RU2697273C1 - Method of producing human recombinant follicle-stimulating hormone, producing cell line and plasmid expression vectors - Google Patents
Method of producing human recombinant follicle-stimulating hormone, producing cell line and plasmid expression vectors Download PDFInfo
- Publication number
- RU2697273C1 RU2697273C1 RU2019105063A RU2019105063A RU2697273C1 RU 2697273 C1 RU2697273 C1 RU 2697273C1 RU 2019105063 A RU2019105063 A RU 2019105063A RU 2019105063 A RU2019105063 A RU 2019105063A RU 2697273 C1 RU2697273 C1 RU 2697273C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- fsh
- rhfsh
- human
- follicle
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 title abstract description 29
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 title abstract description 29
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 title abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 23
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 235000020939 nutritional additive Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 97
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 21
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 11
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- 108010006578 follitropin alfa Proteins 0.000 description 9
- 229940057854 gonal f Drugs 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 7
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 6
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 101000862396 Homo sapiens Follicle-stimulating hormone receptor Proteins 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102100027627 Follicle-stimulating hormone receptor Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 108700010903 cytomegalovirus proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010000732 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Proteins 0.000 description 2
- 102000002287 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Human genes 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000018343 Follicle stimulating hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001038874 Homo sapiens Glycoprotein hormones alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960005210 follitropin alfa Drugs 0.000 description 1
- 108010081934 follitropin beta Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000046113 human FSHR Human genes 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- -1 two weeks later Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для получения рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона.The group of inventions relates to biotechnology and can be used to produce recombinant human follicle-stimulating hormone.
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) представляет собой белок, состоящий из двух субъединиц - альфа (содержит 92 аминокислотных остатка) и бета (содержит 111 аминокислотных остатков), которые синтезируются в одной клетке, после чего подвергаются гликозилированию, протеолитическому удалению сигнальных пептидов, объединению в зрелый функционально активный белок и секреции. В ФСГ человека альфа- и бета-субъединица подвергаются N-гликозилированию по остаткам аспарагина в позициях альфа-52, альфа-78, бета-7, бета-24. При этом наблюдаются высокая степень гликозилирования ФСГ (до 35% углеводов в весовом соотношении) и гетерогенность гликозилирования, определяемая широким спектром углеводных структур, которые могут содержать би-, три- и тетра-разветвленные гликаны. Различия в гликозилировании влияют на биологическую активность, молекулярную массу и заряд молекул ФСГ [Mulders J.W. et al. Prediction of the in vivo Biological Activity of Human Recombinant Follicle Stimulating Hormone Using Quantitative Isoelectric Focusing // Biologicals, 1997, 25(3): 269-281; Horsman G. et al. A biological, immunological and physico-chemical comparison of the current clinical batches of the recombinant FSH preparations Gonal-F and Puregon // Hum Reprod., 2000, 15(9): 1898-1902; патенты RU 2502798 и RU 2560596].Follicle-stimulating hormone (FSH) is a protein consisting of two subunits - alpha (contains 92 amino acid residues) and beta (contains 111 amino acid residues), which are synthesized in one cell, after which they undergo glycosylation, proteolytic removal of signal peptides, and integration into a mature functionally active protein and secretion. In human FSH, the alpha and beta subunits undergo N-glycosylation at asparagine residues at positions alpha-52, alpha-78, beta-7, beta-24. At the same time, a high degree of FSH glycosylation is observed (up to 35% carbohydrates in a weight ratio) and glycosylation heterogeneity, determined by a wide range of carbohydrate structures, which may contain bi-, tri- and tetra-branched glycans. Differences in glycosylation affect the biological activity, molecular weight and charge of FSH molecules [Mulders J.W. et al. Prediction of the in vivo Biological Activity of Human Recombinant Follicle Stimulating Hormone Using Quantitative Isoelectric Focusing // Biologicals, 1997, 25 (3): 269-281; Horsman G. et al. A biological, immunological and physico-chemical comparison of the current clinical batches of the recombinant FSH preparations Gonal-F and Puregon // Hum Reprod., 2000, 15 (9): 1898-1902; patents RU 2502798 and RU 2560596].
ФСГ применяется в медицинской практике для лечения бесплодия и репродуктивных нарушений у пациентов женского и мужского пола.FSH is used in medical practice to treat infertility and reproductive disorders in female and male patients.
Рекомбинантный человеческий фолликулостимулирующий гормон (рчФСГ) производят путем культивирования клеток яичников китайского хомячка (СНО), стабильно трансфицированных плазмидными векторами, кодирующими альфа- и бета-субъединицу данного белка. При этом некоторые из известных клеточных линий - продуцентов ФСГ были получены путем трансфекции клеток двумя плазмидными векторами, один из которых кодирует альфа-субъединицу, а другой - бета-субъединицу ФСГ [US 5240832, US 7939296, RU 2502798], другие клеточные линии были получены с помощью трансфекции клеток СНО одним плазмидным вектором, кодирующим как альфа-, так и бета-субъединицу ФСГ (US 2006223144, RU 2537268).Recombinant human follicle-stimulating hormone (rhFSH) is produced by culturing Chinese hamster ovary cells (CHO) stably transfected with plasmid vectors encoding the alpha and beta subunit of this protein. Moreover, some of the known cell lines producing FSH were obtained by transfecting cells with two plasmid vectors, one of which encodes the alpha subunit, and the other the beta subunit of FSH [US 5240832, US 7939296, RU 2502798], other cell lines were obtained using transfection of CHO cells with one plasmid vector encoding both the alpha and beta subunits of FSH (US 2006223144, RU 2537268).
В US 7939296 раскрыто получение клеточной линии на основе клеток СНО-K1, трансфицированных плазмидными векторами, кодирующими альфа- и бета-субъединицу ФСГ. После селекции и адаптации к росту в бессывороточной среде, клетки данной линии за 7 суток суспензионного культивирования достигали плотности 1⋅107 клеток/мл, обеспечивая накопление 8-10 мкг/мл ФСГ человека в кондиционированной среде.No. 7,939,296 discloses the preparation of a cell line based on CHO-K1 cells transfected with plasmid vectors encoding the FSH alpha and beta subunit. After selection and adaptation to growth in serum-free medium, the cells of this line for 7 days of suspension cultivation reached a density of 1 × 10 7 cells / ml, providing an accumulation of 8-10 μg / ml of human FSH in an air-conditioned environment.
В RU 2502798 раскрыто получение клеточной линии huFSHIK, адаптированной к суспензионному росту к бессывороточной среде, которая обеспечивает накопление рчФСГ в культуральной жидкости в концентрации до 7 мкг/мл, удельная продуктивность клеточной линии составляет 1,5 мкг/106 клеток в день, или 1,5 пг на клетку в день.RU 2502798 discloses the preparation of a huFSHIK cell line adapted for suspension growth to serum-free medium that provides rhFSH accumulation in culture fluid at a concentration of up to 7 μg / ml, the specific productivity of the cell line is 1.5 μg / 10 6 cells per day, or 1 5 pg per cell per day.
В ЕА 022993 раскрыто получение плазмидной ДНК, содержащей оптимизированные последовательности кДНК, кодирующие альфа- и бета-субъединицу ФСГ человека, которую использовали для временной экспрессии рекомбинантного ФСГ человека, что не позволяет производить данный белок в промышленных масштабах.EA 022993 discloses the production of plasmid DNA containing optimized cDNA sequences encoding the alpha and beta subunit of human FSH, which was used for the temporary expression of recombinant human FSH, which does not allow the production of this protein on an industrial scale.
В RU 2560596 раскрыто получение линии клеток C-P1.3-FSH-G4, продуцирующих рчФСГ человека. Клетки данной линии при суспензионном культивировании в бессывороточной среде обладают удельной продуктивностью более 10 пг ФСГ/клетка/день, что позволяет получать до 36,5 мкг/мл ФСГ в кондиционированной культуральной среде при концентрации клеток 1,55⋅106/мл.RU 2560596 discloses the production of a C-P1.3-FSH-G4 cell line producing human rhFSH. When suspended in a serum-free medium, the cells of this line have a specific productivity of more than 10 pg FSH / cell / day, which makes it possible to obtain up to 36.5 μg / ml FSH in an air-conditioned culture medium at a cell concentration of 1.55 × 10 6 / ml.
Для удовлетворения растущих потребностей практической медицины в препаратах ФСГ требуется постоянное повышение продуктивности клеточных линий - продуцентов ФСГ человека.To meet the growing needs of practical medicine in FSH preparations, a constant increase in the productivity of cell lines producing human FSH is required.
Задачей, на решение которой направлена заявленная группа изобретений, является создание способа получения рекомбинантного человеческого ФСГ с высоким выходом, обеспечивающим содержание в культуральной жидкости не менее 75 мкг/мл рчФСГ.The problem to which the claimed group of inventions is directed is to create a method for producing recombinant human FSH in high yield, providing a content in the culture fluid of at least 75 μg / ml rhFSH.
Поставленная задача решается путем создания пары новых совместимых плазмидных экспрессионных векторов pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta, несущих гены альфа- и бета-субъединицы фолликуло-стимулирующего гормона соответственно, создание стабильной и высокопродуктивной клеточной линии CHO-FSH 91 на их основе и способа ее культивирования. Заявленная клеточная линия при культивировании в условиях, раскрываемых в заявленном способе, продуцирует в культуральную среду не менее 75 мкг/мл рчФСГ.The problem is solved by creating a pair of new compatible plasmid expression vectors pTVK4p-FSHalpha and pTVK4n-FSHbeta, carrying the alpha and beta subunit genes of the follicle-stimulating hormone, respectively, creating a stable and highly productive cell line CHO-FSH 91 based on them, and a method for its cultivation . The claimed cell line, when cultured under the conditions disclosed in the claimed method, produces at least 75 μg / ml rhFSH in the culture medium.
Технический результат заключается в высокой продуктивности клеточной линии CHO-FSH 91, превышающей продуктивность известных клеточных линий более чем в два раза при культивировании заявленным способом. Заявленная линия стабильно секретирует ФСГ в бессывороточную культуральную среду на протяжении не менее 20 пассажей в неселективных условиях культивирования. Перечисленные свойства делают ее экономически выгодной для широкого применения в биофармацевтическом производстве.The technical result consists in the high productivity of the cell line CHO-FSH 91, exceeding the productivity of known cell lines more than doubled during cultivation of the claimed method. The claimed line stably secretes FSH into a serum-free culture medium for at least 20 passages under non-selective cultivation conditions. These properties make it economically viable for widespread use in biopharmaceutical manufacturing.
Технический результат достигается тем, что клетки линии CHO-FSH 91, трансфицированные плазмидами pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta, несущими гены альфа- и бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона соответственно, культивируют при следующих условиях. Клетки линии CHO-FSH 91 в концентрации 0,5⋅106-0,7⋅106 кл/мл помещают в среду, содержащую 5% гидролизата растительного белка, и выдерживают при 37°С, 5% CO2 и перемешивании в течение 4-х суток. После этого температуру понижают до 32°С, ежедневно вносят в культуральную среду 3% питательной добавки Cell Boost®7a и 0,3% питательной добавки Cell Boost®7b и выдерживают клетки при 32°С, 5% СО2 и перемешивании, ежедневно проверяя жизнеспособность клеток. Когда доля жизнеспособных клеток в культуре снижается до 85%, клетки удаляют, а культуральную жидкость используют для выделения рчФСГ.The technical result is achieved by the fact that cells of the CHO-
Заявленная клеточная линия CHO-FSH 91 при культивировании в стандартных условиях позволяет получить 6 пг рчФСГ на клетку в сутки. Культивирование при 37°С в присутствии 5% гидролизата растительного белка в течение 4 суток позволяет максимально быстро увеличить клеточную массу. Дальнейшее культивирование при 32°С приводит к снижению темпа роста клеточной культуры, что позволяет увеличить время поддержания культуры клеток, активно продуцирующих целевой белок, и отдалить достижение клеточной культурой стадии отмирания. Добавление в культуральную среду 3% питательной добавки Cell Boost®7a и 0,3% питательной добавки Cell Boost®7b дополнительно приводит к увеличению продуктивности клеток линии CHO-FSH 91. Культивирование клеток заявленной линии до тех пор, пока доля жизнеспособных клеток составляет не менее 85% от общего числа клеток, позволяет повысить качество целевого белка, поскольку с уменьшением жизнеспособности клеток увеличивается гетерогенность синтезируемого ими белка и количество его изоформ. Таким образом, описанная в заявленном способе последовательность операций культивирования клеточной линии CHO-FSH 91, выбранные режимы и вещества, используемые при этом, обеспечивают решение поставленной задачи.The claimed cell line CHO-
Линия клеток CHO-FSH 91 характеризуется следующими признаками:The cell line CHO-FSH 91 is characterized by the following features:
Линия клеток яичников китайского хомячка Cricetulus griseus CHO-FSH 91 - продуцент рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека.The Chinese hamster ovary cell line Cricetulus griseus CHO-FSH 91 is a producer of recombinant human follicle-stimulating hormone.
Родословная клеточной линии. Родительская клеточная линия СНО К-1, адаптированная к суспензионному росту. Котрансфекция плазмидами pTVK4p-FSHalpha, pTVK4n-FSHbeta с последующим последовательным отбором стабильного высокопродуктивного клона на селективной среде, содержащей антибиотики пуромицин и генетицин (G-418).The lineage of the cell line. Parent CHO K-1 cell line adapted to suspension growth. Cotransfection with plasmids pTVK4p-FSHalpha, pTVK4n-FSHbeta followed by sequential selection of a stable highly productive clone on a selective medium containing the antibiotics puromycin and geneticin (G-418).
Культуральные свойства. Суспензионное культивирование в пробирках, колбах Эрленмейера на орбитальном шейкере с частотой вращения 130-180 об/мин, либо в биореакторе (ферментере), при температуре 37°С и 5% CO2. Посевная доза 0,5⋅106-0,7⋅106 клеток/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 18-20 часов.Cultural properties. Suspension cultivation in test tubes, Erlenmeyer flasks on an orbital shaker with a rotation frequency of 130-180 rpm, or in a bioreactor (fermenter), at a temperature of 37 ° C and 5% CO 2 . The sowing dose is 0.5⋅10 6 -0.7⋅10 6 cells / ml, reseeding every 3-4 days. The doubling time is 18-20 hours.
Стандартные условия выращивания. Среда CDM4 СНО (HyClone, США) с добавлением 4 мМ аланилглутамина, 1 г/л сурфактанта Pluronic-F68 (Sigma, США), 2,2 г/л гидрокарбоната натрия, 10 мкг/мл пуромицина, 200 мкг/мл антибиотика G-418, 37°С, 5% CO2.Standard growing conditions. CDM4 CHO medium (HyClone, USA) supplemented with 4 mM alanylglutamine, 1 g / l Pluronic-F68 surfactant (Sigma, USA), 2.2 g / l sodium bicarbonate, 10 μg / ml puromycin, 200 μg / ml G- antibiotic 418, 37 ° C, 5% CO 2 .
Характеристика культивирования в организме животного. Культивирование в организме животного не применяется.Characterization of cultivation in the animal body. Cultivation in the body of the animal is not applied.
Характеристики полезного вещества, продуцируемого линией. Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека. Оценка с помощью иммуноферментного анализа, электрофореза в полиакриламидном геле, капиллярного изоэлектрического фокусирования, биологического теста на клеточной линии CHO-FSHR 11, экспрессирующей рецептор к фолликулостимулирующему гормону человека.Characteristics of the beneficial substance produced by the line. Recombinant follicle-stimulating human hormone. Evaluation by enzyme-linked immunosorbent assay, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary isoelectric focusing, and biological testing on the CHO-
Характеристика биосинтеза полезных продуктов. Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека секретируется в культуральную среду в количестве около 6 пг на клетку в сутки. Стабильность культивирования - не менее 40 пассажей в среде с 10 мкг/мл пуромицина и 200 мкг/мл G-418 и не менее 20 пассажей в среде без селекционного давления.Characterization of the biosynthesis of useful products. The recombinant follicle-stimulating human hormone is secreted into the culture medium in an amount of about 6 pg per cell per day. Cultivation stability is not less than 40 passages in an environment with 10 μg / ml puromycin and 200 μg / ml G-418 and not less than 20 passages in an environment without selection pressure.
Способ криоконсервирования. 45% свежей среды CDM4 СНО, 45% кондиционированной среды, 10% DMSO, 3⋅106-5⋅106 клеток/мл, заморозка до -70°С со скоростью 1°С/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта 90% (окраска трипановым синим).The method of cryopreservation. 45% fresh CDM4 CHO medium, 45% conditioned medium, 10% DMSO, 3⋅10 6 -5⋅10 6 cells / ml, freezing to -70 ° С at a rate of 1 ° С / min, then placing in liquid nitrogen, viability after thawing and washing from the cryopreservative 90% (staining with trypan blue).
Группа изобретений иллюстрируется следующими графическими материалами:The group of inventions is illustrated by the following graphic materials:
На Фиг. 1 представлена карта плазмиды pTVK4p-FSHalpha, где:In FIG. 1 shows a map of plasmid pTVK4p-FSHalpha, where:
CMV - промотор предранних белков цитомегаловируса;CMV - promoter of early cytomegalovirus proteins;
FSH alpha - кодонно оптимизированный ген альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека;FSH alpha - codon-optimized gene for the alpha subunit of human follicle-stimulating hormone;
TK polyA - сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;TK polyA — site for termination of transcription and polyadenylation of RNA from the thymidine kinase gene;
SV40 - промотор ранних белков вируса SV40;SV40 - promoter of the early proteins of the SV40 virus;
Puro - ген устойчивости к пуромицину;Puro - puromycin resistance gene;
SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;SV40 PolyA - site polyadenylation of early proteins of the SV40 virus;
pUC ori - точка начала репликации;pUC ori - replication start point;
b-lactamase - ген бактериального фермента бета-лактамазы;b-lactamase is a gene for the bacterial enzyme beta-lactamase;
regulatory element - регуляторный элемент UCOE, усиливающий экспрессию целевого гена.regulatory element - a regulatory element of UCOE that enhances the expression of the target gene.
На Фиг. 2 представлена карта плазмиды pTVK4n-FSHbeta, где:In FIG. 2 shows a map of plasmid pTVK4n-FSHbeta, where:
CMV - промотор предранних белков цитомегаловируса;CMV - promoter of early cytomegalovirus proteins;
FSH beta - кодонно оптимизированный ген бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека;FSH beta - codon optimized beta-subunit gene of human follicle-stimulating hormone;
TK polyA - сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;TK polyA — site for termination of transcription and polyadenylation of RNA from the thymidine kinase gene;
SV40 - промотор ранних белков вируса SV40;SV40 - promoter of the early proteins of the SV40 virus;
Neo - ген устойчивости к неомицину;Neo - a gene of resistance to neomycin;
SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;SV40 PolyA - site polyadenylation of early proteins of the SV40 virus;
pUC ori - точка начала репликации;pUC ori - replication start point;
b-lactamase - ген бактериального фермента бета-лактамазы;b-lactamase is a gene for the bacterial enzyme beta-lactamase;
regulatory element - регуляторный элемент UCOE, усиливающий экспрессию целевого гена.regulatory element - a regulatory element of UCOE that enhances the expression of the target gene.
На Фиг. 3 представлены клоны, обладающие наибольшей волюметрической продуктивностью, после первого этапа селекции. КЖ - культуральная жидкость, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.In FIG. Figure 3 shows the clones with the highest volumetric productivity after the first stage of selection. QOL - culture fluid, rhFSH - recombinant follicle-stimulating hormone.
На Фиг. 4 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 37°С, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.In FIG. Figure 4 shows the growth dynamics of CHO-
На Фиг. 5 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 32°С, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.In FIG. Figure 5 shows the growth dynamics of CHO-
На Фиг. 6 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 32°С с питательными добавками, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.In FIG. Figure 6 shows the growth dynamics of CHO-
На Фиг. 7 представлен электрофорез в ПААГ рекомбинантного ФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91, до и после обработки нейраминидазой, восстанавливающие условия.In FIG. 7 shows the SDS page electrophoresis of recombinant FSH purified from the culture fluid of the producer line CHO-
М - маркеры молекулярного веса, кДа;M - molecular weight markers, kDa;
ФСГ - необработанный белок;FSH - untreated protein;
ФСГ+НА - белок, обработанный нейраминидазой;FSH + HA - protein treated with neuraminidase;
НА - нейраминидазаNA - Neuraminidase
На Фиг. 8 представлено капиллярное изоэлектрическое фокусирование рчФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91. Указаны значения pI главных изоформ рчФСГ.In FIG. Figure 8 shows the capillary isoelectric focusing of rhFSH purified from the culture fluid of the producer line CHO-
На Фиг. 9 представлено сравнение биологической активности рчФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91, и коммерческого препарата рчФСГ «Гонал-Ф».In FIG. Figure 9 presents a comparison of the biological activity of rhFSH purified from the culture fluid of the producer line CHO-
Группа изобретений поясняется следующими примерами:The group of inventions is illustrated by the following examples:
Пример 1. Дизайн, синтез и сборка генетических конструкций.Example 1. Design, synthesis and assembly of genetic constructs.
Известные последовательности кДНК, кодирующих альфа- и бета-цепи рекомбинантного ФСГ человека, были проанализированы с помощью программных средств IDT (https://eu.idtdna.com/CodonOpt). В последовательности кДНК альфа-субъединицы ФСГ человека был обнаружен 71 кодон, редко встречающийся в генах китайского хомячка Cricetulus griseus, данные кодоны были заменены на часто встречающиеся в генах китайского хомячка синонимические кодоны, для чего потребовалось заменить 80 нуклеотидов. В кДНК бета-субъединицы было обнаружено 7 кодонов, редко встречающихся в генах китайского хомячка С. griseus, которые также были заменены на синонимические кодоны, часто встречающиеся в генах китайского хомячка. Полученные оптимизированные последовательности кДНК альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека представлены в SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2 соответственно. Оптимизированные последовательности к ДНК альфа- и бета-субъединицы были синтезированы методом автоматизированного химического синтеза, при этом к этим последовательностям были добавлены последовательности Kozak (5'-gccacc-3') перед стартовыми кодонами, а также стоп-кодоны и фланкирующие сайты рестрикции: на 3'-конце кДНК - BglII, на 5'-конце кДНК - NotI.Known cDNA sequences encoding the alpha and beta chains of recombinant human FSH were analyzed using IDT software (https://eu.idtdna.com/CodonOpt). In the cDNA sequence of the human FSH alpha subunit, 71 codons were found that are rarely found in the genes of the Chinese hamster Cricetulus griseus; these codons were replaced by synonymous codons that are often found in the genes of the Chinese hamster, for which 80 nucleotides had to be replaced. In the beta subunit cDNA, 7 codons were found rarely found in the genes of the Chinese hamster C. griseus, which were also replaced by synonymous codons, often found in the genes of the Chinese hamster. The obtained optimized cDNA sequences of the alpha and beta subunits of human FSH are presented in SEQ ID No: 1 and SEQ ID No: 2, respectively. Optimized sequences for the alpha and beta subunit DNA were synthesized by automated chemical synthesis, with Kozak sequences (5'-gccacc-3 ') before the start codons, as well as stop codons and flanking restriction sites, added to these sequences The 3'-end of the cDNA is BglII, and the 5'-end of the cDNA is NotI.
Полученные фрагменты ДНК были вставлены в предварительно рестрицированные по этим сайтам плазмидные векторы серии pTVK4, которые содержат следующие элементы:The resulting DNA fragments were inserted into pTVK4 series plasmid vectors previously restricted at these sites, which contain the following elements:
- промотор предранних белков цитомегаловируса (CMV promoter);- promoter of early cytomegalovirus proteins (CMV promoter);
- сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК ТК поли(А) (TK polyA);- TK poly (A) RNA transcription and polyadenylation termination site (TK polyA);
- гены селекции в эукариотических клетках, транскрипция которых обеспечивается локальными промоторами (ген устойчивости к пуромицину (р) в плазмидном векторе pTVK4p и ген устойчивости к неомицину (n) в плазмидном векторе pTVK4n).- selection genes in eukaryotic cells, the transcription of which is provided by local promoters (the puromycin resistance gene (p) in the plasmid vector pTVK4p and the neomycin resistance gene (n) in the plasmid vector pTVK4n).
- точку начала репликации pUC ori- replication start point pUC ori
- ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину;- beta-lactamase gene, providing resistance to ampicillin;
- элемент UCOE из генома мыши длиной 2990 нуклеотидов, обеспечивающий повышенную частоту интеграции плазмидного вектора в транскрипционно активные сайты хроматина. Интеграция в транскрипционно активные сайты хроматина, в свою очередь, приводит к высокому уровню продукции и повышенной стабильности продукции целевого белка, кодируемого плазмидным вектором [Betts Z, Dickson A.J. Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOEs) effect on transgene position and expression stability in CHO cells following methotrexate (MTX) amplification. Biotechnol J. 2016; 11(4): 554-641].- UCOE element from the mouse genome with a length of 2990 nucleotides, providing an increased frequency of integration of the plasmid vector into transcriptionally active chromatin sites. Integration into transcriptionally active chromatin sites, in turn, leads to a high level of production and increased production stability of the target protein encoded by the plasmid vector [Betts Z, Dickson A.J. Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOEs) effect on transgene position and expression stability in CHO cells following methotrexate (MTX) amplification. Biotechnol J. 2016; 11 (4): 554-641].
В результате были получены плазмидные векторы:As a result, plasmid vectors were obtained:
pTVK4p-FSHalpha (Фиг. 1)pTVK4p-FSHalpha (Fig. 1)
pTVK4n-FSHbeta (Фиг. 2)pTVK4n-FSHbeta (Fig. 2)
В этих плазмидных векторах кДНК, кодирующие соответствующие цепи ФСГ человека, находятся между промотором CMV и сайтом терминации транскрипции и полиаденилирования ТК поли(А). Отсутствие ошибок в синтезе генов и сборке плазмидных векторов было подтверждено секвенированием.In these plasmid vectors, cDNAs encoding the corresponding human FSH chains are located between the CMV promoter and the TK poly (A) transcription and polyadenylation termination site. The absence of errors in gene synthesis and assembly of plasmid vectors was confirmed by sequencing.
Пример 2. Получение высокопродуктивной линии культивируемых клеток - продуцента ФСГ человекаExample 2. Obtaining a highly productive cultured cell line producing human FSH
Родительская линия клеток яичников китайского хомячка СНО-К1 была ранее адаптирована к суспензионному росту в бессывороточных средах по описанной методике (Sinacore M.S., Drapeau D., Adamson S.R. Adaptation of mammalian cells to growth in serum-free media. Mol Biotechnol, 2000; 15(3): 249-257). Альтернативно можно использовать коммерчески доступные суспензионные культуры СНО-К1. Клетки культивировали в 50-миллилитровых пробирках в среде CDM4CHO (HyClone, США), содержащей 4 мм аланилглутамина, 1 г/л Pluronic-F68 (Sigma, США), 2,2 г/л бикарбоната натрия (ПанЭко, Россия) при температуре 37°С и 5% CO2. Перемешивание осуществляли с помощью орбитального шейкера с частотой вращения 180 об/мин.The Chinese hamster CHO-K1 ovary cell line was previously adapted for suspension growth in serum-free media using the method described (Sinacore MS, Drapeau D., Adamson SR Adaptation of mammalian cells to growth in serum-free media. Mol Biotechnol, 2000; 15 ( 3): 249-257). Alternatively, commercially available suspension cultures of CHO-K1 can be used. Cells were cultured in 50 ml tubes in CDM4CHO medium (HyClone, USA) containing 4 mm alanylglutamine, 1 g / l Pluronic-F68 (Sigma, USA), 2.2 g / l sodium bicarbonate (PanEco, Russia) at a temperature of 37 ° C and 5% CO 2 . Stirring was carried out using an orbital shaker with a rotational speed of 180 rpm.
Для трансфекции использовали клетки на третий день культивирования после третьего пассажа с жизнеспособностью не ниже, чем 95%. Клетки подсчитывали в камере Горяева, жизнеспособность культур оценивали по исключению трипанового синего. Клетки центрифугировали при 100 g в течение 1 мин. Супернатант удаляли, клетки ресуспензировали в среде DMEM-F12 (HyClone, США) и переносили в лунки 24-луночного планшета (Corning, США) из расчета 3⋅105 клеток на лунку. Готовили растворы плазмидных векторов pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta в среде DMEM-F12 в концентрации 50 мкг/мл. Для трансфекции клеток в одной лунке в каждую лунку помещали по 10 мкл раствора каждого плазмидного вектора. Трансфекцию осуществляли с помощью реагента Turbofect (Thermo Fisher, США) по инструкции изготовителя.For transfection, cells were used on the third day of cultivation after the third passage with a viability of not lower than 95%. Cells were counted in a Goryaev’s chamber; the viability of the cultures was evaluated by the exclusion of trypan blue. Cells were centrifuged at 100 g for 1 min. The supernatant was removed, the cells were resuspended in DMEM-F12 medium (HyClone, USA) and transferred to the wells of a 24-well plate (Corning, USA) at the rate of 3 × 10 5 cells per well. Solutions of plasmid vectors pTVK4p-FSHalpha and pTVK4n-FSHbeta were prepared in DMEM-F12 at a concentration of 50 μg / ml. To transfect cells in one well, 10 μl of a solution of each plasmid vector was placed in each well. Transfection was carried out using Turbofect reagent (Thermo Fisher, USA) according to the manufacturer's instructions.
Через два дня после трансфекции клетки рассевали в плотности 0,7⋅106 кл/мл в среду CDM4CHO (HyClone, США), содержащую 10 мкг/мл пуромицина и 200 мкг/мл генетицина G-418 (селективная среда). В работе использовали антибиотик генетицин (G-418), который является аналогом неомицина, имеет сходный механизм действия и используется для селекции эукариотических клеток, трансфицированных плазмидными экспрессионными векторами, содержащими ген устойчивости к неомицину. Далее клетки адаптировали к селективным условиям, пересевая их каждые три дня. Концентрацию клеток подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность культур оценивали по исключению красителя трипанового синего. После перевода на селективную среду в течение первых трех пассажей жизнеспособность клеток снизилась до 11,4%, затем начала повышаться и на шестом пассаже достигла 100%. Из полученного стабильного пула клеток, экспрессирующих рчФСГ, отбирали отдельные клоны с использованием метода лимитирующих разведений. Для этого клеточную суспензию в концентрации 5-10 клеток/мл переносили в лунки 96-луночного планшета в объеме 200 мкл в селективной среде, через две недели отбирали образцы культуральной жидкости (КЖ) из тех лунок, в которых было отмечено по одному клону. Через 14 суток было отобрано 12 клонов, концентрацию рчФСГ в культуральной жидкости для каждого клона определяли с помощью набора «Гонадотропин-ИФА ФСГ» (АлкорБио, Россия) (Фиг. 3).Two days after transfection, the cells were scattered at a density of 0.7 × 10 6 cells / ml in CDM4CHO medium (HyClone, USA) containing 10 μg / ml puromycin and 200 μg / ml geneticin G-418 (selective medium). We used the antibiotic geneticin (G-418), which is an analogue of neomycin, has a similar mechanism of action, and is used to select eukaryotic cells transfected with plasmid expression vectors containing the neomycin resistance gene. Then the cells were adapted to selective conditions, replanting them every three days. The cell concentration was calculated in the Goryaev chamber. The viability of the cultures was evaluated by the exclusion of trypan blue dye. After transferring to selective medium during the first three passages, cell viability decreased to 11.4%, then it began to increase and reached 100% at the sixth passage. Separate clones were selected from the obtained stable pool of cells expressing rhFSH using the method of limiting dilutions. For this, a cell suspension at a concentration of 5-10 cells / ml was transferred into the wells of a 96-well plate in a volume of 200 μl in selective medium, two weeks later, culture fluid (QL) samples were taken from those wells in which one clone was noted. After 14 days, 12 clones were selected, the rhFSH concentration in the culture fluid for each clone was determined using the Gonadotropin-ELISA FSH kit (AlkorBio, Russia) (Fig. 3).
Клоны, обладающие наибольшей продукцией белка, переносили в 48-луночные планшеты, содержащие по 500 мкл селективной среды. На третьи сутки культивирования отбирали образцы культуральной жидкости из каждой лунки и вновь выбирали клоны с наибольшей продукцией белка. Отобранные клоны переносили в 5 мл селективной среды в 50-миллилитровые пробирки и продолжали культивирование. Через 3 суток 4 клона с наибольшей продуктивностью и жизнеспособностью выше 90% переносили в 5 мл питательной среды CDM4CHO, не содержавшей антибиотиков, и культивировали в течение 6 суток, после чего определяли жизнеспособность клеток и продукцию рчФСГ (Таблица 1). На основании полученных результатов был отобран клон 91, названный CHO-FSH 91, обеспечивающий накопление в культуральной жидкости 10,8 мг/л рекомбинантного ФСГ человека на шестые сутки культивирования при концентрации клеток 6,2⋅106 кл/мл и жизнеспособности не менее 94,2%.Clones with the highest protein production were transferred to 48-well plates containing 500 μl of selective medium. On the third day of cultivation, culture fluid samples were taken from each well and clones with the highest protein production were again selected. Selected clones were transferred into 5 ml of selective medium in 50 ml tubes and cultivation continued. After 3 days, 4 clones with the highest productivity and viability above 90% were transferred to 5 ml of antibiotic-free CDM4CHO culture medium and cultured for 6 days, after which cell viability and rhFSH production were determined (Table 1). Based on the results obtained,
Пример 3. Оптимизация способа культивирования клона клеток СНО-FSH 91.Example 3. Optimization of a method for culturing a clone of CHO-
Стабильный клон клеток CHO-FSH 91, полученный в примере 2, использовали для дальнейшей оптимизации процесса культивирования с целью повышения продукции клетками рчФСГ. Клетки культивировали в 50-миллитровых пробирках в среде CDM4CHO без антибиотиков с 5% гидролизата растительного белка CD Hydrolysate Fusion (Sigma, США) при температуре 37°С и скорости вращения шейкера 180 об/мин. Начальная плотность культуры составляла 0,5⋅106-0,7⋅106 кл/мл. Ежедневно, начиная с 4 суток, отбирали аликвоты для оценки концентрации рчФСГ, содержания и жизнеспособности клеток.The stable clone of CHO-
Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение девяти суток. За это время концентрация рчФСГ в культуральной жидкости достигала 13 мкг/мл (Фиг. 4). Уменьшение количества клеток после 6 суток культивирования было связано с агрегацией части клеток.Viability lasted above 85% for nine days. During this time, the concentration of rhFSH in the culture fluid reached 13 μg / ml (Fig. 4). The decrease in the number of cells after 6 days of cultivation was associated with the aggregation of part of the cells.
Для увеличения времени культивирования и количества синтезированного белка, начиная с 4 суток, температуру культивирования снижали до 32°С, в результате чего концентрация рчФСГ в культуральной жидкости повысилась и на 12-й день составила 30 мкг/мл (Фиг. 5). Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение 12 суток. Ежедневное, начиная с 4 суток культивирования, внесение питательных добавок (HyClone, США): Cell Boost®7a (3% объема питательной среды) и Cell Boost®7b (0,3% объема питательной среды) позволило достигнуть концентрации рчФСГ в культуральной жидкости на 12-й день культивирования равной 75 мкг/мл (Фиг. 6). Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение 12 суток. Уменьшение количества клеток после 8 суток культивирования было связано с агрегацией части клеток.To increase the cultivation time and the amount of synthesized protein, starting from 4 days, the cultivation temperature was reduced to 32 ° C, as a result of which the concentration of rhFSH in the culture fluid increased and amounted to 30 μg / ml on the 12th day (Fig. 5). Viability remained above 85% for 12 days. Daily, starting from 4 days of cultivation, the introduction of nutritional supplements (HyClone, USA): Cell Boost®7a (3% of the volume of the nutrient medium) and Cell Boost®7b (0.3% of the volume of the nutrient medium) allowed to reach the concentration of rhFSH in the culture fluid at 12th day of cultivation equal to 75 μg / ml (Fig. 6). Viability remained above 85% for 12 days. The decrease in the number of cells after 8 days of cultivation was associated with the aggregation of part of the cells.
Клетки клона CHO-FSH 91, выращенные при температуре 37°С, криоконсервировали и поместили в клеточный банк ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» под названием «Клеточная линия CHO-FSH 91 - продуцент рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека»Cells of the CHO-
Пример 4. Очистка рекомбинантного ФСГ человекаExample 4. Purification of recombinant human FSH
Культивирование клеток линии CHO-FSH 91 при температуре 32°С проводили в 8 колбах объемом 500 мл каждая, содержавших по 100 мл питательной среды, при начальной плотности культуры 0,5⋅106 кл/мл в условиях, описанных в примере 3. После 12 суток культивирования было получено 800 мл культуральной жидкости.The cultivation of CHO-
Культуральную жидкость осветляли путем последовательной фильтрации через фильтры с размером пор 0,8 мкм и 0,2 мкм (Sartorius, Германия). Далее рекомбинантный ФСГ человека очищали из осветленной культуральной жидкости следующим образом:The culture fluid was clarified by sequential filtration through filters with pore sizes of 0.8 μm and 0.2 μm (Sartorius, Germany). Next, recombinant human FSH was purified from clarified culture fluid as follows:
Этап I. Концентрирование и замена буферного раствора методом тангенциальной фильтрации на мембране Sartocon Slice 50, (Sartorius, Германия) с размером пор 10 кДа, материал мембраны Hydrostat. Скорость циркуляции ретентата составила 50 мл/мин, скорость трансмембранного потока составила 4 мл/мин. В результате объем культуральной жидкости уменьшили до 160 мл с заменой буфера на 20 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,5.Stage I. Concentration and replacement of the buffer solution by tangential filtration on a
Этап 2. Анионообменная хроматография на колонке HiPrep 16/10 Q-Sepharose FF 16×100 мм (GE-Healthcare, США), уравновешенной 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5. После промывки колонки связавшийся материал элюировали 100 мл элюирующего буфера (100 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,5). Было получено 40 мл элюата.
Этап 3. Гидрофобная хроматография на колонке HiTrap Phenyl HP (GE-Healthcare, США) объемом 1 мл. Элюат, полученный после проведения этапа 2, смешивали с буфером для разведения (3,6 М аммония сульфат, 20 мМ трис гидрохлорид, рН 7,5) в соотношении 1:1 и наносили на колонку, уравновешенную 1,8 М (NH4)2SO4, 20 мМ трис-HCl, рН 7,5. После нанесения и промывки колонки проводили элюцию линейным градиентом 1,8 М - 0 М (NH4)2SO4 в 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, объем градиента 20 мл. Собирали фракции, элюированные в диапазоне проводимости от 150 до 80 мСм/см. Объем собранных фракций составил 12 мл.
Этап 4. Замена буферного раствора путем гель-фильтрации на колонке BioScale Mini Bio-Gel Р6 (Bio-Rad, США) объемом 50 мл. Колонку уравновешивали 100 мл фосфатного буфера (10 мМ натрия фосфат, рН 6,8) и вносили в нее материал, полученный на этапе 3. Элюировали 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6,8. Объем фракций, включающих в себя целевой белок, составил 20 мл.
Этап 5. Хроматография на колонке с гидроксиапатитом. Хроматографию проводили на колонке Foresight СНТ Type I (Bio-Rad, США) объемом 1 мл. Колонку уравновешивали стартовым буфером (20 мМ натрия фосфат, рН 6,8), после чего вносили материал, полученный на этапе 4. Промывали колонку 5 мл стартового буфера и собирали белок, прошедший через колонку при нанесении и промывке с оптической плотностью на длине волны 280 нм более 25 mAU. Объем фракции, содержащей очищенный ФСГ, составил 23 мл.
Этап 6. Диализ. Диализ белка проводили против раствора, содержащего 137 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия, 10 мМ гидрофосфата калия, 1,75 мМ дигидрофосфата калия, с рН 7,3 в диализном мешке MFPI CelluSep RC Т2 с пределом отсечения 6-8 кДа. Степень чистоты белка определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Табл. 2). Выход очищенного рчФСГ составил 50,5%. Баланс процесса очистки рчФСГ представлен в Таблице 2.
Пример 5. Обработка нейраминидазой и электрофорез белка в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Полученный в примере 4 белок обрабатывали ферментом нейраминидазой (NEB, США), отщепляющей концевые остатки сиаловой кислоты, по методике производителя. Затем осуществляли электрофорез нативного и обработанного ферментом рчФСГ в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) на установке Mini-PROTEAN II TETRA CELL (Bio-Rad, США). В качестве маркеров молекулярной массы использовали Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific, США). Перед нанесением на гель образцы белка прогревали при температуре 70°С в течение 10 минут в растворе, содержащем 0,05% бромфенолового синего, 2% SDS, 10% глицерина, 0,0625 М трис-HCl (рН 6,8), 400 мМ β-меркаптоэтанола. Электрофорез белков проводили при напряжении 180 V в течение 1 часа. После промывки геля в дистиллированной воде проводили окрашивание раствором Optiblot Blue Gel Stain (Abcam, США) в течение 15 минут. Затем производили трехкратную отмывку геля в дистиллированной воде в течение 10 минут.Example 5. Treatment with neuraminidase and protein electrophoresis in PAG in the presence of sodium dodecyl sulfate. The protein obtained in Example 4 was treated with the enzyme neuraminidase (NEB, USA), which cleaves the terminal residues of sialic acid, according to the manufacturer's procedure. Then, electrophoresis was performed on native and enzyme-treated rhFSH in 15% polyacrylamide gel (PAGE) using a Mini-PROTEAN II TETRA CELL (Bio-Rad, USA). Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific, USA) was used as molecular weight markers. Before applying to the gel, protein samples were heated at 70 ° C for 10 minutes in a solution containing 0.05% bromophenol blue, 2% SDS, 10% glycerol, 0.0625 M Tris-HCl (pH 6.8), 400 mM β-mercaptoethanol. Protein electrophoresis was carried out at a voltage of 180 V for 1 hour. After washing the gel in distilled water, staining with Optiblot Blue Gel Stain solution (Abcam, USA) was performed for 15 minutes. Then, the gel was washed three times in distilled water for 10 minutes.
На электрофореграмме обнаруживались полосы, соответствующие альфа- и бета-субъединице гетеродимера рчФСГ (Фиг. 7). Увеличение молекулярной массы белка на электрофорезе в ПААГ по сравнению с теоретически рассчитанной связано с наличием гликанов в составе гликопротеина. Гидрофильные гликаны уменьшают гидрофобные взаимодействия между белком и додецилсульфатом натрия (ДСН), препятствуя связыванию белка с ДСН, в результате чего кажущаяся молекулярная масса белка увеличивается [Stoyanov A.V. The proteome revisited: theory and practice of all relevant electrophoretic steps. 2001. Elsevier]. В случае необработанного нейраминидазой рчФСГ молекулярная масса альфа- и бета- субъединиц находилась в диапазоне 32-36 кДа, в случае обработанного нейраминидазой - 28-32 кДа. Такое снижение молекулярной массы субъединиц согласуется с данными о молекулярной массе рчФСГ, полученными в работе Heum K., Kim S.C., Seo K.S., Lee S.H., Kim W.B., Lee K.C. Purification and characterization of recombinant human follicle stimulating hormone produced by Chinese hamster ovary cells // J Microbiol Biotechnol., 2005, 15(2):395-402.On the electrophoregram, bands corresponding to the alpha and beta subunits of the rhFSH heterodimer were detected (Fig. 7). The increase in the molecular weight of the protein on electrophoresis in PAGE compared to the theoretically calculated one is due to the presence of glycans in the glycoprotein. Hydrophilic glycans reduce hydrophobic interactions between protein and sodium dodecyl sulfate (SDS), preventing protein from binding to SDS, resulting in an increase in the apparent molecular weight of the protein [Stoyanov A.V. The proteome revisited: theory and practice of all relevant electrophoretic steps. 2001. Elsevier]. In the case of rhFSH untreated with neuraminidase, the molecular weight of the alpha and beta subunits was in the range of 32-36 kDa, in the case of neuraminidase-treated 28-32 kDa. Such a decrease in the molecular weight of the subunits is consistent with the data on the molecular weight of rhFSH obtained by Heum K., Kim S.C., Seo K.S., Lee S.H., Kim W.B., Lee K.C. Purification and characterization of recombinant human follicle stimulating hormone produced by Chinese hamster ovary cells // J Microbiol Biotechnol., 2005, 15 (2): 395-402.
Пример 6. Определение изоэлектрической точки рчФСГ методом капиллярного изоэлектрического фокусирования.Example 6. Determination of the isoelectric point of rhFSH by capillary isoelectric focusing.
РчФСГ, полученный в примере 4, был сконцентрирован с помощью ультрафильтрационных спин-колонок Amicon Ultra-0.5 («Merck Millipore», Германия) до конечной концентрации 10 мг/мл по инструкции производителя.The rhFSH obtained in Example 4 was concentrated using Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration spin columns (Merck Millipore, Germany) to a final concentration of 10 mg / ml according to the manufacturer's instructions.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (кИЭФ) проводили в капилляре длиной 45 см и внутренним диаметром 50 мкм, в 3 М мочевине с амфолитами «Pharmalyte 3-10» («GE-Healthare», США), с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М» («Люмэкс», Россия).Capillary isoelectric focusing (cIEF) was carried out in a 45 cm long capillary and an inner diameter of 50 μm, in 3 M urea with Pharmalyte 3-10 ampholytes (GE-Healthare, USA), using the Drop-105M capillary electrophoresis system (Lumex, Russia).
Обработку данных проводили в программе «Эльфоран» («Люмэкс», Россия). Расчет изоэлектрических точек белковых фракций осуществляли по уравнению, полученному методом линейной регрессии по пептидным маркерам с известными значениями pI.Data processing was carried out in the Elforan program (Lumex, Russia). Calculation of isoelectric points of protein fractions was carried out according to the equation obtained by linear regression on peptide markers with known pI values.
Результаты, представленные на Фиг. 8, показывают, что очищенный рчФСГ состоит из фракций, pI которых располагаются в диапазоне от 3,83 до 5,01, что соответствует диапазону значений pI для изоформ биологически активного рчФСГ [US 7939296; Driebergen R., Baer G. Quantification of follicle stimulating hormone (follitropin alfa): is in vivo bioassay still relevant in the recombinant age? // Curr Med Res Opin., 2003, 19(1):41-46; Mulders J.W., Derksen M., Swolfs A., Maris F. Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing // Biologicals, 1997, 25(3):269-281].The results presented in FIG. 8 show that purified rhFSH consists of fractions whose pI ranges from 3.83 to 5.01, which corresponds to the pI range for isoforms of biologically active rhFSH [US 7939296; Driebergen R., Baer G. Quantification of follicle stimulating hormone (follitropin alfa): is in vivo bioassay still relevant in the recombinant age? // Curr Med Res Opin., 2003, 19 (1): 41-46; Mulders J.W., Derksen M., Swolfs A., Maris F. Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing // Biologicals, 1997, 25 (3): 269-281].
Пример 7. Оценка биологической активности рчФСГ, продуцируемого линией культивируемых клеток CHO-FSH 91.Example 7. Evaluation of the biological activity of rhFSH produced by the cultured cell line CHO-
Для определения биологической активности рчФСГ, полученного в примере 4, использовали методику, основанную на определении концентрации циклического АМФ в клетках, экспрессирующих FSHR - рецептор ФСГ (RU 2193599; Minegishi Т., Igarashi S., Nakamura K., Nakamura М., Tano М., Shinozaki Н., Miyamoto K., Ibuki Y. Functional expression of the recombinant human FSH receptor // J Endocrinol., 1994, 141(2): 369-375).To determine the biological activity of rhFSH obtained in Example 4, we used a technique based on the determination of the concentration of cyclic AMP in cells expressing FSHR - FSH receptor (RU 2193599; Minegishi T., Igarashi S., Nakamura K., Nakamura M., Tano M ., Shinozaki N., Miyamoto K., Ibuki Y. Functional expression of the recombinant human FSH receptor // J Endocrinol., 1994, 141 (2): 369-375).
Линия клеток CHO-FSHR 11 была получена трансфекцией клеток линии CHOdhƒr-, дефицитных по гену дегидрофолатредуктазы, вектором, содержащим последовательность FSHR - рецептора фолликулостимулирующего гормона, и отбором наиболее хорошо растущего клона, экспрессирующего FSHR. Альтернативно можно использовать любую клеточную культуру, экспрессирующую рецептор ФСГ. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 (HyClone, США), содержащей 10% сыворотки (HyClone, США). За день до проведения эксперимента клетки засевали в лунки 24-луночного планшета (Jet Biofil, Китай) в 1 мл ростовой среды в плотности 4⋅105 кл/мл. Через сутки кондиционированную среду в лунках заменяли на 950 мкл среды DMEM/F12 без сыворотки, содержащей 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma, США) в конечной концентрации 0,1 мМ. Планшет инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°С в течение 15 минут, после чего к клеткам добавляли образцы рчФСГ. Активность полученного в примере 4 рчФСГ сравнивали с активностью препарата «Гонал-Ф» (Merck Serono, Италия). Образец рчФСГ, полученного в примере 4, и препарат Гонал-Ф разводили средой DMEM/F12 без сыворотки до концентрации 17 нг/мл, что составляет 0,23 МЕ/мл для препарата Гонал-Ф. Далее готовили 4 последовательных разведения образца рчФСГ и препарата Гонал-Ф с шагом 1:3. Затем полученные разведения вносили в лунки планшета с подготовленными клетками CHO-FSHR 11 по 50 мкл на каждую лунку, после чего проводили инкубацию планшета в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут. Среду удаляли, промывали лунки планшета фосфатно-солевым буфером и вносили по 200 мкл однократного лизирующего буфера Cell Lysis Buffer 5 из набора Parameter cAMP Assay kit (R&D Systems, США), Концентрацию цАМФ в полученных лизатах определяли с помощью набора Parameter cAMP Assay kit (R&D Systems, США). Затем строили график зависимости концентрации цАМФ в лизатах от концентрации образцов рчФСГ. Результаты, представленные на Фиг. 9, показывают, что препарат Гонал-Ф и рчФСГ, полученный в примере 4, одинаково стимулируют продукцию цАМФ клетками CHO-FSHR 11 в исследованном диапазоне концентрации, при этом 50% повышение уровня цАМФ наступает при одинаковой концентрации рчФСГ и Гонал-Ф, равной 4 нг/мл, что указывает на одинаковую активность сравниваемых препаратов.The CHO-
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019105063A RU2697273C1 (en) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | Method of producing human recombinant follicle-stimulating hormone, producing cell line and plasmid expression vectors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019105063A RU2697273C1 (en) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | Method of producing human recombinant follicle-stimulating hormone, producing cell line and plasmid expression vectors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2697273C1 true RU2697273C1 (en) | 2019-08-13 |
Family
ID=67640315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019105063A RU2697273C1 (en) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | Method of producing human recombinant follicle-stimulating hormone, producing cell line and plasmid expression vectors |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2697273C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU209043U1 (en) * | 2021-08-25 | 2022-01-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Астраханский государственный технический университет, ФГБОУ ВО "АГТУ" | DEVICE FOR ISOLATION AND PURIFICATION OF NUCLEIC ACIDS AND/OR MACROMOLECULES FROM BIOLOGICAL SAMPLE |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502798C2 (en) * | 2012-02-22 | 2013-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармако Биотех" | Cell line hufshik releasing recombinant human follicle-stimulating hormone |
| RU2560596C2 (en) * | 2013-09-24 | 2015-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АйВиФарма" (ООО "АйВиФарма") | Expression plasmid for human recombinant follicle-stimulating hormone (fsh) in cho cells, expression plasmid for beta-subunit of human recombinant fsh in cho cells, cho cell producing human recombinant fsh, and method for producing above hormone |
-
2019
- 2019-02-22 RU RU2019105063A patent/RU2697273C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502798C2 (en) * | 2012-02-22 | 2013-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармако Биотех" | Cell line hufshik releasing recombinant human follicle-stimulating hormone |
| RU2560596C2 (en) * | 2013-09-24 | 2015-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АйВиФарма" (ООО "АйВиФарма") | Expression plasmid for human recombinant follicle-stimulating hormone (fsh) in cho cells, expression plasmid for beta-subunit of human recombinant fsh in cho cells, cho cell producing human recombinant fsh, and method for producing above hormone |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KIM D.-J. et al., Highly expressed recombinant human follicle-stimulating hormone from Chinese hamster ovary cells grown in serum-free medium and its effect on induction of folliculogenesis and ovulation, Fertil and Steril., 2010, v.93, n.8, p.2652-2660. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU209043U1 (en) * | 2021-08-25 | 2022-01-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Астраханский государственный технический университет, ФГБОУ ВО "АГТУ" | DEVICE FOR ISOLATION AND PURIFICATION OF NUCLEIC ACIDS AND/OR MACROMOLECULES FROM BIOLOGICAL SAMPLE |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Howles | Genetic engineering of human FSH (Gonal-F®) | |
| JP5076084B2 (en) | Novel vector and expression cell line for mass production of recombinant protein, and method for producing recombinant protein using the same | |
| JP5432117B2 (en) | Recombinant expression vector element (rEVE) for enhancing expression of recombinant protein in a host cell | |
| KR101229995B1 (en) | Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin | |
| JP4293908B2 (en) | Chromatographic purification of recombinant human erythropoietin | |
| EP2808341B1 (en) | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells | |
| US20090029907A1 (en) | Recombinant Method for Production of an Erythropoiesis Stimulating Protein | |
| EP3277807B1 (en) | Eukaryotic expression vectors comprising regulatory elements of the globin gene clusters | |
| RU2697273C1 (en) | Method of producing human recombinant follicle-stimulating hormone, producing cell line and plasmid expression vectors | |
| EP1141366B1 (en) | Transfectacons comprising calcium phosphate and a nucleic acid | |
| WO2019184372A1 (en) | Gene combination for efficient expression of recombinant human nerve growth factor | |
| RU2555533C2 (en) | Recombined plasmid dna coding chimeric antibody against human tumour necrosis factor-alpha, eukaryotic cell line producing chimeric antibody, and method of chimeric antibody obtainment | |
| CN116648258A (en) | Cell culture method for producing RSV F protein | |
| RU2656142C1 (en) | Recombinant plasmid dna pbipr-abiga1fi6-ht for obtaining recombinant immunoglobulin a igoth iga1 | |
| KR100595864B1 (en) | Transformed Saccharomyces cerevisiae strain and method for producing L8 protein using same | |
| RU2502798C2 (en) | Cell line hufshik releasing recombinant human follicle-stimulating hormone | |
| WO1991005052A1 (en) | Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae | |
| Joshi et al. | Recombinant protein expression in mammalian cells | |
| KR102680148B1 (en) | CHO cells-derived protein secretory factors and expression vectors comprising the same | |
| RU2671477C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA OF pBiPr-ABIgA2m1F16-ht TO OBTAIN RECOMBINANT IMMUNOGLOBULIN A OF ISOTYPE IgA2m1 | |
| WO2025066945A1 (en) | Method for expressing and purifying human recombinant interleukin-7 | |
| CN108424459A (en) | The fusion protein and its preparation method and application of human serum albumins and people's saltant type hepatocyte growth factor | |
| RU2664184C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN | |
| Joshi¹ et al. | Recombinant protein expression in | |
| WO2025066687A1 (en) | Expression and purification method for recombinant human interleukin-15 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210223 |