RU2686732C2 - Method for carrying out tuberculostatic tests in patients with pulmonary tuberculosis for laboratory substantiation of personified treatment - Google Patents
Method for carrying out tuberculostatic tests in patients with pulmonary tuberculosis for laboratory substantiation of personified treatment Download PDFInfo
- Publication number
- RU2686732C2 RU2686732C2 RU2017106232A RU2017106232A RU2686732C2 RU 2686732 C2 RU2686732 C2 RU 2686732C2 RU 2017106232 A RU2017106232 A RU 2017106232A RU 2017106232 A RU2017106232 A RU 2017106232A RU 2686732 C2 RU2686732 C2 RU 2686732C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- serum
- growth
- tuberculosis
- dilution
- suspension
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000814 tuberculostatic agent Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 230000001549 tubercolostatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 5
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 4
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000012766 Growth delay Diseases 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- VRDIULHPQTYCLN-UHFFFAOYSA-N Prothionamide Chemical compound CCCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 VRDIULHPQTYCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960004602 capreomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229960003077 cycloserine Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960002001 ethionamide Drugs 0.000 description 1
- AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N ethionamide Chemical compound CCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006997 middlebrook medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 1
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229960000918 protionamide Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиатрии и бактериологии, и может быть использовано для лабораторной оценки адекватности химиотерапии легочного туберкулеза и коррекции химиотерапии, а также оценки ex vivo противотуберкулезной активности новых препаратов.The invention relates to medicine, in particular to the field of phthisiology and bacteriology, and can be used for laboratory evaluation of the adequacy of chemotherapy for pulmonary tuberculosis and the correction of chemotherapy, as well as the evaluation of the ex vivo anti-tuberculosis activity of new drugs.
Лекарственная устойчивость Mycobacterium tuberculosis (МБТ), в особенности множественная и широкая (МЛУ и ШЛУ), еще в 2006 г. признана ВОЗ глобальной угрозой [9]. По данным ВОЗ в 2014 г. МЛУ-туберкулезом заболели 480000 человек, умерло от него 190000 [10]. Низкая эффективность лечения туберкулеза, отягощенного МЛУ и ШЛУ, соответственно 39,1% и 26,2% по данным Стерликова С.А. и соавторов [7], до 51,1 по данным Тестова В.В. и соавторов [8], высокая его стоимость [1, 5] требуют особенно тщательного и точного подбора химиотерапии, перехода от стандартного и эмпирического к лабораторно обоснованному персонализированному режиму.Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis (MBT), especially multiple and broad (MDR and XDR), was recognized by WHO as a global threat in 2006 [9]. According to the WHO, in 2014, 500,000 people became sick with MDR-tuberculosis, and 190,000 people died from it [10]. Low efficacy of treatment of tuberculosis, burdened by MDR and XDR, respectively 39.1% and 26.2% according to S. Sterlikova. and co-authors [7], up to 51.1, according to Testov V.V. and co-authors [8], its high cost [1, 5] requires particularly careful and precise selection of chemotherapy, the transition from the standard and empirical to laboratory-based personalized regimen.
Суть проведения туберкулостатической пробы (ТСП) заключается в оценке способности сыворотки крови, собранной на пике концентраций назначаемых пациенту нескольких противотуберкулезных препаратов (ПТП), задерживать in vitro рост штамма М. tuberculosis, выделенного от данного больного (аутоштамма). В сравнении с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) какого-либо одного противотуберкулезного препарата, либо ряда препаратов по отдельности [6], ценность ТСП (ранее: тест БАК - бактериостатической активности крови) определяется тем, что величина ТСП/БАК является результирующей действия многих факторов: пути введения препаратов, их фармакокинетики и фармакодинамики в организме данного больного, синергизма или антагонизма комплекса вводимых веществ, уровня чувствительности возбудителя к каждому из назначаемых препаратов. Все перечисленное позволяет отнести данный тест к важным методам, которые обеспечивают лабораторное обоснование персонализированной химиотерапии.The essence of the tuberculostatic test (TSP) is to assess the ability of the blood serum collected at the peak concentration of several anti-tuberculosis drugs (TAPs) assigned to a patient to retard in vitro growth of the M. tuberculosis strain isolated from this patient (autostamma). In comparison with the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of a single anti-tuberculosis drug or a number of drugs separately [6], the value of TSP (previously: BAC test — bacteriostatic blood activity) is determined by the fact that the TSP / BAK value is the resultant effect of many factors: the route of administration of drugs, their pharmacokinetics and pharmacodynamics in the body of the patient, synergy or antagonism of the complex of injected substances, the level of sensitivity of the pathogen to each of the prescribed drug s. All of the above allows us to classify this test as an important method that provides laboratory justification for personalized chemotherapy.
Ранее было показано, что величина ТСП (БАК) коррелирует с клиническими показателями эффективности лечения (101 пациент) [2, 4]. Так, низкие и нулевые значения БАК соотносятся с наибольшей длительностью бактериовыделения (3,8+1,2 и 5,5+1,0 месяцев) и сохранением его через 3 и 6 месяцев лечения (у 44,8% и 27,6% больных при низких значениях БАК и у 100,0% и 54,5% - при нулевых), а также с наименьшей частотой значительных улучшений у пациентов в ходе лечения - 62,1% и 18,2% против 80,0% при высоких значениях БАК в случаях устойчивости возбудителя к изониазиду.It was previously shown that the value of TSP (BAC) correlates with clinical efficacy of treatment (101 patients) [2, 4]. Thus, the low and zero values of BAC correlate with the longest duration of bacterial excretion (3.8 + 1.2 and 5.5 + 1.0 months) and its retention after 3 and 6 months of treatment (in 44.8% and 27.6% patients with low BAC values and 100.0% and 54.5% with zero), as well as with the least frequency of significant improvements in patients during treatment - 62.1% and 18.2% against 80.0% with high values of LHC in cases of pathogen resistance to isoniazid.
Прототипом предлагаемого способа является пробирочный метод определения БАК (ТСП) [2, 3, 4] с помощью полужидкой среды, недостатком которого является субъективность теста, так как результат регистрируется визуально.The prototype of the proposed method is an in vitro method for determining the LHC (TBC) [2, 3, 4] using a semi-liquid medium, the disadvantage of which is the subjectivity of the test, since the result is recorded visually.
Предлагаемый способ переводит пробирочный метод определения ТСП/БАК в формат приборного определения с помощью метода микроразведений в планшете с индикацией роста М. tuberculosis посредством резазурина и регистрацией роста с помощью планшетного флуоресцентного спектрофотометра.The proposed method translates the in vitro method for determining TSP / BAK in an instrument definition format using the microdilution method in a tablet with an indication of M. tuberculosis growth using resazurin and recording the growth using a fluorescent plate spectrophotometer.
Преимущество предлагаемого способа: 1) объективная оценка интенсивности роста М. tuberculosis посредством приборного измерения (планшетный флуориметр) интенсивности флуоресценции резоруфина, который образуется при воздействии комплекса ферментов окислительно-восстановительной системы микобактерий на индикатор роста резазурин; 2) определение точки задержки роста исследуемого штамма после инкубации с разведениями сыворотки крови пациента, содержащей комплекс противотуберкулезных препаратов на пике их концентрации, путем построения графика интенсивности флуоресценции резоруфина с помощью программы, составленной на платформе пакета программ Microsoft Excel; 3) в отличие от пробирочного метода разведение пробы сыворотки параллельно в восьми лунках планшета позволяет избежать ошибки разведения, учесть влияние разведений на флуоресценцию индикатора, обработать статистически полученные данные.The advantage of the proposed method: 1) an objective assessment of the growth rate of M. tuberculosis by means of instrumental measurement (plate fluorometer) of the fluorescence intensity of resorufin, which is formed when a complex of enzymes of the mycobacterial redox system is affected by the resazurin growth indicator; 2) determining the growth inhibition point of the studied strain after incubation with dilutions of the patient's blood serum containing a complex of anti-tuberculosis drugs at the peak of their concentration, by plotting the resorufin fluorescence intensity using a program compiled on the Microsoft Excel software platform; 3) in contrast to the test-tube method, diluting the serum sample in parallel in eight wells of the plate allows you to avoid dilution errors, take into account the effect of dilutions on the indicator fluorescence, process the statistically obtained data.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка приборного способа определения туберкулостатической (бактериостатической) активности крови с целью лабораторного обоснования персонализированного лечения больных туберкулезом легких, отягощенного множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя, а также оценки активности ex vivo новых противотуберкулезных препаратов.The task of the invention is to develop an instrumental method for determining tuberculostatic (bacteriostatic) blood activity for the purpose of laboratory substantiation of personalized treatment of patients with pulmonary tuberculosis, burdened with multiple and extensive drug-resistant pathogen, as well as an assessment of the activity of ex vivo new anti-TB drugs.
Задача решается за счет того, что сыворотку крови пациента, взятой на пике концентраций вводимых препаратов, разводят последовательно двукратно в 96-луночном планшете жидкой средой Миддлбрука 7Н9 (с 10% ростовой добавки OADC) и засевают суспензией штамма М. tuberculosis, выделенного от данного больного, интенсивность роста бактерий визуализируют с помощью резазурина и регистрируют в планшетном флуориметре, точку задержки роста возбудителя определяют графически с помощью составленной на платформе Microsoft Excel программы. Оценка активности противотуберкулезных препаратов приводится на примере исследования потенцирующего эффекта перхлозона.The problem is solved due to the fact that the patient's blood serum, taken at the peak of the concentrations of the injected drugs, is diluted twice twice in a 96-well plate with Middlebrook 7H9 liquid medium (with 10% growth supplement OADC) and inoculated with a suspension of M. tuberculosis strain isolated from this patient , the growth rate of bacteria is visualized using resazurin and recorded in a tablet fluorimeter, the growth delay of the pathogen is determined graphically using a program compiled on the Microsoft Excel platform. The evaluation of the activity of anti-TB drugs is given on the example of a study of the potentiating effect of perchlozone.
Способ поясняется графическим изображениями, где:The method is illustrated by graphic images, where:
Фиг. 1. Пациент А., штамм 2801. Сыворотка задерживает рост M. tuberculosis в разведении 1:64 (log2=6).FIG. 1. Patient A.,
А - графический вариант. По оси абсцисс - разведения сыворотки; по оси ординат - интенсивность флуоресценции в условных единицах. ТСП - линия изменения интенсивности флуоресценции в лунках с разведениями сыворотки. Контроль - рост рабочей суспензии без сыворотки, 10% Контроль - 10% от интенсивности свечения контроля роста рабочей суспензии, 1% Контроль - интенсивность флуоресценции разведенной в 100 раз рабочей суспензии; во всех случаях сплошные линии - средние значения, пунктирные - верхние и нижние значения доверительного интервала (при р=0,05). Б - визуальный вариант.A - graphic option. The abscissa axis is the serum dilution; on the ordinate axis - fluorescence intensity in arbitrary units. TSP - line changes in fluorescence intensity in wells with serum dilutions. Control - growth of the working suspension without serum, 10% Control - 10% of the luminescence intensity of growth control of the working suspension, 1% Control - fluorescence intensity of the working suspension diluted 100 times; in all cases, the solid lines are the mean values, and the dotted lines are the upper and lower values of the confidence interval (with p = 0.05). B - a visual option.
Фиг. 2. Пациент А., штамм 2801, терапия усилена перхлозоном. Сыворотка задерживает рост М. tuberculosis в разведении 1:64 (log2=6).FIG. 2. Patient A.,
См. примечания к рис. 1.See notes to fig. one.
Фиг. 3. Пациентка Ф., штамм 147, ТСП до и после введения перхлозона.FIG. 3. Patient F., strain 147, TSP before and after the administration of perchlozone.
А. Сыворотка задерживает рост М. tuberculosis в разведении 1:8 (log2иcx=3). Б. Сыворотка задерживает рост М. tuberculosis в разведении 1:16 (log2Пх=4). Потенцирование в 2 раза, log2Пх-log2исх=1.A. Serum retards the growth of M. tuberculosis at a dilution of 1: 8 (log 2 and cx = 3). B. Serum retards the growth of M. tuberculosis at a dilution of 1:16 (log 2Px = 4).
Фиг. 4. Пациент П., штамм 1127, ТСП до и после введения перхлозона.FIG. 4. Patient P., strain 1127, TSP before and after the administration of perchlozone.
А. Сыворотка задерживает рост M. tuberculosis в разведении 1:32 (log2исх=5). Б. Сыворотка задерживает рост M. tuberculosis в разведении 1:512 (log2Пх=9). Потенцирование в 16 раз, log2Пх-log2исх=4.A. Serum retards the growth of M. tuberculosis at a dilution of 1:32 (log 2 = = 5). B. Serum retards the growth of M. tuberculosis at a dilution of 1: 512 (log 2Px = 9).
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
За 2 дня до ТСП отменяют все препараты.2 days before the TSP cancel all drugs.
1. Кровь на ТСП забирают на пике концентраций препаратов. При пероральном введении - за 2 часа до взятия крови (этионамид, протионамид - за 5 часов, внутримышечном - за 1 час, внутривенном - непосредственно перед взятием крови, из локтевой вены другой руки (в вену одной руки вводится препарат, из вены другой руки берут кровь). Кровь забирают в объеме 10-12 мл в стерильные иммунологические пробирки с коагулирующим агентом, способствующим образованию сгустка и отделению сыворотки, или в сухие стерильные пластиковые пробирки.1. Blood on TSP is taken at the peak of drug concentrations. When administered orally - 2 hours before blood collection (ethionamide, protionamide - 5 hours, intramuscular - 1 hour, intravenously - just before taking blood, from the ulnar vein of the other hand (a drug is injected into the vein of one hand) blood). Blood is collected in a volume of 10-12 ml in sterile immunological tubes with a coagulating agent that promotes clot formation and serum separation, or in dry sterile plastic tubes.
2. Подготовка питательной среды.2. Preparation of nutrient medium.
Готовят 15 мл коммерческой жидкой среды Миддлбрука7Н9 с коммерческой ростовой добавкой OADC (10%) согласно прописи производителя среды.Prepare 15 ml of a commercial liquid medium Middlebrook7H9 with a commercial growth supplement OADC (10%) according to the formulation of the medium manufacturer.
3. Подготовка суспензии аутоштамма пациента.3. Preparation of the patient's autostrain suspension.
Используют штамм М. tuberculosis, свежевыделенный (не более месяца с момента выделения) на плотной яичной среде, или 3-недельную субкультуру (на среде Левенштейна-Йенсена).The M. tuberculosis strain, freshly isolated (no more than a month from the moment of isolation) on a dense egg medium, or a 3-week subculture (on a Levenshtein-Jensen medium) is used.
Готовят суспензию M. tuberculosis в бульоне 7Н9 (без ростовой добавки OADC). В сухую стеклянную пробирку с 6-8 стеклянными бусами диаметром 3 мм, помещают полную петлю культуры M. tuberculosis, которую растирают в течение 15-20 сек с помощью шейкера Vortex, добавляют 3 капли бульона Миддлбрука и вновь растирают. Затем добавляют 5 мл той же среды, размешивают получившуюся суспензию и оставляют для осаждения конгломератов на 40 мин. Собирают верхнюю часть (≈2 см) супернатанта в сухую пробирку и доводят бульоном Миддлбрука до плотности 1,5 ед. по McFarland, измерение на DENSILAMETR. Для приготовления рабочей суспензии концентрацией 5×107 м.к./мл (микробных клеток/мл) разводят суспензию жидкой средой 7Н9 с 10% OADC в 10 раз, объем 12 мл (1,2 мл суспензии плотностью 1,5 ед. по McFarland + 10,8 мл 7Н9 с OADC) в пробирке объемом 50 мл.A suspension of M. tuberculosis in 7H9 broth is prepared (without OADC growth supplement). In a dry glass tube with 6-8 glass beads with a diameter of 3 mm, place a complete loop of M. tuberculosis culture, which is triturated for 15-20 seconds with a Vortex shaker, add 3 drops of Middlebrook broth and again triturate. Then add 5 ml of the same medium, stir the resulting suspension and leave to precipitate the conglomerates for 40 minutes. Collect the upper part (≈2 cm) of the supernatant in a dry tube and bring Middlebrook broth to a density of 1.5 units. by McFarland, measurement at DENSILAMETR. To prepare a working suspension with a concentration of 5 × 10 7 mk / ml (microbial cells / ml), dilute the suspension with 7H9 liquid medium with 10% OADC 10 times, the volume of 12 ml (1.2 ml of suspension with a density of 1.5 units). McFarland + 10.8 ml of 7H9 with OADC) in a 50 ml tube.
Для приготовления контроля роста 1% популяции (концентрация 5×105 м.к/мл, 10-2) разводят рабочую суспензию в 100 раз. Для этого: 1) разводят рабочую суспензию в 10 раз (10-1) - 0,1 мл рабочей суспензии + 0,9 мл 7Н9 с OADC; 2) предыдущую суспензию разводят еще в 10 раз: 0,2 мл разведения 10-1 + 1,8 мл 7Н9 с OADC, объем конечного разведения 2 мл.To prepare a growth control of 1% of the population (concentration 5 × 10 5 mk / ml, 10 -2 ) dilute the working suspension 100 times. To do this: 1) dilute the working suspension 10 times (10 -1 ) with 0.1 ml of the working suspension + 0.9 ml of 7H9 with OADC; 2) the previous suspension is diluted 10 times: 0.2 ml dilution 10 -1 + 1.8 ml 7Н9 with OADC, the final dilution volume is 2 ml.
4. Приготовление сыворотки4. Preparation of serum
Переносят сыворотку из пробирки с коагулирующим агентом в сухую стерильную пробирку. При использовании пробирок без коагулирующего агента ставят пробирку с кровью на 30 мин в термостат, затем на 30 мин в холодильник (+4°С). Осторожно обводят стерильной пипеткой или палочкой образовавшийся сгусток в верхней его части. Центрифугируют 10 мин 1000 об/мин. Переносят сыворотку из пробирки со сгустком в сухую стерильную пробирку.Transfer the serum from the tube with the coagulating agent to a dry sterile tube. When using tubes without a coagulating agent, put the tube with blood for 30 minutes in a thermostat, then for 30 minutes in a refrigerator (+ 4 ° C). Carefully enclose the clot in the upper part of it with a sterile pipette or a stick. Centrifuged at 10 rpm for 1000 rpm. Transfer the serum from the tube with a clot into a dry sterile tube.
5. Подготовка планшета со средой для приготовления разведений сыворотки.5. Preparation of the tablet with the medium for the preparation of serum dilutions.
Надписывают 96-луночный стерильный плоскодонный планшет в соответствии со схемой исследования. Вносят в планшет жидкую среду Миддлбрука с 10% ростовой добавки OADC по 150 мкл в ряды А-Н1-11, в ряд A-D12 - по 180 мкл (бланк), в ряд Е-Н12 - по 105 мкл, затем в ряд Е-Н12 добавляют по 75 мкл неразведенной сыворотки пациента (контроль сыворотки).Label the 96-well sterile flat-bottomed plate according to the study design. The liquid medium of Middlebrook is introduced into the plate with 10% growth supplement OADC 150 μl each in rows A-H1-11, in row A-D12 - 180 μl each (blank), in row E-H12 - 105 μl, then in row E -H12 add 75 µl of undiluted patient serum (serum control).
6. Разведение сыворотки.6. Dilution of serum.
В ряд А-Н1 планшета со средой Миддлбрука вносят по 150 мкл исследуемой сыворотки, разводят последовательно двукратно 8-канальным дозатором, из ряда А-Н10 отбирают по 150 мкл и выливают в дезраствор. Затем в ряды А1-10, В1-10 вносят по 30 мкл среды 7Н9 с OADC.In the row A-H1 of the tablet with Middlebrook medium, 150 μl of the test serum is applied, diluted two-fold with an 8-channel dispenser, 150 μl taken from the series A-H10, and poured into a disinfecting solution. Then, 30 μl of 7H9 medium with OADC are introduced into rows A1-10, B1-10.
7. Инокуляция суспензии М. tuberculosis.7. Inoculation of M. tuberculosis suspension.
В ряды CH1-10, A-D11 планшетов с разведениями сыворотки в среде Миддлбрука вносят по 30 мкл рабочей суспензии, в ряд Е-Н11 - по 30 мкл суспензии МБТ 10-2 (контроль роста 1% популяции).30 μl of the working suspension are introduced into the rows of CH1-10, A-D11 plates with serum dilutions in the medium of Middlebrook, 30 μl of the MBT 10 -2 suspension each in the E-H11 series (growth control of 1% of the population).
8. Инкубация.8. Incubation.
Засеянные планшеты помещают в герметичные пластиковые пакеты с увлажненной ватой, инкубируют при температуре 35°С в течение 7 дней. Затем во все лунки вносят по 30 мкл 0,02% стерильного водного раствора резазурина (Sigma, кат. номер R7017), инкубируют вторично 18 ч. В случае слабого изменения окраски индикатора инкубацию продлевают еще на 1-2 суток.Sowed plates are placed in sealed plastic bags with moistened cotton, incubated at 35 ° C for 7 days. Then, 30 μl of 0.02% sterile aqueous solution of resazurin (Sigma, cat. No. R7017) is added to all wells, incubated for a second time for 18 hours. In case of a slight discoloration of the indicator, the incubation is prolonged for another 1-2 days.
9. Регистрация результата9. Registration of the result
С помощью планшетного флуориметра FLUOstarOptima (длина волны возбуждения - 520 нм, излучения - 590 нм) измеряют интенсивность флуоресценции в лунках планшета.Using a FLUOstarOptima plate fluorimeter (excitation wavelength - 520 nm, radiation - 590 nm), the fluorescence intensity in the wells is measured.
10. Математическая обработка полученных данных10. Mathematical processing of the data
С помощью программы, составленной в формате МС Excel вычисляют: 1) среднее значение интенсивности свечения контроля разведения сыворотки (КРС) в каждом разведении; 2) в каждой лунке, с инокулятом рабочей суспензии штамма М. tuberculosis, от значения интенсивности свечения данного разведения сыворотки вычитают среднее значение интенсивности свечения КРС; 3) среднее значение интенсивности свечения полученных значений; 4) среднее значение интенсивности свечения контроля роста рабочей суспензии; 5) вычисляют 10% от каждого из значений интенсивности свечения контроля роста рабочей суспензии в каждой лунке планшета и находят среднее значение - 10% контроль; 6) среднее значение интенсивности свечения контроля роста 1% популяции (10-2). Для каждого из полученных параметров вычисляют доверительный интервал (α=0,05). На основании полученных данных в программе Excel строят графики и определяют точку ТСП. Величина ТСП равна log2 разведения сыворотки в точке пересечении прямой, соответствующей средним значениям контроля роста 1% популяции (10-2) в рамках доверительного интервала. Значимость отличий от 1%-ного контроля определяют по t-тесту для парных выборок с помощью программы VassarStats или Microsoft Excel (2 хвоста, двухпарный с неравным отклонением).Using the program compiled in MS Excel format, the following is calculated: 1) the average value of the luminescence intensity of the control of the serum dilution (RS) at each dilution; 2) in each well, with an inoculum of the working suspension of the M. tuberculosis strain, subtract the average value of the luminous intensity of the cattle from the value of the luminescence intensity of this dilution of serum; 3) the average value of the intensity of the glow obtained values; 4) the average value of the intensity of the glow control growth of the working suspension; 5) calculate 10% of each of the values of the intensity of the glow control growth of the working suspension in each well of the tablet and find the average value - 10% control; 6) the average value of the intensity of the glow control growth of 1% of the population (10 -2 ). For each of the parameters obtained, a confidence interval is calculated (α = 0.05). On the basis of the obtained data in the Excel program, graphs are plotted and a point of the commercial center is determined. The value of the TSP is equal to the log 2 dilution of serum at the point of intersection of the straight line corresponding to the average values of the growth control of 1% of the population (10 -2 ) within the confidence interval. Significance of differences from 1% control is determined by t-test for paired samples using VassarStats or Microsoft Excel (2 tails, two-pair with unequal deviation).
11. Оценка активности сыворотки, содержащей комплекс противотуберкулезных препаратов.11. Evaluation of the activity of serum containing a complex of anti-TB drugs.
Оценку туберкулостатической пробы (ТСП) проводили аналогично пробирочному методу [2, 3, 4]: ТСП считали высокой, если сыворотка задерживала рост МБТ в 5-10 разведении (1:32 - 1:1024), средней - в 3-4 (1:8 - 1:16), низкой - в 1-2 (1:2 - 1:4), нулевой - если сыворотка не задерживала рост МБТ ни в одном из разведений.The assessment of tuberculostatic test (TSP) was carried out similarly to the test tube method [2, 3, 4]: TSP was considered high if the serum retarded the growth of MBT in 5-10 dilution (1:32 - 1: 1024), medium - in 3-4 (1 : 8 - 1:16), low - 1-2 (1: 2 - 1: 4), zero - if the serum did not inhibit the growth of MBT in any of the dilutions.
Испытание предлагаемого метода проведено при проведении ТСП/БАК у 16 пациентов с МЛУ/ШЛУ туберкулезом легких, находившихся в клиниках ФГБУ СПб НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ и Второй Городской противотуберкулезной больнице в 2015-2016 гг. От каждого пациента получено информированное согласие на участие в проводимом исследовании.The test of the proposed method was carried out during TSP / BAK in 16 patients with MDR / XDR pulmonary tuberculosis who were in the clinics of the FSB SPb SRI of Phthisiopulmonology of the Ministry of Health of the Russian Federation and the Second City TB Hospital in 2015-2016. Informed consent was obtained from each patient to participate in the study.
Выделение M. tuberculosis из патологического материала обследуемых пациентов, идентификацию выделенной культуры бактерий, определение лекарственной чувствительности возбудителя проводили стандартными бактериологическими методами (Приказ №951 от 29.12.2014). Через неделю после проведения ТСП/БАК всем пациентам усиливали терапию добавлением препарата перхлозон и повторно тестировали.Isolation of M. tuberculosis from the pathological material of the examined patients, identification of the isolated bacterial culture, determination of the drug susceptibility of the pathogen was performed by standard bacteriological methods (Order No. 951 of December 29, 2014). One week after TSP / BAK, all patients were treated with the addition of the perchlozone drug and retested.
ТСП проводили в пробирочном и планшетном вариантах, при этом результат пробы в планшетном варианте регистрировали визуально по изменению цвета индикатора роста и приборно с помощью планшетного флуориметра FLUOstarOptima.TSP was carried out in vitro and tablet versions, while the result of the test in the tablet version was recorded visually by the change in the color of the growth indicator and instrument using a FLUOstarOptima plate fluorimeter.
Результаты проведения ТСП/БАК представлены в таблицах 1, 2 и на фиг. 1-4.The results of TSP / BAK are presented in tables 1, 2 and in FIG. 1-4.
На фиг. 1 и 2 приведен пример визуального и графического результата проведения ТСП планшетным методом у пациента А., штамм 2801. Фиг. 1: введение пациенту перорально левофлоксацина, ПАСК, циклосерина, амоксиклава, внутривенно-капреомицина и меронема, фиг. 2 - терапия усилена перхлозоном per os.FIG. 1 and 2 shows an example of a visual and graphical result of a TSP using a tablet method in patient A.,
В 11 случаях из 16 (68,7%) флуоресцентным планшетным способом выявлена потенцирующая активность перхлозона, значения ТСП колебались от 2 до 64.In 11 cases out of 16 (68.7%), the perchlozone potentiating activity was detected by a fluorescent plate method, the TSP values ranged from 2 to 64.
В табл. 1 приведены результаты проведения ТСП пробирочным и планшетным способом с визуальной и приборной регистрацией интенсивности роста M. tuberculosis.In tab. 1 shows the results of a TSP test tube and plate method with visual and instrumental recording of the growth rate of M. tuberculosis.
В планшетном варианте визуальная регистрация результата ТСП, как правило, выявляет более высокие ее значения в сравнении с приборной вследствие субъективной оценки изменения цвета индикатора роста. При сравнении данных, полученных пробирочным и приборным способами значения ТСП отклоняются как в большую, так и в меньшую сторону. Это объясняется тем, что в варианте пробирочного способа интенсивность роста штамма M. tuberculosis в разведениях сыворотки сравнивается с 1% контролем только визуально, точная ее количественная оценка в большинстве случаев невозможна из-за особенностей роста микобактерий в полужидкой среде.In the tablet version, the visual registration of the TSP result, as a rule, reveals its higher values in comparison with the instrument one due to the subjective assessment of the change in the color of the growth indicator. When comparing the data obtained by in vitro and instrument methods, the values of the PTS deviate both upwards and downwards. This is explained by the fact that in the version of the tube method the growth intensity of the M. tuberculosis strain in serum dilutions is compared with 1% control only visually, its accurate quantitative assessment is impossible in most cases due to the growth characteristics of mycobacteria in a semi-liquid medium.
Значимых различий между средними значениями ТСП, полученными при пробирочном и планшетном приборном способе оценки нет ни в случае до введения перхлозона, ни после его приема (табл. 2). Визуальная оценка результатов ТСП в планшете значимо отличается от приборной в сторону увеличения значений (р=0,0002 и 0,001)There are no significant differences between the TSP average values obtained with the test-tube and tablet instrumentation method of assessment neither in the case before the introduction of perchlozone, nor after its administration (Table 2). The visual assessment of the results of TSP in the tablet significantly differs from the instrument in the direction of increasing values (p = 0.0002 and 0.001)
Таким образом, проведенные исследования показали, что предлагаемый приборный планшетный метод проведения туберкулостатической пробы у больных туберкулезом легких, не отличаясь существенно от прототипа по средним значениям величин ТСП, лишен недостатков прототипа - 1) субъективности оценки результата; 2) невозможности точной количественной оценки интенсивности роста микобактерий; 3) невозможности математической (статистической) обработки данных, полученных при проведении каждой конкретной ТСП.Thus, studies have shown that the proposed instrument tablet method for conducting tuberculostatic tests in patients with pulmonary tuberculosis, does not differ significantly from the prototype in terms of average values of TSP values, is devoid of the prototype drawbacks - 1) subjective assessment of the result; 2) inability to accurately quantify the growth rate of mycobacteria; 3) the impossibility of mathematical (statistical) processing of data obtained during each specific TSP.
Источники информацииInformation sources
1. Гельманова И.Е., Земляная Н.А., Хон Л.В., Крук Е.А., Мишустин С.П., Янова Г.В. Оценка себестоимости лечения больных туберкулезом с лекарственной чувствительностью и устойчивостью возбудителя в учреждениях фтизиатрической службы Томской области // Туберкулез и болезни легких. - 2016. - №3. - С. 20-27. http://elibrary.ru/item.asp?id=257338521. Gelmanova I.E., Zemlyanaya N.A., Khon L.V., Kruk E.A., Mishustin S.P., Yanova G.V. Estimation of the cost of treatment of patients with tuberculosis with drug susceptibility and resistance of the pathogen in the facilities of the phthisiological service of the Tomsk region // Tuberculosis and lung diseases. - 2016. -
2. Маничева О.А. Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность: Автореф. дис. … д.б.н. - СПб., 2009. - 36 с.2. Manicheva O.A. Problems of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis: accelerated culture detection, control of the adequacy of chemotherapy, virulence: author. dis. ... Dr. b. - SPb., 2009. - 36 p.
3. Маничева О.А. Ускоренное определение бактериостатической активности крови у больных туберкулезом с помощью полужидкой питательной среды // Пробл. туб. - 2003. - №9. - С. 26-29.3. Manicheva O.A. Accelerated determination of bacteriostatic blood activity in patients with tuberculosis using a semi-liquid nutrient medium // Probl. tub. - 2003. - №9. - p. 26-29.
4. Маничева О.А., Павлова М.В., Сапожникова Н.В., Арчакова Л.И., Скворцова Л.А., Вишневский Б.И. Контроль химиотерапии больных туберкулезом органов дыхания с помощью БАК-пробы // Пробл. туб. и болезней легких. - 2008. - №5. - С. 14-17.4. Manicheva O.A., Pavlova M.V., Sapozhnikova N.V., Archakova L.I., Skvortsova L.A., Vishnevsky B.I. Chemotherapy control of patients with respiratory tuberculosis with the help of BAC-samples // Probl. tub. and lung diseases. - 2008. - №5. - pp. 14-17.
5. Маркелов Ю.М., Кононенко Ю.С., Войшнис М.Р., Доева Л.В. Сравнительная оценка клинико-экономической эффективности лечения больных туберкулезом в условиях стационара и использования стационарзамещающих технологий. // Туберкулез и болезни легких. - 2015. - №2. - С. 32-38. http://elibrary.ru/item.asp?id=230328655. Markelov Yu.M., Kononenko Yu.S., Voyshnis MR, Doeva L.V. Comparative assessment of the clinical and economic efficiency of treatment of patients with tuberculosis in the hospital and the use of inpatient technologies. // Tuberculosis and lung disease. - 2015. -
6. Попов С.А., Сабгайда Т.П., Можокина Г.Н., Кузьмин А.В., Ставицкая Н.В. Гетерогенность лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в контексте фармакокинетики противотуберкулезных препаратов как основа персонифицированного лечения. // Туберкулез и болезни легких. - 2015. - №4. - С. 18-23. http://elibrary.ru/item.asp?id=23502820\6. Popov S.A., Sabgayda, T.P., Mozhokina G.N., Kuzmin A.V., Stavitskaya N.V. The heterogeneity of drug resistance of mycobacterium tuberculosis in the context of the pharmacokinetics of anti-tuberculosis drugs as the basis of personalized treatment. // Tuberculosis and lung disease. - 2015. -
7. Стерликов С.А., Тестов В.В., Васильева И.А. Результаты лечения пациентов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя, зарегистрированных в 2012 г. в Российской Федерации и в мире // Туберкулез и болезни легких - 2016. - №1. - С. 22-27 http://elibrary.ru/item.asp?id=256111047. Sterlikov S.A., Testov V.V., Vasilyeva I.A. The results of treatment of patients with multiple and wide drug resistance of the pathogen registered in 2012 in the Russian Federation and in the world // Tuberculosis and lung diseases - 2016. -
8. Тестов В.В., Стерликов С.А., Пунга В.В., Ерохин В.В. Мониторинг результатов химиотерапии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя в районах курации ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН // Туберкулез и социально значимые заболевания. - 2014. - №1-2. - С. 10 http://elibrary.ru/download/87020699.pdf8. Testov V.V., Sterlikov S.A., Punga V.V., Erokhin V.V. Monitoring the results of chemotherapy of tuberculosis with multidrug-resistant pathogen in the areas of surveillance of the Federal Research Center for Nuclear Research and Medical Sciences of the Russian Academy of Medical Sciences // Tuberculosis and socially significant diseases. - 2014. - №1-2. - p. 10 http://elibrary.ru/download/87020699.pdf
9. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs--worldwide, 2000-2004 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2006. - Vol. 55, N11. - P. 301-305. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5511a2.htm9. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs - worldwide, 2000-2004 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2006. - Vol. 55, N11. - P. 301-305. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5511a2.htm
10. Global tuberculosis report, 2015. WHO http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/191102/1/9789241565059_eng.pdf?ua=1&ua=110. Global tuberculosis report, 2015. WHO http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/191102/1/9789241565059_eng.pdf?ua=1&ua=1
11. Palomino J.-C., Martin A., Camacho M., Guerra H., Swings J., Portaels F. Resazurin microliter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46, N8. - P. 2720-2722. doi: 10.1128/AAC.46.8.2720-2722.200211. Palomino, J.-C., Martin, A., Camacho, M., Guerra, H., Swings, J., Portaels F. Mycobacterium tuberculosis, Antsicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46, N8. - P. 2720-2722. doi: 10.1128 / AAC.46.8.2720-2722.2002
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017106232A RU2686732C2 (en) | 2017-02-22 | 2017-02-22 | Method for carrying out tuberculostatic tests in patients with pulmonary tuberculosis for laboratory substantiation of personified treatment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017106232A RU2686732C2 (en) | 2017-02-22 | 2017-02-22 | Method for carrying out tuberculostatic tests in patients with pulmonary tuberculosis for laboratory substantiation of personified treatment |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017106232A RU2017106232A (en) | 2018-08-22 |
| RU2017106232A3 RU2017106232A3 (en) | 2018-08-22 |
| RU2686732C2 true RU2686732C2 (en) | 2019-04-30 |
Family
ID=63255432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017106232A RU2686732C2 (en) | 2017-02-22 | 2017-02-22 | Method for carrying out tuberculostatic tests in patients with pulmonary tuberculosis for laboratory substantiation of personified treatment |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2686732C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2504784C1 (en) * | 2012-08-20 | 2014-01-20 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) | Diagnostic technique for secondary immunodeficient disease in pulmonary tuberculosis |
-
2017
- 2017-02-22 RU RU2017106232A patent/RU2686732C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2504784C1 (en) * | 2012-08-20 | 2014-01-20 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) | Diagnostic technique for secondary immunodeficient disease in pulmonary tuberculosis |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BEN GOLD et al. Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria. J. Vis. Exp.2016(118), e54690, p.1-10. * |
| PALOMINO J.C. Resazurin microliter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. Vol. 46, N8, р.2720-2722. * |
| МАНИЧЕВА О.А. Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность: Автореф. дис. д.б.н. СПб., 2009, c.16-18. * |
| МАНИЧЕВА О.А. Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность: Автореф. дис. д.б.н. СПб., 2009, c.16-18. BEN GOLD et al. Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria. J. Vis. Exp.2016(118), e54690, p.1-10. PALOMINO J.C. Resazurin microliter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. Vol. 46, N8, р.2720-2722. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017106232A (en) | 2018-08-22 |
| RU2017106232A3 (en) | 2018-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ismoilovich | Tuberculosis Diagnostics with Modern Solutions (Literature Review) | |
| Donald et al. | The early bactericidal activity of anti-tuberculosis drugs: a literature review | |
| Talbot et al. | Failure of routine diagnostic methods to detect influenza in hospitalized older adults | |
| JP2005508505A (en) | Identification, observation and treatment of diseases and identification of biological states using gene expression profiles | |
| Ibekwe et al. | Baseline Salmonella agglutinin titres in apparently healthy freshmen in Awka, South Eastern, Nigeria | |
| Nicol et al. | Advances in the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children | |
| Czerwinski et al. | Further evaluation of the Griess test to detect significant bacteriuria: Part II | |
| Alateah et al. | A retrospective study of tuberculosis prevalence amongst patients attending a tertiary hospital in Riyadh, Saudi Arabia | |
| Clevenbergh et al. | Lymph node tuberculosis in patients from regions with varying burdens of tuberculosis and human immunodeficiency virus (HIV) infection | |
| Ren et al. | Simultaneous and early detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to antituberculosis drugs using an indirect series piezoelectric system | |
| Marn et al. | Amoebic liver abscess with negative serologic markers for Entamoeba histolytica: mind the gap! | |
| RU2686732C2 (en) | Method for carrying out tuberculostatic tests in patients with pulmonary tuberculosis for laboratory substantiation of personified treatment | |
| Boillat-Blanco et al. | Susceptibility testing of Mycobacterium abscessus by isothermal microcalorimetry | |
| Gabus et al. | Tropheryma whipplei tricuspid endocarditis: a case report and review of the literature | |
| Lamon et al. | Screening tests in acute porphyria | |
| Saito-Nakano et al. | Prevalence and metronidazole resistance of Trichomonas vaginalis among Japanese women in 2021 | |
| RU2659958C2 (en) | Method for assessment of mycobacterium tuberculosis medicinal sensitivity based on results of blood immunological indices determination in patient with pulmonary tuberculosis | |
| Scheifele et al. | Home-testing for recurrent bacteriuria, using nitrite strips | |
| Schauer et al. | Evaluation of respiratory syncytial virus detection by rapid antigen tests in childhood | |
| Todd | Home Follow-up of Urinary Tract Infection: Comparison of Two Nonculture Techniques | |
| Eriksen et al. | Can we trust urine dipsticks? | |
| Unver et al. | Comparative evaluation of in-vitro methods for antimicrobial activity determination | |
| Casula et al. | Mitochondrial DNA assessment in adipocytes and peripheral blood mononuclear cells of HIV‐infected patients with lipodystrophy according to a validated case definition | |
| RU2192642C2 (en) | Method for predicting clinical efficiency of antibacterial preparation | |
| EP3740585B1 (en) | Improving detection of microorganisms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200223 |