RU2714113C1 - Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу - Google Patents
Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу Download PDFInfo
- Publication number
- RU2714113C1 RU2714113C1 RU2019107442A RU2019107442A RU2714113C1 RU 2714113 C1 RU2714113 C1 RU 2714113C1 RU 2019107442 A RU2019107442 A RU 2019107442A RU 2019107442 A RU2019107442 A RU 2019107442A RU 2714113 C1 RU2714113 C1 RU 2714113C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- xylanase
- pichia pastoris
- paenibacillus
- yeast
- endo
- Prior art date
Links
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 33
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 28
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 241000605564 Paenibacillus brasilensis Species 0.000 claims abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 claims description 17
- YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P endo-1,4-beta-Xylanase Chemical compound C=1C=CC=CC=1C[N+](CC)(CC)CCCNC(C(C=1)=O)=CC(=O)C=1NCCC[N+](CC)(CC)CC1=CC=CC=C1 YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P 0.000 claims description 12
- 241000189604 Paenibacillus jamilae Species 0.000 claims description 5
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 claims description 5
- 241000611735 Paenibacillus peoriae Species 0.000 claims description 2
- 241000058353 Paenibacillus terrae Species 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 6
- -1 xylosidase Proteins 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 5
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 5
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 2
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100179978 Arabidopsis thaliana IRX10 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100233722 Arabidopsis thaliana IRX10L gene Proteins 0.000 description 2
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101150115938 GUT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 101150044776 URA5 gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100038910 Alpha-enolase Human genes 0.000 description 1
- 101100170933 Arabidopsis thaliana DMT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100170942 Arabidopsis thaliana MET4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100032487 Beta-mannosidase Human genes 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000882335 Homo sapiens Alpha-enolase Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710122479 Isocitrate lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100502336 Komagataella pastoris FLD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014095 MET2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100036617 Monoacylglycerol lipase ABHD2 Human genes 0.000 description 1
- 101100261242 Mus musculus Trdmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233893 Neocallimastix frontalis Species 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 101150023810 PHO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100008882 Pichia angusta DAS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100271429 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ATP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100190360 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PHO89 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100421128 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SEI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100099285 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) THI11 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 101100115751 Trypanosoma brucei brucei dnaaf11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 108010014507 erythroagglutinating phytohemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N festuclavine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C)=C3C2=CNC3=C1 VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 101150043924 metXA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к трансформанту дрожжей Pichia pastoris, продуцирующему ксиланазу и содержащему ген xyl, кодирующий эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus brasilensis или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Pichia pastoris, способных продуцировать ксиланазу.
Ксилан является основным структурным полисахаридом растительных клеткок и вторым после целлюлозы наиболее распространенным полисахаридом в природе [Biotech. Genet Eng. Rev. 1995, 13, 100-131]. Это комплексный полисахарид, основная цепь которого состоит из β-(1-4) связанного ксилозного скелета с небольшим количеством β-(1-3) ответвлений [Macromol Rapid Commun., 2000, 21(9), 542-556. doi: 10.1002/1521-3927(20000601)21:9<542::AID-MARC542>3.0.CO;2-7].
Полная деградация ксилана требует комплекса ксиланолитических ферментов, включающих эндо-ксиланазу, ксилозидазу, глюкуронидазу, ацетилэстеразу и арабинофуранозидазу [Crit Rev Biotechnol., 2002, 22, 33-64, doi:10.1080/07388550290789450].
Основную роль в разрушении ксилана играет эндо-ксиланаза (эндо-1,4-β-ксиланаза, ЕС 3.2.1.8), которая катализирует случайный гидролиз ксилана до ксилололигосахаридов.
Ксиланазы широко используются в различных отраслях промышленности.
Так при кормопроизводстве введение ксиланаз уменьшает содержание некрахмальных полисахаридов, тем самым снижая вязкость корма в кишечнике животных и улучшая усвояемость и питательную ценность плохо разлагаемых кормов. [J. Anim. Sci., 2002, 80, 2773-2779; Br. Poult. Sci., 2003, 44, 60-66; Br. Poult. Sci., 2003, 44, 291-298]
Природными источниками ксиланаз являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты [FEMS Microbiology Reviews, 2005, 29 (1), 3-23].
Традиционно ферментные препараты, в состав которых входят ксиланазы, получают на основе нерекомбинантных или рекомбинантных штаммов грибов рода Trichoderma, Aspergillus или Penicillium. Однако грибные штаммы, помимо ксиланазы, продуцируют ряд других ферментов, относящихся к карбогидразам, а именно: целлюлазу, глюканазу, пектиназу и маннаназу, что не позволяет использовать их при производстве моноферментных препаратов.
Наиболее перспективным является создание продуцентов ферментов на основе рекомбинантных штаммов метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. При использовании несбраживаемых источников углерода (глицерина, метанола и т.п.) дрожжи Pichia pastoris способны к росту с образованием биомассы высокой плотности, что позволяет получать значительные количества гетерологичного белка [Appl. Microbiol. Biotechnol, 2000, 54(6), 741-750]. При этом процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol.Rev., 2000, 24:45-66, doi: 10.1111/j.l574-6976.2000.tb00532.x].
Известны примеры создания продуцентов ксиланазы на основе дрожжей Pichia pastoris.
Показано [Protein Expression and Purification 57 (2008), 101-107], что ген reBlxA из Bacillus licheniformis, кодирующий ксиланазу А, эффективно экспрессируется в клетках дрожжей Pichia pastoris, при этом активность рекомбинантной ксиланазы в культуральной жидкости составляет 122.9 U/mg.
Известны также рекомбинантные штаммы Pichia pastoris, продуцирующие ксиланазу из Streptomyces sp.FA1 [CN107142225A] и ксиланазу из Neocallimastix frontalis [CN104130951A].
В работе [Биотехнология, 2018, 34(6), в печати] описан ген xyl из Paenibacillus brasilensis кодирующий фермент эндо-1,4-β-ксиланазу (ЕС 3.2.1.8).
Поскольку гены ксиланаз различного происхождения экспрессируются в дрожжах Pichia pastoris с различной эффективностью [Биотехнология, 2018, 34(4), 26-36] важной задачей для конструирования эффективных продуцентов является выбор генов, кодирующих ксиланазу и эффективно работающих в дрожжах Pichia pastoris.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих ксиланазу.
Задача решена путем получения трансформанта дрожжей Pichia pastoris, продуцирующего ксиланазу, содержащего ген xyl, кодирующий эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus brasilensis или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее, чем на 93%
К ферментам, аминокислотная последовательность которых гомологична эндо-1,4-β-ксиланазе из Paenibacillus brasilensis [NCBI: MK014302] не менее, чем на 93% относятся, например, эндо-1,4-β-ксиланаза из Paenibacillus polymyxa [NCBI: WP_061831741.1], или эндо-1,4-β-ксиланаза из Paenibacillus terrae [NCBI: WP_014280040.1], или эндо-1,4-β-ксиланаза из Paenibacillus peoriae [NCBI: WP_104496610.1], или эндо-1,4-β-ксиланаза из Paenibacillus jamilae [NCBI: WP_063212880.1.
Получение заявленных трансформантов включает введение гена xyl из Paenibacillus brasilensis в клетки дрожжей Pichia pastoris с помощью экспрессионной кассеты, включающей в свой состав ген xyl, промотор, работающий в дрожжах Pichia pastoris, сигнальный пептид для осуществления секреции фермента в культуральную жидкость, терминатор, маркерный ген и, предпочтительно, сайт для гомологичной интеграции в хромосому. Интеграция может быть осуществлена путем как гомологичной, так и негомологичной рекомбинации. Трансформацию экспрессионной кассеты в клетки дрожжей Pichia pastoris осуществляют любым подходящим методом, например, методом электоропорации [http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pich_man.pdf) или методом с использованием полиэтиленгликоля или протопластов [http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K173001].
Конструирование экспрессионных кассет осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. - СПб.: СПбГТУ, 1999; Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с, дрожжами Pichia pastoris. В качестве промоторов используют АОХ1, DAS, FLD1, ICL1, PHO89, THI11, ADH1, ENO1, GUT1, GAP, TEF1, PGK1, GCW14, G1, G6 или другие [Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98, 5301-5317]. В качестве сигнальных пептидов используют α-фактор, PHO1, SUC2, PHA-E, KILM1, pGKL, CLY, CLY-L8, K28 pre-pro-toxin или другие [Appl Microbiol Biotechnol., 2014, 98, 5301-5317]. В качестве селективных маркеров используют любые подходящие маркеры, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, генетицину (G418) или бластицидину С, а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме Pichia pastoris, например, HIS4, МЕТ2, ADE1, ARG4, URA3, URA5, GUT1 [Yeast 2005; 22, 249-270]. В качестве плечей для гомологичной интеграции используют последовательности генов АОХ1, HIS4 (http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей Pichia pastoris.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.
Фиг. 1 Экспрессионная кассета 1
Фиг. 2 Электрофорез гена xyl Paenibacillus brasilensis.
Фиг. 3 Фингерпринт штамма Pichia pastoris ВКПМ Y-4393
Изобретение подтверждено следующими примерами.
Пример 1. Получение трансформанта дрожжей Pichia pastoris, несущего ген xyl из Paenibacillus brasilensis
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты используют метод "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.]. В качестве источника гена xyl используют тотальную геномную ДНК Paenibacillus brasilensis X1 ВКПМ В-13092 [Биотехнология, 2018, 34(6) в печати]. Синтезируют ДНК гена xyl методом ПЦР с использованием праймеров XylP-f и XylP-r
Полученную последовательность ДНК встраивают в состав экспрессионной кассеты 1 (фиг. 1), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген xyl Paenibacillus brasilensis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактороа, под контролем АОХ1 промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;
3. Дрожжевой селективный маркер kan, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора и обуславливающий у дрожжей Pichia pastoris устойчивость к антибиотику генетицину (G418);
4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ2.
Указанную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в штамм Pichia pastoris ВКПМ Y-4392, полученный на основе штамма Pichia pastoris DSMZ 70877 интеграцией в хромосому кассеты Pcup-cre, состоящей из гена cre, кодирующего рекомбиназу бактериофага Р1 под контролем Pcup промотора из Saccharomyces cerevisiae.
Штамм Pichia pastoris ВКПМ Y-4392 предварительно выращивают в жидкой питательной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 500 мкг/мл.
Для отбора наиболее продуктивных трансформантов проводят их культивирование в жидкой ферментационной питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением метанола (3 мас. %) в 96-луночных планшетах при 30°С в течение 72 ч на качалке (250 об/мин). В качестве контроля используют штамм Pichia pastoris Y-4392.
Определение активности ксиланазы в культуральной жидкости проводят с использованием ДНС метода [Anal Chem., 1959, 31 (3), 426-428] в 96-луночном планшете следующим образом: в каждой лунке смешивают 25 мкл 1% раствора субстрата ксилана березы в 0,5 М ацетатном буфере (рН 6) и 25 мкл культуральной жидкости. Инкубацию проводят при 50°С 10 минут, после чего добавляют в лунку 50 мкл раствора ДНС. Планшет прогревают при 99°С 10 минут и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 546 нм. В качестве стандарта используют раствор глюкозы.
По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант №378, который при культивировании в планшете синтезирует ксиланазу в количестве 212 ед/мл культуральной жидкости.
Для выщепления маркерного гена kanMX из экспрессионной кассеты, интегрированной в хромосому трансформанта №378, проводят индукцию гена cre, кодирующего рекомбиназу бактериофага Р1, встроенного в хромосому штамма Pichia pastoris Y-4392 (Mut+, INS Pcup-cre) и находящегося под контролем промотора Pcup. Индукция происходит в присутствии ионов меди. Для этого клетки трансформанта №378 выращивают в жидкой питательной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл, после чего добавляют раствор сульфата меди до концентрации 0,3 М, инкубируют в течении 3 часов, после чего клетки высевают на агаризованную питательную среду YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %). Отбирают колонии, не способные к росту в присутствии антибиотика G418.
Таким образом отобран трансформант №378 kanMX- с выщепленным маркерным геном kanMX, способный к синтезу фермента эндо-1,4-β-ксиланазы Paenibacillus brasilensis который депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) как Pichia pastoris ВКПМ Y-4393.
Наличие в хромосоме штамма вставки гена xyl Paenibacillus brasilensis подтверждают методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), для чего используют хромосомальную ДНК, выделенную из клеток штамма Pichia pastoris ВКПМ Y-4393 и специфические праймеры XylP-f и XylP-r
Режим реакции ПЦР:
95°С - 3 мин - 1 цикл
30 циклов:
95°С - 30 сек.
60°С - 30 сек.
72°С - 60 сек.
72°С - 5 мин. - 1 цикл
Для контроля величины амплифицированного фрагмента ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas) (линия 2, фиг. 2, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.). Наработка фрагмента ДНК размером 552 п.н. (линия 1 фиг. 2) свидетельствует о присутствии в хромосоме штамма вставки гена xyl Paenibacillus brasilensis
Результаты ПЦР-фингерпринта [Applied and Environmental Microbiology, Oct, 1999, 4351-4356] штамма Pichia pastoris ВКПМ Y-4393 представлены на фиг 3.
Фингерпринт проведен с использованием полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 1 фиг. 3) и 1254 (линия 2 фиг. 3).
Праймер М13 
режим реакции:
1 цикл
95°С - 3 мин.
39 циклов
95°С - 30 сек.
45°С - 30 сек.
72°С - 2 мин.
1 цикл
72°С - 5 мин
Праймер 1254 
режим реакции:
1 цикл
95°С - 3 мин.
39 циклов
95°С - 30 сек.
48°С - 30 сек.
72°С - 1 мин.
1 цикл
72°С - 5 мин
Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер 1kb DNA GeneRuler (Fermentas) (линия 3, фиг. 3 размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500,2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).
Пример 2. Продукция ксиланазы штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4393
Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке с 250 об/мин. Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.
Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (1 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Через 18 часов добавляют метанол (1 мас. %) Ферментацию продолжают в течение 72 часов, добавляя метанол (1 мас. %) через каждые 24 часа. После окончания ферментации определяют количество фермента ксиланазы в культуральной жидкости с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428].
Через 72 часа ферментации количество фермента составило 1114 ед/мл культуральной жидкости.
Пример 3. Получение трансформантов дрожжей Pichia pastoris. несущих ген xyl из Paenibacillus polymyxa
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты используют метод "фьюжн-пцр". В качестве источника гена xyl используют тотальную геномную ДНК Paenibacillus polymyxa ВКПМ В-3015 [Биотехнология, 2018, 34(4), 26-36]. Синтезируют ДНК гена xyl методом ПЦР с использованием праймеров XylPol-f и XylPol-r
Полученную последовательность ДНК встраивают в состав экспрессионной кассеты, в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген xyl Paenibacillus polymyxa, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактороа, под контролем АОХ1 промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1»
3. Дрожжевой селективный маркер - последовательность гена HIS4 под контролем дрожжевого TEF;
4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ1.
Полученную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в штамм Pichia pastoris GS115 (his4) так, как описано в примере 1.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде среде YNB (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С.
Отбор наиболее продуктивных трансформантов и определение активности ксиланазы в культуральной жидкости проводят как описано в примере 1.
По результатам ферментации отобран наиболее продуктивный трансформант №56, который при культивировании в планшете синтезирует ксиланазу в количестве 113 ед/мл культуральной жидкости.
Пример 4. Получение трансформантов дрожжей Pichia pastoris, несущих ген xyl из Paenibacillus jamilae
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты используют метод "фьюжн-пцр". В качестве источника гена xyl используют тотальную геномную ДНК Paenibacillus jamilae ВКПМ В-4226. Синтезируют ДНК гена xyl методом ПЦР с использованием праймеров Xyljam-f и Xyljam-r
Полученную последовательность ДНК встраивают в состав экспрессионной кассеты, которая содержит следующие генетические элементы:
1. Ген xyl Paenibacillus jamilae, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактороа, под контролем АОХ1 промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;
3. Дрожжевой селективный маркер - последовательность гена HIS4 под контролем дрожжевого TEF;
4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ1.
Трансформацию указанной интегративной экспрессионной кассеты в дрожжи Pichia pastoris GS115 (his4), отбор наиболее активных трансформантов и определение активности ксиланазы в культуральной жидкости проводят как описано в примере 3.
По результатам ферментации отобран наиболее продуктивный трансформант №118, который при культивировании в планшете синтезирует ксиланазу в количестве 89 ед/мл культуральной жидкости.
Claims (2)
1. Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу, содержащий ген xyl, кодирующий эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus brasilensis или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%.
2. Трансформант по п. 1, в котором в качестве фермента, аминокислотная последовательность которого гомологична эндо-1,4-β-ксиланазе из Paenibacillus brasilensis не менее чем на 93%, используют эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus polymyxa, или эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus terrae, или эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus peoriae, или эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus jamilae.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019107442A RU2714113C1 (ru) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019107442A RU2714113C1 (ru) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2714113C1 true RU2714113C1 (ru) | 2020-02-11 |
Family
ID=69625953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019107442A RU2714113C1 (ru) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2714113C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107142225A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-09-08 | 江南大学 | 一种强化表达Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌 |
| RU2701308C1 (ru) * | 2018-12-19 | 2019-09-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы |
-
2019
- 2019-03-15 RU RU2019107442A patent/RU2714113C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107142225A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-09-08 | 江南大学 | 一种强化表达Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌 |
| RU2701308C1 (ru) * | 2018-12-19 | 2019-09-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| КАЛИНИНА А.Н. и др., Сравнение ксиланаз различного происхождения в экспрессионной системе Pichia pastoris: экспрессия, биохимическая характеристика и биотехнологический потенциал, БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2018, т.34, н.4, стр.26-36. * |
| МУЗАЕВ Д. М. и др., Новые штаммы дрожжей Pichia pastoris - продуценты гетерологичных белков, Экологическая генетика, 2015, т.13, н.1, стр.10-15. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Visser et al. | Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1 | |
| Cho et al. | δ-Integration of endo/exo-glucanase and β-glucosidase genes into the yeast chromosomes for direct conversion of cellulose to ethanol | |
| CN107586789B (zh) | 高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用 | |
| Lichius et al. | Genetic transformation of filamentous fungi: achievements and challenges | |
| CN109790510A (zh) | 在不存在诱导底物下丝状真菌细胞中的蛋白产生 | |
| Oliveira et al. | Development of stable flocculent Saccharomyces cerevisiae strain for continuous Aspergillus niger β-galactosidase production | |
| CN113646437A (zh) | 温室气体改进发酵 | |
| RU2008107784A (ru) | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата | |
| RU2701642C1 (ru) | Штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы | |
| RU2701308C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы | |
| Mochizuki et al. | Overexpression and secretion of cellulolytic enzymes by δ-sequence-mediated multicopy integration of heterologous DNA sequences into the chromosomes of Saccharomyces cerevisiae | |
| RU2714113C1 (ru) | Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу | |
| CN100347287C (zh) | 一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用 | |
| CN107058263B (zh) | 一种新型β-淀粉酶的高效制备方法 | |
| RU2728033C1 (ru) | Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus brasilensis | |
| RU2725475C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы из Pyromyces finnis | |
| RU2747782C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis | |
| RU2720914C1 (ru) | Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий бета-глюканазу | |
| RU2728243C1 (ru) | Штамм дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу из Paenibacillus brasilensis | |
| KR101744190B1 (ko) | 재조합 섬유소 당화효소 칵테일 및 재조합 효모 복합 균주 및 이의 용도 | |
| KR20130027984A (ko) | 활성이 증진된 변이 베타-글루코시다제 및 이를 이용한 바이오 에탄올의 제조방법 | |
| RU2764793C1 (ru) | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу, содержащий в составе хромосомы синтетический ген MANS | |
| RU2736440C1 (ru) | Дрожжи Komagataella kurtzmanii - рекомбинантный продуцент бета-глюканазы | |
| Kim et al. | The construction of a stable starch-fermenting yeast strain using genetic engineering and rare-mating | |
| RU2736441C1 (ru) | Штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующий бета-глюканазу из Bacillus pumilus и бета-глюканазу из Paenibacillus jamilae |