RU2713340C1 - Monoclonal antibodies specific to various strains of respiratory syncytial virus - Google Patents
Monoclonal antibodies specific to various strains of respiratory syncytial virus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2713340C1 RU2713340C1 RU2018147428A RU2018147428A RU2713340C1 RU 2713340 C1 RU2713340 C1 RU 2713340C1 RU 2018147428 A RU2018147428 A RU 2018147428A RU 2018147428 A RU2018147428 A RU 2018147428A RU 2713340 C1 RU2713340 C1 RU 2713340C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rsv
- monoclonal antibodies
- protein
- producing
- syncytial virus
- Prior art date
Links
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 title claims abstract description 89
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims abstract description 5
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 16
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 12
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 6
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- FXAGBTBXSJBNMD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FXAGBTBXSJBNMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000884 Airway Obstruction Diseases 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010066091 Bronchial Hyperreactivity Diseases 0.000 description 1
- 206010006440 Bronchial obstruction Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000014085 Chronic respiratory disease Diseases 0.000 description 1
- 101100272852 Clostridium botulinum (strain Langeland / NCTC 10281 / Type F) F gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000008745 Healthcare-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000027771 Obstructive airways disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 1
- 241001168730 Simo Species 0.000 description 1
- 206010044314 Tracheobronchitis Diseases 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108010088716 attachment protein G Proteins 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000036427 bronchial hyperreactivity Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000012774 diagnostic algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к моноклональным антителам, специфичным к различным штаммам респираторно-синцитиального вируса, в частности, полученным с помощью гибридомы, и могут быть использованы в диагностике, в частности, в диагностических тест-системах.The invention relates to monoclonal antibodies specific for various strains of the respiratory syncytial virus, in particular obtained using a hybridoma, and can be used in diagnosis, in particular in diagnostic test systems.
По оценкам ВОЗ ежегодные эпидемии сезонных заболеваний приводят к 3–5 миллионам случаев тяжёлой болезни и 250 000–500 000 случаев смерти во всём мире. Вирусы, вызывающие простудные заболевания, легко передаются от человека человеку воздушно-капельным путём при выделении инфицированными людьми мельчайших частиц во время кашля или чихания. При этом вирус имеет тенденцию быстро распространяться, вызывая сезонные эпидемии. Большинство инфицированных людей выздоравливает за одну-две недели без какого-либо лечения. Однако для детей, пожилых людей и людей, страдающих серьёзными заболеваниями, такие вирусы представляют опасность — они могут привести к осложнениям основных заболеваний, развитию пневмонии и смерти (WHO, 2017).According to WHO estimates, annual epidemics of seasonal diseases result in 3-5 million cases of serious illness and 250,000-500,000 deaths worldwide. Viruses that cause colds are easily transmitted from person to person by airborne droplets when tiny particles are released by infected people during coughing or sneezing. However, the virus tends to spread rapidly, causing seasonal epidemics. Most infected people recover in one to two weeks without any treatment. However, for children, the elderly and people suffering from serious diseases, such viruses are dangerous - they can lead to complications of the underlying diseases, the development of pneumonia and death (WHO, 2017).
Основными причинами ОРВИ у детей и взрослых являются вирусы гриппа (ВГ) типов A, B и C; вирус парагриппа (ВПГ) типов 1, 2 и 3; респираторно-синцитиальный вирус (РСВ); аденовирус (АВ) и риновирус. Все упомянутые вирусы могут вызвать как инфекцию верхних, так и нижних дыхательных путей, кроме того имеют сходные клинические проявления и зачастую не могут быть различены без специальной лабораторной диагностики (Mahony et al., 2011).The main causes of acute respiratory viral infections in children and adults are influenza viruses (HS) types A, B and C; parainfluenza virus (HSV) types 1, 2 and 3; respiratory syncytial virus (RSV); adenovirus (AB) and rhinovirus. All the viruses mentioned can cause infection of the upper and lower respiratory tract, in addition, they have similar clinical manifestations and often cannot be distinguished without special laboratory diagnostics (Mahony et al., 2011).
Острые респираторные заболевания занимают ведущее место в структуре инфекционных болезней человека и обуславливают 20–50% временных потерь трудоспособности. Экономический ущерб от ОРЗ можно сравнить лишь с затратами на профилактику и лечение длительно текущих сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний.Acute respiratory diseases occupy a leading place in the structure of human infectious diseases and account for 20-50% of temporary disability. The economic damage from acute respiratory infections can only be compared with the costs of the prevention and treatment of long-term cardiovascular and oncological diseases.
Наиболее важное место в развитии патологии дыхательных путей занимают вирусы гриппа и парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы.The most important place in the development of pathology of the respiratory tract is occupied by influenza and parainfluenza viruses, respiratory syncytial virus, adenoviruses.
В большинстве случаев заболевания, вызванные этими патогенами, имеют благоприятное течение в виде заболеваний верхних дыхательных путей. Однако у части пациентов, особенно при наличии иммуносупрессии, а также у детей младшего возраста, эти вирусы вызывают осложнённое течение заболевания.In most cases, diseases caused by these pathogens have a favorable course in the form of diseases of the upper respiratory tract. However, in some patients, especially in the presence of immunosuppression, as well as in young children, these viruses cause a complicated course of the disease.
Респираторные вирусы способны выступать в качестве пусковых механизмов возникновения гиперреактивности бронхов, обструкции дыхательных путей и атопий, что способствует формированию хронических обструктивных заболеваний лёгких, включая бронхиальную астму (БА) (Matsumoto & Inoue, 2014). Так, при обострении БА наличие РСВ, ПГ 1 и 3 типов, АВ или вирусов гриппа А или В детектировали в 10–85% случаев у детей и до 44–74% у взрослых (Message et al., 2004; Чучалин и др., 2007; Westerly & Peebles, 2010; Kurai et al., 2013).Respiratory viruses can act as triggers for bronchial hyperreactivity, airway obstruction, and atopy, which contributes to the formation of chronic obstructive pulmonary diseases, including bronchial asthma (BA) (Matsumoto & Inoue, 2014). Thus, with an exacerbation of AD, the presence of RSV, types 1 and 3 GHGs, AV, or influenza A or B viruses was detected in 10–85% of cases in children and up to 44–74% in adults (Message et al., 2004; Chuchalin et al. , 2007; Westerly & Peebles, 2010; Kurai et al., 2013).
Респираторные вирусы являются частой причиной внутрибольничных пневмоний: в 17%, 6% и 4% случаев детектировали РСВ, вирусы парагриппа и гриппа, соответственно (Ning et al., 2017; Walter & Wunderink, 2017).Respiratory viruses are a common cause of nosocomial pneumonia: in 17%, 6% and 4% of cases, RSV, parainfluenza and influenza viruses were detected, respectively (Ning et al., 2017; Walter & Wunderink, 2017).
Дифференциальная диагностика респираторных инфекций необходима для осуществления надзора за заболеваемостью и назначения своевременной терапии, поскольку многие препараты эффективны только на ранних стадиях инфекции. Понимание истинной причины заболевания помогает избежать ненужного использования антибиотиков, которые часто назначают пациентам, инфицированным респираторными вирусами. Быстрое и достоверное обнаружение респираторных патогенов позволяет врачам избежать возникновения внутрибольничных заболеваний, а также прогнозировать возможные осложнения и иммунопатологические явления, которые могут возникнуть при этих инфекциях. Использование точных диагностических тестов даёт возможность клиницистам своевременно поставить диагноз и выявить группы риска. В диагностическом алгоритме должны быть использованы маркеры-индикаторы присоединения бактериальной инфекции. Своевременная дифференциальная диагностика вирусной и бактериальной инфекций особенно актуальна для детей при схожести симптоматики заболеваний, которые могут приводить к неблагоприятному исходу, особенно в группах риска.Differential diagnosis of respiratory infections is necessary to monitor the incidence and prescribe timely therapy, since many drugs are effective only in the early stages of infection. Understanding the true cause of the disease helps to avoid the unnecessary use of antibiotics, which are often prescribed to patients infected with respiratory viruses. The rapid and reliable detection of respiratory pathogens allows doctors to avoid the occurrence of nosocomial diseases, as well as to predict possible complications and immunopathological phenomena that may occur with these infections. The use of accurate diagnostic tests enables clinicians to make timely diagnoses and identify risk groups. In the diagnostic algorithm, marker indicators of the attachment of a bacterial infection should be used. Timely differential diagnosis of viral and bacterial infections is especially relevant for children with similar symptoms of diseases that can lead to an unfavorable outcome, especially in risk groups.
Использование при конструировании диагностических тест-систем моноклональных антител (МКА), специфичных к вирусам ОРЗ, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность анализа, а также выбор правильной схемы лечения.The use of monoclonal antibodies (MABs) specific for ARI viruses in the design of diagnostic test systems provides high sensitivity and specificity of the analysis, as well as the choice of the correct treatment regimen.
Выбор мишеней, к которым должны быть направлены МКА, определяется представительством антигенных детерминант в составе самого вируса и в исследуемых клинических материалах, а также степенью консервативности/вариабельности сайтов-мишеней.The choice of targets to which MCAs should be directed is determined by the representation of antigenic determinants in the composition of the virus and in the studied clinical materials, as well as the degree of conservatism / variability of the target sites.
В соответствии с данными литературы о приоритетной роли РСВ в структуре как острых, так и хронических респираторных заболеваний, именно к этому вирусу была получена панель МКА с целью создания диагностической тест-системы на основе ИФА.In accordance with the literature on the priority role of RSV in the structure of both acute and chronic respiratory diseases, it was to this virus that the MCA panel was obtained with the aim of creating a diagnostic test system based on ELISA.
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) и РСВ-инфекция (РСВИ)Respiratory syncytial virus (RSV) and RSV infection (RSVI)
РСВИ играет чрезвычайно важную роль в структуре инфекционной патологии дыхательного тракта, особенно у детей первых лет жизни. Заболеваемость РСВИ может превышать таковую, наблюдаемую для гриппа (Lee et al., 2013; Matias et al., 2014). 70% детей переносят РСВИ в возрасте до 1 года, и практически каждый инфицируется в течение первых трёх лет. В развитых индустриальных странах у детей в возрасте до 3 лет, госпитализированных с острыми респираторными заболеваниями с поражением нижних отделов дыхательного тракта, частота диагностирования РСВИ достигает 42–63%. При этом РСВ является причиной 50–90% бронхиолитов, 5–40% пневмоний, 10–30% трахеобронхитов. Согласно метаанализу мировой литературы в развитых странах среди детей, госпитализированных с РСВИ, смертность составляет в среднем 1% (Simoes & Carbonell-Estrany, 2003; Nair et al., 2010; Karron, 2012; Borchers et al., 2013; Bont et al., 2016). Среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет с осложнённым анамнезом летальность может достигать 37% (Welliver et al., 2010). Преклонный возраст также является фактором риска тяжёлого течения РСВИ (Lee et al., 2013; Branche & Falsey, 2015).RSVI plays an extremely important role in the structure of infectious pathology of the respiratory tract, especially in children of the first years of life. The incidence of RSVI may exceed that observed for influenza (Lee et al., 2013; Matias et al., 2014). 70% of children undergo RSVI before the age of 1 year, and almost everyone becomes infected during the first three years. In developed industrial countries, children under the age of 3 years hospitalized with acute respiratory infections with damage to the lower respiratory tract, the diagnosis rate of RSVI reaches 42–63%. At the same time, RSV is the cause of 50–90% of bronchiolitis, 5–40% of pneumonia, 10–30% of tracheobronchitis. According to a meta-analysis of world literature in developed countries among children hospitalized with RSVI, mortality is an average of 1% (Simoes & Carbonell-Estrany, 2003; Nair et al., 2010; Karron, 2012; Borchers et al., 2013; Bont et al ., 2016). Among hospitalized patients under the age of 18 years with a complicated history, mortality can reach 37% (Welliver et al., 2010). Old age is also a risk factor for severe RSVI (Lee et al., 2013; Branche & Falsey, 2015).
РСВ является мощным иммуномодулятором и оказывает выраженное иммуносупрессорное действие (Mukherjee et al., 2013; Varga et al., 2013; Gomez et al., 2014). В этой связи индуцируемый им иммунный ответ зачастую оказывает слабое и кратковременное протективное действие, что обуславливает осложнённое течение РСВИ и реинфекции, которые наблюдаются у людей на протяжении всей жизни.RSV is a powerful immunomodulator and has a pronounced immunosuppressive effect (Mukherjee et al., 2013; Varga et al., 2013; Gomez et al., 2014). In this regard, the immune response induced by him often has a weak and short-term protective effect, which leads to the complicated course of RSVI and reinfection, which are observed in people throughout life.
РСВ в значительно большей степени, чем другие часто встречающиеся респираторные вирусы, способствует развитию иммунопатологических проявлений, в том числе обструкции нижних дыхательных путей (Falsey et al., 1995; Byeon et al., 2009), что является специфическим фактором риска, особенно для новорождённых. До 70% детей в возрасте до 1 года, госпитализированных с бронхиолитами, обусловленными РСВ, подвержены рецидивирующим эпизодам бронхообструкции в течение последующих 6–12 лет (Hyvärinen et al., 2007), что связано с риском развития в дальнейшем бронхиальной астмы (Feldman et al., 2015). РСВ у взрослых с неблагоприятным преморбидным фоном способствует развитию хронических лёгочных заболеваний — хронической обструктивной болезни лёгких и бронхиальной астмы (Чучалин и др., 2007). При обследовании пациентов с хронической бронхолёгочной патологией, в частности с бронхиальной астмой, ухудшение общего состояния в 50% случаев вызвано РСВИ (Кривицкая и др., 2015). РСВИ представляет большую опасность для реципиентов костного мозга (Lehners et al., 2016). Частота летальных исходов от РСВИ, регистрируемая среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет, составляет около 37% при осложнённом анамнезе (Welliver et al., 2010).RSV, to a much greater extent than other common respiratory viruses, contributes to the development of immunopathological manifestations, including lower airway obstruction (Falsey et al., 1995; Byeon et al., 2009), which is a specific risk factor, especially for newborns . Up to 70% of children under the age of 1 year who are hospitalized with bronchiolitis due to RSV are prone to recurrent episodes of bronchial obstruction over the next 6–12 years (Hyvärinen et al., 2007), which is associated with the risk of further development of bronchial asthma (Feldman et al ., 2015). RSV in adults with an unfavorable premorbid background contributes to the development of chronic pulmonary diseases - chronic obstructive pulmonary disease and bronchial asthma (Chuchalin et al., 2007). When examining patients with chronic bronchopulmonary pathology, in particular with bronchial asthma, general condition deterioration in 50% of cases was caused by RSVI (Krivitskaya et al., 2015). RSVI is very dangerous for bone marrow recipients (Lehners et al., 2016). The frequency of deaths from RSVI recorded among hospitalized patients under the age of 18 is about 37% with a complicated history (Welliver et al., 2010).
РСВ человека относятся к роду Pneumovirus семейства Paramyxoviridae. Вирионы содержат несегментированную однонитевую антисмысловую минус-РНК. Оболочку вириона составляют 2 основных трансмембранных гликопротеина: белок присоединения G (attachment protein) и белок слияния F (fusion protein), которые являются основными индукторами синтеза РСВ-нейтрализующих антител. РСВ человека существует в виде одного серотипа, но состоит из двух антигенных групп (А и В), что было установлено на основании различий в реагировании МКА (Anderson et al., 1985). Изоляты РСВ из различных групп отличаются генетически. Степень межгрупповых (А/В) отличий в аминокислотных последовательностях (АП) очень сильно варьирует для белков РСВ. Для наиболее консервативных F- и N-белков (внутренний белок, элемент кора вириона) показано до 91% и 96% гомологии АП, соответственно. Наиболее вариабельным из всех является G-белок — только 53–58% гомологии АП между эталонными штаммами РСВ-А и РСВ-В (Collins et al., 2001; Collins & Karron, 2013).Human RSVs belong to the genus Pneumovirus of the Paramyxoviridae family. Virions contain unsegmented single-stranded antisense minus RNA. The shell of the virion is composed of 2 main transmembrane glycoproteins: the attachment protein G and the fusion protein F, which are the main inducers of the synthesis of PCB neutralizing antibodies. Human RSV exists in the form of one serotype, but consists of two antigenic groups (A and B), which was established on the basis of differences in the response of MCA (Anderson et al., 1985). RSV isolates from different groups differ genetically. The degree of intergroup (A / B) differences in amino acid sequences (AP) varies greatly for RSV proteins. Up to 91% and 96% AP homology are shown for the most conservative F and N proteins (internal protein, virion core element), respectively. The most variable of all is G-protein - only 53–58% of AP homology between the RSV-A and RSV-B reference strains (Collins et al., 2001; Collins & Karron, 2013).
С учётом представленных данных наиболее рациональным для выявления РСВ представляется использование МКА к консервативному F-белку.Based on the data presented, the most rational for detecting RSV seems to be the use of MCA for a conservative F-protein.
Ранее в документе RU 2371726 были описаны антитела к РСВ в составе диагностической тест-системы на основе ИФА для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота, однако данные антитела не характеризовались высокой специфичностью именно к РСВ и не были предназначены для диагностики человеческой инфекции.Earlier, RU 2371726 described antibodies to RSV as part of an ELISA diagnostic test system for determining the level of antibodies to viral respiratory diseases of cattle, however, these antibodies were not characterized by high specificity specifically for RSV and were not intended for the diagnosis of human infection.
Таким образом, проблема получения антител, которые бы имели высокую специфичность именно к РСВ, в частности, к группам А и В, и не имели бы специфичности к другим вирусам, является крайне актуальной.Thus, the problem of obtaining antibodies that would have high specificity specifically for RSV, in particular, to groups A and B, and would not have specificity for other viruses, is extremely urgent.
На Фиг. 1 показана схема получения гибридом — продуцентов МКА.In FIG. 1 shows a scheme for producing hybridomas - producers of MCA.
На Фиг. 2 приведена сенсограмма взаимодействия моноклональных антител клона 10G6 с анализируемым штаммом респираторно-синцитиального вируса.In FIG. Figure 2 shows a sensogram of the interaction of monoclonal antibodies of clone 10G6 with the analyzed strain of the respiratory syncytial virus.
На Фиг. 3 представлена диаграмма аффинности моноклональных антител клона 10G6 к респираторно-синцитиальному вирусу.In FIG. 3 is an affinity diagram of monoclonal antibodies of clone 10G6 for respiratory syncytial virus.
Описание изобретенияDescription of the invention
Данное изобретение описывает моноклональные антитела, специфичные к штаммам респираторно-синцитиального вируса, относящимся к группам А и В, и имеющие высокую специфичность к F-белку. При этом данные антитела представляют собой антитела IgG типа, в частности, мышиные моноклональные антитела.This invention describes monoclonal antibodies specific for respiratory syncytial virus strains belonging to groups A and B and having high specificity for the F protein. Moreover, these antibodies are IgG antibodies of the type, in particular, murine monoclonal antibodies.
Описанные антитела могут быть получены способом, включающим:The described antibodies can be obtained by a method including:
- получение антитело-продуцирующих спленоцитов;- obtaining antibody-producing splenocytes;
- накопление клеток мышиной миеломы;- accumulation of mouse myeloma cells;
- слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками;- fusion of antibody-producing splenocytes with myeloma cells;
- отбор гибридом;- selection of hybridomas;
- введение гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей;- the introduction of hybridomas into the abdominal cavity of mice primed by the pier;
- накопление моноклональных антител в асцитах;- accumulation of monoclonal antibodies in ascites;
- очистка полученных моноклональных антител.- purification of the obtained monoclonal antibodies.
Для получения и накопления антител могут быть использованы специально полученные гибридомы-продуценты моноклональных антител, направленных к F-белку респираторно-синцитиального вируса групп А и В. Такие гибридомы как представители гибридом-продуцентов моноклональных антител, направленных к F-белку респираторно-синцитиального вируса групп А и В, были депонированы как 11G4/RS под номером РККК(П) 786Д, и как 10G6/RS под номером РККК(П) 784Д в Специализированную коллекцию культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ФГБУН Института цитологии РАН, соответственно.To obtain and accumulate antibodies, specially prepared hybridomas producing monoclonal antibodies directed to the F protein of respiratory syncytial virus groups A and B can be used. Such hybridomas as representatives of hybridomas producing monoclonal antibodies directed to the F protein of respiratory syncytial virus groups A and B, were deposited as 11G4 / RS under the number of RKKK (P) 786D, and as 10G6 / RS under the number of RKKK (P) 784D in the Specialized Collection of Cell Culture CCP “Collection of Vertebrate Cell Cultures” of the Institute of Cytogenesis Logies of the Russian Academy of Sciences, respectively.
Моноклональные антитела согласно изобретению могут быть использованы для идентификации респираторно-синцитиального вируса групп А и В, в частности, в диагностических тест-системах.Monoclonal antibodies according to the invention can be used to identify respiratory syncytial virus of groups A and B, in particular, in diagnostic test systems.
Более подробно получение и анализ указанных моноклональных антител иллюстрируют примеры, приведённые ниже.In more detail, the preparation and analysis of these monoclonal antibodies is illustrated by the examples below.
ПримерыExamples
Пример 1Example 1
Получение МКА к белкам респираторно-синцитиального вирусаObtaining MCA for respiratory syncytial virus proteins
Процесс получения гибридом-продуцентов МКА к консервативным эпитопам в составе респираторно-синцитиального вируса состоял из нескольких стадий.The process of obtaining hybridoma-producing MCAs for conservative epitopes in the respiratory syncytial virus consisted of several stages.
Стадия 1. Очистка вирусов, предназначенных для использования в качестве иммуногена.Stage 1. Purification of viruses intended for use as an immunogen.
Эталонный штамм РСВ, принадлежащий к антигенной группе Long (группа А), полученный из National Institute for Medical Research (Лондон), культивировали в перевиваемой клеточной культуре МА-104 (эпителиальные клетки почки обезьяны) в течение 5–7 суток. В качестве поддерживающей бессывороточной среды использовали среду alpha-МЕМ («Биолот», Россия). Вируссодержащую культуральную жидкость использовали для очистки и концентрации вируса путём ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы по методу Orvell (Orvell et al., 1978). Для этого вирусы из культуральной среды осаждали ультрацентрифугированием при 50 000 g в течение 2 ч, суспендировали в малом количестве 10 мМ трис-ЭДТА буфера, рН 7,2 (STE) и производили очистку через градиент 20–60% сахарозы ультрацентрифугированием при 100 000 g в течение 2,5 ч с последующим осаждением вируса из зоны 36–40% сахарозы на дно при 120 000 g в течение 1 ч. Осадок ресуспендировали в STE. Содержание белка в очищенном вирусном материале определяли с использованием набора “Pierce BCA Protein assay kit” (“Thermo Fisher Scientific”, США). Наличие вирусной контаминации и целостность полученных вирионов контролировали с помощью электронной микроскопии. Полученные цельновирионные вирусные суспензии хранили при –80°С.The RSV reference strain belonging to the Long antigenic group (Group A), obtained from the National Institute for Medical Research (London), was cultured in an MA-104 transplanted cell culture (monkey kidney epithelial cells) for 5–7 days. Alpha-MEM medium (Biolot, Russia) was used as a maintenance-free serum-free medium. Virus-containing culture fluid was used for purification and concentration of the virus by ultracentrifugation in a sucrose density gradient according to the Orvell method (Orvell et al., 1978). For this, viruses from the culture medium were besieged by ultracentrifugation at 50,000 g for 2 h, suspended in a small amount of 10 mM Tris-EDTA buffer, pH 7.2 (STE), and purification was performed through a 20-60% sucrose gradient by ultracentrifugation at 100,000 g for 2.5 hours, followed by precipitation of the virus from the zone of 36–40% sucrose to the bottom at 120,000 g for 1 hour. The sediment was resuspended in STE. The protein content in the purified viral material was determined using the Pierce BCA Protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, USA). The presence of viral contamination and the integrity of the resulting virions were monitored by electron microscopy. The resulting whole-virus viral suspensions were stored at –80 ° C.
Стадия 2. Получение антитело-продуцирующих спленоцитов в результате иммунизации мышей соответствующим антигеном под контролем образования специфических сывороточных антител в ИФА.Stage 2. Obtaining antibody-producing splenocytes as a result of immunization of mice with an appropriate antigen under the control of the formation of specific serum antibodies in ELISA.
Мышей линии BALB/c иммунизировали очищенным антигеном, полученным на стадии 1, смешанным с неполным адъювантом Фрейнда путём внутрибрюшинного введения (иммунизации) очищенного ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы антигена РСВ в концентрации 50–100 мкг/мл (по 1 мл на мышь). Затем проводили мониторинг иммунизированных животных на образование специфических антител. Животных с достаточно высоким титром антител отбирали в качестве источника антитело-продуцирующих клеток.BALB / c mice were immunized with the purified antigen obtained in stage 1 mixed with incomplete Freund's adjuvant by intraperitoneal administration (immunization) of RSV antigen at a concentration of 50-100 μg / ml (1 ml per mouse) purified by ultracentrifugation in a sucrose density gradient. Then, immunized animals were monitored for the formation of specific antibodies. Animals with a sufficiently high antibody titer were selected as the source of antibody-producing cells.
Инъекции антигенов проводили двукратно с интервалом в 5 недель. Спустя 7 дней после каждой иммунизации из ретробульбарного синуса мышей брали пробы крови для определения титра сывороточных антител против гомологичного РСВ или рекомбинантного белка в ИФА. Через две недели после последней иммунизации мышей, имевших по данным ИФА антитела в титре 1:10000, бустировали антигеном, полученным на стадии 1, или рекомбинантным белком.Injections of antigens were performed twice with an interval of 5 weeks. 7 days after each immunization, blood samples were taken from the retrobulbar sinus of mice to determine the titer of serum antibodies against homologous RSV or recombinant protein in ELISA. Two weeks after the last immunization, mice that had, according to ELISA, antibodies in a titer of 1: 10000, were boosted with the antigen obtained in stage 1, or a recombinant protein.
Стадия 3. Определение титра сывороточных антител в ИФА.Stage 3. Determination of titer of serum antibodies in ELISA.
Очищенный концентрат РСВ сорбировали на твёрдой поверхности (96-луночный планшет для ИФА) в концентрации 1–5 мкг/мл. После промывания планшета в лунки с сорбированным антигеном вносили серийные двукратные разведения сыворотки от иммунизированной мыши (от 1:10 до 1:20480) и инкубировали в течение часа при температуре 37°C. Для выявления сформированного комплекса антигена с антителом добавляли антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (HRP). После промывания в планшет добавляли субстратную смесь для фермента. В качестве субстрата на стадии детекции использовали раствор ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) в концентрации 100 мкг/мл с 0,03% Н2О2. Титр антител оценивали по изменению оптической плотности раствора, регистрируемой спектрофотометрически на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.The purified RSV concentrate was sorbed on a solid surface (96-well ELISA plate) at a concentration of 1–5 μg / ml. After washing the tablet, serial two-fold dilutions of serum from the immunized mouse (from 1:10 to 1: 20480) were added to the wells with the sorbed antigen and incubated for one hour at 37 ° C. To identify the formed antigen-antibody complex, anti-mouse IgG antibodies labeled with horseradish peroxidase (HRP) were added. After washing, an enzyme substrate mixture was added to the plate. A solution of TMB (3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine) at a concentration of 100 μg / ml with 0.03% H 2 O 2 was used as a substrate at the detection stage. The antibody titer was evaluated by the change in the optical density of the solution, recorded spectrophotometrically on a Multiscan FC photometer at a wavelength of 450 nm.
Стадия 4. Накопление клеток мышиной миеломы.Stage 4. The accumulation of cells of murine myeloma.
Через 3 дня после бустер-иммунизации мышь использовали в качестве донора лимфоцитов селезёнки для слияния с клетками мышиной миеломы в целях получения гибридом (Новохатский и др., 1985; Новиков и др., 1988). Для этого проводили гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы в присутствии 50% ПЭГ-2000. В качестве партнёра для слияния при получении гибридом использовали культуру клеток мышиной миеломы линии Х63Аg8.653, адаптированную к росту в среде с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), полученную из коллекции ФГБУ «РНЦРХТ». Данный штамм является устойчивым к 8-азагуанину, то есть дефектным по гену гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы.3 days after booster immunization, the mouse was used as a spleen lymphocyte donor to fuse with mouse myeloma cells in order to obtain hybridomas (Novokhatsky et al., 1985; Novikov et al., 1988). For this, splenocytes of immunized mice were hybridized with mouse myeloma cells in the presence of 50% PEG-2000. As a partner for fusion, the hybridomas were obtained using the X63Ag8.653 mouse murine myeloma cell culture adapted for growth in medium supplemented with cattle blood serum (RED) obtained from the collection of the Federal State Budget Scientific Center for Scientific Research and Development. This strain is resistant to 8-azaguanine, that is, deficient in the hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase gene.
Выбранную клеточную линию культивировали на среде RPMI-1640 c добавлением глутамина, 2-меркаптоэтанола (МЭ), гентамицина и сыворотки КРС для обеспечения в день слияния со спленоцитами плотности популяции не менее 2×107 клеток/мл. Культивирование миеломы осуществляли в пластиковых культуральных планшетах или во флаконах производства “Sarstedt” или “Nunc” (Германия, США). Клетки размножали при температуре 36–37°С и 100% влажности в атмосфере воздуха с 5–7% СО2. Базовая культуральная среда содержала 90% RPMI-1640 и 10% сыворотки КРС («Биолот», Санкт-Петербург).The selected cell line was cultured on RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol (ME), gentamicin and cattle serum to ensure a population density of at least 2 × 10 7 cells / ml on the day of fusion with splenocytes. Myeloma was cultured in plastic culture plates or in bottles of Sarstedt or Nunc production (Germany, USA). Cells were propagated at a temperature of 36–37 ° С and 100% humidity in an air atmosphere with 5–7% СО 2 . The basic culture medium contained 90% RPMI-1640 and 10% cattle serum (Biolot, St. Petersburg).
Стадия 5. Слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками.Stage 5. The fusion of antibody-producing splenocytes with myeloma cells.
Для получения антитело-продуцирующих клеток у мышей с высокими титрами специфических антител через 3–4 дня после последней бустер-иммунизации удаляли селезёнку и вымывали из неё спленоциты бессывороточной средой (такой как RPMI-1640) или забуференным физиологическим раствором, после чего их смешивали с миеломными клетками в соотношении от 5:1 до 10:1. Затем клетки центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин), осадок разрыхляли, после чего, перемешивая, по каплям добавляли 1 мл бессывороточной среды, содержащей 50% (масс/об) ПЭГ (молекулярный вес 1000–4000 Да). Затем медленно добавляли 10 мл бессывороточной среды, после чего смесь центрифугировали.To obtain antibody-producing cells in mice with high titers of specific antibodies 3-4 days after the last booster immunization, the spleen was removed and splenocytes were washed out of it with serum-free medium (such as RPMI-1640) or buffered saline, after which they were mixed with myeloma cells in a ratio of 5: 1 to 10: 1. Then, the cells were centrifuged (10 min, 1000 rpm), the pellet was loosened, and then, while stirring, 1 ml of serum-free medium containing 50% (w / v) PEG (
Осаждённые клетки суспендировали в соответствующем количестве селективной НАТ-среды. Затем клетки переносили в селективную НАТ-среду, приготовленную на основе RPMI-1640 и 20% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) с добавлением гипоксантина (10–4 М), аминоптерина (4×10–7 М) и тимидина (1,6×10–5 М) производства “Sigma-Aldrich” (США), а также 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (“Sigma-Aldrich”, США), 1 мг/л амфотерицина В и 50 мг/л гентамицина. Суспензию распределяли по ячейкам 96-луночных планшетов для культивирования, содержащих трёхсуточную культуру мышиных макрофагов, и инкубировали в атмосфере 5–7% СО2 при температуре 37°С в течение 3 недель. После 10 суток культивирования НАТ-среду заменяли на более щадящую НТ-среду, а после 20 суток культуры поддерживали на среде RPMI-1640 с СКРС. Для удаления иммуноглобулинов, секретированных неслившимися спленоцитами мышей, культуральную жидкость из ячеек с растущими гибридами отбирали на 5–6, затем 10–12 и на 16–17 дни после слияния.The precipitated cells were suspended in an appropriate amount of selective NAT medium. Then, the cells were transferred to a selective NAT medium prepared on the basis of RPMI-1640 and 20% cattle serum (SCRS) supplemented with hypoxanthine ( 10–4 M), aminopterin (4 × 10–7 M) and thymidine (1.6 × 10–5 M) manufactured by Sigma-Aldrich (USA), as well as 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate (Sigma-Aldrich, USA), 1 mg / l amphotericin B and 50 mg / l gentamicin. The suspension was distributed into the cells of 96-well culture plates containing a three-day culture of mouse macrophages and incubated in an atmosphere of 5-7% CO 2 at a temperature of 37 ° C for 3 weeks. After 10 days of cultivation, the NAT medium was replaced with a more gentle NT medium, and after 20 days the cultures were maintained on RPMI-1640 medium with SCRS. To remove immunoglobulins secreted by mouse splenocytes which did not fuse, culture fluid from cells with growing hybrids was taken 5–6, then 10–12, and 16–17 days after fusion.
Стадия 6. Отбор гибридом.Stage 6. Selection by hybrid.
Поскольку используемый штамм миеломы резистентен к 8-азагуанину, он является дефектным по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазе, и любые не слитые с лимфоцитами миеломные клетки и любые гибриды миелома-миелома не способны выживать в среде НАТ. С другой стороны, гибриды антителообразующих клеток друг с другом, а также гибридомы, образованные антителопродуцирующими и миеломными клетками, могут выживать в этой среде, причём гибриды спленоцитов друг с другом имеют ограниченное время жизни (на протяжении 3–4 пассажей) и отмирают в ходе культивирования, тогда как гибридомы спленоцитов с миеломными клетками (СМ) способны к неограниченному размножению.Since the myeloma strain used is resistant to 8-azaguanine, it is defective in the hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase enzyme, and any myeloma cells and any myeloma-myeloma hybrids that are not fused with lymphocytes cannot survive in NAT medium. On the other hand, hybrids of antibody-forming cells with each other, as well as hybridomas formed by antibody-producing and myeloma cells, can survive in this environment, and hybrids of splenocytes with each other have a limited life time (3-4 passages) and die during cultivation whereas hybridomas of splenocytes with myeloma cells (SM) are capable of unlimited reproduction.
Стадия 7. Реклонирование и криоконсервирование гибридом.Stage 7. Reclonation and cryopreservation of hybridomas.
Скрининг гибридом проводили методом твердофазного ИФА. Из большого числа активно размножающихся гибридом отбирали гибридомы, активно продуцирующие противовирусные антитела. Для этого в супернатантах гибридом определяли титры специфических антител к вирусу-иммуногену в ИФА. Вирусным материалом (очищенные концентраты), разведённым карбонатно-бикарбонатным буфером (КББ) до концентрации 2–5 мкг/мл, сенсибилизировали планшеты в течение 18 часов при температуре 4°С. После отмывания несвязавшегося антигенного материала 0,01 М фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением 0,05% Tween 20 (PBS-T), рН 7,2 вносили культуральную жидкость в PBS-T в разведении 1:10 (при тестировании субклонов в 2-х повторах) и инкубировали 1 час при 37°С. Связавшиеся с антигеном антитела детектировали с помощью пероксидазных конъюгатов антител к IgG мыши (“Sigma-Aldrich”, США) в PBS-T в течение 1 часа при температуре 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% Н2О2 в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0. После остановки реакции 2N H2SO4 оптическую плотность измеряли на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.Hybridomas were screened by ELISA. From a large number of actively propagating hybridomas, hybridomas actively producing antiviral antibodies were selected. For this, titers of specific antibodies to the immunogen virus in ELISA were determined in hybridoma supernatants. Viral material (purified concentrates), diluted with carbonate-bicarbonate buffer (CBB) to a concentration of 2-5 μg / ml, sensitized the plates for 18 hours at a temperature of 4 ° C. After washing the unbound antigenic material with 0.01 M phosphate-buffered saline (PBS) with the addition of 0.05% Tween 20 (PBS-T), pH 7.2, the culture fluid was added to PBS-T at a 1:10 dilution (when testing subclones in 2 repetitions) and incubated for 1 hour at 37 ° C. Antigen-bound antibodies were detected using peroxidase conjugated anti-mouse IgG antibodies (Sigma-Aldrich, United States) in PBS-T for 1 hour at 37 ° C. The peroxidase reaction was manifested by adding a substrate mixture containing 0.1 mg / ml 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine (TMB) and 0.02% H 2 O 2 in acetate citrate buffer, pH 5.0. After stopping the reaction of 2N H 2 SO 4, the optical density was measured on a Multiscan FC photometer at a wavelength of 450 nm.
Для последующего клонирования отобранных гибридом СМ использовали метод предельных разведений. Клетки гибридомы разводили из расчёта, чтобы на одну лунку планшета приходилось 1–2 клетки, и затем культивировали их, как выше описано, в ростовой среде в инкубаторе с подачей 5–7% СО2 при температуре 36–37°С. Процедуру клонирования повторяли 3–4 раза для каждого избранного клона, продуцирующего специфические антитела. Клоны — стабильные продуценты антител — отбирали для последующего накопления культивированием в ростовой среде с целью накопления клеток в количестве, достаточном для последующего пассажа на сингенных мышах и криоконсервирования.For the subsequent cloning of selected SM hybridomas, the limiting dilution method was used. Hybridoma cells were diluted to have 1–2 cells per well of the plate, and then they were cultured, as described above, in a growth medium in an incubator with a supply of 5–7% CO 2 at a temperature of 36–37 ° С. The cloning procedure was repeated 3-4 times for each selected clone producing specific antibodies. Clones, stable producers of antibodies, were selected for subsequent accumulation by cultivation in growth medium in order to accumulate cells in an amount sufficient for subsequent passage on syngeneic mice and cryopreservation.
Стадия 8. Криоконсервирование гибридом.Stage 8. Cryopreservation of hybridomas.
Криоконсервированию подвергали культуры гибридомных клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, или клетки, выращенные в перитонеальной полости мышей сингенной линии (при получении асцитных жидкостей). Перед замораживанием клетки подвергали микроскопическому анализу на жизнеспособность и бактериологическому исследованию на отсутствие контаминации микрофлорой. Количество живых клеток оценивали по эксклюзии трипанового синего. После центрифугирования при 1000 об/мин концентрацию клеток доводили до 1–2 млн в мл. Для криоконсервирования клеток использовали среду, состоящую из 90% СКРС и 10% ДМСО (“Sigma-Aldrich”, США). Предварительно охлаждённые до температуры –80°С в парах азота криопробирки с клетками помещали в жидкий азот (для многолетнего хранения при температуре –196°С) и хранили в Криобанке гибридом ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.Hybridoma cultures in the logarithmic growth phase or cells grown in the peritoneal cavity of syngeneic line mice (upon receipt of ascites fluids) were cryopreserved. Before freezing, the cells were subjected to microscopic analysis for viability and bacteriological examination for the absence of contamination with microflora. The number of living cells was evaluated by exclusion of trypan blue. After centrifugation at 1000 rpm, the cell concentration was adjusted to 1-2 million per ml. For cryopreservation of cells, a medium consisting of 90% SCRS and 10% DMSO (Sigma-Aldrich, USA) was used. Cryovials with cells that were preliminarily cooled to a temperature of –80 ° C in nitrogen vapors were placed in liquid nitrogen (for long-term storage at a temperature of –196 ° C) and stored in a cryobank with a hybrid FSBI NII named after A.A. Smorodintseva "Ministry of Health of Russia.
Полученные гибридомы были депонированы в специализированную коллекцию культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» 08.11.18 под номером РККК(П) 784Д (гибридома 10G6/RS) и 786Д (гибридома 11G4/RS), соответственно.The resulting hybridomas were deposited in a specialized collection of cell cultures of the CCE “Collection of vertebrate cell cultures” on 08.11.18 under the number RACC (P) 784D (hybridoma 10G6 / RS) and 786D (hybridoma 11G4 / RS), respectively.
Стадия 9. Накопление МКА в асцитах.Stage 9. Accumulation of MCA in ascites.
Асцитные жидкости мышей линии BALB/c, содержащие МКА, секретируемые гибридомой, получали следующим образом. Для этого мышам-реципиентам за 12–14 дней до инокуляции гибридомы вводили внутрибрюшинно 0,5 мл пристана (“Sigma-Aldrich”, США) (Hoogenraad et al., 1983). Восстановленные гибридомы в количестве 5–10 млн инокулировали в брюшную полость праймированных пристаном мышей. Спустя 2–3 недели после образования асцита, контролируемого визуально, делали прокол брюшной стенки и собирали оттекающую жидкость. После центрифугирования асцитов надосадочная жидкость служила источником МКА, а клетки гибридом, прошедшие пассирование на мышах, криоконсервировали. Исследования выполнялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003). Концентрации МКА после очистки составили:The ascitic fluid of BALB / c mice containing MAB secreted by hybridoma was prepared as follows. For this, recipient mice were injected intraperitoneally with 0.5 ml of pristan 12–14 days before inoculation of hybridomas (Sigma-Aldrich, USA) (Hoogenraad et al., 1983). 5–10 million reconstituted hybridomas were inoculated into the abdominal cavity of primed mice. 2-3 weeks after the formation of ascites, which was controlled visually, an abdominal wall was punctured and a flowing fluid was collected. After centrifugation of ascites, the supernatant served as a source of MCA, and hybridoma cells that were passaged in mice were cryopreserved. The studies were carried out in accordance with the "Rules for the use of experimental animals" (order No. 266 of the Ministry of Health of the Russian Federation dated 06/19/2003). The concentration of MCA after cleaning amounted to:
Клон 10G6 — 4,15 мг/мл,Clone 10G6 - 4.15 mg / ml,
Клон 11G4 — 5,73 мг/мл.Clone 11G4 - 5.73 mg / ml.
В общем виде схема получения гибридом — продуцентов МКА представлена на Фиг. 1.In general terms, the scheme for producing hybridomas producing MCAs is shown in FIG. 1.
Пример 2Example 2
Очистка накопленных моноклональных антител к респираторно-синцитиальному вирусуPurification of accumulated monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
Препараты мышиных МКА перед очисткой представляли собой асцитные жидкости мышей, содержащие МКА, секретируемые клетками отобранной гибридомы. Очистку фракции МКА проводили методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Первый этап очистки МКА методом гидрофобной хроматографии предусматривает удаление большей части белковых примесей из исходных препаратов и получение промежуточных препаратов, содержащих как нативную форму IgG, так и продукты их олигомеризации и деградации. Второй этап очистки предусматривает удаление остаточных белковых примесей, а также агрегатов, димеров и фрагментов IgG из промежуточных препаратов методом гель-фильтрации на колонке с сорбентом высокого разрешения.The preparations of murine MABs before purification were ascites fluids of mice containing MAB secreted by the cells of the selected hybridoma. The MCA fraction was purified by affinity chromatography and gel filtration. The first step in the purification of MCAs by hydrophobic chromatography involves the removal of most of the protein impurities from the starting preparations and the preparation of intermediate preparations containing both the native form of IgG and the products of their oligomerization and degradation. The second stage of purification involves the removal of residual protein impurities, as well as aggregates, dimers and IgG fragments from intermediate preparations by gel filtration on a column with a high resolution sorbent.
Концентрацию IgG определяли при помощи спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (“Thermo Fisher Scientific”, США) в режиме IgG (коэффициент молярной экстинции E 1% = 13,70). Результат анализа очищенных препаратов МКА подтверждали методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли. Гель окрашивали коллоидным кумасси и документировали при помощи системы ChemiDoc MP Imaging System (“Bio-Rad”, США) с последующим денситометрическим анализом. При качественной очистке препарат должен представлять собой две мажорных дорожки — тяжёлая цепь антител представлена на уровне ~ 50 кДа, а лёгкая цепь на уровне ~ 25–30 кДа.IgG concentration was determined using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA) in the IgG mode (molar extinction coefficient E 1% = 13.70). The result of the analysis of purified MCA preparations was confirmed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis according to the Laemmli method. The gel was stained with colloidal Coomassie and documented using a ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad, USA) followed by densitometric analysis. With high-quality purification, the preparation should consist of two major paths - the heavy chain of antibodies is represented at ~ 50 kDa, and the light chain at ~ 25-30 kDa.
Пример 3Example 3
Получение МКА к респираторно-синцитиальному вирусуObtaining MCA for respiratory syncytial virus
Было получено 5 МКА к РСВ (клоны 4F2, 5F3, 5H8, 1H3, 5F8) и были проанализированы их аналитические и диагностические характеристики. Все МКА специфически взаимодействовали в непрямом варианте ИФА с очищенным концентратом вируса-иммуногена (РСВ, эталонный штамм Long), сенсибилизированным на твёрдой фазе, при отсутствии перекрёстного реагирования с гетерологичными респираторными вирусами и клеточными антигенами. Свойства МКА были оценены в различных иммунологических реакциях. Для характеристики направленности полученных МКА был проведен вестерн-блоттинг с использованием в качестве антигена очищенного концентрата РСВ, штамм Long. В случае проведения электрофореза (ЭФ) с РСВ, обработанным в условиях мягкого нагревания при нередуцирующих условиях (нагревание при температуре 37°С без β-меркаптоэтанола (МЭ) в течение 1,5 ч), после иммуноблоттинга все МКА взаимодействовали на мембране с тремя белковыми продуктами с молекулярной массой 130, 110 и 70 кДа. Белку с молекулярной массой 70 кДа соответствует мономер поверхностного F-белка РСВ. Согласно данным литературы, две высокомолекулярные полосы представляют собой олигомерные формы F-гликопротеина РСВ — гомодимерную и гомотримерную. По данным других авторов, высокомолекулярные полосы с близкими молекулярными массами на электрофореграмме соответствуют гетероолигомерам двух поверхностных гликопротеинов РСВ: (мономер F-белка 70 кДа + полностью гликозилированная форма G-белка 90 кДа) и (мономер F-белка 70 кДа + форма G-белка с неполным гликозилированием 55 кДа).5 MCAs for RSV were obtained (clones 4F2, 5F3, 5H8, 1H3, 5F8) and their analytical and diagnostic characteristics were analyzed. All MCAs specifically interacted in an indirect ELISA with a purified concentrate of the immunogen virus (RSV, Long reference strain) sensitized on the solid phase, in the absence of cross-reaction with heterologous respiratory viruses and cellular antigens. The properties of MCAs were evaluated in various immunological reactions. To characterize the directivity of the obtained MCA, Western blotting was performed using purified RSV concentrate, Long strain as an antigen. In the case of electrophoresis (EF) with RSV treated under mild heating under non-reducing conditions (heating at 37 ° C without β-mercaptoethanol (ME) for 1.5 h), after immunoblotting, all MABs interacted on the membrane with three protein products with a molecular weight of 130, 110 and 70 kDa. A protein with a molecular weight of 70 kDa corresponds to the monomer of the surface RSV F protein. According to the literature, two high molecular weight bands are oligomeric forms of PCB F-glycoprotein - homodimeric and homotrimeric. According to other authors, high molecular weight bands with similar molecular weights on the electrophoregram correspond to hetero-oligomers of two surface RSV glycoproteins: (monomer F protein of 70 kDa + fully glycosylated form of G protein of 90 kDa) and (monomer of F protein of 70 kDa + form of G protein with incomplete glycosylation of 55 kDa).
После ЭФ вируса, подвергшегося более жёсткой обработке в нередуцирующих условиях (кипячение 2 мин при температуре 100°С без МЭ), все МКА реагировали на мембране после иммуноблоттинга только с мономерной формой F-белка РСВ (70 кДа), что объясняется распадом олигомеров. С РСВ, обработанным в наиболее жёстких редуцирующих условиях при кипячении в течение 2 мин в присутствии МЭ, МКА не взаимодействовали, что свидетельствует о полном разрушении эпитопа-мишени. Таким образом, результаты иммуноблоттинга свидетельствуют о том, что все полученные МКА взаимодействовали с конформационно лабильными эпитопами, присутствующими как в мономерной, так и в олигомерных формах F-белка РСВ.After the EF of the virus, which was subjected to more stringent processing under non-reducing conditions (boiling for 2 min at 100 ° С without ME), all MABs reacted on the membrane after immunoblotting only with the monomeric form of RSV F protein (70 kDa), which is explained by the decay of oligomers. MCVs did not interact with RSV treated under the most severe reducing conditions during boiling for 2 min in the presence of ME, which indicates complete destruction of the target epitope. Thus, the results of immunoblotting indicate that all obtained MABs interacted with conformationally labile epitopes present in both the monomeric and oligomeric forms of RSV F protein.
Все МКА относились к различным изотипам IgG. МКА 5F8 и 5F3 обладали выраженной вируснейтрализующей активностью (до концентрации 9–26 мкг/мл) по отношению к эталонным штаммам РСВ группы А. Для РСВ группы В этот показатель был значительно ниже. Слабая нейтрализующая активность выявлена также для МКА 5Н8. Остальные МКА не оказывали вируснейтрализующего действия (таблица 1).All MCAs belonged to different IgG isotypes. MCA 5F8 and 5F3 had a pronounced neutralizing activity (up to a concentration of 9–26 μg / ml) in relation to the reference strains of RSV group A. For RSV group B, this indicator was significantly lower. Weak neutralizing activity was also detected for 5H8 MCA. The rest of the MCA did not have a neutralizing effect (table 1).
Примечания: * — конечная концентрация МКА (мкг/мл), при которой наблюдается нейтрализация анализируемого вируса в инфекционной дозе 100 ТЦД50, н/а — не анализировали.Notes: * - final concentration of MCA (μg / ml), at which neutralization of the analyzed virus at an infectious dose of 100 TCD 50 is observed, n / a - not analyzed.
Примечание — степень ингибирования (%):Note - the degree of inhibition (%):
Для характеристики антигенной направленности МКА был проведён конкурентный ИФА с использованием МКА, меченных и не меченных пероксидазой хрена. Результаты анализа представлены в таблице 2.To characterize the antigenic orientation of MAB, a competitive ELISA was conducted using MAB labeled and not labeled with horseradish peroxidase. The results of the analysis are presented in table 2.
Результаты конкурентного ингибирования МКА, меченных и не меченных пероксидазой хрена, показали, что у них наблюдаются следующие особенности взаимодействия с антигеном:The results of competitive inhibition of MCA labeled and not labeled with horseradish peroxidase showed that they have the following features of interaction with the antigen:
1. МКА 5F3, 5H8 и 1H8 не конкурируют друг с другом за связь с F-белком. Однако эти МКА направлены к детерминантам, частично (на 37−51%) общим с сайтом связывания для МКА 4F2.1. MCAs 5F3, 5H8 and 1H8 do not compete with each other for binding to the F protein. However, these MABs are directed to determinants that are partially (37–51%) shared with the binding site for MAB 4F2.
2. Сайт взаимодействия МКА 5F8 не имеет общих детерминант с сайтами связывания всех остальных МКА.2. The interaction site of MCA 5F8 does not have common determinants with the binding sites of all other MCAs.
Для оценки способности полученных новых МКА взаимодействовать со штаммами РСВ, относящимися к различным антигенным группам, был проведён микрокультуральный ИФА (мк-ИФА, in-cell ELISA) с использованием монослойных культур инфицированных вирусом клеток МА-104. При постановке метода для инфицирования использовали 3 эталонных штамма РСВ: Long и А2 (РСВ-А), а также штамм 9320 (РСВ-В).To assess the ability of the obtained new MCAs to interact with RSV strains belonging to different antigenic groups, microcultural ELISA (μ ELISA, in-cell ELISA) was performed using monolayer cultures of MA-104 virus-infected cells. When setting the method for infection, 3 reference RSV strains were used: Long and A2 (RSV-A), as well as strain 9320 (RSV-B).
Все МКА специфически реагировали в мк-ИФА с инфицированными данными штаммами РСВ клетками МА-104. Фоновые значения OD450 при взаимодействии МКА с монослойными культурами неинфицированных клеток не превышали 0,15. Все полученные МКА практически с одинаковой эффективностью взаимодействовали в мк-ИФА с вирусом-иммуногеном (РСВ, штамм Long). На высокую аффинность МКА при взаимодействии с данным вирусом указывает наличие плато на кривых титрования, наблюдаемое в широком диапазоне концентраций МКА (от 0,5 до 50 мкг/мл). С клетками, инфицированными другим штаммом РСВ-А (А2), все МКА взаимодействовали слабее, чем с РСВ Long. Наименее активными при этом оказались МКА 5H8, 1H3 и 5F8. Эти же 3 МКА значительно слабее, чем другие антитела, реагировали также со штаммом 9320, относящимся к гетерологичной группе В.All Mabs specifically reacted in μ-ELISA with infected RSV strains of MA-104 cells. The background OD 450 values during the interaction of MCA with monolayer cultures of uninfected cells did not exceed 0.15. All obtained MCAs interacted with the same efficiency with μ-ELISA with the immunogen virus (RSV, Long strain). The high affinity of MABs when interacting with this virus is indicated by the presence of a plateau on the titration curves observed in a wide range of MAB concentrations (from 0.5 to 50 μg / ml). With cells infected with another strain of RSV-A (A2), all MCAs interacted weaker than with RSV Long. In this case, MCAs 5H8, 1H3, and 5F8 turned out to be the least active. The same 3 MCAs were significantly weaker than other antibodies; they also reacted with strain 9320 belonging to the heterologous group B.
Следует отметить, что МКА 5F3 оказались единственными из полученных МКА, которые реагировали с эталонными штаммами группы РСВ-А со значительно большей активностью, чем с РСВ-В. Полученные результаты указывают на то, что МКА 4F2 направлены к консервативным эпитопам F-белка, общим для обеих антигенных групп РСВ. Соответственно, МКА 5H8, 1H3, 5F8 и 5F3 взаимодействуют с более вариабельными эпитопами.It should be noted that MCA 5F3 turned out to be the only ones from MCA that reacted with reference strains of the RSV-A group with significantly greater activity than with RSV-B. The results indicate that MCA 4F2 is directed to the conserved F-protein epitopes common to both RSV antigenic groups. Accordingly, MCAs 5H8, 1H3, 5F8 and 5F3 interact with more variable epitopes.
Было показано, что МКА 10G6 и 11G4 специфически взаимодействуют с F-белком РСВ по данным иммуноблоттинга. Спектр взаимодействия данных МКА был проанализирован методом мк-ИФА. Для этого в лунки планшетов с монослойными культурами клеток МА-104 вносили вируссодержащий материал (культуральную среду, содержащую 50–100 ТЦД50 РСВ). После инкубации в СО2-инкубаторе в течение 3–5 суток при 37°С среду удаляли, клетки в лунках фиксировали 80% холодным ацетоном. На фиксированный клеточный монослой наносили по 100 мкл вирусспецифических МКА в рабочем разведении (5–10 мкг/мл) и инкубировали 2 ч при 37°С. На следующем этапе в лунки добавляли по 100 мкл козьих антител против IgG мыши (1/5000), меченных пероксидазой (“Sigma-Aldrich”, США), и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% Н2О2 в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0. После остановки реакции с помощью 2N H2SO4 измеряли оптическую плотность на фотометре при длине волны 450 нм (ОD450).It was shown that MCA 10G6 and 11G4 specifically interact with the F-protein of RSV according to immunoblotting. The spectrum of the interaction of the MCA data was analyzed by the μ-ELISA method. For this, virus-containing material (culture medium containing 50–100 TCD 50 RSV) was added to the wells of plates with monolayer cultures of MA-104 cells. After incubation in a CO 2 incubator for 3–5 days at 37 ° C, the medium was removed, the cells in the wells were fixed with 80% cold acetone. 100 μl of virus-specific MABs in working dilution (5–10 μg / ml) was applied to a fixed cell monolayer and incubated for 2 h at 37 ° С. In the next step, 100 μl of goat anti-mouse IgG antibodies (1/5000) labeled with peroxidase (Sigma-Aldrich, USA) were added to the wells and incubated for 1 h at 37 ° С. The peroxidase reaction was manifested by adding a substrate mixture containing 0.1 mg / ml 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine (TMB) and 0.02% H 2 O 2 in acetate citrate buffer, pH 5.0. After stopping the reaction with 2N H 2 SO 4 , the optical density was measured on a photometer at a wavelength of 450 nm (OD 450 ).
По результатам мк-ИФА МКА 10G6 и 11G4 показали широкий спектр специфического взаимодействия с референс-штаммами РСВ обеих подгрупп: Long и А2 (РСВ-А), а также со штаммом 9320 (РСВ-В). Помимо этого данные МКА эффективно взаимодействовали со штаммами РСВ, выделенными из клинических образцов (назальных соскобов), полученных от госпитализированных детей Санкт-Петербурга в 2017–2018 гг. При рабочем разведении МКА показатели ОD450 в мк-ИФА превышали для штаммов РСВ 1,0. МКА не показали кросс-реактивности при взаимодействии с клетками, инфицированными гетерологичными вирусами (парагриппом 2 и 3 типа, аденовирусом).According to the results of μ-ELISA, MKA 10G6 and 11G4 showed a wide range of specific interactions with the RSV reference strains of both subgroups: Long and A2 (RSV-A), as well as with strain 9320 (RSV-B). In addition, MCA data effectively interacted with RSV strains isolated from clinical samples (nasal scrapings) obtained from hospitalized children of St. Petersburg in 2017–2018. With a working dilution of the MCA, the OD 450 values in μ-ELISA exceeded 1.0 for RSV strains. MCAs did not show cross-reactivity when interacting with cells infected with heterologous viruses (type 2 and 3 parainfluenza, adenovirus).
Изоляты РСВ, выделенные в Санкт-Петербурге из клинических материалов в 2018 г. и идентифицированные МКА 10G6 и 11G4 методом мк-ИФА:RSV isolates isolated in St. Petersburg from clinical materials in 2018 and identified by MCA 10G6 and 11G4 using the μ-ELISA method:
RSV/St.Petersburg/457/2018, RSV/St.Petersburg/460/2018, RSV/St.Petersburg/462/2018, RSV/St.Petersburg/466/2018, RSV/St.Petersburg/478/2018, RSV/St.Petersburg/479/2018, RSV/St.Petersburg/494/2018, RSV/St.Petersburg/498/2018, RSV/St.Petersburg/562/2018, RSV/St.Petersburg/570/2018, RSV/St.Petersburg/571/2018, RSV/St.Petersburg/572/2018, RSV/St.Petersburg/654/2018, RSV/St.Petersburg/679/2018, RSV/St.Petersburg/751/2018, RSV/St.Petersburg/949/2018, RSV/St.Petersburg/1335/2018RSV / St. Petersburg / 457/2018, RSV / St. Petersburg / 460/2018, RSV / St. Petersburg / 462/2018, RSV / St. Petersburg / 466/2018, RSV / St. Petersburg / 478/2018, RSV / St. Petersburg / 479/2018, RSV / St. Petersburg / 494/2018, RSV / St. Petersburg / 498/2018, RSV / St. Petersburg / 562/2018, RSV / St. Petersburg / 570/2018, RSV / St. Petersburg / 571/2018, RSV / St. Petersburg / 572/2018, RSV / St. Petersburg / 654/2018, RSV / St. Petersburg / 679/2018, RSV / St. Petersburg / 751/2018, RSV / St. Petersburg / 949/2018, RSV / St. Petersburg / 1335/2018
Идентификация выделенных штаммов РСВ, провёденная с применением МКА методом мк-ИФА, была подтверждена ПЦР.Identification of the isolated strains of RSV, carried out using the MCA by the μ-ELISA method, was confirmed by PCR.
Описанные МКА могут быть использованы для диагностики, в частности, в диагностических тест-системах, например, в тест-системах по типу «сэндвич»-ИФА.The described MCAs can be used for diagnostics, in particular, in diagnostic test systems, for example, in sandwich-IFA type test systems.
Пример 4Example 4
Активацию сенсорного чипа СМ5 и иммобилизацию на его поверхность антител 10G6 к F-белку РСВ проводили в соответствии с инструкцией производителя (“GE Healthcare”, США). Раствор лиганда (МКА 10G6) готовили в 10 мМ CH3COONa pH 5,0. Поверхность чипа предварительно активировали обработкой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соотношении 1:1. Далее, в первую ячейку прибора вносили раствор лиганда (50 мкг/мл при скорости потока 10 мкл/мин, время контакта 420 с), иммобилизация которого проходила путём образования ковалентных связей между аминогруппами в полипептидной цепи лиганда и NHS-активированной поверхностью чипа. Затем в первую ячейку вносили 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации участков поверхности чипа, не занятых лигандом. Во вторую ячейку прибора вносили только 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации поверхности чипа. Таким образом, первая (рабочая) ячейка служила для снятия сигнала взаимодействия лиганд-аналит, вторая (референсная) ячейка служила для снятия фонового сигнала. Увеличение сигнала на 1 RU (Response Unit, единица ответа) соответствовало иммобилизации ≈ 1 пг/мм2 лиганда на поверхность чипа CM5.Activation of the CM5 sensor chip and immobilization of 10G6 antibodies to the RSV F protein on its surface was carried out in accordance with the manufacturer's instructions (GE Healthcare, USA). A ligand solution (MCA 10G6) was prepared in 10 mM CH 3 COONa pH 5.0. The surface of the chip was pre-activated by treating 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) in a 1: 1 ratio. Further, a ligand solution (50 μg / ml at a flow rate of 10 μl / min, contact time 420 s) was introduced into the first cell of the device, the immobilization of which took place by the formation of covalent bonds between the amino groups in the ligand polypeptide chain and the NHS-activated surface of the chip. Then, a 1M solution of ethanolamine hydrochloride-NaOH pH 8.5 was introduced into the first cell to inactivate areas of the chip surface not occupied by the ligand. Only a 1 M solution of ethanolamine hydrochloride-NaOH pH 8.5 was introduced into the second cell of the device to inactivate the surface of the chip. Thus, the first (working) cell served to record the ligand-analyte interaction signal, and the second (reference) cell served to record the background signal. An increase in the signal by 1 RU (Response Unit, response unit) corresponded to immobilization of ≈ 1 pg / mm 2 ligand on the surface of the CM5 chip.
Инжектирование аналита (РСВ) проводили в серии двукратных разведений (87,5; 43,8; 21,9; 10,9 нМ). Для регенерации поверхности чипа использовали 10 мМ глицин гидрохлорид pH 2,5.Injection of the analyte (RSV) was performed in a series of double dilutions (87.5; 43.8; 21.9; 10.9 nM). To regenerate the surface of the chip, 10 mM glycine hydrochloride pH 2.5 was used.
Связывание антител с аналитом было изучено путём мониторинга изменения значений RU в ходе построения сенсограммы взаимодействия во времени. Полученные кривые взаимодействия были обработаны с использованием программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software (Фиг. 2).The binding of antibodies to the analyte was studied by monitoring the change in RU values in the course of constructing a sensogram of interaction over time. The resulting interaction curves were processed using Biacore X100 Evaluation Software (Fig. 2).
Данное взаимодействие было описано кинетикой Лэнгмюра. Так, рассчитанная по данному приближению (Фиг. 3) равновесная константа диссоциации составила KD = 2,88×10–10 М, что свидетельствует о высокоаффинном взаимодействии МКА 10G6 c РСВ.This interaction has been described by Langmuir kinetics. Thus, the equilibrium dissociation constant calculated from this approximation (Fig. 3) was KD = 2.88 × 10 –10 M, which indicates a high-affinity interaction of 10G6 MCA with RSV.
Пример 5Example 5
Активацию сенсорного чипа СМ5 и иммобилизацию на его поверхность антител 11G4 к F-белку РСВ проводили в соответствии с инструкцией производителя (“GE Healthcare”, США). Раствор лиганда (МКА 11G4) готовили в 10 мМ CH3COONa pH 5,0. Поверхность чипа предварительно активировали обработкой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соотношении 1:1. Далее, в первую ячейку прибора вносили раствор лиганда (50 мкг/мл при скорости потока 10 мкл/мин, время контакта 420 с), иммобилизация которого проходила путём образования ковалентных связей между аминогруппами в полипептидной цепи лиганда и NHS-активированной поверхностью чипа. Затем в первую ячейку вносили 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации участков поверхности чипа, не занятых лигандом. Во вторую ячейку прибора вносили только 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации поверхности чипа. Таким образом, первая (рабочая) ячейка служила для снятия сигнала взаимодействия лиганд-аналит, вторая (референсная) ячейка служила для снятия фонового сигнала. Увеличение сигнала на 1 RU соответствовало иммобилизации ≈ 1 пг/мм2 лиганда на поверхность чипа CM5.Activation of the CM5 sensor chip and immobilization of 11G4 antibodies to the RSV F protein on its surface was carried out in accordance with the manufacturer's instructions (GE Healthcare, USA). A ligand solution (MKA 11G4) was prepared in 10 mM CH 3 COONa pH 5.0. The surface of the chip was pre-activated by treating 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) in a 1: 1 ratio. Further, a ligand solution (50 μg / ml at a flow rate of 10 μl / min, contact time 420 s) was introduced into the first cell of the device, the immobilization of which took place by the formation of covalent bonds between the amino groups in the ligand polypeptide chain and the NHS-activated surface of the chip. Then, a 1M solution of ethanolamine hydrochloride-NaOH pH 8.5 was added to the first cell to inactivate areas of the chip surface not occupied by the ligand. Only a 1 M solution of ethanolamine hydrochloride-NaOH pH 8.5 was introduced into the second cell of the device to inactivate the surface of the chip. Thus, the first (working) cell served to record the ligand-analyte interaction signal, and the second (reference) cell served to record the background signal. An increase in signal by 1 RU corresponded to immobilization of ≈ 1 pg / mm 2 of ligand on the surface of the CM5 chip.
Инжектирование аналита (РСВ) проводили в серии двукратных разведений (87,5; 43,8; 21,9; 10,9 нМ). Для регенерации поверхности чипа использовали 10 мМ глицин гидрохлорид pH 2,5.Injection of the analyte (RSV) was performed in a series of double dilutions (87.5; 43.8; 21.9; 10.9 nM). To regenerate the surface of the chip, 10 mM glycine hydrochloride pH 2.5 was used.
Связывание антител с аналитом было изучено путём мониторинга изменения значений RU в ходе построения сенсограммы взаимодействия во времени. Полученные кривые взаимодействия были обработаны с использованием программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software. Данное взаимодействие было описано кинетикой Лэнгмюра. Так, рассчитанная по данному приближению равновесная константа диссоциации составила KD = 7,16×10–11 М, что свидетельствует о высокоаффинном взаимодействии МКА 11G4 c РСВ.The binding of antibodies to the analyte was studied by monitoring the change in RU values in the course of constructing a sensogram of interaction over time. The resulting interaction curves were processed using the Biacore X100 Evaluation Software. This interaction has been described by Langmuir kinetics. Thus, the equilibrium dissociation constant calculated from this approximation was KD = 7.16 × 10 –11 M, which indicates a high-affinity interaction of 11G4 MCA with RSV.
Описанные МКА могут быть использованы для диагностики, в частности, в диагностических тест-системах, например, в тест-системах по типу «сэндвич»-ИФА или иных тест-системах.The described MCAs can be used for diagnostics, in particular, in diagnostic test systems, for example, in sandwich-IFA type test systems or other test systems.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018147428A RU2713340C1 (en) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Monoclonal antibodies specific to various strains of respiratory syncytial virus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018147428A RU2713340C1 (en) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Monoclonal antibodies specific to various strains of respiratory syncytial virus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2713340C1 true RU2713340C1 (en) | 2020-02-04 |
Family
ID=69625487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018147428A RU2713340C1 (en) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Monoclonal antibodies specific to various strains of respiratory syncytial virus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2713340C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005079479A2 (en) * | 2004-02-17 | 2005-09-01 | Absalus, Inc. | Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus |
| EP2784088A2 (en) * | 2011-11-25 | 2014-10-01 | Pontificia Universidad Católica de Chile | Monoclonal antibodies specific for the m2-1 antigen of respiratory syncytial virus (rsv) |
| RU2540020C2 (en) * | 2009-10-06 | 2015-01-27 | Медиммьюн Лтд | Molecule specifically binding to rsv |
-
2018
- 2018-12-28 RU RU2018147428A patent/RU2713340C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005079479A2 (en) * | 2004-02-17 | 2005-09-01 | Absalus, Inc. | Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus |
| RU2540020C2 (en) * | 2009-10-06 | 2015-01-27 | Медиммьюн Лтд | Molecule specifically binding to rsv |
| EP2784088A2 (en) * | 2011-11-25 | 2014-10-01 | Pontificia Universidad Católica de Chile | Monoclonal antibodies specific for the m2-1 antigen of respiratory syncytial virus (rsv) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9523686B2 (en) | Methods and materials for the detection of dengue virus infection | |
| CN105683756B (en) | The assay method of influenza B virus | |
| JPH09501316A (en) | Monoclonal IgA antibody against respiratory syncytial virus | |
| EP3037822A1 (en) | Mycoplasma pneumoniae immunological detection method and kit | |
| CA2856258C (en) | Monoclonal antibodies specific for the m2-1 antigen of respiratory syncytial virus (rsv) | |
| TW201643189A (en) | Antibody-mediated neutralization of CHIKUNGUNYA virus | |
| CN111978396B (en) | Antibody specifically binding SARS-COV-2 NP protein and its use | |
| CN113603769A (en) | Hybridoma cell strain capable of stably secreting anti-novel coronavirus nucleocapsid protein monoclonal antibody and establishment method and application thereof | |
| US20210277093A1 (en) | Immunotherapeutic compositions and methods of production for coronavirus | |
| CN112010962B (en) | Antibody for detecting COVID-19 and medical application thereof | |
| Trento et al. | The complexity of antibody responses elicited against the respiratory syncytial virus glycoproteins in hospitalized children younger than 2 years | |
| CN109180810A (en) | Specifically bind norovirus GI.1 genotype VP1 albumen and/or the antibody of VLP and its preparation method and application | |
| TWI487537B (en) | Monoclonal antibodies against enterovirus 71 and uses thereof | |
| US20230235027A1 (en) | Nanobodies directed to coronavirus spike protein receptor binding domain and uses thereof | |
| KR102012123B1 (en) | Hybridomas that produce specific antibodies that bind simultaneously to non-structural protein 1 of dengue virus and Zika virus and antibodies produced therefrom, and uses thereof | |
| RU2713340C1 (en) | Monoclonal antibodies specific to various strains of respiratory syncytial virus | |
| JP2007145775A (en) | Method for detecting norovirus gi in high sensitivity | |
| JP2013049645A (en) | Antibody responding to foot-and-mouth disease virus, method of detecting foot-and-mouth disease virus using the antibody, and strip containing the antibody | |
| WO2019165019A1 (en) | Antibodies to human respiratory syncytial virus protein f pre-fusion conformation and methods of use therefor | |
| RU2714246C1 (en) | Monoclonal antibodies specific to different strains of influenza b virus | |
| CN112912394B (en) | Monoclonal antibodies directed against the N antigen of HRSV useful for the treatment of infections, detection and diagnosis thereof | |
| JP6446274B2 (en) | Antibodies that react with foot-and-mouth disease virus | |
| RU2733379C1 (en) | Test system for diagnostics of agents of acute respiratory viral infections | |
| US20200319206A1 (en) | Methods and compositions relating to diagnosis and treatment of cardiac disorders | |
| RU2491338C2 (en) | Using monoclonal antibodies for identifying yamagata or victorian influenza b viral evolution line, hybridoma 4h7 strain for preparing monoclonal antibodies used to identify influenza b viruses in yamagata branch, hybridoma b/4h1 strain for preparing monoclonal antibodies used to identify influenza b viruses in victorian branch |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200721 Effective date: 20200721 |