RU2781829C2 - Polynucleotide and method for control of insect infestation - Google Patents
Polynucleotide and method for control of insect infestation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781829C2 RU2781829C2 RU2020143244A RU2020143244A RU2781829C2 RU 2781829 C2 RU2781829 C2 RU 2781829C2 RU 2020143244 A RU2020143244 A RU 2020143244A RU 2020143244 A RU2020143244 A RU 2020143244A RU 2781829 C2 RU2781829 C2 RU 2781829C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequence
- polynucleotide
- ribonucleic acid
- insect
- paragraphs
- Prior art date
Links
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 title claims abstract description 87
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims description 167
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 title abstract description 20
- 241000013382 Monolepta hieroglyphica Species 0.000 claims abstract description 96
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 86
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 83
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 62
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims abstract description 48
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000001965 increased Effects 0.000 claims abstract description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 103
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 92
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 claims description 90
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 68
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims description 59
- 230000000749 insecticidal Effects 0.000 claims description 53
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims description 52
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 claims description 47
- 230000001743 silencing Effects 0.000 claims description 47
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 33
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 claims description 31
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 claims description 30
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 claims description 29
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 26
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 claims description 26
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 22
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 16
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 claims description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 230000002633 protecting Effects 0.000 claims description 5
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 4
- 229940097012 Bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 3
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000193417 Brevibacillus laterosporus Species 0.000 claims description 3
- 240000006669 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 claims description 3
- 240000008962 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001148064 Photorhabdus luminescens Species 0.000 claims description 3
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000008529 Triticum aestivum Species 0.000 claims description 3
- 241001110037 Xenorhabdus ehlersii Species 0.000 claims description 3
- 235000021307 wheat Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000241602 Gossypianthus Species 0.000 claims 1
- 230000002222 downregulating Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 57
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 53
- 230000025458 RNA interference Effects 0.000 description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 230000002987 rna-interference Effects 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 28
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 23
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 16
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 16
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 14
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 13
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 13
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 12
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 12
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 11
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N Acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 description 10
- 101710011940 HPRT1 Proteins 0.000 description 9
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 9
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 9
- 101700074518 hpt Proteins 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 9
- 239000005631 2,4-D Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 241000602080 Dracaena fragrans Species 0.000 description 8
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 7
- 229920000972 Sense strand Polymers 0.000 description 7
- 229940023877 Zeatin Drugs 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- -1 excipient Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 7
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 7
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 7
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 description 7
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 description 7
- HNXGGWNCFXZSAI-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-2-ylethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCC1CNCCO1 HNXGGWNCFXZSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 6
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 6
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 6
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 6
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 6
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 5
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 5
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 5
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 5
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 5
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 5
- 230000002363 herbicidal Effects 0.000 description 5
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 230000001418 larval Effects 0.000 description 5
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 4
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 102000013598 Signal recognition particle protein Human genes 0.000 description 4
- 108010051611 Signal recognition particle protein Proteins 0.000 description 4
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001949 Transfer RNA Polymers 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 229930003571 Vitamin B5 Natural products 0.000 description 4
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 4
- 229920002847 antisense RNA Polymers 0.000 description 4
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 4
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 4
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 4
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2,5-diamino-5-oxopentanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N 0.000 description 3
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Asparagine Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 3
- BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N BNC210 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 3
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 3
- MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 3
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 3
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N Pro-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 3
- 241000254113 Tribolium castaneum Species 0.000 description 3
- QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 3
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 3
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 3
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N (3β)-Cholest-5-en-3-ol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumyl-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetate Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950008167 Abamectin Drugs 0.000 description 2
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- OMSMPWHEGLNQOD-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Phenylalanine Chemical compound NC(=O)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Asparagine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000005944 Chlorpyrifos Substances 0.000 description 2
- SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N Chlorpyrifos Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- 240000006962 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- IQVNEKKDSLOHHK-FNCQTZNRSA-N Hydramethylnon Chemical compound N1CC(C)(C)CNC1=NN=C(/C=C/C=1C=CC(=CC=1)C(F)(F)F)\C=C\C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 IQVNEKKDSLOHHK-FNCQTZNRSA-N 0.000 description 2
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Aspartate Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Lysine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N Lys-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- MUMXFARPYQTTSL-BQBZGAKWSA-N Met-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O MUMXFARPYQTTSL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N 0.000 description 2
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N Phosphoenolpyruvic acid Natural products OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M Potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000970 Repeated sequence (DNA) Polymers 0.000 description 2
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001891 Small hairpin RNA Polymers 0.000 description 2
- 229920001985 Small interfering RNA Polymers 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N Spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N Val-His Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Cysteine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001112 coagulant Effects 0.000 description 2
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000005058 diapause Effects 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N pro glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 200000000019 wound Diseases 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCVAOQKBXKSDMS-PVAVHDDUSA-N (+)-trans-(S)-allethrin Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)O[C@@H]1C(C)=C(CC=C)C(=O)C1 ZCVAOQKBXKSDMS-PVAVHDDUSA-N 0.000 description 1
- FYQGBXGJFWXIPP-UHFFFAOYSA-N (2E,4E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,4-dienoic acid, ethyl ester Chemical compound CCOC(=O)C=C(C)C=CCC(C)CCCC(C)C FYQGBXGJFWXIPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N (2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-sulfanylpropanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N (2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BAONJAHBAUDJKA-BZSNNMDCSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BAONJAHBAUDJKA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N (2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- BVZABQIRMYTKCF-JSGCOSHPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-azaniumyl-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVZABQIRMYTKCF-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N (2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N (2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- TZBJAXGYGSIUHQ-XUXIUFHCSA-N (3S)-3-amino-4-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O TZBJAXGYGSIUHQ-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N (4S)-4-amino-5-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 1,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-methylpentanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-sulfanylpropanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-4-carboxybutanoyl)amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 2-[[2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PABVKUJVLNMOJP-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(1-carboxy-2-sulfanylethyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O PABVKUJVLNMOJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKTRDWYCAUTRRL-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[[1-carboxy-2-(1H-imidazol-5-yl)ethyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[[1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino)butyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710017630 AF_0914 Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- JQDFGZKKXBEANU-UHFFFAOYSA-N Alanyl-Cysteine Chemical compound CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O JQDFGZKKXBEANU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024113 Allethrin Drugs 0.000 description 1
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 description 1
- SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N Arg-Asp Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Histidine Chemical compound NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCNC(N)=N XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWXZVVXRRRRSLT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Cysteine Chemical compound NC(=O)CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O TWXZVVXRRRRSLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Cysteine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DYDKXJWQCIVTMR-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Methionine Chemical compound CSCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O DYDKXJWQCIVTMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N Boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N Bromoxynil Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N Chitin Chemical compound O[C@@H]1C(NC(=O)C)[C@H](O)OC(CO)[C@H]1COC[C@H]1C(NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](COC[C@H]2C([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)O2)NC(C)=O)C(CO)O1 DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N 0.000 description 1
- 102000011045 Chloride Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010062745 Chloride Channels Proteins 0.000 description 1
- 229940107161 Cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 241001124134 Chrysomelidae Species 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- NXTYATMDWQYLGJ-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS NXTYATMDWQYLGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 1
- 239000005899 Fipronil Substances 0.000 description 1
- ZOCSXAVNDGMNBV-UHFFFAOYSA-N Fipronil Chemical compound NC1=C(S(=O)C(F)(F)F)C(C#N)=NN1C1=C(Cl)C=C(C(F)(F)F)C=C1Cl ZOCSXAVNDGMNBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001611586 Galeruca Species 0.000 description 1
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229940049906 Glutamate Drugs 0.000 description 1
- SSHIXEILTLPAQT-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Aspartate Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O SSHIXEILTLPAQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Histidine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLSDNFWKGFJIBZ-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O CLSDNFWKGFJIBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-O Glyphosate Chemical compound OC(=O)C[NH2+]CP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NIKBMHGRNAPJFW-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Arginine Chemical compound NC(=N)NCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TUYOFUHICRWDGA-CIUDSAMLSA-N Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC TUYOFUHICRWDGA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 239000005907 Indoxacarb Substances 0.000 description 1
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N L-tyrosyl-L-tyrosine Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 229920001320 Leader sequence (mRNA) Polymers 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-ZFWWWQNUSA-N Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Asparagine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGRMTQMIDNDFAA-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Histidine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 IGRMTQMIDNDFAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001776 Mature messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000035633 Metabolized Effects 0.000 description 1
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 1
- 235000008098 Oxalis acetosella Nutrition 0.000 description 1
- 101700082982 PAT0 Proteins 0.000 description 1
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OHUXOEXBXPZKPT-STQMWFEESA-N Phe-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 OHUXOEXBXPZKPT-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N Phenylalanyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229950008679 Protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N RIFAMPICIN Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VEMKTZHHVJILDY-FIWHBWSRSA-N Resmethrin Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)C1C(=O)OCC1=COC(CC=2C=CC=CC=2)=C1 VEMKTZHHVJILDY-FIWHBWSRSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004418 Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940081190 Rifampin Drugs 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfizole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L Sulphite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N Thr-Gln Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N Thr-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 229920000401 Three prime untranslated region Polymers 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Asparagine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008214 Trifolium repens Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)=CNC2=C1 LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- NZCPCJCJZHKFGZ-UHFFFAOYSA-N Tryptophyl-Glutamine Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 NZCPCJCJZHKFGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N Tyr-Trp Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C([O-])=O)C1=CC=C(O)C=C1 BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Aspartate Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100011083 UBC Human genes 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 1
- 229940088594 Vitamin Drugs 0.000 description 1
- 102000034433 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020000715 acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010078114 alanyl-tryptophyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 244000062662 apex predator Species 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 101710006851 bath-42 Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960001901 bioallethrin Drugs 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal Effects 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative Effects 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003111 delayed Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 241001233061 earthworms Species 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 1
- 229940013764 fipronil Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- JLJLRLWOEMWYQK-OBDJNFEBSA-N gibberellin A1 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@@]2(OC3=O)[C@H]1[C@@]3(C)[C@@H](O)CC2 JLJLRLWOEMWYQK-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108010010096 glycyl-glycyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010033719 glycyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine zwitterion Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 230000035929 gnawing Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 1
- 229930000073 hydroprenes Natural products 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- VBCVPMMZEGZULK-NRFANRHFSA-N indoxacarb Chemical compound C([C@@]1(OC2)C(=O)OC)C3=CC(Cl)=CC=C3C1=NN2C(=O)N(C(=O)OC)C1=CC=C(OC(F)(F)F)C=C1 VBCVPMMZEGZULK-NRFANRHFSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 239000003621 irrigation water Substances 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 1
- QBSJMKIUCUGGNG-UHFFFAOYSA-N isoprocarb Chemical compound CNC(=O)OC1=CC=CC=C1C(C)C QBSJMKIUCUGGNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large scale production Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010044655 lysylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 101700052672 mix-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- YTYGAJLZOJPJGH-UHFFFAOYSA-N noviflumuron Chemical compound FC1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=C(Cl)C=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F YTYGAJLZOJPJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N p-acetaminophenol Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 1
- 108010058453 phenylalanyl-glutamyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010064486 phenylalanyl-leucyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 230000006308 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 230000036678 protein binding Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive Effects 0.000 description 1
- 229940108410 resmethrin Drugs 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000979 retarding Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920002973 ribosomal RNA Polymers 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical compound OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000152 swallowing Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003313 weakening Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N α-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Proline Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Serine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области защиты растений, особенно, защиты сельскохозяйственных культур. В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду и способу борьбы с нашествием насекомых, и, особенно, к способу борьбы с нашествием Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) за счет уменьшения или прекращения экспрессии целевой последовательности в Monolepta hieroglyphica с использованием технологии РНКи.The present invention relates to the field of plant protection, especially crop protection. In particular, the present invention relates to a polynucleotide and method for controlling insect infestation, and especially a method for controlling Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) infestation by reducing or stopping the expression of a target sequence in Monolepta hieroglyphica using RNAi technology.
Уровень техникиState of the art
Сельскохозяйственные культуры, как правило, являются мишенью для насекомых. За последние несколько десятилетий были достигнуты некоторые существенные успехи в разработке более эффективных способов и композиций против нападения насекомых на сельскохозяйственные культуры. Например, для борьбы с вредными насекомыми применяют химические инсектициды, микробные инсектициды и способы генетической инженерии.Agricultural crops are generally targeted by insects. Over the past few decades, there have been some significant advances in the development of more effective methods and compositions against insect attack on crops. For example, chemical insecticides, microbial insecticides, and genetic engineering methods are used to control harmful insects.
Химические инсектициды являются относительно эффективным средством борьбы с нашествием вредных насекомых. Однако использование химических пестицидов также имеет много недостатков. Прежде всего, химические инсектициды неселективны. Люди намереваются использовать химические инсектициды для борьбы с насекомыми, которые вредны для многих сельскохозяйственных культур и других растений. Однако из-за отсутствия селективности химические инсектициды также вредны для нецелевых организмов, таких как дождевые черви. Кроме того, после периода применения химических пестицидов они, как правило, делают поля бесплодными. Химические пестициды постоянно существуют в окружающей среде и, как правило, медленно метаболизируются. Этот медленный метаболизм вызывает накопление остатков химических пестицидов в сельскохозяйственных культурах и окружающей среде, так что они могут накапливаться в пищевой цепи, особенно в пищевой цепи высших хищников. Накопление этих химических пестицидов может вызывать заболевания у более совершенных видов, такие как злокачественные опухоли у человека. Monolepta hieroglyphica переживает зиму в виде яйца в почве, и личинки также живут в почве после вылупления в июне следующего года. Однако из-за широкомасштабной популяризации в последние годы возвращения соломы на поле, сложность использования химических пестицидов для борьбы с Monolepta hieroglyphica увеличивается с каждым годом. Тем более, что с конца июля до начала августа взрослая особь Monolepta hieroglyphica выкапывается из земли и в это время вырастает кукуруза, и применять химические пестициды для борьбы с вредителями становится еще сложнее.Chemical insecticides are relatively effective in controlling pest infestations. However, the use of chemical pesticides also has many disadvantages. First of all, chemical insecticides are not selective. People intend to use chemical insecticides to control insects that are harmful to many crops and other plants. However, due to their lack of selectivity, chemical insecticides are also harmful to non-target organisms such as earthworms. Also, after a period of application of chemical pesticides, they tend to render fields barren. Chemical pesticides are constantly present in the environment and are usually slowly metabolized. This slow metabolism causes chemical pesticide residues to build up in crops and the environment so that they can accumulate in the food chain, especially in the food chain of top predators. Accumulation of these chemical pesticides can cause diseases in more advanced species, such as malignant tumors in humans. Monolepta hieroglyphica survives the winter as an egg in the soil, and the larvae also live in the soil after hatching in June of the following year. However, due to the large-scale promotion in recent years of the return of straw to the field, the difficulty of using chemical pesticides to control Monolepta hieroglyphica is increasing every year. Moreover, from late July to early August, an adult Monolepta hieroglyphica digs out of the ground and corn grows at this time, and it becomes even more difficult to apply chemical pesticides to control pests.
Микробные инсектициды, особенно инсектициды, полученные из штаммов Bacillus thuringiensis (Bt) в качестве заменителей химических инсектицидов, играют важную роль в сельскохозяйственном производстве и проявляют определенную инсектицидную активность против насекомых, таких как Lepidoptera, Diptera и Coleoptera. Однако микробные инсектициды предъявляют относительно высокие требования к среде применения. Если среда не подходит для роста этих микроорганизмов, требуется повторное применение в производстве, а в некоторых случаях даже повторное нанесение не может достичь цели борьбы с вредителями, что значительно увеличивает производственные затраты.Microbial insecticides, especially insecticides derived from strains of Bacillus thuringiensis (Bt) as substitutes for chemical insecticides, play an important role in agricultural production and exhibit certain insecticidal activity against insects such as Lepidoptera, Diptera and Coleoptera. However, microbial insecticides place relatively high demands on the application environment. If the medium is not suitable for the growth of these microorganisms, re-application in production is required, and in some cases, even re-application cannot achieve the goal of pest control, which greatly increases production costs.
Один или несколько генов, кодирующих инсектицидный белок Bt, переносят в растения посредством генетической инженерии, и можно получать некоторые трансгенные растения с повышенной устойчивостью к вредителям. Например, растения кукурузы и хлопка, которые были генетически сконструированы для производства токсинов Cry, широко используются в сельскохозяйственном производстве в США и предоставляют фермерам альтернативу традиционным методам борьбы с вредителями. Однако разработанные в настоящее время генетически модифицированные сельскохозяйственные культуры, содержащие токсин Cry, можно использовать только для борьбы с относительно узким кругом жесткокрылых вредителей, таких как кукурузный корневой жук и колорадский жук. Для одного из основных вредителей кукурузы, Monolepta hieroglyphica, нет сообщений о применении токсина Cry для профилактики и лечения.One or more genes encoding the insecticidal Bt protein are transferred into plants through genetic engineering, and some transgenic plants with increased resistance to pests can be obtained. For example, corn and cotton plants that have been genetically engineered to produce Cry toxins are widely used in U.S. agricultural production and provide farmers with an alternative to traditional pest control methods. However, currently developed genetically modified crops containing Cry toxin can only be used to control a relatively narrow range of beetle pests such as corn root beetle and Colorado potato beetle. For one of the main pests of corn, Monolepta hieroglyphica, there are no reports of the use of Cry toxin for prevention and treatment.
Ввиду ограничений вышеупомянутых способов существует острая необходимость в способе борьбы с атаками насекомых или способе искоренения атак насекомых в процессе производства сельскохозяйственных культур, особенно борьбы с нашествием Monolepta hieroglyphica, способе, который является экологически чистым (т.е. селективным, экологически чистым и биоразлагаемым) и может часто использоваться в системе управления устойчивостью к вредителям.In view of the limitations of the above methods, there is a strong need for a method for controlling insect attacks or a method for eradicating insect attacks in a crop production process, especially for controlling Monolepta hieroglyphica infestation, a method that is environmentally friendly (i.e., selective, environmentally friendly, and biodegradable) and can often be used in a pest resistance management system.
РНК-интерференцию или РНКи можно использовать для подавления экспрессии гена в клетке или целом организме на основании его последовательности. Нацеленного вмешательства в экспрессию гена-мишени можно достичь путем специфического отбора мишени и эффективного подавления мРНК. Хотя использование технологии РНКи для борьбы с вредителями известно в данной области, ввиду большого разнообразия насекомых эта технология не только оказывает очень разное воздействие на разных насекомых, но также ключевым фактором для использования этой технологии в качестве меры по борьбе с вредителями является выбор наиболее подходящих генов-мишеней, то есть тех генов, потеря функции которых приводит к серьезному разрушению основных биологических процессов и/или гибели организмов. Таким образом, в настоящем изобретении используется негативная регуляция конкретных генов-мишеней у вредителей как средство борьбы с нашествием насекомых, особенно, с целью борьбы с нашествием насекомых у растенияй.RNA interference or RNAi can be used to suppress the expression of a gene in a cell or whole organism based on its sequence. Targeted interference with target gene expression can be achieved by specific target selection and effective mRNA silencing. Although the use of RNAi technology for pest control is known in the art, due to the wide variety of insects, this technology not only has very different effects on different insects, but also a key factor for using this technology as a pest control measure is the choice of the most appropriate genes - targets, i.e. those genes, the loss of function of which leads to a serious destruction of the main biological processes and/or death of organisms. Thus, the present invention uses the down-regulation of specific target genes in pests as a means of controlling insect infestation, especially for the purpose of controlling insect infestation in plants.
СущностьEssence
Задачей настоящего изобретения является создание полинуклеотида и способа борьбы с вторжением насекомого, то есть использование технологии РНКи для подавления экспрессии гена-мишени: ослабление способности насекомых выживать, расти, размножаться, колонизироваться в определенной окружающей среде и/или вторгаться в хозяина, и, таким образом, борьба с нашествием насекомых и вызываемыми ими повреждениями.The object of the present invention is to provide a polynucleotide and a method for combating insect invasion, that is, using RNAi technology to suppress the expression of a target gene: weakening the ability of insects to survive, grow, reproduce, colonize in a certain environment and/or invade a host, and thus , the fight against the invasion of insects and the damage they cause.
Для решения вышеуказанной задачи настоящее изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, где полинуклеотид выбран из:To solve the above problem, the present invention relates to an isolated polynucleotide, where the polynucleotide is selected from:
(а) полинуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1; или(a) the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1; or
(b) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 15 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(b) a polynucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or
(c) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 17 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(c) a polynucleotide sequence of at least 17 consecutive nucleotides from SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or
(d) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 19 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(d) a polynucleotide sequence of at least 19 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or
(e) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 21 последовательного нуклеотида из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(e) a polynucleotide sequence of at least 21 consecutive nucleotides from SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or
(f) любой из полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: от 3 до 20; или(f) any of the polynucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 to 20; or
(g) полинуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью или комплементарна полинуклеотидной последовательности, как определено в любом из пунктов от (а) до (f), при жестких условиях.(g) a polynucleotide sequence that hybridizes to, or is complementary to, a polynucleotide sequence as defined in any of (a) to (f), under stringent conditions.
Дополнительно, полинуклеотид также включает последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности.Additionally, the polynucleotide also includes a sequence that is complementary to the polynucleotide sequence.
Дополнительно, полинуклеотид также содержит спейсерную последовательность.Additionally, the polynucleotide also contains a spacer sequence.
Предпочтительно, спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 23.Preferably, the spacer sequence is SEQ ID NO: 23.
В вариантах осуществления, основанных на вышеуказанных технических решениях, жесткокрылым насекомым-вредителем является Monolepta hieroglyphica.In embodiments based on the above technical solutions, the beetle pest is Monolepta hieroglyphica.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к экспрессионной кассете, содержащей полинуклеотидную последовательность под контролем функционально связанной регуляторной последовательности.To achieve the above object, the present invention also relates to an expression cassette containing a polynucleotide sequence under the control of an operably linked regulatory sequence.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к рекомбинантному вектору, содержащему полинуклеотидную последовательность или экспрессионную кассету.To achieve the above object, the present invention also relates to a recombinant vector containing a polynucleotide sequence or an expression cassette.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к использованию полинуклеотида для вмешательства в экспрессию целевой последовательности жесткокрылых насекомых-вредителей или для ингибирования роста жесткокрылых насекомых-вредителей.In order to achieve the above object, the present invention also relates to the use of a polynucleotide to interfere with the expression of a target sequence of a beetle pest or to inhibit the growth of a beetle pest.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте, которая после того, как интерферирующая рибонуклеиновая кислота попадает в организм жесткокрылого насекомого-вредителя, подавляет экспрессию, по меньшей мере, одного гена-мишени у жесткокрылого насекомого-вредителя, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один элемент сайленсинга, где элемент сайленсинга представляет собой двухцепочечную область РНК, содержащую соединенные комплементарные цепи, где одна цепь содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени, и ген-мишень содержит полинуклеотидную последовательность.In order to achieve the above object, the present invention also relates to an interfering ribonucleic acid which, after the interfering ribonucleic acid enters the body of a hemipteran pest, suppresses the expression of at least one target gene in the hemipteran pest, wherein the interfering ribonucleic acid contains at least one silencing element, where the silencing element is a double-stranded region of RNA containing connected complementary strands, where one strand contains a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene , and the target gene contains a polynucleotide sequence.
Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 15 последовательных нуклеотидов, которая, по меньшей мере, частично комплементарны целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains or consists of a nucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides that is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.
Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 17 последовательных нуклеотидов, которая, по меньшей мере, частично комплементарны целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence of at least 17 consecutive nucleotides, which is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.
Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 19 последовательных нуклеотидов, которая, по меньшей мере, частично комплементарны целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains or consists of a nucleotide sequence of at least 19 consecutive nucleotides that is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.
Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 21 последовательного нуклеотида, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains or consists of a nucleotide sequence of at least 21 consecutive nucleotides that is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.
Альтернативно, интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, два элемента сайленсинга, и каждый из элементов сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени.Alternatively, the interfering ribonucleic acid contains at least two silencing elements, and each of the silencing elements contains or consists of a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene.
Дополнительно, каждый из элементов сайленсинга содержит или включает разные нуклеотидные последовательности, комплементарные другой целевой последовательности.Additionally, each of the silencing elements contains or includes different nucleotide sequences that are complementary to another target sequence.
Дополнительно, другая целевая последовательность происходит исключительно из гена-мишени или происходит из дополнительного гена-мишени, отличного от гена-мишени.Additionally, the other target sequence is derived exclusively from the target gene or is derived from an additional target gene other than the target gene.
Дополнительный ген-мишень, отличный от гена-мишени, получен от того же жесткокрылого насекомого-вредителя или от другого жесткокрылого насекомого-вредителя.An additional target gene other than the target gene is derived from the same beetle pest or from another beetle pest.
Предпочтительно, жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica.Preferably, the beetle pest is Monolepta hieroglyphica.
В вариантах осуществления, основанных на вышеуказанных технических решениях, интерферирующая рибонуклеиновая кислота дополнительно содержит спейсерную последовательность.In embodiments based on the above technical solutions, the interfering ribonucleic acid further comprises a spacer sequence.
В частности, спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 23.In particular, the spacer sequence is SEQ ID NO: 23.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к композиции для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, содержащей, по меньшей мере, одну из интерферирующих рибонуклеиновых кислот и, по меньшей мере, один подходящий носитель, эксципиент или разбавитель.To achieve the above object, the present invention also relates to a composition for combating the invasion of beetle pests, containing at least one of the interfering ribonucleic acids and at least one suitable carrier, excipient or diluent.
Дополнительно композиция содержит клетку-хозяина, которая экспрессирует или способна экспрессировать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту. В частности, клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.Additionally, the composition contains a host cell that expresses or is capable of expressing an interfering ribonucleic acid. In particular, the host cell is a bacterial cell.
Кроме того, композиция представляет собой твердое вещество, жидкость или гель. В частности, композиция представляет собой инсектицидный спрей.In addition, the composition is a solid, liquid or gel. In particular, the composition is an insecticidal spray.
Необязательно, композиция содержит по меньшей мере один инсектицид, в котором инсектицид представляет собой химический инсектицид, специфический белок клубней картофеля, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, инсектицидный белок Xenorhabdus ehlersii, инсектицидный белок Photorhabdus luminescens, инсектицидный белок Bacillus laterosporus или инсектицидный белок Bacillus sphaericus.Optionally, the composition comprises at least one insecticide, wherein the insecticide is a chemical insecticide, a potato tuber specific protein, a Bacillus thuringiensis insecticidal protein, a Xenorhabdus ehlersii insecticidal protein, a Photorhabdus luminescens insecticidal protein, a Bacillus laterosporus insecticidal protein, or a Bacillus sphaericus insecticidal protein.
Для решения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к применению композиции для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей для профилактики нашествия и/или борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей.In order to achieve the above object, the present invention also relates to the use of a beetle pest control composition for preventing and/or controlling beetle pest infestation.
Предпочтительно, жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica.Preferably, the beetle pest is Monolepta hieroglyphica.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, включающему контактирование жесткокрылых насекомых-вредителей с эффективным количеством, по меньшей мере, одной из последовательностей интерферирующей рибонуклеиновой кислоты.To achieve the above object, the present invention also relates to a method for controlling the invasion of hemipteran pests, comprising contacting the hemipteran pests with an effective amount of at least one of the interfering ribonucleic acid sequences.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу повышения устойчивости растений к жесткокрылому насекомому-вредителю, включающему введение в растение полинуклеотида или экспрессионной кассеты, или рекомбинантного вектора или конструкции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.In order to achieve the above object, the present invention also relates to a method for increasing the resistance of plants to a hemipteran insect pest, comprising introducing into a plant a polynucleotide or an expression cassette, or a recombinant vector or construct containing an interfering ribonucleic acid.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу получения растения для борьбы с жесткокрылым насекомым-вредителем, включающему введение в растение полинуклеотида или экспрессионной кассеты, или рекомбинантного вектора или конструкции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.To achieve the above object, the present invention also relates to a method for producing a plant for combating a hemipteran insect pest, comprising introducing into the plant a polynucleotide or an expression cassette, or a recombinant vector or construct containing an interfering ribonucleic acid.
Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу защиты растения от повреждения, вызываемого жесткокрылым насекомым-вредителем, включающим введение в растение полинуклеотида или экспрессионной кассеты, или рекомбинантного вектора или конструкции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, где растение после введения подавляет рост жесткокрылых насекомых-вредителей после того, как его поедают жесткокрылые насекомые-вредители.To achieve the above object, the present invention also relates to a method for protecting a plant from damage caused by a hemipteran insect pest, comprising introducing into the plant a polynucleotide or an expression cassette, or a recombinant vector or construct containing an interfering ribonucleic acid, where the plant, after administration, inhibits the growth of hemipteran insects - pests after being eaten by beetle pests.
В вариантах осуществления, основанных на вышеуказанных технических решениях, растение представляет собой сою, пшеницу, ячмень, кукурузу, табак, рис, рапс, хлопок или подсолнечник.In embodiments based on the above technical solutions, the plant is soybean, wheat, barley, corn, tobacco, rice, rapeseed, cotton, or sunflower.
Настоящее изобретение включает способ регулирования или ингибирования экспрессии одного или нескольких генов-мишеней у жесткокрылого насекомого-вредителя, способ, включающий введение части или целой стабилизированной двухцепочечной РНК (дцРНК) или ее модифицированной формы (например, последовательности малой интерферирующей РНК) в клетку или внеклеточную среду беспозвоночного вредного насекомого. В организме насекомого дцРНК или миРНК проникает в клетки, подавляя экспрессию, по меньшей мере, одного или нескольких генов-мишеней, и это ингибирование снижает способность насекомого выживать, расти, воспроизводиться и вторгаться в хозяина.The present invention includes a method for regulating or inhibiting the expression of one or more target genes in a hemipteran insect pest, a method comprising introducing a portion or whole of a stabilized double-stranded RNA (dsRNA) or a modified form thereof (e.g., a small interfering RNA sequence) into a cell or extracellular environment invertebrate pest. In the insect body, dsRNA or siRNA enters cells to repress the expression of at least one or more target genes, and this inhibition reduces the insect's ability to survive, grow, reproduce and invade the host.
Подробное описаниеDetailed description
Далее в настоящем документе будут подробно описаны различные аспекты настоящего изобретения.Hereinafter, various aspects of the present invention will be described in detail.
Monolepta hieroglyphica и повреждение сельскохозяйственных культурMonolepta hieroglyphica and crop damage
Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) по настоящему изобретению представляет собой голометаболическое насекомое из отрядов Galeruca, Chrysomelidae, Coleoptera. Его яйцо, личинки и куколки живут в почве, а взрослое насекомое вылетает из почвы после вылупления. Это однолетнее насекомое зимует в виде диапаузных яиц. Диапаузные яйца начинают вылупляться в мае каждого года, а личинки можно наблюдать в полевой почве с мая до начала июля; куколки можно увидеть в поле с конца июня до середины июля; взрослые особи появляются время от времени и летают на кукурузные, соевые и другие поля, чтобы нанести ущерб; пиковый период вылупления происходит с конца июля до начала августа; приблизительно через 15 суток после вылупления, может начаться отложение яиц, и период размножения длится приблизительно 1 месяц.Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) according to the present invention is a holometabolic insect from the orders Galeruca, Chrysomelidae, Coleoptera. Its egg, larvae and pupae live in the soil, and the adult flies out of the soil after hatching. This annual insect hibernates as diapause eggs. Diapause eggs begin to hatch in May of each year, and larvae can be observed in the field soil from May to early July; pupae can be seen in the field from late June to mid-July; adults appear from time to time and fly into corn, soybean and other fields to cause damage; the peak hatching period occurs from late July to early August; about 15 days after hatching, egg laying can begin and the breeding season lasts about 1 month.
Личинки Monolepta hieroglyphica, в основном, питаются корнями сельскохозяйственных культур в полевых условиях, и повреждение личинками не отражается на надземных частях; ежегодно в середине июля взрослые особи повреждают листья кукурузы и сои; большое количество взрослых особей в основном повреждает волокна кукурузы с конца июля до начала августа, в результате чего кукурузные волокна откусываются, что серьезно влияет на опыление и колосья остаются заостренными и веретеновидными, что приводит к сокращению производства кукурузы; затем Monolepta hieroglyphica перемещается на соевые поля, чтобы питаться листьями сои, или перемещается на окружающие овощные поля, чтобы нанести вред овощам. С 2009 по 2016 год в Китае площадь кукурузы, пораженной Monolepta hieroglyphica, увеличилась с 16 миллионов му до почти 40 миллионов му, а площадь распространения увеличилась вдвое. Зона поражения также распространилась с северо-запада и других мест на основные районы производства кукурузы, такие как северо-восток и север Китая.The larvae of Monolepta hieroglyphica mainly feed on crop roots in the field, and larval damage does not affect aboveground parts; annually in mid-July, adults damage the leaves of corn and soybeans; a large number of adults mainly damage the corn fibers from late July to early August, causing the corn fibers to be bitten off, which seriously affects pollination and the ears remain pointed and fusiform, resulting in a reduction in corn production; then Monolepta hieroglyphica moves to soybean fields to feed on soybean leaves, or moves to surrounding vegetable fields to harm vegetables. From 2009 to 2016, in China, the area of maize affected by Monolepta hieroglyphica increased from 16 million mu to almost 40 million mu, and the area of distribution doubled. The affected area has also spread from the northwest and elsewhere to major corn production areas such as the northeast and north of China.
В то же время, постоянное совершенствование мер по возврату соломы, постоянное обогащение полевого гумуса и увеличение поверхностного покрова почвы затрудняют внесение пестицидов в почву, и профилактика, и борьба с личинками Monolepta hieroglyphica становятся более серьезными и трудными. Иными словами, естественная защита, обеспечиваемая личинкам Monolepta hieroglyphica возвращаемой соломой, может значительно увеличить коэффициент выживаемости личинок Monolepta hieroglyphica, тем самым вызывая увеличение плотности популяции Monolepta hieroglyphica. Взрослые особи Monolepta hieroglyphica представляют собой хорошо летающих и прыгучих насекомых, и начинают повреждать кукурузу после вылупления с середины до конца июля, когда кукуруза вступает в период опушения. В это время кукуруза становится выше, сложность применения пестицидов возрастает, и легко спровоцировать трагедию, что пестициды случайно повредят опрыскивателям. В то же время их неселективное инсектицидное действие может вызывать повреждение сельскохозяйственных культур и нецелевых органических веществ. Кроме того, химические пестициды могут иметь кумулятивное воздействие на организм человека и становиться мутагенами или канцерогенами. Таким образом, необходимо иметь точный, экологически чистый и простой в использовании способ, позволяющий фермерам бороться с ущербом, наносимым Monolepta hieroglyphica. За счет генетической модификации сельскохозяйственная культура оказывает определенное воздействие против насекомых в течение всего периода роста и обеспечивает защиту всего растения и всего периода роста.At the same time, the constant improvement of straw return measures, the constant enrichment of field humus and the increase in the surface soil cover make it difficult to apply pesticides to the soil, and the prevention and control of Monolepta hieroglyphica larvae become more serious and difficult. In other words, the natural protection provided to Monolepta hieroglyphica larvae by returned straw can significantly increase the survival rate of Monolepta hieroglyphica larvae, thereby causing an increase in Monolepta hieroglyphica population density. Adult Monolepta hieroglyphica are well-flying and jumping insects, and begin to damage corn after hatching from mid to late July, when the corn enters its hairy period. At this time, the corn is getting taller, the difficulty of applying pesticides is increasing, and it is easy to provoke a tragedy that pesticides accidentally damage the sprayers. At the same time, their non-selective insecticidal action can cause damage to crops and non-target organic matter. In addition, chemical pesticides can have a cumulative effect on the human body and become mutagens or carcinogens. Thus, it is necessary to have an accurate, environmentally friendly and easy-to-use way to enable farmers to combat the damage caused by Monolepta hieroglyphica. Through genetic modification, the crop has a certain effect against insects during the entire growth period and provides protection for the entire plant and the entire growth period.
Исходя из вышеупомянутых проблем, одним из лучших решений является применение способа генетически модифицированных РНКи, способных контролировать Monolepta hieroglyphica и обеспечивать профилактику и борьбу в течение полного периода роста и всего растения кукурузы, сои и других сельскохозяйственных культур.Based on the above problems, one of the best solutions is to use the method of genetically modified RNAi, able to control Monolepta hieroglyphica and provide prevention and control throughout the entire growth period and the whole plant of corn, soybean and other crops.
РНКи и полинуклеотидная последовательностьRNAi and polynucleotide sequence
Настоящее изобретение в основном относится к технологии РНКи. В настоящем изобретении «РНК-интерференция (РНКи)» относится к тому, что некоторые РНК могут эффективно и специфично блокировать экспрессию конкретных генов in vivo, способствовать деградации мРНК и побуждать клетки проявлять фенотип делеции конкретного гена. Ее еще называют вмешательством РНК или интерференцией. РНК-интерференция представляет собой высокоспецифичный механизм подавления генов на уровне мРНК.The present invention mainly relates to RNAi technology. In the present invention, "RNA interference (RNAi)" refers to the fact that certain RNAs can effectively and specifically block the expression of specific genes in vivo, promote mRNA degradation, and induce cells to exhibit a specific gene deletion phenotype. It is also called RNA interference or interference. RNA interference is a highly specific mechanism for gene silencing at the mRNA level.
В настоящем изобретении, РНК-интерференцию или РНКи применяют для снижения экспрессии гена. РНКи представляет собой способ регуляции генов на основе последовательности, как правило, опосредованный двухцепочечной молекулой РНК (такой как миРНК). миРНК содержит смысловую цепь РНК, которая спаривается за счет комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК. Смысловая или «направляющая цепь» молекулы миРНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, расположенной в транскрипте РНК гена-мишени. Таким образом, смысловая цепь миРНК может быть спарена с транскриптом РНК посредством спаривания оснований типа Уотсона-Крика и нацелена на РНК, чтобы разрушить в клетке комплекс, называемый РНКи-индуцированный комплекс сайленсинга или RISC.In the present invention, RNA interference or RNAi is used to reduce gene expression. RNAi is a sequence-based gene regulation method, typically mediated by a double-stranded RNA molecule (such as siRNA). The miRNA contains an RNA sense strand that pairs by complementary base pairing with an antisense RNA strand. The sense or "guide strand" of an siRNA molecule includes a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence located in the RNA transcript of the target gene. Thus, the siRNA sense strand can be paired with the RNA transcript via Watson-Crick type base pairing and targeted to the RNA to disrupt a complex in the cell called the RNAi-Induced Silencing Complex or RISC.
Настоящее изобретение относится к изолированному и очищенному полинуклеотиду, последовательность которого показана в SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение также относится к любой РНК, включая дцРНК, экспрессируемой из полинуклеотида. Настоящее изобретение относится к стабилизированной двухцепочечной молекуле РНК для ингибирования экспрессии целевой последовательности жесткокрылых вредителей. При экспрессии в виде дцРНК и предоставлении вредителю, фрагмент можно определить как фрагмент, который заставляет вредителя погибать, препятствует питанию, блокирует или останавливает.Фрагмент может, например, содержать по меньшей мере, приблизительно 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 или более последовательных нуклеотидов, или приблизительно от 19 до приблизительно 100 или более нуклеотидов из SEQ ID NO: 1 или ее комплементарной последовательности, такой как SEQ ID NO: с 3 до 20. Особенно подходящей является последовательность дцРНК, содержащая приблизительно от 19 до 300 нуклеотидов, гомологичных целевой последовательности вредителя.The present invention relates to an isolated and purified polynucleotide, the sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1. The present invention also relates to any RNA, including dsRNA, expressed from a polynucleotide. The present invention relates to a stabilized double-stranded RNA molecule for inhibiting the expression of a target sequence in a beetle pest. When expressed as dsRNA and presented to a pest, a fragment can be defined as a fragment that causes the pest to die, interfere with feeding, block or stop. The fragment may, for example, contain at least about 19, 21, 23, 25, 40, 80, 100, 125 or more consecutive nucleotides, or from about 19 to about 100 or more nucleotides from SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, such as SEQ ID NO: 3 to 20. Particularly suitable is a dsRNA sequence containing about from 19 to 300 nucleotides homologous to the target pest sequence.
Стабилизированная двухцепочечная РНК содержит, по меньшей мере, две кодирующих последовательности, которые расположены в смысловом и антисмысловом направлениях относительно, по меньшей мере, одного промотора, где нуклеотидные последовательности, содержащие смысловую цепь и антисмысловую цепь, связаны через спейсерную последовательность, по меньшей мере, длиной приблизительно от 5 до 1000 нуклеотидов, где смысловая цепь и антисмысловая цепь могут иметь разную длину, и где, по меньшей мере, одна из двух кодирующих последовательностей имеет идентичность последовательности, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или 100% с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1.The stabilized double-stranded RNA contains at least two coding sequences that are located in the sense and antisense directions relative to at least one promoter, where the nucleotide sequences containing the sense strand and the antisense strand are linked via a spacer sequence of at least a length about 5 to 1000 nucleotides, where the sense strand and antisense strand may be of different lengths, and where at least one of the two coding sequences has a sequence identity of at least 80%, at least 90%, at least at least 95%, at least 98% or 100% with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Термин «борьба с насекомыми» или «борьба с вредителями» или «борьба с насекомыми-вредителями» в настоящем изобретении относится к любому эффекту, который может ограничить ущерб, причиняемый насекомым, и действовать на насекомое, включая в качестве неограничивающих примеров уничтожение насекомых, замедление развития насекомого, изменение размножения или роста насекомого таким образом, что насекомое наносит меньший ущерб растению, уменьшение количества потомства, производимого насекомым, производство меньшего количества нормальных насекомых, создание насекомого, более уязвимого для хищника, или предотвращение того, чтобы насекомое поедало растение.The term "insect control" or "pest control" or "insect pest control" in the present invention refers to any effect that can limit the damage caused by insects and act on an insect, including, but not limited to, killing insects, retarding development of an insect, altering the reproduction or growth of an insect so that the insect causes less damage to the plant, reducing the number of offspring produced by the insect, producing fewer normal insects, making the insect more vulnerable to a predator, or preventing the insect from eating the plant.
«Ген-мишень», описанный в настоящем изобретении, представляет собой любую последовательность, которая предназначена для подавления у насекомых. Нашествие насекомых контролируется подавлением генов-мишеней, таким как разрушение важного биологического процесса у насекомых. Таким образом, предпочтительный ген-мишень в качестве неограничивающих примеров включает ген, который играет ключевую роль в регулировании кормления, выживания, роста, развития, размножения, нашествия и заражения. Когда экспрессия генов-мишеней подавляется или ингибируется, по меньшей мере, 30% насекомых погибают; или, по меньшей мере, у 30% насекомых предотвращен/задерживается/затруднен/отстает/блокируется рост, или, по меньшей мере, у 30% насекомых не происходит размножения, или, по меньшей мере, у 30% насекомых предотвращается переход через жизненный цикл; или снижен ущерб, причиненный насекомыми, и/или способность насекомых заражать или вторгаться в окружающую среду, на поверхности и/или растения или сельскохозяйственную культуру; или, по меньшей мере, 30% насекомых перестают поедать свои естественные пищевые ресурсы (такие как растения и растительные продукты). Эти гены-мишени можно экспрессировать во всех или в части клеток насекомых. Кроме того, эти гены-мишени можно экспрессировать только на определенной стадии жизненного цикла насекомых, такой как стадия взрослого или личиночная стадия, или стадия яйца.A "target gene" described in the present invention is any sequence that is intended to be suppressed in insects. Insect invasion is controlled by suppression of target genes, such as disruption of an important biological process in insects. Thus, a preferred target gene includes, but is not limited to, a gene that plays a key role in the regulation of feeding, survival, growth, development, reproduction, invasion, and infection. When expression of target genes is suppressed or inhibited, at least 30% of insects die; or at least 30% of insects are prevented/delayed/hindered/lagged/blocked in growth, or at least 30% of insects do not reproduce, or at least 30% of insects are prevented from passing through the life cycle ; or reduced damage caused by insects and/or the ability of insects to infect or invade the environment, surfaces and/or plants or crops; or at least 30% of insects stop eating their natural food resources (such as plants and plant products). These target genes can be expressed in all or part of the insect cells. In addition, these target genes can only be expressed at a certain stage in the insect life cycle, such as the adult or larval or egg stage.
В настоящем изобретении термин «вредитель» относится, предпочтительно, к насекомому, которое вызывает нашествие/нападение на растения/заражение растений, и принадлежит к Coleoptera, предпочтительно, Monolepta hieroglyphica. Термины «заражение», «нападение» и/или «нашествие» в настоящем изобретении в основном используются взаимозаменяемо.In the present invention, the term "pest" preferably refers to an insect that causes invasion/attack on plants/infection of plants and belongs to Coleoptera, preferably Monolepta hieroglyphica. The terms "infection", "attack" and/or "invasion" in the present invention are generally used interchangeably.
В настоящем изобретении "нуклеиновая кислота" относится к одно- или двухцепочечному полимеру из оснований дезоксирибонуклеиновой кислоты или рибонуклеиновой кислоты, которые читаются от 5'к 3'-концу. Необязательно, «нуклеиновая кислота» может также содержать неприродные или измененные основания, которые могут правильно считываться полимеразой без снижения экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. «Нуклеотидная последовательность» относится к смысловым и антисмысловым цепям нуклеиновой кислоты, которые существуют в виде отдельных однонитевых цепей или существуют в виде дуплекса. «Рибонуклеиновая кислота» (РНК) включает РНКи (РНК-интерференция), дцРНК (двухцепочечную РНК), миРНК (малую интерферирующую РНК), мРНК (матричную РНК), мкРНК (микроРНК), тРНК (транспортную РНК, которая несет или не несет соответствующую ацилированную аминокислоту), гибридную кДНК, геномную ДНК и ДНК-РНК. «Фрагмент нуклеиновой кислоты», «фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты» или более часто «фрагмент» будет пониматься специалистами в данной области как содержащий геномную последовательность, последовательность рибосомной РНК, последовательность транспортной РНК, последовательность матричной РНК, последовательность оперона и малую инженерно модифицированную нуклеотидную последовательность, где последовательность экспрессирует белок, полипептид или пептид или может быть модифицирована для экспрессии белка, полипептида или пептида.In the present invention, "nucleic acid" refers to a single- or double-stranded polymer of deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid bases that read from the 5' to the 3' end. Optionally, the "nucleic acid" may also contain non-natural or altered bases that can be correctly read by the polymerase without reducing the expression of the polypeptide encoded by the nucleic acid. "Nucleotide sequence" refers to sense and antisense nucleic acid strands that exist as separate single strands or exist as a duplex. "Ribonucleic acid" (RNA) includes RNAi (RNA interference), dsRNA (double-stranded RNA), miRNA (small interfering RNA), mRNA (messenger RNA), miRNA (miRNA), tRNA (transfer RNA that carries or does not carry the corresponding acylated amino acid), hybrid cDNA, genomic DNA and DNA-RNA. "Nucleic acid fragment", "nucleic acid sequence fragment" or more commonly "fragment" will be understood by those skilled in the art as containing a genomic sequence, a ribosomal RNA sequence, a transfer RNA sequence, a messenger RNA sequence, an operon sequence, and a small engineered nucleotide sequence, where the sequence expresses a protein, polypeptide or peptide or can be modified to express a protein, polypeptide or peptide.
«Интерферирующая рибонуклеиновая кислота» по настоящему изобретению включает любой тип молекулы РНК, который может подавлять или «выключать» экспрессию гена-мишени, включая в качестве неограничивающих примеров смысловую РНК, антисмысловую РНК, миРНК, мкРНК, дцРНК, шпилечную РНК и т.д. Способы определения функциональных интерферирующих молекул РНК описаны и хорошо известны в данной области.The "interfering ribonucleic acid" of the present invention includes any type of RNA molecule that can repress or "turn off" the expression of a target gene, including but not limited to sense RNA, antisense RNA, siRNA, miRNA, dsRNA, hairpin RNA, etc. Methods for determining functional interfering RNA molecules have been described and are well known in the art.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может специфически подавлять экспрессию гена-мишени путем связывания с целевой последовательностью в гене-мишени. Связывание происходит из-за спаривания оснований между интерферирующей РНК и комплементарной областью целевой последовательности.The interfering ribonucleic acid of the present invention can specifically suppress the expression of a target gene by binding to a target sequence in the target gene. Binding is due to base pairing between the interfering RNA and the complementary region of the target sequence.
Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты или ее фрагментам, которые гибридизуются (особенно специфически гибридизуются) с полинуклеотидом по настоящему изобретению в «жестких условиях». Как известно специалистам в данной области, молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагменты могут специфически гибридизоваться с другими молекулами нуклеиновой кислоты в определенных условиях. В настоящем изобретении, если две молекулы нуклеиновой кислоты могут образовывать антипараллельную структуру двухцепочечной нуклеиновой кислоты, это указывает, что две молекулы нуклеиновой кислоты могут специфически гибридизоваться друг с другом. Если две молекулы нуклеиновой кислоты демонстрируют полную комплементарность, это указывает, что одна из молекул нуклеиновой кислоты является «комплементарной» другой молекуле нуклеиновой кислоты. В настоящем изобретении, когда каждый нуклеотид одной молекулы нуклеиновой кислоты комплементарен соответствующему нуклеотиду другой молекулы нуклеиновой кислоты, это указывает на то, что две молекулы нуклеиновой кислоты демонстрируют «полную комплементарность». Если две молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизироваться друг с другом с достаточной стабильностью, так что они могут отжигаться и связываться друг с другом, по меньшей мере, при общепринятых условиях с «низкой жесткостью», это указывает, что две молекулы нуклеиновой кислоты являются «минимально комплементарными». Точно так же, если две молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, так что они могут отжигаться и связываться друг с другом при общепринятых условиях с «высокой жесткостью», это указывает, что две молекулы нуклеиновой кислоты имеют «комплементарность». Отклонение от полной комплементарности допустимо, при условии, что отклонение не полностью препятствует двум молекулам формировать двухцепочечную структуру. Для того чтобы молекула нуклеиновой кислоты действовала в качестве праймера или зонда, необходимо только убедиться, что она имеет достаточную комплементарность по последовательности, так что стабильная двухцепочечная структура может быть сформирована с используемым конкретным растворителем и солью. В настоящем изобретении по существу гомологичной последовательностью является молекула нуклеиновой кислоты, которая может специфически гибридизоваться с комплементарной цепью другой подходящей молекулы нуклеиновой кислоты в очень жестких условиях. Подходящие жесткие условия, способствующие гибридизации ДНК включают, например, обработку 6,0× хлоридом натрия/цитратом натрия (SSC) при приблизительно 45°C, промывание 2,0×SSC при 50°C, и эти условия хорошо известны специалистам в данной области. Например, концентрацию соли на этапе промывания можно выбирать приблизительно от 2,0× SSC, 50°C в условиях низкой жесткости до приблизительно 0,2× SSC, 50°C в условиях высокой жесткости. Кроме того, температурные условия на этапе промывания могут быть индуцированы от комнатной температуры приблизительно от 22°C в условиях низкой жесткости до приблизительно 65°C в очень жестких условиях. Температурные условия и концентрации соли могут изменяться или одна из них может оставаться неизменной, а другая переменная меняется. Предпочтительно, жесткие условия по настоящему изобретению могут заключаться в том, что специфическую гибридизацию с полинуклеотидом по настоящему изобретению проводят при 6× SSC, 0,5% растворе SDS при 65°C, а промывание проводят один раз с использованием каждого из 2× SSC, 0,1% SDS и 1× SSC и 0,1% SDS.In addition, the present invention relates to nucleic acid molecules or fragments thereof, which hybridize (especially specifically hybridize) with the polynucleotide of the present invention under "stringent conditions". As is known to those skilled in the art, nucleic acid molecules or fragments thereof can specifically hybridize with other nucleic acid molecules under certain conditions. In the present invention, if two nucleic acid molecules can form an antiparallel structure of a double-stranded nucleic acid, this indicates that the two nucleic acid molecules can specifically hybridize with each other. If two nucleic acid molecules show complete complementarity, this indicates that one of the nucleic acid molecules is "complementary" to the other nucleic acid molecule. In the present invention, when each nucleotide of one nucleic acid molecule is complementary to the corresponding nucleotide of another nucleic acid molecule, this indicates that the two nucleic acid molecules exhibit "full complementarity". If two nucleic acid molecules can hybridize with each other with sufficient stability such that they can anneal and bind to each other under at least conventional conditions with "low stringency", this indicates that the two nucleic acid molecules are "minimally complementary". ". Similarly, if two nucleic acid molecules can hybridize with each other with sufficient stability such that they can anneal and bind to each other under conventional conditions with "high stringency", this indicates that the two nucleic acid molecules have "complementarity". Deviation from complete complementarity is acceptable, provided that the deviation does not completely prevent the two molecules from forming a double-stranded structure. For a nucleic acid molecule to act as a primer or probe, it is only necessary to ensure that it has sufficient sequence complementarity so that a stable double-stranded structure can be formed with the particular solvent and salt used. In the present invention, a substantially homologous sequence is a nucleic acid molecule that can specifically hybridize to the complementary strand of another suitable nucleic acid molecule under very stringent conditions. Suitable stringent conditions to promote DNA hybridization include, for example, treatment with 6.0× sodium chloride/sodium citrate (SSC) at approximately 45°C, washing with 2.0×SSC at 50°C, and these conditions are well known to those skilled in the art. . For example, the salt concentration in the wash step can be selected from about 2.0×SSC, 50°C under low stringency conditions to about 0.2×SSC, 50°C under high stringency conditions. In addition, the temperature conditions in the washing step can be induced from room temperature from about 22° C. under low stringency conditions to about 65° C. under very harsh conditions. Temperature conditions and salt concentrations may change, or one of them may remain constant while the other variable changes. Preferably, the stringent conditions of the present invention may be that specific hybridization with a polynucleotide of the present invention is carried out at 6x SSC, 0.5% SDS solution at 65°C, and washing is carried out once using each of 2x SSC, 0.1% SDS and 1× SSC and 0.1% SDS.
Термин «элемент сайленсинга» относится к части или области интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидные последовательности или состоит из нуклеотидных последовательностей, комплементарных или, по меньшей мере, частично комплементарных целевой последовательности в гене-мишени, и эта часть или область действует как активная часть интерферирующей рибонуклеиновой кислота, чтобы направлять негативную регуляцию экспрессии гена-мишени. Элемент сайленсинга включает интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из 15 последовательных нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, 18 или 19 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере, из 21 последовательного нуклеотида, даже более предпочтительно, по меньшей мере, из 22, 23, 24 или 25 последовательных нуклеотидов, которые комплементарны целевой последовательности в гене-мишени. В случае предпочтительной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, элемент сайленсинга может представлять собой двухцепочечную область, содержащую спаренную комплементарную цепь, где, по меньшей мере, одна цепь содержит интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая содержит или включает нуклеотидные последовательности, комплементарные или, по меньшей мере, частично комплементарные целевой последовательности в гене-мишени. Двухцепочечная область имеет длину, по меньшей мере, приблизительно от 15 до приблизительно 25 пар оснований, или длину приблизительно от 25 до приблизительно 100 пар оснований, или даже длину 3000 пар оснований.The term "silencing element" refers to a portion or region of an interfering ribonucleic acid that contains or consists of nucleotide sequences that are complementary or at least partially complementary to a target sequence in a target gene, and that portion or region acts as an active part of the interfering ribonucleic acid to direct the down regulation of target gene expression. The silencing element includes an interfering ribonucleic acid that contains or consists of 15 consecutive nucleotides, preferably at least 18 or 19 consecutive nucleotides, more preferably at least 21 consecutive nucleotides, even more preferably at least 22 , 23, 24 or 25 consecutive nucleotides that are complementary to the target sequence in the target gene. In the case of a preferred interfering ribonucleic acid of the present invention, the silencing element may be a double-stranded region containing a paired complementary strand, where at least one strand contains an interfering ribonucleic acid that contains or includes nucleotide sequences that are complementary to or at least partially complementary to the target sequence in the target gene. The double-stranded region is at least about 15 to about 25 base pairs long, or about 25 to about 100 base pairs long, or even 3000 base pairs long.
В настоящем изобретении «экспрессия гена-мишени» относится к транскрипции и накоплению транскрипта РНК, кодируемого геном-мишенью, и/или трансляции мРНК в белок.In the present invention, "expression of a target gene" refers to the transcription and accumulation of an RNA transcript encoded by a target gene and/or translation of an mRNA into a protein.
Термин «негативная регуляция» относится к любому из известных в данной области способов для интерферирующей рибонуклеиновой кислоты для снижения уровня транскрипта первичной РНК, мРНК или белка, продуцируемого геном-мишенью. Негативная регуляция относится к ситуации, когда уровень РНК или белка, производимого геном, снижается, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 33%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 80%. В частности, негативная регуляция относится к ситуации, при которой уровень РНК или белка, продуцируемого геном в клетках насекомых, снижается, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, по меньшей мере, на 99%, по сравнению с насекомыми с общепринятыми способами борьбы (например, насекомыми, которые не подвергались воздействию интерферирующей рибонуклеиновой кислоты или подвергались воздействию контрольной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты). Способы определения снижения уровня РНК или белка хорошо известны в данной области и включают гибридизацию раствора РНК, нозерн-гибридизацию, обратную транскрипцию (например, количественный анализ при помощи ОТ-ПЦР), анализ с помощью микропанели, связывание антител и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), и Вестерн-блоттинг. В то же время негативная регуляция может также относиться к тому, что уровень РНК или белка снижается настолько, что вызывает детектируемое изменение фенотипа насекомых, такое как гибель клеток, задержку роста и т.д., по сравнению с насекомыми с общепринятыми способами борьбы. Таким образом, общепринятые способы в данной области можно использовать для измерения негативной регуляции посредством фенотипического анализа насекомых.The term "downregulation" refers to any of the methods known in the art for an interfering ribonucleic acid to reduce the level of a primary RNA transcript, mRNA, or protein produced by a target gene. Downregulation refers to a situation where the level of RNA or protein produced by a gene is reduced by at least 10%, preferably at least 33%, more preferably at least 50%, even more preferably, at least 80%. In particular, downregulation refers to a situation in which the level of RNA or protein produced by a gene in insect cells is reduced by at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 99%, compared to insects with conventional control methods (eg, insects that have not been exposed to interfering ribonucleic acid or have been exposed to control interfering ribonucleic acid). Methods for detecting RNA or protein reduction are well known in the art and include RNA solution hybridization, Northern hybridization, reverse transcription (e.g., RT-PCR quantitation), microarray analysis, antibody binding, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , and Western blotting. At the same time, down regulation can also refer to the fact that the level of RNA or protein is reduced enough to cause a detectable change in the phenotype of insects, such as cell death, growth stunting, etc., compared to insects with conventional methods of control. Thus, conventional methods in the art can be used to measure downregulation through phenotypic analysis of insects.
В настоящем изобретении «ингибирование экспрессии гена-мишени» относится к снижению или отсутствию (ниже детектируемого порога) уровня белкового продукта и/или мРНК гена-мишени. Специфичность относится к способности ингибировать ген-мишень, не затрагивая другие гены в клетке, и не оказывая никакого воздействия на какой-либо ген в клетке, которая производит молекулы дцРНК.As used herein, "inhibition of target gene expression" refers to a decrease or absence (below a detectable threshold) in the level of a protein product and/or mRNA of a target gene. Specificity refers to the ability to inhibit a target gene without affecting other genes in the cell and without affecting any gene in the cell that produces dsRNA molecules.
В настоящем изобретении «смысловая» РНК относится к транскрипту РНК соответствующей последовательности или фрагменту, который существует в форме мРНК и который может быть переведен в белок с помощью растительной клетки. В настоящем изобретении «антисмысловая» РНК относится к РНК, которая комплементарна всей или части мРНК, в норме производимой в растении. Комплементарность антисмысловой РНК может быть направлена на любую часть транскрипта конкретного гена, т.е. 5'-некодирующую последовательность, 3'-некодирующую последовательность, интрон или кодирующую последовательность. В настоящем изобретении «транскрипт РНК» относится к к продукту транскрипции последовательности ДНК, последовательно катализируемой РНК-полимеразой. Когда транскрипт РНК является полностью комплементарной копией последовательности ДНК, он называется первичным транскриптом, или он может быть РНК, полученной путем посттранскрипционнной обработки первичного транскрипта, и, таким образом, называется зрелой РНК.In the present invention, "sense" RNA refers to an RNA transcript of the corresponding sequence or fragment that exists in the form of mRNA and that can be translated into protein using a plant cell. As used herein, "antisense" RNA refers to RNA that is complementary to all or part of the mRNA normally produced in a plant. The complementarity of the antisense RNA can be directed to any part of the transcript of a particular gene, ie. 5' non-coding sequence, 3' non-coding sequence, intron, or coding sequence. In the present invention, "RNA transcript" refers to a transcription product of a DNA sequence sequentially catalyzed by an RNA polymerase. When an RNA transcript is a fully complementary copy of a DNA sequence, it is called a primary transcript, or it may be RNA obtained by post-transcriptional processing of the primary transcript, and thus is called mature RNA.
В настоящем изобретении молекулы дцРНК могут служить предшественниками активных молекул миРНК, и эти молекулы миРНК направляют транскрипты РНК в комплексы RISC для последующей деградации. Молекула дцРНК, присутствующая в организме или окружающей его среде, может быть поглощена организмом и обработана ферментом, называемым DICER, для получения молекулы миРНК. Альтернативно, молекулу дцРНК можно получать in vivo, то есть она транскрибируется из одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих дцРНК, которые существуют в клетке (например, бактериальной клетке или растительной клетке), и после поглощения более длинного предшественника дцРНК он обрабатывается DICER в клетке-хозяине или предпочтительно в клетке насекомого. дцРНК может быть образована из двух отдельных (смысловой и антисмысловой) цепей РНК, которые спариваются посредством комплементарного спаривания оснований. Альтернативно, дцРНК может быть одной цепью, которая может складываться сама по себе, образуя шпилечную РНК или структуру петли стебля. В случае одной цепи РНК, двухцепочечная область или «стебель» образована двумя областями или сегментами РНК, и эти области или сегменты по сути последовательности с инвертированным повтором друг друга и имеют достаточную комплементарность, чтобы позволить образование двухцепочечной области. В этой «стеблевой области» молекулы может быть один или несколько функциональных двухцепочечных элементов сайленсинга. Область инвертированных повторов, как правило, отделена областью или сегментом, называемым «петлевой» областью в РНК. Эта область может содержать любую нуклеотидную последовательность, которая придает достаточную гибкость, чтобы позволить самоспаривание между фланкирующими комплементарными областями РНК. В основном, область петли по сути одноцепочечная и действует как спейсер между последовательностями с инвертированными повторами.In the present invention, dsRNA molecules can serve as precursors to active siRNA molecules, and these siRNA molecules direct RNA transcripts to RISC complexes for subsequent degradation. A dsRNA molecule present in an organism or its environment can be taken up by the body and processed by an enzyme called DICER to produce an siRNA molecule. Alternatively, the dsRNA molecule can be produced in vivo, i.e., it is transcribed from one or more dsRNA-coding polynucleotides that exist in a cell (e.g., bacterial cell or plant cell) and, after uptake of the longer dsRNA precursor, it is processed by DICER in the host cell or preferably in an insect cell. dsRNA can be formed from two separate (sense and antisense) RNA strands that pair by complementary base pairing. Alternatively, the dsRNA can be a single strand that can fold by itself to form a hairpin RNA or stem loop structure. In the case of a single strand of RNA, a double-stranded region or "stalk" is formed by two regions or segments of RNA, and these regions or segments are essentially inverted repeat sequences of each other and have sufficient complementarity to allow the formation of a double-stranded region. In this "stem region" of the molecule, there may be one or more functional double-stranded silencing elements. The region of inverted repeats is typically separated by a region or segment called the "loop" region in RNA. This region may contain any nucleotide sequence that confers sufficient flexibility to allow self-pairing between flanking complementary RNA regions. Basically, the loop region is essentially single-stranded and acts as a spacer between inverted repeat sequences.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, одну двухцепочечную область, которая, как правило, является элементом сайленсинга интерферирующей рибонуклеиновой кислоты. Он включает смысловую цепь РНК, спаренную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, где смысловая цепь молекулы дцРНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, расположенной в транскрипте РНК гена-мишени. Элемент сайленсинга или, по меньшей мере, одна его цепь (когда элемент сайленсинга является двухцепочечным) может быть полностью или частично комплементарна целевой последовательности гена-мишени. «Полностью комплементарный» означает, что все основания нуклеотидной последовательности элемента сайленсинга комплементарны или «совпадают» с основаниями целевой последовательности. Термин «по меньшей мере, частично комплементарный» означает, что совпадают менее 100% оснований элемента сайленсинга и оснований целевой последовательности. Специалисты в данной области поймут, что для того, чтобы опосредовать негативную регуляцию экспрессии гена-мишени, элементу сайленсинга необходимо только, по меньшей мере, частично быть комплементарным целевой последовательности. Известно в данной области, что последовательность РНК со вставкой, делецией и несоответствием по отношению к гену-мишени все еще может быть эффективной в отношении РНКи. Предпочтительно, элемент сайленсинга и целевая последовательность гена-мишени имеют идентичность последовательности, по меньшей мере, 80% или 85%, предпочтительно, идентичность последовательности, по меньшей мере, 90% или 95%, или более предпочтительно, идентичность последовательности, по меньшей мере, 97% или 98%, и даже более предпочтительно, идентичность последовательности, по меньшей мере, 99%. Альтернативно, элемент сайленсинга может содержать 1, 2 или 3 несовпадения по всей длине из 24 частично комплементарных нуклеотидов по сравнению с целевой последовательностью. Специалистам в данной области хорошо известно, что степень комплементарности между элементом сайленсинга и целевой последовательностью варьируется в зависимости от вида насекомых, у которых должна контролироваться экспрессия генов-мишеней, подлежащих подавлению.The interfering ribonucleic acid of the present invention contains at least one double-stranded region, which, as a rule, is a silencing element of the interfering ribonucleic acid. It includes an RNA sense strand complementary base-paired to an antisense RNA strand, where the sense strand of the dsRNA molecule includes a nucleotide sequence that is complementary to a nucleotide sequence located in the target gene's RNA transcript. The silencing element, or at least one strand thereof (when the silencing element is double-stranded), may be fully or partially complementary to the target gene sequence. "Completely complementary" means that all bases of the nucleotide sequence of the silencing element are complementary or "match" the bases of the target sequence. The term "at least partially complementary" means that less than 100% of the bases of the silencing element and the bases of the target sequence match. Those skilled in the art will appreciate that, in order to mediate down regulation of target gene expression, the silencing element only needs to be at least partially complementary to the target sequence. It is known in the art that an RNA sequence with an insertion, deletion, and mismatch with respect to the target gene can still be effective against RNAi. Preferably, the silencing element and the target gene sequence have at least 80% or 85% sequence identity, preferably at least 90% or 95% sequence identity, or more preferably at least 97% or 98%, and even more preferably at least 99% sequence identity. Alternatively, the silencing element may contain 1, 2, or 3 mismatches over the entire length of the 24 partially complementary nucleotides compared to the target sequence. It is well known to those skilled in the art that the degree of complementarity between the silencing element and the target sequence varies depending on the species of insect in which the expression of the target genes to be suppressed is to be controlled.
Целевую последовательность в настоящем изобретении можно выбирать из любой подходящей области или нуклеотидной последовательности гена-мишени или его транскрипта РНК. Например, целевая последовательность может быть расположена внутри 5'UTR или 3'UTR гена-мишени или транскрипта РНК, или в области экзона или интрона гена.The target sequence in the present invention can be selected from any suitable region or nucleotide sequence of the target gene or RNA transcript thereof. For example, the target sequence may be located within the 5'UTR or 3'UTR of a target gene or RNA transcript, or within the exon or intron region of a gene.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может содержать один или несколько элементов сайленсинга, где каждый элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени, и действует, чтобы подавлять экспрессию гена-мишени после поглощения насекомыми. Термин «множество» означает, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре и т.д., и до, по меньшей мере, 10, 15, 20 или, по меньшей мере, 30. Интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит множество копий одного элемента сайленсинга, то есть повторение элемента сайленсинга, который связывается с конкретной целевой последовательностью в конкретном гене-мишени. Элемент сайленсинга в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте также может содержать различные нуклеотидные последовательности или состоять из различных нуклеотидных последовательностей, комплементарных другим целевой последовательностям. Должно быть ясно, что комбинация множества копий одного и того же элемента сайленсинга в сочетании с элементами сайленсинга, которые связываются с разными целевыми последовательностями, также входит в объем настоящего изобретения.The interfering ribonucleic acid of the present invention may comprise one or more silencing elements, where each silencing element contains or consists of a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene, and acts to suppress the expression of the gene- targets after ingestion by insects. The term "multiple" means at least two, at least three, at least four, etc., and up to at least 10, 15, 20, or at least 30. Interfering a ribonucleic acid contains multiple copies of a single silencing element, that is, a repeat of a silencing element that binds to a particular target sequence in a particular target gene. The silencing element in the interfering ribonucleic acid may also contain different nucleotide sequences or be composed of different nucleotide sequences that are complementary to other target sequences. It should be clear that the combination of multiple copies of the same silencing element in combination with silencing elements that bind to different target sequences is also within the scope of the present invention.
Для того чтобы добиться негативной регуляции определенного гена-мишени у жесткокрылого насекомого в настоящем изобретении, можно получать различные целевые последовательности из одного гена-мишени у одного насекомого. В этом случае элемент сайленсинга в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте можно комбинировать в исходном порядке, в котором целевая последовательность существует в гене-мишени, или по сравнению с порядком целевой последовательности в гене-мишени элемент сайленсинга может быть дезорганизован в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте и комбинирован случайным образом в любом порядке.In order to down-regulate a particular target gene in a hemipteran insect in the present invention, different target sequences can be obtained from the same target gene in the same insect. In this case, the silencing element in the interfering ribonucleic acid can be combined in the original order in which the target sequence exists in the target gene, or compared to the order of the target sequence in the target gene, the silencing element can be disorganized in the interfering ribonucleic acid and combined randomly in any order.
Альтернативно, разные целевые последовательности представляют собой один ген-мишень, но происходят от разных видов насекомых.Alternatively, different target sequences represent the same target gene but come from different insect species.
Альтернативно, разные целевые последовательности могут быть получены из разных генов-мишеней. Если интерферирующая рибонуклеиновая кислота применяется для предотвращения и/или борьбы с вторжением вредителей, предпочтительно, чтобы различные гены-мишени были выбраны из группы генов, которые регулируют основные биологические функции насекомых, и эти биологические функции в качестве неограничивающих примеров включают выживание, рост, развитие, размножение и патогенность. Гены-мишени могут регулировать одни и те же или разные биологические пути или процессы.Alternatively, different target sequences can be derived from different target genes. If the interfering ribonucleic acid is used to prevent and/or control the invasion of pests, it is preferable that the various target genes be selected from the group of genes that regulate the basic biological functions of insects, and these biological functions include, as non-limiting examples, survival, growth, development, reproduction and pathogenicity. Target genes may regulate the same or different biological pathways or processes.
В настоящем изобретении разные гены, на которые нацелены разные элементы сайленсинга, происходят от одного и того же насекомого. Этот способ можно использовать для усиления атаки против одного насекомого. В частности, разные гены-мишени могут по-разному экспрессироваться на разных стадиях жизненного цикла насекомых, таких как стадия зрелой взрослой особи, стадия незрелой личинки и стадия яйца. Таким образом, интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может использоваться для предотвращения и/или борьбы с вторжением насекомых в течение более чем одной стадии жизненного цикла насекомых. Альтернативно, разные гены, на которые нацелены разные элементы сайленсинга, происходят от разных насекомых. Таким образом, интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению также может использоваться для предотвращения и/или борьбы с вторжением более чем одного насекомого одновременно.In the present invention, different genes targeted by different silencing elements come from the same insect. This method can be used to increase the attack against a single insect. In particular, different target genes may be expressed differently at different stages of the insect life cycle, such as the mature adult stage, the immature larval stage, and the egg stage. Thus, the interfering ribonucleic acid of the present invention can be used to prevent and/or control insect invasion during more than one stage of the insect life cycle. Alternatively, different genes targeted by different silencing elements come from different insects. Thus, the interfering ribonucleic acid of the present invention can also be used to prevent and/or combat the invasion of more than one insect at the same time.
Элемент сайленсинга по настоящему изобретению может быть непрерывной областью интерферирующей рибонуклеиновой кислоты или может быть отделен за счет присутствия линкерной последовательности. Линкерная последовательность может содержать короткую случайную нуклеотидную последовательность, которая не комплементарна какой-либо целевой последовательности или гену-мишени. Линкерная последовательность может быть условно саморасщепляющейся последовательностью РНК, в том числе pH-чувствительным линкером или гидрофобно-чувствительным линкером. Линкер может также содержать нуклеотидную последовательность, эквивалентную интронной последовательности. Линкерная последовательность может иметь длину в диапазоне от 1 пары оснований до приблизительно 10000 пар оснований, при условии, что линкер не ухудшает способность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты подавлять экспрессию гена.The silencing element of the present invention may be a contiguous region of interfering ribonucleic acid or may be separated by the presence of a linker sequence. The linker sequence may contain a short random nucleotide sequence that is not complementary to any target sequence or gene. The linker sequence may be a conditionally self-cleaving RNA sequence, including a pH sensitive linker or a hydrophobically sensitive linker. The linker may also contain a nucleotide sequence equivalent to the intron sequence. The linker sequence may range from 1 base pair to about 10,000 base pairs in length, provided that the linker does not impair the ability of the interfering ribonucleic acid to repress gene expression.
В дополнение к одному или нескольким элементам сайленсинга и любым линкерным последовательностям, интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению также может содержать, по меньшей мере, одну дополнительную полинуклеотидную последовательность. Дополнительная полинуклеотидная последовательность выбрана из (1) последовательности, способной защищать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту от процессинга РНК; (2) последовательности, влияющей на стабильность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты; (3) последовательности, позволяющей связывание белка, что способствовует поглощению интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого; (4) последовательности, способной способствовать крупномасштабному производству интерферирующей рибонуклеиновой кислоты; (5) последовательности, которая действует как аптамер, способный связываться с рецептором или молекулой на поверхности клетки насекомого, чтобы способствовать поглощению; или (6) последовательности, способной катализировать процессинг интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетке насекомого и, тем самым, повышать эффективность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты.In addition to one or more silencing elements and any linker sequences, the interfering ribonucleic acid of the present invention may also contain at least one additional polynucleotide sequence. The additional polynucleotide sequence is selected from (1) a sequence capable of protecting the interfering ribonucleic acid from RNA processing; (2) a sequence affecting the stability of the interfering ribonucleic acid; (3) a sequence that allows protein binding to facilitate uptake of the interfering ribonucleic acid into the insect cell; (4) a sequence capable of promoting large-scale production of interfering ribonucleic acid; (5) a sequence that acts as an aptamer capable of binding to a receptor or molecule on the surface of an insect cell to promote uptake; or (6) a sequence capable of catalyzing the processing of the interfering ribonucleic acid in an insect cell and thereby increasing the efficiency of the interfering ribonucleic acid.
Длина интерферирующей рибонуклеиновой кислоты по настоящему изобретению должна быть достаточной для того, чтобы ее могла поглотить клетка насекомого, и чтобы подавить ген-мишень этого насекомого. Верхний предел длины может зависеть от (1) потребности в поглощении интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого и (2) потребности в переработке интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетке насекомого, чтобы опосредовать выключение генов через путь РНКи; и длина также может быть определена производственными способами и составами для доставки интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетку. Предпочтительно, длина интерферирующей рибонуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может составлять от 19 до 10000 нуклеотидов, предпочтительно от 50 до 5000 нуклеотидов, или от 100 до 2500 нуклеотидов, и более предпочтительно от 80 до 2000 нуклеотидов.The length of the interfering ribonucleic acid of the present invention should be sufficient to be taken up by the insect cell and to repress the insect's target gene. The upper limit of length may depend on (1) the need for uptake of the interfering ribonucleic acid into the insect cell and (2) the need for the processing of the interfering ribonucleic acid in the insect cell to mediate gene shutdown via the RNAi pathway; and length can also be determined by manufacturing methods and formulations for delivering interfering ribonucleic acid into a cell. Preferably, the length of the interfering ribonucleic acid of the present invention may be 19 to 10,000 nucleotides, preferably 50 to 5,000 nucleotides, or 100 to 2,500 nucleotides, and more preferably 80 to 2,000 nucleotides.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может содержать основания ДНК, неприродные основания или неприродные связи остова или модификации сахарид-фосфатных остовов, например, для повышения стабильности во время хранения или повышения устойчивости к деградации нуклеазами. Кроме того, интерферирующая рибонуклеиновая кислота может быть получена специалистом в данной области химическим или ферментативным способом посредством ручной или автоматической реакции. Альтернативно, интерферирующая рибонуклеиновая кислота может быть транскрибирована из кодирующего ее полинуклеотида. Таким образом настоящее изобретение относится к любому из изолированных полинуклеотидов, кодирующих интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.The interfering ribonucleic acid of the present invention may contain DNA bases, non-natural bases or non-natural backbone linkages or saccharide-phosphate backbone modifications, for example to increase stability during storage or to increase resistance to degradation by nucleases. In addition, the interfering ribonucleic acid can be produced by a person skilled in the art by a chemical or enzymatic method through a manual or automatic reaction. Alternatively, the interfering ribonucleic acid may be transcribed from the polynucleotide encoding it. Thus, the present invention relates to any of the isolated polynucleotides encoding an interfering ribonucleic acid.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть вставлен в конструкцию ДНК или вектор, известный в данной области, с помощью общепринятых способов молекулярного клонирования. Конструкция ДНК может быть рекомбинантным ДНК-вектором, таким как бактериальный, вирусный или дрожжевой вектор. Конструкция ДНК является экспрессирующей конструкцией, и полинуклеотид функционально связан, по меньшей мере, с одной регуляторной последовательностью, способной управлять экспрессией полинуклеотидной последовательности. «Регуляторная последовательность» относится к любой нуклеотидной последовательности, способной влиять на экспрессию функционально связанного полинуклеотида, и включает в качестве неограничивающих примеров промоторы, энхансеры и другие природные или синтетические элементы активации транскрипции. Регуляторная последовательность может располагаться на 5'- или 3'-конце полинуклеотидной последовательности. «Функционально связанный» относится к тому, что регуляторная последовательность и полинуклеотидная последовательность функционально связаны между собой, и такая связь позволяет регуляторной последовательности управлять экспрессией полинуклеотида. Функционально связанные элементы могут непрерывно следовать друг за другом или быть разделенными.The polynucleotide of the present invention can be inserted into a DNA construct or vector known in the art using conventional molecular cloning techniques. The DNA construct may be a recombinant DNA vector such as a bacterial, viral or yeast vector. The DNA construct is an expression construct and the polynucleotide is operably linked to at least one regulatory sequence capable of directing the expression of the polynucleotide sequence. "Regulatory sequence" refers to any nucleotide sequence capable of influencing the expression of an operably linked polynucleotide and includes, but is not limited to, promoters, enhancers, and other naturally occurring or synthetic transcription activating elements. The regulatory sequence may be located at the 5' or 3' end of the polynucleotide sequence. "Operably linked" refers to the fact that the regulatory sequence and the polynucleotide sequence are operably linked, and such linkage allows the regulatory sequence to direct the expression of the polynucleotide. Functionally related elements may continuously follow each other or be separated.
Регуляторная последовательность в настоящем изобретении может быть промотором. Предпочтительно, промотор представляет собой промотор, который можно экспрессировать в растении, и «промотор, который можно экспрессировать в растении» относится к промотору, который обеспечивает экспрессию связанного с ним полинуклеотида в растительной клетке. Промотор, который можно экспрессировать в растении, может быть конститутивным промотором. Примеры промоторов, которые непосредственно конститутивно экспрессируются в растениях в качестве неограничивающих примеров включают промотор 35S, полученный из вируса мозаики цветной капусты, промотор кукурузы ubi, промотор гена GOS2 риса и т.п.Альтернативно, промотор, который можно экспрессировать в растении, может быть тканеспецифическим промотором, таким как промотор карбоксилазы PEP, то есть такой промотор направляет экспрессию кодирующей последовательности в некоторых тканях растения, таких как зеленые ткани на уровне, более высоком, чем в других тканях растения (что можно определить по общепринятому тесту РНК). Альтернативно, промотором, который можно экспрессировать в растении, может быть промотор, индуцируемый повреждением. Повреждение-индуцибельный промотор или промотор, который управляет индуцируемым раной профилем экспрессии, относится к тому, что, когда растение подвергается механическим ранениям или ранам от грызущих насекомых, экспрессия полинуклеотида под регуляцией промотора значительно выше, чем в нормальных условиях роста. Примеры индуцируемых повреждением промоторов в качестве неограничивающих примеров включают промоторы генов ингибиторов протеазы картофеля и помидора (pin I и pin II) и гена ингибитора протеазы кукурузы (MPI).The regulatory sequence in the present invention may be a promoter. Preferably, the promoter is a promoter that can be expressed in a plant, and "a promoter that can be expressed in a plant" refers to a promoter that allows the expression of its associated polynucleotide in a plant cell. A promoter that can be expressed in a plant may be a constitutive promoter. Examples of promoters that are directly constitutively expressed in plants include, but are not limited to, the 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus, the maize ubi promoter, the rice GOS2 gene promoter, and the like. Alternatively, a promoter that can be expressed in a plant may be tissue specific. a promoter such as the PEP carboxylase promoter, i.e. such a promoter directs the expression of the coding sequence in some plant tissues, such as green tissues, at a level higher than in other plant tissues (as determined by a conventional RNA test). Alternatively, a promoter that can be expressed in a plant may be a lesion inducible promoter. An injury-inducible promoter, or a promoter that drives a wound-induced expression profile, refers to the fact that when a plant is subjected to mechanical or gnawing wounds, the expression of the polynucleotide under the regulation of the promoter is significantly higher than under normal growth conditions. Non-limiting examples of injury-induced promoters include those for the potato and tomato protease inhibitor genes (pin I and pin II) and the maize protease inhibitor (MPI) gene.
Альтернативно, одна или несколько последовательностей терминации транскрипции могут быть включены в экспрессирующую конструкцию по настоящему изобретению. Термин «последовательность терминации транскрипции» включает в себя контрольную последовательность в конце блока транскрипции, которая передает сигналы терминации транскрипции, процессинга 3'-конца и полиаденилирования первичного транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы в качестве неограничивающих примеров включают энхансеры транскрипции или трансляции, которые могут быть включены в экспрессирующую конструкцию, например, промотор с двойным энхансером CaMV35S.Alternatively, one or more transcription termination sequences may be included in an expression construct of the present invention. The term "transcriptional termination sequence" includes a control sequence at the end of a transcription block that signals transcription termination, 3' end processing, and polyadenylation of the primary transcript. Additional regulatory elements include, but are not limited to, transcriptional or translational enhancers that can be included in an expression construct, such as the CaMV35S dual enhancer promoter.
Способ получения любой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в настоящем изобретении включает следующие этапы: (1) контактирование полинуклеотида, кодирующего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, или конструкции ДНК, содержащей полинуклеотид, с бесклеточным компонентом; (2) введение полинуклеотида, кодирующего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту или конструкцию ДНК, содержащую полинуклеотид (например, путем трансформации, трансфекции или инъекции), в клетку.The method for producing any interfering ribonucleic acid in the present invention includes the following steps: (1) contacting a polynucleotide encoding an interfering ribonucleic acid, or a DNA construct containing a polynucleotide, with a cell-free component; (2) introducing a polynucleotide encoding an interfering ribonucleic acid or a DNA construct containing the polynucleotide (eg, by transformation, transfection, or injection) into the cell.
В настоящем изобретении клетка-хозяин, содержащая любую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, любой полинуклеотид по настоящему изобретению, или конструкцию ДНК, содержащую полинуклеотид, может быть прокариотической клеткой, включая в качестве неограничивающих примеров грамположительные и грамотрицательные бактериальные клетки; или эукариотической клеткой, включая в качестве неограничивающих примеров дрожжевые клетки или растительные клетки. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку или растительную клетку. Полинуклеотид или конструкция ДНК по настоящему изобретению может существовать или поддерживаться как внехромосомный элемент в клетке-хозяине или может быть стабильно включена в геном клетки-хозяина.In the present invention, a host cell containing any interfering ribonucleic acid of the present invention, any polynucleotide of the present invention, or a DNA construct containing a polynucleotide may be a prokaryotic cell, including, but not limited to, Gram-positive and Gram-negative bacterial cells; or a eukaryotic cell, including but not limited to yeast cells or plant cells. Preferably, the host cell is a bacterial cell or a plant cell. A polynucleotide or DNA construct of the present invention may exist or be maintained as an extrachromosomal element in a host cell, or may be stably incorporated into the host cell's genome.
В настоящем изобретении, когда интерферирующая рибонуклеиновая кислота экспрессируется в клетке-хозяине и/или применяется для профилактики заражения и/или борьбы с заражением насекомыми организма-хозяина, предпочтительно, чтобы интерферирующая рибонуклеиновая кислота не проявляла значительного «нецелевого» эффекта, то есть интерферирующая рибонуклеиновая кислота не влияет на экспрессию нецелевых генов в организме хозяина. Предпочтительно, чтобы выключенный ген не проявлял значительной комплементарности с нуклеотидной последовательностью, отличной от установленной целевой последовательности гена-мишени. Элемент сайленсинга демонстрирует идентичность последовательности, менее чем 30%, более предпочтительно, менее 20%, более предпочтительно, менее 5% и даже более предпочтительно, менее 5% по отношению к любому гену клетки-хозяина или организма-хозяина. Если доступны данные о геномной последовательности организма-хозяина, то можно использовать стандартные инструменты биоинформатики для перекрестной проверки согласованности с элементом сайленсинга. В области с 17 последовательными нуклеотидами, более предпочтительно в области с 18 или 19 последовательными нуклеотидами, и наиболее предпочтительно в области с 19 или 20 или 21 последовательными нуклеотидами, не существует идентичности последовательности между элементом сайленсинга и геном из клетки-хозяина или организма-хозяина.In the present invention, when the interfering ribonucleic acid is expressed in a host cell and/or is used to prevent infection and/or control insect infestation of the host, it is preferable that the interfering ribonucleic acid does not show a significant "off-target" effect, that is, the interfering ribonucleic acid does not affect the expression of non-target genes in the host organism. Preferably, the knocked-out gene does not show significant complementarity with a nucleotide sequence other than the established target gene sequence. The silencing element exhibits less than 30%, more preferably less than 20%, more preferably less than 5%, and even more preferably less than 5% sequence identity to any host cell or host organism gene. If host genomic sequence data is available, then standard bioinformatics tools can be used to cross-check for consistency with the silencing element. In a region of 17 contiguous nucleotides, more preferably in a region of 18 or 19 contiguous nucleotides, and most preferably in a region of 19 or 20 or 21 contiguous nucleotides, there is no sequence identity between the silencing element and the gene from the host cell or host organism.
Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может включать инвертированные повторы, разделенные «спейсерной последовательностью». Спейсерная последовательность может представлять собой область, включающую любые из следующих нуклеотидных последовательностей, и, если необходимо, нуклеотидные последовательности могут способствовать образованию вторичной структуры между каждым повтором. Спейсерная последовательность является частью смысловой или антисмысловой кодирующей последовательности, используемой для мРНК. Альтернативно, спейсерная последовательность может включать любую комбинацию нуклеотидов или их гомологов, которые могут быть ковалентно связаны с молекулой нуклеиновой кислоты. Спейсерная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, от 10 до 100 нуклеотидов в длину, или, по меньшей мере, примерно от 100 до 200 нуклеотидов в длину, по меньшей мере, приблизительно от 200 до 400 нуклеотидов в длину, или, по меньшей мере, приблизительно от 200 до 400 нуклеотидов в длину, или приблизительно от 400 до 500 нуклеотидов в длину.The nucleotide sequence of the present invention may include inverted repeats separated by a "spacer sequence". The spacer sequence may be a region including any of the following nucleotide sequences, and if necessary, the nucleotide sequences may contribute to the formation of a secondary structure between each repeat. The spacer sequence is part of the sense or antisense coding sequence used for the mRNA. Alternatively, the spacer sequence may include any combination of nucleotides or homologues thereof that may be covalently linked to the nucleic acid molecule. The spacer sequence may include a nucleotide sequence of at least 10 to 100 nucleotides in length, or at least about 100 to 200 nucleotides in length, at least about 200 to 400 nucleotides in length, or at least about 200 to 400 nucleotides in length, or about 400 to 500 nucleotides in length.
В настоящем изобретении, когда интерферирующая рибонуклеиновая кислота «вводится» в растение, это означает, что это может происходить посредством прямой трансформации, такой как опосредованная Agrobacterium трансформация, бомбардировка частиц, электропорация и т.д.; или введение можно проводить путем скрещивания растения, имеющего гетерологичную нуклеотидную последовательность, с другим растением, так что потомство имеет нуклеотидную последовательность, включенную в их геном. Такие способы селекции хорошо известны специалистам в данной области.In the present invention, when an interfering ribonucleic acid is "introduced" into a plant, this means that it can occur through direct transformation such as Agrobacterium-mediated transformation, particle bombardment, electroporation, etc.; or the introduction may be by crossing a plant having a heterologous nucleotide sequence with another plant such that the progeny has the nucleotide sequence included in their genome. Such selection methods are well known to those skilled in the art.
РастенияPlants
Растения, описанные в настоящем изобретении в качестве неограничивающих примеров, включают сою, пшеницу, ячмень, кукурузу, табак, рис, рапс, хлопок или подсолнечник. В конкретном варианте осуществления растение представляет собой кукурузу. В другом конкретном варианте осуществления растение представляет собой сою.Plants described in the present invention as non-limiting examples include soybean, wheat, barley, corn, tobacco, rice, rapeseed, cotton or sunflower. In a particular embodiment, the plant is corn. In another specific embodiment, the plant is a soybean.
Растения, описанные в настоящем изобретении, могут содержать любой репродуктивный материал или материал для размножения растения, а также могут включать растительные клетки, протопласты растений, растительные тканевые культуры, каллус растений и растительные клетки, которые являются интактными в растении или части растения. «Часть растения» включает зародыши, пыльцу, семяпочки, семена, листья, цветы, ветви, плоды, косточки, колосья, початки, кожуру, стебли, корни, кончики корней и т.п. В конкретном варианте осуществления «часть растения» представляет собой лист, более конкретно, пластинку листа.The plants described herein may contain any plant reproductive or propagation material, and may also include plant cells, plant protoplasts, plant tissue cultures, plant callus, and plant cells that are intact in the plant or plant part. "Part of a plant" includes germs, pollen, ovules, seeds, leaves, flowers, branches, fruits, pits, ears, cobs, skins, stems, roots, root tips, and the like. In a specific embodiment, the "plant part" is a leaf, more specifically, a leaf blade.
КомпозицииCompositions
В настоящем изобретении композиция для предотвращения заражения и/или для борьбы с заражением насекомыми содержит, по меньшей мере, одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту и необязательно, по меньшей мере, один подходящий носитель, эксципиент или разбавитель, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота подавляет экспрессию генов-мишеней у насекомого после ее проглатывания насекомым. Интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит или включает, по меньшей мере, один элемент сайленсинга, а элемент сайленсинга представляет собой двухцепочечную область РНК, содержащую спаренные комплементарные цепи, где одна цепь (смысловая цепь) содержит нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени. Ген-мишень в качестве неограничивающих примеров включает ген, регулирующий выживание, рост, развитие, размножение и патогенность насекомых. Необязательно, композиция содержит, по меньшей мере, одну клетку-хозяина, клетку-хозяина, содержащую, по меньшей мере, одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту или конструкцию ДНК, кодирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, и необязательно, по меньшей мере, один подходящий носитель, эксципиент или разбавитель, где после того как клетка-хозяин поглощена насекомым, интерферирующая рибонуклеиновая кислота подавляет экспрессию гена-мишени у насекомого.In the present invention, the composition for preventing and/or controlling insect infestation comprises at least one interfering ribonucleic acid and optionally at least one suitable carrier, excipient or diluent, wherein the interfering ribonucleic acid suppresses the expression of target genes in insect after it has been ingested by the insect. The interfering ribonucleic acid contains or includes at least one silencing element, and the silencing element is a double-stranded region of RNA containing paired complementary strands, where one strand (sense strand) contains a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene. The target gene, as non-limiting examples, includes a gene that regulates the survival, growth, development, reproduction, and pathogenicity of insects. Optionally, the composition comprises at least one host cell, a host cell containing at least one interfering ribonucleic acid or a DNA construct encoding an interfering ribonucleic acid, and optionally at least one suitable carrier, excipient, or a diluent, where after the host cell is engulfed by the insect, the interfering ribonucleic acid represses the expression of the target gene in the insect.
Композиция по настоящему изобретению может быть в любой физической форме, подходящей для введения насекомому. Например, композиция может быть в твердой форме (порошок, осадок или приманка), жидкой форме (в том числе в виде инсектицидного спрея) или форме геля. Композиция может быть краской, пастой или порошком, которые могут быть нанесены на субстрат для защиты субстрата от заражения насекомыми. Композицию можно использовать для защиты любого субстрата или материала, чувствительного к атакам насекомых или повреждению, причиненному насекомыми.The composition of the present invention may be in any physical form suitable for administration to an insect. For example, the composition may be in solid form (powder, pellet, or bait), liquid form (including insecticidal spray), or gel form. The composition may be a paint, paste or powder that can be applied to the substrate to protect the substrate from insect infestation. The composition can be used to protect any substrate or material susceptible to insect attack or damage caused by insects.
Природа эксципиента и физическая форма композиции могут варьироваться в зависимости от природы подлежащего обработке субстрата. Например, композиция может представлять собой жидкость, которой покрывают материал или субстрат или которую распыляют на материал или субстрат, подлежащий обработке, или напечатывают на материале или субстрате, подлежащем обработке; или может быть покрытием или порошком, который наносится на обрабатываемый материал или субстрат.The nature of the excipient and the physical form of the composition may vary depending on the nature of the substrate to be treated. For example, the composition may be a liquid that is coated on the material or substrate, or sprayed onto the material or substrate to be treated, or printed on the material or substrate to be treated; or may be a coating or powder that is applied to the material or substrate to be treated.
В настоящем изобретении композиция может быть в виде приманки. Приманка применяется для привлечения насекомого для контакта с композицией. После того, как насекомое контактирует с ней, композиция затем интернализуется насекомым посредством, например, проглатывания, и опосредует РНКи, тем самым убивая насекомое. Приманка может включать пищу, такую как пища на основе белка, такую как рыба. Борную кислоту также можно использовать в качестве приманки. Приманка может зависеть от вида-мишени. Также можно использовать аттрактант, например, аттрактант может быть феромоном, таким как мужской или женский феромон. Аттрактантные функции привлекают насекомое к контакту с композицией, и могут быть нацелены на конкретное насекомое или могут привлекать весь спектр насекомых, увеличивая шанс этих привлекаемых насекомых контактировать с композицией по настоящему изобретению, тем самым убивая большое количество насекомых. Приманка может быть любой подходящей формы, такой как твердое вещество, паста, осадок или порошок.In the present invention, the composition may be in the form of a bait. The bait is used to attract the insect into contact with the composition. Once the insect contacts it, the composition is then internalized by the insect through, for example, ingestion, and mediates RNAi, thereby killing the insect. The bait may include a food such as a protein-based food such as fish. Boric acid can also be used as bait. The bait may depend on the target species. An attractant may also be used, for example the attractant may be a pheromone such as a male or female pheromone. Attractant functions attract an insect to contact with the composition and may be targeted to a particular insect or may attract a whole range of insects, increasing the chance of these attracted insects to contact the composition of the present invention, thereby killing a large number of insects. The bait may be in any suitable form such as a solid, paste, pellet or powder.
Насекомые также могут принести наживку в сообщество насекомых. Затем приманка может служить источником пищи для других членов сообщества, тем самым обеспечивая эффективный контроль над большим количеством насекомых и, возможно, над всем сообществом насекомых. Приманка также может быть предусмотрена в подходящем «корпусе» или «ловушке».Insects may also provide bait to the insect community. The bait can then serve as a food source for other members of the community, thus providing effective control over a large number of insects and possibly the entire insect community. The bait may also be provided in a suitable "case" or "trap".
Кроме того, композиция при контакте с насекомым может оставаться на эпидермисе насекомого. При очистке, независимо от того, очищает ли себя одно насекомое или очищают насекомые друг друга, эти композиции могут быть проглочены и, таким образом, опосредуют свое действие на насекомых. Это требует от композиции, чтобы она была достаточно стабильной, чтобы даже после воздействия внешних условий окружающей среды в течение периода времени (например, нескольких суток) интерферирующая рибонуклеиновая кислота оставалась интактной и могла опосредовать РНКи.In addition, the composition upon contact with the insect may remain on the epidermis of the insect. When cleaning, whether one insect cleans itself or cleans each other, these compositions can be ingested and thus mediate their effect on the insects. This requires the composition to be sufficiently stable that even after exposure to external environmental conditions for a period of time (eg, several days), the interfering ribonucleic acid remains intact and can mediate RNAi.
В настоящем изобретении композиция может быть представлена в виде спрея. Таким образом, люди-пользователи могут напрямую опрыскивать насекомых композицией. Затем композиция интернализуется насекомым, где она может опосредовать РНК-интерференцию, чтобы бороться с насекомым. Спрей представляет собой преимущественно спрей под давлением/распылительный спрей или спрей с помпой. Эти частицы могут быть подходящего размера, чтобы они прилипали к насекомому, например, прикреплялись к экзоскелету и могли оттуда впитываться.In the present invention, the composition may be in the form of a spray. Thus, human users can directly spray insects with the composition. The composition is then internalized by the insect where it can mediate RNA interference to fight the insect. The spray is advantageously a pressure spray/spray spray or a pump spray. These particles can be of a suitable size so that they stick to the insect, for example, attach to the exoskeleton and can be absorbed from there.
Носитель композиции по настоящему изобретению представляет собой порошок или гранулу, заряженную статическим электричеством, которое прилипает к насекомому. Необязательно, носитель композиции может содержать магнитные частицы, которые прикрепляются к эпидермису насекомых. Необязательно, носитель композиции содержит металлические частицы, и эти частицы изначально не намагничиваются, но способны становиться магнитно поляризованными при воздействии электрического поля, создаваемого телом насекомого. Предпочтительно, композиция включена в носитель, и носитель увеличивает попадание интерферирующей РНК в организм насекомого. Этот носитель может быть носителем на основе липидов, предпочтительно включающим одно или несколько из следующего: эмульсии «масло-в-воде», мицеллы, холестерин, липополиамины и липосомы. Другие агенты, способствующие проглатыванию конструкции по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области, и включают поликатионы, декстран и катионные липиды, такие как CS096, CS102 и т.п. Необязательно, носитель композиции представляет собой коагулянт нуклеиновых кислот; предпочтительные коагулянты нуклеиновых кислот включают спермидин или протамина сульфат или их производные.The carrier of the composition of the present invention is a powder or granule charged with static electricity that adheres to the insect. Optionally, the carrier composition may contain magnetic particles that attach to the epidermis of insects. Optionally, the composition carrier contains metal particles, and these particles are not initially magnetized, but are capable of becoming magnetically polarized when subjected to an electric field generated by the insect's body. Preferably, the composition is included in a carrier and the carrier increases the entry of the interfering RNA into the insect body. This carrier may be a lipid-based carrier, preferably comprising one or more of the following: oil-in-water emulsions, micelles, cholesterol, lipopolyamines, and liposomes. Other swallowing agents of the construct of the present invention are well known to those skilled in the art and include polycations, dextran, and cationic lipids such as CS096, CS102, and the like. Optionally, the composition carrier is a nucleic acid coagulant; preferred nucleic acid coagulants include spermidine or protamine sulfate or derivatives thereof.
В случае, когда композиция по настоящему изобретению подходит для профилактики заражения и/или для борьбы с заражением растения насекомыми, композиция может включать подходящий сельскохозяйственный носитель. Этим носителем может быть любой материал, который может переносить обрабатываемое растение, этот материал не причиняет чрезмерного вреда окружающей среде или другим существующим в ней организмам, и он позволяет интерферирующей рибонуклеиновой кислоте оставаться эффективной против насекомых. В частности, композицию по настоящему изобретению можно формулировать для доставки к растениям в соответствии с общепринятой практикой, применяемой в индустрии биопестицидов. Композиция может содержать дополнительный компонент, способный выполнять другие функции, включая в качестве неограничивающих примеров (1), усиление или способствование поглощению интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого, и (2) стабилизацию активного компонента композиции. Такой дополнительный компонент, содержащийся в композиции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, может быть дрожжевой тРНК или дрожжевой тотальной РНК.Where the composition of the present invention is suitable for preventing and/or controlling insect infestation of a plant, the composition may include a suitable agricultural carrier. The carrier can be any material that can be tolerated by the plant being treated, the material does not cause undue harm to the environment or other organisms present therein, and allows the interfering ribonucleic acid to remain effective against insects. In particular, the composition of the present invention may be formulated for delivery to plants in accordance with common practice in the biopesticide industry. The composition may contain an additional component capable of performing other functions, including, but not limited to, (1) enhancing or facilitating the uptake of an interfering ribonucleic acid into an insect cell, and (2) stabilizing the active component of the composition. Such an additional component contained in the composition containing the interfering ribonucleic acid may be yeast tRNA or yeast total RNA.
Композицию можно формулировать для прямого применения или составлять в виде концентрированной формы первичной композиции, которую следует разбавить перед использованием. Альтернативно, композиция может быть представлена в виде набора; набора, содержащего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту в контейнере или клетку-хозяина, содержащую/экспрессирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, и подходящий разбавитель или носитель для РНК или клетки-хозяина в отдельном контейнере. В заявке по настоящему изобретению композицию можно применять для растения или любой части растения на любой стадии развития растения, например, композицию применяют для надземной части растения во время выращивания растения в поле; и композицию наносят на семена растений во время хранения или после посадки в почву. В целом, важно получить хороший контроль над насекомыми на ранних стадиях роста растений, так как это период, когда насекомые могут наиболее серьезно повредить растения.The composition can be formulated for direct use or formulated as a concentrated form of the primary composition, which should be diluted before use. Alternatively, the composition may be presented as a kit; a kit containing the interfering ribonucleic acid in a container or a host cell containing/expressing the interfering ribonucleic acid and a suitable diluent or carrier for the RNA or host cell in a separate container. In the application of the present invention, the composition can be applied to the plant or any part of the plant at any stage of plant development, for example, the composition is applied to the aerial part of the plant during the growing of the plant in the field; and the composition is applied to the plant seeds during storage or after planting in the soil. In general, it is important to get good insect control in the early stages of plant growth, as this is the period when insects can most severely damage plants.
В настоящем изобретении композицию можно применять к окружающей среде насекомого различными способами, включая в качестве неограничивающих примеров распыление, опрыскивание, опыление, разбрасывание, поливание, покрытие семян, обработку семян, внесение в почву и внесение в воду для орошения. При обработке растения, восприимчивого к заражению насекомыми, композиция может быть доставлена на растение или часть растения до появления насекомых (в целях профилактики) или после того, как начинают появляться признаки заражения насекомыми (в целях борьбы).In the present invention, the composition can be applied to the insect's environment in a variety of ways, including, but not limited to, spraying, spraying, pollinating, spreading, watering, seed coating, seed treatment, soil application, and irrigation water application. When treating a plant susceptible to insect infestation, the composition may be delivered to the plant or part of the plant before insects appear (for prevention purposes) or after signs of insect infestation begin to appear (for control purposes).
Композицию по настоящему изобретению можно формулировать так, чтобы она содержала, по меньшей мере, одно дополнительное активное средство. Таким образом композиция может быть представлена в виде «набора из нескольких частей», набора, включающего несколько композиций, содержащих интерферирующую рибонуклеиновую кислоту в контейнере и один или несколько подходящих активных ингредиентов, таких как химические или биологические пестициды в отдельном контейнере. Альтернативно, композиция может быть представлена в виде смеси, которая является стабильной, и может использоваться в комбинации друг с другом.The composition of the present invention can be formulated to contain at least one additional active agent. Thus, a composition may be presented as a "multi-part kit", a kit comprising several compositions containing an interfering ribonucleic acid in a container and one or more suitable active ingredients such as chemical or biological pesticides in a separate container. Alternatively, the composition may be presented as a mixture which is stable and may be used in combination with each other.
Подходящие активные ингредиенты, которые могут действовать на интерферирующую рибонуклеиновую кислоту по настоящему изобретению дополняющим образом, в качестве неограничивающих примеров включают следующие: хлорпирифос, аллетрин, ресметрин, тетрабромэтил, диметанол-циклопропанкарбоновая кислота (в основном, содержится в жидкой композиции); а также гидраметилнон, авермектин, хлорпирифос, сульфурамид, гидропрен, фипронил (рецептор ГАМК), изопропилфенилметил карбамат, индоксакарб, новифлумурон (ингибитор синтеза хитина), имипротрин, абамектин (хлоридный канал с глутаминатными воротами), имидилаклоприд (ацетилхолиновый рецептор) (в основном содержится в композиции приманки). Предпочтительно, в отношении здоровья и окружающей среды известным активным ингредиентом является инсектицид, такой как гидраметилнон и абамектин.Suitable active ingredients that can act on the interfering ribonucleic acid of the present invention in a complementary manner include, as non-limiting examples, the following: chlorpyrifos, allethrin, resmethrin, tetrabromoethyl, dimethanol-cyclopropanecarboxylic acid (mainly contained in the liquid composition); as well as hydramethylnon, avermectin, chlorpyrifos, sulfuramide, hydroprene, fipronil (GABA receptor), isopropylphenylmethyl carbamate, indoxacarb, noviflumuron (chitin synthesis inhibitor), imiprotrin, abamectin (chloride channel with glutamate gate), imidilacloprid (acetylcholine receptor) (mainly contains in the composition of the bait). Preferably, from a health and environmental point of view, the known active ingredient is an insecticide such as hydramethylnon and abamectin.
Композицию по настоящему изобретению можно сформулировать так, чтобы она содержала по меньшей мере один дополнительный агрономический агент, такой как гербицид или дополнительный инсектицид. "Дополнительный инсектицид" или "второй инсектицид" относится к инсектициду, отличному от первого или от исходной интерферирующей молекулы РНК из композиции. Необязательно, композиция по настоящему изобретению может быть доставлена в комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным агрономическим агентом (например, гербицидом или вторым инсектицидом). Композиция может быть представлена в комбинации с гербицидом, гербицидом, выбранным из любого гербицида, известного в данной области, такого как глифосат, 2,4-D, имидазолинон, сульфонилкарбамид и бромоксинил. Композиция также может быть представлена в виде комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным инсектицидом, и дополнительный инсектицид, можно выбирать из любого инсектицида, известного в данной области, и/или может содержать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, и интерферирующая рибонуклеиновая кислота действует, подавляя экспрессию гена-мишени у насекомого после того, как насекомое проглотило ее. Вредителем-мишенью является насекомое, и интерферирующая рибонуклеиновая кислота представляет собой любую кислоту, выбранную из интерферирующих рибонуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Дополнительный инсектицид включает интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая подавляет экспрессию известного гена у любого вредителя-мишени. Исходная интерферирующая рибонуклеиновая кислота и второй или дополнительный инсектицид композиции могут быть нацелены на одних и тех же или разных насекомых. Например, исходная интерферирующая рибонуклеиновая кислота и второй инсектицид могут быть нацелены на различных насекомых или могут быть нацелены на насекомых разных семейств или классов, таких как грибы или нематоды, или насекомые. Специалисты в данной области должны знать, как тестировать синергическое действие интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в комбинации с другими агрономическими реагентами. Предпочтительно, композиция содержит первую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту и один или несколько дополнительных инсектицидов, каждый из которых токсичен для одного и того же насекомого, где один или несколько дополнительных инсектицидов выбраны из специфического белка клубней картофеля, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus ehlersii, инсектицидного белка Photorhabdus luminescens, инсектицидного белка Bacillus laterosporus, инсектицидного белка Bacillus sphaericus и лигнина. Различные компоненты могут быть доставлены одновременно или последовательно в область или организм, подлежащий лечению.The composition of the present invention can be formulated to contain at least one additional agronomic agent, such as a herbicide or additional insecticide. "Additional insecticide" or "second insecticide" refers to an insecticide other than the first or the original interfering RNA molecule of the composition. Optionally, the composition of the present invention may be delivered in combination with at least one additional agronomic agent (eg, herbicide or second insecticide). The composition may be presented in combination with a herbicide, a herbicide selected from any herbicide known in the art such as glyphosate, 2,4-D, imidazolinone, sulfonylurea and bromoxynil. The composition may also be presented in combination with at least one additional insecticide, and the additional insecticide may be selected from any insecticide known in the art and/or may contain an interfering ribonucleic acid, and the interfering ribonucleic acid acts to suppress the expression target gene in an insect after the insect has ingested it. The target pest is an insect, and the interfering ribonucleic acid is any acid selected from the interfering ribonucleic acids of the present invention. The additional insecticide includes an interfering ribonucleic acid that suppresses the expression of a known gene in any target pest. The parent interfering ribonucleic acid and the second or additional insecticide of the composition may target the same or different insects. For example, the parent interfering ribonucleic acid and the second insecticide may target different insects, or may target insects of different families or classes, such as fungi or nematodes, or insects. Those skilled in the art would know how to test synergistic effects of interfering ribonucleic acid in combination with other agronomic reagents. Preferably, the composition contains the first interfering ribonucleic acid and one or more additional insecticides, each of which is toxic to the same insect, where one or more additional insecticides are selected from a specific potato tuber protein, a Bacillus thuringiensis insecticidal protein, a Xenorhabdus ehlersii insecticidal protein, an insecticidal Photorhabdus luminescens protein, Bacillus laterosporus insecticidal protein, Bacillus sphaericus insecticidal protein and lignin. The various components may be delivered simultaneously or sequentially to the area or organism to be treated.
Способ профилактики вторжения насекомых и/или борьбы с вторжением насекомыхMethod for preventing insect invasion and/or controlling insect invasion
Способ профилактики вторжения насекомых и/или борьбы с вторжением насекомых по настоящему изобретению включает контактирование насекомого с эффективным количеством, по меньшей мере, одной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота подавляет экспрессию жизненного важного гена-мишени насекомого после того, как поглощается насекомым. Жизненно важным геном-мишенью может быть любой ген насекомого, участвующий в регуляции важного биологического процесса, необходимого насекомому для инициирования или поддержания заражения, включая в качестве неограничивающих примеров выживание, рост, развитие, воспроизводство и патогенность.The method of preventing insect invasion and/or controlling insect invasion of the present invention comprises contacting an insect with an effective amount of at least one interfering ribonucleic acid, wherein the interfering ribonucleic acid represses the expression of a vital target insect gene after being ingested by the insect. A vital target gene can be any insect gene involved in the regulation of an essential biological process required by an insect to initiate or maintain infection, including, but not limited to, survival, growth, development, reproduction, and pathogenicity.
Способ по настоящему изобретению для профилактики вторжения насекомых и/или борьбы с вторжением насекомых на полях сельскохозяйственных культур включает экспрессию эффективного количества интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в растении. В случае, когда количество применяется для борьбы с вторжением насекомых, термин "эффективное" относится к количеству или содержанию интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, необходимому для оказания фенотипического эффекта на насекомое, с тем чтобы уменьшить количество насекомых, поражающих организмы-хозяева и/или уменьшить ущерб, нанесенный насекомым. Фенотипическим эффектом может быть смерть насекомого, и применение интерферирующей РНК приводит к смерти насекомого, по меньшей мере, в 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, в 50%, 60%, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, в 80% или 90% случаев по сравнению с контрольным насекомым. Фенотипические эффекты могут также в качестве неограничивающих примеров включать препятствование росту насекомых, прекращение кормления и снижение яйценоскости. Таким образом, по сравнению с контрольным насекомым, общее количество насекомых, атакующих организм-хозяин, может быть уменьшено, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% или 90%. Необязательно, ущерб, наносимый насекомым, можно уменьшить, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% или 90% по сравнению с контрольным насекомым. Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для достижения контроля над насекомыми, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, и более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% или 90%.The method of the present invention for preventing and/or controlling insect invasion in crop fields comprises expressing an effective amount of an interfering ribonucleic acid in a plant. In the case where the amount is used to control insect invasion, the term "effective" refers to the amount or content of interfering ribonucleic acid necessary to have a phenotypic effect on the insect in order to reduce the number of insects infecting host organisms and/or reduce the damage, inflicted by insects. The phenotypic effect may be insect death, and the use of interfering RNA results in insect death of at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70%, more preferably at least 80% or 90% of the time compared to the control insect. Phenotypic effects may also include, but are not limited to, inhibition of insect growth, feeding cessation, and reduced egg production. Thus, compared with the control insect, the total number of insects attacking the host can be reduced by at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70 %, more preferably at least 80% or 90%. Optionally, insect damage can be reduced by at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70%, more preferably at least 80% or 90% compared to the control insect. Thus, the present invention can be used to achieve insect control of at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70%, and more preferably at least , by 80% or 90%.
Способ и композицию по настоящему изобретению можно использовать для ограничения или устранения вторжения жесткокрылых вредителей, в частности Monolepta hieroglyphica, в окружающей среде или на поверхности, где существует любой вредитель-хозяин, симбионт-вредитель или вредитель, путем предоставления одной или нескольких композиций, содержащих молекулы дцРНК по настоящему изобретению, в корме для вредителей. Этот способ особенно полезен для предотвращения нападения насекомых на растения, а вредители определяются как имеющие пищеварительную систему с pH приблизительно от 4,5 до приблизительно 9,5, приблизительно от 5 до приблизительно 9, приблизительно от 6 до приблизительно 7, и приблизительно pH 7,0.The method and composition of the present invention can be used to limit or eliminate the invasion of beetle pests, in particular Monolepta hieroglyphica, in an environment or on a surface where any host pest, pest symbiont or pest exists, by providing one or more compositions containing molecules dsRNA of the present invention, in pest feed. This method is particularly useful in preventing insect attacks on plants, and pests are defined as having a digestive system with a pH of about 4.5 to about 9.5, about 5 to about 9, about 6 to about 7, and about
Преимущества по настоящему изобретениюAdvantages of the present invention
Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду и способу борьбы с нашествием насекомых, который имеет, по меньшей мере, следующие преимущества:The present invention relates to a polynucleotide and method for controlling insect infestation, which has at least the following advantages:
1. Настоящее изобретение относится впервые ко множеству целевых последовательностей гена-мишени c35112 для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями, Monolepta hieroglyphica, и подтверждает, что ингибитор нуклеиновой кислоты, полученный на основе этих целевых последовательностей, может быть непосредственно использован для контроля вторжения жесткокрылого насекомого-вредителя.1. The present invention relates for the first time to a plurality of target gene sequences c35112 for controlling the beetle insect pest, Monolepta hieroglyphica, and confirms that a nucleic acid inhibitor derived from these target sequences can be directly used to control the invasion of the beetle pest - pest.
2. Высокая специфичность к виду. Целевая последовательность по настоящему изобретению для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями Monolepta hieroglyphica очень специфично действует на Monolepta hieroglyphica и виды, которые тесно связаны с ней и имеют совпадающие последовательности.2. High species specificity. The target sequence of the present invention for controlling the beetle pest Monolepta hieroglyphica acts very specifically on Monolepta hieroglyphica and species that are closely related to it and share sequences.
3. Отсутствует резистентность. Настоящее изобретение не зависит от комбинации конкретных дцРНК и рецепторного белка у насекомого и может эффективно избежать риска, такого как выработка у насекомого устойчивости к белку токсина Bt.3. No resistance. The present invention does not depend on the combination of specific dsRNA and receptor protein in an insect, and can effectively avoid the risk such as developing resistance in the insect to the Bt toxin protein.
4. Технология РНКи, используемая в настоящем изобретении, имеет высокую эффективность и специфичность, а полученная дцРНК может быть непосредственно применена в полевых условиях для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, что удобно, дешево и имеет хорошую экологическую совместимость.4. The RNAi technology used in the present invention has high efficiency and specificity, and the resulting dsRNA can be directly applied in the field to control the invasion of beetle insect pests, which is convenient, cheap, and has good environmental compatibility.
Технические решения по настоящему изобретению будут дополнительно описаны в деталях ниже с помощью прилагаемых чертежей и примеров.The technical solutions of the present invention will be further described in detail below with the help of the accompanying drawings and examples.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
На фигуре 1 представлена электрофореграмма уровня экспрессии гена-мишени c35112 из полинуклеотида и способа для борьбы с нашествием насекомых по настоящему изобретению;Figure 1 shows an electropherogram of the expression level of the c35112 target gene from a polynucleotide and a method for controlling insect infestation of the present invention;
На фигуре 2 представлена схема рекомбинантного экспрессионного вектора DBNR35112C1, применяемого в полинуклеотиде и способе для борьбы с нашествием насекомых по настоящему изобретению.Figure 2 is a diagram of the DBNR35112C1 recombinant expression vector used in the insect control polynucleotide and method of the present invention.
ПримерыExamples
Следующие конкретные примеры дополнительно иллюстрируют техническое решение полинуклеотида и способа по настоящему изобретению для борьбы с нашествием насекомых.The following specific examples further illustrate the polynucleotide and method of the present invention for controlling insect infestation.
Пример 1: Определение целевой последовательности Monolepta hieroglyphicaExample 1: Target Sequence Determination of Monolepta hieroglyphica
1. Выделение тотальной РНК Monolepta hieroglyphica.1. Isolation of the total RNA of Monolepta hieroglyphica.
В качестве материала использовали червей личинок первого возраста Monolepta hieroglyphica, РНК экстрагировали при помощи общепринятого способа с тризолом, очищали общепринятым способом, и обрабатывали ферментом для ДНК для получения образца тотальной РНК с концентрацией ≥300нг/мкл, общим количеством ≥6 мкг и OD 260/280 1,8-2,2.First instar larval worms Monolepta hieroglyphica were used as material, RNA was extracted using the conventional method with trizol, purified by the conventional method, and treated with DNA enzyme to obtain a total RNA sample with a concentration of ≥300ng/μl, a total amount of ≥6 μg and OD 260/ 280 1.8-2.2.
2. Выделение мРНК и синтез кДНК.2. Isolation of mRNA and synthesis of cDNA.
Магнитные шарики с олиго-dT применяли для выделения мРНК с полиA из образца тотальной РНК, подготовленного выше, а затем синтезировали первую цепь кДНК при помощи случайного гексамера и набора с обратной транскриптазой Invitrogen's Superscript II.Oligo-dT magnetic beads were used to isolate polyA mRNA from the total RNA sample prepared above, and then first strand cDNA was synthesized using a random hexamer and Invitrogen's Superscript II reverse transcriptase kit.
3. Скрининг генов-мишеней3. Screening for target genes
Один образец гена-мишени c35112 Monolepta hieroglyphica был выделен при скрининге при анализе библиотеки личинок из генов с умеренным уровнем экспрессии и, возможно, участвующих в важных метаболических путях, его полноразмерная нуклеотидная последовательность была показана в SEQ ID NO: 1, и его аминокислотная последовательность была показана в SEQ ID NO: 2.One sample of the c35112 target gene of Monolepta hieroglyphica was isolated by screening analysis of a larval library from genes with a moderate level of expression and possibly involved in important metabolic pathways, its full nucleotide sequence was shown in SEQ ID NO: 1, and its amino acid sequence was shown in SEQ ID NO: 2.
4. Выбор целевой последовательности в гене-мишени4. Selection of the target sequence in the target gene
Восемнадцать целевых последовательностей с разными позициями ORF и/или разными длинами выбирали из гена-мишени c35112, как показано в таблице 1.Eighteen target sequences with different ORF positions and/or different lengths were selected from the c35112 target gene as shown in Table 1.
Таблица 1. Информация о последовательностях восемнадцати целевых последовательностейTable 1. Sequence information for the eighteen target sequences
Пример 2: Получение дцРНКExample 2: Preparation of dsRNA
Ссылаясь на инструкции набора MEGAscript RNAi компании ThermoFisher, синтезировали дцРНК из указанных выше 18 целевых последовательностей, которые представляют собой r1-дцРНК в r18-дцРНК; размеры продуктов были определены путем агарозного электрофореза с массовой концентрацией 1%, а концентрацию указанных выше r1-дцРНК до r18-дцРНКли определяли с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), соответственно.Referring to the instructions of the ThermoFisher MEGAscript RNAi kit, dsRNA was synthesized from the above 18 target sequences, which are r1-dsRNA in r18-dsRNA; the sizes of the products were determined by agarose electrophoresis with a mass concentration of 1%, and the concentration of the above r1-dsRNA to r18-dsRNAli was determined using NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), respectively.
Пример 3: Определение контроля над Monolepta hieroglyphica путем кормления дцРНК.Example 3: Determination of control of Monolepta hieroglyphica by feeding dsRNA.
Выделенные и очищенные дцРНК от r1-дцРНК до r18-дцРНК смешивали раздельно и равномерно добавляли в корм в соотношении 50 мкг/г корма и 5 мкг/г корма (для формулы корма, см.: Development of an artificial diet for the western corn rootworm, Entomologia Experimentalis et Applicata 105:1-11, 2002), и таким образом получали корма от c35112-r1-50 до c35112-r18-50 и корма от c35112-r1-5 до c35112-r18-5 соответственно, где в корма контрольной группы СК добавляли нерелевантную дцРНК (SEQ ID NO: 29), а другие условия были точно такими же. Только что вылупившихся личинок Monolepta hieroglyphica кормили приготовленным кормом, при этом 30 только что вылупившихся личинок с временем инкубации не более 24 часов помещали в каждую чашку, где корма, смешанные с дцРНК, меняли каждые два дня и кормили до тех пор, пока не наступали сутки 12. Смертность насекомых подсчитывали каждые два дня от начала кормления. С начала кормления уровни экспрессии генов-мишеней измеряли на Сутки 0, 4, 8 и 10 определенным способом следующим образом:The isolated and purified dsRNAs from r1-dsRNA to r18-dsRNA were mixed separately and evenly added to the feed at a ratio of 50 µg/g feed and 5 µg/g feed (for the feed formula, see: Development of an artificial diet for the western corn rootworm , Entomologia Experimentalis et Applicata 105:1-11, 2002) and thus obtained food from c35112-r1-50 to c35112-r18-50 and food from c35112-r1-5 to c35112-r18-5 respectively, where in the food SC control group was added irrelevant dsRNA (SEQ ID NO: 29), and other conditions were exactly the same. Newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae were fed prepared food, while 30 newly hatched larvae with an incubation time of no more than 24 hours were placed in each dish, where the food mixed with dsRNA was changed every two days and fed until the day 12. Insect mortality was counted every two days from the start of feeding. From the start of feeding, target gene expression levels were measured on
Этап 301: червей, которым скармливали корма c35112-r1-50 - c35112-r18-50 и корма c35112-r1-5 - c35112-r18-5, собирали на Сутки 0, 4, 8 и 10 соответственно, и криоконсервировали в жидком азоте;Step 301: Worms fed c35112-r1-50 to c35112-r18-50 and c35112-r1-5 to c35112-r18-5 were harvested on
Этап 302: тотальную РНК вышеуказанных червей экстрагировали с использованием способа с тризолом;Step 302: The total RNA of the above worms was extracted using the Trizol method;
Этап 303: Проводили обратную транскрипцию тотальной РНК вышеуказанных червей с использованием TransGen Biotech ER301-01 для получения кДНК;Step 303: Total RNA of the above worms was reverse transcribed using TransGen Biotech ER301-01 to obtain cDNA;
Этап 304: Убиквитин-C применяли в качестве внутреннего референсного гена для проведения ПЦР-амплификации, и после амплификации 10 мкл амплифицированного продукта подвергали агарозному электрофорезу в геле с массовой концентрацией 1%.Step 304: Ubiquitin-C was used as an internal reference gene for PCR amplification, and after amplification, 10 μl of the amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis at a mass concentration of 1%.
Каждую обработку в вышеупомянутом эксперименте повторяли 5 раз, и статистические результаты были показаны на фигуре 1 и в Таблице 2. В таблице 2, «-50» в номере материала означает, что 50 мкг соответствующей дцРНК содержится в одном грамме корма, т.е. указанное выше «50 мкг/г корма»; «-5» означает, что 5 мкг соответствующей дцРНК содержится в одном грамме корма, т.е. указанное выше «5 мкг/г корма». Например, «r1-дцРНК-50» означает, что 50 мкг r1-дцРНК содержалось в одном грамме корма. «DAI» относится к количеству суток после кормления.Each treatment in the above experiment was repeated 5 times, and the statistical results were shown in Figure 1 and Table 2. In Table 2, "-50" in the material number means that 50 μg of the respective dsRNA is contained in one gram of feed, i.e. the above "50 µg/g feed"; "-5" means that 5 µg of the corresponding dsRNA is contained in one gram of food, i.e. the above "5 µg/g feed". For example, "r1-dsRNA-50" means that 50 µg of r1-dsRNA was contained in one gram of food. "DAI" refers to the number of days after feeding.
Результаты измерения экспрессия гена-мишени на фигуре 1 показывают, что дцРНК целевых последовательностей r3 и r4 (50 мкг/г питания) оказывала значительное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени c35112 у Monolepta hieroglyphica, экспрессия гена-мишени c35112 была значительно подавлена на сутки 4 кормления, и экспрессия c35112 почти не определялась на сутки 10.The results of measuring the expression of the target gene in figure 1 show that dsRNA of the target sequences r3 and r4 (50 μg/g nutrition) had a significant inhibitory effect on the expression of the c35112 target gene in Monolepta hieroglyphica, the expression of the c35112 target gene was significantly suppressed on
Результаты кормления дцРНК в таблице 2 показывают, что дцРНК целевых последовательностей r1-r18 гена-мишени c35112 оказывает очевидное летальное воздействие на Monolepta hieroglyphica, и в большинстве повторов на двенадцатые сутки кормления почти не было выживших личинок.The dsRNA feeding results in Table 2 show that the dsRNA target sequences r1-r18 of the target gene c35112 have a clear lethal effect on Monolepta hieroglyphica and most repeats had almost no surviving larvae on the twelfth day of feeding.
Таблица 2: Результаты коэффициента выживаемости Monolepta hieroglyphica в тесте кормления дцРНКTable 2: Survival Rate Results of Monolepta hieroglyphica in the dsRNA Feeding Test
Пример 4: Неожиданные технические эффекты интерференции экспрессии одного и того же гена у разных насекомых.Example 4: Unexpected technical effects of interference in the expression of the same gene in different insects.
Белок частицы распознавания сигнала 54кДа принадлежит к одной из пептидных цепей в комплексе частиц распознавания сигнала. Его основная функция заключается в том, что когда секретируемый в данный момент белок выходит из рибосомы, белок частицы распознавания сигнала 54кДа быстро связывается с сигнальной последовательностью ранее секретированного белка и переносит его на мембранный белок, связанный с цепью транслокации. Соответствующая литература показала, что вмешательство в экспрессию гена, кодирующего белок частицы распознавания сигнала 54кДа, может иметь летальные эффекты для ряда жесткокрылых насекомых; например, как сообщает Julia Ulrich et al. (2015), когда ген, кодирующий белок у Tribolium castaneum, подвергался РНК-интерференции путем инъекции (инъекция последовательности, код iB_00404), было выявлено, что почти все Tribolium castaneum погибли в течение 4 суток после инъекции. Дополнительно, как сообщает Avet-Rochex et al. (2010), когда ген, кодирующий белок у Drosophila, подвергался РНК-интерференции путем инъекции (Таблица 1), результаты показали, что почти все Drosophila погибли после инъекции.The 54 kDa signal recognition particle protein belongs to one of the peptide chains in the signal recognition particle complex. Its main function is that when the currently secreted protein exits the ribosome, the 54kD signal recognition particle protein quickly binds to the signal sequence of the previously secreted protein and transfers it to the membrane protein associated with the translocation chain. The relevant literature has shown that interference with the expression of the gene encoding the 54 kDa signal recognition particle protein can have lethal effects in a number of beetles; for example, as reported by Julia Ulrich et al. (2015), when the gene encoding a protein in Tribolium castaneum was subjected to RNA interference by injection (sequence injection, code iB_00404), it was found that almost all Tribolium castaneum died within 4 days after injection. Additionally, as reported by Avet-Rochex et al. (2010), when a gene encoding a protein in Drosophila was subjected to RNA interference by injection (Table 1), the results showed that almost all Drosophila died after the injection.
На основании вышеуказанных выше сообщений в литературе и высокой последовательности гомологии, провели скрининг гена, кодирующего белок у Monolepta hieroglyphica, и выбирали последовательность M1, показанную в SEQ ID NO: 30, в соответствующем положении согласно последовательности, введенной в Tribolium castaneum и Drosophila. Также была выбрана последовательность M2, показанная в SEQ ID NO: 31, в несоответствующем положении. Использовали способ кормления дцРНК (соотношение корма 50 мкг/г) в примере 3 по настоящему изобретению для определения способности контроля Monolepta hieroglyphica. Как показано в таблице 3, экспериментальные результаты показали, что ни последовательность M1 в соответствующем положении, ни последовательность M2 в несоответствующем положении не оказали очевидного летального эффекта на Monolepta hieroglyphica, который был в основном таким же, как и в контроле. Аналогичные экспериментальные результаты подтверждены в WO 2018/026770, в котором после получения группы транскрипции, применяли для проверки РНКи летальных генов нематод и дрозофил, то есть, согласно известным летальным генам у нематод и дрозофил, соответствующий ген у корневых червей кукурузы подвергался РНКи, и в принципе не наблюдали очевидного летального эффекта. По сути, технические эффекты интерференции экспрессии одного и того же гена у разных насекомых непредсказуемы, и не обязательно связаны с техническими эффектами известной интерференции и гомологии последовательностей.Based on the above literature reports and high sequence homology, the gene encoding the protein in Monolepta hieroglyphica was screened, and the M1 sequence shown in SEQ ID NO: 30 was selected at the appropriate position according to the sequence introduced in Tribolium castaneum and Drosophila. The M2 sequence shown in SEQ ID NO: 31 was also selected in the wrong position. The dsRNA feeding method (
Таблица 3: Результаты уровня летальности в тесте кормления дцРНК у Monolepta hieroglyphicaTable 3: Mortality rate results in the dsRNA feeding test in Monolepta hieroglyphica
Пример 5: Конструирование растительного экспрессионного вектораExample 5: Construction of a Plant Expression Vector
Синтезировали две экспрессионные кассеты в соответствии с последовательностью p35S-RX-tNos-p35S-Hpt-tNos (X был 1-18), и лигировали с растительным экспрессионным вектором с использованием EcoRV и BamHI, и полученные векторы были названы DBNR35112CX (X был 1-18), где схематическая диаграмма вектора DBNR35112C1 показана на фигуре 2 (Kan: ген канамицина; RB: правая граница; pr35S: промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (SEQ ID NO: 21); R1 (SEQ ID NO: 22): обратная комлементарная последовательность нуклеотидной последовательности r1 (r1 - целевая последовательность 1 гена-мишени c35112, SEQ ID NO: 3)+спейсерная последовательность (SEQ ID NO: 23)+нуклеотидная последовательность r1; tNos: терминатор гена нопалинсинтазы (SEQ ID NO: 24); Hpt: ген гигромицин фосфотрансферазы (SEQ ID NO: 25); LB: левая граница).Two expression cassettes were synthesized according to the sequence p35S-RX-tNos-p35S-Hpt-tNos (X was 1-18) and ligated to a plant expression vector using EcoRV and BamHI and the resulting vectors were named DBNR35112CX (X was 1-18). 18), where a schematic diagram of the DBNR35112C1 vector is shown in figure 2 (Kan: kanamycin gene; RB: right border; pr35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter (SEQ ID NO: 21); R1 (SEQ ID NO: 22): reverse complementary r1 nucleotide sequence (r1 - target gene c35112 target sequence 1, SEQ ID NO: 3) + spacer sequence (SEQ ID NO: 23) + r1 nucleotide sequence; tNos: nopaline synthase gene terminator (SEQ ID NO: 24); Hpt : hygromycin phosphotransferase gene (SEQ ID NO: 25); LB: left border).
Рекомбинантным экспрессионным вектором DBNR35112C1 были трансформированы компетентные клетки E.coli T1 с помощью способа теплового шока, при котором условия теплового шока были: 50 мкл компетентных клеток E.coli T1, 10 мкл ДНК-плазмиды (рекомбинантный экспрессионный вектор DBNR35112C1), водяная баня 42°C на 30 секунд; встряхивание культуры при 37°C в течение 1 часа (встряхивание на шейкере при 100 об./мин.); затем культивировали при 37°C в течение 12 часов на твердой чашке LB, содержащей 50 мг/л канамицина (триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, NaCl 10 г/л, агар 15 г/л, pH доведен до 7,5 с помощью NaOH). Белые колонии отбирали и культивировали в течение ночи при 37°C в жидкой среде LB (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, Канамицин 50 мг/л, pH доведен до 7,5 с помощью NaOH). Плазмиды экстрагировали щелочным способом: бактериальный раствор центрифугировали при 12000 об./мин. в течение 1 минуты, супернатант удаляли, и осажденные бактериальные клетки суспендировали с помощью 100 мкл предварительно охлажденного льдом Раствора I (25 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 50 мМ глюкоза, pH 8,0); Добавляли 200 мкл свежеприготовленного Раствора II (0,2M NaOH, 1% SDS (додецилсульфат натрия)), пробирку переворачивали 4 раза для перемешивания и помещали на лед в течение 3-5 минут; добавляли 150 мкл охлажденного на льду Раствора III (3M ацетат калия, 5M уксусная кислота), тщательно перемешивали и помещали на лед на 5-10 минут; после центрифугировали в течение 5 минут при температуре 4°C и скорости вращения 12000 об./мин. К супернатанту добавляли, равномерно перемешивая, 2 объема абсолютного этанола и выдерживали при комнатной температуре в течение 5 минут; центрифугировали в течение 5 минут при температуре 4°C и скорости вращения 12000 об./мин., супернатант удаляли, осадок отмывали этанолом с 70% содержанием (об./об.) и сушили на воздухе. Добавляли 30 мкл TE (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0), содержащего РНКазу (20 мкг/мл), для растворения осадка; расщепление РНК проводили на водяной бане при 37°C в течение 30 минут; хранили для дальнейшего использования при -20°C. Выделенные плазмиды были секвенированы и идентифицированы при помощи ПЦР, и результаты показали, что рекомбинантный экспрессионный вектор DBNR35112C1 сконструирован верно.Competent E. coli T1 cells were transformed with the recombinant expression vector DBNR35112C1 using the heat shock method, in which the heat shock conditions were: 50 μl of competent E. coli T1 cells, 10 μl of DNA plasmid (DBNR35112C1 recombinant expression vector), water bath 42° C for 30 seconds; shaking the culture at 37°C for 1 hour (shaking on a shaker at 100 rpm); then cultured at 37°C for 12 hours on a solid LB plate containing 50 mg/l kanamycin (tryptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l, pH adjusted to 7.5 with NaOH). White colonies were selected and cultured overnight at 37°C in liquid LB medium (tryptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l,
Рекомбинантные экспрессионный векторы DBNR35112C2 в DBNR35112C18 конструировали в соответствии с вышеуказанным способом, и их векторные структуры были: Kan: ген канамицина; RB: правая граница; pr35S: промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (SEQ ID NO: 21); RX: нуклеотидная последовательность rX (rX представляла собой целевую последовательность X гена-мишени c35112, X составлял от 2 до 18)+спейсерная последовательность (SEQ ID NO: 23)+последовательность, обратно комплементарная нуклеотидной последовательности rX; tNos: терминатор гена нопалинсинтазы (SEQ ID NO: 24); Hpt: ген гигромицин фосфотрансферазы (SEQ ID NO: 25); LB: левая граница. Рекомбинантными экспрессионными векторами DBNR35112C2 в DBNR35112C18 трансформировали компетентные клетки E.coli T1 с помощью способа теплового шока, плазмиды экстрагировали щелочным способом.DBNR35112C2 recombinant expression vectors in DBNR35112C18 were constructed according to the above method and their vector structures were: Kan: kanamycin gene; RB: right border; pr35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter (SEQ ID NO: 21); RX: rX nucleotide sequence (rX was the target X sequence of the c35112 target gene, X was 2 to 18) + spacer sequence (SEQ ID NO: 23) + reverse complementary sequence to the rX nucleotide sequence; tNos: nopaline synthase gene terminator (SEQ ID NO: 24); Hpt: hygromycin phosphotransferase gene (SEQ ID NO: 25); LB: left border. Recombinant expression vectors DBNR35112C2 into DBNR35112C18 were transformed into competent E. coli T1 cells using the heat shock method, plasmids were extracted by the alkaline method.
Пример 6: Трансформация Agrobacterium рекомбинантным экспрессионным векторомExample 6: Transformation of Agrobacterium with a Recombinant Expression Vector
Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Чикаго, США, каталожный номер: 18313-015) были трансформированы правильно сконструированными рекомбинантными экспрессионными векторами от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 с помощью способа с жидким азотом, в котором условиями трансформации были: 100 мкл ДНК Agrobacterium LBA4404, 3 мкл ДНК плазмиды (рекомбинантный экспрессионный вектор); помещали в жидкий азот в течение 10 минут, затем на теплую водяную баню при 37°C в течение 10 минут; трансформированные Agrobacterium LBA4404 инокулировали в тестовую пробирку с LB при температуре 28°C и скорости вращения 200 об./мин. в течение 2 часов, затем наносили на чашку с LB, содержащую 50 мкг/л рифампицина и 100 мкг/л канамицина, выращивали до получения положительного моноклона, моноклональную культуру отбирали и выделяли ее плазмиду, рекомбинантные экспрессионные векторы от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 подвергали ферментному расщеплению с использованием ферментов рестрикции EcoRV и BamHI для проведения подтверждения расщепления ферментами, и результаты показали, что рекомбинантные экспрессионные векторы DBNR35112C1-DBNR35112C18 были полностью правильными.Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA, catalog number: 18313-015) were transformed with properly designed recombinant expression vectors DBNR35112C1 to DBNR35112C18 using the liquid nitrogen method, in which the transformation conditions were: 100 µl Agrobacterium LBA4404 DNA, 3 µl plasmid DNA (recombinant expression vector); placed in liquid nitrogen for 10 minutes, then in a warm water bath at 37°C for 10 minutes; the transformed Agrobacterium LBA4404 was inoculated into the LB test tube at 28°C and 200 rpm. for 2 hours, then applied to a LB dish containing 50 μg/l rifampicin and 100 μg/l kanamycin, grown to obtain a positive monoclone, the monoclonal culture was selected and its plasmid isolated, recombinant expression vectors from DBNR35112C1 to DBNR35112C18 were subjected to enzymatic cleavage with using the restriction enzymes EcoRV and BamHI to perform enzyme digestion confirmation, and the results showed that the recombinant expression vectors DBNR35112C1-DBNR35112C18 were completely correct.
Пример 7: Получение трансгенных растений кукурузыExample 7 Production of Transgenic Maize Plants
Согласно общепринятому способу заражения Agrobacterium, незрелые зародыши выращиваемой в асептических условиях кукурузы сорта Z31 (Z31) совместно культивировали с трансформированными Agrobacterium, описанными в примере 6, для переноса Т-ДНК (включающей нуклеотидную последовательность RX, последовательность промотора вируса мозаики цветной капусты 35S, ген Hpt и последовательность терминатора Nos) из рекомбинантных экспрессионных векторов от DBNR35112C1 до DBNR35112C18, сконструированных в примере 5, в геном кукурузы, тем самым получая растения кукурузы с перенесенной нуклеотидной последовательностью RX (X был 1-18); одновременно в качестве контроля использовали растения кукурузы дикого типа.According to the conventional method of infecting Agrobacterium, immature embryos of aseptically grown Z31 (Z31) corn cultivars were co-cultured with the transformed Agrobacterium described in Example 6 for T-DNA transfer (comprising the RX nucleotide sequence, the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter sequence, the Hpt gene and a Nos terminator sequence) from the recombinant expression vectors DBNR35112C1 to DBNR35112C18 constructed in Example 5 into the maize genome, thereby obtaining maize plants with a transferred RX nucleotide sequence (X was 1-18); at the same time, wild-type corn plants were used as controls.
Что касается трансформации кукурузы, опосредованной Agrobacterium, в кратком изложении, незрелые зародыши выделяли из кукурузы и незрелые зародыши контактировали с суспензией Agrobacterium, где Agrobacterium были способны доставлять нуклеотидную последовательность RX, по меньшей мере, к одной из клеток незрелого зародыша (этап 1: этап заражения). На этом этапе незрелые зародыши были предпочтительно погружены в суспензию Agrobacterium (OD 660=от 0,4 до 0,6, инфекционная среда (MS соль 4,3 г/л, MS витамин, казеин 300 мг/л, сахароза 68,5 г/л, глюкоза 36 г/л, ацетосирингон (AS) 40 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 1 мг/, pH 5,3)) для начала инокуляции. Незрелые зародыши совместно культивировали с Agrobacterium в течение периода времени (3 суток) (этап 2: этап совместного культивирования). Предпочтительно, незрелые зародыши помещали в твердую среду (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 20 г/л, глюкоза 10 г/л, ацетосирингон (AS) 100 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) 1 мг/л, агар 8 г/л, pH 5,8) после этапа заражения. После этого этапа совместного культивирования может быть необязательный этап «восстановления». На этапе «восстановления» среда восстановления (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 1 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8) содержала, по меньшей мере, один антибиотик (цефалоспорин), который, как известно, подавляет рост Agrobacterium, без добавления селективного агента для трансформанта растений (стадия 3: стадия восстановления). Предпочтительно, незрелые зародыши культивировали на твердой среде, содержащей антибиотик, но без селективного агента для уничтожения Agrobacterium и обеспечивали период восстановления для инфицированных клеток. Затем инокулированные незрелые зародыши культивировали на среде, содержащей селективный агент (гигромицин) и выбирали растущий трансформированный каллус (этап 4: этап селекции). Предпочтительно, незрелые зародыши культивировали на твердой среде (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, гигромицин 50 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 1 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8), содержащей селективный агент, что приводит к селективному росту трансформированных клеток. Затем каллус регенерировали в растение (этап 5: этап регенерации). Предпочтительно, каллус, выращенный на среде, содержащей селективный агент, культивировали на твердых средах (среда для дифференцировки MS и среда для укоренения MS) для регенерации растения.With regard to Agrobacterium mediated transformation of maize, in brief, immature embryos were isolated from maize and immature embryos were contacted with an Agrobacterium suspension where the Agrobacterium were able to deliver the RX nucleotide sequence to at least one of the cells of the immature embryo (step 1: infection step ). At this stage, immature embryos were preferably immersed in Agrobacterium suspension (OD 660=0.4 to 0.6, infection medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamin, casein 300 mg/l, sucrose 68.5 g /l, glucose 36 g/l, acetosyringone (AS) 40 mg/l, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1 mg/, pH 5.3)) to start the inoculation. Immature embryos were co-cultured with Agrobacterium for a period of time (3 days) (step 2: co-culture step). Preferably, immature embryos are placed in solid medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l, acetosyringone (AS) 100 mg/l, 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1 mg/l, agar 8 g/l, pH 5.8) after the infection step. After this co-culture step, there may be an optional "recovery" step. At the “recovery” stage, recovery medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1 mg/l, vegetable gel 3 g/l, pH 5.8) contained at least one antibiotic (cephalosporin) known to inhibit the growth of Agrobacterium without the addition of a plant transformant selective agent (step 3: recovery step). Preferably, immature embryos are cultured on a solid medium containing an antibiotic but without a selective agent to kill Agrobacterium and a recovery period is allowed for the infected cells. Then, the inoculated immature embryos were cultured on a medium containing a selective agent (hygromycin), and the growing transformed callus was selected (step 4: selection step). Preferably, immature embryos were cultured on a solid medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, hygromycin 50 mg/l, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D) 1 mg/l, vegetable gel 3 g/l, pH 5.8) containing a selective agent, which results in the selective growth of the transformed cells. The callus was then regenerated into a plant (step 5: regeneration step). Preferably, the callus grown on the medium containing the selective agent is cultured on solid media (MS differentiation medium and MS rooting medium) to regenerate the plant.
Отобранные устойчивые каллусы переносили в среду для дифференцировки MS (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, 6-бензиламинопурин 2 мг/л, гигромицин 50 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8) и культивировали при 25°C для дифференцировки. Дифференцированные сеянцы переносили на среду для укоренения MS (MS соль 2,15 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, индол-3-уксусная кислота 1 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8), культивировали при 25°C до высоты примерно 10 см, затем перемещали в теплицу и культивировали до плодоношения. В теплице продолжали выращивание при 28°C в течение 16 часов, а затем при 20°C в течение 8 часов в сутки.Selected resistant calli were transferred to MS differentiation medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, 6-benzylaminopurine 2 mg/l, hygromycin 50 mg/l, vegetable gel 3 g/l, pH 5.8) and cultured at 25°C for differentiation. Differentiated seedlings were transferred to MS rooting medium (MS salt 2.15 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, indole-3-acetic acid 1 mg/l, vegetable gel 3 g/l , pH 5.8), cultivated at 25°C to a height of about 10 cm, then transferred to a greenhouse and cultivated until fruiting. In the greenhouse continued cultivation at 28°C for 16 hours, and then at 20°C for 8 hours a day.
Пример 8: Получение трансгенных растений соиExample 8: Production of transgenic soybean plants
Согласно общепринятому способу заражения Agrobacterium, ткань семядольного узла ткани стерильно культивируемого сорта сои Zhonghuang 13 совместно культивировали с трансформированными Agrobacterium, описанными в примере 6, для переноса Т-ДНК (включающей нуклеотидную последовательность RX, последовательность промотора вируса мозаики цветной капусты 35S, ген Hpt и последовательность терминатора Nos) из рекомбинантных экспрессионных векторов от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 в геном сои, тем самым получая растения сои с перенесенной нуклеотидной последовательностью RX (X составляет 1-18); и одновременно в качестве контроля использовали растения сои дикого типа.According to the conventional Agrobacterium infection method, the cotyledon node tissue of the sterile cultured soybean variety Zhonghuang 13 was co-cultured with the transformed Agrobacterium described in Example 6 for T-DNA transfer (comprising the RX nucleotide sequence, the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter sequence, the Hpt gene and the terminator Nos) from recombinant expression vectors DBNR35112C1 to DBNR35112C18 into the soybean genome, thereby obtaining soybean plants with a transferred RX nucleotide sequence (X is 1-18); and at the same time, wild-type soybean plants were used as controls.
Для трансформации сои, опосредованной Agrobacterium, в кратком изложении, зрелые семена сои проращивали в среде для проращивания сои (B5 соль 3,1 г/л, витамин B5, сахароза 20 г/л, агар 8 г/л, pH 5,6), Семена высевали на среду для проращивания и культивировали в следующих условиях: температура 25±1°С; фотопериод (свет/темнота) составил 16/8 часов. После 4-6 суток прорастания выбирали асептические всходы сои с увеличенными семядольными узлами ярко-зеленого цвета, срезали гипокотили на 3-4 мм ниже семядольных узлов, срезали семядоли продольно, затем удаляли верхушечные почки, боковые почки и корни семян. Снова использовали скальпель для ранения семядольного узла, и раненая ткань семядольного узла контактировала с суспензией Agrobacterium, где Agrobacterium могли передавать нуклеотидную последовательность RX в поврежденную ткань семядольного узла (Этап 1: этап заражения). На этом этапе ткань семядольного узла предпочтительно погружали в суспензию Agrobacterium (OD 660=от 0,5 до 0,8, инфекционная среда (MS соль 2,15 г/л, витамин B5, сахароза 20 г/л, глюкоза 10 г/л, ацетилсирингон (AS) 40 мг/л, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) г/л, зеатин (ZT) 2 мг/л, pH5,3) для начала инокуляции. Ткань семядольного узла и Agrobacterium совместно культивировали в течение определенного периода (3 суток) (Этап 2: Этап совместного культивирования). Предпочтительно, после этапа заражения ткань узла семядоли помещали в твердую среду (MS соль 4,3 г/л, витамин B5, сахароза 20 г/л, глюкоза 10 г/л, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 4 г/л, зеатин 2 мг/л, агар 8 г/л, pH 5,6). После этой стадии совместного культивирования может быть необязательный этап «восстановления». На этапе «восстановления», восстановительная среда (B5 соль 3,1 г/л, витамины B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, зеатин (ZT) 2 мг/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, глутаминовая кислота 100 мг/л, аспарагиновая кислота 100 мг/л, pH 5,6) содержала, по меньшей мере, один антибиотик (цефалоспорин), который, как известно, ингибирует рост Agrobacterium, и не содержала селективный агент для трансформанта растений (стадия 3: стадия восстановления). Предпочтительно, регенерированную тканевую массу узла семядолей культивировали на твердой среде с антибиотиком, но без селективного агента, для уничтожения Agrobacterium и обеспечения периода восстановления инфицированных клеток. Затем регенерированную тканевую массу узла семядолей культивировали на среде, содержащей селективный агент (гигромицин), и выбирали растущий трансформированный каллус (этап 4: этап отбора). Предпочтительно, регенерированную тканевую массу узла семядолей культивировали на твердой среде для скрининга с селективным агентом (B5 соль 3,1 г/л, витамин B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, 6-бензиламинопурин (6-БАП) 1 мг/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, глутаминовая кислота 100 мг/л, аспарагиновая кислота 100 мг/л, гигромицин 50 мг/л, pH 5,6), что приводило к селективному росту трансформированной клетки. Затем трансформированная клетка была преобразована в растение (этап 5: этап регенерации); предпочтительно регенерированную тканевую массу семядольного узла, выращенную на среде, содержащей селективный агент, культивировали на твердых средах (среда для дифференцировки B5 и среда для укоренения B5) для регенерации растения.For Agrobacterium mediated transformation of soybean, in brief, mature soybean seeds were germinated in soybean germination medium (B5 salt 3.1 g/l, vitamin B5, sucrose 20 g/l, agar 8 g/l, pH 5.6) , Seeds were sown on the medium for germination and cultivated under the following conditions: temperature 25±1°C; photoperiod (light/dark) was 16/8 hours. After 4-6 days of germination, aseptic soybean seedlings with enlarged bright green cotyledon nodes were selected, hypocotyls were cut 3-4 mm below the cotyledon nodes, the cotyledons were cut longitudinally, then the apical buds, lateral buds and seed roots were removed. Again a scalpel was used to injure the cotyledon node, and the wounded tissue of the cotyledon node was contacted with a suspension of Agrobacterium, where Agrobacterium could transfer the RX nucleotide sequence to the injured tissue of the cotyledon node (Step 1: infection step). At this point, the cotyledon node tissue was preferably immersed in Agrobacterium suspension (OD 660=0.5 to 0.8, infectious medium (MS salt 2.15 g/l, vitamin B5, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l , acetylsyringone (AS) 40 mg/l, 2-morpholineethanesulfonic acid (MES) g/l, zeatin (ZT) 2 mg/l, pH5.3) to start inoculation Cotyledon node tissue and Agrobacterium were co-cultured for a certain period ( 3 days) (Step 2: Co-culture step) Preferably, after the infection step, the cotyledon node tissue was placed in solid medium (MS salt 4.3 g/l, vitamin B5, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l, 2 -morpholinethanesulfonic acid (MES) 4 g/l, zeatin 2 mg/l, agar 8 g/l, pH 5.6) After this co-culture step, there may be an optional "recovery" step. In the "recovery" step, reducing medium (B5 salt 3.1 g/l, vitamins B5, 2-morpholinethanesulfonic acid (MES) 1 g/l, sucrose 30 g/l, zeatin (ZT) 2 mg/l, agar 8 g/l, cephalosporin 150 mg/l l, glu tamic acid 100 mg/l, aspartic acid 100 mg/l, pH 5.6) contained at least one antibiotic (cephalosporin) known to inhibit the growth of Agrobacterium and did not contain a selective agent for the plant transformant (step 3: recovery stage). Preferably, the regenerated tissue mass of the cotyledon node was cultured on a solid medium with an antibiotic but no selective agent to kill Agrobacterium and allow the infected cells to recover. Then, the regenerated tissue mass of the cotyledon node was cultured on a medium containing a selective agent (hygromycin), and the growing transformed callus was selected (step 4: selection step). Preferably, the regenerated tissue mass of the cotyledon node was cultured on a solid screening medium with a selective agent (B5 salt 3.1 g/l, vitamin B5, 2-morpholineethanesulfonic acid (MES) 1 g/l, sucrose 30 g/l, 6-benzylaminopurine (6-BAP) 1 mg/l, agar 8 g/l, cephalosporin 150 mg/l, glutamic acid 100 mg/l, aspartic acid 100 mg/l, hygromycin 50 mg/l, pH 5.6), which resulted in selective growth of the transformed cell. Then, the transformed cell was transformed into a plant (step 5: regeneration step); preferably, the regenerated cotyledon node tissue mass grown on the medium containing the selective agent is cultured on solid media (B5 differentiation medium and B5 rooting medium) to regenerate the plant.
Отобранную устойчивую тканевую массу переносили на среду для дифференцировки В5 (B5 соль 3,1 г/л, витамины B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, зеатин (ZT) 1 мг/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, глутаминовая кислота 50 мг/л, аспарагиновая кислота 50 мг/л, гиббереллин 1 мг/л, ауксин 1 мг/л, гигромицин 50 мг/л, pH 5,6) и культивировали при 25°C для дифференцировки. Дифференцированные сеянцы переносили на среду для укоренения B5 (B5 соль 3,1 г/л, витамины B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, индол-3-масляная кислота (IBA) 1 мг/л), культивировали в среде для укоренения при 25°C до высоты примерно 10 см, переносили в теплицу и культивировали до плодоношения. В теплице выращивание проводили при 26°C в течение 16 часов, а затем при 20°C в течение 8 часов в сутки.The selected stable tissue mass was transferred to the B5 differentiation medium (B5 salt 3.1 g/l, vitamins B5, 2-morpholineethanesulfonic acid (MES) 1 g/l, sucrose 30 g/l, zeatin (ZT) 1 mg/l, agar 8 g/l, cephalosporin 150 mg/l,
Пример 9: Подтверждение трансгенных растений кукурузы и сои посредством TaqManExample 9 Confirmation of transgenic corn and soybean plants by TaqMan
Приблизительно 100 мг листьев растений кукурузы с перенесенными нуклеотидными последовательностями RX (X составляло 1-18) брали раздельно в качестве образцов, и выделяли их геномную ДНК при помощи набора DNeasy Plant Maxi от Qiagen, соответственно, и количество копий нуклеотидных последовательностей RX определяли путем определения количества копий гена Hpt с помощью способа количественной ПЦР с флуоресцентным зондом Taqman. При этом растения кукурузы дикого типа использовали в качестве контроля и проводили детекцию и анализ в соответствии с вышеуказанными способами. Эксперимент повторяли 3 раза и брали среднее значение. Конкретный способ определения количества копий гена Hpt был следующим:Approximately 100 mg of leaves of corn plants with transferred RX nucleotide sequences (X was 1-18) were taken separately as samples, and their genomic DNA was isolated using the DNeasy Plant Maxi kit from Qiagen, respectively, and the copy number of RX nucleotide sequences was determined by quantitation copies of the Hpt gene using the Taqman fluorescent probe quantitative PCR method. Meanwhile, wild-type corn plants were used as a control, and detection and analysis were carried out in accordance with the above methods. The experiment was repeated 3 times and the average value was taken. The specific method for determining the number of copies of the Hpt gene was as follows:
Этап 901: 100 мг каждого листа растения кукурузы с перенесенной нуклеотидной последовательностью RX и дикого типа брали раздельно и измельчали до гомогената с жидким азотом в ступке, соответственно, и для каждого образца брали 3 повтора;Step 901: 100 mg of each leaf of corn plant with the transferred nucleotide sequence of RX and wild type were taken separately and ground to homogenate with liquid nitrogen in a mortar, respectively, and 3 repetitions were taken for each sample;
Этап 902: выделяли геномную ДНК вышеуказанного образца с использованием мини-набора DNeasy Plant от Qiagen, согласно руководству к продукту для конкретного способа;Step 902: Genomic DNA of the above sample was isolated using the DNeasy Plant mini kit from Qiagen, according to the method specific product manual;
Этап 903: Использовали NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) для измерения концентрации геномной ДНК вышеуказанного образца;Step 903: Used NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) to measure the concentration of genomic DNA of the above sample;
Этап 904: концентрация геномной ДНК вышеуказанного образца была скорректирована до одинакового значения концентрации, и диапазон значений составлял от 80 до 100 нг/мкл;Step 904: The concentration of the genomic DNA of the above sample was adjusted to the same concentration value, and the range of values was from 80 to 100 ng/µl;
Этап 905: Способ количественной ПЦР с флуоресцентным зондом Taqman применяли для определения количества копий образца, идентифицированный образец с известным количеством копий использовали в качестве стандартного продукта, и образец кукурузы дикого типа использовали в качестве контроля, для каждого образца было взято 3 повтора, и брали среднее значение.Step 905: The Taqman fluorescent probe quantitative PCR method was used to determine the number of copies of a sample, the identified sample with a known copy number was used as a standard product, and a wild-type corn sample was used as a control, 3 replicates were taken for each sample, and the average was taken. meaning.
Последовательности праймеров и зондов для флуоресцентной количественной ПЦР:Primer and probe sequences for fluorescent quantitative PCR:
следующие праймеры и зонды использовали для детекции нуклеотидной последовательности Hpt:The following primers and probes were used to detect the Hpt nucleotide sequence:
Праймер 1: cagggtgtcacgttgcaaga как показано в SEQ ID NO: 26 в списке последовательностей;Primer 1: cagggtgtcacgttgcaaga as shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing;
Праймер 2: ccgctcgtctggctaagatc как показано в SEQ ID NO: 27 в списке последовательностей;Primer 2: ccgctcgtctggctaagatc as shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing;
Зонд 1: tgcctgaaaccgaactgcccgctg как показано в SEQ ID NO: 28 в списке последовательностей;Probe 1: tgcctgaaaccgaactgcccgctg as shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing;
Система для реакции ПЦР:System for PCR reaction:
JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma) - 10 мклJumpStart ™ Taq ReadyMix ™ (Sigma) - 10 µl
50× смесь праймер/зонд - 1 мкл50× primer/probe mix - 1 µl
Геномная ДНК - 3 мклGenomic DNA - 3 µl
Вода (ddH2O) - 6 мклWater (ddH 2 O) - 6 µl
50× смесь праймер/зонд содержала 45 мкл каждого праймера в концентрации 1 мМ, 50 мкл зонда в концентрации 100 мкМ, и 860 мкл буфера TE 1×, ее хранили в центрифужной пробирке при 4°C.The 50× primer/probe mixture contained 45 µl of each primer at 1 mM, 50 µl of probe at 100 µM, and 860 µl of 1× TE buffer, and was stored in a centrifuge tube at 4°C.
Условия реакции ПЦР:PCR reaction conditions:
Данные анализировали с использованием программного обеспечения SDS2.3 (Applied Biosystems).Data were analyzed using SDS2.3 software (Applied Biosystems).
Путем анализа экспериментальных результатов количества копий гена Hpt было подтверждено, что нуклеотидные последовательности RX были интегрированы в хромосому тестируемых растений кукурузы, соответственно, и однокопийные трансгенные растения кукурузы были получены из растений кукурузы с перенесенными нуклеотидными последовательностями RX (X составляло 1-18).By analyzing the experimental results of the number of copies of the Hpt gene, it was confirmed that the RX nucleotide sequences were integrated into the chromosome of the tested corn plants, respectively, and single-copy transgenic corn plants were obtained from corn plants with transferred RX nucleotide sequences (X was 1-18).
В соответствии с вышеописанным способом использования TaqMan для проверки трансгенных растений кукурузы, были детектированы и проанализированы трансгенные растения сои. Путем анализа экспериментальных результатов по количеству копий гена Hpt было подтверждено, что нуклеотидные последовательности RX были интегрированы в хромосому тестируемых растений сои, а однокопийные трансгенные растения сои были получены из растений сои с перенесенными нуклеотидными последовательностями RX (X составляло 1-18).In accordance with the above method of using TaqMan to test transgenic corn plants, transgenic soybean plants were detected and analyzed. By analyzing the experimental results on the number of copies of the Hpt gene, it was confirmed that the RX nucleotide sequences were integrated into the chromosome of the tested soybean plants, and single-copy transgenic soybean plants were obtained from soybean plants with transferred RX nucleotide sequences (X was 1-18).
Пример 10: Идентификация инсектицидного действия трансгенной кукурузы на Monolepta hieroglyphica.Example 10: Identification of the insecticidal effect of transgenic corn on Monolepta hieroglyphica.
Растения кукурузы, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X составлял 1-18), тестировали на устойчивость к насекомым на Monolepta hieroglyphica.Maize plants transformed with the RX nucleotide sequences (X was 1-18) were tested for insect resistance on Monolepta hieroglyphica.
Этап 1001: Выбирали 10 растений каждого из однокопийных трансформантов кукурузы от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 (RX-M), идентифицированных как положительные с помощью taqman, и 3 растения из трансформантов кукурузы (NGM1), идентифицированных как отрицательные с помощью taqman, соответственно; кукурузу дикого типа использовали одновременно в качестве контроля (СК1); и высаживали их в теплицу до стадии трилистника;Step 1001: 10 plants of each of the single copy corn transformants DBNR35112C1 to DBNR35112C18 (RX-M) identified as positive by taqman and 3 plants from the corn transformants (NGM1) identified as negative by taqman, respectively, were selected; wild-type corn was used simultaneously as a control (CK1); and planted them in a greenhouse to the stage of a shamrock;
Этап 1002: брали материалы, описанные в этапе 1001, с каждого саженца был взят третий нежный лист, разрезан на 1×2 см, чтобы удалить листовую пластинку главной жилки, и листовую пластинку выкладывали в чашке Петри, покрытой влажной фильтровальной бумагой;Step 1002: The materials described in Step 1001 were taken, a third tender leaf was taken from each seedling, cut into 1×2 cm to remove the lamina of the main vein, and the lamina was laid out in a Petri dish covered with moist filter paper;
Этап 1003: 10 недавно вылупившихся личинок Monolepta hieroglyphica с временем инкубации не более чем 24 часа помещали в каждую чашку Петри, и закрывали крышку чашки Петри, чашку Петри помещали в бокс для биопроб с увлажняющей марлей на дне, и бокс для биопроб помещали в камеру для биоанализа с температурой 24±2°C, с режимом день/ночь 24/0, и влажностью 70-80% (т.е. «биоанализ»);Step 1003: 10 newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae with an incubation time of not more than 24 hours were placed in each Petri dish, and the lid of the Petri dish was closed, the Petri dish was placed in a bioassay box with moistening gauze at the bottom, and the bioassay box was placed in the chamber for bioassay with temperature 24±2°C, day/night 24/0, and humidity 70-80% (i.e. "bioassay");
Этап 1004: учитывая, что недавно вылупившиеся личинки Monolepta hieroglyphica были слабыми и склонными к механическим повреждениям, чашку Петри поддерживали как можно более неподвижной в течение суток инокуляции и первые сутки после инокуляции;Step 1004: Given that the newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae were weak and prone to mechanical damage, the Petri dish was kept as still as possible during the day of inoculation and the first day after inoculation;
Этап 1005: с суток 2 инокуляции подсчитывали количество выживших Monolepta hieroglyphica снаружи чашки Петри каждые сутки до конца суток 16; выживших в чашке Петри Monolepta hieroglyphica переносили в чашку Петри со свежими листьями каждые 2 суток, и результаты экспериментов показаны в таблице 4.Step 1005: From day 2 of inoculation, the number of surviving Monolepta hieroglyphica outside the petri dish was counted every day until the end of day 16; Monolepta hieroglyphica survivors in the Petri dish were transferred to the Petri dish with fresh leaves every 2 days, and the results of the experiments are shown in Table 4.
Таблица 4. Экспериментальные результаты кормления Monolepta hieroglyphica листьями трансформантов кукурузыTable 4. Experimental results of feeding Monolepta hieroglyphica with leaves of maize transformants
Результаты экспериментов в таблице 4 показали, что растения кукурузы, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X было от 1 до 18), имели хорошее ингибирующее действие на Monolepta hieroglyphica, и коэффициент выживаемости Monolepta hieroglyphica на Сутки 16 (коэффициент выживаемости=количество выживших насекомых/количество испытанных насекомых) составил примерно 30%.The results of the experiments in Table 4 showed that maize plants transformed with the RX nucleotide sequences (X was 1 to 18) had a good inhibitory effect on Monolepta hieroglyphica, and the survival rate of Monolepta hieroglyphica at Day 16 (survival rate=number of surviving insects/ the number of tested insects) was approximately 30%.
Пример 11: Определение инсектицидных эффектов трансгенной сои на Monolepta hieroglyphica.Example 11: Determination of insecticidal effects of transgenic soybean on Monolepta hieroglyphica.
Растения сои, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X составлял 1-18), тестировали на устойчивость к насекомым на Monolepta hieroglyphica.Soybean plants transformed with RX nucleotide sequences (X was 1-18) were tested for insect resistance on Monolepta hieroglyphica.
Этап 1101: Выбирали 10 растений каждого из однокопийных трансформантов сои от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 (RX-S), идентифицированных как положительные с помощью taqman, и 3 растения из трансформантов сои (NGM2), идентифицированных как отрицательные с помощью taqman, соответственно; сою дикого типа использовали одновременно в качестве контроля (СК2); и высаживали их в теплицу до выращивания трех настоящих листов;Step 1101: 10 plants each of single copy soybean transformants DBNR35112C1 to DBNR35112C18 (RX-S) identified as positive by taqman and 3 plants from soybean transformants (NGM2) identified as negative by taqman, respectively; wild-type soybean was used simultaneously as a control (CK2); and planted them in a greenhouse until three true leaves were grown;
Этап 1102: брали материалы, описанные в этапе 1101, от каждого проростка был взят кусок настоящего листа размером примерно 2×2 см и выкладывали в чашке Петри, покрытой влажной фильтровальной бумагой;Step 1102: the materials described in step 1101 were taken, a piece of true leaf measuring approximately 2×2 cm was taken from each seedling and laid out in a Petri dish covered with moist filter paper;
Этап 1103: 15 недавно вылупившихся личинок Monolepta hieroglyphica с временем инкубации не более, чем 24 часа помещали в каждую чашку, и закрывали крышку чашки Петри, чашку Петри помещали в бокс для биопроб с увлажняющей марлей на дне, и бокс для биопроб помещали в камеру для биоанализа с температурой 24±2°C, с режимом день/ночь 24/0, и влажностью 70-80%;Step 1103: 15 newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae with an incubation time of not more than 24 hours were placed in each dish, and the lid of the Petri dish was closed, the Petri dish was placed in the bioassay box with moistening gauze at the bottom, and the bioassay box was placed in the chamber for bioassay with temperature 24±2°C, day/night mode 24/0, and humidity 70-80%;
Этап 1104: учитывая, что недавно вылупившиеся личинки Monolepta hieroglyphica были слабыми и склонными к механическим повреждениям, чашку Петри поддерживали как можно более неподвижной в течение суток инокуляции и первые сутки после инокуляции;Step 1104: given that the newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae were weak and prone to mechanical damage, the petri dish was kept as still as possible during the day of inoculation and the first day after inoculation;
Этап 1105: с суток 2 инокуляции подсчитывали количество выживших Monolepta hieroglyphica снаружи чашки Петри каждые сутки до конца суток 16; выживших в чашке Петри Monolepta hieroglyphica переносили в чашку Петри со свежими листьями каждые 2 суток, и результаты экспериментов показаны в таблице 5.Step 1105: From day 2 of inoculation, the number of surviving Monolepta hieroglyphica outside the petri dish was counted every day until the end of day 16; Monolepta hieroglyphica survivors in the Petri dish were transferred to the Petri dish with fresh leaves every 2 days, and the results of the experiments are shown in Table 5.
Таблица 5. Экспериментальные результаты кормления Monolepta hieroglyphica листьями трансформантов соиTable 5. Experimental results of feeding Monolepta hieroglyphica with leaves of soybean transformants
каждые два дня после биоанализаMonolepta hieroglyphica survival rate
every two days after bioassay
Результаты экспериментов в таблице 5 показали, что растения сои, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X было от 1 до 18), имели хорошее ингибирующее действие на Monolepta hieroglyphica, и коэффициент выживаемости Monolepta hieroglyphica на Сутки 16 (коэффициент выживаемости=количество выживших насекомых/количество тестируемых насекомых) составил не более 35%.The results of the experiments in Table 5 showed that soybean plants transformed with RX nucleotide sequences (X was 1 to 18) had a good inhibitory effect on Monolepta hieroglyphica, and Monolepta hieroglyphica survival rate at Day 16 (survival rate=number of surviving insects/ the number of tested insects) was no more than 35%.
Пример 12: КомпозицияExample 12: Composition
Формула приемлемого носителя для пестицида с дцРНК (система 1 л): 50 мМ NaHPO4 (pH7,0), 10 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мМ ЭДТА, 0,1% (массовая доля) натрий цэтил сульфонат, 0,1% (массовая доля) простой эфир полиэтиленгликоль октилфенила, с добавлением H2O до 1 л.Acceptable carrier formula for dsRNA pesticide (1 L system): 50 mM NaHPO4 (pH7.0), 10 mM β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA, 0.1% (w/w) sodium cethyl sulfonate, 0.1% (w/w) share) polyethylene glycol ether of octylphenyl, with the addition of H 2 O to 1 l.
Вышеупомянутая формула была формулой буфера, и требовалось только напрямую добавить любую очищенную дцРНК в буфер, при условии, что конечная концентрация удовлетворяет требованиям, таким как 50 мг/л. Его также можно было бы подготовить в виде концентрированного состава по мере необходимости.The above formula was a buffer formula, and it was only required to directly add any purified dsRNA to the buffer, provided that the final concentration satisfies the requirement, such as 50 mg/L. It could also be prepared as a concentrated formulation as required.
Таким образом, настоящее изобретение относится впервые к гену-мишени c35112 и его целевой последовательности для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями Monolepta hieroglyphica, и трансгенным растениям (кукуруза и соя), полученным по технологии РНКи; в трансгенные растения вводят с последовательность дцРНК, образованную целевой последовательностью, и они могут контролировать вторжение Monolepta hieroglyphica, они эффективны и специфичны и могут избегать риска, такого как то, что Monolepta hieroglyphica генерирует устойчивость к белкам токсина Bt. При этом они обладают хорошей экологичностью, удобством и низкой стоимостью.Thus, the present invention relates for the first time to the target gene c35112 and its target sequence for the control of beetle insect pests Monolepta hieroglyphica, and transgenic plants (corn and soybeans) obtained by RNAi technology; transgenic plants are introduced with a dsRNA sequence formed by the target sequence, and they can control the invasion of Monolepta hieroglyphica, they are efficient and specific, and can avoid the risk such that Monolepta hieroglyphica generates resistance to Bt toxin proteins. At the same time, they have good environmental friendliness, convenience and low cost.
Наконец, следует отметить, что приведенные выше примеры используются только для иллюстрации технических решений по настоящему изобретению, а не для их ограничения. Хотя настоящее изобретение было описано в деталях со ссылкой на предпочтительные примеры, специалисты в данной области должны понимать, что технические решения по настоящему изобретению могут быть подвергнуты модификации или эквивалентным заменам без отступления от сущности и объема технических решений по настоящему изобретению.Finally, it should be noted that the above examples are used only to illustrate the technical solutions of the present invention and not to limit them. Although the present invention has been described in detail with reference to preferred examples, those skilled in the art should understand that the technical solutions of the present invention may be subject to modification or equivalent substitutions without departing from the spirit and scope of the technical solutions of the present invention.
--->--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST
<110>BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.<110>BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
<120>Полинуклеотид и способ борьбы с вторжением насекомых<120>Polynucleotide and insect control method
<130>IEC190006PCT<130>IEC190006PCT
<150>CN 201810550207.4<150>CN 201810550207.4
<151>2018-05-31<151>2018-05-31
<160>31<160>31
<170>SIPOSequenceListing 1.0<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1<210>1
<211>2994<211>2994
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>1<400>1
caagagccac gtataaaaca aggttacaga ttttggacaa ctcaaaaaat agtgatgtgt 60caagagccac gtataaaaca aggttacaga ttttggacaa ctcaaaaaat agtgatgtgt 60
ttataattcg tgtcatttca agaagattaa acaaaaattg ctggataata acccttaaaa 120ttataattcg tgtcatttca agaagattaa acaaaaattg ctggataata acccttaaaa 120
atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 180atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 180
gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 240gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 240
gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga catacctgtt 300gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga catacctgtt 300
agagctgcaa agtttgtacc tagaaagaac tggattgtca gtggttcaga tgatatgcag 360agagctgcaa agtttgtacc tagaaagaac tggattgtca gtggttcaga tgatatgcag 360
ataagagttt ttaactacaa tacactagac agggtacact ctttcgaagc ccattcagat 420ataagagttt ttaactacaa tacactagac agggtacact ctttcgaagc ccattcagat 420
tatgtgaggt ctattgtggt acatccaaca caaccatata ttttaacaag tagtgatgat 480tatgtgaggt ctattgtggt acatccaaca caaccatata ttttaacaag tagtgatgat 480
atgcttatca aactgtggaa ctgggaaaag gcatgggctt gtcagcaagt gtttgaagga 540atgcttatca aactgtggaa ctgggaaaag gcatgggctt gtcagcaagt gtttgaagga 540
catactcatt atattatgca aattgcaata aatcccaaag acaacaatac atttgccagt 600catactcatt atattatgca aattgcaata aatcccaaag acaacaatac atttgccagt 600
gcatctctag atagaacatt aaaagtgtgg cagctaggtg catcaacagc taacttcact 660gcatctctag atagaacatt aaaagtgtgg cagctaggtg catcaacagc taacttcact 660
cttgaagggc atgagaaagg tgtcaattgt gtagactact accacggagg tgataaaccc 720cttgaagggc atgagaaagg tgtcaattgt gtagactact accacgggagg tgataaaccc 720
tatataatat caggagccga tgataggttg gtcaaaatct gggattacca aaataaaaca 780tatataatat caggagccga tgataggttg gtcaaaatct gggattacca aaataaaaca 780
tgtgttcaaa ccttagaagg acatggtcaa aatgttactg ctgtcttttt ccatccagaa 840tgtgttcaaa ccttagaagg acatggtcaa aatgttactg ctgtcttttt ccatccagaa 840
cttccagttg ctcttacggg aagtgaagat ggtacagtga gaatatggca tgcaaatacc 900cttccagttg ctcttacggg aagtgaagat ggtacagtga gaatatggca tgcaaatacc 900
catcgactgg aaagtacctt aaattatgga tttgaaaggg tttggaccat ttgttgctta 960catcgactgg aaagtacctt aaattatgga tttgaaaggg tttggaccat ttgttgctta 960
aaaggaagta ataatgtggc attgggttat gacgagggta gtattcttgt taaagttggt 10201020
agagaagaac cagctgttag tatggatgcc agtggtggta aaattatttg ggctaggcac 1080agagaagaac cagctgttag tatggatgcc agtggtggta aaattatttg ggctaggcac 1080
tcagaactcc aacaagccaa tcttaaggca ttgcctgaag gtgctgaaat aaaagatgga 1140tcagaactcc aacaagccaa tcttaaggca ttgcctgaag gtgctgaaat aaaagatgga 1140
gaacgacttc cagtatctgt aaaggatatg ggtgcctgtg aaatctatcc tcaaaccatt 1200gaacgacttc cagtatctgt aaaggatatg ggtgcctgtg aaatctatcc tcaaaccatt 1200
caacacaatc ccaatggtcg ttttgtagtt gtgtgtggag atggtgaata tataatttac 1260caacacaatc ccaatggtcg ttttgtagtt gtgtgtggag atggtgaata tataatttac 1260
actgccatgg ccttacgtaa caaagcattt ggaagtgcac aagaattcgt ttgggcccaa 1320actgccatgg ccttacgtaa caaagcattt ggaagtgcac aagaattcgt ttgggcccaa 1320
gattctagtg aatatgctat tagagaatca ggatctacta taaggatatt taaaaatttc 1380gattctagtg aatatgctat tagagaatca ggatctacta taaggatatt taaaaatttc 1380
aaagaaaaga aaaatttcaa gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt 1440aaagaaaaga aaaatttcaa gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt 1440
ttgggagtca aatctgtttc tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt 1500ttgggagtca aatctgtttc tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt 1500
agaaggattg agatacaacc aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt 1560agaaggattg agatacaacc aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt 1560
ttggccaccg aagatagtta ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct 1620ttggccaccg aagatagtta ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct 1620
aaagataata atcaagttgc tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa 1680aaagataata atcaagttgc tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa 1680
atcaacgaat ctgttagaac aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct 1740atcaacgaat ctgttagaac aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct 1740
gtgaatcgta tcaattactt tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt 1800gtgaatcgta tcaattactt tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt 1800
ccattgtacg tcttgggtta tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag 1860ccattgtacg tcttgggtta tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag 1860
ttacgagttg tcagctacca attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg 1920ttacgagttg tcagctacca attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg 1920
aggagggact tcccaacagc agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga gcacagaaca 1980aggagggact tcccaacagc agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga gcacagaaca 1980
agggtagcac atttcttaga aaagcaaggt tttaaacaac aagctttagc tgtaagttcc 2040agggtagcac atttcttaga aaagcaaggt tttaaacaac aagctttagc tgtaagttcc 2040
gatcccgaac atagattcga actcgctgtg gcattagaag acctgaatac agctaaaatt 2100gatcccgaac atagattcga actcgctgtg gcattagaag acctgaatac agctaaaatt 2100
ctagcacaag aggctaacaa tccacaaaag tggagccaat tagctgatct agctgctggc 2160ctagcacaag aggctaacaa tccacaaaag tggagccaat tagctgatct agctgctggc 2160
acaaataatg tagaactagc aaaagaatgc atgcagaaag cccaagattt tggtggatta 2220acaaataatg tagaactagc aaaagaatgc atgcagaaag cccaagattt tggtggatta 2220
ttacttctag ccactagttc gggagatgaa tcattagtcc gtacattagg tgaaacaaca 2280ttacttctag ccactagttc gggagatgaa tcattagtcc gtacattagg tgaaacaaca 2280
caagctgagg gcaaacataa tttagccttc ctttctcatt tcttggtagg agatttagac 2340caagctgagg gcaaacataa tttagccttc ctttctcatt tcttggtagg agatttagac 2340
aagtgtctag atattttagt aagtacagga aggttgccag aagctgcgtt tttcgccaga 2400aagtgtctag atattttagt aagtacagga aggttgccag aagctgcgtt tttcgccaga 2400
tcttatcttc ccgataaaat ttctgaagtt gtagaattgt ggaggacaca attatcaact 2460tcttatcttc ccgataaaat ttctgaagtt gtagaattgt ggaggacaca attatcaact 2460
ataaatcaaa aagccggaca aagtttagcc gatcctaaaa attatgaaaa tctatttccc 2520ataaatcaaa aagccggaca aagtttagcc gatcctaaaa attatgaaaa tctatttccc 2520
ggtcttcaac aagcattgtc ggcacagaaa tttttggaac agaacaaaca gttgccacct 2580ggtcttcaac aagcattgtc ggcacagaaa tttttggaac agaacaaaca gttgccacct 2580
gcatttatgg ctccttctat tgttcccaac caagatagaa atgttatagc cgaagcggag 2640gcatttatgg ctccttctat tgttcccaac caagatagaa atgttatagc cgaagcggag 2640
gcacagttaa agaatagtgg aacttcatca aatttgttca gtgccccacc ttcagcagaa 2700gcacagttaa agaatagtgg aacttcatca aatttgttca gtgccccacc ttcagcagaa 2700
acttctagga atgttataga atcagtacca caaaataagc cctcagaaga tttatcaaac 2760acttctagga atgttataga atcagtacca caaaataagc cctcagaaga tttatcaaac 2760
agggtgttat tagatcaaga tgatgatgat gacatagact tggatttgga tggcgtcaat 2820agggtgttat tagatcaaga tgatgatgat gacatagact tggatttgga tggcgtcaat 2820
attgacgata acatcgatac aactgatatc aacttggatg atgatttgct gagtgattaa 2880attgacgata acatcgatac aactgatatc aacttggatg atgatttgct gagtgattaa 2880
aaataacttt ttttactatt ttagtattaa tctgtatatt attcattcct aatttttaag 2940aaataacttt ttttactatt ttagtattaa tctgtatatt attcattcct aatttttaag 2940
aaaataaatt atgtaagata atgttttatt aactaaaata tggtaattca aaac 2994aaaataaatt atgtaagata atgttttatt aactaaaata tggtaattca aaac 2994
<210>2<210>2
<211>919<211>919
<212>Белок<212>Protein
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>2<400>2
Met Pro Leu Arg Leu Asp Ile Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Ser AspMet Pro Leu Arg Leu Asp Ile Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Ser Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Val Lys Cys Val Asp Leu His Pro Thr Glu Pro Trp Met Leu CysArg Val Lys Cys Val Asp Leu His Pro Thr Glu Pro Trp Met Leu Cys
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Tyr Ser Gly Asn Ile Asn Val Trp Asn Thr Glu Asn Gln GlnSer Leu Tyr Ser Gly Asn Ile Asn Val Trp Asn Thr Glu Asn Gln Gln
35 40 45 35 40 45
Leu Val Lys Thr Phe Glu Val Cys Asp Ile Pro Val Arg Ala Ala LysLeu Val Lys Thr Phe Glu Val Cys Asp Ile Pro Val Arg Ala Ala Lys
50 55 60 50 55 60
Phe Val Pro Arg Lys Asn Trp Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Met GlnPhe Val Pro Arg Lys Asn Trp Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Met Gln
65 70 75 8065 70 75 80
Ile Arg Val Phe Asn Tyr Asn Thr Leu Asp Arg Val His Ser Phe GluIle Arg Val Phe Asn Tyr Asn Thr Leu Asp Arg Val His Ser Phe Glu
85 90 95 85 90 95
Ala His Ser Asp Tyr Val Arg Ser Ile Val Val His Pro Thr Gln ProAla His Ser Asp Tyr Val Arg Ser Ile Val Val His Pro Thr Gln Pro
100 105 110 100 105 110
Tyr Ile Leu Thr Ser Ser Asp Asp Met Leu Ile Lys Leu Trp Asn TrpTyr Ile Leu Thr Ser Asp Asp Met Leu Ile Lys Leu Trp Asn Trp
115 120 125 115 120 125
Glu Lys Ala Trp Ala Cys Gln Gln Val Phe Glu Gly His Thr His TyrGlu Lys Ala Trp Ala Cys Gln Gln Val Phe Glu Gly His Thr His Tyr
130 135 140 130 135 140
Ile Met Gln Ile Ala Ile Asn Pro Lys Asp Asn Asn Thr Phe Ala SerIle Met Gln Ile Ala Ile Asn Pro Lys Asp Asn Asn Thr Phe Ala Ser
145 150 155 160145 150 155 160
Ala Ser Leu Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Gln Leu Gly Ala Ser ThrAla Ser Leu Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Gln Leu Gly Ala Ser Thr
165 170 175 165 170 175
Ala Asn Phe Thr Leu Glu Gly His Glu Lys Gly Val Asn Cys Val AspAla Asn Phe Thr Leu Glu Gly His Glu Lys Gly Val Asn Cys Val Asp
180 185 190 180 185 190
Tyr Tyr His Gly Gly Asp Lys Pro Tyr Ile Ile Ser Gly Ala Asp AspTyr Tyr His Gly Gly Asp Lys Pro Tyr Ile Ile Ser Gly Ala Asp Asp
195 200 205 195 200 205
Arg Leu Val Lys Ile Trp Asp Tyr Gln Asn Lys Thr Cys Val Gln ThrArg Leu Val Lys Ile Trp Asp Tyr Gln Asn Lys Thr Cys Val Gln Thr
210 215 220 210 215 220
Leu Glu Gly His Gly Gln Asn Val Thr Ala Val Phe Phe His Pro GluLeu Glu Gly His Gly Gln Asn Val Thr Ala Val Phe Phe His Pro Glu
225 230 235 240225 230 235 240
Leu Pro Val Ala Leu Thr Gly Ser Glu Asp Gly Thr Val Arg Ile TrpLeu Pro Val Ala Leu Thr Gly Ser Glu Asp Gly Thr Val Arg Ile Trp
245 250 255 245 250 255
His Ala Asn Thr His Arg Leu Glu Ser Thr Leu Asn Tyr Gly Phe GluHis Ala Asn Thr His Arg Leu Glu Ser Thr Leu Asn Tyr Gly Phe Glu
260 265 270 260 265 270
Arg Val Trp Thr Ile Cys Cys Leu Lys Gly Ser Asn Asn Val Ala LeuArg Val Trp Thr Ile Cys Cys Leu Lys Gly Ser Asn Asn Val Ala Leu
275 280 285 275 280 285
Gly Tyr Asp Glu Gly Ser Ile Leu Val Lys Val Gly Arg Glu Glu ProGly Tyr Asp Glu Gly Ser Ile Leu Val Lys Val Gly Arg Glu Glu Pro
290 295 300 290 295 300
Ala Val Ser Met Asp Ala Ser Gly Gly Lys Ile Ile Trp Ala Arg HisAla Val Ser Met Asp Ala Ser Gly Gly Lys Ile Ile Trp Ala Arg His
305 310 315 320305 310 315 320
Ser Glu Leu Gln Gln Ala Asn Leu Lys Ala Leu Pro Glu Gly Ala GluSer Glu Leu Gln Gln Ala Asn Leu Lys Ala Leu Pro Glu Gly Ala Glu
325 330 335 325 330 335
Ile Lys Asp Gly Glu Arg Leu Pro Val Ser Val Lys Asp Met Gly AlaIle Lys Asp Gly Glu Arg Leu Pro Val Ser Val Lys Asp Met Gly Ala
340 345 350 340 345 350
Cys Glu Ile Tyr Pro Gln Thr Ile Gln His Asn Pro Asn Gly Arg PheCys Glu Ile Tyr Pro Gln Thr Ile Gln His Asn Pro Asn Gly Arg Phe
355 360 365 355 360 365
Val Val Val Cys Gly Asp Gly Glu Tyr Ile Ile Tyr Thr Ala Met AlaVal Val Val Cys Gly Asp Gly Glu Tyr Ile Ile Tyr Thr Ala Met Ala
370 375 380 370 375 380
Leu Arg Asn Lys Ala Phe Gly Ser Ala Gln Glu Phe Val Trp Ala GlnLeu Arg Asn Lys Ala Phe Gly Ser Ala Gln Glu Phe Val Trp Ala Gln
385 390 395 400385 390 395 400
Asp Ser Ser Glu Tyr Ala Ile Arg Glu Ser Gly Ser Thr Ile Arg IleAsp Ser Ser Glu Tyr Ala Ile Arg Glu Ser Gly Ser Thr Ile Arg Ile
405 410 415 405 410 415
Phe Lys Asn Phe Lys Glu Lys Lys Asn Phe Lys Ser Asp Phe Gly AlaPhe Lys Asn Phe Lys Glu Lys Lys Asn Phe Lys Ser Asp Phe Gly Ala
420 425 430 420 425 430
Glu Gly Ile Tyr Gly Gly Tyr Leu Leu Gly Val Lys Ser Val Ser GlyGlu Gly Ile Tyr Gly Gly Tyr Leu Leu Gly Val Lys Ser Val Ser Gly
435 440 445 435 440 445
Leu Thr Phe Tyr Asp Trp Asp Thr Leu Asp Leu Val Arg Arg Ile GluLeu Thr Phe Tyr Asp Trp Asp Thr Leu Asp Leu Val Arg Arg Ile Glu
450 455 460 450 455 460
Ile Gln Pro Lys Ala Val Tyr Trp Ser Asp Ser Gly Lys Leu Val CysIle Gln Pro Lys Ala Val Tyr Trp Ser Asp Ser Gly Lys Leu Val Cys
465 470 475 480465 470 475 480
Leu Ala Thr Glu Asp Ser Tyr Phe Ile Leu Ser Tyr Asp Ala Asp GluLeu Ala Thr Glu Asp Ser Tyr Phe Ile Leu Ser Tyr Asp Ala Asp Glu
485 490 495 485 490 495
Val Gln Lys Ala Lys Asp Asn Asn Gln Val Ala Asp Asp Gly Val GluVal Gln Lys Ala Lys Asp Asn Asn Gln Val Ala Asp Asp Gly Val Glu
500 505 510 500 505 510
Ser Ala Phe Asn Leu Leu Gly Glu Ile Asn Glu Ser Val Arg Thr GlySer Ala Phe Asn Leu Leu Gly Glu Ile Asn Glu Ser Val Arg Thr Gly
515 520 525 515 520 525
Leu Trp Val Gly Asp Cys Phe Ile Tyr Thr Asn Ala Val Asn Arg IleLeu Trp Val Gly Asp Cys Phe Ile Tyr Thr Asn Ala Val Asn Arg Ile
530 535 540 530 535 540
Asn Tyr Phe Val Gly Gly Glu Leu Val Thr Ile Ala His Leu Asp ArgAsn Tyr Phe Val Gly Gly Glu Leu Val Thr Ile Ala His Leu Asp Arg
545 550 555 560545 550 555 560
Pro Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Val Pro Lys Asp Asp Arg Leu Tyr LeuPro Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Val Pro Lys Asp Asp Arg Leu Tyr Leu
565 570 575 565 570 575
Val Asp Lys Glu Leu Arg Val Val Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Ser ValVal Asp Lys Glu Leu Arg Val Val Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Ser Val
580 585 590 580 585 590
Leu Glu Tyr Gln Thr Ala Val Met Arg Arg Asp Phe Pro Thr Ala AspLeu Glu Tyr Gln Thr Ala Val Met Arg Arg Asp Phe Pro Thr Ala Asp
595 600 605 595 600 605
Arg Val Leu Pro Ser Ile Pro Lys Glu His Arg Thr Arg Val Ala HisArg Val Leu Pro Ser Ile Pro Lys Glu His Arg Thr Arg Val Ala His
610 615 620 610 615 620
Phe Leu Glu Lys Gln Gly Phe Lys Gln Gln Ala Leu Ala Val Ser SerPhe Leu Glu Lys Gln Gly Phe Lys Gln Gln Ala Leu Ala Val Ser Ser
625 630 635 640625 630 635 640
Asp Pro Glu His Arg Phe Glu Leu Ala Val Ala Leu Glu Asp Leu AsnAsp Pro Glu His Arg Phe Glu Leu Ala Val Ala Leu Glu Asp Leu Asn
645 650 655 645 650 655
Thr Ala Lys Ile Leu Ala Gln Glu Ala Asn Asn Pro Gln Lys Trp SerThr Ala Lys Ile Leu Ala Gln Glu Ala Asn Asn Pro Gln Lys Trp Ser
660 665 670 660 665 670
Gln Leu Ala Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asn Val Glu Leu Ala LysGln Leu Ala Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asn Val Glu Leu Ala Lys
675 680 685 675 680 685
Glu Cys Met Gln Lys Ala Gln Asp Phe Gly Gly Leu Leu Leu Leu AlaGlu Cys Met Gln Lys Ala Gln Asp Phe Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Ser Gly Asp Glu Ser Leu Val Arg Thr Leu Gly Glu Thr ThrThr Ser Ser Gly Asp Glu Ser Leu Val Arg Thr Leu Gly Glu Thr Thr
705 710 715 720705 710 715 720
Gln Ala Glu Gly Lys His Asn Leu Ala Phe Leu Ser His Phe Leu ValGln Ala Glu Gly Lys His Asn Leu Ala Phe Leu Ser His Phe Leu Val
725 730 735 725 730 735
Gly Asp Leu Asp Lys Cys Leu Asp Ile Leu Val Ser Thr Gly Arg LeuGly Asp Leu Asp Lys Cys Leu Asp Ile Leu Val Ser Thr Gly Arg Leu
740 745 750 740 745 750
Pro Glu Ala Ala Phe Phe Ala Arg Ser Tyr Leu Pro Asp Lys Ile SerPro Glu Ala Ala Phe Phe Ala Arg Ser Tyr Leu Pro Asp Lys Ile Ser
755 760 765 755 760 765
Glu Val Val Glu Leu Trp Arg Thr Gln Leu Ser Thr Ile Asn Gln LysGlu Val Val Glu Leu Trp Arg Thr Gln Leu Ser Thr Ile Asn Gln Lys
770 775 780 770 775 780
Ala Gly Gln Ser Leu Ala Asp Pro Lys Asn Tyr Glu Asn Leu Phe ProAla Gly Gln Ser Leu Ala Asp Pro Lys Asn Tyr Glu Asn Leu Phe Pro
785 790 795 800785 790 795 800
Gly Leu Gln Gln Ala Leu Ser Ala Gln Lys Phe Leu Glu Gln Asn LysGly Leu Gln Gln Ala Leu Ser Ala Gln Lys Phe Leu Glu Gln Asn Lys
805 810 815 805 810 815
Gln Leu Pro Pro Ala Phe Met Ala Pro Ser Ile Val Pro Asn Gln AspGln Leu Pro Pro Ala Phe Met Ala Pro Ser Ile Val Pro Asn Gln Asp
820 825 830 820 825 830
Arg Asn Val Ile Ala Glu Ala Glu Ala Gln Leu Lys Asn Ser Gly ThrArg Asn Val Ile Ala Glu Ala Glu Ala Gln Leu Lys Asn Ser Gly Thr
835 840 845 835 840 845
Ser Ser Asn Leu Phe Ser Ala Pro Pro Ser Ala Glu Thr Ser Arg AsnSer Ser Asn Leu Phe Ser Ala Pro Pro Ser Ala Glu Thr Ser Arg Asn
850 855 860 850 855 860
Val Ile Glu Ser Val Pro Gln Asn Lys Pro Ser Glu Asp Leu Ser AsnVal Ile Glu Ser Val Pro Gln Asn Lys Pro Ser Glu Asp Leu Ser Asn
865 870 875 880865 870 875 880
Arg Val Leu Leu Asp Gln Asp Asp Asp Asp Asp Ile Asp Leu Asp LeuArg Val Leu Leu Asp Gln Asp Asp Asp Asp Asp Ile Asp Leu Asp Leu
885 890 895 885 890 895
Asp Gly Val Asn Ile Asp Asp Asn Ile Asp Thr Thr Asp Ile Asn LeuAsp Gly Val Asn Ile Asp Asp Asn Ile Asp Thr Thr Asp Ile Asn Leu
900 905 910 900 905 910
Asp Asp Asp Leu Leu Ser AspAsp Asp Asp Leu Leu Ser Asp
915 915
<210>3<210>3
<211>361<211>361
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>3<400>3
aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60
cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120
aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180
gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240
cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300
ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgttaaagtt ggtagagaag aaccagctgt 360ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgttaaagtt ggtagagaag aaccagctgt 360
t 361t 361
<210>4<210>4
<211>423<211>423
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>4<400>4
gaaaatcaac aactggttaa aacttttgaa gtatgtgaca tacctgttag agctgcaaag 60gaaaatcaac aactggttaa aacttttgaa gtatgtgaca tacctgttag agctgcaaag 60
tttgtaccta gaaagaactg gattgtcagt ggttcagatg atatgcagat aagagttttt 120tttgtaccta gaaagaactg gattgtcagt ggttcagatg atatgcagat aagagttttt 120
aactacaata cactagacag ggtacactct ttcgaagccc attcagatta tgtgaggtct 180aactacaata cactagacag ggtacactct ttcgaagccc attcagatta tgtgaggtct 180
attgtggtac atccaacaca accatatatt ttaacaagta gtgatgatat gcttatcaaa 240attgtggtac atccaacaca accatatatt ttaacaagta gtgatgatat gcttatcaaa 240
ctgtggaact gggaaaaggc atgggcttgt cagcaagtgt ttgaaggaca tactcattat 300ctgtggaact gggaaaaggc atgggcttgt cagcaagtgt ttgaaggaca tactcattat 300
attatgcaaa ttgcaataaa tcccaaagac aacaatacat ttgccagtgc atctctagat 360attatgcaaa ttgcaataaa tcccaaagac aacaatacat ttgccagtgc atctctagat 360
agaacattaa aagtgtggca gctaggtgca tcaacagcta acttcactct tgaagggcat 420agaacattaa aagtgtggca gctaggtgca tcaacagcta acttcactct tgaagggcat 420
gag 423gag 423
<210>5<210>5
<211>571<211>571
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>5<400>5
gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt ttgggagtca aatctgtttc 60gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt ttgggagtca aatctgtttc 60
tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt agaaggattg agatacaacc 120tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt agaaggattg agatacaacc 120
aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt ttggccaccg aagatagtta 180aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt ttggccaccg aagatagtta 180
ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct aaagataata atcaagttgc 240ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct aaagataata atcaagttgc 240
tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa atcaacgaat ctgttagaac 300tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa atcaacgaat ctgttagaac 300
aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct gtgaatcgta tcaattactt 360aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct gtgaatcgta tcaattactt 360
tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt ccattgtacg tcttgggtta 420tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt ccattgtacg tcttgggtta 420
tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag ttacgagttg tcagctacca 480tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag ttacgagttg tcagctacca 480
attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg aggagggact tcccaacagc 540attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg aggagggact tcccaacagc 540
agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga g 571agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga g 571
<210>6<210>6
<211>780<211>780
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>6<400>6
gcacatttct tagaaaagca aggttttaaa caacaagctt tagctgtaag ttccgatccc 60gcacatttct tagaaaagca aggttttaaa caacaagctt tagctgtaag ttccgatccc 60
gaacatagat tcgaactcgc tgtggcatta gaagacctga atacagctaa aattctagca 120gaacatagat tcgaactcgc tgtggcatta gaagacctga atacagctaa aattctagca 120
caagaggcta acaatccaca aaagtggagc caattagctg atctagctgc tggcacaaat 180caagaggcta acaatccaca aaagtggagc caattagctg atctagctgc tggcacaaat 180
aatgtagaac tagcaaaaga atgcatgcag aaagcccaag attttggtgg attattactt 240aatgtagaac tagcaaaaga atgcatgcag aaagcccaag attttggtgg attattactt 240
ctagccacta gttcgggaga tgaatcatta gtccgtacat taggtgaaac aacacaagct 300ctagccacta gttcgggaga tgaatcatta gtccgtacat taggtgaaac aacacaagct 300
gagggcaaac ataatttagc cttcctttct catttcttgg taggagattt agacaagtgt 360gagggcaaac ataatttagc cttcctttct catttcttgg taggagattt agacaagtgt 360
ctagatattt tagtaagtac aggaaggttg ccagaagctg cgtttttcgc cagatcttat 420ctagatattt tagtaagtac aggaaggttg ccagaagctg cgtttttcgc cagatcttat 420
cttcccgata aaatttctga agttgtagaa ttgtggagga cacaattatc aactataaat 480cttcccgata aaatttctga agttgtagaa ttgtggagga cacaattatc aactataaat 480
caaaaagccg gacaaagttt agccgatcct aaaaattatg aaaatctatt tcccggtctt 540caaaaagccg gacaaagttt agccgatcct aaaaattatg aaaatctatt tcccggtctt 540
caacaagcat tgtcggcaca gaaatttttg gaacagaaca aacagttgcc acctgcattt 600caacaagcat tgtcggcaca gaaatttttg gaacagaaca aacagttgcc acctgcattt 600
atggctcctt ctattgttcc caaccaagat agaaatgtta tagccgaagc ggaggcacag 660atggctcctt ctattgttcc caaccaagat agaaatgtta tagccgaagc ggaggcacag 660
ttaaagaata gtggaacttc atcaaatttg ttcagtgccc caccttcagc agaaacttct 720ttaaagaata gtggaacttc atcaaatttg ttcagtgccc caccttcagc agaaacttct 720
aggaatgtta tagaatcagt accacaaaat aagccctcag aagatttatc aaacagggtg 780aggaatgtta tagaatcagt accacaaaat aagccctcag aagatttatc aaacagggtg 780
<210>7<210>7
<211>174<211>174
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>7<400>7
atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 60atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 60
gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 120gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 120
gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga cata 174gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga cata 174
<210>8<210>8
<211>697<211>697
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>8<400>8
tgtacctaga aagaactgga ttgtcagtgg ttcagatgat atgcagataa gagtttttaa 60tgtacctaga aagaactgga ttgtcagtgg ttcagatgat atgcagataa gagtttttaa 60
ctacaataca ctagacaggg tacactcttt cgaagcccat tcagattatg tgaggtctat 120ctacaataca ctagacaggg tacactcttt cgaagcccat tcagattatg tgaggtctat 120
tgtggtacat ccaacacaac catatatttt aacaagtagt gatgatatgc ttatcaaact 180tgtggtacat ccaacacaac catatatttt aacaagtagt gatgatatgc ttatcaaact 180
gtggaactgg gaaaaggcat gggcttgtca gcaagtgttt gaaggacata ctcattatat 240gtggaactgg gaaaaggcat gggcttgtca gcaagtgttt gaaggacata ctcattatat 240
tatgcaaatt gcaataaatc ccaaagacaa caatacattt gccagtgcat ctctagatag 300tatgcaaatt gcaataaatc ccaaagacaa caatacattt gccagtgcat ctctagatag 300
aacattaaaa gtgtggcagc taggtgcatc aacagctaac ttcactcttg aagggcatga 360aacattaaaa gtgtggcagc taggtgcatc aacagctaac ttcactcttg aagggcatga 360
gaaaggtgtc aattgtgtag actactacca cggaggtgat aaaccctata taatatcagg 420gaaaggtgtc aattgtgtag actactacca cggaggtgat aaaccctata taatatcagg 420
agccgatgat aggttggtca aaatctggga ttaccaaaat aaaacatgtg ttcaaacctt 480agccgatgat aggttggtca aaatctggga ttaccaaaat aaaacatgtg ttcaaacctt 480
agaaggacat ggtcaaaatg ttactgctgt ctttttccat ccagaacttc cagttgctct 540agaaggacat ggtcaaaatg ttactgctgt ctttttccat ccagaacttc cagttgctct 540
tacgggaagt gaagatggta cagtgagaat atggcatgca aatacccatc gactggaaag 600tacgggaagt gaagatggta cagtgagaat atggcatgca aatacccatc gactggaaag 600
taccttaaat tatggatttg aaagggtttg gaccatttgt tgcttaaaag gaagtaataa 660660
tgtggcattg ggttatgacg agggtagtat tcttgtt 697tgtggcattg ggttatgacg agggtagtat tcttgtt 697
<210>9<210>9
<211>342<211>342
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>9<400>9
ctgttagtat ggatgccagt ggtggtaaaa ttatttgggc taggcactca gaactccaac 60ctgttagtat ggatgccagt ggtggtaaaa ttatttgggc taggcactca gaactccaac 60
aagccaatct taaggcattg cctgaaggtg ctgaaataaa agatggagaa cgacttccag 120aagccaatct taaggcattg cctgaaggtg ctgaaataaa agatggagaa cgacttccag 120
tatctgtaaa ggatatgggt gcctgtgaaa tctatcctca aaccattcaa cacaatccca 180tatctgtaaa ggatatggggt gcctgtgaaa tctatcctca aaccattcaa cacaatccca 180
atggtcgttt tgtagttgtg tgtggagatg gtgaatatat aatttacact gccatggcct 240atggtcgttt tgtagttgtg tgtggagatg gtgaatatat aatttacact gccatggcct 240
tacgtaacaa agcatttgga agtgcacaag aattcgtttg ggcccaagat tctagtgaat 300tacgtaacaa agcatttgga agtgcacaag aattcgtttg ggcccaagat tctagtgaat 300
atgctattag agaatcagga tctactataa ggatatttaa aa 342atgctattag agaatcagga tctactataa ggatatttaa aa 342
<210>10<210>10
<211>139<211>139
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>10<400>10
aagtctgatt ttggagctga aggtatatat gggggttacc ttttgggagt caaatctgtt 60aagtctgatt ttggagctga aggtatatat gggggttacc ttttgggagt caaatctgtt 60
tctgggttaa ctttctatga ttgggataca cttgatttgg ttagaaggat tgagatacaa 120120
ccaaaagctg tctattggt 139ccaaaagctg tctattggt 139
<210>11<210>11
<211>821<211>821
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>11<400>11
catatgatgc tgatgaagtg caaaaagcta aagataataa tcaagttgct gacgatggtg 60catatgatgc tgatgaagtg caaaaagcta aagataataa tcaagttgct gacgatggtg 60
tggaatctgc attcaacctt ttaggagaaa tcaacgaatc tgttagaaca ggcctatggg 120tggaatctgc attcaacctt ttaggagaaa tcaacgaatc tgttagaaca ggcctatggg 120
taggtgattg tttcatctac acaaatgctg tgaatcgtat caattacttt gtaggaggtg 180taggtgattg tttcatctac acaaatgctg tgaatcgtat caattacttt gtaggaggtg 180
aactagtaac tatcgcacac ttggatcgtc cattgtacgt cttgggttat gtgcccaaag 240aactagtaac tatcgcacac ttggatcgtc cattgtacgt cttgggttat gtgcccaaag 240
acgatcgttt gtatctagta gataaagagt tacgagttgt cagctaccaa ttgcttcttt 300acgatcgttt gtatctagta gataaagagt tacgagttgt cagctaccaa ttgcttcttt 300
cagtactcga atatcagaca gctgttatga ggagggactt cccaacagca gatagagtac 360cagtactcga atatcagaca gctgttatga ggagggactt cccaacagca gatagagtac 360
taccgtctat acctaaagag cacagaacaa gggtagcaca tttcttagaa aagcaaggtt 420taccgtctat acctaaagag cacagaacaa gggtagcaca tttcttagaa aagcaaggtt 420
ttaaacaaca agctttagct gtaagttccg atcccgaaca tagattcgaa ctcgctgtgg 480ttaaacaaca agctttagct gtaagttccg atcccgaaca tagattcgaa ctcgctgtgg 480
cattagaaga cctgaataca gctaaaattc tagcacaaga ggctaacaat ccacaaaagt 540cattagaaga cctgaataca gctaaaattc tagcacaaga ggctaacaat ccacaaaagt 540
ggagccaatt agctgatcta gctgctggca caaataatgt agaactagca aaagaatgca 600ggagccaatt agctgatcta gctgctggca caaataatgt agaactagca aaagaatgca 600
tgcagaaagc ccaagatttt ggtggattat tacttctagc cactagttcg ggagatgaat 660tgcagaaagc ccaagatttt ggtggattat tacttctagc cactagttcg ggagatgaat 660
cattagtccg tacattaggt gaaacaacac aagctgaggg caaacataat ttagccttcc 720cattagtccg tacattaggt gaaacaacac aagctgaggg caaacataat ttagccttcc 720
tttctcattt cttggtagga gatttagaca agtgtctaga tattttagta agtacaggaa 780tttctcattt cttggtagga gatttagaca agtgtctaga tattttagta agtacaggaa 780
ggttgccaga agctgcgttt ttcgccagat cttatcttcc c 821ggttgccaga agctgcgttt ttcgccagat cttatcttcc c 821
<210>12<210>12
<211>316<211>316
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>12<400>12
gaattgtgga ggacacaatt atcaactata aatcaaaaag ccggacaaag tttagccgat 60gaattgtgga ggacacaatt atcaactata aatcaaaaag ccggacaaag tttagccgat 60
cctaaaaatt atgaaaatct atttcccggt cttcaacaag cattgtcggc acagaaattt 120cctaaaaatt atgaaaatct atttcccggt cttcaacaag cattgtcggc acagaaattt 120
ttggaacaga acaaacagtt gccacctgca tttatggctc cttctattgt tcccaaccaa 180ttggaacaga acaaacagtt gccacctgca tttatggctc cttctattgt tcccaaccaa 180
gatagaaatg ttatagccga agcggaggca cagttaaaga atagtggaac ttcatcaaat 240gatagaaatg ttatagccga agcggaggca cagttaaaga atagtggaac ttcatcaaat 240
ttgttcagtg ccccaccttc agcagaaact tctaggaatg ttatagaatc agtaccacaa 300ttgttcagtg ccccaccttc agcagaaact tctaggaatg ttatagaatc agtaccacaa 300
aataagccct cagaag 316aataagccct cagaag 316
<210>13<210>13
<211>174<211>174
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>13<400>13
atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 60atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 60
gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 120gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 120
gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga cata 174gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga cata 174
<210>14<210>14
<211>361<211>361
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>14<400>14
tgtacctaga aagaactgga ttgtcagtgg ttcagatgat atgcagataa gagtttttaa 60tgtacctaga aagaactgga ttgtcagtgg ttcagatgat atgcagataa gagtttttaa 60
ctacaataca ctagacaggg tacactcttt cgaagcccat tcagattatg tgaggtctat 120ctacaataca ctagacaggg tacactcttt cgaagcccat tcagattatg tgaggtctat 120
tgtggtacat ccaacacaac catatatttt aacaagtagt gatgatatgc ttatcaaact 180tgtggtacat ccaacacaac catatatttt aacaagtagt gatgatatgc ttatcaaact 180
gtggaactgg gaaaaggcat gggcttgtca gcaagtgttt gaaggacata ctcattatat 240gtggaactgg gaaaaggcat gggcttgtca gcaagtgttt gaaggacata ctcattatat 240
tatgcaaatt gcaataaatc ccaaagacaa caatacattt gccagtgcat ctctagatag 300tatgcaaatt gcaataaatc ccaaagacaa caatacattt gccagtgcat ctctagatag 300
aacattaaaa gtgtggcagc taggtgcatc aacagctaac ttcactcttg aagggcatga 360aacattaaaa gtgtggcagc taggtgcatc aacagctaac ttcactcttg aagggcatga 360
g 361g 361
<210>15<210>15
<211>334<211>334
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>15<400>15
aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60
cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120
aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180
gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240
cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300
ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgtt 334ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgtt 334
<210>16<210>16
<211>342<211>342
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>16<400>16
ctgttagtat ggatgccagt ggtggtaaaa ttatttgggc taggcactca gaactccaac 60ctgttagtat ggatgccagt ggtggtaaaa ttatttgggc taggcactca gaactccaac 60
aagccaatct taaggcattg cctgaaggtg ctgaaataaa agatggagaa cgacttccag 120aagccaatct taaggcattg cctgaaggtg ctgaaataaa agatggagaa cgacttccag 120
tatctgtaaa ggatatgggt gcctgtgaaa tctatcctca aaccattcaa cacaatccca 180tatctgtaaa ggatatggggt gcctgtgaaa tctatcctca aaccattcaa cacaatccca 180
atggtcgttt tgtagttgtg tgtggagatg gtgaatatat aatttacact gccatggcct 240atggtcgttt tgtagttgtg tgtggagatg gtgaatatat aatttacact gccatggcct 240
tacgtaacaa agcatttgga agtgcacaag aattcgtttg ggcccaagat tctagtgaat 300tacgtaacaa agcatttgga agtgcacaag aattcgtttg ggcccaagat tctagtgaat 300
atgctattag agaatcagga tctactataa ggatatttaa aa 342atgctattag agaatcagga tctactataa ggatatttaa aa 342
<210>17<210>17
<211>139<211>139
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>17<400>17
aagtctgatt ttggagctga aggtatatat gggggttacc ttttgggagt caaatctgtt 60aagtctgatt ttggagctga aggtatatat gggggttacc ttttgggagt caaatctgtt 60
tctgggttaa ctttctatga ttgggataca cttgatttgg ttagaaggat tgagatacaa 120120
ccaaaagctg tctattggt 139ccaaaagctg tctattggt 139
<210>18<210>18
<211>380<211>380
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>18<400>18
catatgatgc tgatgaagtg caaaaagcta aagataataa tcaagttgct gacgatggtg 60catatgatgc tgatgaagtg caaaaagcta aagataataa tcaagttgct gacgatggtg 60
tggaatctgc attcaacctt ttaggagaaa tcaacgaatc tgttagaaca ggcctatggg 120tggaatctgc attcaacctt ttaggagaaa tcaacgaatc tgttagaaca ggcctatggg 120
taggtgattg tttcatctac acaaatgctg tgaatcgtat caattacttt gtaggaggtg 180taggtgattg tttcatctac acaaatgctg tgaatcgtat caattacttt gtaggaggtg 180
aactagtaac tatcgcacac ttggatcgtc cattgtacgt cttgggttat gtgcccaaag 240aactagtaac tatcgcacac ttggatcgtc cattgtacgt cttgggttat gtgcccaaag 240
acgatcgttt gtatctagta gataaagagt tacgagttgt cagctaccaa ttgcttcttt 300acgatcgttt gtatctagta gataaagagt tacgagttgt cagctaccaa ttgcttcttt 300
cagtactcga atatcagaca gctgttatga ggagggactt cccaacagca gatagagtac 360cagtactcga atatcagaca gctgttatga ggagggactt cccaacagca gatagagtac 360
taccgtctat acctaaagag 380taccgtctat acctaaagag 380
<210>19<210>19
<211>426<211>426
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>19<400>19
gcacatttct tagaaaagca aggttttaaa caacaagctt tagctgtaag ttccgatccc 60gcacatttct tagaaaagca aggttttaaa caacaagctt tagctgtaag ttccgatccc 60
gaacatagat tcgaactcgc tgtggcatta gaagacctga atacagctaa aattctagca 120gaacatagat tcgaactcgc tgtggcatta gaagacctga atacagctaa aattctagca 120
caagaggcta acaatccaca aaagtggagc caattagctg atctagctgc tggcacaaat 180caagaggcta acaatccaca aaagtggagc caattagctg atctagctgc tggcacaaat 180
aatgtagaac tagcaaaaga atgcatgcag aaagcccaag attttggtgg attattactt 240aatgtagaac tagcaaaaga atgcatgcag aaagcccaag attttggtgg attattactt 240
ctagccacta gttcgggaga tgaatcatta gtccgtacat taggtgaaac aacacaagct 300ctagccacta gttcgggaga tgaatcatta gtccgtacat taggtgaaac aacacaagct 300
gagggcaaac ataatttagc cttcctttct catttcttgg taggagattt agacaagtgt 360gagggcaaac ataatttagc cttcctttct catttcttgg taggagattt agacaagtgt 360
ctagatattt tagtaagtac aggaaggttg ccagaagctg cgtttttcgc cagatcttat 420ctagatattt tagtaagtac aggaaggttg ccagaagctg cgtttttcgc cagatcttat 420
cttccc 426cttccc 426
<210>20<210>20
<211>316<211>316
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>20<400>20
gaattgtgga ggacacaatt atcaactata aatcaaaaag ccggacaaag tttagccgat 60gaattgtgga ggacacaatt atcaactata aatcaaaaag ccggacaaag tttagccgat 60
cctaaaaatt atgaaaatct atttcccggt cttcaacaag cattgtcggc acagaaattt 120cctaaaaatt atgaaaatct atttcccggt cttcaacaag cattgtcggc acagaaattt 120
ttggaacaga acaaacagtt gccacctgca tttatggctc cttctattgt tcccaaccaa 180ttggaacaga acaaacagtt gccacctgca tttatggctc cttctattgt tcccaaccaa 180
gatagaaatg ttatagccga agcggaggca cagttaaaga atagtggaac ttcatcaaat 240gatagaaatg ttatagccga agcggaggca cagttaaaga atagtggaac ttcatcaaat 240
ttgttcagtg ccccaccttc agcagaaact tctaggaatg ttatagaatc agtaccacaa 300ttgttcagtg ccccaccttc agcagaaact tctaggaatg ttatagaatc agtaccacaa 300
aataagccct cagaag 316aataagccct cagaag 316
<210>21<210>21
<211>328<211>328
<212>ДНК<212>DNA
<213>Cauliflower mosaic virus<213>Cauliflower mosaic virus
<400>21<400>21
ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta 60ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta 60
caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg 120caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg 120
tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 180tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 180
gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc 240gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc 240
ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac 300ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac 300
acgctgacaa gctgactcta gcagatct 328acgctgacaa gctgactcta gcagatct 328
<210>22<210>22
<211>872<211>872
<212>ДНК<212>DNA
<213>Искусственная последовательность - нуклеотидная последовательность-R1<213>Artificial sequence - nucleotide sequence-R1
<400>22<400>22
aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60
cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120
aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180
gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240
cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300
ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgttaaagtt ggtagagaag aaccagctgt 360ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgttaaagtt ggtagagaag aaccagctgt 360
taagtactgc gatcgcgtta acgctttatc acgatacctt ctaccacata tcactaacaa 420taagtactgc gatcgcgtta acgctttatc acgatacctt ctaccacata tcactaacaa 420
catcaacact catcactctc gacgacatcc actcgatcac tactctcaca cgaccgatta 480catcaacact catcactctc gacgacatcc actcgatcac tactctcaca cgaccgatta 480
actcctcatc cacgcggccg cctgcaggag caacagctgg ttcttctcta ccaactttaa 540actcctcatc cacgcggccg cctgcaggag caacagctgg ttcttctcta ccaactttaa 540
caagaatact accctcgtca taacccaatg ccacattatt acttcctttt aagcaacaaa 600caagaatact accctcgtca taacccaatg ccacattatt acttcctttt aagcaacaaa 600
tggtccaaac cctttcaaat ccataattta aggtactttc cagtcgatgg gtatttgcat 660tggtccaaac cctttcaaat ccataattta aggtactttc cagtcgatgg gtatttgcat 660
gccatattct cactgtacca tcttcacttc ccgtaagagc aactggaagt tctggatgga 720gccatattct cactgtacca tcttcacttc ccgtaagagc aactggaagt tctggatgga 720
aaaagacagc agtaacattt tgaccatgtc cttctaaggt ttgaacacat gttttatttt 780aaaagacagc agtaacattt tgaccatgtc cttctaaggt ttgaacacat gttttatttt 780
ggtaatccca gattttgacc aacctatcat cggctcctga tattatatag ggtttatcac 840ggtaatccca gattttgacc aacctatcat cggctcctga tattatatag ggtttatcac 840
ctccgtggta gtagtctaca caattgacac ct 872ctccgtggta gtagtctaca caattgacac ct 872
<210>23<210>23
<211>150<211>150
<212>ДНК<212>DNA
<213>Искусственная последовательность - последовательность спейсера<213>Artificial Sequence - Spacer Sequence
<400>23<400>23
aagtactgcg atcgcgttaa cgctttatca cgataccttc taccacatat cactaacaac 60aagtactgcg atcgcgttaa cgctttatca cgataccttc taccacatat cactaacaac 60
atcaacactc atcactctcg acgacatcca ctcgatcact actctcacac gaccgattaa 120atcaacactc atcactctcg acgacatcca ctcgatcact actctcacac gaccgattaa 120
ctcctcatcc acgcggccgc ctgcaggagc 150ctcctcatcc acgcggccgc ctgcaggagc 150
<210>24<210>24
<211>253<211>253
<212>ДНК<212>DNA
<213>Agrobacterium tumefaciens<213>Agrobacterium tumefaciens
<400>24<400>24
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253atgttactag atc 253
<210>25<210>25
<211>1026<211>1026
<212>ДНК<212>DNA
<213>Salmonella enterica<213>Salmonella enterica
<400>25<400>25
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360
gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780
cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020
gaatag 1026gaatag 1026
<210>26<210>26
<211>20<211>20
<212>ДНК<212>DNA
<213>Искусственная последовательность - Праймер 1<213>Artificial Sequence - Primer 1
<400>26<400>26
cagggtgtca cgttgcaaga 20cagggtgtca cgttgcaaga 20
<210>27<210>27
<211>20<211>20
<212>ДНК<212>DNA
<213>Искусственная последовательность - Праймер 2<213>Artificial Sequence - Primer 2
<400>27<400>27
ccgctcgtct ggctaagatc 20ccgctcgtct ggctaagatc 20
<210>28<210>28
<211>24<211>24
<212>ДНК<212>DNA
<213>Искусственная последовательность - Зонд 1<213>Artificial Sequence - Probe 1
<400>28<400>28
tgcctgaaac cgaactgccc gctg 24tgcctgaaac cgaactgccc gctg 24
<210>29<210>29
<211>334<211>334
<212>ДНК<212>DNA
<213>Искусственная последовательность - несоответствующая dsRNA<213>Artificial sequence - mismatched dsRNA
<400>29<400>29
ggaaatcgcc actgctaaga aaaatggaca gaaaaataag agagcggcac ttcaagcact 60ggaaatcgcc actgctaaga aaaatggaca gaaaaataag agagcggcac ttcaagcact 60
caagcggaag aagcggtatg agaaacagtt gcagcagatt gatggaacat tatcaactat 120caagcggaag aagcggtatg agaaacagtt gcagcagatt gatggaacat tatcaactat 120
tgaaatgcag agagaagctt tagagggtgc caacactaat acagctgttc tcacaacaat 180tgaaatgcag agagaagctt tagagggtgc caacactaat acagctgttc tcacaacaat 180
gaaagatgct gcggacgccc tcaaagctgc tcacaaacac atggatgtcg atcaagttca 240gaaagatgct gcggacgccc tcaaagctgc tcacaaacac atggatgtcg atcaagttca 240
tgatatgatg gatgacattg ccgaacagca agatgtagct agagaaattt ctgatgccat 300tgatatgatg gatgacattg ccgaacagca agatgtagct agagaaattt ctgatgccat 300
atccaaccca gttgcatttg gtcatgatat tgat 334atccaaccca gttgcatttg gtcatgatat tgat 334
<210>30<210>30
<211>541<211>541
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>30<400>30
atttgttgat actagtggta gacataaaca agaagaatca ctatttgaag aaatgttggc 60atttgttgat actagtggta gacataaaca agaagaatca ctatttgaag aaatgttggc 60
agtttctaat gctgtgagac cagataatat tattttcgtt atggatgcaa ctattggtca 120agtttctaat gctgtgagac cagataatat tattttcgtt atggatgcaa ctattggtca 120
agcttgtgag tctcaggcta aagctttcaa agaaaaggta gatgtaggct ctgtaattat 180agcttgtgag tctcaggcta aagctttcaa agaaaaggta gatgtaggct ctgtaattat 180
aacaaaatta gatggacatg caaaaggagg tggtgcactc agtgctgtgg cagccactaa 240aacaaaatta gatggacatg caaaaggagg tggtgcactc agtgctgtgg cagccactaa 240
cagtcctatt atattcattg gtacaggaga acatatagat gacttagaac cttttaaaac 300cagtcctatt atattcattg gtacaggaga acatatagat gacttagaac cttttaaaac 300
aaaacctttc attagtaaat tattaggaat gggtgatata gaaggtttaa ttgataaagt 360360
aaacgaatta aagttagagg ataatgaaga attgttagaa aaaattaaac atgggcaatt 420aaacgaatta aagttagagg ataatgaaga attgttagaa aaaattaaac atgggcaatt 420
cacactcaga gacatgtatg aacagttcca aaatattatg aaaatgggac ctttctcaca 480cacactcaga gacatgtatg aacagttcca aaatattatg aaaatgggac ctttctcaca 480
aataatggga atgatccctg gatttagcca agatttcatg tcaaaaggaa gtgaacaaga 540aataatggga atgatccctg gatttagcca agatttcatg tcaaaaggaa gtgaacaaga 540
a 541a 541
<210>31<210>31
<211>394<211>394
<212>ДНК<212>DNA
<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica
<400>31<400>31
aataatggac agtatgaatg attatgaatt agataaccga gatggtgcaa aattatttac 60aataatggac agtatgaatg attatgaatt agataaccga gatggtgcaa aattatttac 60
aaagcaaaat ggtagagtta ttagagttgc acaagggtct ggtgttacag aaagagaagt 120aaagcaaaat ggtagagtta ttagagttgc acaagggtct ggtgttacag aaagagaagt 120
aaaagatttg atcacgcaat acacgaagtt tgccgccgta gtaaagaaaa tgggcggcat 180aaaagatttg atcacgcaat acacgaagtt tgccgccgta gtaaagaaaa tgggcggcat 180
aaagggtctt tttaaaggcg gcgatatggc taaaaatgtc aatcacaacc aaatggccaa 240aaagggtctt tttaaaggcg gcgatatggc taaaaatgtc aatcacaacc aaatggccaa 240
acttaatcaa caaatggcca agatgatgga tcctcgagtg cttcagcaaa tgggcggcat 300acttaatcaa caaatggcca agatgatgga tcctcgagtg cttcagcaaa tgggcggcat 300
ggctggatta cagaacatga tgagacagct acaagcgggc gcggcaggag gcttgggagg 360ggctggatta cagaacatga tgagacagct acaagcggggc gcggcaggag gcttgggagg 360
tttgggtaac cttatgggtg gttttggagg gaaa 394tttggggtaac cttatggggtg gttttgggagg gaaa 394
<---<---
Claims (35)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810550207.4 | 2018-05-31 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020143244A RU2020143244A (en) | 2022-06-30 |
RU2781829C2 true RU2781829C2 (en) | 2022-10-18 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011075584A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-06-23 | Dow Agrosciences Llc | Insect resistance management with combinations of cry1be and cry1f proteins |
RU2639549C2 (en) * | 2010-12-30 | 2017-12-21 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Nucleic acids molecules that provide resistance to beetle pests |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011075584A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-06-23 | Dow Agrosciences Llc | Insect resistance management with combinations of cry1be and cry1f proteins |
RU2639549C2 (en) * | 2010-12-30 | 2017-12-21 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Nucleic acids molecules that provide resistance to beetle pests |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2016228053B2 (en) | Uses of insecticidal protein | |
KR102266402B1 (en) | Novel pest control methods | |
BR102013031016A2 (en) | pesticide gene and use of it | |
US20140154224A1 (en) | Method of Pest Control | |
CN106497966B (en) | Use of insecticidal proteins | |
US12037584B2 (en) | Polynucleotide and method for controlling insect infestation | |
JP2017515474A (en) | SEC23 nucleic acid molecules that confer resistance to Coleoptera and Hemiptera pests | |
KR20170107437A (en) | Parental rnai suppression of hunchback gene to control hemipteran pests | |
US10676741B2 (en) | Nucleotide sequence and method for controlling insect infestation | |
CN107603984B (en) | Nucleotide sequences and methods for controlling insect infestation | |
US20140242048A1 (en) | Methods For Controlling Pests | |
US11505805B2 (en) | Polynucleotide and method for controlling insect invasion | |
CA3103004C (en) | Polynucleotide and method used for controlling insect invasion | |
CN105838727B (en) | For controlling the nucleotide sequence and its method of insect infestations | |
RU2781829C2 (en) | Polynucleotide and method for control of insect infestation | |
RU2775943C1 (en) | Polynucleotide and method for control of insect infestation | |
RU2775717C1 (en) | Polynucleotide and method used to control an insect outbreak | |
CN110669760B (en) | Nucleotide sequences and methods for controlling insect infestation | |
US20140161778A1 (en) | Method of Pest Control | |
CN117535289A (en) | Polynucleotide sequence for controlling coleopteran pest stress of plants and application |