RU2772351C1 - Способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов - Google Patents
Способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2772351C1 RU2772351C1 RU2021127457A RU2021127457A RU2772351C1 RU 2772351 C1 RU2772351 C1 RU 2772351C1 RU 2021127457 A RU2021127457 A RU 2021127457A RU 2021127457 A RU2021127457 A RU 2021127457A RU 2772351 C1 RU2772351 C1 RU 2772351C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strains
- microorganisms
- dna
- probiotic
- antioxidant
- Prior art date
Links
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 22
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 16
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 12
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 9
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 8
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 7
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 7
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 6
- 241001493843 Lactobacillus frumenti Species 0.000 description 6
- 241000674808 Lactobacillus kitasatonis Species 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 5
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 3
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 3
- 241000186842 Lactobacillus coryniformis Species 0.000 description 3
- 230000027151 SOS response Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 2
- 239000011436 cob Substances 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 2
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 231100000280 DNA damage induction Toxicity 0.000 description 1
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N Dopamine Natural products NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102100025367 Keratin, type II cytoskeletal 75 Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241001134659 Lactobacillus curvatus Species 0.000 description 1
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 1
- 241000607568 Photobacterium Species 0.000 description 1
- 241001148064 Photorhabdus luminescens Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002790 anti-mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 1
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 229960004755 ceftriaxone Drugs 0.000 description 1
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001739 density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009892 regulation of energy homeostasis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов, включающий проверку антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств выделенных штаммов микроорганизмов, из которых отбираются штаммы, обладающие антиоксидантной и ДНК-протекторной активностью выше 40%. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов выявления микроорганизмов, пригодных для применения в качестве пробиотиков. 2 ил., 3 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам выявления и селекции штаммов микроорганизмов, и может быть использовано для получения новых видов пробиотических препаратов.
Пробиотики - живые микроорганизмы, приносящие пользу организму хозяина при введении в адекватных количествах. Основными функциями пробиотиков являются: поддержка колонизационной резистентности, метаболизм пищевых субстратов и утилизация конечных метаболитов, продукция субстратов, необходимых для макроорганизма, а также регуляция местного и адаптивного иммунного ответа.
К пробиотикам, в частности, относятся бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Escherichia и грибы рода Saccharomyces.
В основе колонизационной резистентности лежит способность пробиотических штаммов предотвращать колонизацию желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микроорганизмами вследствие конкуренции за питательные вещества, а также путём синтеза ряда антибактериальных метаболитов, активных в отношении патогенных бактерий. Пробиотики метаболизируют компоненты пищи и некоторые другие субстанции, за счет наличия специфических ферментов, отсутствующих у организма-хозяина.
Пробиотические штаммы осуществляют синтез большого числа важнейших метаболитов, которые участвуют в поддержании гомеостаза макроорганизма. К таким метаболитам относятся короткоцепочечные жирные кислоты, поддерживающие регуляцию энергетического гомеостаза, а также служащие сигнальными молекулами для клеток иммунной системы, определяя их дифференцировку и противовоспалительную активность. Пробиотические микроорганизмы продуцируют медиаторы – допамин, норадреналин, серотонин, гамма-аминомасляную кислоту и гистамин. Кроме того, пробиотики синтезируют незаменимые для макроорганизма метаболиты: триптофан и витамины группы В.
Метаболиты пробиотических бактерий взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками и участвуют в регуляции местного и системного иммунного ответа.
Для расширения спектра пробиотических микроорганизмов, для поиска новых, эффективных штаммов, способных оказать значительное положительное влияние на организм хозяина, необходимы способы и методы, позволяющие выделить и идентифицировать микроорганизмы, обладающие необходимыми свойствами и отвечающие требованиям, предъявляемым к пробиотическим препаратам.
Известны способы решающие аналогичные задачи в иных направлениях. Так в (патенте RU 2624667C1, B09C1/10, опуб. 05.07.2017) «Способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремедиации» описан способ выделения штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти, включающий стадии селекции и выделения чистой культуры, оценки выделенных штаммов. Известно изобретение (по патенту RU 2241745 С2, C12N1/26, B09C1/10, опубл. 10.12.2004) «Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов». Сущностью является способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что селекцию начинают на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведут при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней. Известен способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов (RU 2352630 C1, C121/10,C12N1/26, опубл. 20.04.2009), отличающийся тем, что после выделения проводят активацию микроорганизмов с помощью стимуляторов. Известен способ (патент RU 2133775 С1, C12Q1/04,C12N1/04, опубл. 27.07.1999) выделения штаммов-деструкторов, обладающих полисубстратной специфичностью, техническим результатом которого является возможность отбора наиболее ценных штаммов микроорганизмов. Известны способы получения аутопробиотиков, из фекальных масс организма-хозяина (патент RU 2580002 С1, C12N1/20, A61K35/74, C12R1/07, опубл. 10.04.2016) «Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии» и (патент RU 2139070 С1, A61K35/74, C12N1/20, опубл. 10.10.1999) «Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы». Сущность данных способов заключается в выделении и накоплении пробиотически активных штаммов из фекалий.
Однако данные способы не позволяют получить новые штаммы, отсутствующие у данного хозяина, и провести оценку выделенных микроорганизмов по важным признакам и свойствам, обуславливающим их пробиотическое действие.
В целях достижения заявленного результата была разработана методика отбора и селекции пробиотических микроорганизмов, за счет того, что включает их скрининг на ДНК-протекторную и антиоксидантную активность, и позволяющая выявлять наиболее перспективные штаммы, потенциально обладающие значительным потенциалом системных положительных эффектов в организме хозяина.
Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов, включающий отбор проб с субстратов, выделение и очистку штаммов микроорганизмов, при этом после выделения проводят исследование безопасности и свойств микроорганизмов, обусловливающих их потенциальное пробиотическое действие;
- проверяются антиоксидантные свойства микроорганизмов, и отбираются штаммы обладающие антиоксидантной активностью выше 40%;
- проверяются ДНК-протекторные свойства микроорганизмов, и отбираются штаммы обладающие ДНК-протекторной активностью выше 40%.
Технический результат заключается в поиске новых, эффективных штаммов, способных оказать значительное положительное влияние на организм хозяина, и позволяет выделить и идентифицировать микроорганизмы, обладающие необходимыми свойствами и отвечающие требованиям, предъявляемым к пробиотическим препаратам, а также проводить более эффективный скрининг за счет учета прогностически информативных параметров выработки низкомолекулярных метаболитов, обеспечивающих пробиотические свойства анализируемых штаммов.
Сущность способа состоит в следующем:
Проводится сбор материала, включая помет, содержимое слепой кишки, образцы подстилки.
Полученные образцы высеваются на твёрдых питательных средах и очищаются до отдельных штаммов методом истощающего штриха. Для чего пробы тщательно перемешиваются, затем из каждой отбирается две навески по 10 г. Для выделения Lactobacillus используют среду MRS (ЛенРеактив) с добавлением сорбиновой кислоты. Молочнокислые бактерии инкубируют в анаэробных условиях, при следующем составе газовой среды: 95% N2, 4% СО2, 1% О2.
Выделенные штаммы проверяются на безопасность, на отсутствие гемолитической активности, чувствительность к антибиотикам, и мутагенность. Для определения гемолитической активности штаммы высевают на кровяной агар и инкубируют при температуре 42°С в течение 48 часов. Гемолитическую активность оценивают по наличию и ширине зоны лизиса.
Для определения чувствительности к антибиотикам штаммы засевают газоном на соответствующие твёрдые питательные среды. Далее на них же помещают стандартные диски с антибиотиками: амоксициллином, ципрофлоксацином, цефтриаксоном, азитромицином, карбопенемом, эритромицином, тетрациклином, гентамицином, по 4 диска на одну чашку в 2х повторностях. Штаммы инкубируют при 42°С в анаэробных условиях, результат учитывают через 48 часов.
У штаммов, прошедших тесты на антибиотико-чувствительность и гемолитическую активность, исследуют антиоксидантные и генопротекторные свойства с помощью lux-биосенсоров. В качестве биосенсоров применяли рекомбинантные штаммы E.coli MG1655 (pKatG-lux) и MG1655 (pRecA-lux), содержащие плазмиды с опероном luxCDABE фотобактерии Photorhabdus luminescens, поставленным под контроль соответствующих промоторов Е. coli. Данный оперон содержит гены люциферазы и их регуляторы и обеспечивает биолюминесценцию, используемую в данном тесте в качестве репортерной функции. Биосенсоры с плазмидой pKatG реагируют на наличие в среде окислителей, в частности, перекиси водорода. Биосенсоры с плазмидой pRecA реагируют на наличие в клетке факторов, вызывающих повреждение ДНК.
Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37ºС до ранней или средней логарифмической фазы. Ночную культуру разбавляли свежей средой до плотности 0,01 - 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅107 - 3⋅106 клеток/мл). Измерения плотности проводились при помощи денситометра DEN-1B («Biosan»). Затем суспензию подращивали до ранней логарифмической фазы. Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносили в стерильные ячейки (находящиеся в стрипах планшета) и добавляли в них по 10 мкл тестируемого препарата (кроме контрольных ячеек). В контрольные ячейки добавляли 10 мкл деионизированной воды.
После обработки планшет с пробами помещали в люминометр, при температуре 30°С и измеряли изменения интенсивности биолюминесценции.
Фактор индукции SOS ответа/окислительного стресса/повреждения ДНК (Is) вычисляют по формуле:
где: Lk – интенсивность люминесценции контрольной пробы (в условных единицах);
Le– интенсивность люминесценции опытной пробы (в условных единицах).
Признаком статистической значимости эффекта SOS-индукции считали статистически значимое превышение Le над Lk, оцениваемое по t-критерию.
Показатель протекторной активности (А, %) вычисляют по формуле:
(2) 
где: Ia – фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием в присутствии ингибитора.
Ip- фактор индукции SOS-ответа ципрофлоксацином.
Среднее квадратичное отклонение факторов индукции S вычисляют по формуле:
(3) 
где индексы e и k относятся к опыту и контролю, соответственно.
Штаммы проявившие генопротекторные и антиоксидантные свойства отбирают для дальнейшей работы, и исследуют на пригодность к использованию в производственных целях. Определяют скорость роста, устойчивость к температурам и рН, скорость утилизации субстрата. Скорость роста оценивают по времени появления мутности суспензии клеток 0,5 по Макфаланду.
Проводя селекцию наиболее перспективных штаммов, безопасных и обладающих наиболее выраженной антиоксидантной и антимутагенной активностью, а так же высокой скоростью роста и утилизацией субстрата, получают штаммы максимально подходящие для производства пробиотических препаратов.
Пример 1
Проведен отбор подстилки и помета у следующих групп птиц:
1. яичный кросс Хайсекс-браун, клеточное содержание, корм: стандартная кормосмесь; ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», х. Гуляй-Борисовка Зерноградского района РО;
2. яичный кросс Хайсекс-браун, клеточное содержание, корм: стандартная кормосмесь; ОАО «Птицефабрика Белокалитвинская», п. Сосны Белокалитвинского района РО;
3. бройлеры напольного содержания, кросс Кобб, корм: полнорационный комбикорм; птицефабрика «Донецкий бройлер» (ИП Строителев О.Н.), г. Донецк, РО;
4. бройлеры клеточного содержания, кросс Кобб, корм: полнорационный комбикорм; учхоз ДГТУ, РО;
5. яичный кросс Хайсекс-браун, свободновыгульное содержание, корм: комбикорм ПК-1-2; личное подсобное хозяйство, п. Персиановский Октябрьского района РО;
6. яичная порода полосато-пестрый леггорн, свободновыгульное содержание, корм: полнорационный комбикорм с добавками в виде овощей до 20% рациона, личное подсобное хозяйство, с. Раздольное, Краснодарский край;
7. яичный кросс Хайсекс-браун, свободновыгульное содержание, корм: комбикорм «Мегамикс» с добавками в виде овощей до 10% рациона; личное подсобное хозяйство, г. Ростов-на-Дону.
Все группы не получали каких-либо пре- или пробиотических добавок ни в виде корма, ни в виде препаратов для подстилки. Также все группы не получали антибиотиков минимум за полгода до начала исследований.
Для отбора выбирали свежий помёт, полученный от нескольких, не менее 5-6 здоровых птиц. Отобранный помёт в количестве 30-40 г. помещали в стерильные пластиковые контейнеры. Все пробы охлаждали до температуры +4°С и в течение 24 часов доставляли в лабораторию. В процессе транспортировки обеспечивали поддержание температурного режима +4 - +8°С.
Из проб было отобрано 38 штаммов молочнокислых бактерий, которые представлены в Таблице 1.
Определение видовой принадлежности штаммов было проведено методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Исследование проводили на приборе Microflex LT instrument (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Германия) с использованием программного обеспечения Biotyper (version 3.0) (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Германия).
Таблица 1.
Отобранные штаммы молочнокислых бактерий, их источник и КОЕ/г лактобактерий в источнике.
| Источник | Количество Lactobacillus, КОЕ/г | Выделенные штаммы |
| клеточное содержание, бройлеры, птицефабрика «Донецкий бройлер» | 8,0±0,5·108 | L. johnsonii KL18 |
| свободновыгульное содержание, личное хозяйство, с. Раздольное | 4,0±0,5·108 | L. johnsonii KL20, KL21 L. gasseri KL22, L. salivarius KL23, KL24, L. johnsonii KL25, L. johnsonii KL26, L. salivarius KL27, L. johnsonii KL28, L. reuteri KL29 |
| клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», х. Гуляй-Борисовка Зерноградского района РО | 3,1±0,1·108 | L. frumenti KL31, KL32, L. reuteri KL33, L. gasseri KL34, L. johnsonii KL36, L. salivarius KL37, L. frumenti KL39 |
| клеточное содержание, несушки, ОАО «Птицефабрика Белокалитвинская», п. Сосны Белокалитвинского района РО | 5,1±0,4·106 | L. crispatus KL41 |
| напольное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, РО | 1,2±0,2·109 | L. salivarius KL61, L. crispatus KL62, L. johnsonii KL63, L. crispatus KL64, L. salivarius KL65, L. crispatus KL66, L. coryniformis KL67 |
| личное подсобное хозяйство, п. Персиановский Октябрьского района РО | 4,4±1,2·108 | L. crispatus KL71, L. crispatus KL72, L. kitasatonis KL73, L. curvatus KL74, L. reuteri KL75, L. reuteri KL76, L. kitasatonis KL77, |
| свободновыгульное содержание (РнД), личное подсобное хозяйство, г. Ростов-на-Дону | 1,1±0,04·109 | L. reuteri KL81, L. crispatus KL82, L. reuteri KL83, L. coryniformis KL84, L. frumenti KL85, L. frumenti KL86, L. crispatus KL87 |
Все выделенные штаммы проверили на безопасность по следующим параметрам: гемолитическая активность, антибиотикорезистентность, мутагенность. Анализ гемолитической активности при посеве на кровяной агар показал, что из 38 штаммов ни один не обладает такой активностью.
Исследование устойчивость к антибиотикам выявило устойчивость у четырех штаммов молочнокислых бактерий. Штаммы KL21 и KL24 оказались нечувствительны амоксициллину (отсутствие зоны подавления роста), KL32 продемонстрировал слабую чувствительность к эритромицину (зона отсутствия роста 1 мм), KL87 – отсутствие чувствительности к эритромицину (отсутствие зоны подавления роста). Все четыре штамма исключаются из дальнейших исследований.
Тест на повреждение ДНК с биосенсором pRecA показал отсутствие мутагенной активности у всех выделенных штаммов.
Безопасные штаммы были проанализированы на наличие антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств в тестах с биосенсорами. Результаты исследования отображены на фиг. 1 и фиг. 2.
В качестве пробиотических рассматриваются штаммы, обладающие одновременно выраженной ДНК-протекторной и антиоксидантной активностью. В общей сложности отобрано 11 штаммов, удовлетворяющих следующим критериям: антиоксидантная активность выше 40%, ДНК-протекторная активность также выше 40%. По совокупности антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств для применения в качестве пробиотиков были выбраны следующие штаммы:
Таблица 2
| № штамма | Видовое название | Источник |
| KB16 | Bacillus subtilis | напольное содержание, бройлеры, «Донецкий бройлер», помёт |
| KB18 | Bacillus amyloliquefaciens | напольное содержание, бройлеры, «Донецкий бройлер», помёт |
| KB41 | Bacillus subtilis | клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт |
| KB44 | Bacillus amyloliquefaciens | клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт |
| KB54 | Bacillus amyloliquefaciens | свободновыгульное содержание л/х г. Ростов-на-Дону, помёт |
| KL31 | Limosilactobacillus frumenti | клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт |
| KL61 | Ligilactobacillus salivarius | клеточное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, помёт |
| KL62 | Lactobacillus crispatus | клеточное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, помёт |
| KL73 | Lactobacillus kitasatonis | свободновыгульное содержание, л/х п. Персиановский, помёт |
| KL82 | Lactobacillus crispatus | свободновыгульное содержание, л/х г. Ростов-на-Дону, помёт |
Антиоксидантная активность выделенных штаммов в целом была выше, чем ДНК-протекторная. Известно, что многие штаммы Lactobacillus обладают высокой антиоксидантной активностью за счёт ферментативных систем замещающих каталазу, способности выделять вторичные метаболиты-антиоксиданты, связывать ионы металлов и т.д. (Wang, 2017). Из 36 исследованных штаммов 21 штамм имел антиоксидантную активность более 60%, из них 16 – более 80%. Для сравнения: антиоксидантная активность α-токоферола в концентрации 0,43 мг/мл (10-3 М) составляет 36,8%.
ДНК-протекторная активность выделенных штаммов сильно разнилась между собой. Так, 12 исследуемых штаммов вообще не имели выраженной ДНК-протекторной активности, 7 – имели слабую активность - менее 20%. С другой стороны, 4 штамма имели очень высокую ДНК-протекторную активность (более 80%). Всё это свидетельствует о том, что представители рода Lactobacillus имеют широкий диапазон свойств, и что первичный скрининг активности клеток по целевым параметрам являются обязательным.
В процессе подбора штаммов-пробиотиков необходимо учитывать также их потенциальные промышленные свойства, в том числе скорость роста и наработки биомассы. 11 безопасных и обладающих пробиотической активностью штаммов были протестированы на скорость роста по времени появления мутности суспензии клеток 0,5 по Макфаланду. Данные представлены в табл. 3.
Таблица 3.
Время достижения суспензией лактобактерий мутности 0,5 по Макфарланду.
| Штамм | Время, часы |
| L. frumenti KL31 | 24 |
| L. salivarius KL61 | 24 |
| L. crispatus KL62 | 24 |
| L. johnsonii KL63 | 48 |
| L. crispatus KL64 | 60 |
| L. coryniformis KL67 | 72 |
| L. crispatus KL72 | 48 |
| L. kitasatonis KL73 | 24 |
| L. kitasatonis KL77 | 36 |
| L. crispatus KL82 | 24 |
| L. reuteri KL83 | 72 |
По совокупности свойств штаммов наиболее перспективными для дальнейших исследований и коммерческого использования признаны штаммы L. frumenti KL31, L. salivarius KL61, L. crispatus KL62, L. kitasatonis KL73, L. crispatus KL82.
Claims (1)
- Способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов, включающий отбор проб с субстратов, выделение и очистку штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что вначале проверяются антиоксидантные свойства и ДНК-протекторные свойства микроорганизмов, а затем отбираются штаммы, обладающие антиоксидантной активностью и ДНК-протекторной активностью выше 40%.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2772351C1 true RU2772351C1 (ru) | 2022-05-19 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2139070C1 (ru) * | 1999-03-31 | 1999-10-10 | Шендеров Борис Аркадьевич | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы |
| RU2506308C1 (ru) * | 2012-07-25 | 2014-02-10 | Вячеслав Михайлович Абрамов | КОНСОРЦИУМ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ Lactobacillus rhamnosus И Lactobacillus plantarum ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА И ЗАКВАСКИ ПРЯМОГО ВНЕСЕНИЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ФЕРМЕНТИРОВАННОГО МОЛОКА И ФЕРМЕНТИРОВАННОГО СВЕКОЛЬНОГО СОКА |
| RU2580002C1 (ru) * | 2015-05-19 | 2016-04-10 | Дмитрий Евгеньевич Денисов | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2139070C1 (ru) * | 1999-03-31 | 1999-10-10 | Шендеров Борис Аркадьевич | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы |
| RU2506308C1 (ru) * | 2012-07-25 | 2014-02-10 | Вячеслав Михайлович Абрамов | КОНСОРЦИУМ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ Lactobacillus rhamnosus И Lactobacillus plantarum ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА И ЗАКВАСКИ ПРЯМОГО ВНЕСЕНИЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ФЕРМЕНТИРОВАННОГО МОЛОКА И ФЕРМЕНТИРОВАННОГО СВЕКОЛЬНОГО СОКА |
| RU2580002C1 (ru) * | 2015-05-19 | 2016-04-10 | Дмитрий Евгеньевич Денисов | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| описание: пример 5. * |
| формула, описание: с.6-7, пример 2. ПРАЗДНОВА Е.В. "Антимутагенное действие пробиотиков как основа их биологического эффекта"; Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 2020, Ростов-на Дону, с.4, 8, 9, 15, 16, 23. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cotta et al. | Isolation, characterization and comparison of bacteria from swine faeces and manure storage pits | |
| Mattarelli et al. | Recommended minimal standards for description of new taxa of the genera Bifidobacterium, Lactobacillus and related genera | |
| Shehata et al. | Screening of isolated potential probiotic lactic acid bacteria for cholesterol lowering property and bile salt hydrolase activity | |
| Klieve et al. | Establishing populations of Megasphaera elsdenii YE 34 and Butyrivibrio fibrisolvens YE 44 in the rumen of cattle fed high grain diets | |
| Teo et al. | Inhibition of Clostridium perfringens by a novel strain of Bacillus subtilis isolated from the gastrointestinal tracts of healthy chickens | |
| Liu et al. | ARTP mutation and adaptive laboratory evolution improve probiotic performance of Bacillus coagulans | |
| Hjelm et al. | Seasonal incidence of autochthonous antagonistic Roseobacter spp. and Vibrionaceae strains in a turbot larva (Scophthalmus maximus) rearing system | |
| Cato et al. | Taxonomy and phylogeny | |
| Spivey et al. | Epithelial cell adhesion and gastrointestinal colonization of Lactobacillus in poultry | |
| Strompfová et al. | Isolation and characterization of faecal bifidobacteria and lactobacilli isolated from dogs and primates | |
| Mazanko et al. | Antioxidant and antimutagenic properties of probiotic Lactobacilli determined using LUX-biosensors | |
| Kurakawa et al. | Development of a sensitive rRNA‐targeted reverse transcription‐quantitative polymerase chain reaction for detection of Vibrio cholerae/mimicus, V. parahaemolyticus/alginolyticus and Campylobacter jejuni/coli | |
| Wang et al. | The isolation, identification, whole-genome sequencing of Clostridium butyricum LV1 and its effects on growth performance, immune response, and disease-resistance of Litopenaeus vannamei | |
| Pratama et al. | Molecular identification of lactic acid bacteria from" budu" of West Sumatera, Indonesia, as a potential probiotic | |
| Dang et al. | In vitro interaction between fumonisin B1 and the intestinal microflora of pigs | |
| EP2212415A1 (en) | Stress tolerant bifidobacteria | |
| Akouris et al. | Ethanolamine enhances adhesion, promotes microcompartment formation, and modulates gene expression in Levilactobacillus brevis ATCC 14869 | |
| CN112961804B (zh) | 一种鼠伤寒沙门菌及其应用 | |
| RU2772351C1 (ru) | Способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов | |
| CN112961805A (zh) | 一种喹诺酮类药物耐药基因gyrA和parE同时发生突变的鼠伤寒沙门菌及其应用 | |
| Burton et al. | Studies on the production of vitamin B12-active substances by microorganisms | |
| Peng et al. | Isolation, identification, and virulence gene analysis of pathogenic Aeromonas dhakensis in Macrobrachium rosenbergii and histopathological observation | |
| Durant et al. | Detection and quantification of poultry probiotic bacteria in mixed culture using monoclonal antibodies in an enzyme-linked immunosorbent assay | |
| Waters et al. | Characterisation of prototype Nurmi cultures using culture-based microbiological techniques and PCR-DGGE | |
| RU2425877C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Escherichia coli V32 ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Escherichia coli СЕРОГРУППЫ О157 |