.S. Provisional Application 62/840,610, filed April 30, 2019, which are incorporated herein by reference in in all its fullness.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION
[0002] Настоящее изобретение относится к способам, композициям и наборам для создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без использования ПЦР-амплификации, включая способы и композиции для фрагментирования и нанесения меток на нуклеиновые кислоты (например, ДНК) с использованием комплексов транспосом, иммобилизованных на твердых подложках. [0002] The present invention relates to methods, compositions and kits for creating a library of labeled nucleic acid fragments without the use of PCR amplification, including methods and compositions for fragmenting and labeling nucleic acids (for example, DNA) using transposome complexes immobilized on solid substrates.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
[0003] В текущих протоколах секвенирования следующего поколения (NGS) образцов нуклеиновых кислот, как правило, применяют способ получения образца, который преобразует ДНК или РНК в библиотеку фрагментированных матриц, которые можно секвенировать. Для способов получения образцов часто требуется применение множества стадий и переноса материала, а также дорогостоящих приборов для осуществления фрагментации, что может сделать данные способы сложными, трудоемкими, дорогостоящими и неэффективными. Более того, амплификация с использованием праймеров вносит систематическую погрешность в содержимое библиотеки и, таким образом, в полученные данные секвенирования. Например, стадии ПЦР-амплификации могут создавать бреши, которые усугубляются в обогащенных GC областях вследствие неспособности полимераз эффективно копировать обогащенные GC области. Данные бреши создают систематическую погрешность в полученных данных секвенирования из библиотек. Способы получения библиотек со стадиями ПЦР-амплификации могут иметь значительно сниженную эффективность вставки и делеции (индел). Точное секвенирование некоторых областей с множеством расширенных повторов может быть сложным, а ДНК, имеющая обогащенные GC промоторы, может демонстрировать низкое покрытие в пределах генома. Более того, многие способы получения библиотек несовместимы с включением индексов образцов или требуют множества дополнительных стадий для введения таких индексов. [0003] Current protocols for next generation sequencing (NGS) of nucleic acid samples typically use a sample preparation method that converts DNA or RNA into a library of fragmented templates that can be sequenced. Sample preparation methods often require multiple steps and material transfer, as well as expensive fragmentation apparatus, which can make these methods complex, time consuming, costly, and inefficient. Moreover, primer amplification introduces bias into the contents of the library and thus into the resulting sequencing data. For example, the PCR amplification steps can create gaps that are exacerbated in GC-rich regions due to the inability of polymerases to efficiently replicate GC-rich regions. These gaps create bias in the resulting sequencing data from libraries. Methods for generating libraries with PCR amplification steps may have significantly reduced insertion and deletion efficiency (indel). Accurate sequencing of some regions with many extended repeats can be difficult, and DNA having GC-rich promoters can show low coverage within the genome. Moreover, many methods for obtaining libraries are incompatible with the inclusion of sample indexes or require many additional steps to introduce such indexes.
[0004] Для получения библиотек необходимы короткие, эффективные и точные процедуры. В настоящем документе описаны различные способы, композиции и наборы, которые решают данные проблемы и которые поддерживают одинарный и двойной подходы к индексированию. [0004] Short, efficient and precise procedures are needed to obtain libraries. This document describes various methods, compositions and kits that solve these problems and that support single and dual indexing approaches.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
[0005] Настоящее раскрытие изобретения относится к способам, композициям и наборам для создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без использования ПЦР-амплификации для включения меток фрагментов, таких как праймерные последовательности и/или индексные последовательности, включая способы и композиции для фрагментации и нанесения меток на нуклеиновые кислоты (например, ДНК) с использованием комплексов транспосом, иммобилизованных на твердых подложках. [0005] The present disclosure relates to methods, compositions, and kits for generating a library of labeled nucleic acid fragments without using PCR amplification to incorporate fragment labels, such as primer sequences and/or index sequences, including methods and compositions for fragmenting and labeling nucleic acids (eg DNA) using transposome complexes immobilized on solid supports.
[0006] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к комплексу транспосомы, который включает полинуклеотид присоединения. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к комплексу транспосомы, содержащему следующее: (a) транспозаза; (b) первый транспозон, включающий 3’-концевую последовательность транспозона и 5’-адаптерную последовательность; (c) второй транспозон, включающий 5’-концевую последовательность транспозона и 3’-адаптерную последовательность, причем 5’-концевая последовательность комплементарна по меньшей мере участку 3’-концевой последовательности транспозона; и (d) полинуклеотид присоединения, включающий следующее: (i) соединительная адаптерная последовательность, гибридизованная с одной из двух адаптерных последовательностей, и (ii) связывающий элемент. Как правило, концевые транспозонные последовательности ренатурируют вместе с образованием двухцепочечной концевой транспозонной последовательности, которая распознается транспозазой. В некоторых аспектах связывающий элемент иммобилизован на твердой подложке с образованием иммобилизованного комплекса транспосомы. [0006] Some embodiments provided herein relate to a transposome complex that includes an attachment polynucleotide. In some aspects, the present invention provides a transposome complex comprising the following: (a) a transposase; (b) a first transposon comprising a 3' transposon sequence and a 5' adapter sequence; (c) a second transposon comprising a 5' end sequence of the transposon and a 3' adapter sequence, the 5' end sequence being complementary to at least a portion of the 3' end sequence of the transposon; and (d) an attachment polynucleotide comprising the following: (i) an attachment adapter sequence hybridized to one of the two adapter sequences, and (ii) a binding element. Typically, terminal transposon sequences anneal together to form a double-stranded terminal transposon sequence that is recognized by the transposase. In some aspects, the binding element is immobilized on a solid support to form an immobilized transposome complex.
[0007] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к ренатурированному полинуклеотиду транспозона/присоединения, содержащему первый транспозон, второй транспозон и полинуклеотид присоединения. [0007] In some aspects, the present invention relates to a annealed transposon/attachment polynucleotide comprising a first transposon, a second transposon, and an attachment polynucleotide.
[0008] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам получения ренатурированного полинуклеотида транспозона/присоединения, содержащего комплекс транспосом, включающий отжиг первого транспозона, второго транспозона и полинуклеотида присоединения. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам получения комплекса транспосомы, включающим обработку ренатурированного гибрида полинуклеотида транспозона/присоединения с использованием транспозазы. В некоторых аспектах представлен способ получения иммобилизованного комплекса транспосомы посредством иммобилизации комплекса транспосомы на твердой подложке с использованием связывающего элемента. [0008] In some aspects, the present invention relates to methods for producing a annealed transposon/attachment polynucleotide containing a transposome complex, including annealing a first transposon, a second transposon, and an attachment polynucleotide. In some aspects, the present invention relates to methods for preparing a transposome complex, comprising treating a renatured transposon/attachment polynucleotide fusion with a transposase. In some aspects, a method is provided for obtaining an immobilized transposome complex by immobilizing the transposome complex on a solid support using a binding element.
[0009] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к комплексу транспосомы, содержащему следующее: (a) транспозаза; (b) первый транспозон, содержащий концевую последовательность 3’-транспозона и 5’-адаптерную последовательность; (c) второй транспозон, содержащий концевую последовательность 5’-транспозона, комплементарную по меньшей мере части 3’-концевой последовательности-транспозона, и 3’-адаптерную последовательность; и (d) связывающий элемент, присоединенный к 5’-адаптерной последовательности посредством расщепляемого линкера. В некоторых аспектах связывающий элемент иммобилизован на твердой подложке с образованием иммобилизованного комплекса транспосомы. В некоторых аспектах настоящее описание относится к ренатурированной олигонуклеотидной конструкции, содержащей первый транспозон, второй транспозон и связывающий элемент. [0009] In some aspects, the present invention provides a transposome complex comprising the following: (a) transposase; (b) a first transposon containing a 3' transposon terminal sequence and a 5' adapter sequence; (c) a second transposon comprising a 5' transposon terminal sequence complementary to at least a portion of the 3' transposon sequence and a 3' adapter sequence; and (d) a linking element attached to the 5' adapter sequence via a cleavable linker. In some aspects, the binding element is immobilized on a solid support to form an immobilized transposome complex. In some aspects, the present disclosure relates to a renatured oligonucleotide construct comprising a first transposon, a second transposon, and a binding element.
[0010] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот, включающим приведение целевой нуклеиновой кислоты в контакт с множеством иммобилизованных комплексов транспосом, как описано в настоящем документе, в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты во множество целевых фрагментов и для присоединения 3’-концов 3’-концевых последовательностей транспозона к 5’-концам целевых фрагментов для получения множества 5’-меченных целевых фрагментов. [0010] In some aspects, the present invention relates to methods for creating a library of labeled nucleic acid fragments, including contacting a target nucleic acid with a plurality of immobilized transposome complexes, as described herein, under conditions sufficient to fragment the target nucleic acid into a plurality of target fragments. and for joining the 3' ends of the 3' transposon sequences to the 5' ends of the target fragments to obtain a plurality of 5' labeled target fragments.
[0011] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к набору для создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без применения ПЦР-амплификации. В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя иммобилизованный комплекс транспосом, как описано в настоящем документе. [0011] Some embodiments provided herein relate to a kit for generating a library of labeled nucleic acid fragments without the use of PCR amplification. In some embodiments, the kit includes an immobilized transposome complex as described herein.
[0012] В некоторых аспектах изобретение относится к способам создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот, включающим приведение иммобилизованного комплекса транспосомы в контакт с целевой нуклеиновой кислотой в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты на множество целевых фрагментов, и присоединение 3’-конца первого транспозона к 5’-концам целевых фрагментов для получения множества 5’-меченных целевых фрагментов; обработку твердой подложки для удаления несвязанных нуклеиновых кислот; или обработку твердой подложки для удаления транспозазы из комплекса, необязательно посредством (a) нагревания твердой подложки и/или (b) мойки твердой подложки ферментативным денатурирующим средством, причем ферментативное денатурирующее средство необязательно содержит додецилсульфат натрия (SDS), гидрохлорид гуанидина, мочевину или протеиназу; обработку множества 5’-меченых целевых фрагментов полимеразой и лигазой для удлинения и лигирования 5’-меченых целевых фрагментов для получения полностью двухцепочечных меченых фрагментов, при этом необязательно обработку полимеразой и лигазой выполняют в присутствии средства разрушения вторичной структуры ДНК, причем средство разрушения необязательно представляет собой ДМСО; удаление полностью двухцепочечных фрагментов с твердой подложки, причем удаление необязательно включает применение нагревания и/или денатурирующего вещества, достаточного для отщепления полностью двухцепочечных меченых фрагментов от твердой подложки, при этом необязательно денатурирующее вещество представляет собой NaOH; и отбор полностью двухцепочечных меченых фрагментов с использованием гранул для захвата, при этом необязательно гранулы для захвата представляют собой магнитные микроносители, и при этом необязательно выполнять две отдельные стадии отбора. [0012] In some aspects, the invention relates to methods for creating a library of labeled nucleic acid fragments, including bringing an immobilized transposome complex into contact with a target nucleic acid under conditions sufficient to fragment the target nucleic acid into a plurality of target fragments, and attaching the 3'-end of the first transposon to the 5' ends of the target fragments to obtain a plurality of 5'-labeled target fragments; treating the solid support to remove unbound nucleic acids; or treating the solid support to remove the transposase from the complex, optionally by (a) heating the solid support and/or (b) washing the solid support with an enzymatic denaturing agent, the enzymatic denaturing agent optionally containing sodium dodecyl sulfate (SDS), guanidine hydrochloride, urea, or proteinase; treatment of a plurality of 5'-labeled target fragments with a polymerase and ligase to extend and ligate the 5'-labeled target fragments to obtain fully double-stranded labeled fragments, optionally the polymerase and ligase treatment is performed in the presence of a DNA secondary structure disruptor, the disruptor optionally being DMSO; removal of fully double-stranded fragments from the solid support, the removal optionally comprising the application of heat and/or a denaturant sufficient to cleave the fully double-stranded labeled fragments from the solid support, optionally the denaturant being NaOH; and selecting fully double-stranded labeled fragments using capture beads, optionally the capture beads being magnetic microcarriers, and optionally performing two separate selection steps.
[0013] В некоторых вариантах осуществления иммобилизованный комплекс транспосом содержит твердую подложку и комплекс транспосом, иммобилизованный на твердой подложке, причем комплекс транспосом содержит транспозазу; первый транспозон, содержащий 3’-концевую последовательность транспозона и якорную последовательность (якорь); второй транспозон, содержащий 5’-концевую последовательность транспозона и последовательность B15’; полинуклеотид присоединения, содержащий комплементарную якорную последовательность (якорь’), последовательность A14’, спейсер и последовательность P5’, а также связывающий элемент, содержащий биотин, причем биотин иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает секвенирование одного или более полностью двухцепочечных меченых фрагментов. [0013] In some embodiments, the immobilized transposome complex comprises a solid support and a transposome complex immobilized on a solid support, the transposome complex comprising a transposase; the first transposon containing the 3'-terminal sequence of the transposon and the anchor sequence (anchor); the second transposon containing the 5'-terminal sequence of the transposon and the B15'sequence; an attachment polynucleotide containing a complementary anchor sequence (anchor'), an A14' sequence, a spacer and a P5' sequence, as well as a binding element containing biotin, the biotin being immobilized on a solid support. In some embodiments, the method further comprises sequencing one or more fully double-stranded labeled fragments.
[0014] В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение в контакт первого иммобилизованного комплекса транспосомы и второго иммобилизованного комплекса транспосомы с целевой нуклеиновой кислотой в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты во множество целевых фрагментов, и присоединение 3’-конца каждого первого транспозона к 5’-концам целевых фрагментов для получения множества первых 5’-меченных целевых фрагментов, полученных из первого иммобилизованного комплекса транспосомы, и множества вторых 5’-меченных целевых фрагментов, полученных из второго иммобилизованного комплекса транспосомы. В некоторых вариантах осуществления первый иммобилизованный комплекс транспосом содержит твердую подложку и первый комплекс транспосом, иммобилизованный на твердой подложке, причем комплекс транспосом содержит транспозазу; первый транспозон, содержащий 3’-концевую последовательность транспозона и якорную последовательность; второй транспозон, содержащий 5’-концевую последовательность транспозона и первый полинуклеотид присоединения, содержащий (i) комплементарную якорную последовательность, последовательность A14’, спейсер и последовательность P5’; и (ii) связывающий элемент, содержащий биотин, причем биотин иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления второй иммобилизованный комплекс транспосом содержит твердую подложку и второй комплекс транспосом, иммобилизованный на твердой подложке, причем комплекс транспосом содержит транспозазу; первый транспозон, содержащий 3’-концевую последовательность транспозона и якорную последовательность; второй транспозон, содержащий 5’-концевую последовательность транспозона и второй полинуклеотид присоединения, содержащий (i) комплементарную якорную последовательность, последовательность B15’, спейсер и последовательность P7’; и (ii) связывающий элемент, содержащий биотин, причем биотин иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обработку множества 5’-меченных целевых фрагментов лигазой для лигирования каждого 5’-меченого целевого фрагмента либо с первым индексирующим олигонуклеотидом, либо со вторым индексирующим олигонуклеотидом путем приведения 5’-меченных целевых фрагментов в контакт с пулом первого и второго индексирующих олигонуклеотидов, причем каждый первый индексирующий олигонуклеотид содержит последовательность A14, последовательность i5 и последовательность P5 и может связываться с первым меченым 5’-концом; и при этом каждый второй индексирующий олигонуклеотид содержит последовательность B15, последовательность i7 и последовательность P7 и может связываться со вторым меченым 5’-концом для получения множества 5’-меченых целевых фрагментов, лигированных с индексирующими олигонуклеотидами; обработки твердой подложки для удаления транспозаз из комплекса, необязательно посредством (a) нагревания твердой подложки и/или (b) промывки твердой подложки ферментативным денатурирующим средством, причем средство, денатурирующее фермент, необязательно содержит додецилсульфат натрия (SDS), гидрохлорид гуанидина, мочевину или протеиназу; и обработки множества меченных на 5’-конце целевых фрагментов, лигированных с индексированием олигонуклеотидов полимеразой для удлинения с получением полностью двухцепочечных меченых фрагментов. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт первого иммобилизованного комплекса транспосомы со вторым иммобилизованным комплексом транспосомы и обработку множества 5’-меченых целевых фрагментов лигазой проводят в одну реакцию. В некоторых вариантах осуществления двухцепочечные меченые фрагменты получают в растворе. [0014] In some embodiments, the method includes contacting a first immobilized transposome complex and a second immobilized transposome complex with a target nucleic acid under conditions sufficient to fragment the target nucleic acid into a plurality of target fragments, and attaching the 3' end of each first transposon to 5 '-ends of target fragments to obtain a plurality of first 5'-labeled target fragments derived from the first immobilized transposome complex and a plurality of second 5'-labeled target fragments derived from the second immobilized transposome complex. In some embodiments, the first immobilized transposome complex comprises a solid support and the first transposome complex immobilized on a solid support, the transposome complex comprising a transposase; the first transposon containing the 3'-terminal sequence of the transposon and the anchor sequence; a second transposon containing a 5'-terminal transposon sequence and a first polynucleotide accession containing (i) a complementary anchor sequence, an A14' sequence, a spacer and a P5'sequence; and (ii) a binding element containing biotin, and the biotin is immobilized on a solid support. In some embodiments, the second immobilized transposome complex comprises a solid support and a second transposome complex immobilized on a solid support, the transposome complex comprising a transposase; the first transposon containing the 3'-terminal sequence of the transposon and the anchor sequence; a second transposon containing a 5'-terminal transposon sequence and a second polynucleotide accession containing (i) a complementary anchor sequence, a B15' sequence, a spacer and a P7'sequence; and (ii) a binding element containing biotin, and the biotin is immobilized on a solid support. In some embodiments, the method includes treating a plurality of 5'-labeled target fragments with a ligase to ligate each 5'-labeled target fragment to either a first indexing oligonucleotide or a second indexing oligonucleotide by bringing the 5'-labeled target fragments into contact with a pool of first and second indexing oligonucleotides, wherein each first indexing oligonucleotide contains an A14 sequence, an i5 sequence, and a P5 sequence and can be linked to a first labeled 5'end; and wherein each second indexing oligonucleotide contains a B15 sequence, an i7 sequence, and a P7 sequence and can be linked to a second 5'-tagged end to obtain a plurality of 5'-labeled target fragments ligated to the indexing oligonucleotides; treating the solid support to remove the transposases from the complex, optionally by (a) heating the solid support and/or (b) washing the solid support with an enzymatic denaturing agent, the enzyme denaturing agent optionally containing sodium dodecyl sulfate (SDS), guanidine hydrochloride, urea, or proteinase ; and treating a plurality of 5'-labeled target fragments ligated to index the oligonucleotides with polymerase to extend to obtain fully double-stranded labeled fragments. In some embodiments, contacting a first immobilized transposome complex with a second immobilized transposome complex and treating a plurality of 5'-labeled target fragments with a ligase is performed in a single reaction. In some embodiments, double-stranded labeled fragments are obtained in solution.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
[0015] На Фиг. 1 представлена блок-схема, на которой изображен вариант осуществления способа создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без использования ПЦР-амплификации. На первой стадии получают комплекс транспосом, как описано в настоящем документе, иммобилизованный на твердой подложке. Целевую нуклеиновую кислоту наносят на твердую подложку, где протекает реакция тагментации с образованием меченых и фрагментированных нуклеиновых кислот. Применяют смесь индексов, имеющую индексные последовательности, и происходит удлинение и лигирование. Наконец, происходит индексирование меченых фрагментов нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления индексирование происходит одновременно с удлинением и лигированием, а в других вариантах осуществления индексирование происходит после удлинения и лигирования. В других вариантах осуществления схемы расположения стадий различаются, как показано в примере 9. [0015] In FIG. 1 is a flowchart depicting an embodiment of a method for generating a library of labeled nucleic acid fragments without using PCR amplification. In the first step, a transposome complex is obtained, as described herein, immobilized on a solid support. The target nucleic acid is applied to a solid support, where the tagmentation reaction proceeds with the formation of labeled and fragmented nucleic acids. An index mixture having index sequences is used and extension and ligation occurs. Finally, the labeled nucleic acid fragments are indexed. In some embodiments, indexing occurs simultaneously with extension and ligation, and in other embodiments, indexing occurs after extension and ligation. In other embodiments, the stage layouts are different, as shown in Example 9.
[0016] На Фиг. 2A-2B представлена принципиальная схема и способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без применения ПЦР-амплификации. На Фиг. 2A представлен пример конфигурации комплекса транспосомы с биотином (B), присоединенным к одному транспозону посредством расщепляемого линкера. В данном примере осуществления комплекса транспосомы, содержащего транспозазу, первый транспозон, содержащий 3’-концевую последовательность транспозона и 5’-адаптерную последовательность; второй транспозон, содержащий 5’-концевую последовательность транспозона, комплементарную по меньшей мере части 3’-концевой последовательности транспозона и 3’-адаптерной последовательности; и связывающий элемент, присоединенный к 5’-адаптерной последовательности посредством расщепляемого линкера (Фиг. 2A). На Фиг. 2B схематично представлены примеры стадий способа получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без применения ПЦР-амплификации с использованием примера комплекса транспосомы, изображенного на Фиг. 2A, иммобилизованного на твердой подложке (твердая подложка не показана), включая стадии нанесения метки и промывки, удлинения и лигирования, а также удаления гранул. На Фиг. 2B показаны стадии тагментации, на которых вставки из целевой нуклеиновой кислоты присоединяются к меткам, удлинению и лигированию, а также отщеплению от твердой подложки. [0016] In FIG. 2A-2B show a schematic diagram and method for obtaining a library of labeled nucleic acid fragments without the use of PCR amplification. On FIG. 2A shows an example configuration of a transposome complex with biotin (B) attached to one transposon via a cleavable linker. In this embodiment, a transposome complex containing a transposase, a first transposon containing a 3' transposon sequence and a 5' adapter sequence; a second transposon comprising a 5' transposon sequence complementary to at least a portion of the 3' transposon sequence and the 3' adapter sequence; and a linking element attached to the 5' adapter sequence via a cleavable linker (FIG. 2A). On FIG. 2B schematically illustrates exemplary steps of a method for obtaining a library of labeled nucleic acid fragments without the use of PCR amplification using the exemplary transposome complex depicted in FIG. 2A immobilized on a solid support (solid support not shown) including labeling and washing, extension and ligation, and bead removal steps. On FIG. 2B shows the tagmentation steps in which target nucleic acid inserts are attached to tags, extension and ligation, and cleavage from a solid support.
[0017] На Фиг. 3A-3C представлены примеры стадий способа создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без использования ПЦР-амплификации. На Фиг. 3A показан комплекс транспосом, иммобилизованный на твердой подложке посредством полинуклеотида присоединения, несущего биотин (B, твердая подложка не показана). Для упрощения изображение димера показано на Фиг. 3A, но не на Фиг. 3B-3C. На Фиг. 3B показана меченая и фрагментированная нуклеиновая кислота, которая все еще образует комплекс с транспозазой (верхняя панель) и структурой после удаления транспозазы (нижняя панель). На Фиг. 3B представлен комплекс транспосом, имеющий фрагмент нуклеиновой кислоты (вставку), связанный с первым транспозоном, причем 5’-конец вставки присоединен к 3’-концевой последовательности транспозона. Транспозазу удаляют с использованием способов, описанных в настоящем документе, например, с использованием средства для удаления транспозазы, такого как додецилсульфат натрия (SDS). На Фиг. 3C изображена структура после заполнения бреши и удлинения (удлинения и лигирования) (верхняя панель) и после дегибридизации для удаления полученных фрагментов с твердой подложки (нижняя панель). Как показано на Фиг. 3C, индексы добавляют к твердой подложке и гибридизуют с полинуклеотидом присоединения второго транспозона. В частности, как показано в варианте осуществления на Фиг. 3C, индекс i5, имеющий праймерную последовательность (последовательность P5), индексную последовательность (последовательность i5) и якорную последовательность, гибридизуется с полинуклеотидом присоединения в комплементарных последовательностях, так что Р5 гибридизуется с P5’ и якорный участок гибридизуется с якорным участком’. Аналогичным образом в варианте осуществления на Фиг. 3C индекс i7, имеющий праймерную последовательность (P7), индексную последовательность (i7) и адаптерную последовательность (последовательность B15), гибридизуется со вторым транспозоном в комплементарных последовательностях, так что P7 гибридизуется с P7’, i7 гибридизуется с i7’, а B15 гибридизуется с B15’. После приведения твердой подложки в контакт с индексами фрагменты удлиняют и лигируют с использованием смеси для удлинения и лигирования (ELM). Затем твердую подложку обрабатывают средством для денатурации последовательностей цепей, например NaOH, с получением таким образом меченых фрагментов нуклеиновых кислот. Показан вариант осуществления комплекса транспосом, содержащего транспозазу Tn5 с первым и вторым транспозонами. Первый транспозон включает в себя 3’-концевую последовательность транспозона (последовательность МЕ), гибридизованную с 5’-концевой последовательностью транспозона (последовательностью МЕ) второго транспозона. Второй транспозон также включает в себя 3’-адаптерную последовательность (последовательность B15’). Первый транспозон включает в себя 5’-адаптерную последовательность (последовательность A14), которая показана гибридизованной с соединительной адаптерной последовательностью (последовательность A14’) полинуклеотида присоединения. Полинуклеотид присоединения также включает в себя якорную последовательность (якорь’), спейсерную область, праймерную последовательность (последовательность P5’) и линкер, присоединенный к связывающему элементу (B). Комплекс транспосом представляет собой димер с двумя димеризованными мономерами. [0017] In FIG. 3A-3C are exemplary steps of a method for generating a library of labeled nucleic acid fragments without the use of PCR amplification. On FIG. 3A shows a transposome complex immobilized on a solid support by a biotin-bearing attachment polynucleotide (B, solid support not shown). For simplicity, the image of the dimer is shown in Fig. 3A but not in FIG. 3B-3C. On FIG. 3B shows a labeled and fragmented nucleic acid that is still complexed with the transposase (upper panel) and structure after removal of the transposase (lower panel). On FIG. 3B shows a transposome complex having a nucleic acid fragment (insert) linked to a first transposon, with the 5' end of the insert attached to the 3' end of the transposon sequence. The transposase is removed using the methods described herein, for example, using a transposase remover such as sodium dodecyl sulfate (SDS). On FIG. 3C shows the structure after gap filling and extension (lengthening and ligation) (upper panel) and after dehybridization to remove the resulting fragments from the solid support (lower panel). As shown in FIG. 3C, indices are added to a solid support and hybridized to a second transposon attachment polynucleotide. Specifically, as shown in the embodiment of FIG. 3C, an index i5 having a primer sequence (P5 sequence), an index sequence (i5 sequence), and an anchor sequence hybridizes to an attachment polynucleotide in complementary sequences such that P5 hybridizes to P5' and the anchor region hybridizes to the anchor region. Similarly, in the embodiment of FIG. 3C index i7, having a primer sequence (P7), an index sequence (i7), and an adapter sequence (sequence B15), hybridizes to the second transposon in complementary sequences such that P7 hybridizes to P7', i7 hybridizes to i7', and B15 hybridizes to B15'. After bringing the solid support into contact with the indices, the fragments are extended and ligated using an extension and ligation mixture (ELM). The solid support is then treated with a chain denaturant, such as NaOH, to thereby produce labeled nucleic acid fragments. An embodiment of a transposome complex containing a Tn5 transposase with first and second transposons is shown. The first transposon includes a 3' transposon sequence (ME sequence) hybridized to a 5' transposon sequence (ME sequence) of a second transposon. The second transposon also includes a 3' adapter sequence (sequence B15'). The first transposon includes a 5' adapter sequence (sequence A14) which is shown hybridized to the junction adapter sequence (sequence A14') of the attachment polynucleotide. The attachment polynucleotide also includes an anchor sequence (anchor'), a spacer region, a primer sequence (P5' sequence), and a linker attached to the linking element (B). The transposome complex is a dimer with two dimerized monomers.
[0018] На Фиг. 4A-4E представлена принципиальная схема для сравнения различных конфигураций комплекса транспосомы, иммобилизованного на твердой подложке посредством иллюстративного биотина (B, твердая подложка не показана), включая индексированные гранулы и универсальные гранулы, каждая из которых показана как в режиме единичного индексирования, так и в режиме двойного индексирования, для вариантов осуществления способов создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без применения ПЦР-амплификации с использованием вариаций комплексов транспосом, причем компоненты транспозонов и/или полинуклеотидов присоединения изменены, упорядочены или изменены по сравнению друг с другом. На Фиг. 4A представлены различные конфигурации комплекса транспосомы, присоединенного к твердой подложке. На Фиг. 4 A представлены варианты осуществления комплексов транспосом, демонстрирующие транспозазу с первым и вторым транспозоном и присоединенную к твердой подложке посредством полинуклеотида присоединения. На Фиг. 4B показаны различные конфигурации после тагментации. На Фиг. 4B представлена реакция тагментации для индексированных или универсальных гранул с единичным или двойным индексированием, в которой твердую подложку приводят в контакт с фрагментами нуклеиновой кислоты (вставка), которые связываются с 3’-концом первого транспозона. На Фиг. 4C изображены различные конфигурации после удлинения и лигирования. На Фиг. 4C представлено удлинение и лигирование индексированных или универсальных гранул с единичным или двойным индексированием, при котором твердую подложку приводят в контакт со смесью индексов, которая гибридизуется со транспозоном или полинуклеотидом присоединения, и при этом фрагменты нуклеиновых кислот удлинены. На Фиг. 4D показаны различные конфигурации после индексирования (индексированные гранулы для единичного индексирования не показаны, так как индексирование было завершено для данной конфигурации на Фиг. 4C). На Фиг. 4D представлено индексирование гранул с двойным индексированием или универсальных гранул с единичным или двойным индексированием. Как показано на Фиг. 4D, индексирование гранулы с единичным индексированием было завершено на стадии обширного лигирования, показанной на Фиг. 4C. Твердую подложку приводят в контакт со смесью для индексирования, а на фрагменты нуклеиновых кислот наносят метки для индексирования. На Фиг. 4E представлены иллюстративные результаты различных конфигураций, на которых показаны нормализованные частоты считывания в зависимости от размера вставки. На Фиг. 4E представлена нормализованная частота считывания меченых фрагментов нуклеиновых кислот из индексированных или универсальных гранул с единичным или двойным индексированием. На Фиг. 4A-4E, в частности, показаны варианты осуществления комплексов транспосом, расположенных в виде индексированных гранул для единичного индексирования (слева сверху), универсальных гранул для единичного индексирования (справа сверху), индексированных гранул для двойного индексирования (слева снизу) и универсальных гранул для двойного индексирования. Для вариантов осуществления индексированных гранул, показанных на Фиг. 4A-4E, как для одинарного, так и для двойного индексирования (слева), полинуклеотид присоединения гибридизуется со вторым транспозоном в 3’-адаптерной последовательности (последовательность B15’). Для вариантов осуществления универсальных гранул, показанных на Фиг. 4A-4E, как для одинарного, так и для двойного индексирования (справа), полинуклеотид присоединения гибридизуется с первым транспозоном в 5’-адаптерной последовательности (последовательность A14’). В некоторых вариантах осуществления нормализованные библиотеки могут быть получены из исходных образцов, так что нуклеиновую кислоту экстрагируют из исходного образца и непосредственно вводят в систему или способ, описанные в настоящем документе, причем самонормализованный образец обеспечивает прочную CV в диапазоне типов образцов. [0018] In FIG. 4A-4E is a schematic diagram for comparing different configurations of a transposome complex immobilized on a solid support with exemplary biotin (B, solid support not shown), including indexed beads and universal beads, each shown in both single indexing mode and double indexing, for embodiments of methods for creating a library of labeled nucleic acid fragments without the use of PCR amplification using variations of transposome complexes, wherein the components of the transposons and/or attachment polynucleotides are changed, ordered or changed compared to each other. On FIG. 4A shows various configurations of the transposome complex attached to a solid support. On FIG. 4A depicts embodiments of transposome complexes showing a transposase with a first and second transposon and attached to a solid support via an attachment polynucleotide. On FIG. 4B shows various configurations after tagging. On FIG. 4B shows a tagging reaction for single or double indexed indexed or universal beads in which a solid support is brought into contact with nucleic acid fragments (insert) that bind to the 3' end of the first transposon. On FIG. 4C shows various configurations after extension and ligation. On FIG. 4C shows the extension and ligation of indexed or universal beads with single or double indexing, in which a solid support is brought into contact with a mixture of indices that hybridizes to a transposon or attachment polynucleotide, and the nucleic acid fragments are extended. On FIG. 4D shows various post-indexing configurations (indexed beads for single indexing are not shown since indexing has been completed for this configuration in FIG. 4C). On FIG. 4D shows the indexing of dual-indexed pellets or universal single- or dual-indexed pellets. As shown in FIG. 4D, single indexing bead indexing was completed in the extensive ligation step shown in FIG. 4C. The solid support is brought into contact with the indexing mixture and the nucleic acid fragments are labeled for indexing. On FIG. 4E shows illustrative results of various configurations showing normalized read rates versus insert size. On FIG. 4E shows the normalized read rates of labeled nucleic acid fragments from indexed or universal beads with single or double indexing. On FIG. 4A-4E specifically show embodiments of transposome complexes arranged as indexed single index beads (top left), universal single index beads (top right), indexed dual index beads (bottom left), and universal dual index beads. indexing. For the indexed bead embodiments shown in FIG. 4A-4E, for both single and double indexing (left), the attachment polynucleotide hybridizes to a second transposon in the 3' adapter sequence (sequence B15'). For the embodiments of the universal granules shown in FIG. 4A-4E, for both single and double indexing (right), the attachment polynucleotide hybridizes to the first transposon in the 5' adapter sequence (sequence A14'). In some embodiments, normalized libraries can be obtained from stock samples such that the nucleic acid is extracted from the stock sample and directly injected into the system or method described herein, the self-normalized sample providing a strong CV across a range of sample types.
[0019] На Фиг. 5A и 5B показана принципиальная схема иллюстративных комплексов транспосом для воздействия, отличного от индексирования, показывающая полинуклеотид присоединения, гибридизованный либо с транспозоном, содержащим последовательность Р7 (Фиг. 5A), либо с транспозоном, содержащим последовательность Р5 (Фиг. 5B). В частности, на Фиг. 5A и 5B показана праймерная последовательность (последовательность P5), присоединенная к 5’-адаптерной последовательности (последовательности A14) первого транспозона, и праймерная последовательность (последовательность P7’), присоединенная к 3’-адаптерной последовательности (последовательности B15’) второго транспозона, с получением таким образом неиндексирующих комплексов транспосом. Полинуклеотид присоединения можно гибридизовать либо на втором транспозоне с использованием 5’-связывающего элемента (B) (Фиг. 5A), либо на первом транспозоне с использованием 3’-связывающего элемента (B) (Фиг. 5B). [0019] In FIG. 5A and 5B show a schematic diagram of exemplary transposome complexes for action other than indexing, showing an addition polynucleotide hybridized to either a transposon containing the P7 sequence (FIG. 5A) or a transposon containing the P5 sequence (FIG. 5B). In particular, in FIG. 5A and 5B show a primer sequence (P5 sequence) fused to the 5' adapter sequence (A14 sequence) of the first transposon and a primer sequence (P7' sequence) fused to the 3' adapter sequence (B15' sequence) of the second transposon, with thereby obtaining non-indexing transposome complexes. The addition polynucleotide can be hybridized either at the second transposon using the 5' binding element (B) (FIG. 5A) or at the first transposon using the 3' binding element (B) (FIG. 5B).
[0020] На Фиг. 6A-6D показаны принципиальные схемы примеров комплексов транспосом, включающих в себя последовательность индексирования i5. На Фиг. 6A показан комплекс, в котором полинуклеотид присоединения, содержащий нитропоследовательность и якорную последовательность, может гибридизоваться с индексирующим олигонуклеотидом, который затем может быть лигирован с 5’-концом первого транспозона. На Фиг. 6A комплекс транспосом содержит первый транспозон, содержащий 3’-концевую последовательность транспозона (ME) и 5’-адаптерную последовательность (A14), второй транспозон, содержащий 5’-концевую последовательность транспозона (ME’) и 3’-адаптерую последовательность (B15’), и полинуклеотид присоединения, содержащий соединительную адаптерную последовательность (A14’), гибридизованную с A14 в первом транспозоне, и связывающий элемент (биотин). В данном случае полинуклеотид присоединения дополнительно содержит нитроиндольную последовательность (универсальную последовательность, которая связывается с любой индексной областью i5) и праймерную последовательность (P5’). Область B15’ второго транспозона может быть гибридизована с полинуклеотидом, содержащим комплемент (B15), индексную область и праймерную последовательность P7, которая сама по себе ренатурирована с индексной молекулой P7’-i7’. Лигирование 5’-конца индексной области i7’ к 3’-концу 3’-адаптерной последовательности служит для создания полностью двухцепочечной области. [0020] In FIG. 6A-6D show schematic diagrams of exemplary transposome complexes including the i5 indexing sequence. On FIG. 6A shows a complex in which an attachment polynucleotide containing a nitro sequence and an anchor sequence can hybridize to an index oligonucleotide, which can then be ligated to the 5' end of the first transposon. On FIG. 6A, the transposome complex contains a first transposon containing a 3' transposon sequence (ME) and a 5' adapter sequence (A14), a second transposon containing a 5' transposon sequence (ME') and a 3' adapter sequence (B15' ), and an attachment polynucleotide containing a junction adapter sequence (A14') hybridized to A14 in the first transposon and a binding element (biotin). In this case, the addition polynucleotide further comprises a nitroindole sequence (a universal sequence that binds to any i5 index region) and a primer sequence (P5'). The B15' region of the second transposon can be hybridized to a polynucleotide containing a complement (B15), an index region and a P7 primer sequence, which itself is annealed to the P7'-i7' index molecule. Ligation of the 5' end of the i7' index region to the 3' end of the 3' adapter sequence serves to create a fully double stranded region.
[0021] На Фиг. 6B показан полинуклеотид присоединения, содержащий якорную последовательность и спейсерную область, который может гибридизоваться с индексирующим олигонуклеотидом, который затем может быть лигирован с 5’-концом первого транспозона. На Фиг. 6B первый транспозон содержит 3’-концевую последовательность транспозона (ME) и 5’-адаптерную последовательность (A14), а второй транспозон содержит 5’-концевую последовательность транспозона (МЕ’) и 3’-адаптерную последовательность (B15’), как показано на Фиг. 6A. Однако в этом случае полинуклеотид присоединения содержит комплементарный адаптер (A14’), фиксированную последовательность, спейсерную область 2 x sp 18, комплемент праймера (P5’) и связывающийся с биотином элемент. Индекс i5 содержит якорную последовательность (комплементарную якорю’), индексную область i5 и праймерную последовательность (P5). Индекс i5 гибридизуется с комплементарными якорными и праймерными последовательностями на полинуклеотиде присоединения по всему спейсеру. [0021] In FIG. 6B shows an attachment polynucleotide containing an anchor sequence and a spacer region that can hybridize to an index oligonucleotide that can then be ligated to the 5' end of the first transposon. On FIG. 6B, the first transposon contains a 3' transposon sequence (ME) and a 5' adapter sequence (A14), and the second transposon contains a 5' transposon sequence (ME') and a 3' adapter sequence (B15'), as shown. in FIG. 6A. However, in this case, the attachment polynucleotide contains a complementary adapter (A14'), a fixed sequence, a 2 x sp 18 spacer region, a primer complement (P5'), and a biotin-binding element. The i5 index contains an anchor sequence (complementary to anchor'), an i5 index region, and a primer sequence (P5). The i5 index hybridizes to complementary anchor and primer sequences on the attachment polynucleotide throughout the spacer.
[0022] На Фиг. 6С показан полинуклеотид присоединения, содержащий спейсер и последовательность A14’, который может гибридизоваться с индексирующим олигонуклеотидом, который затем может быть лигирован к последовательности Х у 5’-конца первого транспозона. На Фиг. 6C первый транспозон содержит 3’-концевую последовательность транспозона (ME) и 5’-адаптерную последовательность X, а второй транспозон содержит 5’-концевую последовательность транспозона (МЕ’) и 3’-адаптерную последовательность (B15’). Полинуклеотид присоединения содержит комплемент 5’-адаптерной последовательности (X’), вторую адаптерную последовательность (A14’), спейсерную область (2 x sp18), комплемент праймера (P5’) и связывающий элемент биотин. 5’-адаптерная последовательность (X’) гибридизуется с первой 5’-адаптерной последовательностью транспозона (X). Индекс i5 содержит комплемент второй адаптерной последовательности (A14), спейсерную область 2 x sp18 и праймерную последовательность (P5). Индекс i5 гибридизуется со второй адаптерной последовательностью и комплементом праймера на полинуклеотиде присоединения в спейсерной области, а 3’-конец комплемента второй адаптерной последовательности лигируется с последовательностью X. Кроме того, индекс i7, содержащий 5’-праймерную последовательность (P7), индексную область i7 и комплемент 3’-адаптерной последовательности (B15), отжигают, а 3’-конец 3’-адаптерной последовательности удлиняют с получением двухцепочечной области. [0022] In FIG. 6C shows an attachment polynucleotide containing a spacer and an A14' sequence that can hybridize to an index oligonucleotide that can then be ligated to an X sequence at the 5' end of the first transposon. On FIG. 6C, the first transposon contains the 3' transposon sequence (ME) and the 5' adapter sequence X, and the second transposon contains the 5' transposon sequence (ME') and the 3' adapter sequence (B15'). The attachment polynucleotide contains a 5' adapter sequence complement (X'), a second adapter sequence (A14'), a spacer region (2 x sp18), a primer complement (P5'), and a biotin binding element. The 5' adapter sequence (X') hybridizes to the first 5' adapter sequence of the transposon (X). The i5 index contains the complement of the second adapter sequence (A14), the 2 x sp18 spacer region and the primer sequence (P5). The i5 index hybridizes to the second adapter sequence and the primer complement on the attachment polynucleotide in the spacer region, and the 3' end of the complement of the second adapter sequence ligates to the X sequence. In addition, the i7 index containing the 5' primer sequence (P7), the i7 index and the complement of the 3' adapter sequence (B15) are annealed and the 3' end of the 3' adapter sequence is extended to form a double stranded region.
[0023] На Фиг. 6D показан полинуклеотид присоединения, содержащий спейсер и последовательность A14’, который может гибридизоваться с индексирующим олигонуклеотидом, который затем может быть лигирован к последовательности Х у 5’-конца первого транспозона. В данном случае индексирующий олигонуклеотид содержит двухцепочечную праймерную область. На Фиг. 6D первый транспозон, второй транспозон и полинуклеотид присоединения аналогичны представленным на Фиг. 6C. Индекс i7 содержит двухцепочечный праймер (P7/P7’), индексную область i7 и комплемент 3’-адаптерной последовательности (B15). Двухцепочечная область в индексе i7 может быть создана (отожжена) в ходе реакции удлинения и лигирования, например, отсутствует необходимость в отжиге индекса i7 перед самой реакцией. Олигонуклеотид P7 ’может быть включен в реакционную смесь. Индекс i7 отжигают посредством области B15, а удлинение и лигирование от второго транспозона обеспечивают двухцепочечную область. Пример данного способа представлен в примере 5. [0023] In FIG. 6D shows an attachment polynucleotide containing a spacer and an A14' sequence that can hybridize to an index oligonucleotide that can then be ligated to an X sequence at the 5' end of the first transposon. In this case, the indexing oligonucleotide contains a double-stranded primer region. On FIG. 6D, the first transposon, second transposon, and attachment polynucleotide are the same as those shown in FIG. 6C. The i7 index contains a double-stranded primer (P7/P7'), an i7 index region, and a 3' adapter sequence complement (B15). The double-stranded region at the i7 index can be created (annealed) during the extension and ligation reaction, for example, there is no need to anneal the i7 index before the reaction itself. The P7' oligonucleotide can be included in the reaction mixture. The i7 index is annealed through the B15 region and extension and ligation from the second transposon provides a double stranded region. An example of this method is presented in example 5.
[0024] На Фиг. 7A-7B показаны иллюстративные результаты осуществления способа создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот с использованием ПЦР-амплификации и без нее, включая результаты для улучшенной точности и повторного распознавания инделов (Фиг. 7A) и улучшения покрытия промоторов, обогащенных GC (Фиг. 7B). Для получения этих данных использовали четыре способа: два с помощью ПЦР (TruSeq™ Nano и Nextera™ DNA Flex) и два без ПЦР (настоящий способ и TruSeq™ PCR-Free). Каждый способ предполагал две повторности, причем всего создавали восемь библиотек. После секвенирования данные прореживали 25 раз. На Фиг. 7A показан высокий процент точности индела и повторного распознавания для способа без ПЦР, описанного в настоящем документе. Образцы слева направо включают следующее (в двух повторностях): TruSeq™ Nano (черный); Nextera™ DNA Flex (белый); способ без ПЦР, описанный в настоящем документе (в линию); и TruSeq™ PCR-Free (в клетку). На Фиг. 7B показано улучшение покрытия промоторов, обогащенных GC, для способа без ПЦР, описанного в настоящем документе, по сравнению с другими способами, в том числе: Nextera™ DNA Flex (слева сверху); TruSeq™ Nano (справа сверху); способ без ПЦР, описанный в настоящем документе (слева снизу); и TruSeq™ PCR-Free (справа снизу). [0024] In FIG. 7A-7B show illustrative results of a method for generating a labeled nucleic acid fragment library with and without PCR amplification, including results for improved accuracy and re-indel recognition (FIG. 7A) and improved coverage of GC-rich promoters (FIG. 7B). Four methods were used to obtain these data: two with PCR (TruSeq™ Nano and Nextera™ DNA Flex) and two without PCR (the present method and TruSeq™ PCR-Free). Each method involved two replications, and a total of eight libraries were created. After sequencing, data were thinned 25 times. On FIG. 7A shows the high percentage of indel accuracy and re-recognition for the non-PCR method described herein. Samples from left to right include the following (in duplicate): TruSeq™ Nano (black); Nextera™ DNA Flex (White); the non-PCR method described herein (inline); and TruSeq™ PCR-Free (cage). On FIG. 7B shows the improvement in GC-rich promoter coverage for the non-PCR method described herein compared to other methods, including: Nextera™ DNA Flex (upper left); TruSeq™ Nano (top right); the non-PCR method described herein (lower left); and TruSeq™ PCR-Free (lower right).
[0025] На Фиг. 8 представлены результаты библиотек секвенирования из образца, содержащего известное 100%-ное повторное размножение GC (FMR1), полученного с использованием ДНК из наборов Nextera™ DNA Flex или TruSeq™ DNA PCR-Free Library Prep, для сравнения со способами, описанными в настоящем документе (в четырех экземплярах образцов 1-4), как описано в примере 3. [0025] In FIG. 8 shows the results of sequencing libraries from a sample containing known 100% GC replication (FMR1) generated using DNA from the Nextera™ DNA Flex or TruSeq™ DNA PCR-Free Library Prep kits for comparison with the methods described herein. (in four copies of samples 1-4), as described in example 3.
[0026] На Фиг. 9A-9C представлены результаты % CV для библиотек, полученных с использованием восьми пар индексов вместе с системами, показанными на Фиг. 6C (данные на Фиг. 9A) и 6D (данные для двух условий реакции на Фиг. 9B и 9C), как описано в примере 5. [0026] In FIG. 9A-9C show % CV results for libraries generated using eight pairs of indexes along with the systems shown in FIG. 6C (data in Fig. 9A) and 6D (data for the two reaction conditions in Figs. 9B and 9C) as described in Example 5.
[0027] На Фиг. 10 показано графическое представление покрытия секвенированием с пропуском в области гена RNPEPL1 для способов получения библиотек ПЦР (Nextera Flex или Nextera на основе пробирок), но с меньшим количеством пропусков при использовании способов без ПЦР, описанных в настоящем документе (две нижние панели). [0027] In FIG. 10 shows a graphical representation of RNPEPL1 gapped sequencing coverage for PCR library preparation methods (Nextera Flex or Tube-based Nextera), but with fewer gaps using non-PCR methods described here (bottom two panels).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0028] Библиотеки фрагментированных нуклеиновых кислот часто создают из геномных нуклеиновых кислот для применения в областях, связанных с секвенированием следующего поколения (NGS). В настоящем раскрытии изобретения представлены способы, композиции и наборы для создания библиотеки фрагментированных нуклеиновых кислот, которая присоединяет последовательности, необходимые для выполнения операций секвенирования, включая индексы, без использования ПЦР для добавления последовательностей посредством амплификации (также называемой в настоящем документе образованием библиотеки без ПЦР или получением библиотеки без ПЦР). Данный способ получения библиотеки транспосом без ПЦР может уменьшить и/или устранить систематическую ошибку, вызванную ПЦР, в современных подходах тагментации для получения библиотеки. [0028] Libraries of fragmented nucleic acids are often created from genomic nucleic acids for use in fields related to next generation sequencing (NGS). The present disclosure provides methods, compositions, and kits for generating a fragmented nucleic acid library that adds sequences necessary to perform sequencing operations, including indexes, without using PCR to add sequences via amplification (also referred to herein as non-PCR library generation or libraries without PCR). This method of obtaining a transposome library without PCR can reduce and/or eliminate PCR-induced bias in current tagging approaches for library preparation.
[0029] «Тагментация» относится к применению транспозазы для фрагментации и нанесения метки на нуклеиновые кислоты. Тагментация включает модификацию ДНК комплексом транспосомы, содержащим фермент транспозазу в комплексе с адаптерами, содержащими концевые последовательности транспозона (называемые в настоящем документе транспозонами). Тагментация обеспечивает одновременную фрагментацию ДНК и лигирование адаптеров к 5’-концам обеих цепей дуплексных фрагментов. Как правило, после стадии очистки для удаления фермента транспозазы дополнительные последовательности добавляют к концам адаптированных фрагментов посредством ПЦР. [0029] "Tagmentation" refers to the use of a transposase to fragment and label nucleic acids. Tagging involves the modification of DNA with a transposome complex containing the enzyme transposase in complex with adapters containing transposon terminal sequences (referred to herein as transposons). Tagging provides simultaneous fragmentation of DNA and ligation of adapters to the 5' ends of both strands of duplex fragments. Typically, after a purification step to remove the transposase enzyme, additional sequences are added to the ends of the adapted fragments by PCR.
[0030] Описанные в настоящем документе способы, композиции, системы и наборы относятся к комплексно-гибридизованным олигонуклеотидам и комплексам, содержащим такие гибриды, включая комплексы, иммобилизованные на поверхности, и к применению комплексов транспосом для образования библиотеки без ПЦР. Как описано в настоящем документе, комплекс транспосом включает в себя транспозазу и связанные с ней транспозоны, которые фрагментируют и наносят метку на целевую молекулу ДНК. В некоторых аспектах комплексно-гибридизованный олигонуклеотид является расщепляемым и включает в себя связывающий элемент, а в других аспектах комплексно-гибридизованный олигонуклеотид содержит полинуклеотид присоединения со связывающим элементом. В некоторых аспектах полинуклеотид присоединения представляет собой нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с транспозоном в комплексе транспосомы и иммобилизована на твердой подложке, такой как слайд, проточная кювета или гранула. Вследствие гибридизации полинуклеотида с транспозоном, комплекс транспосом можно иммобилизовать на твердой подложке опосредованно через полинуклеотид присоединения. Связывание полинуклеотида с твердой подложкой происходит через связывающий элемент на полинуклеотиде присоединения. Целевые нуклеиновые кислоты захватываются комплексами транспосомы, а затем нуклеиновые кислоты фрагментируют и на них наносят метку («тагментация»). Олигонуклеотидная система выполнена с возможностью включения любых меток, необходимых для индексирования и секвенирования, посредством стадий тагментации, удлинения и/или лигирования без ПЦР-амплификации. Таким образом, в некоторых аспектах меченые фрагменты можно удлинить, лигировать и индексировать без амплификации для создания библиотеки фрагментов нуклеиновых кислот без использования ПЦР-амплификации. [0030] The methods, compositions, systems, and kits described herein relate to complex-hybridized oligonucleotides and complexes containing such hybrids, including surface-immobilized complexes, and to the use of transposome complexes to form a library without PCR. As described herein, the transposome complex includes a transposase and its associated transposons that fragment and label the target DNA molecule. In some aspects, the complex-hybridized oligonucleotide is cleavable and includes a linking element, and in other aspects, the complex-hybridized oligonucleotide contains an attachment polynucleotide with a linking element. In some aspects, an attachment polynucleotide is a nucleotide sequence that hybridizes to a transposon in a transposome complex and is immobilized on a solid support such as a slide, flow cell, or bead. Due to the hybridization of the polynucleotide with the transposon, the transposome complex can be immobilized on a solid support indirectly via the attachment polynucleotide. Binding of the polynucleotide to the solid support occurs via a linking element on the attachment polynucleotide. Target nucleic acids are captured by the transposome complexes, and then the nucleic acids are fragmented and labeled ("tagmentation"). The oligonucleotide system is configured to include any labels required for indexing and sequencing through tagmentation, extension and/or ligation steps without PCR amplification. Thus, in some aspects, labeled fragments can be extended, ligated and indexed without amplification to create a library of nucleic acid fragments without the use of PCR amplification.
[0031] Тагментация на основе раствора имеет недостатки и требует нескольких трудоемких стадий. Кроме того, во время стадий ПЦР-амплификации, применяемых для введения последовательностей тегов, может быть введена систематическая погрешность. Например, снижение индела может быть результатом ПЦР вследствие «проскальзывания» полимеразы. Кроме того, полимеразы ПЦР имеют сложности в некоторых областях, таких как области с высоким уровнем GC или АТ, или области повтора последовательности, что приводит к образованию гэпов, ложных определений структуры в геноме или к потерям экспансии повторов. [0031] Solution-based tagmentation has disadvantages and requires several laborious steps. In addition, bias can be introduced during the PCR amplification steps used to introduce tag sequences. For example, a decrease in indel may result from PCR due to polymerase slippage. In addition, PCR polymerases have difficulties in certain regions, such as regions with high levels of GC or AT, or regions of sequence repeat, resulting in gaps, misidentifications of structure in the genome, or loss of repeat expansion.
[0032] Способы, композиции, системы и наборы, представленные в настоящем документе, позволяют преодолеть данные недостатки и позволяют производить неискаженную подготовку и секвенирование образцов с минимальными требованиями к манипуляциям или переносу образцов. Способы, композиции, системы и наборы, описанные в настоящем документе, относятся к созданию библиотек без применения ПЦР-амплификации. Подход без ПЦР снижает и/или устраняет систематические погрешности, вызванные ПЦР, включая снижение числа и частоты гэпов, в частности, в труднодоступных для ПЦР обогащенных GC областях; повышение эффективности распознавания инделов, в том числе повышение эффективности повторного распознавания инделов и точности инделов; улучшение распознавания размножения повторов; а также улучшение покрытия в обогащенных GC промоторах. В настоящей заявке описаны различные сложные транспосомные конфигурации для выполнения тагментации без ПЦР для улучшения создания библиотек нуклеиновых кислот. [0032] The methods, compositions, systems, and kits provided herein overcome these disadvantages and allow for undistorted sample preparation and sequencing with minimal sample manipulation or transfer requirements. The methods, compositions, systems and kits described herein relate to the creation of libraries without the use of PCR amplification. The non-PCR approach reduces and/or eliminates PCR-induced biases, including reduction in the number and frequency of gaps, particularly in GC-rich regions difficult to access by PCR; improving the efficiency of indel recognition, including improving the efficiency of repeated recognition of indels and the accuracy of indels; improved recognition of reproduction of repeats; as well as improved coverage in GC-rich promoters. The present application describes various complex transposome configurations for performing non-PCR tagging to improve the generation of nucleic acid libraries.
[0033] Кроме того, способы, композиции, системы и наборы, описанные в настоящем документе, могут осуществляться в течение периода меньшего, чем получение и анализ образца нуклеиновой кислоты, с использованием других способов, таких как способы, основанные на ПЦР. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы образования библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот, описанные в данном документе, можно выполнять в течение периода менее приблизительно 5 часов, например, менее 5, менее 4, менее 3 или менее 2 часов. В некоторых вариантах осуществления способы создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, можно выполнять в течение периода в диапазоне от около 90 минут до около 300 минут, например 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 195, 210, 225, 240, 255, 270, 285 или 300 минут, или в течение периода в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеупомянутых значений. [0033] In addition, the methods, compositions, systems, and kits described herein can be performed over a period of less than obtaining and analyzing a nucleic acid sample using other methods, such as PCR-based methods. Thus, in some embodiments, the methods for generating a library of labeled nucleic acid fragments described herein can be performed over a period of less than about 5 hours, such as less than 5, less than 4, less than 3, or less than 2 hours. In some embodiments, the methods for generating a library of labeled nucleic acid fragments described herein can be performed over a period ranging from about 90 minutes to about 300 minutes, such as 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 195, 210, 225, 240, 255, 270, 285 or 300 minutes, or for a period within the range defined by any two of the above values.
[0034] Более того, в некоторых вариантах осуществления применение способов, композиций, систем и наборов, описанных в настоящем документе, приводит к фрагментации нуклеиновых кислот, которая не зависит от времени, иммобилизация транспосомы приводит к постоянному размеру вставки, а насыщение позволяет интегрировать извлечение и получить библиотеку без количественного определения. [0034] Moreover, in some embodiments, the use of the methods, compositions, systems, and kits described herein results in nucleic acid fragmentation that is time independent, immobilization of the transposome results in a constant insert size, and saturation allows integration of extraction and get the library without quantification.
[0035] Дополнительные преимущества способов, композиций, систем и наборов, описанных в настоящем документе, относятся к иммобилизации комплекса транспосомы на твердой поверхности и включают следующее: например, сокращая непосредственное и общее время подготовки библиотеки, стоимость и требования к реагентам, снижая входные требования к образцу и позволяя использовать неочищенные или разложенные образцы в качестве отправной точки для получения библиотеки. Кроме того, описанные в настоящем документе комплексы транспосом также позволяют получать библиотеки с более стабильными размерами вставок по сравнению со способами, в которых применяется фаза растворения, даже при использовании различных входных концентраций образцов. [0035] Additional advantages of the methods, compositions, systems, and kits described herein relate to the immobilization of a transposome complex on a solid surface and include the following: for example, reducing direct and total library preparation time, cost, and reagent requirements, reducing entry requirements for sample and allowing uncleaned or decomposed samples to be used as a starting point for obtaining a library. In addition, the transposome complexes described herein also allow the production of libraries with more consistent insert sizes compared to methods that use a dissolution phase, even when using different input sample concentrations.
[0036] В некоторых вариантах осуществления библиотеки нуклеиновых кислот, полученные посредством способов, описанных в настоящем документе, можно секвенировать с использованием любой подходящей платформы секвенирования нуклеиновых кислот для определения последовательности нуклеиновой кислоты целевой последовательности. В некоторых отношениях интересующие последовательности коррелируют или ассоциируют с одним или более врожденными или наследственными расстройствами, патогенностью, резистентностью к антибиотикам или генетическими модификациями. Для определения нуклеотидной последовательности короткого тандемного повтора, однонуклеотидного полиморфизма, гена, экзона, кодирующей области, экзома или их части можно применять секвенирование. Таким образом, способы и композиции, описанные в настоящем документе, относятся к созданию секвенируемых библиотек, применяемых без ограничения в диагностике рака и иных заболеваний, прогнозе и терапевтических средствах, приложениях для ДНК-генотипоскопии (например, для создания баз данных ДНК, в работе по изучению материалов уголовных дел), метагеномных исследованиях и открытиях, сельском хозяйстве, а также для идентификации и мониторинга патогенов. [0036] In some embodiments, nucleic acid libraries obtained by the methods described herein can be sequenced using any suitable nucleic acid sequencing platform to determine the nucleic acid sequence of the target sequence. In some respects, sequences of interest correlate or associate with one or more congenital or inherited disorders, pathogenicity, antibiotic resistance, or genetic modifications. Sequencing can be used to determine the nucleotide sequence of a short tandem repeat, single nucleotide polymorphism, gene, exon, coding region, exome, or portion thereof. Thus, the methods and compositions described herein relate to the creation of sequencing libraries for use without limitation in cancer and other disease diagnostics, prognosis and therapeutics, DNA genotyposcopy applications (e.g., for creating DNA databases, in work on criminal cases), metagenomic research and discovery, agriculture, and pathogen identification and monitoring.
[0037] В некоторых вариантах осуществления соединительная адаптерная последовательность гибридизована с по меньшей мере частью 5’-адаптерной последовательности, и связывающий элемент находится на 3’-конце полинуклеотида присоединения. В некоторых вариантах осуществления адаптерная последовательность присоединения гибридизуется по меньшей мере с частью 3’-адаптерной последовательности, а связывающий элемент находится на 5’-конце олигонуклеотида присоединения. [0037] In some embodiments, the junction adapter sequence is hybridized to at least a portion of the 5' adapter sequence and the junction element is at the 3' end of the attachment polynucleotide. In some embodiments, the attachment adapter sequence hybridizes to at least a portion of the 3' adapter sequence and the binding element is at the 5' end of the attachment oligonucleotide.
[0038] Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно применяет специалист в данной области. Все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, на которые даны ссылки в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки, если не указано иное. Если не указано иное, при наличии множества определений для термина, представленного в настоящем документе, преимущественными являются определения, приведенные в данном разделе. Применяемые в данном описании и приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают упоминания форм множественного числа, если в контексте явно не указано иное. Если не указано иное, применяют традиционные способы масс-спектроскопии, ЯМР, ВЭЖХ, химии белков, биохимии, способы рекомбинантной ДНК и фармакологии. Применение союза «или» или «и» означает «и/или», если не указано иное. Более того, применение термина «включая», а также других форм, таких как «включают», «включает» и «включенный», не имеет ограничительного характера. При использовании в настоящем описании, либо в переходной фразе, либо в структуре формулы изобретения, термины «содержит(ат)» и «содержащий» следует интерпретировать как имеющие неограниченное значение. Другими словами, термины следует интерпретировать как синонимы фраз «имеющий по меньшей мере» или «включающий по меньшей мере». В контексте процесса термин «содержащий» означает, что процесс включает в себя по меньшей мере указанные стадии, но может включать в себя дополнительные стадии. В контексте соединения, композиции или устройства термин «содержащий» означает, что соединение, композиция или устройство включает по меньшей мере указанные особенности или компоненты, но может включать дополнительные особенности или компоненты. [0038] Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning as commonly used by a person skilled in the art. All patents, applications, published applications, and other publications referenced herein are incorporated herein by reference in their entirety, unless otherwise noted. Unless otherwise noted, where there are multiple definitions for a term provided in this document, the definitions provided in this section take precedence. As used in this specification and the appended claims, the singular forms include references to the plural forms, unless the context clearly indicates otherwise. Unless otherwise indicated, conventional methods of mass spectroscopy, NMR, HPLC, protein chemistry, biochemistry, recombinant DNA and pharmacology methods are used. The use of the union "or" or "and" means "and/or", unless otherwise indicated. Moreover, the use of the term "including", as well as other forms such as "include", "includes" and "included", is not intended to be limiting. When used in the present description, either in a transitional phrase or in the structure of the claims, the terms "comprises" and "comprising" should be interpreted as having an unrestricted meaning. In other words, the terms should be interpreted as synonymous with the phrases "having at least" or "comprising at least". In the context of a process, the term "comprising" means that the process includes at least these steps, but may include additional steps. In the context of a compound, composition, or device, the term "comprising" means that the compound, composition, or device includes at least the specified features or components, but may include additional features or components.
[0039] Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, предназначены только для организационных целей и не должны толковаться как ограничивающие описанный предмет. [0039] The section headings used in this specification are for organizational purposes only and should not be construed as limiting the subject matter described.
Комплексы транспосомTransposome complexes
[0040] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к композиции для создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без ПЦР-амплификации. В некоторых вариантах осуществления композиция включает твердую подложку и комплекс транспосом, иммобилизованный на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления комплекс транспосом включает в себя транспозазу, первый транспозон, полинуклеотид присоединения и второй транспозон. В некоторых вариантах осуществления первый транспозон включает в себя 3’-концевую последовательность транспозона и 5’-адаптерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид присоединения включает в себя адаптерную последовательность присоединения, гибридизованную с 5’-адаптерной последовательностью, и связывающий элемент. В некоторых вариантах осуществления второй транспозон содержит 5’-концевую последовательность транспозона и 3’-адаптерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления комплекс транспосом иммобилизуют на твердой подложке посредством полинуклеотида присоединения. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид присоединения дополнительно содержит праймерную последовательность. [0040] Some embodiments provided herein relate to a composition for generating a library of labeled nucleic acid fragments without PCR amplification. In some embodiments, the composition comprises a solid support and a transposome complex immobilized on the solid support. In some embodiments, the transposome complex includes a transposase, a first transposon, an attachment polynucleotide, and a second transposon. In some embodiments, the first transposon includes a 3' transposon sequence and a 5' adapter sequence. In some embodiments, the attachment polynucleotide includes an attachment adapter sequence fused to a 5' adapter sequence and a linking element. In some embodiments, the second transposon contains a 5' transposon sequence and a 3' adapter sequence. In some embodiments, the transposome complex is immobilized on a solid support via an attachment polynucleotide. In some embodiments, the attachment polynucleotide further comprises a primer sequence.
[0041] В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент содержит или представляет собой необязательно замещенный биотин. В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент соединен с полинуклеотидом присоединения посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент содержит или представляет собой линкер биотина. В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент содержит или представляет собой 3’, 5’ или внутренний биотин. [0041] In some embodiments, the implementation of the connecting element contains or is an optionally substituted biotin. In some embodiments, the implementation of the connecting element is connected to the polynucleotide accession via a linker. In some embodiments, the linking element comprises or is a biotin linker. In some embodiments, the implementation of the connecting element contains or is a 3', 5' or internal biotin.
[0042] В некоторых вариантах осуществления 3’-концевая последовательность транспозона содержит концевую мозаичную (ME) последовательность, а 5’-концевая последовательность транспозона содержит МЕ’-последовательность. В некоторых вариантах осуществления 5’-адаптерная последовательность содержит последовательность A14, а адаптерная последовательность крепления содержит последовательность A14’. В некоторых вариантах осуществления 3’-адаптерная последовательность содержит последовательность B15’. В некоторых вариантах осуществления 3’-адаптерная последовательность комплементарна по меньшей мере участку индексной адаптерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления индексная адаптерная последовательность содержит последовательность В15. В некоторых вариантах осуществления часть полинуклеотида присоединения содержит праймерную последовательность, такую как праймерная последовательность P5’. В некоторых вариантах осуществления праймерная последовательность полинуклеотида присоединения комплементарна по меньшей мере части индексирующей олигонуклеотидной последовательности, такой как праймерная последовательность P5. [0042] In some embodiments, the 3'-terminal sequence of the transposon contains a terminal mosaic (ME) sequence, and the 5'-terminal sequence of the transposon contains the ME' sequence. In some embodiments, the 5' adapter sequence contains an A14 sequence and the attachment adapter sequence contains an A14' sequence. In some embodiments, the 3' adapter sequence contains the B15' sequence. In some embodiments, the 3' adapter sequence is complementary to at least a portion of the index adapter sequence. In some embodiments, the index adapter sequence comprises a B15 sequence. In some embodiments, a portion of the attachment polynucleotide contains a primer sequence, such as a P5' primer sequence. In some embodiments, the accession polynucleotide primer sequence is complementary to at least a portion of an indexing oligonucleotide sequence, such as a P5 primer sequence.
[0043] В некоторых вариантах осуществления комплекс транспосом иммобилизуют на твердой подложке посредством связывающего элемента (и необязательного линкера), как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой гранулу, парамагнитную гранулу, проточную кювету, поверхность микрожидкостного устройства, пробирку, лунку планшета, предметное стекло, структурированную поверхность или микрочастицу. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит или представляет собой гранулу. В одном варианте осуществления гранула представляет собой парамагнитную гранулу. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит множество твердых подложек. В некоторых вариантах осуществления комплексы транспосом иммобилизованы на множестве твердых подложек. В некоторых вариантах осуществления множество твердых подложек содержит множество гранул. В некоторых вариантах осуществления множество комплексов транспосом иммобилизуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 103, 104, 105, 106 комплексов на мМ2. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой гранулу или парамагнитные гранулы, и с каждой гранулой связано более 10000, 20000, 30000, 40000, 50000 или 60000 комплексов транспосом. [0043] In some embodiments, the transposome complex is immobilized on a solid support via a binding element (and an optional linker) as described herein. In some embodiments, the solid support is a bead, a paramagnetic bead, a flow cell, a microfluidic device surface, a test tube, a plate well, a glass slide, a structured surface, or a microparticle. In some embodiments, the solid support comprises or is a bead. In one embodiment, the bead is a paramagnetic bead. In some embodiments, the solid support comprises a plurality of solid supports. In some embodiments, transposome complexes are immobilized on a plurality of solid supports. In some embodiments, the plurality of solid supports comprises a plurality of granules. In some embodiments, a plurality of transposome complexes are immobilized on a solid support at a density of at least 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 complexes per mM 2 . In some embodiments, the solid support is a bead or paramagnetic beads and more than 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, or 60,000 transposome complexes are associated with each bead.
[0044] Для фрагментации ДНК можно применять технологию на основе транспозона, например, как показано в примере рабочего процесса наборов для получения образцов NEXTERA™ FLEX DNA (Illumina, Inc.), причем целевые нуклеиновые кислоты, такие как геномная ДНК, обрабатывают комплексами транспосом, которые одновременно фрагментируют и наносят метки на мишень («тагментация»), создавая таким образом популяцию фрагментированных молекул нуклеиновой кислоты, несущих метку уникальных адаптерных последовательностей на концах фрагментов. [0044] Transposon-based technology can be used for DNA fragmentation, for example, as shown in the example workflow of NEXTERA™ FLEX DNA Sampler Kits (Illumina, Inc.), where target nucleic acids, such as genomic DNA, are treated with transposome complexes, which simultaneously fragment and label the target (“tagmentation”), thus creating a population of fragmented nucleic acid molecules labeled with unique adapter sequences at the ends of the fragments.
[0045] Реакция транспозиции представляет собой реакцию, в которой один или более транспозонов вводят в целевые нуклеиновые кислоты в случайных сайтах или практически случайных сайтах. Компоненты реакции транспозиции включают транспозазу (или другой фермент, способный фрагментировать и наносить метку на нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем документе, такую как интеграза) и транспозонный элемент, который включает двухцепочечную транспозонную концевую последовательность, связывающуюся с транспозазой (или другим ферментом, описанным в настоящем документе), и адаптерную последовательность, присоединенную к одной из двух концевых последовательностей транспозона. Одну цепь двухцепочечной транспозонной концевой последовательности переносят в одну цепь целевой нуклеиновой кислоты, а комплементарную цепь транспозонной концевой последовательности не переносят (транспозонная последовательность без переноса). Адаптерная последовательность может включать в себя одну или более функциональных последовательностей или компонентов (например, праймерные последовательности, якорных последовательностей, универсальных последовательностей, спейсерных участков или последовательностей индексированных меток) по мере необходимости. [0045] A transposition reaction is a reaction in which one or more transposons are introduced into target nucleic acids at random sites or substantially random sites. The components of the transposition reaction include a transposase (or other enzyme capable of fragmenting and labeling a nucleic acid as described herein, such as an integrase) and a transposon element that includes a double-stranded transposon terminal sequence that binds to the transposase (or other enzyme described in herein), and an adapter sequence attached to one of the two terminal sequences of the transposon. One strand of the double-stranded transposon end sequence is transferred into one strand of the target nucleic acid, and the complementary strand of the transposon end sequence is not transferred (no transfer transposon sequence). The adapter sequence may include one or more functional sequences or components (eg, primer sequences, anchor sequences, universal sequences, spacer regions, or index tag sequences) as needed.
[0046] «Комплекс транспосом» состоит по меньшей мере из одной транспозазы (или другого фермента, описанного в настоящем документе) и последовательности распознавания транспозона. В некоторых таких системах транспозаза связывается с последовательностью распознавания транспозона с образованием функционального комплекса, который способен катализировать реакцию транспозиции. В некоторых аспектах последовательность распознавания транспозона представляет собой двухцепочечную концевую последовательность транспозона. Транспозаза связывается с сайтом распознавания транспозазы в целевой нуклеиновой кислоте и вставляет последовательность распознавания транспозона в целевую нуклеиновую кислоту. В некоторых таких явлениях вставки одну цепь последовательности распознавания транспозона (или концевой последовательности) переносят в целевую нуклеиновую кислоту, что приводит к явлению расщепления. Иллюстративные процедуры и системы транспозиции, которые можно легко приспособить для использования с транспозазами. [0046] A "transposome complex" consists of at least one transposase (or other enzyme described herein) and a transposon recognition sequence. In some of these systems, a transposase binds to a transposon recognition sequence to form a functional complex that is capable of catalyzing the transposition reaction. In some aspects, the transposon recognition sequence is the double-stranded terminal sequence of the transposon. The transposase binds to the transposase recognition site in the target nucleic acid and inserts the transposon recognition sequence into the target nucleic acid. In some such insertion events, one strand of a transposon recognition sequence (or terminal sequence) is transferred into the target nucleic acid, resulting in a cleavage event. Illustrative transposition procedures and systems that can be readily adapted for use with transposases.
[0047] Примеры транспозаз, которые можно применять с определенными вариантами осуществления, представленными в настоящем документе, включают следующие (или кодируются следующими): транспозаза Tn5, транспозаза Спящая Красавица (SB), Vibrio harveyi, транспозаза MuA и сайт распознавания транспозазы Mu, содержащий концевые последовательности R1 и R2, транспозаминаза StaphylococcUS aureUS Tn552, Ty1, Tn7, Tn/O и IS10, транспозаза Mariner, Tc1, P-элемент, Tn3, последовательности бактериальной вставки, ретровирусы и ретротранспозон дрожжей. Остальные примеры включают IS5, Tn10, Tn903, IS911 и сконструированные версии ферментов семейства транспозаз. Способы, описанные в настоящем документе, также могут включать комбинации транспозаз, а не только одну транспозазу. [0047] Examples of transposases that can be used with certain embodiments provided herein include the following (or are encoded as follows): Tn5 transposase, Sleeping Beauty (SB) transposase, Vibrio harveyi , MuA transposase, and Mu transposase recognition site containing terminal R1 and R2 sequences, StaphylococcUS aureUS transposaminase Tn552, Ty1, Tn7, Tn/O and IS10, Mariner transposase, Tc1, P-element, Tn3, bacterial insert sequences, retroviruses and yeast retrotransposon. Other examples include IS5, Tn10, Tn903, IS911, and engineered versions of the transposase family of enzymes. The methods described herein may also include combinations of transposases, not just one transposase.
[0048] В некоторых вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Tn5, Tn7, MuA или Vibrio Haryi или ее активный мутант. В других вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Тn5 или ее мутант. В других вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Тn5 или ее мутант. В других вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Тn5 или ее активный мутант. В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Тn5 или ее активный мутант. В некоторых аспектах транспозаза Tn5 представляет собой транспозазу Tn5, описанную в публикации PCT № WO2015/160895, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых аспектах транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Tn5 с мутациями в позициях 54, 56, 372, 212, 214, 251 и 338 относительно транспозазы Tn5 дикого типа. В некоторых аспектах транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Tn5 со следующими мутациями относительно транспозазы Tn5 дикого типа: E54K, M56A, L372P, K212R, P214R, G251R и A338V. В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой белок слияния. В некоторых вариантах осуществления белок слияния транспозазы Tn5 содержит метку слитого фактора удлинения Ts (Tsf). В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Tn5, содержащую мутации по аминокислотам 54, 56 и 372 относительно последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления гиперактивная транспозаза Tn5 представляет собой белок слияния, причем необязательно белок слияния представляет собой фактор удлинения Ts (Tsf). В некоторых вариантах осуществления сайт распознавания представляет собой сайт распознавания транспозазы типа Tn5 (Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367, 1998). В одном варианте осуществления применяют сайт распознавания транспозазы, образующий комплекс с гиперактивной транспозазой Tn5 (например, транспозаза EZ-Tn5™, Epicentre Biotechnologies, Madison, Wis.). В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой транспозазу Tn5 дикого типа. [0048] In some embodiments, the transposase is a Tn5, Tn7, MuA, or Vibrio Haryi transposase, or an active mutant thereof. In other embodiments, the transposase is a Tn5 transposase or a mutant thereof. In other embodiments, the transposase is a Tn5 transposase or a mutant thereof. In other embodiments, the transposase is a Tn5 transposase or an active mutant thereof. In some embodiments, the Tn5 transposase is a hyperactive Tn5 transposase or an active mutant thereof. In some aspects, the Tn5 transposase is the Tn5 transposase described in PCT Publication No. WO2015/160895, which is incorporated herein by reference. In some aspects, the Tn5 transposase is an overactive Tn5 transposase with mutations at positions 54, 56, 372, 212, 214, 251, and 338 relative to the wild-type Tn5 transposase. In some aspects, the Tn5 transposase is an overactive Tn5 transposase with the following mutations relative to the wild-type Tn5 transposase: E54K, M56A, L372P, K212R, P214R, G251R, and A338V. In some embodiments, the Tn5 transposase is a fusion protein. In some embodiments, the Tn5 transposase fusion protein contains a Ts extension factor (Tsf) fusion tag. In some embodiments, the Tn5 transposase is an overactive Tn5 transposase containing mutations at amino acids 54, 56, and 372 relative to the wild-type sequence. In some embodiments, the overactive Tn5 transposase is a fusion protein, optionally the fusion protein is a Ts extension factor (Tsf). In some embodiments, the recognition site is a Tn5 type transposase recognition site (Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367, 1998). In one embodiment, a transposase recognition site complexed with an overactive Tn5 transposase (eg, EZ-Tn5™ transposase, Epicentre Biotechnologies, Madison, Wis.) is used. In some embodiments, the Tn5 transposase is a wild-type Tn5 transposase.
[0049] В некоторых вариантах осуществления комплекс транспосом содержит димер двух молекул транспозазы. В некоторых вариантах осуществления комплекс транспосом представляет собой гомодимер, в котором каждая из двух молекул транспозазы связана с первым и вторым транспозонами одного типа (например последовательности двух транспозонов, связанных с каждым мономером, являются одинаковыми, образуя «гомодимер»). В некоторых вариантах осуществления в композициях и способах, описанных в настоящем документе, применяют две популяции комплексов транспосом. В некоторых вариантах осуществления транспозазы в каждой популяции являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления комплексы транспомосом в каждой популяции являются гомодимерами, причем первая популяция имеет первую адаптерную последовательность в каждом мономере, а вторая популяция имеет отличную адаптерную последовательность в каждом мономере. [0049] In some embodiments, the transposome complex comprises a dimer of two transposase molecules. In some embodiments, the transposome complex is a homodimer in which two transposase molecules are each associated with a first and second transposon of the same type (eg, the sequences of the two transposons associated with each monomer are the same, forming a "homodimer"). In some embodiments, the compositions and methods described herein use two populations of transposome complexes. In some embodiments, the transposases in each population are the same. In some embodiments, the transpomosome complexes in each population are homodimers, with the first population having a first adapter sequence in each monomer and the second population having a different adapter sequence in each monomer.
[0050] В некоторых вариантах осуществления комплекс транспозазы содержит димер транспозазы (например, транспозазу Tn5), содержащий первый и второй мономеры. В некоторых аспектах каждый мономер содержит первый транспозон, второй транспозон и полинуклеотид присоединения, причем первый транспозон включает в себя концевую последовательность транспозона на 3’-конце (также называемую 3’ -концевой последовательностью транспозона) и адаптерную последовательность на 5’-конце (также называемую 5’-адаптерной последовательностью); второй транспозон включает в себя концевую последовательность транспозона на 5’-конце (также называемую 5’-концевой последовательностью транспозона) и адаптерную последовательность на 3’-конце (также называемую 3’-адаптерной последовательностью); и полинуклеотид присоединения включает в себя адаптерную последовательность присоединения, гибридизованную с 5’-адаптерной последовательностью первого транспозона, праймерную последовательность и линкер. В некоторых вариантах осуществления 5’-концевая последовательность транспозона второго транспозона по меньшей мере частично комплементарна 3’-концевой последовательности транспозона первого транспозона. В некоторых вариантах осуществления соединительная адаптерная последовательность полинуклеотида присоединения по меньшей мере частично комплементарна 5’-адаптерной последовательности первого транспозона. В некоторых вариантах осуществления линкер полинуклеотида присоединения включает связывающий элемент. [0050] In some embodiments, the transposase complex comprises a transposase dimer (eg, Tn5 transposase) containing first and second monomers. In some aspects, each monomer comprises a first transposon, a second transposon, and an attachment polynucleotide, wherein the first transposon includes a transposon terminal sequence at the 3' end (also referred to as a 3' transposon sequence) and an adapter sequence at the 5' end (also referred to as 5'-adapter sequence); the second transposon includes a transposon terminal sequence at the 5' end (also referred to as a 5' transposon sequence) and an adapter sequence at the 3' end (also referred to as a 3' adapter sequence); and the attachment polynucleotide includes an attachment adapter sequence fused to the 5' adapter sequence of the first transposon, a primer sequence, and a linker. In some embodiments, the 5' transposon sequence of the second transposon is at least partially complementary to the 3' transposon sequence of the first transposon. In some embodiments, the attachment polynucleotide junction adapter sequence is at least partially complementary to the 5' adapter sequence of the first transposon. In some embodiments, the attachment polynucleotide linker includes a linking element.
Концевые последовательностиEnd sequences
[0051] В любом из вариантов осуществления способа, описанного в настоящем документе, первый транспозон включает в себя 3’-концевую последовательность транспозона, а второй транспозон включает в себя 5’-концевую последовательность транспозона. В некоторых вариантах осуществления 5’-концевая последовательность транспозона по меньшей мере частично комплементарна 3’-концевой последовательности транспозона. В некоторых вариантах осуществления комплементарные концевые последовательности транспозона гибридизуются с образованием двухцепочечной концевой последовательности транспозона, которая связывается с транспозазой (или другим ферментом, как описано в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления концевая последовательность транспозона представляет собой последовательность мозаичного конца (ME). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления 3’-концевая последовательность транспозона представляет собой последовательность МЕ, и 5’-концевая последовательность транспозона представляет собой последовательность МЕ. [0051] In any of the embodiments of the method described herein, the first transposon includes a 3' transposon sequence and the second transposon includes a 5' transposon sequence. In some embodiments, the 5' end sequence of the transposon is at least partially complementary to the 3' end sequence of the transposon. In some embodiments, the transposon's complementary terminal sequences hybridize to form a double-stranded transposon terminal sequence that binds to a transposase (or other enzyme as described herein). In some embodiments, the terminal sequence of the transposon is a mosaic end (ME) sequence. Thus, in some embodiments, the 3' end sequence of the transposon is the ME sequence and the 5' end sequence of the transposon is the ME sequence.
Адаптерные последовательностиAdapter sequences
[0052] В любом из вариантов осуществления способа, описанного в настоящем документе, первый транспозон включает в себя 5’-адаптерную последовательность, а второй транспозон включает в себя 3’-адаптерную последовательность. Адаптерные последовательности могут содержать одну или более функциональных последовательностей или компонентов, выбранных из группы, включающей праймерные последовательности, якорные последовательности, универсальные последовательности, спейсерные области, индексные последовательности, последовательности захвата, последовательности банка данных, последовательностей отщепления, последовательности, связанные с секвенированием и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления адаптерная последовательность содержит праймерную последовательность. В других вариантах осуществления адаптерная последовательность содержит праймерную последовательность и индексную последовательность или последовательность банка данных. Праймерная последовательность также может представлять собой универсальную последовательность. Данное раскрытие не ограничено типом адаптерных последовательностей, которые можно применять, и квалифицированный специалист распознает дополнительные последовательности, которые можно применять для получения библиотеки и секвенирования следующего поколения. Универсальная последовательность представляет собой область нуклеотидной последовательности, которая является общей для двух или более фрагментов нуклеиновых кислот. Необязательно два или более фрагментов нуклеиновых кислот также имеют области различий последовательности. Универсальная последовательность, которая может присутствовать в разных членах множества фрагментов нуклеиновых кислот, может обеспечивать репликацию или амплификацию множества разных последовательностей с использованием одного универсального праймера, комплементарного универсальной последовательности. [0052] In any of the embodiments of the method described herein, the first transposon includes a 5' adapter sequence and the second transposon includes a 3' adapter sequence. Adapter sequences may contain one or more functional sequences or components selected from the group including primer sequences, anchor sequences, universal sequences, spacer regions, index sequences, capture sequences, data bank sequences, cleavage sequences, sequences associated with sequencing, and combinations thereof. . In some embodiments, the implementation of the adapter sequence contains a primer sequence. In other embodiments, the adapter sequence comprises a primer sequence and an index or databank sequence. The primer sequence may also be a universal sequence. This disclosure is not limited to the type of adapter sequences that may be used, and the skilled artisan will recognize additional sequences that may be used for library generation and next generation sequencing. A universal sequence is a region of a nucleotide sequence that is common to two or more nucleic acid fragments. Optionally, two or more nucleic acid fragments also have regions of sequence differences. A universal sequence that may be present in different members of a plurality of nucleic acid fragments may allow for the replication or amplification of a plurality of different sequences using a single universal primer that is complementary to the universal sequence.
[0053] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид присоединения включает в себя адаптерную последовательность присоединения, гибридизованную с 5’-адаптерной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления адаптерная последовательность присоединения по меньшей мере частично комплементарна 5’-адаптерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления адаптерная последовательность представляет собой последовательность А14 или последовательность В15. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления 5’-адаптерная последовательность представляет собой последовательность A14, а адаптерная последовательность присоединения представляет собой последовательность A14’. В некоторых вариантах осуществления 3’-адаптерная последовательность представляет собой последовательность B15’. В некоторых вариантах осуществления адаптерная последовательность представляет собой любую последовательность для гибридизации (называемую в настоящем документе последовательностью X). В некоторых вариантах осуществления последовательность X содержит 16-20 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность X имеет температуру плавления (Tm), аналогичную температуре плавления адаптерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления результаты секвенирования улучшаются, если Tm последовательности X имеет температуру плавления, аналогичную температуре плавления адаптерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления последовательность X имеет температуру плавления, аналогичную температуре плавления последовательности А14 или последовательности В15. В некоторых вариантах осуществления Tm последовательности X составляет 53°-56°. В некоторых вариантах осуществления адаптерную последовательность переносят к 5’-концам фрагмента нуклеиновой кислоты посредством реакции тагментации. [0053] In some embodiments, the attachment polynucleotide includes an attachment adapter sequence fused to a 5' adapter sequence. In some embodiments, the adapter attachment sequence is at least partially complementary to the 5' adapter sequence. In some embodiments, the adapter sequence is an A14 sequence or a B15 sequence. Thus, in some embodiments, the 5' adapter sequence is an A14 sequence and the attachment adapter sequence is an A14' sequence. In some embodiments, the 3' adapter sequence is a B15' sequence. In some embodiments, the adapter sequence is any hybridization sequence (referred to herein as an X sequence). In some embodiments, the X sequence contains 16-20 nucleotides. In some embodiments, sequence X has a melting point (Tm) similar to that of the adapter sequence. In some embodiments, sequencing results are improved if the Tm of sequence X has a melting point similar to that of the adapter sequence. In some embodiments, sequence X has a melting point similar to that of sequence A14 or sequence B15. In some embodiments, the Tm of sequence X is 53°-56°. In some embodiments, the adapter sequence is transferred to the 5' ends of the nucleic acid fragment via a tagging reaction.
[0054] В любом из вариантов осуществления адаптерная последовательность или транспозонные концевые последовательности, включая A14-ME, ME, B15-ME, ME’, A14, B15 и ME, представлены ниже: [0054] In any of the embodiments, the adapter sequence or transposon terminal sequences, including A14-ME, ME, B15-ME, ME', A14, B15, and ME, are as follows:
A14-ME: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′ (SEQ ID NO: 1A14-ME: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 1
B15-ME: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′ (SEQ ID NO: 2).B15-ME: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 2).
ME’: 5’-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3’ (SEQ ID NO: 3).ME': 5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (SEQ ID NO: 3).
A14: 5′-TCGTCGGCAGCGTC-3′ (SEQ ID NO: 4)A14: 5'-TCGTCGGCAGCGTC-3' (SEQ ID NO: 4)
B15: 5′-GTCTCGTGGGCTCGG-3’ (SEQ ID NO: 5)B15: 5'-GTCTCGTGGGCTCGG-3' (SEQ ID NO: 5)
ME: AGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID NO: 6)ME: AGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID NO: 6)
Полинуклеотид присоединенияAttachment polynucleotide
[0055] Варианты осуществления описанного в настоящем документе комплекса транспосомы включают в себя полинуклеотид присоединения. В настоящем документе полинуклеотид присоединения представляет собой полинуклеотид, который гибридизуется с транспозоном на одном конце и связывается с поверхностью на втором конце. Таким образом, описанный в настоящем документе комплекс транспосом иммобилизован на твердой подложке посредством полинуклеотида присоединения. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид присоединения включает в себя адаптерную последовательность присоединения, гибридизованную с адаптерной последовательностью первого транспозона или адаптерной последовательностью второго транспозона, последовательностью праймера и линкером. В некоторых вариантах осуществления линкер включает связывающий элемент. [0055] Embodiments of the transposome complex described herein include an attachment polynucleotide. As used herein, an attachment polynucleotide is a polynucleotide that hybridizes to a transposon at one end and binds to a surface at the second end. Thus, the transposome complex described herein is immobilized on a solid support via an attachment polynucleotide. In some embodiments, the attachment polynucleotide comprises an attachment adapter sequence fused to a first transposon adapter sequence or a second transposon adapter sequence, a primer sequence, and a linker. In some embodiments, the implementation of the linker includes a connecting element.
[0056] Как описано в настоящем документе, адаптерная последовательность присоединения может быть по меньшей мере частично комплементарна адаптерной последовательности первого или второго транспозона. В некоторых вариантах осуществления адаптерная последовательность присоединения гибридизуется с 5’-адаптерной последовательностью. В вариантах осуществления, в которых адаптерная последовательность присоединения гибридизуется с 5’-адаптерной последовательностью, где 5’-адаптерная последовательность представляет собой последовательность A14, адаптерная последовательность присоединения представляет собой последовательность A14’. В некоторых вариантах осуществления адаптерная последовательность представляет собой последовательность X. В некоторых вариантах осуществления соединительная адаптерная последовательность гибридизуется с 3’-адаптерной последовательностью. В вариантах осуществления, в которых адаптерная последовательность присоединения гибридизуется с 3’-адаптерной последовательностью, где 3’-адаптерная последовательность представляет собой последовательность B15’, адаптерная последовательность присоединения представляет собой последовательность B15. В любом из данных вариантов осуществления соединительная адаптерная последовательность может быть полностью комплементарна адаптерной последовательности первого или второго транспозона или частично комплементарна адаптерной последовательности первого или второго транспозона. [0056] As described herein, the attachment adapter sequence may be at least partially complementary to the adapter sequence of the first or second transposon. In some embodiments, the attachment adapter sequence hybridizes to a 5' adapter sequence. In embodiments in which the attachment adapter sequence hybridizes to a 5' adapter sequence, where the 5' adapter sequence is an A14 sequence, the attachment adapter sequence is an A14' sequence. In some embodiments, the adapter sequence is an X sequence. In some embodiments, the junction adapter sequence hybridizes to a 3' adapter sequence. In embodiments in which the attachment adapter sequence hybridizes to a 3' adapter sequence, where the 3' adapter sequence is a B15' sequence, the attachment adapter sequence is a B15 sequence. In any of these embodiments, the junction adapter sequence may be fully complementary to the first or second transposon adapter sequence, or partially complementary to the first or second transposon adapter sequence.
[0057] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид присоединения содержит праймерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления праймерная последовательность представляет собой праймерную последовательность P5, или праймерную последовательность P7, или ее комплемент (например, P5’ или P7’). Праймеры P5 и P7 используют на поверхности коммерческих проточных кювет, поставляемых компанией Illumina, Inc., для секвенирования на различных платформах Illumina. Праймерные последовательности описаны в публикации патента США № 2011/0059865, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Примеры праймеров P5 и P7, которые могут иметь алкиновую концевую группу на 5’-конце, включают в себя следующие: [0057] In some embodiments, the attachment polynucleotide contains a primer sequence. In some embodiments, the primer sequence is a P5 primer sequence, or a P7 primer sequence, or its complement (eg, P5' or P7'). Primers P5 and P7 are used on the surface of commercial flow cells supplied by Illumina, Inc. for sequencing on various Illumina platforms. Primer sequences are described in US Patent Publication No. 2011/0059865, which is incorporated herein by reference in its entirety. Examples of P5 and P7 primers that may have an alkyne end group at the 5' end include the following:
P5: AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (SEQ ID NO: 7)P5: AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (SEQ ID NO: 7)
P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ ID NO: 8)P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ ID NO: 8)
и их производные. В некоторых примерах последовательность Р7 включает модифицированный гуанин в положении G*, например, 8-оксогуанин. В других примерах * указывает на то, что связь между G* и смежным 3’ A представляет собой тиофосфатную связь. В некоторых примерах праймеры Р5 и/или Р7 включают линкеры не природного происхождения. Необязательно один или оба праймера P5 и P7 могут включать хвост поли-T. Хвост поли-T по существу расположен на 5’-конце указанной выше последовательности, например, между 5’-основанием и концевым алкиновым звеном, но в некоторых случаях может быть расположен на 3’-конце. Последовательность поли-T может включать любое число Т-нуклеотидов, например от 2 до 20. Несмотря на то, что в качестве примеров приведены праймеры P5 и P7, следует понимать, что в примерах, представленных в настоящем документе, можно использовать любые подходящие праймеры. Индексные последовательности, имеющие праймерные последовательности, включая праймерные последовательности P5 и P7, служат для добавления P5 и P7 для активации библиотеки для секвенирования. Несмотря на то, что в качестве примеров приведены праймеры P5 и P7, следует понимать, что в примерах, представленных в настоящем документе, можно использовать любые подходящие праймеры амплификации.and their derivatives. In some examples, the P7 sequence includes a modified guanine at the G* position, such as 8-oxoguanine. In other examples, * indicates that the bond between G* and the adjacent 3' A is a thiophosphate bond. In some examples, the P5 and/or P7 primers include non-naturally occurring linkers. Optionally, one or both of the P5 and P7 primers may include a poly-T tail. The poly-T tail is essentially located at the 5' end of the above sequence, for example between the 5' base and the terminal alkyne unit, but in some cases may be located at the 3' end. The poly-T sequence may include any number of T-nucleotides, for example from 2 to 20. Although primers P5 and P7 are given as examples, it should be understood that any suitable primers can be used in the examples provided herein. Index sequences having primer sequences, including P5 and P7 primer sequences, serve to add P5 and P7 to activate the sequencing library. Although primers P5 and P7 are given as examples, it should be understood that any suitable amplification primers can be used in the examples provided herein.
[0058] В контексте настоящего документа один пример линкера представляет собой функциональную группу, которая ковалентно соединяет связывающий элемент с концом нуклеотидной части полинуклеотида присоединения и может использоваться для иммобилизации полинуклеотида присоединения на твердой подложке. Линкер может представлять собой расщепляемый линкер, например, линкер, способный отщепляться для удаления полинуклеотида присоединения и, таким образом, комплекса транспосомы или продукта мечения с твердой подложки. В контексте настоящего документа отщепляемый линкер представляет собой линкер, который может быть отщеплен химическими или физическими способами, такими как, например, фотолиз, химическое отщепление, термическое отщепление или ферментативное отщепление. В некоторых вариантах осуществления отщепление может осуществляться биохимическими, химическими, ферментативными, нуклеофильными, чувствительными к восстановлению средствами или иными способами. Отщепляемые линкеры могут содержать фрагмент, выбранный из группы, включающей следующее: сайт рестрикционной эндонуклеазы; по меньшей мере один рибонуклеотид, отщепляемый РНКазой; аналоги нуклеотидов, отщепляемые в присутствии определенного(ых) химического(ых) средства(средств); фоторасщепляемое(ые) линкерное(ые) звено (звенья); диольная связь, отщепляемая посредством обработки периодатом (как пример); дисульфидная группа, отщепляемая химическим восстанавливающим средством; отщепляемая функциональная группа, которая может подвергаться фотохимическому отщеплению; и пептид, отщепляемый пептидазой ферментом или другими подходящими способами. Отщепление может быть опосредовано ферментами путем включения отщепляемого нуклеотида или нуклеотидного основания в отщепляемый линкер, такой как урацил или 8-оксогуанин. [0058] As used herein, one example of a linker is a functional group that covalently connects the linking element to the end of the nucleotide portion of the attachment polynucleotide and can be used to immobilize the attachment polynucleotide on a solid support. The linker may be a cleavable linker, for example a linker capable of being cleaved to remove the attachment polynucleotide and thus the transposome complex or label product from the solid support. As used herein, a cleavable linker is a linker that can be cleaved off by chemical or physical means such as, for example, photolysis, chemical cleavage, thermal cleavage, or enzymatic cleavage. In some embodiments, the cleavage may be carried out by biochemical, chemical, enzymatic, nucleophilic, reduction-sensitive means, or other means. The cleavable linkers may contain a moiety selected from the group consisting of the following: a restriction endonuclease site; at least one ribonucleotide cleaved by RNase; nucleotide analogs cleavable in the presence of a specific chemical(s) agent(s); photocleavable(s) linker(s) unit(s); a diol bond cleaved off by periodate treatment (as an example); a disulfide group cleaved off by a chemical reducing agent; a cleavable functional group that can be subjected to photochemical cleavage; and a peptide cleavable by a peptidase enzyme or other suitable methods. Cleavage can be mediated by enzymes by incorporating the cleavable nucleotide or nucleotide base into a cleavable linker such as uracil or 8-oxoguanine.
[0059] В некоторых вариантах осуществления линкер, описанный в настоящем документе, может быть ковалентно и непосредственно присоединен к полинуклеотиду присоединения, например, с образованием связи -O-, или может быть ковалентно присоединен посредством другой группы, такой как фосфат или сложный эфир. В альтернативном варианте осуществления описанный в настоящем документе линкер может быть ковалентно присоединен к фосфатной группе полинуклеотида присоединения, например, ковалентно присоединен к 3’-гидроксильной группе посредством фосфатной группы, с образованием таким образом связи -O-P(O)3. [0059] In some embodiments, the linker described herein may be covalently and directly attached to the attachment polynucleotide, for example, to form an -O- bond, or may be covalently attached through another group, such as a phosphate or ester. In an alternative embodiment, the linker described herein can be covalently attached to the phosphate group of the attachment polynucleotide, eg, covalently attached to the 3'-hydroxyl group via a phosphate group, thereby forming an -OP(O) 3 bond.
[0060] В контексте настоящего документа связывающий элемент представляет собой фрагмент, который можно использовать для связывания, ковалентно или нековалентно, с партнером по связыванию. В некоторых аспектах связывающий элемент находится на комплексе транспосом, а партнер по связыванию находится на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент может связываться или нековалентно связываться с партнером по связыванию на твердой подложке, нековалентно присоединяя таким образом комплекс транспосом к твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент способен связываться (ковалентно или нековалентно) с партнером по связыванию на твердой подложке. В некоторых аспектах связывающий элемент связан (ковалентно или нековалентно) с партнером по связыванию на твердой подложке, что приводит к образованию иммобилизованного комплекса транспосом. [0060] As used herein, a binding element is a moiety that can be used to bind, covalently or non-covalently, to a binding partner. In some aspects, the binding element is on the transposome complex and the binding partner is on a solid support. In some embodiments, the binding element may bind or non-covalently bind to a binding partner on a solid support, thereby non-covalently attaching the transposome complex to the solid support. In some embodiments, the implementation of the connecting element is able to communicate (covalently or non-covalently) with a binding partner on a solid support. In some aspects, the binding element is linked (covalently or non-covalently) to a binding partner on a solid support, resulting in the formation of an immobilized transposome complex.
[0061] В таких вариантах осуществления связывающий элемент содержит или представляет собой, например, биотин, а партнер по связыванию содержит или представляет собой авидин или стрептавидин. В других вариантах осуществления комбинация связывающего элемента/партнера по связыванию содержит или представляет собой FITC/антитело к FITC, дигоксигенин/антитело дигоксигенин или гаптен/антитело. Другие подходящие пары связывания включают без ограничения дитиобиотинавидин, иминобиотинавидин, биотинавидин, дитиобиотинсукцинилированный авидин, иминобиотинсукцинилированный авидин, биотинстрептавидин и биотинсукцинилированный авидин. В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент представляет собой биотин, а партнер по связыванию представляет собой стрептавидин. [0061] In such embodiments, the binding element contains or is, for example, biotin, and the binding partner contains or is avidin or streptavidin. In other embodiments, the binding element/binding partner combination comprises or is FITC/anti-FITC antibody, digoxigenin/digoxigenin antibody, or hapten/antibody. Other suitable binding pairs include, without limitation, dithiobiotinavidin, iminobiotinavidin, biotinavidin, dithiobiotinsuccinylated avidin, iminobiotinsuccinylated avidin, biotinstreptavidin, and biotinsuccinylated avidin. In some embodiments, the binding element is biotin and the binding partner is streptavidin.
[0062] В некоторых вариантах осуществления связывающий элемент может связываться с партнером по связыванию посредством химической реакции или ковалентно связываться с партнером по связыванию на твердой подложке, таким образом ковалентно связывая комплекс транспосом с твердой подложкой. В некоторых аспектах комбинация связывающего элемента/партнера по связыванию содержит или представляет собой амин/карбоновую кислоту (например, связывание посредством стандартной реакции сочетания пептидов в условиях, известных специалисту в данной области, таких как EDC или NHS-опосредованное связывание). Реакция двух компонентов соединяет связывающий элемент с партнером по связыванию посредством амидной связи. В альтернативном варианте осуществления связывающий элемент и связывающее вещество могут представлять собой двух партнеров по клик-химии (например, азид/алкин, которые реагируют с образованием триазольной связи). [0062] In some embodiments, the linking element can be linked to a binding partner via a chemical reaction or covalently bonded to a binding partner on a solid support, thereby covalently linking the transposome complex to the solid support. In some aspects, the binding element/binding partner combination comprises or is an amine/carboxylic acid (eg, binding via a standard peptide coupling reaction under conditions known to one of skill in the art, such as EDC or NHS-mediated binding). The reaction of the two components connects the linking element to the linking partner via an amide bond. In an alternative embodiment, the linker and the linker may be two click chemistry partners (eg, an azide/alkyne that react to form a triazole bond).
[0063] В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид присоединения также включает дополнительные последовательности или компоненты, такие как универсальная последовательность, спейсерная область, якорная последовательность или последовательность индексированной метки, или их комбинацию. Универсальная последовательность представляет собой область нуклеотидной последовательности, которая является общей для двух или более фрагментов нуклеиновых кислот. Необязательно два или более фрагментов нуклеиновых кислот также имеют области различий последовательности. Универсальная последовательность, которая может присутствовать в разных членах множества фрагментов нуклеиновых кислот, может обеспечивать репликацию или амплификацию множества разных последовательностей с использованием одного универсального праймера, комплементарного универсальной последовательности. [0063] In some embodiments, the attachment polynucleotide also includes additional sequences or components, such as a universal sequence, a spacer region, an anchor sequence, or an indexed tag sequence, or a combination thereof. A universal sequence is a region of a nucleotide sequence that is common to two or more nucleic acid fragments. Optionally, two or more nucleic acid fragments also have regions of sequence differences. A universal sequence that may be present in different members of a plurality of nucleic acid fragments may allow for the replication or amplification of a plurality of different sequences using a single universal primer that is complementary to the universal sequence.
[0064] В некоторых вариантах осуществления первый транспозон дополнительно содержит 5’-праймерную последовательность 5’-адаптерной последовательности, а полинуклеотид присоединения содержит (i) часть, комплементарную 5’-адаптерной последовательности и гибридизованную с ней, и (ii) комплементарную праймерную последовательность (см. Фиг. 4A, универсальные гранулы с единичным индексированием). Такие конструкции можно применять в качестве универсальных микроносителей в областях применения с единичным индексированием, поскольку отсутствует последовательность индексной метки. [0064] In some embodiments, the first transposon further comprises a 5' primer sequence of the 5' adapter sequence, and the attachment polynucleotide comprises (i) a portion complementary to and hybridized to the 5' adapter sequence, and (ii) a complementary primer sequence ( see Fig. 4A, universal granules with single indexing). Such constructs can be used as general purpose microcarriers in single indexing applications because there is no index mark sequence.
[0065] В некоторых вариантах осуществления первый транспозон дополнительно содержит 5’-праймерную последовательность 5’-адаптерной последовательности, а полинуклеотид присоединения содержит последовательность индексной метки и праймерную последовательность (см., например, Фиг. 4A, индексированные гранулы с единичным индексированием). [0065] In some embodiments, the first transposon further comprises a 5' primer sequence of a 5' adapter sequence and the attachment polynucleotide comprises an index tag sequence and a primer sequence (see, e.g., Fig. 4A, single indexing beads).
[0066] В некоторых вариантах осуществления первый транспозон содержит 5’-адаптерную последовательность, а полинуклеотид присоединения содержит (i) часть, комплементарную 5’-адаптерной последовательности и гибридизованную с ней, (ii) спейсерную область и (iii) праймерную последовательность (см. Фиг. 4A, универсальные гранулы, двойное индексирование). [0066] In some embodiments, the first transposon comprises a 5' adapter sequence, and the attachment polynucleotide comprises (i) a portion complementary to and hybridized to the 5' adapter sequence, (ii) a spacer region, and (iii) a primer sequence (see Fig. 4A, universal beads, double indexing).
[0067] В некоторых вариантах осуществления второй транспозон содержит 3’-адаптерную последовательность, а полинуклеотид присоединения содержит (i) часть, комплементарную 3’-адаптерной последовательности и гибридизованную с ней, (ii) последовательность индексной метки и (iii) праймерную последовательность (см. Фиг. 4A, двойное индексирование, индексированные гранулы). [0067] In some embodiments, the second transposon comprises a 3' adapter sequence, and the attachment polynucleotide comprises (i) a portion complementary to and hybridized to the 3' adapter sequence, (ii) an index tag sequence, and (iii) a primer sequence (see Fig. 4A, double indexing, indexed beads).
[0068] В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид присоединения содержит спейсерную область (см. например, Фиг. 4A) или спейсерную область и якорную область (см. например, Фиг. 3). В настоящем документе «спейсерная область» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, не содержащую никакой структурной или кодирующей информации для известных функций гена. Спейсерная область на полинуклеотиде присоединения способна выравниваться с индексирующими олигонуклеотидами с различными последовательностями (например, с диапазоном последовательностей i5). В некоторых вариантах осуществления спейсерная область представляет собой универсальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область представляет собой спейсер, отличный от ДНК. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область включает универсальные основания, такие как инозины или нитроиндолы. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает линкер sp18. В настоящем документе линкер sp18 представляет собой стандартный модифицирующий линкер со спейсером С18 (18-атомный гекса-этиленгликолевый спейсер), который эквивалентен 4 парам оснований по длине. Таким образом, линкер 2 x sp18 эквивалентен по длине 8 парам оснований. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит синтетический линкер 2 x sp18. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит один или более спейсеров С18, например 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более спейсеров С18. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит два спейсера С18 (длина которых эквивалентна 8 нуклеотидам). В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой спейсер C9, эквивалентный по длине 2 парам оснований. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит один или более спейсеров C9 (триэтиленгликолевый спейсер), например 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более спейсеров C9. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой стандартный спейсер, применяемый с существующими индексами, такой как спейсер по 10 паре оснований. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область представляет собой комбинацию спейсеров, например комбинацию одного или более спейсеров С18 и одного или более спейсеров С9 или любую комбинацию любых спейсеров, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область имеет длину, эквивалентную 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 или 30 парам оснований. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область имеет длину, приблизительно эквивалентную 8 или 10 парам оснований или нуклеотидам. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область специфически была такой же длины, что и индексная область. В некоторых вариантах осуществления индексные области имеют длину 8 нуклеотидов, а спейсерная область содержит два спейсера С18. В некоторых вариантах осуществления индексные области имеют длину 10 нуклеотидов, а спейсерная область содержит два спейсера С18 и один спейсер C9. [0068] In some embodiments, the attachment polynucleotide comprises a spacer region (see, for example, Fig. 4A) or a spacer region and an anchor region (see, for example, Fig. 3). As used herein, a "spacer region" is a nucleic acid sequence that does not contain any structural or coding information for the known functions of a gene. The spacer region on the attachment polynucleotide is capable of aligning with indexing oligonucleotides of different sequences (eg, i5 sequence range). In some embodiments, the implementation of the spacer region is a universal sequence. In some embodiments, the spacer region is a spacer other than DNA. In some embodiments, the spacer region includes universal bases such as inosines or nitroindoles. In some embodiments, the spacer includes an sp18 linker. As used herein, the sp18 linker is a standard modifier linker with a C18 spacer (18 atom hexaethylene glycol spacer) which is equivalent to 4 base pairs in length. Thus, a 2 x sp18 linker is equivalent in length to 8 base pairs. In some embodiments, the spacer region contains a 2 x sp18 synthetic linker. In some embodiments, the spacer region contains one or more C18 spacers, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more C18 spacers. In some embodiments, the spacer region contains two C18 spacers (equivalent to 8 nucleotides in length). In some embodiments, the spacer is a C9 spacer equivalent in length to 2 base pairs. In some embodiments, the spacer region comprises one or more C9 spacers (triethylene glycol spacer), such as 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more C9 spacers. In some embodiments, the spacer is a standard spacer used with existing indexes, such as a 10 bp spacer. In some embodiments, the spacer region is a combination of spacers, such as a combination of one or more C18 spacers and one or more C9 spacers, or any combination of any of the spacers described herein. In some embodiments, the spacer region has a length equivalent to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, or 30 base pairs. In some embodiments, the spacer region has a length approximately equivalent to 8 or 10 base pairs or nucleotides. In some embodiments, the spacer region was specifically the same length as the index region. In some embodiments, the index regions are 8 nucleotides in length and the spacer region contains two C18 spacers. In some embodiments, the index regions are 10 nucleotides in length and the spacer region contains two C18 spacers and one C9 spacer.
[0069] В некоторых аспектах полинуклеотид присоединения содержит якорную последовательность. В некоторых вариантах осуществления якорная последовательность представляет собой GGATATGCTCGG (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления якорная последовательность представляет собой последовательность A14 (SEQ ID NO: 4). В контексте настоящего документа «якорная область» означает последовательность ДНК, которая комплементарна области комплемента якоря в индексирующем олигонуклеотиде и которая обеспечивает гибридизацию двух компонентов (см. например, Фиг. 3B). В некоторых аспектах якорная область комплементарна участку области комплемента якоря индексирующего олигонуклеотида, причем индексирующий олигонуклеотид содержит комплементарную область якоря и последовательность индексной метки (--якорь’ - последовательность индексной метки -). В некоторых вариантах осуществления якорная последовательность комплементарна области комплемента якоря, общей для множества индексирующих олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления каждая последовательность индексной метки во множестве индексирующих олигонуклеотидов является одинаковой (без индексирования) или разной (с индексированием). В некоторых вариантах осуществления последовательность индексной метки представляет собой последовательность i5. Полинуклеотид присоединения может дополнительно включать дополнительные элементы последовательности или компоненты для повышения эффективности и функциональности полинуклеотида присоединения для связывания с индексами, включая, например, праймерные последовательности, якорные последовательности, универсальные последовательности, спейсерные области, индексные последовательности, последовательности захвата, последовательности банка данных, последовательности отщепления, последовательности, связанные с секвенированием, и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид присоединения содержит последовательность A14’. [0069] In some aspects, the attachment polynucleotide contains an anchor sequence. In some embodiments, the anchor sequence is GGATATGCTCGG (SEQ ID NO: 22). In some embodiments, the anchor sequence is an A14 sequence (SEQ ID NO: 4). In the context of this document, "anchor region" means a DNA sequence that is complementary to the complement region of the anchor in the indexing oligonucleotide and that allows hybridization of the two components (see, for example, Fig. 3B). In some aspects, the anchor region is complementary to a portion of the complement region of the anchor of the indexing oligonucleotide, wherein the indexing oligonucleotide comprises the complementary region of the anchor and an index tag sequence (--anchor' - index tag sequence -). In some embodiments, the anchor sequence is complementary to the complement region of the anchor that is common to multiple indexing oligonucleotides. In some embodiments, each index tag sequence in a plurality of indexing oligonucleotides is the same (no indexing) or different (with indexing). In some embodiments, the index mark sequence is an i5 sequence. The attachment polynucleotide may further include additional sequence elements or components to enhance the efficiency and functionality of the attachment polynucleotide for binding to indexes, including, for example, primer sequences, anchor sequences, universal sequences, spacer regions, index sequences, capture sequences, data bank sequences, cleavage sequences , sequences associated with sequencing, and combinations thereof. In some embodiments, the attachment polynucleotide contains the sequence A14'.
[0070] Могут быть реализованы варианты комплекса транспосомы, включая транспозазу, транспозоны и полинуклеотид присоединения. Например, могут быть реализованы варианты конфигурации, конструкции, гибридизации, структурных элементов и общего расположения комплекса транспосомы. В описании и графических материалах, представленных в настоящем документе, представлены несколько вариантов, но следует понимать, что могут быть легко реализованы дополнительные варианты в пределах объема настоящего описания изобретения. [0070] Variants of the transposome complex can be implemented, including transposase, transposons, and polynucleotide attachment. For example, variations in configuration, design, hybridization, building blocks, and general arrangement of the transposome complex can be implemented. In the description and drawings presented herein, several options are presented, but it should be understood that additional options can be easily implemented within the scope of the present description of the invention.
7.5. Твердая подложка7.5. Solid backing
[0071] Термины «твердая поверхность»,«твердая подложка» и другие грамматические эквиваленты относятся к любому материалу, подходящему или выполненному с возможностью присоединения комплексов транспосом. Как будет понятно специалистам в данной области, количество возможных подложек является широким. Возможные подложки включают в себя без ограничения стекло и модифицированное или функционализированное стекло, пластмассы (включая акрилы, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, тефлон и т. п.), полисахариды, материалы на основе полиэдрического органического силсесквиоксана (POSS), нейлон или нитроцеллюлозу, керамику, смолы, кремнезем или материалы на основе кремнезема, в том числе кремний и модифицированный кремний, углерод, металлы, неорганические стекла, пластмассы, волоконно-оптические жгуты, гранулы, парамагнитные гранулы и множество других полимеров. [0071] The terms "solid surface", "solid support" and other grammatical equivalents refer to any material suitable for or capable of attaching transposome complexes. As will be appreciated by those skilled in the art, the number of possible substrates is wide. Possible substrates include, without limitation, glass and modified or functionalized glass, plastics (including acrylics, polystyrene and copolymers of styrene and other materials, polypropylene, polyethylene, polybutylene, polyurethanes, Teflon, etc.), polysaccharides, materials based on polyhedral organic silsesquioxane (POSS), nylon or nitrocellulose, ceramics, resins, silica or silica-based materials, including silicon and modified silicon, carbon, metals, inorganic glasses, plastics, fiber optic bundles, granules, paramagnetic granules, and many other polymers .
[0072] Подходящие композиции на основе гранул включают без ограничения пластмассы, керамику, стекло, полистирол, метилстирол, акриловые полимеры, парамагнитные материалы, золь тория, углерод в форме графита, диоксид титана, латекс или сшитый декстран, такой как сефароза, целлюлоза, нейлон, поперечносшитые мицеллы и тефлон, а также любые другие материалы, описанные в настоящем документе применительно к твердым подложкам. В определенных вариантах осуществления микросферы представляют собой магнитные микросферы или гранулы, например парамагнитные частицы, сферы или гранулы. Гранулы не обязательно должны быть сферическими; можно применять частицы неправильной формы. В качестве альтернативы или дополнительно гранулы могут быть пористыми. Размеры гранул варьируют от нанометров, например 100 нМ, до миллиметров, например 1 мМ, предпочтительно от 0,2 микрон до 200 микрон и особенно предпочтительно от 0,5 до 5 микрон, несмотря на то, что в некоторых вариантах осуществления можно применять гранулы меньшего или большего размера. Гранула может быть покрыта партнером по связыванию, например, гранула может быть покрыта стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой парамагнитные гранулы, покрытые стрептавидином, например гранулы Dynabeads MyOne streptavidin C1 (Thermo Scientific, № по кат. 65601), парамагнитные частицы стрептавидина (Promega, № по кат. Z5481), магнитные гранулы стрептавидина (NEB, № по кат. S1420S) и MaxBead Streptavidin (Abnova, № по кат. U0087). Твердая подложка также может представлять собой предметное стекло, например проточную кювету или иное предметное стекло, измененное таким образом, чтобы на нем можно было иммобилизовать комплекс транспосом. [0072] Suitable granular compositions include, without limitation, plastics, ceramics, glass, polystyrene, methylstyrene, acrylic polymers, paramagnetic materials, thorium sol, carbon in the form of graphite, titanium dioxide, latex, or cross-linked dextran such as sepharose, cellulose, nylon , cross-linked micelles and Teflon, as well as any other materials described in this document in relation to solid substrates. In certain embodiments, the microspheres are magnetic microspheres or beads, such as paramagnetic particles, spheres or beads. The granules need not be spherical; irregularly shaped particles can be used. Alternatively or additionally, the granules may be porous. Bead sizes range from nanometers, such as 100 nM, to millimeters, such as 1 mM, preferably from 0.2 microns to 200 microns, and particularly preferably from 0.5 to 5 microns, although in some embodiments smaller beads can be used. or larger. The bead may be coated with a binding partner, for example the bead may be coated with streptavidin. In some embodiments, the beads are streptavidin-coated paramagnetic beads, e.g., Dynabeads MyOne streptavidin C1 beads (Thermo Scientific, cat. no. 65601), streptavidin paramagnetic beads (Promega, cat. no. Z5481), streptavidin magnetic beads (NEB, cat. no. S1420S) and MaxBead Streptavidin (Abnova, Cat. No. U0087). The solid support may also be a glass slide, such as a flow cell or other glass slide, modified so that the transposome complex can be immobilized on it.
[0073] В некоторых вариантах осуществления партнер по связыванию присутствует на твердой подложке или грануле с плотностью от 1000 до около 6000 пМоль/мг, или от около 2000 до около 5000 пМоль/мг, или от около 3000 до около 5000 пМоль/мг, или от около 3500 до около 4500 пМоль/мг. [0073] In some embodiments, the binding partner is present on a solid support or bead at a density of 1000 to about 6000 pmol/mg, or about 2000 to about 5000 pmol/mg, or about 3000 to about 5000 pmol/mg, or from about 3500 to about 4500 pmol/mg.
[0074] В одном варианте осуществления твердая поверхность представляет собой внутреннюю поверхность пробирки для образца. В другом варианте осуществления твердая поверхность представляет собой мембрану для захвата. В одном примере мембрана для захвата представляет собой мембрану, захватывающую биотин (например, поставляемую компанией Promega Corporation). В другом примере мембрана для захвата представляет собой фильтровальную бумагу. В некоторых вариантах осуществления настоящего описания твердые подложки, состоящие из инертного субстрата или матрицы (например, стеклянных предметных стекол, полимерных гранул и т. д.), которые были функционализированы, например, посредством нанесения слоя или покрытия из промежуточного материала, содержащего реакционноспособные группы, которые обеспечивают ковалентное присоединение к молекулам, таким как полинуклеотиды. Примеры таких подложек включают без ограничения полиакриламидные гидрогели, нанесенные на инертный субстрат, такой как стекло, в частности, полиакриламидные гидрогели, описанные в WO2005/065814 и US2008/0280773, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Способы тагментации (фрагментирования и нанесения метки) ДНК на твердой поверхности для конструирования меченой библиотеки ДНК описаны в WO2016/189331 и US2014/0093916A1, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе комплекс транспосом иммобилизован на твердой подложке посредством связывающего элемента. В некоторых таких вариантах осуществления твердая подложка содержит стрептавидин в качестве партнера по связыванию, а связывающий элемент представляет собой биотин. [0074] In one embodiment, the hard surface is the inner surface of the sample tube. In another embodiment, the hard surface is a capture membrane. In one example, the capture membrane is a biotin capture membrane (eg, available from Promega Corporation). In another example, the capture membrane is filter paper. In some embodiments of the present disclosure, solid supports composed of an inert substrate or matrix (e.g., glass slides, polymer beads, etc.) that have been functionalized, for example, by applying a layer or coating of an intermediate material containing reactive groups, which provide covalent attachment to molecules such as polynucleotides. Examples of such supports include, without limitation, polyacrylamide hydrogels supported on an inert substrate such as glass, in particular the polyacrylamide hydrogels described in WO2005/065814 and US2008/0280773, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. Methods for tagging (fragmenting and labeling) DNA on a solid surface to construct a labeled DNA library are described in WO2016/189331 and US2014/0093916A1, which are incorporated herein by reference in their entirety. In some embodiments, the transposome complex described herein is immobilized on a solid support by means of a binding element. In some such embodiments, the solid support contains streptavidin as a binding partner and the binding element is biotin.
[0075] В некоторых вариантах осуществления комплексы транспосом иммобилизованы на твердой подложке, такой как гранулы, с определенной плотностью или с диапазоном плотностей. В некоторых вариантах осуществления плотность комплексов на твердой подложке относится к концентрации комплексов транспосом в растворе в ходе реакции иммобилизации. Плотность комплекса предполагает, что реакция иммобилизации является количественной. После образования комплексов с конкретной плотностью данная плотность остается постоянной для партии связанных с поверхностью комплексов транспосом. Полученные гранулы могут быть разведены, и полученная концентрация комплексов в разбавленном растворе представляет собой полученную плотность гранул, разделенную на коэффициент разбавления. Маточные растворы разбавленных гранул сохраняют плотность комплекса при их получении, но комплексы присутствуют в более низкой концентрации в разбавленном растворе. На стадии разбавления плотность комплексов на гранулах не изменяется и, следовательно, влияет на выход библиотеки, но не на размер вставки (фрагмента). В некоторых вариантах осуществления плотность составляет от около 5 нМ до около 1000 нМ, или от около 5 до 150 нМ, или от около 10 нМ до 800 нМ. В других вариантах осуществления плотность составляет около 10 нМ, или около 25 нМ, или около 50 нМ, или около 100 нМ, или около 200 нМ, или около 300 нМ, или около 400 нМ, или около 500 нМ, или около 600 нМ, или около 700 нМ, или около 800 нМ, или около 900 нМ, или около 1000 нМ. В некоторых вариантах осуществления плотность составляет приблизительно 100 нМ. В некоторых вариантах осуществления плотность составляет приблизительно 300 нМ. В некоторых вариантах осуществления плотность составляет приблизительно 600 нМ. В некоторых вариантах осуществления плотность составляет приблизительно 800 нМ. В некоторых вариантах осуществления плотность составляет приблизительно 100 нМ. В некоторых вариантах осуществления плотность составляет приблизительно 1000 нМ. [0075] In some embodiments, transposome complexes are immobilized on a solid support, such as beads, at a specific density or range of densities. In some embodiments, the density of complexes on a solid support refers to the concentration of transposome complexes in solution during the immobilization reaction. The density of the complex suggests that the immobilization reaction is quantitative. After the formation of complexes with a particular density, this density remains constant for a batch of surface-bound transposome complexes. The resulting granules can be diluted and the resulting concentration of complexes in the dilute solution is the resulting density of the granules divided by the dilution factor. The stock solutions of the dilute granules retain the density of the complex when they are prepared, but the complexes are present at a lower concentration in the dilute solution. During the dilution step, the density of the complexes on the beads does not change and therefore affects the yield of the library, but not the size of the insert (fragment). In some embodiments, the density is from about 5 nM to about 1000 nM, or from about 5 nM to 150 nM, or from about 10 nM to 800 nM. In other embodiments, the density is about 10 nM, or about 25 nM, or about 50 nM, or about 100 nM, or about 200 nM, or about 300 nM, or about 400 nM, or about 500 nM, or about 600 nM, or about 700 nM, or about 800 nM, or about 900 nM, or about 1000 nM. In some embodiments, the implementation of the density is approximately 100 nm. In some embodiments, the implementation of the density is approximately 300 nm. In some embodiments, the density is about 600 nM. In some embodiments, the implementation of the density is approximately 800 nm. In some embodiments, the implementation of the density is approximately 100 nm. In some embodiments, the implementation of the density is approximately 1000 nm.
[0076] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к набору, включающему в себя комплекс транспосом, как описано в настоящем документе, и смесь индексов, содержащую индексные последовательности. Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к набору, включающему в себя композицию, имеющую твердую подложку с иммобилизованным на ней комплексом транспосом, как описано в настоящем документе, и смесь индексов, содержащую индексные последовательности. В некоторых вариантах осуществления смесь индексов содержит последовательности индексов i5 и последовательности индексов i7, причем последовательности индексов i5 комплементарны полинуклеотиду присоединения и гибридизуются с ним, и причем последовательности индексов i7 комплементарны 3’-адаптерной последовательности и гибридизуются с ней. [0076] Some embodiments provided herein relate to a kit including a transposome complex as described herein and an index mixture containing index sequences. Some embodiments provided herein relate to a kit comprising a composition having a solid support with a transposome complex immobilized thereon, as described herein, and an index mixture containing index sequences. In some embodiments, the index mixture comprises i5 index sequences and i7 index sequences, wherein the i5 index sequences are complementary to and hybridizes to the access polynucleotide, and wherein the i7 index sequences are complementary to and hybridize to the 3' adapter sequence.
7.6. Иммобилизованные комплексы транспосом/способы образования фрагментов нуклеиновых кислот с нанесенной меткой7.6. Immobilized Transposome Complexes/Methods for Generating Labeled Nucleic Acid Fragments
[0077] В настоящем описании дополнительно предложены способы получения иммобилизованных комплексов транспосом, как описано в настоящем документе. Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способу создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение твердой подложки, имеющей иммобилизованный на ней комплекс транспосом, нанесение целевой нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты на множество целевых фрагментов и присоединения 3’-конца первого транспозона к 5’-концам целевых фрагментов для получения множества 5’-меченных целевых фрагментов, и применение смеси индексов, содержащей индексные последовательности, для активации библиотеки для секвенирования. В некоторых вариантах осуществления комплекс транспосом включает транспозазу, связанную с первым и вторым транспозоном, первый транспозон, содержащий 3’-концевую последовательность транспозона и 5’-адаптерную последовательность, полинуклеотид присоединения, содержащий адаптерную последовательность присоединения и связывающий элемент, и второй транспозон, содержащий 5’-концевую последовательность транспозона и 3’-адаптерную последовательность. [0077] The present disclosure further provides methods for preparing immobilized transposome complexes as described herein. Some embodiments provided herein relate to a method for generating a library of labeled nucleic acid fragments. In some embodiments, the method includes providing a solid support having a transposome complex immobilized thereon, applying a target nucleic acid to the solid support under conditions sufficient to fragment the target nucleic acid into a plurality of target fragments and attach the 3' end of the first transposon to the 5' ends. target fragments to obtain a plurality of 5'-labeled target fragments, and using an index mixture containing the index sequences to activate the library for sequencing. In some embodiments, the transposome complex includes a transposase associated with a first and a second transposon, a first transposon containing a 3' transposon sequence and a 5' adapter sequence, an attachment polynucleotide containing an attachment adapter sequence and a binding element, and a second transposon containing 5 the '-terminal sequence of the transposon; and the 3'-adapter sequence.
[0078] В некоторых вариантах осуществления способ включает создание библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот, включающее приведение целевой нуклеиновой кислоты в контакт с множеством иммобилизованных комплексов транспосом, как описано в настоящем документе, в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты во множество целевых фрагментов и для присоединения 3’-конца первого транспозона к 5’-концам целевых фрагментов с получением множества 5’-меченных целевых фрагментов. [0078] In some embodiments, the method includes generating a library of labeled nucleic acid fragments, comprising contacting a target nucleic acid with a plurality of immobilized transposome complexes, as described herein, under conditions sufficient to fragment the target nucleic acid into a plurality of target fragments and to attaching the 3' end of the first transposon to the 5' ends of the target fragments to obtain a plurality of 5' labeled target fragments.
[0079] В некоторых аспектах способ дополнительно включает следующее: обработка твердой подложки для удаления несвязанных нуклеиновых кислот; или обработка твердой подложки с удалением транспозазы из комплекса, необязательно посредством (a) нагревания твердой подложки и/или (b) промывки твердой подложки ферментным денатурирующим средством, причем ферментное денатурирующее средство необязательно содержит додецилсульфат натрия (SDS), гидрохлорид гуанидина, мочевину или протеиназу. [0079] In some aspects, the method further includes: treating the solid support to remove unbound nucleic acids; or treating the solid support to remove the transposase from the complex, optionally by (a) heating the solid support and/or (b) washing the solid support with an enzymatic denaturant, the enzymatic denaturant optionally containing sodium dodecyl sulfate (SDS), guanidine hydrochloride, urea, or proteinase.
[0080] В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт включает в себя добавление биологического образца к комплексу транспосомы. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит клеточный лизат или цельные клетки или его выбирают из крови, плазмы, сыворотки, лимфы, слизи, мокроты, мочи, спермы, спинномозговой жидкости, бронхиальной аспирации, фекалий, мацерированной ткани и фиксированной ткани FFPE. [0080] In some embodiments, bringing into contact includes adding a biological sample to the transposome complex. In some embodiments, the biological sample contains a cell lysate or whole cells, or is selected from blood, plasma, serum, lymph, mucus, sputum, urine, semen, cerebrospinal fluid, bronchial aspiration, feces, macerated tissue, and fixed FFPE tissue.
[0081] В некоторых аспектах приведение в контакт дополнительно включает гибридизацию множества индексирующих олигонуклеотидов с полинуклеотидами крепления, причем множество индексирующих олигонуклеотидов содержит одинаковые или разные индексные последовательности. [0081] In some aspects, contacting further comprises hybridizing a plurality of index oligonucleotides to anchor polynucleotides, wherein the plurality of index oligonucleotides contain the same or different index sequences.
[0082] В некоторых аспектах способ дополнительно включает обработку множества 5’-меченых целевых фрагментов полимеразой и лигазой для удлинения и лигирования цепей с получением полностью двухцепочечных меченых фрагментов. В некоторых аспектах обработку полимеразой и лигазой выполняют в присутствии средства разрушения вторичной структуры ДНК, причем средство разрушения необязательно представляет собой ДМСО. В некоторых аспектах обработку полимеразой и лигазой проводят в присутствии олигонуклеотида, который комплементарен праймерной последовательности, причем олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид P7’, а праймерная последовательность представляет собой последовательность P7. В некоторых вариантах осуществления полимераза содержит мутант ДНК-полимеразы Т4, не имеющий экзонуклеазной активности. [0082] In some aspects, the method further comprises treating the plurality of 5'-labeled target fragments with polymerase and ligase to extend and ligate the chains to produce fully double-stranded labeled fragments. In some aspects, the polymerase and ligase treatment is performed in the presence of a DNA secondary structure disruptor, the disruptor being optionally DMSO. In some aspects, the polymerase and ligase treatment is carried out in the presence of an oligonucleotide that is complementary to the primer sequence, wherein the oligonucleotide is a P7' oligonucleotide and the primer sequence is a P7 sequence. In some embodiments, the polymerase comprises a T4 DNA polymerase mutant lacking exonuclease activity.
[0083] В некоторых аспектах способ дополнительно включает удаление из твердой подложки полностью двухцепочечных меченых фрагментов. В некоторых аспектах удаление включает применение нагревания и/или денатурирующего вещества, достаточного для отщепления полностью двухцепочечных меченых фрагментов от твердой подложки. [0083] In some aspects, the method further comprises removing fully double-stranded labeled fragments from the solid support. In some aspects, removal includes the application of heat and/or a denaturant sufficient to cleave fully double-stranded labeled fragments from the solid support.
[0084] В некоторых аспектах способ дополнительно включает секвенирование одного или более 5’-меченных целевых фрагментов полностью двухцепочечных меченых фрагментов. В некоторых аспектах фрагменты не определяют количественно с помощью ПЦР после приведения в контакт и до секвенирования. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК. В некоторых аспектах 3’-адаптерная последовательность комплементарна по меньшей мере участку индексной адаптерной последовательности. В некоторых аспектах праймерная последовательность полинуклеотида присоединения комплементарна по меньшей мере части индексной праймерной последовательности. В некоторых аспектах праймерная последовательность полинуклеотида присоединения комплементарна праймерной последовательности показателя индексирующего полинуклеотида. [0084] In some aspects, the method further comprises sequencing one or more 5'-labeled target fragments of fully double-stranded labeled fragments. In some aspects, fragments are not quantified by PCR after contact and prior to sequencing. In some aspects, the nucleic acid is DNA or RNA. In some aspects, the 3' adapter sequence is complementary to at least a portion of the index adapter sequence. In some aspects, the primer sequence of the accession polynucleotide is complementary to at least a portion of the index primer sequence. In some aspects, the primer sequence of the polynucleotide of the accession is complementary to the primer sequence of the index of the indexing polynucleotide.
[0085] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает промывку твердой подложки с удалением несвязанных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает обработку твердой подложки с удалением транспозазы. В некоторых вариантах осуществления обработка твердой подложки включает промывку твердой подложки ферментативным денатурирующим средством. В некоторых вариантах осуществления ферментативное денатурирующее средство включает в себя уксусную кислоту, диметилсульфоксид (ДМСО), дитиотреитол, этанол, формальдегид, формамид, глутаральдегид, гидрохлорид гуанидина, перхлорат лития, меркаптоэтанол, пропиленгликоль, протеиназу, бикарбонат натрия, додецилсульфат натрия (SDS), салицилат натрия, сульфосалициловую кислоту, трихлоруксусную кислоту, трис(2-карбоксиэтил)фосфин) (TCEP) или мочевину. В некоторых вариантах осуществления обработка твердой подложки включает нагревание твердой подложки с удалением транспозазы. В некоторых вариантах осуществления применение целевой нуклеиновой кислоты включает смешивание биологического образца с комплексом транспосомы. Нуклеиновая кислота не обязательно должна быть полностью очищена или очищена вообще, и может представлять собой часть биологического образца или смеси с белком, другими видами нуклеиновых кислот, другими клеточными компонентами и/или любыми другими загрязнителями. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает в себя клеточный лизат. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает в себя цельные клетки. В некоторых вариантах осуществления биологический образец выбирают из биологической жидкости, крови, плазмы, сыворотки, лимфы, слизи, мокроты, мочи, спермы, спинномозговой жидкости, бронхиальной аспирации, фекалий, мацерированной ткани и фиксированной ткани, зафиксированной в формалине залитой парафином ткани (FFPE). [0085] In some embodiments, the method further comprises washing the solid support to remove unbound nucleic acids. In some embodiments, the method further comprises treating the solid support to remove the transposase. In some embodiments, treating the solid support includes washing the solid support with an enzymatic denaturant. In some embodiments, the enzymatic denaturant includes acetic acid, dimethyl sulfoxide (DMSO), dithiothreitol, ethanol, formaldehyde, formamide, glutaraldehyde, guanidine hydrochloride, lithium perchlorate, mercaptoethanol, propylene glycol, proteinase, sodium bicarbonate, sodium dodecyl sulfate (SDS), salicylate sodium, sulfosalicylic acid, trichloroacetic acid, tris(2-carboxyethyl)phosphine) (TCEP) or urea. In some embodiments, treating the solid support includes heating the solid support to remove the transposase. In some embodiments, the use of the target nucleic acid comprises mixing the biological sample with the transposome complex. The nucleic acid need not be completely purified or purified at all, and may be part of a biological sample or admixture with protein, other types of nucleic acids, other cellular components, and/or any other contaminants. In some embodiments, the biological sample includes a cell lysate. In some embodiments, the biological sample includes whole cells. In some embodiments, the biological sample is selected from a biological fluid, blood, plasma, serum, lymph, mucus, sputum, urine, semen, cerebrospinal fluid, bronchial aspiration, feces, macerated tissue, and fixed tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue (FFPE) .
[0086] В некоторых вариантах осуществления нанесение смеси индексов включает в себя гибридизацию индексной последовательности с полинуклеотидом присоединения и вторым транспозоном. В некоторых вариантах осуществления смесь индексов включает смесь для интенсивного лигирования (ELM). В некоторых вариантах осуществления ELM содержит полимеразу и лигазу. В некоторых вариантах осуществления ELM представляет собой разделенную ELM для лигирования индексов. В некоторых вариантах осуществления полимераза включает ДНК-полимеразу Т4 или ее мутант (например, ДНК-полимеразу Т4 без экзонуклеазной активности, или мутантную ДНК-полимеразу Т4, или мутантную ДНК-полимеразу Т4 без экзонуклеазной активности). В некоторых вариантах осуществления лигаза содержит ДНК-лигазу E. coli. В некоторых вариантах осуществления реакцию удлинения и лигирования проводят в присутствии средства разрушения вторичной структуры ДНК, такого как ДМСО. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает денатурацию множества 5’-меченных целевых фрагментов из твердой подложки. В некоторых вариантах осуществления денатурация может быть достигнута посредством применения нагревания и/или денатурирующего вещества, достаточного для отщепления меченных 5’-целевых фрагментов от твердой подложки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает секвенирование одного или более из 5’-меченных целевых фрагментов или продуктов их лигирования. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК. [0086] In some embodiments, applying a mixture of indices includes hybridizing the index sequence to an attachment polynucleotide and a second transposon. In some embodiments, the index mixture includes an intensive ligation mixture (ELM). In some embodiments, the ELM contains a polymerase and a ligase. In some embodiments, the ELM is a split ELM for index ligation. In some embodiments, the polymerase comprises a T4 DNA polymerase or a mutant thereof (eg, a T4 DNA polymerase without exonuclease activity, or a mutant T4 DNA polymerase, or a mutant T4 DNA polymerase without exonuclease activity). In some embodiments, the ligase comprises E. coli DNA ligase. In some embodiments, the extension and ligation reaction is carried out in the presence of a DNA secondary structure disruptor such as DMSO. In some embodiments, the method further comprises denaturing a plurality of 5' labeled target fragments from the solid support. In some embodiments, denaturation can be achieved by applying heat and/or a denaturant sufficient to cleave the labeled 5' target moieties from the solid support. In some embodiments, the method further comprises sequencing one or more of the 5' labeled target fragments or their ligation products. In some embodiments, the nucleic acid is DNA or RNA.
[0087] В некоторых аспектах такие способы включают приведение в контакт первого и второго транспозонов, как описано в настоящем документе, с полинуклеотидом присоединения, связанным с поверхностью, в условиях, подходящих для гибридизации полинуклеотида присоединения с первым или вторым транспозоном. В некоторых аспектах способы получения связанного с твердой подложкой комплекса транспосомы включают инкубацию комплекса транспосомы, как описано в настоящем документе, с твердой подложкой, содержащей партнера по связыванию, в условиях, достаточных для связывания (ковалентного или нековалентного) связывающего элемента с партнером по связыванию. Затем иммобилизованный гибридизованный полинуклеотид, который включает полинуклеотид присоединения и первый и второй транспозоны, приводят в контакт с транспозазой в условиях, подходящих для образования комплекса транспосом. [0087] In some aspects, such methods include contacting the first and second transposons, as described herein, with a surface-bound attachment polynucleotide under conditions suitable for hybridizing the attachment polynucleotide to the first or second transposon. In some aspects, methods for preparing a transposome complex bound to a solid support include incubating the transposome complex, as described herein, with a solid support containing a binding partner under conditions sufficient to bind the (covalent or non-covalent) binding element to the binding partner. The immobilized hybridized polynucleotide, which includes the attachment polynucleotide and the first and second transposons, is then brought into contact with a transposase under conditions suitable for the formation of a transposome complex.
[0088] В некоторых вариантах осуществления первый и второй транспозоны, описанные в настоящем документе, ренатурируют между собой, а первый транспозон ренатурируют с полинуклеотидом присоединения. Затем отожженные полинуклеотиды загружают на транспозазу, такую как транспозаза Tn5, с получением таким образом комплекса транспосом, который затем приводят в контакт и связывают с твердой подложкой, такой как гранула. В некоторых вариантах осуществления отожженные транспозоны связывают с твердой подложкой, такой как гранула, а затем транспозазу связывают в комплекс с транспозонами с получением таким образом транспосомы, которая связывается с твердой подложкой. [0088] In some embodiments, the first and second transposons described herein are annealed to each other, and the first transposon is annealed to an attachment polynucleotide. The annealed polynucleotides are then loaded onto a transposase, such as a Tn5 transposase, thereby obtaining a transposome complex, which is then brought into contact with and bound to a solid support, such as a bead. In some embodiments, the annealed transposons are coupled to a solid support, such as a bead, and then the transposase is complexed with the transposons, thereby producing a transposome that binds to the solid support.
[0089] В некоторых аспектах представлены способы получения фрагментов из целевой нуклеиновой кислоты, включающие получение твердой подложки, содержащей иммобилизованный на ней комплекс транспосом, как описано в настоящем документе; применение целевой нуклеиновой кислоты к твердой подложке в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты во множество целевых фрагментов и для присоединения 3’-конца первого транспозона к 5’-концам целевых фрагментов с получением множества 5’-меченных целевых фрагментов. В некоторых аспектах способ дополнительно включает применение смеси индексов, включающей в себя индексные последовательности. В некоторых вариантах осуществления состояние фрагмента представляет собой состояние, подходящее для тагментации с использованием комплекса транспосом для фрагмента и нанесения метки на целевую нуклеиновую кислоту. [0089] In some aspects, methods for obtaining fragments from a target nucleic acid are provided, including obtaining a solid support containing a transposome complex immobilized thereon, as described herein; applying the target nucleic acid to a solid support under conditions sufficient to fragment the target nucleic acid into a plurality of target fragments and to attach the 3' end of the first transposon to the 5' ends of the target fragments to produce a plurality of 5' labeled target fragments. In some aspects, the method further comprises using an index mixture including index sequences. In some embodiments, the state of the fragment is a state suitable for tagging using the transposome complex for the fragment and labeling the target nucleic acid.
[0090] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в данном документе, после фрагментации и нанесения метки способы дополнительно включают промывку твердой подложки с удалением несвязанных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, после фрагментации и нанесения метки способы дополнительно включают удаление транспозазы. Удаление транспозазы можно осуществлять в химических условиях, таких как промывка твердой подложки средством для удаления транспозазы. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой додецилсульфат натрия (SDS). [0090] In some embodiments of the methods described herein, after fragmentation and labeling, the methods further comprise washing the solid support to remove unbound nucleic acids. In some embodiments of the methods described herein, after fragmentation and labeling, the methods further comprise removing the transposase. Removal of the transposase can be accomplished under chemical conditions, such as washing the solid support with a transposase remover. In some embodiments, the agent is sodium dodecyl sulfate (SDS).
[0091] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение твердой подложки в контакт со смесью индексов. Взаимодействие со смесью индексов служит для нанесения меток на фрагменты с определенным индексом и активации библиотеки для секвенирования. В некоторых вариантах осуществления смесь индексов включает в себя олигонуклеотиды, которые гибридизуются с транспозоном или полинуклеотидом присоединения для нанесения метки или индексирования фрагментов нуклеиновых кислот. Таким образом, например, олигонуклеотид включает в себя индекс, а другие области олигонуклеотида комплементарны транспозону или полинуклеотиду присоединения и гибридизуются с ним. В качестве примера, в одном варианте осуществления индекс i5, имеющий праймерную последовательность (последовательность P5), индексную последовательность (последовательность i5) и якорную последовательность, гибридизуется с полинуклеотидом присоединения в комплементарных последовательностях, так что Р5 гибридизуется с P5’ и якорный участок гибридизуется с якорным участком’. В некоторых вариантах осуществления последовательность i5 связывается с последовательностью нитроиндола (нитро) полинуклеотида присоединения. В некоторых вариантах осуществления нитроиндольная последовательность комплементарна любой индексной последовательности i5 и гибридизуется с ней. В одном варианте осуществления индекс i7, имеющий праймерную последовательность (P7), индексную последовательность (i7) и адаптерную последовательность (последовательность B15), гибридизуется со вторым транспозоном в комплементарных последовательностях, так что P7 гибридизуется с P7’, i7 гибридизуется с i7’, а B15 гибридизуется с B15’. В некоторых вариантах осуществления смесь индексов включает в себя двухцепочечный индекс. После приведения твердой подложки в контакт со смесью индексов фрагменты лигируют и удлиняют с использованием смеси для удлинения и лигирования (ELM). ELM может включать, например, ДНК-полимеразу Т4 и ДНК-лигазу E. coli. Примеры полимераз включают без ограничения крупные фрагменты Bst ДНК-полимеразы I Bst, ДНК-полимеразы I E. coli (фрагмент Klenow), фрагмент Klenow (3′-5′ exо-), ДНК-полимеразы T4, ДНК-полимеразы Т7, Deep VentR. (exo-) ДНК-полимеразы, ДНК-полимеразы Deep VentR, ДНК-полимеразы Therminator II, ДНК-полимеразы AmpliTherm, ДНК-полимеразы SP6 или Taq-полимеразы, или мутанты, аналоги или производные любой из вышеупомянутых полимераз. Примеры лигаз включают без ограничения следующее: ДНК-лигаза Т4, РНК-лигаза Т4, ДНК-лигаза Taq, ДНК-лигаза E. Coli, ДНК-лигаза Pfu и Tth ДНК-лигаза. В некоторых вариантах осуществления ELM представляет собой реакцию расщепленного ELM для обеспечения лигирования индекса и удлинения индекса различных индексов, например, для обеспечения отдельного лигирования i5 и удлинения i7. Затем твердую подложку обрабатывают средством для денатурации последовательностей цепей, например NaOH, с получением таким образом меченых фрагментов нуклеиновых кислот. [0091] In some embodiments, the implementation of the method further includes bringing the solid substrate into contact with a mixture of indices. Interaction with a mixture of indices is used to label fragments with a specific index and activate the library for sequencing. In some embodiments, the index mixture includes oligonucleotides that hybridize to a transposon or attachment polynucleotide to label or index nucleic acid fragments. Thus, for example, the oligonucleotide includes an index, and other regions of the oligonucleotide are complementary to and hybridize to the transposon or attachment polynucleotide. As an example, in one embodiment, an i5 index having a primer sequence (P5 sequence), an index sequence (i5 sequence), and an anchor sequence hybridizes to an attachment polynucleotide in complementary sequences such that P5 hybridizes to P5' and the anchor region hybridizes to the anchor. plot'. In some embodiments, the i5 sequence is linked to a nitroindole (nitro) sequence of an attachment polynucleotide. In some embodiments, the nitroindole sequence is complementary to and hybridizes to any i5 index sequence. In one embodiment, an index i7 having a primer sequence (P7), an index sequence (i7), and an adapter sequence (sequence B15) hybridizes to a second transposon in complementary sequences such that P7 hybridizes to P7', i7 hybridizes to i7', and B15 hybridizes with B15'. In some embodiments, the implementation of the mixture of indices includes a double-stranded index. After bringing the solid support into contact with the index mixture, the fragments are ligated and extended using an extension and ligation mixture (ELM). The ELM may include, for example, T4 DNA polymerase and E. coli DNA ligase. Examples of polymerases include, but are not limited to, large Bst fragments of Bst DNA polymerase I, E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment), Klenow fragment (3'-5'exo-), T4 DNA polymerase, T7 DNA polymerase, Deep VentR . (exo-) DNA polymerase, Deep VentR DNA polymerase, Therminator II DNA polymerase, AmpliTherm DNA polymerase, SP6 DNA polymerase or Taq polymerase, or mutants, analogues or derivatives of any of the aforementioned polymerases. Examples of ligases include, without limitation, the following: T4 DNA ligase, T4 RNA ligase, Taq DNA ligase, E. coli DNA ligase, Pfu DNA ligase, and Tth DNA ligase. In some embodiments, the ELM is a split ELM reaction to provide index ligation and index extension of different indexes, for example, to provide separate i5 ligation and i7 extension. The solid support is then treated with a chain denaturant, such as NaOH, to thereby produce labeled nucleic acid fragments.
[0092] В некоторых вариантах осуществления фрагменты депонируют на проточной кювете. В некоторых вариантах осуществления фрагменты гибридизуют с комплементарными праймерами, привитыми на проточную кювету или поверхность. В некоторых вариантах осуществления последовательности фрагментов секвенирования обнаруживают с помощью секвенирования матрицы или способов секвенирования следующего поколения, таких как секвенирование посредством синтеза. [0092] In some embodiments, fragments are deposited on a flow cell. In some embodiments, the fragments are hybridized to complementary primers grafted onto a flow cell or surface. In some embodiments, the sequences of the sequencing fragments are detected using template sequencing or next generation sequencing methods, such as sequencing by synthesis.
[0093] В таблице 1 представлены примеры последовательностей, применяемых в комплексах транспосом для создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот. [0093] Table 1 provides examples of sequences used in transposome complexes to create a library of labeled nucleic acid fragments.
7.7. Таблица 1: Иллюстративные последовательности7.7. Table 1: Exemplary sequences
[0094] В некоторых аспектах способы создания библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот включают приведение иммобилизованного комплекса транспосомы в контакт с целевой нуклеиновой кислотой в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты на множество целевых фрагментов и присоединения 3’-конца первого транспозона к 5’-концам целевых фрагментов для получения множества 5’-меченных целевых фрагментов; обработку твердой подложки для удаления несвязанных нуклеиновых кислот; или обработку твердой подложки для удаления транспозазы из комплекса, необязательно посредством (a) нагревания твердой подложки и/или (b) мойки твердой подложки ферментативным денатурирующим средством, причем ферментативное денатурирующее средство необязательно содержит додецилсульфат натрия (SDS), гидрохлорид гуанидина, мочевину или протеиназу; обработку множества 5’-меченых целевых фрагментов полимеразой и лигазой для удлинения и лигирования 5’-меченых целевых фрагментов для получения полностью двухцепочечных меченых фрагментов, при этом необязательно обработку полимеразой и лигазой выполняют в присутствии средства разрушения вторичной структуры ДНК, причем средство разрушения необязательно представляет собой ДМСО; удаление полностью двухцепочечных фрагментов с твердой подложки, причем удаление необязательно включает применение нагревания и/или денатурирующего вещества, достаточного для отщепления полностью двухцепочечных меченых фрагментов от твердой подложки, при этом необязательно денатурирующее средство представляет собой NaOH; и отбор полностью двухцепочечных меченых фрагментов с использованием гранул для захвата, при этом необязательно гранулы для захвата представляют собой магнитные микроносители, и при этом необязательно выполнять две отдельные стадии отбора. [0094] In some aspects, methods for creating a library of labeled nucleic acid fragments include bringing the immobilized transposome complex into contact with a target nucleic acid under conditions sufficient to fragment the target nucleic acid into a plurality of target fragments and attach the 3' end of the first transposon to the 5' ends target fragments to obtain multiple 5'-labeled target fragments; treating the solid support to remove unbound nucleic acids; or treating the solid support to remove the transposase from the complex, optionally by (a) heating the solid support and/or (b) washing the solid support with an enzymatic denaturing agent, the enzymatic denaturing agent optionally containing sodium dodecyl sulfate (SDS), guanidine hydrochloride, urea, or proteinase; treatment of a plurality of 5'-labeled target fragments with a polymerase and ligase to extend and ligate the 5'-labeled target fragments to obtain fully double-stranded labeled fragments, optionally the polymerase and ligase treatment is performed in the presence of a DNA secondary structure disruptor, the disruptor optionally being DMSO; removing fully double-stranded fragments from the solid support, the removal optionally comprising the application of heat and/or a denaturant sufficient to cleave the fully double-stranded labeled fragments from the solid support, optionally the denaturing agent being NaOH; and selecting fully double-stranded labeled fragments using capture beads, optionally the capture beads being magnetic microcarriers, and optionally performing two separate selection steps.
[0095] В некоторых вариантах осуществления иммобилизованный комплекс транспосом содержит твердую подложку; и комплекс транспосом, иммобилизованный на твердой подложке, причем комплекс транспосом содержит транспозазу; первый транспозон, содержащий 3’-концевую последовательность транспозона и якорную последовательность (якорь); второй транспозон, содержащий 5’-концевую последовательность транспозона и последовательность B15’; и полинуклеотид присоединения, содержащий комплементарную якорную последовательность (якорь’), последовательность A14’, спейсер и последовательность P5’, и связывающий элемент, содержащий биотин, причем биотин иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает секвенирование одного или более полностью двухцепочечных меченых фрагментов. [0095] In some embodiments, the immobilized transposome complex comprises a solid support; and a transposome complex immobilized on a solid support, the transposome complex containing a transposase; the first transposon containing the 3'-terminal sequence of the transposon and the anchor sequence (anchor); the second transposon containing the 5'-terminal sequence of the transposon and the B15'sequence; and an attachment polynucleotide containing a complementary anchor sequence (anchor'), an A14' sequence, a spacer and a P5' sequence, and a binding element containing biotin, the biotin being immobilized on a solid support. In some embodiments, the method further comprises sequencing one or more fully double-stranded labeled fragments.
7.8. Способы создания меченых фрагментов нуклеиновых кислот посредством комбинированной тагментации и индексирования7.8. Methods for generating labeled nucleic acid fragments by combined tagging and indexing
[0096] В некоторых вариантах осуществления библиотеки с парными концами после двойного индексирования могут быть получены из образца ДНК с использованием комбинированной стадии тагментации и индексирования. Благодаря предотвращению отдельных стадий тагментации и индексирования данный протокол имеет преимущество в виде простого применения и меньшей продолжительности. Более того, данный протокол позволяет избежать стадии денатурации и получить двухцепочечные библиотеки без необходимости отдельной стадии получения двухцепочечных образцов из денатурированных одноцепочечных образцов. Данный протокол также позволяет избежать определенных стадий промывки, что еще больше сокращает время, необходимое для рабочего процесса. [0096] In some embodiments, libraries with paired ends after double indexing can be obtained from a DNA sample using a combined tagging and indexing step. By avoiding separate tagging and indexing steps, this protocol has the advantage of ease of use and shorter duration. Moreover, this protocol avoids the denaturation step and obtains double-stranded libraries without the need for a separate step to obtain double-stranded samples from denatured single-stranded samples. This protocol also avoids certain washing steps, further reducing the time required for the workflow.
[0097] В данном способе применяют первый иммобилизованный транспозонный комплекс и второй иммобилизованный транспозонный комплекс. В первом иммобилизованном транспозонном комплексе последовательность X в первом транспозоне представляет собой якорную последовательность, а последовательность X’ в полинуклеотиде присоединения представляет собой комплемент якорной последовательности. Во втором иммобилизованном транспозонном комплексе последовательность X в первом транспозоне представляет собой якорную последовательность, а последовательность X’ в полинуклеотиде присоединения представляет собой комплемент якорной последовательности. Якорные последовательности первого и второго иммобилизованных транспозонных комплексов могут быть некомплементарными во избежание перекрестной гибридизации. Первый транспозонный комплекс может содержать иллюстративный первый полинуклеотид присоединения, содержащий (i) комплемент якорной последовательности, последовательность A14’, спейсер и последовательность P5’, и (ii) связывающий элемент, содержащий биотин, а второй транспозонный комплекс может содержать иллюстративный второй полинуклеотид присоединения, содержащий (i) комплемент якорной последовательности, последовательность B15’, спейсер и последовательность P7’, и (ii) связывающий элемент, содержащий биотин. [0097] This method uses a first immobilized transposon complex and a second immobilized transposon complex. In the first immobilized transposon complex, the X sequence in the first transposon is the anchor sequence and the X' sequence in the attachment polynucleotide is the complement of the anchor sequence. In the second immobilized transposon complex, the X sequence in the first transposon is the anchor sequence and the X' sequence in the attachment polynucleotide is the complement of the anchor sequence. The anchor sequences of the first and second immobilized transposon complexes may be non-complementary to avoid cross-hybridization. The first transposon complex may comprise an exemplary first attachment polynucleotide comprising (i) an anchor sequence complement, an A14' sequence, a spacer, and a P5' sequence, and (ii) a binding element comprising biotin, and the second transposon complex may comprise an exemplary second attachment polynucleotide comprising (i) an anchor sequence complement, a B15' sequence, a spacer and a P7' sequence, and (ii) a binding element containing biotin.
[0098] При комбинированной тагментации и индексировании в каждую лунку можно добавлять суспензию связанных с твердой подложкой транспозонных комплексов (BLT, т. е. иммобилизованных комплексов транспосом), содержащих первый и второй комплексы транспосом. Затем можно осуществлять стадию индексирования в одном реакционном растворе с адаптерами индекса 1 (i7), адаптерами индекса 2 (i5) и последовательностями, необходимыми для образования кластеров секвенирования, лигированных в том же реакционном растворе, что и для проведения тагментации. Первые индексирующие олигонуклеотиды могут содержать последовательность A14, последовательность i5 и последовательность P5, а вторые индексирующие олигонуклеотиды могут содержать последовательность B15, последовательность i7 и последовательность P7. Условия на стадии тагментации/лигирования включают в себя меченый буфер и ДНК-лигазу E. Coli, добавленные к смеси целевой ДНК, первому и второму комплексам транспосом и первому и второму индексирующим олигонуклеотидам. Данная комбинированная стадия тагментации и индексирования может продолжаться в течение различных периодов, например по меньшей мере от 1 минуты до по меньшей мере 15 минут или по меньшей мере от 5 минут до по меньшей мере 15 минут. [0098] In combined tagging and indexing, a suspension of solid support bound transposome complexes (BLTs, i.e., immobilized transposome complexes) containing first and second transposome complexes can be added to each well. The indexing step can then be performed in the same reaction solution with index 1 (i7) adapters, index 2 (i5) adapters, and sequences necessary to form sequencing clusters ligated in the same reaction solution as for tagging. The first indexing oligonucleotides may contain an A14 sequence, an i5 sequence, and a P5 sequence, and the second indexing oligonucleotides may contain a B15 sequence, an i7 sequence, and a P7 sequence. Conditions for the tag/ligation step include labeled buffer and E. coli DNA ligase added to the target DNA mixture, the first and second transposome complexes, and the first and second index oligonucleotides. This combined tagmentation and indexing step may last for various periods, such as at least 1 minute to at least 15 minutes, or at least 5 minutes to at least 15 minutes.
[0099] Реакции тагментации и индексирования можно затем остановить с использованием различных способов, включая нагревание твердой подложки и/или промывку твердой подложки ферментативным денатурирующим средством, например, необязательно с использованием додецилсульфата натрия (SDS), гидрохлорида гуанидина, мочевины или протеиназы. Время остановки реакции как при нагревании, так и/или при использовании стадии промывки может варьироваться от по меньшей мере 1 минуты до по меньшей мере 5 минут. [0099] The tagging and indexing reactions can then be stopped using a variety of methods, including heating the solid support and/or washing the solid support with an enzymatic denaturant, for example, optionally using sodium dodecyl sulfate (SDS), guanidine hydrochloride, urea, or proteinase. The time to stop the reaction, whether by heating and/or by using a washing step, can vary from at least 1 minute to at least 5 minutes.
[0100] Меченные 5’-меткой целевые фрагменты, лигированные для индексирующих олигонуклеотидов, можно обрабатывать полимеразой для удлинения и получения полностью двухцепочечных меченых фрагментов. Реакция удлинения может протекать в течение различных периодов, например по меньшей мере от 1 минуты до по меньшей мере 10 минут или по меньшей мере от 2 минут до по меньшей мере 10 минут. [0100] 5'-labeled target fragments ligated for indexing oligonucleotides can be treated with polymerase to extend and produce fully double-stranded labeled fragments. The elongation reaction may take place over various periods, for example at least 1 minute to at least 10 minutes, or at least 2 minutes to at least 10 minutes.
[0101] Кроме того, при получении библиотеки, включающей комбинированную тагментацию и индексирование, также можно избежать стадии кПЦР, так как конечный продукт представляет собой двухцепочечную библиотеку ДНК в растворе. [0101] In addition, when obtaining a library that includes combined tagging and indexing, the qPCR step can also be avoided, since the final product is a double-stranded DNA library in solution.
[0102] В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт первого иммобилизованного комплекса транспосомы со вторым иммобилизованным комплексом транспосомы и обработку множества 5’-меченых целевых фрагментов лигазой проводят в одну реакцию. [0102] In some embodiments, contacting a first immobilized transposome complex with a second immobilized transposome complex and treating a plurality of 5'-labeled target fragments with a ligase is performed in a single reaction.
[0103] В некоторых вариантах осуществления двухцепочечные меченые фрагменты получают в растворе. [0103] In some embodiments, double-stranded labeled fragments are obtained in solution.
[0104] Некоторые варианты осуществления дополнительно содержат отбор полностью двухцепочечных меченых фрагментов с использованием гранул для захвата, причем необязательно гранулы для захвата представляют собой магнитные микроносители, и необязательно дополнительно выполняют две отдельные стадии отбора. [0104] Some embodiments further comprise selecting fully double-stranded labeled fragments using capture beads, optionally the capture beads being magnetic microcarriers, and optionally additionally performing two separate selection steps.
[0105] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает секвенирование одного или более полностью двухцепочечных меченых фрагментов. [0105] In some embodiments, the implementation of the method further includes sequencing one or more fully double-stranded labeled fragments.
Целевая нуклеиновая кислотаTarget nucleic acid
[0106] Целевая нуклеиновая кислота может представлять собой любой тип, который содержит ДНК, РНК, кДНК и т. п. Например, целевая нуклеиновая кислота может находиться в различных состояниях очистки, включая очищенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит смесь нуклеиновых кислот (таких как ДНК), белка, других видов нуклеиновых кислот, других клеточных компонентов и/или любого другого загрязняющего вещества, приблизительно в той же пропорции, что и in vivo. Например, в некоторых вариантах осуществления компоненты находятся в той же пропорции, что и в интактной клетке. Поскольку предложенные в настоящем документе способы позволяют связывать нуклеиновую кислоту или ДНК с твердой подложкой посредством процесса мечения, другие загрязняющие вещества могут быть удалены посредством промывки твердой подложки после осуществления тагментации. Биологический образец может содержать, например, неочищенный клеточный лизат или цельные клетки. Например, неочищенный клеточный лизат, нанесенный на твердую подложку посредством способа, описанного в настоящем документе, необязательно необходимо подвергнуть одной или более стадиям разделения, которые традиционно применяют для выделения нуклеиновых кислот из других клеточных компонентов. [0106] The target nucleic acid can be any type that contains DNA, RNA, cDNA, etc. For example, the target nucleic acid can be in various states of purification, including purified nucleic acid. In some embodiments, the biological sample contains a mixture of nucleic acids (such as DNA), protein, other types of nucleic acids, other cellular components, and/or any other contaminant, in approximately the same proportion as in vivo. For example, in some embodiments, the components are in the same proportion as in an intact cell. Because the methods provided herein allow nucleic acid or DNA to be bound to a solid support through a labeling process, other contaminants can be removed by washing the solid support after tagging has been performed. The biological sample may contain, for example, crude cell lysate or whole cells. For example, a crude cell lysate applied to a solid support by the method described herein does not necessarily need to be subjected to one or more separation steps that are traditionally used to isolate nucleic acids from other cellular components.
[0107] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления биологический образец может содержать не только очищенные нуклеиновые кислоты из любого источника, но и, например, неочищенные нуклеиновые кислоты, обнаруженные в крови, плазме, сыворотке, лимфе, слизи, мокроте, моче, сперме, спинномозговой жидкости, бронхиальной аспирате, фекалиях и мацерированной ткани или их лизате, или любой другой биологический препарат, содержащий нуклеиновую кислоту или материал ДНК. Целевая нуклеиновая кислота может представлять собой образец ткани, образец опухоли, раковые клетки или образец биопсии. Целевая нуклеиновая кислота может представлять собой бесклеточную ДНК (скДНК). [0107] Thus, in some embodiments, the biological sample may contain not only purified nucleic acids from any source, but also, for example, crude nucleic acids found in blood, plasma, serum, lymph, mucus, sputum, urine, semen, cerebrospinal fluid, bronchial aspirate, faeces and macerated tissue or their lysate, or any other biological preparation containing nucleic acid or DNA material. The target nucleic acid may be a tissue sample, a tumor sample, cancer cells, or a biopsy sample. The target nucleic acid may be cell-free DNA (scDNA).
[0108] Целевая нуклеиновая кислота может быть получена из любого вида или смеси видов. Например, целевая нуклеиновая кислота может быть получена от млекопитающего (такого как человек, собака, кошка, корова, свинья, овца или другое домашнее животное) или от других видов, таких как рыба, бактерии, вирус, грибок или архебактерия. Нуклеиновая кислота может поступать из образцов окружающей среды, таких как почва или вода. [0108] The target nucleic acid can be obtained from any species or mixture of species. For example, the target nucleic acid may be from a mammal (such as a human, dog, cat, cow, pig, sheep, or other domestic animal) or from other species such as a fish, bacteria, virus, fungus, or archaebacterium. The nucleic acid can come from environmental samples such as soil or water.
[0109] В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В одном таком варианте осуществления ДНК является двухцепочечной. В некоторых дополнительных вариантах осуществления двухцепочечная ДНК содержит геномную ДНК. В некоторых других вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой РНК или ее производное или кДНК. В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой продукт реакции выше по потоку, такой как явление амплификации или репликации, например, ампликон. В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, обработанную бисульфитом. [0109] In some embodiments, the target nucleic acid is DNA. In one such embodiment, the DNA is double stranded. In some additional embodiments, the implementation of double-stranded DNA contains genomic DNA. In some other embodiments, the target nucleic acid is RNA or a derivative thereof, or cDNA. In some embodiments, the target nucleic acid is the product of an upstream reaction, such as an amplification or replication event, such as an amplicon. In some embodiments, the target nucleic acid is DNA treated with bisulfite.
[0110] В некоторых вариантах осуществления биологический образец (необработанный образец или экстракт) обрабатывают для очистки целевых нуклеиновых кислот перед способами тагментации, описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой необработанный образец или необработанный образец лизата (например, кровь, слюну, клетку или клетки). В некоторых вариантах осуществления способ обработки включает получение исходного образца, лизата исходного образца или предварительно обработанного образца (например, образца крови или слюны), смешивание образца с лизирующим буфером и протеиназой K, инкубирование смеси для лизиса клеток в образце и высвобождение ДНК из клеток, таким образом обеспечивая целевую(ые) нуклеиновую(ые) кислоту(ы) для способов тагментации, описанных в настоящем документе. Количество биологического образца конкретно не указывается при условии, что биологический образец содержит достаточное количество нуклеиновых кислот для анализа. Таким образом, количество биологического образца может включать от приблизительно 1 мкл до приблизительно 500 мкл, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкл, или количество в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. [0110] In some embodiments, a biological sample (raw sample or extract) is processed to purify target nucleic acids prior to the tagging methods described herein. In some embodiments, the biological sample is a raw sample or a raw lysate sample (eg, blood, saliva, cell, or cells). In some embodiments, the processing method includes obtaining a stock sample, a lysate of the stock sample, or a pretreated sample (e.g., a blood or saliva sample), mixing the sample with lysis buffer and proteinase K, incubating the cell lysis mixture in the sample, and releasing the DNA from the cells, such thus providing the target nucleic acid(s) for the tagmentation methods described herein. The amount of the biological sample is not specifically stated, provided that the biological sample contains a sufficient amount of nucleic acids for analysis. Thus, the amount of biological sample may include from about 1 µl to about 500 µl, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 or 500 µl, or an amount within the range defined by any two of the above values.
[0111] Компоненты исходных образцов или лизаты исходных образцов, такие как кровь, или добавки в предварительно обработанных образцах, таких как слюна, собранная в пробирку для сбора генов Oragene (стабилизирующие средства в пробирках для сбора), могут ингибировать реакции тагментации. Таким образом, в настоящем документе предложен способ обработки исходного образца, исходного лизата образца или предварительно обработанного образца для преодоления данной проблемы. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение необработанного образца, лизата необработанного образца или предварительно обработанного образца (например, образца крови или слюны), смешивание образа с лизирующим буфером, протеиназой K и гранулами для захвата или очистки ДНК (например, гранулы SPRI, гранулы, содержащие карбоксильные группы, если гранулы необязательно представляют собой магнитные гранулы), инкубацию смеси для лизиса клеток в образце и высвобождения ДНК из клеток, захват таким образом ДНК на гранулы для очистки ДНК или SPRI и отделение гранул, содержащих захваченную ДНК, от смеси. Разделение служит для удаления потенциальных ингибиторов тагментации, присутствующих в супернатанте. Способ дополнительно включает необязательно промывку гранул, содержащих захваченную ДНК, и элюирование ДНК из гранул с образованием целевой(-ых) нуклеиновой(-их) кислоты(кислот). [0111] Components of the original samples or lysates of the original samples, such as blood, or additives in pre-treated samples, such as saliva collected in an Oragene gene collection tube (stabilizing agents in collection tubes), can inhibit tagmentation reactions. Thus, the present document proposes a method of processing the original sample, the original sample lysate or pre-treated sample to overcome this problem. In some embodiments, the method includes obtaining a raw sample, a raw sample lysate, or a pretreated sample (e.g., a blood or saliva sample), mixing the image with lysis buffer, proteinase K, and DNA capture or purification beads (e.g., SPRI beads, beads containing carboxyl groups, if the beads are optionally magnetic beads), incubating the mixture to lyse the cells in the sample and release the DNA from the cells, thereby capturing the DNA on the DNA purification or SPRI beads, and separating the beads containing the captured DNA from the mixture. Separation serves to remove potential inhibitors of tagmentation present in the supernatant. The method further includes optionally washing the beads containing the captured DNA and eluting the DNA from the beads to form the target nucleic acid(s).
[0112] В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота присутствует в количестве, достаточном для создания библиотеки для секвенирования. В некоторых вариантах осуществления количество целевой нуклеиновой кислоты представляет собой количество гДНК 10-500 нг, например 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 или 500 нг, или количество в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой гДНК, присутствующую в количестве 50 нг. [0112] In some embodiments, the implementation of the target nucleic acid is present in an amount sufficient to create a library for sequencing. In some embodiments, the amount of target nucleic acid is a 10-500 ng amount of gDNA, such as 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, or 500 ng, or an amount in within the range defined by any two of the above values. In some embodiments, the target nucleic acid is gDNA present at 50 ng.
7.10. Способы секвенирования7.10. Sequencing methods
[0113] Некоторые из способов, предложенных в настоящем документе, включают способы анализа нуклеиновых кислот. Такие способы включают в себя получение библиотеки матричных нуклеиновых кислот целевой нуклеиновой кислоты, получение данных последовательности из библиотеки матричных нуклеиновых кислот и необязательно сборку представления последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Фрагменты ДНК, полученные посредством опосредованной транспосомой тагментации, можно секвенировать в соответствии с любой подходящей методикой секвенирования, такой как прямое секвенирование или секвенирование следующего поколения, включая секвенирование посредством синтеза, секвенирование посредством лигирования, секвенирование посредством гибридизации, секвенирование на основе обнаружения высвобожденных протонов, могут применяться электрический детектор и связанные с ним методики, которые доступны на рынке от компании Ion Torrent (Guilford, CT, дочерняя компания Life Technologies), секвенирование наночастиц и т. п. В некоторых вариантах осуществления фрагменты ДНК секвенируют на твердой подложке, такой как проточная кювета. Примеры проточных кювет и связанных с ними жидкостных систем и платформ обнаружения, которые можно легко применять в рамках данного изобретения, описаны, например, в Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281 и US 2008/0108082, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. [0113] Some of the methods provided herein include methods for analyzing nucleic acids. Such methods include obtaining a template nucleic acid library of a target nucleic acid, obtaining sequence data from a template nucleic acid library, and optionally assembling a sequence representation of the target nucleic acid. DNA fragments obtained by transposome-mediated tagging can be sequenced according to any suitable sequencing technique, such as direct sequencing or next generation sequencing, including sequencing by synthesis, sequencing by ligation, sequencing by hybridization, sequencing based on the detection of released protons, can be used electrical detector and related techniques that are commercially available from Ion Torrent (Guilford, CT, a subsidiary of Life Technologies), nanoparticle sequencing, and the like. In some embodiments, DNA fragments are sequenced on a solid support such as a flow cell. Examples of flow cells and associated fluidic detection systems and platforms that can be easily used in the context of this invention are described, for example, in Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; W091/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281 and US 2008/0108082, which are incorporated herein by reference.
[0114] Способы, описанные в настоящем документе, не ограничиваются каким-либо конкретным применяемым типом аппаратуры для секвенирования. [0114] The methods described herein are not limited to any particular type of sequencing equipment used.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
[0115] Следующие примеры служат для иллюстрации, но не ограничивают предложенное в настоящем документе описание. [0115] The following examples serve to illustrate, but do not limit the description provided herein.
Пример 1: Олигонуклеотиды, которые не соединяются с отщепляемым пользователем линкеромExample 1: Oligonucleotides that do not connect to a user-cleavable linker
[0116] Проводили эксперимент для сравнения данных секвенирования без ПЦР с данными секвенирования с использованием ПЦР. Библиотеки получали с применением TruSeq PCR-free, TruSeq Nano (+ПЦР), Nextera Flex (+ПЦР) и способа, составляющего предмет настоящего изобретения, а затем секвенировали до 25-кратного покрытия. Каждый способ предполагал две повторности, причем всего создавали восемь библиотек. На Фиг. 7A показано, что способы без ПЦР (столбцы в линию и столбцы в клетку, которые представляют собой настоящий способ и TruSeq без ПЦР соответственно) имеют улучшенную точность и повторное распознавание индела по сравнению со способами с ПЦР (черные столбцы и белые столбцы, которые представляют собой TruSeq Nano и Nextera Flex соответственно). На Фиг. 7B показано, что покрытие промоторных областей с высоким содержанием GC также улучшено в способах без ПЦР (две нижние панели, причем настоящий способ представлен на нижней левой панели, а TruSeq без ПЦР на нижней правой панели). [0116] An experiment was conducted to compare sequencing data without PCR with sequencing data using PCR. Libraries were generated using TruSeq PCR-free, TruSeq Nano (+PCR), Nextera Flex (+PCR) and the method of the present invention and then sequenced up to 25x coverage. Each method involved two replications, and a total of eight libraries were created. On FIG. 7A shows that non-PCR methods (linear and checkered columns, which are the present method and TruSeq without PCR, respectively) have improved accuracy and indel re-recognition compared to PCR methods (black bars and white bars, which are TruSeq Nano and Nextera Flex respectively). On FIG. 7B shows that coverage of high GC promoter regions is also improved in non-PCR methods (lower two panels, with the present method in the lower left panel and TruSeq without PCR in the lower right panel).
Пример 2. Создание библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот без использования ПЦР-амплификацииExample 2. Creation of a library of labeled nucleic acid fragments without the use of PCR amplification
[0117] Стадия А1. Получение иммобилизованных комплексов транспосом - индексированные гранулы. Смесь: (1) первого транспозона, имеющего последовательность 3’-мозаичного конца (ME) (SEQ ID NO: 6), первой последовательности метки (A14) и 5’-праймерной последовательности (P5’) (конечная концентрация 25 мкМ); (2) второго транспозона с 5’-комплементарной концевой мозаичной последовательностью (МЕ’; SEQ ID NO: 3) и второй последовательности метки (B15’) (конечная концентрация 37,5 мкМ); и (3) полинуклеотида присоединения, включающего 3’-последовательность, комплементарную второй последовательности метки (B15), индексную последовательность (в данном случае i701 в таблице 1) и 5’-праймерную последовательность (P7) с биотином на 5’-конце (конечная концентрация 25 мкM), отжигали посредством обработки 10 мМ трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ EDTA и 25 мМ NaCl, нагревания при 95°C в течение 10 мин, а затем охлаждения до 10°C в течение приблизительно 15 мин. Затем отожженные транспозоны/полинуклеотид присоединения (конечная концентрация 2 мкМ по отношению к полинуклеотиду присоединения) смешивали с ферментом транспозазой (конечная концентрация 6,1 мкМ) и инкубировали при 37°C в течение ночи с образованием комплексов транспосом в фазе растворения (Фиг. 4A, фигуры с индексированными гранулами). Затем комплексы транспосом в фазе растворения иммобилизовали на твердой подложке посредством смешивания с покрытыми стрептавидином гранулами. В некоторых примерах иммобилизацию можно проводить в присутствии буфера HT1 (Illumina), который представляет собой буфер с высоким содержанием соли, способствующий образованию биотин-стрептавидиновых связей. После перемешивания в HT1 в течение 1 ч гранулы осаждали и однократно промывали в смеси буферного раствора HT1 и 50% глицеринового стандартного буфера для хранения (Illumina) (9:1). Затем гранулы ресуспендировали в 360 мкл буфера, содержащего 50 мМ Tris pH 7,5, 30 мМ NaCl и 0,1% Tween 20. Добавляли 40 мкл EPX2 (Illumina) и гранулы дополнительно вращали в течение 10 мин при комнатной температуре. Гранулы снова осаждали, а затем ресуспендировали в 396 мкл того же буфера, обрабатывали 4 мкл одноцепочечного связывающего белка (5 мг/мл) и снова вращали в течение 10 мин. Гранулы снова осаждали, промывали один раз в смеси 9:1 HT1: стандартный буфер для хранения и ресуспендировали в 15% глицериновом стандартном буфере для хранения (Illumina). Полученные индексированные гранулы применяли в протоколах тагментации с единичным индексированием и двойным индексированием. [0117] Step A1. Preparation of immobilized transposome complexes - indexed beads. A mixture of: (1) a first transposon having a 3' mosaic end (ME) sequence (SEQ ID NO: 6), a first tag sequence (A14) and a 5' primer sequence (P5') (final concentration 25 μM); (2) a second transposon with a 5' complementary terminal mosaic sequence (ME'; SEQ ID NO: 3) and a second tag sequence (B15') (final concentration 37.5 μM); and (3) an attachment polynucleotide comprising a 3' sequence complementary to the second tag sequence (B15), an index sequence (in this case, i701 in Table 1) and a 5' primer sequence (P7) with biotin at the 5' end (terminal concentration 25 μM), annealed by treatment with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA and 25 mM NaCl, heating at 95°C for 10 min, and then cooling to 10°C for approximately 15 min . The annealed transposons/attachment polynucleotide (
[0118] Стадия А2. Формирование иммобилизованных комплексов транспосом - универсальные гранулы. Отожженные транспозоны получали, как описано на стадии А1, за исключением того, что полинуклеотид присоединения включал в себя 5’-последовательность, комплементарную первой последовательности метки (A14’) и 3’-праймерной последовательности (P5’) с биотином на 3’-конце (для одного индексирования), и необязательно промежуточную универсальную последовательность нитроиндола (для двойного индексирования). Транспосомные комплексы получали из отожженных транспозонов и иммобилизовали на твердой подложке, как описано для стадии А1. Полученные универсальные гранулы применяли в протоколах единичного индексирования и двойного индексирования, как указано выше. [0118] Step A2. Formation of immobilized transposome complexes - universal granules. Annealed transposons were prepared as described in step A1, except that the addition polynucleotide included a 5' sequence complementary to the first tag sequence (A14') and a 3' primer sequence (P5') with biotin at the 3' end. (for single indexing), and optionally an intermediate universal nitroindole sequence (for double indexing). Transposome complexes were prepared from annealed transposons and immobilized on a solid support as described for step A1. The resulting universal beads were used in single indexing and dual indexing protocols as above.
[0119] Стадия b. Тагментация. ДНК (например, от приблизительно 50 пг до 5 мкг) смешивали с иммобилизованными комплексами транспосомы и 50 мкл буфера для тагментации (10 мМ трис-ацетата (pH 7,6), 5 мМ ацетата магния и 10% диметилформамида, как описано в патентах США №№ 9,080,211, 9,085,801 и 9,115,396, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, и полученную смесь инкубировали при 55°C в течение 5 мин. Получали библиотеку меченых фрагментов ДНК, иммобилизованных на гранулах. Реакционную смесь для тагментации обрабатывали 10 мкл стоп-буфера, содержащего 5% SDS, 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20, и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 5 мин для денатурации фермента транспозазы из комплексов транспосом. Затем гранулы с иммобилизованными фрагментами ДНК осаждали на магните и три раза промывали промывочным буфером (100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween) для удаления остатков SDS. Гранулы отделяли от супернатанта посредством магнитного захвата и дополнительно промывали с помощью 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20. Полученные меченые фрагменты для всех четырех подходов показаны на Фиг. 4B. [0119] Step b. Tagging. DNA (e.g., approximately 50 pg to 5 μg) was mixed with immobilized transposome complexes and 50 μl of tagging buffer (10 mM tris-acetate (pH 7.6), 5 mM magnesium acetate, and 10% dimethylformamide as described in US patents Nos. 9,080,211, 9,085,801 and 9,115,396, each of which is incorporated herein by reference, and the resulting mixture was incubated at 55°C for 5 min. buffer containing 5% SDS, 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl and 0.1
[0120] Стадия С. Удлинение, лигирование и индексирование. Удлинение и лигирование выполняли посредством приведения гранул в контакт со смесью для удлинения и лигирования (ELM), которая включала ДНК-полимеразу Т4 (экзонуклеазу минус) и ДНК-лигазу E. coli, и инкубирования при 30°C в течение 15 мин, а затем при 16°C в течение 15 мин, заполняя таким образом гэп фрагменты ДНК между 3’-концами фрагментов и 5’-концами последовательностей ME’ и удлинения одноцепочечных областей с образованием полностью двухцепочечных продуктов посредством введения оставшихся последовательностей из полинуклеотида присоединения (Фиг. 4C). В определенных случаях на данной стадии также добавляли индексы. Как показано на Фиг. 4D, правая верхняя фигура, к универсальной конструкции гранул/одноиндексных значений добавляли индекс посредством добавления олигонуклеотида с двухцепочечной последовательностью праймера (P7/P7’), двухцепочечной индексной последовательностью (в данном случае i701/i701’) и одноцепочечной выступающей областью с 3’-последовательностью, комплементарной второй последовательности метки (B15). Для подхода с индексированными гранулами/двойным индексированием (Фиг. 4D, левая нижняя фигура) реагент для определения индекса включал в себя двухцепочечную праймерную последовательность (P5/P5’), двухцепочечную индексную последовательность (в данном случае i501/i501’) и одноцепочечную выступающую область с 5’-последовательностью, комплементарной метке первой последовательности (A14’). Для подхода с универсальными гранулами/двойным индексированием (Фиг. 4D, правая нижняя фигура) индексный реагент был таким же, что и в случае универсальной гранулы/единичного индекса, но дополнительный второй индексный реагент, содержащий комплементарную праймерную последовательность (P5) и индексную последовательность (i5), гибридизовали и лигировали с 5’-концом последовательностей A14. [0120] Stage C. Lengthening, ligation and indexing. Extension and ligation was performed by contacting the beads with an extension and ligation mixture (ELM) that included T4 DNA polymerase (exonuclease minus) and E. coli DNA ligase, and incubation at 30° C. for 15 min, and then at 16°C for 15 min, thus filling in the gap of the DNA fragments between the 3' ends of the fragments and the 5' ends of the ME' sequences and elongation of the single-stranded regions to form fully double-stranded products by introducing the remaining sequences from the attachment polynucleotide (Fig. 4C) . In certain cases, indexes were also added at this stage. As shown in FIG. 4D, upper right figure, an index was added to the universal bead/single-index construct by adding an oligonucleotide with a double-stranded primer sequence (P7/P7'), a double-stranded index sequence (in this case, i701/i701'), and a single-stranded overhang with a 3'-sequence , complementary to the second label sequence (B15). For the indexed bead/double indexing approach (FIG. 4D, lower left figure), the indexing reagent included a double stranded primer sequence (P5/P5'), a double stranded index sequence (in this case i501/i501'), and a single stranded overhang. with a 5' sequence complementary to the label of the first sequence (A14'). For the universal bead/dual indexing approach (Fig. 4D, lower right figure), the index reagent was the same as for the universal bead/single index, but an additional second index reagent containing a complementary primer sequence (P5) and an index sequence ( i5), hybridized and ligated to the 5' end of the A14 sequences.
[0121] Реакционную смесь обрабатывали с помощью 10 мкл стоп-буфера, содержащего 5% SDS, 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20, и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 5 мин для денатурации фермента транспозазы из комплексов транспосом. Затем гранулы с иммобилизованными фрагментами ДНК осаждали на магните и три раза промывали промывочным буфером (100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween) для удаления остатков SDS. Гранулы отделяли от супернатанта посредством магнитного захвата и дополнительно промывали с помощью 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20. [0121] The reaction mixture was treated with 10 μl of stop buffer containing 5% SDS, 100 mm Tris-HCl (pH 7.5), 100 mm NaCl and 0.1
[0122] Стадия D. Высвобождение фрагментов с нанесенной меткой. После третьей промывки гранулы ресуспендировали в 100 мкл 0,2 н. NaOH для денатурации фрагментов библиотеки и их высвобождения из гранул. Библиотеку очищали посредством добавления 100 мкл супернатанта непосредственно к 180 мкл гранул SPRI в соответствии со стандартным протоколом очистки SPRI и элюирования в 15 мкл буфера для ресуспендирования Illumina. Библиотеки количественно определяли посредством способа количественной ПЦР, а затем готовили к секвенированию на MiSeq® посредством разведения до 5 мкл около 3200 пМ и денатурации 5 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли охлажденный буфер Illumina HT1 (990 мкл) и весь 1 мл смеси загружали в картридж MiSeq®. [0122] Step D. Release of labeled fragments. After the third wash, the beads were resuspended in 100 µl of 0.2 N. NaOH to denature the library fragments and release them from the beads. The library was purified by adding 100 μl of supernatant directly to 180 μl of SPRI beads according to standard SPRI purification protocol and eluting in 15 μl of Illumina resuspension buffer. Libraries were quantified by qPCR method and then prepared for sequencing on MiSeq® by diluting to 5 µl at about 3200 pM and
[0123] Результаты показаны на Фиг. 4E и обобщены в таблице 2 ниже для индексированных гранул или универсальных гранул с единичным или двойным индексированием. [0123] The results are shown in FIG. 4E and summarized in Table 2 below for indexed pellets or universal single or double indexed pellets.
Таблица 2: Результаты получения библиотеки для различных конфигураций комплекса транспосомTable 2: Results of obtaining a library for various configurations of the transposome complex
[0124] С использованием описанных в данном документе способов удалось преодолеть ошибки в данных секвенирования, которые обычно вносятся посредством ПЦР. Например, при использовании способов без ПЦР, описанных в настоящем документе, полученные библиотеки фрагментов нуклеиновых кислот секвенировали и последовательности не имели значительных гэпов в обогащенных GC областях, что обычно наблюдается при использовании ПЦР. [0124] Using the methods described herein, it was possible to overcome errors in sequencing data that are usually introduced by PCR. For example, using the non-PCR methods described herein, the resulting libraries of nucleic acid fragments were sequenced and the sequences did not have significant gaps in the GC-rich regions that are commonly seen using PCR.
Пример 3. Сравнение секвенирования испытываемых библиотекExample 3 Sequencing Comparison of Tested Libraries
[0125] В данном примере две сравнительные библиотеки из образца, содержащего известное 100%-е повторное размножение GC (FMR1), получали с использованием наборов Nextera™ DNA Flex (который включает ПЦР) и TruSeq™ PCR-Free Library Prep, а четыре библиотеки для испытания получали, как описано в настоящем документе, с использованием способа универсальных гранул/двойного индексирования, как показано на Фиг. 4D. Как показано на Фиг. 8, повторы для данных секвенирования из библиотеки, полученной с использованием набора Nextera™ DNA Flex, не были получены (первая колонка, столбец не показан, так как результат составляет 0). Повторы описывали с использованием TruSeq™ PCR-Free (колонка 2) и четырех библиотек для испытания с использованием способов, описанных в настоящем документе (образцы 1-4, колонки 3-6). Таким образом, настоящие способы демонстрируют улучшение вызова повторных размноженных образцов с 100% GC областей. [0125] In this example, two comparative libraries from a sample containing known 100% GC replication (FMR1) were generated using Nextera™ DNA Flex kits (which includes PCR) and TruSeq™ PCR-Free Library Prep, and four libraries for testing was prepared as described herein using the universal bead/double indexing method as shown in FIG. 4D. As shown in FIG. 8, no repeats were obtained for the sequencing data from the library obtained using the Nextera™ DNA Flex kit (first column, column not shown because the result is 0). Repeats were described using TruSeq™ PCR-Free (column 2) and four libraries for testing using the methods described herein (samples 1-4, columns 3-6). Thus, the present methods demonstrate an improvement in calling replicated samples with 100% GC regions.
Пример 4: Раздвоенные олигонуклеотиды с отщепляемым линкеромExample 4 Cleavable Linker Split Oligonucleotides
[0126] Стадия 1. Образование комплексов транспосом. Биотинилированный олигонуклеотид (50 мкМ), содержащий 5’-биотин, три остатка T, затем три остатка U, P5, A14 и ME, с последовательностью: /5Biosg/TTUUUAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA (SEQ ID NO: 20) [0126] Step 1: Formation of transposome complexes. Biotinylated oligonucleotide (50 μM) containing 5'-biotin, three T residues, then three U, P5, A14 and ME residues, with the sequence: /5Biosg/TTUUUAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA (SEQ ID NO: 20)
и олигонуклеотид, содержащий ME’_B15’_P7’ (75 мкМ), с последовательностью: CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG (SEQ ID NO: 21)and an oligonucleotide containing ME'_B15'_P7' (75 μM) with the sequence: CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG (SEQ ID NO: 21)
обрабатывали 10 мМ трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ EDTA и 25 мМ NaCl, нагревали до 95°C в течение 10 мин, а затем охлаждали до 10°C со скоростью -0,1°C в секунду. Затем отожженные транспозоны смешивали с ферментом транспозазой таким образом, чтобы итоговая концентрация биотинилированного олигонуклеотида составляла 2 мкМ, и концентрация транспозазы составляла 4 мкМ. Смесь инкубировали при 37°C в течение ночи с образованием комплексов транспосом в фазе растворения. Затем комплексы транспосом в фазе растворения иммобилизовали на твердой подложке посредством смешивания с покрытыми стрептавидином гранулами и буфером HT1 (Illumina) и вращения при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем гранулы трижды промывали в буфере HT1, а затем ресуспендировали в 15%-м глицериновом стандартном буфере для хранения (Illumina) (Фиг. 2A).treated with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA and 25 mM NaCl, heated to 95° C. for 10 min and then cooled to 10° C. at a rate of -0.1° C. per second. The annealed transposons were then mixed with the transposase enzyme so that the final concentration of the biotinylated oligonucleotide was 2 μM and the transposase concentration was 4 μM. The mixture was incubated at 37°C overnight with the formation of transposome complexes in the dissolution phase. The dissolution phase transposome complexes were then immobilized on a solid support by mixing with streptavidin-coated beads and HT1 buffer (Illumina) and rotating at room temperature for 1 hour. The beads were then washed three times in HT1 buffer and then resuspended in 15% glycerol standard storage buffer (Illumina) (FIG. 2A).
[0127] Стадия 2. Тагментация. ДНК (например, от приблизительно 50 пг до 5 мкг) смешивали с иммобилизованными комплексами транспосомы и 50 мкл буфера для тагментации (10 мМ трис-ацетата (pH 7,6), 5 мМ ацетата магния и 10% диметилформамида, как описано в патентах США №№ 9,080,211, 9,085,801 и 9,115,396, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, и полученную смесь инкубировали при 55°C в течение 5 мин. Получали библиотеку меченых фрагментов ДНК, иммобилизованных на гранулах. Реакционную смесь для тагментации обрабатывали 10 мкл стоп-буфера, содержащего 5% SDS, 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20, и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 5 мин для денатурации фермента транспозазы из комплексов транспосом. Затем гранулы с иммобилизованными фрагментами ДНК осаждали на магните и три раза промывали промывочным буфером (100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween) для удаления остатков SDS. Гранулы отделяли от супернатанта посредством магнитного захвата и дополнительно промывали с помощью 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20. [0127] Stage 2: Tagging. DNA (e.g., approximately 50 pg to 5 μg) was mixed with immobilized transposome complexes and 50 μl of tagging buffer (10 mM tris-acetate (pH 7.6), 5 mM magnesium acetate, and 10% dimethylformamide as described in US patents Nos. 9,080,211, 9,085,801 and 9,115,396, each of which is incorporated herein by reference, and the resulting mixture was incubated at 55°C for 5 min. buffer containing 5% SDS, 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl and 0.1
[0128] Стадия 3. Удлинение и лигирование. Удлинение и лигирование выполняли посредством приведения гранул в контакт со смесью для удлинения и лигирования (ELM), которая включала ДНК-полимеразу Т4 (экзонуклеазу минус) и ДНК-лигазу E. coli, и инкубирования при 30°C в течение 15 мин, а затем при 16°C в течение 15 мин, заполняя таким образом гэп фрагменты ДНК между 3’-концами фрагментов и 5’-концами последовательностей ME’. Реакционную смесь обрабатывали с помощью 10 мкл промывочного буфера, содержащего 5% SDS, 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20, и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 5 мин для денатурации фермента транспозазы из комплексов транспосом. Затем гранулы с иммобилизованными фрагментами ДНК осаждали на магните и три раза промывали промывочным буфером (100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween) для удаления остатков SDS. Гранулы отделяли от супернатанта посредством магнитного захвата и дополнительно промывали с помощью 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0,1% Tween 20. [0128] Step 3: Lengthening and ligation. Extension and ligation was performed by contacting the beads with an extension and ligation mixture (ELM) that included T4 DNA polymerase (exonuclease minus) and E. coli DNA ligase, and incubation at 30°C for 15 min, and then at 16°C for 15 min, thus filling the gap between the DNA fragments between the 3' ends of the fragments and the 5' ends of the ME' sequences. The reaction mixture was treated with 10 µl of wash buffer containing 5% SDS, 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl and 0.1
[0129] Стадия 4. Высвобождение фрагментов с нанесенной меткой. После третьей промывки гранулы ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ ацетата калия, 20 мМ трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния и 100 мкг/мл BSA. Добавляли 5 мкл смеси ферментов, содержащей урацил-ДНК-гликозилазу и эндонуклеазу VIII, и библиотеки инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Ферменты действовали совместно, расщепляя U’ в олигонуклеотидах присоединения и высвобождая фрагменты библиотеки в раствор. Библиотеку очищали посредством добавления 100 мкл супернатанта непосредственно к гранулам SPRI в соответствии со стандартным протоколом очищения SPRI по размеру (0,5x справа и 0,7-0,8x слева) и элюирования в 15 мкл буфера для ресуспендирования Illumina. Полученные библиотеки количественно определяли посредством кПЦР (Фиг. 2B). [0129] Step 4: Release labeled fragments. After the third wash, the beads were resuspended in a buffer containing 50 mM potassium acetate, 20 mM tris acetate, 10 mM magnesium acetate and 100 μg/ml BSA. 5 μl of an enzyme mixture containing uracil DNA glycosylase and endonuclease VIII was added and the libraries were incubated at 37°C for 30 min. The enzymes worked together to cleave the U' at the attachment oligonucleotides and release the library fragments into solution. The library was purified by adding 100 µl of the supernatant directly to the SPRI beads according to the standard SPRI size purification protocol (0.5x right and 0.7-0.8x left) and eluting in 15 µl Illumina resuspension buffer. The resulting libraries were quantified by qPCR (FIG. 2B).
Пример 5: Модифицированный протокол удлинения и лигированияExample 5 Modified Extension and Ligation Protocol
[0130] Можно применять альтернативный протокол для реакции удлинения и лигирования с индексированными вариациями (пример 2C). В некоторых случаях удлинение индекса i7 неэффективно вследствие вторичной структуры в определенных индексных последовательностях. Таким образом, для конструкции, представленной на Фиг. 6C, исследовали восемь различных пар индексов. Как показано на Фиг. 9A, % CV для пула индексов составлял 76%. Было обнаружено, что добавление олигонуклеотида Р7’ в ходе реакции удлинения и индексирования повышает эффективность определенных пар индексов, возможно, вследствие гибридизации с последовательностью Р7, которая может нарушать или предотвращать образование вторичной структуры. В данном случае реакция удлинения и индексирования также включает лигирование. P7’ (с 5’-фосфатом для лигирования) добавляют в ходе реакции удлинения-лигирования-индексирования при 2,5 мкМ. Для конструкции, представленной на Фиг. 6D, на Фиг. 9B представлен % CV для восьми пар индексов менее 30%. [0130] You can use an alternative protocol for the reaction of extension and ligation with indexed variations (example 2C). In some cases, i7 index extension is inefficient due to secondary structure in certain index sequences. Thus, for the design shown in Fig. 6C, eight different index pairs were examined. As shown in FIG. 9A, the % CV for the index pool was 76%. It has been found that the addition of the P7' oligonucleotide during the extension and indexing reaction enhances the performance of certain index pairs, possibly due to hybridization with the P7 sequence, which may disrupt or prevent secondary structure formation. In this case, the reaction of elongation and indexing also includes ligation. P7' (with 5'-phosphate for ligation) is added during the extension-ligation-indexing reaction at 2.5 μM. For the design shown in Fig. 6D, in FIG. 9B shows % CV for eight index pairs less than 30%.
[0131] Добавление ДМСО к реакции удлинения-лигирования-индексирования олигонуклеотида P7 дополнительно повышает показатель % CV. В данном примере в конструкции, представленной на Фиг. 6D, ДМСО добавляют в реакцию удлинения-лигирования-индексирования на уровне 5%. Реакция удлинения и лигирования содержит все ферменты и компоненты, необходимые для удлинения и лигирования. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин, после чего продолжают работу в нормальном рабочем процессе. Как показано на Фиг. 9C, % CV для восьми разных пар индексов составлял менее 20%. Данный результат позволяет использовать систему без количественной оценки выхода ДНК из библиотеки для каждого образца с целью коррекции вариаций характеристик индексирования. [0131] The addition of DMSO to the extension-ligation-indexing reaction of the P7 oligonucleotide further increases the % CV. In this example, in the design shown in Fig. 6D, DMSO is added to the extension-ligation-indexing reaction at 5%. The extension and ligation reaction contains all the enzymes and components required for extension and ligation. The reaction mixture is incubated at 37° C. for 30 min, after which work is continued in the normal workflow. As shown in FIG. 9C, % CV for eight different pairs of indices was less than 20%. This result makes it possible to use the system without quantifying the yield of DNA from the library for each sample in order to correct for variations in indexing characteristics.
Пример 6: Иммобилизованная транспосома в пробирке без ПЦРExample 6: Immobilized transposome in a tube without PCR
[0132] Данный пример демонстрирует способ и систему для иммобилизации комплексов транспосом в пробирке, например в пробирке для ПЦР, для секвенирования целого генома без ПЦР. Способы осуществляют аналогично способу, описанному в примере 2, и всю обработку можно выполнять в той же пробирке. [0132] This example demonstrates a method and system for immobilizing transposome complexes in a test tube, such as a PCR tube, for whole genome sequencing without PCR. The methods are carried out similarly to the method described in example 2, and all processing can be performed in the same tube.
[0133] Получение иммобилизованных комплексов транспосом в пробирке. Смесь: (1) первого транспозона, имеющего последовательность 3’-мозаичного конца (ME) (SEQ ID NO: 6), первой последовательности метки (A14) и 5’-праймерной последовательности (P5) (конечная концентрация 25 мкМ); (2) второго транспозона с 5’-комплементарной концевой мозаичной последовательностью (МЕ’; SEQ ID NO: 3) и второй последовательности метки (B15’) (конечная концентрация 37,5 мкМ); и (3) полинуклеотида присоединения, включающего 3’-последовательность, комплементарную второй последовательности метки (B15), индексную последовательность и 5’-праймерную последовательность (P7) с биотином на 5’-конце (конечная концентрация 25 мкM), отжигали посредством обработки 10 мМ трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ EDTA и 25 мМ NaCl, нагревания при 95°C в течение 10 мин, а затем охлаждения до 10°C в течение приблизительно 15 мин. Полинуклеотид присоединения включал в себя 5’-последовательность, комплементарную первой последовательности метки (A14’), и 3’-праймерную последовательность (P5’) с биотином на 3’-конце (для единичного индексирования). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид присоединения включал промежуточную универсальную нитроиндольную последовательность (для двойного индексирования). Затем отожженные транспозоны/полинуклеотиды присоединения (конечная концентрация 2 мкМ на основе полинуклеотида присоединения) смешивали с ферментом транспозазой (конечная концентрация 6,1 мкМ) и инкубировали при 37°C в течение ночи с образованием комплексов транспосом в фазе растворения. Затем комплексы транспосом в фазе растворения иммобилизовали на поверхности пробирки для ПЦР посредством смешивания комплексов (имеющих биотин) в пробирке для ПЦР с поверхностью, покрытой стрептавидином. В некоторых примерах иммобилизацию можно проводить в присутствии буфера HT1 (Illumina, San Diego, CA), который представляет собой буфер с высоким содержанием соли, способствующий образованию биотин-стрептавидиновых связей. После инкубации в течение 1 ч. пробирку для ПЦР промывали в смеси буфера TWB (Illumina, San Diego, CA). Полученные пробирки с иммобилизованными на них транспосомами использовали в протоколах агментации с единичным индексированием и двойным индексированием. [0133] Preparation of immobilized transposome complexes in vitro. A mixture of: (1) a first transposon having a 3' mosaic end (ME) sequence (SEQ ID NO: 6), a first tag sequence (A14) and a 5' primer sequence (P5) (final concentration 25 μM); (2) a second transposon with a 5' complementary terminal mosaic sequence (ME'; SEQ ID NO: 3) and a second tag sequence (B15') (final concentration 37.5 μM); and (3) an attachment polynucleotide comprising a 3' sequence complementary to the second tag sequence (B15), an index sequence and a 5' primer sequence (P7) with biotin at the 5' end (final concentration 25 μM) was annealed by treatment with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA and 25 mM NaCl, heated at 95°C for 10 min and then cooled to 10°C for approximately 15 min. The attachment polynucleotide included a 5' sequence complementary to the first tag sequence (A14') and a 3' primer sequence (P5') with biotin at the 3' end (for single indexing). In some embodiments, the attachment polynucleotide included an intermediate universal nitroindole sequence (for double indexing). The annealed transposons/attachment polynucleotides (
[0134] Рабочий процесс получения библиотеки, включая стадии тагментации, удлинения, лигирования и индексирования, выполняли в соответствии с описанием в примере 2. После завершения стадий, описанных в примере 2, были созданы фрагменты библиотеки, иммобилизованные на поверхности пробирки. Пробирки промывали 50 мкл 0,2 н. NaOH для денатурации фрагментов библиотеки и высвобождения их с поверхности пробирок. Библиотеки количественно определяли посредством способа количественной ПЦР, а затем готовили к секвенированию на MiSeq® посредством разведения до 5 мкл около 3200 пМ и денатурации 5 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли охлажденный буфер Illumina HT1 (990 мкл) и весь 1 мл смеси загружали в картридж MiSeq®. [0134] The workflow for obtaining the library, including the steps of tagmentation, extension, ligation and indexing, was performed as described in example 2. After completing the steps described in example 2, library fragments immobilized on the surface of the tube were created. The tubes were washed with 50 µl of 0.2 N. NaOH to denature library fragments and release them from the surface of the tubes. Libraries were quantified by qPCR method and then prepared for sequencing on MiSeq® by diluting to 5 µl at about 3200 pM and
[0135] Результаты секвенирования представлены на Фиг. 10, где показана степень покрытия в области генома, которую, как известно, сложно секвенировать (ген RNPEPL1). В двух способах получения библиотек с помощью ПЦР (Nextera Flex и Nextera на основе пробирок) показан гэп, в котором ни одна из последовательностей не покрывала область гена, отмеченную прямоугольной ограничительной рамкой. Было обнаружено, что два способа без ПЦР имеют хорошее покрытие в данной области, как показано в разделах, обозначенных на Фиг. 10 как «PCR-free Flex» и «Nextera без ПЦР на основе пробирок». [0135] The sequencing results are shown in FIG. 10, which shows the extent of coverage in a region of the genome that is notoriously difficult to sequence (the RNPEPL1 gene). Two methods of obtaining libraries using PCR (Nextera Flex and Nextera tube-based) showed a gap in which none of the sequences covered the region of the gene marked with a rectangular bounding box. The two non-PCR methods were found to have good coverage in this area, as shown in the sections labeled in FIG. 10 as "PCR-free Flex" and "Nextera tube-free PCR".
Пример 7: Препарат без отщепляемого линкера без использования ПЦРExample 7: Preparation without cleavable linker without using PCR
[0136] Следующий пример демонстрирует способ и систему для иммобилизации комплексов транспосом в пробирке, например, в пробирке для ПЦР, для секвенирования целого генома без ПЦР. Способы осуществляют аналогично способу, описанному в примере 2, но без нуклеотида присоединения, содержащего отщепляемый линкер или стадию отщепления линкера. В данном способе применяют три отдельных олигонуклеотида. Дополнительные компоненты данного способа включают транспозон Tn5, SDS, смесь для интенсивного лигирования (ELM) и покрытую стрептавидином поверхность (такую как гранулы или планшет). [0136] The following example demonstrates a method and system for immobilizing transposome complexes in a test tube, such as a PCR tube, for whole genome sequencing without PCR. The methods are carried out similarly to the method described in example 2, but without the addition nucleotide containing a cleavable linker or linker cleavage step. This method uses three separate oligonucleotides. Additional components of this method include a Tn5 transposon, SDS, an intensive ligation mixture (ELM), and a streptavidin-coated surface (such as beads or a plate).
[0137] Смесь (1) первого транспозона, имеющего последовательность ME, первую последовательность метки (A14), последовательность i5 и 5’-праймерную последовательность (P5); (2) второго транспозона с 5’-комплементарной концевой мозаичной последовательностью (МЕ’), второй меткой (B15’), i7’-последовательностью и 3’-праймерной последовательность (P7’); и (3) полинуклеотида присоединения, содержащего последовательность P7 и связывающий элемент (такой как биотин), можно получить и закрепить на поверхности (такой как планшет или гранула, покрытые стрептавидином). Транспосомы можно построить и прикрепить к поверхности в ходе одной стадии в присутствии матричной нуклеиновой кислоты в буфере для тагментации. [0137] A mixture of (1) a first transposon having an ME sequence, a first tag sequence (A14), an i5 sequence, and a 5' primer sequence (P5); (2) a second transposon with a 5' complementary terminal mosaic sequence (ME'), a second tag (B15'), an i7' sequence and a 3' primer sequence (P7'); and (3) an attachment polynucleotide containing a P7 sequence and a binding element (such as biotin) can be prepared and attached to a surface (such as a streptavidin-coated plate or bead). Transposomes can be constructed and attached to a surface in a single step in the presence of a template nucleic acid in a tag buffer.
[0138] Тагментацию выполняют в течение 5 мин при 55°C. В реакцию тагментации может быть включен ПЭГ. Смесь обрабатывают SDS для удаления транспозазы Tn5. Выполняют ELM и удаляют супернатант. При использовании данного способа не требуются гранулы для захвата SPRI и, следовательно, нет необходимости в настройке размера вставки посредством плотности загрузки гранул. Для подготовки секвенирования фрагменты можно элюировать в NaOH. [0138] Tagging is performed for 5 minutes at 55°C. PEG can be included in the tagmentation reaction. The mixture is treated with SDS to remove the Tn5 transposase. Perform ELM and remove the supernatant. Using this method, no SPRI capture beads are required, and therefore there is no need to adjust the size of the insert through the loading density of the beads. Fragments can be eluted in NaOH to prepare for sequencing.
Пример 8: Получение библиотек из 96 лунок без ПЦРExample 8 Obtaining 96 Well Libraries Without PCR
[0139] Следующий пример демонстрирует способ и систему для получения до 96 библиотек с парными концами после двойного индексирования из образца ДНК. Способы осуществляют аналогично способу, описанному в примере 2, но используют две стадии инкубации с иммобилизованными гранулами для обеспечения получения без конечной стадии кПЦР. Поскольку кПЦР может занимать много времени (до двух часов), данный протокол имеет преимущество в виде простого применения и меньшую продолжительность применения. Данный способ был совместим с вводимыми количествами ДНК в 25-1000 нг. В образцах человеческой ДНК и других больших сложных геномах вводимое количество ДНК может составлять более 200 нг. Для вводимого количества ДНК от 200 до 1000 нг не требуется количественное определение и нормализация исходного образца ДНК. Перед секвенированием выполняли количественное определение и нормализацию библиотек для вводимого количества от 25 до 200 нг ДНК. [0139] The following example demonstrates a method and system for obtaining up to 96 paired end libraries after double indexing from a DNA sample. The methods are carried out similarly to the method described in example 2, but using two stages of incubation with immobilized beads to ensure the preparation without the final qPCR step. Because qPCR can take a long time (up to two hours), this protocol has the advantage of being easy to use and less time consuming. This method was compatible with DNA administration amounts of 25-1000 ng. In human DNA samples and other large complex genomes, the amount of DNA injected can be over 200 ng. For an input amount of DNA from 200 to 1000 ng, no quantitation and normalization of the original DNA sample is required. Prior to sequencing, libraries were quantitated and normalized for an input amount of 25 to 200 ng of DNA.
[0140] В данном способе применяют первый транспозон, как описано на Фиг. 6D, причем последовательность X в первом транспозоне представляет собой ATCTGACTATCCCCTGCG (SEQ ID NO: 23), и последовательность X’ в прикрепляемом полинуклеотиде представляет собой CGCAGGGGATAGTCAGAT (SEQ ID NO: 24). Якорная последовательность представляет собой А14, а спейсерная область состоит из 2 углеродных спейсеров C18 и 1 C9 (последовательности, отличные от ДНК). [0140] This method uses the first transposon as described in FIG. 6D, wherein the X sequence in the first transposon is ATCTGACTATCCCCTGCG (SEQ ID NO: 23) and the X' sequence in the attachment polynucleotide is CGCAGGGGATAGTCAGAT (SEQ ID NO: 24). The anchor sequence is A14 and the spacer region consists of 2 carbon spacers C18 and 1 C9 (non-DNA sequences).
[0141] Тагментация. В каждую лунку 96-луночного планшета для ПЦР добавляли ДНК в 10 мМ трис-HCl (приблизительно 2-30 мкл) таким образом, чтобы общее вводимое количество (нг) находилось в пределах необходимого диапазона. Если объем ДНК составляет менее 30 мкл, к образцам ДНК добавляют не содержащую нуклеазу воду для доведения общего объема до 30 мкл. В каждую лунку добавляли суспензию связанных с гранулами транспосом (Blt) (10 мкл) с последующим добавлением 10 мкл буфера для тагментации. BLT загружали на гранулы в концентрации от приблизительно 50 до 1000 нМ. Их ресуспендировали в 15% глицериновом стандартном буфере для хранения, который состоит из 15% глицерина, 100 мМ NaCl, 50 мМ Tris HCl pH 7,5, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,1% Triton X-100. Образцы пипетировали для перемешивания до полного ресуспендирования гранул, планшет запечатывали и помещали в термоциклер при 41°C на 5 мин, а затем выдерживали при 10°C. Значения времени тагментации, составляющие 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 и 300 с, обеспечивают сходный выход со сдвигом на большую длину вставки при меньшем времени инкубации (например, 15 с обеспечивали более длинные размеры вставки, чем 60, 120 или 300 с). В некоторых примерах время тагментации сокращено до 1 мин. [0141] Tagging. DNA in 10 mM Tris-HCl (approximately 2-30 μl) was added to each well of a 96-well PCR plate such that the total amount injected (ng) was within the desired range. If the DNA volume is less than 30 µl, nuclease-free water is added to the DNA samples to bring the total volume to 30 µl. A suspension of bead-bound transposomes (Blt) (10 µl) was added to each well followed by 10 µl of tag buffer. BLT was loaded onto the beads at a concentration of from about 50 to 1000 nM. They were resuspended in 15% glycerol standard storage buffer, which consists of 15% glycerol, 100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% Triton X-100. The samples were pipetted for mixing until the pellets were completely resuspended, the plate was sealed and placed in a thermal cycler at 41°C for 5 min, and then kept at 10°C. Tagging times of 15 s, 30 s, 45 s, 60 s, 75 s, 90 s, 105 s, 120 s, and 300 s provide a similar yield with a longer insert length shift at a shorter incubation time (e.g., 15 s provided longer insert sizes than 60 s). , 120 or 300 s). In some examples, the tag time is reduced to 1 minute.
[0142] В каждую лунку добавляли 10 мкл стоп-буфера для тагментации, содержащего SDS, полученную смесь пипетировали до полного восстановления гранул и смесь инкубировали в течение 1-5 мин. Планшет помещали на магнитную стойку на 2-5 мин, супернатант извлекали и удаляли. Планшет удаляли с магнита и в каждую лунку непосредственно на гранулы добавляли 150 мкл промывочного буфера для тагментации. Образцы перемешивали пипеткой и планшет помещали на магнитную стойку до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (приблизительно 2-5 мин). На данной стадии из образцов удаляли SDS. [0142] 10 μl of tag stop buffer containing SDS was added to each well, the resulting mixture was pipetted until the pellets were completely reconstituted, and the mixture was incubated for 1-5 minutes. The plate was placed on a magnetic stand for 2-5 min, the supernatant was removed and removed. The plate was removed from the magnet and 150 µl of tagmentation wash buffer was added to each well directly on the beads. The samples were mixed with a pipette and the plate was placed on a magnetic stand until the solution became clear (approximately 2-5 min). At this stage, SDS was removed from the samples.
[0143] Удлинение/лигирование. Адаптеры индекса 1 (i7), адаптеры индекса 2 (i5) и последовательности, необходимые для генерации кластера секвенирования, добавляют посредством удлинения/лигирования. В то время, как планшет находился на магнитной стойке, супернатант извлекали и удаляли. Планшет извлекали из магнитного штатива и в каждую лунку добавляли по 45 мкл смеси для удлинения и лигирования с последующим повторным суспендированием гранул. Затем к каждому образцу добавляли соответствующие адаптеры индекса (5 мкл), планшет герметизировали и помещали в термоциклер при 37°C на 5 мин, при 50°C на 5 мин, а затем выдерживали при 10°C. Каждый из периодов инкубации при 37°C и 50°C можно выполнять в течение 1, 3 или 5 мин, и все вариации дают аналогичный выход библиотеки. Более короткие периоды инкубации позволяют получать библиотеки с увеличенным размером фрагментов, тогда как более длительные инкубации обеспечивают более высокие концентрации продуктов лигирования. Затем планшет помещали на магнитную стойку на 2-5 мин и удаляли супернатант. [0143] Extension/ligation. Index 1 (i7) adapters, index 2 (i5) adapters, and sequences needed to generate a sequencing cluster are added via extension/ligation. While the plate was on the magnetic stand, the supernatant was removed and discarded. The plate was removed from the magnetic rack and 45 μl of the extension and ligation mixture was added to each well, followed by resuspension of the beads. Then the appropriate index adapters (5 μl) were added to each sample, the plate was sealed and placed in a thermal cycler at 37°C for 5 min, at 50°C for 5 min, and then kept at 10°C. Each of the periods of incubation at 37°C and 50°C can be performed for 1, 3 or 5 min, and all variations give a similar output of the library. Shorter incubation times produce libraries with increased fragment size, while longer incubations result in higher concentrations of ligation products. Then the plate was placed on a magnetic stand for 2-5 min and the supernatant was removed.
[0144] В лунки добавляли 75 мкл промывочного буфера для тагментации и смесь пипетировали для ресуспендирования гранул для тагментации. Супернатант удаляли, планшет центрифугировали и помещали на магнит на 2-5 мин. В каждую лунку добавляли 45 мкл 0,2 н. NaOH для денатурации фрагментов. Смесь в каждой лунке пипетировали для ресуспендирования гранул для тагментации и планшет инкубировали в течение 1-5 мин при комнатной температуре. [0144] 75 µl of tagging wash buffer was added to the wells and the mixture was pipetted to resuspend the tagging beads. The supernatant was removed, the plate was centrifuged and placed on a magnet for 2–5 min. 45 µl of 0.2 N solution was added to each well. NaOH to denature fragments. The mixture in each well was pipetted to resuspend the tag pellets and the plate was incubated for 1-5 minutes at room temperature.
[0145] Очистка библиотеки. В каждую лунку добавляли 36 мкл гранул для захвата (таких как гранулы Ampure XP) и содержимое лунок перемешивали для ресуспендирования гранул, а затем инкубировали в течение 1, 3 или 5 мин. Планшет помещали на магнитную стойку приблизительно на 1-5 мин, до тех пор, пока супернатант не становился прозрачным. [0145] Clearing the library. 36 µl capture beads (such as Ampure XP beads) were added to each well and the contents of the wells were mixed to resuspend the beads and then incubated for 1, 3, or 5 minutes. The plate was placed on a magnetic stand for approximately 1-5 minutes until the supernatant became clear.
[0146] В каждую лунку второго 96-луночного планшета добавляли 42 мкл гранул для захвата. Затем во второй 96-луночный планшет с гранулами захвата добавляли по 76 мкл супернатанта из каждой лунки первого 96-луночного планшета. Образцы перемешивали пипеткой и инкубировали в течение 1, 3 или 5 мин, а затем помещали на магнитную стойку до тех пор, пока супернатант не становился прозрачным (приблизительно 1-5 мин). В некоторых примерах вторую стадию с гранулами для захвата исключают. [0146] 42 µl of capture beads were added to each well of the second 96-well plate. Then, 76 μl of the supernatant from each well of the first 96-well plate was added to the second 96-well plate with capture beads. The samples were mixed with a pipette and incubated for 1, 3, or 5 min, and then placed on a magnetic rack until the supernatant became clear (approximately 1-5 min). In some examples, the second capture bead step is omitted.
[0147] Подходящими являются протоколы очистки гранул с однократным или двойным захватом и инкубацией в течение 1, 3 или 5 мин для каждой стадии очистки гранул. [0147] Suitable bead cleaning protocols are single or double capture and incubation for 1, 3, or 5 minutes for each bead cleaning step.
[0148] После очистки гранул для захвата супернатант удаляли и гранулы для захвата дважды промывали 180 мкл свежего 80% этанола без перемешивания и инкубировали при комнатной температуре, после чего супернатант удаляли. Остаточный этанол удаляли пипеткой и планшет высушивали на воздухе и удаляли с магнитной стойки. [0148] After cleaning the capture beads, the supernatant was removed and the capture beads were washed twice with 180 μl of fresh 80% ethanol without stirring and incubated at room temperature, after which the supernatant was discarded. Residual ethanol was removed with a pipette and the plate was air dried and removed from the magnetic rack.
[0149] В каждую лунку добавляли по 15-22 мкл буфера для ресуспендирования, а содержимое лунки перемешивали пипеткой для ресуспендирования гранул. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем помещали на магнитную стойку до тех пор, пока супернатант не становился прозрачным (приблизительно 2 мин). Всего в третий планшет для ПЦР объемом 96 лунок переносили 14-20 мкл супернатанта из каждой лунки. Данный планшет является конечной библиотекой ДНК, и его подготавливали для секвенирования, как описано выше. [0149] 15-22 μl of resuspension buffer was added to each well, and the contents of the well were mixed with a pipette to resuspend the beads. The plate was incubated at room temperature for 2 minutes and then placed on a magnetic stand until the supernatant became clear (approximately 2 minutes). A total of 14-20 µl of supernatant from each well was transferred to a third 96-well PCR plate. This plate is the final DNA library and was prepared for sequencing as described above.
[0150] В данном протоколе применяют две стадии очистки с иммобилизованными гранулами и исключают стадию количественной ПЦР, что позволяет за более короткое время завершить получение библиотеки. Например, образцы получают с применением данных способов в течение менее 30 мин при использовании стадий короткой магнитной инкубации в течение 20 мин. [0150] This protocol employs two purification steps with immobilized beads and eliminates the qPCR step, which allows the library to be completed in a shorter time. For example, samples are prepared using these methods in less than 30 minutes using short magnetic incubation steps of 20 minutes.
[0151] Протокол можно осуществлять в других сосудах, таких как пробирки для микроцентрифугирования. [0151] The protocol can be carried out in other vessels such as microcentrifuge tubes.
[0152] В некоторых вариантах осуществления для достижения оптимальной плотности кластеров объединяют равные объемы библиотеки и пул перед секвенированием количественно оценивают. При использовании вводимых количеств 200-1000 нг ДНК в некоторых случаях библиотеки объединяют посредством смешивания равных объемов каждой библиотеки в пробирке для микроцентрифугирования объемом 1,7 мл, встряхивания для перемешивания, а затем центрифугирования. Пул библиотеки количественно определяли с использованием набора Qubit ssDNA для определения концентрации пула. При использовании вводимых количеств 25-200 нг ДНК в некоторых примерах каждую библиотеку количественно определяли индивидуально с использованием набора Quibit ssDNA. [0152] In some embodiments, equal library volumes are pooled to achieve optimum cluster density and the pool is quantified prior to sequencing. When using injection amounts of 200-1000 ng of DNA, in some cases, libraries are pooled by mixing equal volumes of each library in a 1.7 ml microcentrifuge tube, shaking to mix, and then centrifuging. The library pool was quantified using the Qubit ssDNA pool concentration kit. Using input amounts of 25-200 ng of DNA, in some examples each library was quantified individually using the Quibit ssDNA kit.
[0153] В некоторых примерах секвенирование проводят на картридже NovaSeq6000. [0153] In some examples, sequencing is performed on a NovaSeq6000 cartridge.
Пример 9: Получение библиотек посредством комбинации тагментации и индексированияExample 9: Retrieving libraries through a combination of tagging and indexing
[0154] Следующий пример демонстрирует способ и систему для получения библиотек с парными концами после двойного индексирования из образца ДНК с использованием стадии комбинированной тагментации и индексирования. Способы выполняли аналогично способу, описанному в примере 2, но с комбинированной тагментацией и индексированием за одну стадию. Благодаря предотвращению отдельных стадий тагментации и индексирования данный протокол имеет преимущество в виде простого применения и меньшей продолжительности. Более того, данный протокол позволяет избежать стадии денатурации и получить двухцепочечные библиотеки без необходимости отдельной стадии получения двухцепочечных образцов из денатурированных одноцепочечных образцов. Данный протокол также позволяет избежать определенных стадий промывки, что еще больше сокращает время, необходимое для рабочего процесса. [0154] The following example demonstrates a method and system for obtaining dual-ended libraries from a DNA sample using a combined tagging and indexing step. The methods were performed similarly to the method described in example 2, but with combined tagging and indexing in one step. By avoiding separate tagging and indexing steps, this protocol has the advantage of ease of use and shorter duration. Moreover, this protocol avoids the denaturation step and obtains double-stranded libraries without the need for a separate step to obtain double-stranded samples from denatured single-stranded samples. This protocol also avoids certain washing steps, further reducing the time required for the workflow.
[0155] Для демонстрации того, что данные библиотеки могут быть получены с использованием реакций, осуществляемых в течение либо долгого, среднего, либо короткого промежутка времени для выполнения, три набора образцов можно обрабатывать с нормальной скоростью рабочего процесса, высокой скоростью рабочего процесса и сверхвысокой скоростью рабочего процесса соответственно. [0155] To demonstrate that library data can be generated using reactions performed in either long, medium, or short run times, three sets of samples can be run at normal workflow, high workflow, and ultra high speed. workflow, respectively.
[0156] В данном способе применяют первый иммобилизованный транспозонный комплекс и второй иммобилизованный транспозонный комплекс. В первом иммобилизованном транспозонном комплексе последовательность X в первом транспозоне представляет собой якорную последовательность, а последовательность X’ в полинуклеотиде присоединения представляет собой комплемент якорной последовательности. Во втором иммобилизованном транспозонном комплексе последовательность X в первом транспозоне представляет собой якорную последовательность, а последовательность X’ в полинуклеотиде присоединения представляет собой комплемент якорной последовательности. Якорная последовательность первого и второго иммобилизованных транспозонных комплексов может быть некомплементарной во избежание перекрестной гибридизации. Первый транспозонный комплекс может содержать иллюстративный первый полинуклеотид присоединения, содержащий (i) комплемент якорной последовательности, последовательность A14’, спейсер и последовательность P5’, и (ii) связывающий элемент, содержащий биотин, а второй транспозонный комплекс может содержать иллюстративный второй полинуклеотид присоединения, содержащий (i) комплемент якорной последовательности, последовательность B15’, спейсер и последовательность P7’, и (ii) связывающий элемент, содержащий биотин. [0156] In this method, a first immobilized transposon complex and a second immobilized transposon complex are used. In the first immobilized transposon complex, the X sequence in the first transposon is the anchor sequence and the X' sequence in the attachment polynucleotide is the complement of the anchor sequence. In the second immobilized transposon complex, the X sequence in the first transposon is the anchor sequence and the X' sequence in the attachment polynucleotide is the complement of the anchor sequence. The anchor sequence of the first and second immobilized transposon complexes may be non-complementary to avoid cross-hybridization. The first transposon complex may comprise an exemplary first attachment polynucleotide comprising (i) an anchor sequence complement, an A14' sequence, a spacer, and a P5' sequence, and (ii) a binding element comprising biotin, and the second transposon complex may comprise an exemplary second attachment polynucleotide comprising (i) an anchor sequence complement, a B15' sequence, a spacer and a P7' sequence, and (ii) a binding element containing biotin.
[0157] Тагментация и индексирование. В каждую лунку 96-луночного планшета для ПЦР добавляли ДНК в 10 мМ трис-HCl (приблизительно 2-30 мкл) таким образом, чтобы общее вводимое количество (нг) находилось в пределах необходимого диапазона. В каждую лунку добавляли суспензию связанных с гранулами транспомосом (BLT, т. е. иммобилизованных транспозоновых комплексов), содержащую первый и второй комплексы транспосом. Стадию индексирования осуществляли в одном реакционном растворе с адаптерами индекса 1 (i7), адаптерами индекса 2 (i5) и последовательностями, необходимыми для образования кластеров секвенирования, лигированных в том же реакционном растворе, что и для проведения тагментации. В данном примере первые индексирующие олигонуклеотиды содержат последовательность A14, последовательность i5 и последовательность P5, а вторые индексирующие олигонуклеотиды содержат последовательность B15, последовательность i7 и последовательность P7. Условия на стадии тагментации/лигирования включают в себя меченый буфер и ДНК-лигазу E. Coli, добавленные к смеси целевой ДНК, первому и второму комплексам транспосом и первому и второму индексирующим олигонуклеотидам при общем объеме 20 мкл. Реакцию тагментации и индексирования проводили при температуре 41°C в течение трех разных временных интервалов (для трех разных образцов): 15 минут (обычный рабочий процесс), 5 минут (быстрый рабочий процесс) и 1 минут (сверхбыстрый рабочий процесс). [0157] Tagging and indexing. DNA in 10 mM Tris-HCl (approximately 2-30 μl) was added to each well of a 96-well PCR plate such that the total amount injected (ng) was within the desired range. A suspension of bead-bound transpomosomes (BLT, ie, immobilized transposon complexes) containing the first and second transposome complexes was added to each well. The indexing step was performed in the same reaction solution with index 1 (i7) adapters, index 2 (i5) adapters, and sequences necessary to form sequencing clusters ligated in the same reaction solution as for tagging. In this example, the first indexing oligonucleotides contain an A14 sequence, an i5 sequence, and a P5 sequence, and the second indexing oligonucleotides contain a B15 sequence, an i7 sequence, and a P7 sequence. Conditions for the tag/ligation step include labeled buffer and E. coli DNA ligase added to target DNA mixture, first and second transposome complexes, and first and second index oligonucleotides in a total volume of 20 µl. The tagging and indexing reaction was carried out at 41°C for three different time intervals (for three different samples): 15 minutes (normal workflow), 5 minutes (fast workflow) and 1 minute (ultrafast workflow).
[0158] После реакции тагментации и индексирования в каждую лунку добавляли 5 мкл 0,6% SDS с инкубацией при 37°C для остановки реакции агментации посредством промывки SDS для денатурации транспозазы. Стадию остановки проводили в течение трех разных временных интервалов (для трех разных образцов): 5 минут (обычный рабочий процесс), 5 минут (быстрый рабочий процесс) и 1 минута (сверхбыстрый рабочий процесс). Несмотря на то, что стадию остановки выполняют в течение одного и того же периода для обычного и быстрого рабочего процесса, общее время для быстрого рабочего процесса все еще является более коротким вследствие различий по времени на других стадиях. [0158] After the tagmentation and indexing reaction, 5 μl of 0.6% SDS was added to each well with incubation at 37°C to stop the agmentation reaction by washing with SDS to denature the transposase. The stop step was performed for three different time intervals (for three different samples): 5 minutes (normal workflow), 5 minutes (fast workflow) and 1 minute (ultrafast workflow). Although the stop step is performed during the same period for the normal and fast workflows, the total time for the fast workflow is still shorter due to time differences in other steps.
[0159] Удлинение. В каждую лунку добавляли 75 мкл смеси для удлинения (ДНК-полимераза, dNTP и буфер), и реакцию удлинения проводили при температуре менее 68°C в реакционном объеме 100 мкл. Стадию удлинения выполняли в течение трех разных временных интервалов (для трех разных образцов): 10 минут (обычный рабочий процесс), 2 минут (быстрый рабочий процесс) и 1 минут (сверхбыстрый рабочий процесс). Стадия удлинения позволяет создать библиотеку двухцепочечной ДНК в растворе. Очистку библиотеки можно выполнять с помощью гранул для захвата. [0159] Extension. 75 μl of the extension mixture (DNA polymerase, dNTP and buffer) was added to each well, and the extension reaction was carried out at less than 68° C. in a reaction volume of 100 μl. The elongation step was performed for three different time intervals (for three different samples): 10 minutes (normal workflow), 2 minutes (fast workflow) and 1 minute (ultrafast workflow). The extension step allows the creation of a double-stranded DNA library in solution. Library cleanup can be done with capture beads.
[0160] В целом выходы библиотек обычного и быстрого рабочего процесса сопоставимы со способами, которые включают отдельные стадии тагментации и индексирования, тогда как выходы библиотек сверхбыстрого рабочего процесса, вероятно, достаточны для многих применений, особенно с учетом дополнительного удобства еще более быстрого рабочего процесса. Способы с комбинированной тагментацией и индексированием могут обеспечивать индексирование олигонуклеотидов с транспозазами, которые успешно не фрагментировали образец ДНК (т. е. с побочными продуктами тагментации). Кроме того, комбинированная тагментация и индексирование могут обеспечивать библиотечные продукты, имеющие последовательности P5/P5 или последовательности P7/P7 с обоих концов, и данные библиотечные продукты с гомозиготными концами могут неправильно секвенироваться. Тем не менее, для многих применений количество исходного образца ДНК является достаточным для получения результатов секвенирования, даже если получены некоторые побочные продукты. [0160] In general, the outputs of the regular and fast workflow libraries are comparable to methods that include separate tagging and indexing steps, while the outputs of the ultra-fast workflow libraries are likely sufficient for many applications, especially given the added convenience of an even faster workflow. Combined tagging and indexing methods can index oligonucleotides with transposases that have not successfully fragmented the DNA sample (ie, with tagging by-products). In addition, combined tagging and indexing may provide library products having P5/P5 sequences or P7/P7 sequences at both ends, and these library products with homozygous ends may not be correctly sequenced. However, for many applications, the amount of the original DNA sample is sufficient to obtain sequencing results, even if some by-products are obtained.
[0161] Описан ряд вариантов осуществления. Тем не менее, следует понимать, что возможны различные модификации. Соответственно, нижеследующая формула изобретения охватывает другие варианты осуществления. [0161] A number of embodiments have been described. However, it should be understood that various modifications are possible. Accordingly, the following claims cover other embodiments.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
SEQ ID NO: 1 - A14-MESEQ ID NO: 1 - A14-ME
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
SEQ ID NO: 2 - B15-MESEQ ID NO: 2 - B15-ME
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGTTCCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
SEQ ID NO: 3 - ME’SEQ ID NO: 3 - ME'
phos-CTGTCTCTTATACACATCTphos-CTGTCTCTTATACACATCT
SEQ ID NO: 4 - A14SEQ ID NO:4-A14
TCGTCGGCAGCGTCTCGTCGGCAGCGTC
SEQ ID NO: 5 - B15SEQ ID NO: 5-B15
GTCTCGTGGGCTCGGGTCTCGTGGGCTCGG
SEQ ID NO: 6 - MESEQ ID NO: 6 - ME
AGATGTGTATAAGAGACAGAGATGTGTATAAGAGACAG
SEQ ID NO: 7 - P5SEQ ID NO: 7-P5
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACACAATGATACGGCGACCCACCGAAUCTACAC
SEQ ID NO: 8 - P7SEQ ID NO: 8-P7
CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*ACAAGCAGAAGACGGCATACGAG*A
SEQ ID NO: 9 - P5_A14_MESEQ ID NO: 9 - P5_A14_ME
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAATGATACGGCGACCCACGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
SEQ ID NO: 10 - P_ME’_B15’SEQ ID NO: 10 - P_ME'_B15'
5Phos/CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC5Phos/CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC
SEQ ID NO: 11 - Bio_P7_i701_B1_5_ddCSEQ ID NO: 11 - Bio_P7_i701_B1_5_ddC
5Biosg/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG/3ddC/5Biosg/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG/3ddC/
SEQ ID NO: 12 - A14’_P5’_bioSEQ ID NO: 12 - A14'_P5'_bio
GACGCTGCCGACGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3Bio/GACGCTGCCGACGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3Bio/
SEQ ID NO: 13 - P_A14_MESEQ ID NO: 13 - P_A14_ME
5Phos/TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG5Phos/TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
SEQ ID NO: 14 - A14’_nitro_P5’_bioSEQ ID NO: 14 - A14'_nitro_P5'_bio
GACGCTGCCGACGACCC/i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd/GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3Bio/GACGCTGCCGACGACCC/i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd/GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3Bio/
SEQ ID NO: 15 - A14’_12anc’_2sp_P5’_bioSEQ ID NO: 15 - A14'_12anc'_2sp_P5'_bio
GACGCTGCCGACGACCGAGCATATCC/iSp18//iSp18/GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3BioTEG/GACGCTGCCGACGACCGAGCATATCC/iSp18//iSp18/GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3BioTEG/
SEQ ID NO: 16 - P5_i501SEQ ID NO: 16-P5_i501
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGC
SEQ ID NO: 17 - P_i701’_P7_ddCSEQ ID NO: 17 - P_i701'_P7_ddC
5Phos/TAAGGCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG/3ddC/5Phos/TAAGGCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG/3ddC/
SEQ ID NO: 18 - P7_i701_B15_ddCSEQ ID NO: 18 - P7_i701_B15_ddC
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG/3ddC/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG/3ddC/
SEQ ID NO: 19 - P5_i501_12ancSEQ ID NO: 19 - P5_i501_12anc
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCGGATATGCTCGGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCGGATATGCTCGG
SEQ ID NO: 20 - биотинилированный олигонуклеотидSEQ ID NO: 20 - biotinylated oligonucleotide
/5Biosg/TTUUUAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA /5Biosg/TTUUUAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA
SEQ ID NO: 21 - ME’_B15’_P7’SEQ ID NO: 21 - ME'_B15'_P7'
CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGCTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
SEQ ID NO: 22 - иллюстративная якорная последовательностьSEQ ID NO: 22 - exemplary anchor sequence
GGATATGCTCGGGGATATGCTCGG
SEQ ID NO: 23: Иллюстративная последовательность X SEQ ID NO: 23: Exemplary Sequence X
ATCTGACTATCCCCTGCGATCTGACTATCCCCTGCG
SEQ ID NO: 24: Иллюстративная последовательность X ’SEQ ID NO: 24: Exemplary sequence X'
CGCAGGGGATAGTCAGATCGCAGGGGATAGTCAGAT
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> ILLUMINA CAMBRIDGE LIMITED<110> ILLUMINA CAMBRIDGE LIMITED
<120> СЛОЖНЫЕ КОМПЛЕКСЫ СВЯЗАННОЙ НА ПОВЕРХНОСТИ ТРАНСПОСОМЫ<120> COMPLEX COMPLEXES OF A SURFACE-BOUND TRANSPOSOME
<130> 01243-0011-00PCT<130> 01243-0011-00PCT
<150> US 62/840,610<150> US 62/840,610
<151> 2019-04-30<151> 2019-04-30
<150> US 62/791,509<150> US 62/791,509
<151> 2019-01-11<151> 2019-01-11
<160> 24 <160> 24
<170> PatentIn версии 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 33<211> 33
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательности, применяемая в комплексе транспосом<223> Illustrative sequence used in the transposome complex
<400> 1<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 2<210> 2
<211> 34<211> 34
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательности, применяемая в комплексе транспосом<223> Illustrative sequence used in the transposome complex
<400> 2<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 3<210> 3
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательности, применяемая в комплексе транспосом<223> Illustrative sequence used in the transposome complex
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> 5’-фосфатная группа<223> 5'-phosphate group
<400> 3<400> 3
ctgtctctta tacacatct 19ctgtctctta tacacatct 19
<210> 4<210> 4
<211> 14<211> 14
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная адаптерная последовательность присоединения<223> Exemplary adapter connection sequence
<400> 4<400> 4
tcgtcggcag cgtc 14
<210> 5<210> 5
<211> 15<211> 15
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная адаптерная последовательность присоединения<223> Exemplary adapter connection sequence
<400> 5<400> 5
gtctcgtggg ctcgg 15
<210> 6<210> 6
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательности, применяемая в комплексе транспосом<223> Illustrative sequence used in the transposome complex
<400> 6<400> 6
agatgtgtat aagagacag 19agatgtgtat aagagacag 19
<210> 7<210> 7
<211> 29<211> 29
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный праймер<223> Illustrative primer
<400> 7<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gauctacac 29aatgatacgg cgaccaccga gauctacac 29
<210> 8<210> 8
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный праймер<223> Illustrative primer
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (22)..(22)<222> (22)..(22)
<223> Необязательно модифицированный гуанин, например 8-оксогуанин<223> Optionally modified guanine, such as 8-oxoguanine
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (22)..(23)<222> (22)..(23)
<223> Необязательная фосфоротиоатная связь<223> Optional phosphorothioate bond
<400> 8<400> 8
caagcagaag acggcatacg agat 24caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 9<210> 9
<211> 62<211> 62
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный 5’-фрагмент транспозона<223> Illustrative 5'-transposon fragment
<400> 9<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60
ag 62ag 62
<210> 10<210> 10
<211> 34<211> 34
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный 3’-фрагмент транспозона<223> Illustrative 3'-transposon fragment
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> 5’-фосфатная группа<223> 5'-phosphate group
<400> 10<400> 10
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34ctgtctctta tacacatctc cgagccccg agac 34
<210> 11<210> 11
<211> 48<211> 48
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный олигонуклеотид присоединения<223> Exemplary attachment oligonucleotide
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> 5’-биотин<223> 5'-biotin
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (48)..(48)<222> (48)..(48)
<223> 3’-дидезокси-C<223> 3'-dideoxy-C
<400> 11<400> 11
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggn 48caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggn 48
<210> 12<210> 12
<211> 43<211> 43
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный олигонуклеотид присоединения<223> Exemplary attachment oligonucleotide
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (43)..(43)<222> (43)..(43)
<223> 3’-биотин<223> 3'-biotin
<400> 12<400> 12
gacgctgccg acgagtgtag atctcggtgg tcgccgtatc att 43gacgctgccg acgagtgtag atctcggtgg tcgccgtatc att 43
<210> 13<210> 13
<211> 33<211> 33
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный 5’-фрагмент транспозона<223> Illustrative 5'-transposon fragment
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> 5’-фосфатная группа<223> 5'-phosphate group
<400> 13<400> 13
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 14<210> 14
<211> 54<211> 54
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный олигонуклеотид присоединения<223> Exemplary attachment oligonucleotide
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (18)..(25)<222> (18)..(25)
<223> Int 5-нитроиндол<223> Int 5-nitroindole
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (54)..(54)<222> (54)..(54)
<223> 3’-биотин<223> 3'-biotin
<400> 14<400> 14
gacgctgccg acgacccnnn nnnnngtgta gatctcggtg gtcgccgtat catt 54gacgctgccg acgacccnnn nnnnngtgta gatctcggtg gtcgccgtat catt 54
<210> 15<210> 15
<211> 57<211> 57
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный олигонуклеотид присоединения<223> Exemplary attachment oligonucleotide
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (27)..(28)<222> (27)..(28)
<223> Int спейсер 18<223> Int spacer 18
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (57)..(57)<222> (57)..(57)
<223> 3’-биотин-ТЭГ<223> 3'-biotin-TEG
<400> 15<400> 15
gacgctgccg acgaccgagc atatccnngt gtagatctcg gtggtcgccg tatcatt 57gacgctgccg acgaccgagc atatccnngt gtagatctcg gtggtcgccg tatcatt 57
<210> 16<210> 16
<211> 37<211> 37
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный индексирующий олигонуклеотид i501<223> Exemplary indexing oligonucleotide i501
<400> 16<400> 16
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgc 37aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgc 37
<210> 17<210> 17
<211> 33<211> 33
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный индексирующий олигонуклеотид i701<223> Exemplary indexing oligonucleotide i701
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> 5’-фосфатная группа<223> 5'-phosphate group
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (33)..(33)<222> (33)..(33)
<223> 3’-дидезокси-C<223> 3'-dideoxy-C
<400> 17<400> 17
taaggcgaat ctcgtatgcc gtcttctgct tgn 33taaggcgaat ctcgtatgcc gtcttctgct tgn 33
<210> 18<210> 18
<211> 48<211> 48
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный индексирующий олигонуклеотид i701<223> Exemplary Indexing Oligonucleotide i701
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (48)..(48)<222> (48)..(48)
<223> 3’-дидезокси-C<223> 3'-dideoxy-C
<400> 18<400> 18
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggn 48caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggn 48
<210> 19<210> 19
<211> 49<211> 49
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративный индексирующий олигонуклеотид i501<223> Exemplary Indexing Oligonucleotide i501
<400> 19<400> 19
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgcgga tatgctcgg 49aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgcggga tatgctcgg 49
<210> 20<210> 20
<211> 66<211> 66
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательности, применяемая в комплексе транспосом<223> Illustrative sequence used in the transposome complex
<220><220>
<221> прочие характеристики<221> other characteristics
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> 5’-биотин<223> 5'-biotin
<400> 20<400> 20
ttuuuaatga tacggcgacc accgagatct acactcgtcg gcagcgtcag atgtgtataa 60ttuuuaatga tacggcgacc accgagatct acactcgtcg gcagcgtcag atgtgtataa 60
gagaca 66gagaca 66
<210> 21<210> 21
<211> 58<211> 58
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательности, применяемая в комплексе транспосом<223> Illustrative sequence used in the transposome complex
<400> 21<400> 21
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agacatctcg tatgccgtct tctgcttg 58ctgtctctta tacacatctc cgagccccg agacatctcg tatgccgtct tctgcttg 58
<210> 22<210> 22
<211> 12<211> 12
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная якорная последовательность<223> Illustrative anchor sequence
<400> 22<400> 22
ggatatgctc gg 12
<210> 23<210> 23
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательность X<223> Illustrative sequence X
<400> 23<400> 23
atctgactat cccctgcg 18atctgactat ccctgcg 18
<210> 24<210> 24
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Иллюстративная последовательность X’<223> Illustrative sequence X'
<400> 24<400> 24
cgcaggggat agtcagat 18cgcaggggat agtcagat 18
<---<---
Claims (129)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/791,509 | 2019-01-11 | ||
US62/840,610 | 2019-04-30 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2023102737A Division RU2023102737A (en) | 2019-01-11 | 2020-01-10 | COMPLEX COMPLEXES OF A SURFACE-BOUND TRANSPOSOME |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021108087A RU2021108087A (en) | 2023-01-27 |
RU2790295C2 true RU2790295C2 (en) | 2023-02-16 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016061517A2 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Illumina Cambridge Limited | Contiguity preserving transposition |
RU2016107196A (en) * | 2013-08-19 | 2017-09-26 | Эбботт Молекьюлар Инк. | LIBRARIES FOR SEQUENCING A NEW GENERATION |
WO2018156519A1 (en) * | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Illumina Inc. | Tagmentation using immobilized transposomes with linkers |
WO2018208699A1 (en) * | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Illumina, Inc. | Universal short adapters for indexing of polynucleotide samples |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2016107196A (en) * | 2013-08-19 | 2017-09-26 | Эбботт Молекьюлар Инк. | LIBRARIES FOR SEQUENCING A NEW GENERATION |
WO2016061517A2 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Illumina Cambridge Limited | Contiguity preserving transposition |
WO2018156519A1 (en) * | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Illumina Inc. | Tagmentation using immobilized transposomes with linkers |
WO2018208699A1 (en) * | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Illumina, Inc. | Universal short adapters for indexing of polynucleotide samples |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KUAN FENG et al., Next-generation sequencing library construction on a surface, BMC Genomics, 2018, Vol.19, N.416. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11685946B2 (en) | Complex surface-bound transposome complexes | |
US11708573B2 (en) | Tagmentation using immobilized transposomes with linkers | |
EP3981884B1 (en) | Single cell whole genome libraries for methylation sequencing | |
JP2024511766A (en) | Improved library preparation method | |
JP2017079773A (en) | Improved methods of nucleic acid sequencing | |
WO2022021279A1 (en) | Multi-nucleic acid co-labeling support, preparation method therefor, and application thereof | |
IL302207A (en) | Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput | |
JP2021526367A (en) | Nucleic acid amplification method | |
RU2790295C2 (en) | Complex systems of transposome bound on surface | |
EP4127220B1 (en) | Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries | |
JP2024515305A (en) | Nucleic Acid Concentration and Detection | |
KR20230124636A (en) | Compositions and methods for highly sensitive detection of target sequences in multiplex reactions | |
RU2783536C2 (en) | Tagmentation using immobilized transposomes with linkers | |
RU2798952C2 (en) | Obtaining a nucleic acid library using electrophoresis | |
CN117062910A (en) | Improved library preparation method | |
WO2023215524A2 (en) | Primary template-directed amplification and methods thereof | |
CA3211172A1 (en) | Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction |