RU2675810C1 - Polymeric complex for molecular targeting therapy and method for its obtaining - Google Patents
Polymeric complex for molecular targeting therapy and method for its obtaining Download PDFInfo
- Publication number
- RU2675810C1 RU2675810C1 RU2017144561A RU2017144561A RU2675810C1 RU 2675810 C1 RU2675810 C1 RU 2675810C1 RU 2017144561 A RU2017144561 A RU 2017144561A RU 2017144561 A RU2017144561 A RU 2017144561A RU 2675810 C1 RU2675810 C1 RU 2675810C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polymer
- particles
- suspension
- folic acid
- pluronic
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
- A61K9/0051—Ocular inserts, ocular implants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
Abstract
Description
Возможности химиотерапии злокачественных новообразований сильно ограничивает низкая избирательность действия подавляющего большинства противоопухолевых препаратов, а также развитие устойчивости опухолевых клеток к действию лекарств. В настоящее время для преодоления указанных проблем разрабатываются препараты, способные связываться со специфическими детерминантами на поверхности клеток-мишеней благодаря введению в их состав адресных (векторных) молекул. Использование адресного компонента обеспечивает селективность системы доставки по отношению к опухолевым клеткам. Такие векторные лекарственные препараты получили название таргетных препаратов, или систем направленного транспорта (СНТ). Несколько десятков таких препаратов в настоящее время проходят клинические испытания, значительное количество разнообразных конструкций находятся в стадии доклинических испытаний. Избирательность доставки СНТ обеспечивается за счет связывания препарата с векторными молекулами, которые должны обладать специфическим сродством к поверхности опухолевых клеток. В качестве векторных молекул могут быть использованы антитела, лиганды рецепторов, специфических для опухолевых клеток, аптамеры. При использовании в качестве векторных молекул лигандов рецепторов, уровень экспрессии которых повышен на клетках опухолей, препарат проникает внутрь клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, избегая действия трансмембранных ABC-транспортеров. Таким образом, данный подход является не только методом повышения селективности действия препарата, но и одним из способов преодоления множественной лекарственной устойчивости.The possibilities of chemotherapy for malignant neoplasms are severely limited by the low selectivity of the vast majority of antitumor drugs, as well as the development of resistance of tumor cells to drugs. Currently, to overcome these problems, drugs are being developed that can bind to specific determinants on the surface of target cells by introducing address (vector) molecules into their composition. The use of the targeted component ensures the selectivity of the delivery system with respect to tumor cells. Such vector drugs are called targeted drugs, or targeted transport systems (SNT). Several dozen of these drugs are currently undergoing clinical trials, a significant number of various designs are in preclinical trials. Selectivity of SNT delivery is ensured by binding the drug to vector molecules, which must have a specific affinity for the surface of tumor cells. Antibodies, ligands of receptors specific for tumor cells, and aptamers can be used as vector molecules. When receptor ligands are used as vector molecules, the expression level of which is increased on tumor cells, the drug penetrates into the cell through receptor-mediated endocytosis, avoiding the action of transmembrane ABC transporters. Thus, this approach is not only a method of increasing the selectivity of the drug, but also one of the ways to overcome multidrug resistance.
Несколько препаратов, относящихся к СНТ, зарегистрированы в настоящее время для лечения злокачественных заболеваний: Милотарг (Mylotarg®, Ozogamicin), Адсетрис (Adcetris®, Brentuximab vedotin; SGN35), Кадсила (Kadcyla®, Ado-trastuzumab emtansine; T-DM1) (Lambert J.M., Morris C.Q. Antibody-Drug Conjugates (ADCs) for Personalized Treatment of Solid Tumors: A Review // Adv. Ther. 2017. - V. 34 (5). - P. 1015-1035). Все они представляют собой конъюгаты гуманизированных или химерных антител с цитотоксическими соединениями.Several drugs related to SNT are currently registered for the treatment of malignant diseases: Mylotarg (Mylotarg ® , Ozogamicin), Adsetris (Adcetris ® , Brentuximab vedotin; SGN35), Cadsila (Kadcyla ® , Ado-trastuzumab emtansine; T-DM1) ( Lambert JM, Morris CQ Antibody-Drug Conjugates (ADCs) for Personalized Treatment of Solid Tumors: A Review // Adv. Ther. 2017 .-- V. 34 (5) .-- P. 1015-1035). All of them are conjugates of humanized or chimeric antibodies with cytotoxic compounds.
Недостатком конъюгатов антител с цитотоксическими веществами в качестве терапевтических препаратов, препятствующим их внедрению в клиническую практику, является малое количество молекул цитотоксических соединений, которое можно присоединить к пептиду без нарушения его способности связываться со своим рецептором с высокой аффинностью. Для решения этой проблемы разрабатываются новые подходы, в которых цитотоксический препарат включается в состав мицелл или полимерных биодеградируемых наночастиц, снабженных векторными молекулами. Использование препаратов в составе наноразмерных частиц в виде липосом, мицелл и полимерных наночастиц, даже без векторных молекул является одним из подходов для улучшения биодоступности и оптимизации фармакокинетики лекарств, так как позволяет оптимизировать доставку препаратов в опухоль (Zhang H., Wang G., Yang Н. Drug delivery systems for differential release in combination therapy // Expert Opin. Drug Deliv. 2011. - V. 8 (2). - P. 171-190).The disadvantage of conjugates of antibodies with cytotoxic substances as therapeutic drugs that impede their introduction into clinical practice is the small number of molecules of cytotoxic compounds that can be attached to a peptide without impairing its ability to bind to its receptor with high affinity. To solve this problem, new approaches are being developed in which the cytotoxic drug is included in the composition of micelles or polymer biodegradable nanoparticles equipped with vector molecules. The use of drugs in the composition of nanosized particles in the form of liposomes, micelles and polymer nanoparticles, even without vector molecules, is one of the approaches to improve the bioavailability and optimize the pharmacokinetics of drugs, as it allows to optimize the delivery of drugs to the tumor (Zhang H., Wang G., Yang N Drug delivery systems for differential release in combination therapy // Expert Opin. Drug Deliv. 2011.- V. 8 (2) .- P. 171-190).
Дальнейший прогресс в создании полимерных форм противоопухолевых лекарств связан с разработкой усовершенствованных многофункциональных носителей, несущих на своей поверхности векторные лиганды, обеспечивающие избирательное связывание наночастиц с опухолевыми клетками или эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, снабжающих опухоль питательными веществами и кислородом, и даже лиганды, обеспечивающие проникновение таких контейнеров в раковую клетку-мишень (Ramzy L., Nasr М., Metwally А.А., Awad G.A.S. Cancer nanotheranostics: A review of the role of conjugated ligands for overexpressed receptors // Eur. J. Pharm. Sci. 2017. - V. 104. - P. 273-292). Использование векторных полимерных наноразмерных (субмикронных) носителей при создании таргетных препаратов должно также обеспечивать защиту лекарственных препаратов от деградации и оптимизировать их фармакокинетику, благодаря улучшению накопления в опухоли. Таким образом, разработка новых противоопухолевых препаратов избирательного действия на основе полимерных комплексов для молекулярно-прицельной терапии (ПКМПТ) является актуальной задачей и перспективным направлением создания высокоэффективных и относительно безопасных лекарственных препаратов.Further progress in the creation of polymer forms of anticancer drugs is associated with the development of improved multifunctional carriers that carry vector ligands on their surface that provide selective binding of nanoparticles to tumor cells or endothelial cells of blood vessels supplying the tumor with nutrients and oxygen, and even ligands that allow such containers to penetrate into a target cancer cell (Ramzy L., Nasr M., Metwally A.A., Awad GAS Cancer nanotheranostics: A review of the role of conjugated ligands for overexpr essed receptors // Eur. J. Pharm. Sci. 2017 .-- V. 104. - P. 273-292). The use of vector polymeric nanoscale (submicron) carriers when creating targeted drugs should also protect drugs from degradation and optimize their pharmacokinetics, due to improved accumulation in the tumor. Thus, the development of new selective antitumor drugs based on polymer complexes for molecular targeted therapy (PCMPT) is an urgent task and a promising direction in creating highly effective and relatively safe drugs.
При разработке ПКМПТ наиболее важным аспектом является подбор оптимального состава, а именно выбор действующего вещества, векторной молекулы, полимерного носителя. При использовании полимерных наноразмерных (субмикронных) носителей в виде полимерных частиц, действующее вещество нековалентно сорбируется в объеме частицы и на ее поверхности, и в условиях организма постепенно высвобождается из состава частицы за счет диффузии и деградации полимера. Векторные молекулы, ковалентно или нековалентно связанные с полимерным носителем, обеспечивают механизм активного транспорта частицы в клетку-мишень. Наиболее важным требованием, предъявляемым к полимерам для создания ПКМПТ, является отсутствие токсичности используемого полимера и его биодеградируемость. Этим требованиям отвечает ряд полимеров, но наибольшее распространение получили полимеры на основе молочной, гликолевой кислот и их сополимеров (PLGA, ПЛГА) (Branco М.С., Schneider J.P. Self-assembling materials for therapeutic delivery // Acta Biomater. 2009. - V. 5 (3). - P. 817-831).In the development of PCMPT, the most important aspect is the selection of the optimal composition, namely, the choice of the active substance, vector molecule, polymer carrier. When using polymeric nanoscale (submicron) carriers in the form of polymer particles, the active substance is non-covalently sorbed in the volume of the particle and on its surface, and is gradually released from the composition of the particle due to diffusion and degradation of the polymer under the conditions of the body. Vector molecules covalently or non-covalently linked to a polymeric carrier provide a mechanism for the active transport of a particle into a target cell. The most important requirement for polymers to create PCMPT is the lack of toxicity of the polymer used and its biodegradability. A number of polymers meet these requirements, but the most widely used are polymers based on lactic, glycolic acids and their copolymers (PLGA, PLGA) (Branco M.S., Schneider JP Self-assembling materials for therapeutic delivery // Acta Biomater. 2009. - V 5 (3) .- P. 817-831).
Вторым важным параметром при разработке ПКМПТ является размер частиц. В здоровом организме внутривенно введенные частицы могут покинуть сосудистую систему только в тех участках, где встречаются фенестрированные или синусоидные капилляры, например, в печени или селезенке. Однако проницаемость капилляров может повышаться в случаях патологии, например, в зоне роста опухоли или при воспалительном процессе. Размер пор в капиллярах, питающих эти опухоли, составляет от 200 нм до 1.2 мкм. Этот феномен создает предпосылки для эффективного лечения этих заболеваний с помощью наносомальных препаратов (Ruoslahti Е., Bhatia S.N., Sailor M.J. Targeting of drugs and nanoparticles to tumors // J. Cell Biol. 2010. V. 188 (6). - P. 759-768). Типичное для неопластических тканей нарушение оттока лимфы способствует удерживанию частиц. В мировой литературе это явление, впервые описанное для макромолекулярных пролекарств, получило название эффекта «повышенной проницаемости и удерживания» Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect (Maeda H., Matsumura Y. Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1989. - V. 6 (3). - P. 193-210; Maeda H., Matsumura Y. EPR effect based drug design and clinical outlook for enhanced cancer chemotherapy // Adv. Drug Deliv. Rev. 2011. - V. 63 (3). - P. 129-130).The second important parameter in the development of PCMPT is the particle size. In a healthy organism, intravenously administered particles can leave the vascular system only in those areas where fenestrated or sinusoidal capillaries are found, for example, in the liver or spleen. However, the permeability of capillaries can increase in cases of pathology, for example, in the area of tumor growth or in the inflammatory process. The pore size in the capillaries feeding these tumors ranges from 200 nm to 1.2 μm. This phenomenon creates the prerequisites for the effective treatment of these diseases with the help of nanosomal drugs (Ruoslahti E., Bhatia SN, Sailor MJ Targeting of drugs and nanoparticles to tumors // J. Cell Biol. 2010. V. 188 (6). - P. 759 -768). Typical neoplastic tissue impairment of lymph outflow promotes particle retention. In the world literature, this phenomenon, first described for macromolecular prodrugs, is called the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect (Maeda H., Matsumura Y. Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1989. - V. 6 (3). - P. 193-210; Maeda H., Matsumura Y. EPR effect based drug design and clinical outlook for enhanced cancer chemotherapy // Adv. Drug Deliv. Rev . 2011.- V. 63 (3) .- P. 129-130).
Третьим важным аспектом разработки ПКМПТ является технологичность производственного процесса его получения. Для связывания полимерных частиц с векторными молекулами используются различные стратегии. Связывание молекулы-вектора с полимером можно производить как на предварительных стадиях до получения частиц, так и в процессе получения частиц.The third important aspect of the development of PCMPT is the manufacturability of the production process for its production. Various strategies are used to bind polymer particles to vector molecules. The binding of a vector molecule to a polymer can be carried out both in the preliminary stages before the production of particles and in the process of obtaining particles.
Использование в качестве векторных молекул в составе ПКМПТ белковых молекул (например, гуманизированных антител, рекомбинантных белков) сопряжено с рядом проблем. Получение химически связанных с реакционными группами на поверхности полимерных частиц белковых молекул, являющихся достаточно лабильными, - это весьма сложный, многостадийный и достаточно затратный процесс с низкими показателями выхода конечного продукта. В результате, использование в качестве векторных молекул белков многократно повышает стоимость готового продукта и делает производство таких препаратов экономически не выгодным.The use of protein molecules (for example, humanized antibodies, recombinant proteins) as vector molecules in PCMPT is fraught with a number of problems. The preparation of protein molecules chemically bound to the reaction groups on the surface of polymer particles, which are quite labile, is a very complex, multi-stage, and quite costly process with low rates of yield of the final product. As a result, the use of proteins as vector molecules greatly increases the cost of the finished product and makes the production of such drugs economically unprofitable.
Таким образом, важнейшей задачей является разработка эффективного и экономически целесообразного лекарственного препарата, сочетающего в себе высокую специфичность за счет использования векторного компонента, его стабильность, ценовую доступность и высокую технологичность производственного процесса получения. Этим критериям соответствует хорошо известный витамин В9 - фолиевая кислота (ФК), которая может быть использована в свободной форме, так и в виде конъюгатов (Mainardes R.M., Silva L.P., Drug Delivery Systems: Past, Present, and Future // Current Drug Target. 2004. - V. 5 (5). - P. 449-455) В результате может быть получена эффективная транспортная система для доставки противоопухолевых препаратов внутрь клеток. В силу сходства особенностей строения капиллярной сети в зоне опухоли и очаге воспаления, похожая транспортная система может оказаться интересной с точки зрения доставки противовоспалительных препаратов в очаг воспаления, что уже было показано на конъюгатах ФК с противовоспалительными препаратами.Thus, the most important task is to develop an effective and economically feasible drug that combines high specificity through the use of a vector component, its stability, affordability and high manufacturability of the production process. The well-known vitamin B9 - folic acid (FC), which can be used in free form or in the form of conjugates (Mainardes RM, Silva LP, Drug Delivery Systems: Past, Present, and Future // Current Drug Target, meets these criteria. 2004. - V. 5 (5). - P. 449-455) As a result, an effective transport system for delivering antitumor drugs into cells can be obtained. Due to the similarities in the structure of the capillary network in the tumor zone and the inflammation focus, a similar transport system may be interesting from the point of view of delivery of anti-inflammatory drugs to the inflammatory focus, which has already been shown on conjugates of FC with anti-inflammatory drugs.
Рецептор фолиевой кислоты присутствует на мембранах клеток широкого спектра опухолей (Salazar M.D., Ratnam М. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics? // Cancer Metastasis Rev. 2007. - V. 26 (1). - P. 141-152). Поэтому фолиевая кислота - привлекательный объект для использования в качестве вектора для доставки противоопухолевых препаратов. Молекула ФК имеет высокое сродство к своему рецептору. Использование ее в качестве адресной метки удобно ввиду высокой химической стабильности в широком диапазоне температур и значений рН и прочности связывания с рецептором (Chen K, Xie J, Xu Н, et al. Triblock copolymer coated iron oxide nanoparticle conjugate for tumour integrin targeting. // Biomaterials. 2009. - V. 30. - P. 6912-6919; Zhan C., Gu В., Xie C, et al. Cyclic RGD conjugated poly(ethylene glycol)-copoly(lactic acid) micelle enhances paclitaxel anti-glioblastoma effect // J. Control. Release. 2010. - V. 143. - P. 136-142).The folic acid receptor is present on the cell membranes of a wide spectrum of tumors (Salazar MD, Ratnam M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics? // Cancer Metastasis Rev. 2007. - V. 26 (1). - P. 141-152). Therefore, folic acid is an attractive target for use as a vector for the delivery of antitumor drugs. The FC molecule has a high affinity for its receptor. Using it as an address label is convenient due to the high chemical stability over a wide range of temperatures and pH values and receptor binding strength (Chen K, Xie J, Xu H, et al. Triblock copolymer coated iron oxide nanoparticle conjugate for tumor integrin targeting. // Biomaterials. 2009. - V. 30. - P. 6912-6919; Zhan C., Gu B., Xie C, et al. Cyclic RGD conjugated poly (ethylene glycol) -copoly (lactic acid) micelle enhances paclitaxel anti-glioblastoma effect // J. Control. Release. 2010 .-- V. 143. - P. 136-142).
Низкая стоимость фолиевой кислоты и обширная библиотека доступных реакций конъюгации делают ее одним из наиболее используемых лигандов для доставки лекарств, нацеленных на опухоль (Low P.S., Henne W.A., Doorneweerd D.D. Discovery and development of folic-acidbased receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases // Acc. Chem. Res. 2008. - V. 41 (1). - P. 120-129).The low cost of folic acid and the extensive library of available conjugation reactions make it one of the most used ligands for delivering tumor-targeted drugs (Low PS, Henne WA, Doorneweerd DD Discovery and development of folic-acidbased receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases // Acc. Chem. Res. 2008.- V. 41 (1) .- P. 120-129).
Фолиевую кислоту используют для доставки в клетки-мишени антител, антисмысловых олигонуклеотидов, нуклеиновых кислот, белков и пептидов, радиоактивных и контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (Zhao X., Li H., Lee R.J. Targeted drug delivery via folate receptors. // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. - V. 5 (3). - P. 309-319). После связывания с рецептором такой комплекс проникает в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Известно также, что активированные макрофаги экспрессируют на своей поверхности рецептор к фолиевой кислоте FRB и путем рецептор-зависимого эндоцитоза также захватывают фолиевую кислоту в повышенных количествах. В связи с этим, в ряде исследовательских работ ФК используют для доставки противовоспалительных агентов.Folic acid is used to deliver antibodies, antisense oligonucleotides, nucleic acids, proteins and peptides, radioactive and contrast agents for magnetic resonance imaging to target cells (Zhao X., Li H., Lee RJ Targeted drug delivery via folate receptors. // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. - V. 5 (3). - P. 309-319). After binding to the receptor, such a complex enters the cell through receptor-mediated endocytosis. It is also known that activated macrophages express on their surface a receptor for folic acid FRB and by receptor-dependent endocytosis also capture folic acid in increased amounts. In this regard, in a number of research works, FCs are used to deliver anti-inflammatory agents.
Ниже приводятся примеры использования фолиевой кислоты или ее производных в целях создания препаратов для избирательной доставки в опухолевые клетки. Варианты включения ФК в состав систем доставки можно разделить на две группы подходов: первая группа - ковалентное связывание фолиевой кислоты с частицами, вторая группа - получение производных фолиевой кислоты и их встраивание в состав частиц.The following are examples of the use of folic acid or its derivatives in order to create drugs for selective delivery to tumor cells. Options for including PK in the delivery systems can be divided into two groups of approaches: the first group is the covalent binding of folic acid to particles, the second group is the preparation of folic acid derivatives and their incorporation into the composition of the particles.
В работе Esmaeili F. et al, 2008 (Esmaeili F., Ghahremani M.H., Ostad S.N., et al. Folate-receptor-targeted delivery of docetaxel nanoparticles prepared by PLGA-PEG-folate conjugate. // J. Drug Target. 2008. - V. 16 (5). - P. 415-423) получали конъюгат ди-блок-сополимера PLGA-PEG с активированной фолиевой кислотой, а затем, используя этот продукт, получали наночастицы с включением доцетаксела. Частицы имели средний размер 200 нм, при этом фолатный фрагмент был расположен на поверхности полимерной мицеллы. Было показано, значительно большее внутриклеточное поглощение частиц, содержащих остаток фолиевой кислоты, в опухолевые клетки (SKOV3) по сравнению с аналогичными частицами без вектора, что указывает на то, что механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза играет важную роль в клеточном поглощении препарата.Esmaeili F. et al, 2008 (Esmaeili F., Ghahremani MH, Ostad SN, et al. Folate-receptor-targeted delivery of docetaxel nanoparticles prepared by PLGA-PEG-folate conjugate. // J. Drug Target. 2008. - V. 16 (5). - P. 415-423) the conjugate of the PLGA-PEG di-block copolymer with activated folic acid was obtained, and then, using this product, nanoparticles with docetaxel incorporation were obtained. The particles had an average size of 200 nm, while the folate fragment was located on the surface of the polymer micelle. A significantly greater intracellular uptake of particles containing a folic acid residue into tumor cells (SKOV3) has been shown to be compared to similar non-vector particles, which indicates that the mechanism of receptor-mediated endocytosis plays an important role in the cellular uptake of the drug.
В работе Wang Y. et al, 2015 (Wang Y., Li P., Chen L., Gao W., Zeng F, Kong L.X. Targeted delivery of 5-fluorouracil to HT-29 cells using high efficient folic acid-conjugated nanoparticles // Drug Delivery. 2015. - V. 22 (2). - P. 191-198) приводятся результаты исследований по получению полимерных частиц, содержащих 5-фторурацил, и снабженных фолатным вектором. В этом исследовании 1,3-диаминопропан использовался в качестве сшивающего агента для связывания PLGA и фолиевой кислоты. Полимерные частицы, нагруженные 5-фторурацилом, были получены с помощью метода эмульгирования и отгонки растворителя. На первом этапе проводили эмульгирование ультразвуком водной фазы, содержащей 5-фторурацил и органической фазы, содержащей модифицированный полимер с получением первичной эмульсии, которую далее эмульгировали ультразвуком с водным раствором ПАВ и получением вторичной эмульсии. Конъюгированные с ФК полимерные частицы имели средний размер частиц 224 нм. В экспериментах in vitro на раковых клетках НТ-29 было показано, что такие частицы обладают большей цитотоксичностью, чем свободный 5-фторурацил, и чем частицы, полученные без фолиевой кислоты (IC50=5,69, 22,9 и 14,17 мкг/мл, соответственно).Wang Y. et al, 2015 (Wang Y., Li P., Chen L., Gao W., Zeng F, Kong LX Targeted delivery of 5-fluorouracil to HT-29 cells using high efficient folic acid-conjugated nanoparticles // Drug Delivery. 2015. - V. 22 (2). - P. 191-198) the results of studies on the production of polymer particles containing 5-fluorouracil and equipped with a folate vector are presented. In this study, 1,3-diaminopropane was used as a crosslinking agent to bind PLGA and folic acid. The polymer particles loaded with 5-fluorouracil were obtained using the method of emulsification and distillation of the solvent. At the first stage, ultrasonically emulsified an aqueous phase containing 5-fluorouracil and an organic phase containing a modified polymer to obtain a primary emulsion, which was then emulsified with ultrasound with an aqueous solution of a surfactant and to obtain a secondary emulsion. Conjugated with FC polymer particles had an average particle size of 224 nm. In vitro experiments on cancer cells NT-29, it was shown that such particles have greater cytotoxicity than free 5-fluorouracil and than particles obtained without folic acid (IC 50 = 5.69, 22.9 and 14.17 μg / ml, respectively).
В работе Санжаков и др., 2016 (Санжаков М.А., Игнатов Д.В., Кострюкова Л.В. и др. Изучение свойств лекарственных композиций доксорубицина в составе коллоидных наночастиц с адресным фрагментом в экспериментах in vivo // Биомед. химия, 2016. - Т. 62, вып. 2, - С. 150-153) был предложен способ конструирования системы адресной доставки доксорубицина в составе растительных фосфолипидных частиц. В качестве адресного фрагмента были использованы конъюгаты фолиевая кислота-додециламин и биотин-додециламин. Средний размер частиц лекарственных композиций доксорубицина в составе коллоидных частиц на основе фосфатидилхолина с этими адресными конъюгатами не превышал 20 нм. Плотность поверхностного заряда (дзета-потенциала) частиц была положительна и составляла 20,9 и 14,3 мВ, соответственно. Накопление доксорубицина в ткани опухоли Льюис у мышей повышалось при введении его в составе коллоидных наночастиц с адресными коньюгатами: содержание в опухоли доксорубицина, введенного внутривенно в составе наночастиц с адресным фрагментом фолиевая кислота-додециламин было почти в 2 раза выше в сравнении со свободным доксорубицином и в 1,4 раза выше в сравнении с доксорубицином, введенным в составе наночастиц с адресным фрагментом биотин-додециламин.In the work of Sanzhakov et al., 2016 (Sanzhakov M.A., Ignatov D.V., Kostryukova L.V. et al. Study of the properties of medicinal compositions of doxorubicin in colloidal nanoparticles with an address fragment in in vivo experiments // Biomed. Chemistry , 2016. - T. 62, issue 2, - S. 150-153) a method was proposed for constructing a system for targeted delivery of doxorubicin in plant phospholipid particles. Folic acid-dodecylamine and biotin-dodecylamine conjugates were used as the address fragment. The average particle size of the doxorubicin drug compositions in the colloidal particles based on phosphatidylcholine with these targeted conjugates did not exceed 20 nm. The density of the surface charge (zeta potential) of the particles was positive and amounted to 20.9 and 14.3 mV, respectively. The accumulation of doxorubicin in Lewis tumor tissue in mice increased when it was introduced as part of colloidal nanoparticles with targeted conjugates: the content of doxorubicin injected intravenously in the composition of nanoparticles with targeted folic acid-dodecylamine fragment was almost 2 times higher compared to free doxorubicin and 1.4 times higher in comparison with doxorubicin introduced in the composition of nanoparticles with an address fragment of biotin-dodecylamine.
В работе Varshosaz J. et al. 2012 (Varshosaz J., Hassanzadeh F., Sadeghi H. Shaker M. Folate Targeted Solid Lipid Nanoparticles of Simvastatin for Enhanced Cytotoxic Effects of Doxorubicin in Chronic Myeloid Leukemia // Current Nanosci. 2012. - V. 8 (2). - P. 249-258) описано получение конъюгата фолиевой кислоты с октадециламином и включение его в состав твердых липидных наночастиц (SLN) с симвастатином. При получении частиц использовали глицерил моностеарат. Показано, что фолиевая кислота в составе таких частиц может значительно повысить цитотоксический эффект симвастатина на клеточной линии К562.In the work of Varshosaz J. et al. 2012 (Varshosaz J., Hassanzadeh F., Sadeghi H. Shaker M. Folate Targeted Solid Lipid Nanoparticles of Simvastatin for Enhanced Cytotoxic Effects of Doxorubicin in Chronic Myeloid Leukemia // Current Nanosci. 2012.- V. 8 (2) .- P . 249-258) describes the preparation of a conjugate of folic acid with octadecylamine and its inclusion in the composition of solid lipid nanoparticles (SLN) with simvastatin. Upon receipt of the particles used glyceryl monostearate. It was shown that folic acid in the composition of such particles can significantly increase the cytotoxic effect of simvastatin on the K562 cell line.
Одним из наиболее эффективных современных противоопухолевых препаратов является доцетаксел (ДТ). Однако клиническое применение доцетаксела ограничивает высокий уровень проявления побочной токсичности, в связи с чем ведется поиск путей создания новых лекарственных форм доцетаксела и схем его применения. Включение ДТ в состав ПКМПТ является перспективным подходом для повышения избирательности действия препарата и снижения его неспецифической токсичности.One of the most effective modern antitumor drugs is docetaxel (DT). However, the clinical use of docetaxel limits the high level of manifestation of adverse toxicity, in connection with which a search is being made for ways to create new dosage forms of docetaxel and its administration. The inclusion of DT in PCMPT is a promising approach to increase the selectivity of the drug and reduce its non-specific toxicity.
По фармакологическому действию доцетаксел относится к противоопухолевым препаратам цитостатического действия. Действие доцетаксела связано с повреждением микротубулярной сети в клетках на стадии митоза и в интерфазе. Доцетаксел связывается со свободным тубулином, стимулирует сбор тубулина в стабильные микротрубочки и препятствует их распаду. В результате образуются связки микротрубочек, они стабилизируются, теряют способность к нормальному функционированию, что приводит к ингибированию митоза в клетках. Лекарственный препарат доцетаксел выпускается в парентеральной форме. Доцетаксел широко применяют в схемах адъювантной и монотерапии при лечении злокачественных новообразований желудка, бронхов, легкого, молочной железы, яичника, предстательной железы, рака головы, лица и шеи (Доцетаксел. Регистр лекарственных средств России, www.rlsnet.ru). Доцетаксел вызывает многочисленные побочные эффекты, основные из которых: со стороны сердечнососудистой системы и крови (кроветворение, гемостаз) - нейтропения, тромбоцитопения, анемия; нарушение сердечного ритма, сердечная недостаточность, понижение или повышение АД; Со стороны органов ЖКТ - тошнота, рвота, диарея/запор, анорексия, стоматит, эзофагит, повышение сывороточных уровней ACT, АЛТ, ЩФ, гипербилирубинемия; случаи желудочно-кишечного кровотечения; со стороны кожных покровов: алопеция; кожная сыпь, зуд; аллергические реакции: реакции гиперчувствительности легкой или умеренной степени выраженности и тяжелые реакции (сопровождающиеся артериальной гипотензией и/или бронхоспазмом или генерализованной сыпью/эритемой); периферическая нейропатия (парестезия, дизестезия или боль, слабость), периферические отеки (первоначально обычно появляются на нижних конечностях), асцит, астения, артралгия и миалгия, реакции в месте введения (гиперпигментация, воспаление, покраснение или сухость кожи, флебит, кровоизлияние или отек вены).According to the pharmacological action, docetaxel belongs to antitumor drugs with a cytostatic effect. The action of docetaxel is associated with damage to the microtubular network in cells at the stage of mitosis and in interphase. Docetaxel binds to free tubulin, stimulates the collection of tubulin into stable microtubules and prevents their breakdown. As a result, ligaments of microtubules are formed, they stabilize, lose their ability to function normally, which leads to inhibition of mitosis in cells. The drug docetaxel is available in parenteral form. Docetaxel is widely used in adjuvant and monotherapy regimens in the treatment of malignant neoplasms of the stomach, bronchi, lung, breast, ovary, prostate, head, face and neck cancer (Docetaxel. Russian Drug Register, www.rlsnet.ru). Docetaxel causes numerous side effects, the main of which are: from the cardiovascular system and blood (hematopoiesis, hemostasis) - neutropenia, thrombocytopenia, anemia; heart rhythm disturbance, heart failure, lowering or increasing blood pressure; From the digestive tract - nausea, vomiting, diarrhea / constipation, anorexia, stomatitis, esophagitis, increased serum levels of ACT, ALT, alkaline phosphatase, hyperbilirubinemia; cases of gastrointestinal bleeding; on the part of the skin: alopecia; skin rash, itching; allergic reactions: hypersensitivity reactions of mild or moderate severity and severe reactions (accompanied by arterial hypotension and / or bronchospasm or generalized rash / erythema); peripheral neuropathy (paresthesia, dysesthesia or pain, weakness), peripheral edema (initially usually appear on the lower extremities), ascites, asthenia, arthralgia and myalgia, reactions at the injection site (hyperpigmentation, inflammation, redness or dryness of the skin, phlebitis, hemorrhage or edema veins).
Из приведенной информации видно, что использование ДТ сопряжено с многочисленными и сильными побочными эффектами, представляющими в ряде случаев опасность для жизни пациентов (Ковтун В.А., Гаевой К.В., Севидов В.В. Длительная инфузия доцетаксела (Таксотера) в полихимиотерапии 2-й линии у больных с прогрессирующими солидными опухолями // Онкология. 2006. - Т. 8, №3. - С. 285-286).From the above information, it is clear that the use of DT is associated with numerous and severe side effects, which in some cases pose a danger to the life of patients (Kovtun V.A., Gaeva K.V., Sevidov V.V. Prolonged infusion of docetaxel (Taxotere) in polychemotherapy 2nd line in patients with progressive solid tumors // Oncology. 2006. - T. 8, No. 3. - S. 285-286).
Как показывают литературные данные, включение доцетаксела в системы для адресной доставки позволяет успешно решать проблемы связанные с токсичностью, а также с преодолением лекарственной резистентности.According to published data, the inclusion of docetaxel in systems for targeted delivery can successfully solve the problems associated with toxicity, as well as overcoming drug resistance.
Имеющиеся в литературе данные о разработке ПКМПТ на основе доцетаксела в качестве действующего вещества и фолиевой кислоты в качестве векторной молекулы в составе полимерных комплексов на основе PLGA показывают, что основным подходом является создание таких комплексов через стадию получения блоксополимера (например, PLGA-PEG), химически связанного с фолиевой кислотой, и использование его для получения частиц с включенным доцетакселом.The literature data on the development of PCMPT based on docetaxel as an active substance and folic acid as a vector molecule in the composition of polymer complexes based on PLGA show that the main approach is to create such complexes through the stage of producing block copolymers (e.g., PLGA-PEG), chemically associated with folic acid, and its use to obtain particles with docetaxel included.
В работе Hu L. et al, 2015 (Hu L., Pang S., Hu Q., Gu D., Kong D., Xiong X., Su J. Enhanced antitumor efficacy of folate targeted nanoparticles co-loaded with docetaxel and curcumin // Biomed. Pharmacother. 2015. - V. 75. - P. 26-32) приведены результаты исследований по получению полимерных частиц на основе PLGA, содержащих доцетаксел и куркумин, а также векторную молекулу - остаток фолиевой кислоты, ковалентно связанный с диаминополиэтиленгликолем. Полученный фрагмент далее "сшивался" с молекулами PLGA-COOH с получением диблоксополимера PEG-PLGA. На основе синтезированных полимеров были получены наночастицы с включением доцетаксела и куркумина, методом эмульгирования на гомогенизаторе высокого давления и последующего удаления органического растворителя. Размер частиц составил 
Однако следует отметить, что направление получения ПКМПТ, связанное с использованием блоксополимеров, в настоящее время является дорогостоящим так, как не налажено их производство, а получение осуществляется в лабораторных условиях.However, it should be noted that the direction of obtaining PCMPT, associated with the use of block copolymers, is currently expensive since they are not adjusted to production, and production is carried out in the laboratory.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Проблемой, решаемой данным изобретением является усовершенствование состава и технологии получения ПКМПТ, сочетающего в себе высокую технологичность процесса получения и его экономичность, а также оптимальные показатели для реализации молекулярно-прицельного механизма действия ПКМПТ,The problem solved by this invention is to improve the composition and technology of obtaining PCMPT, combining the high adaptability of the production process and its cost-effectiveness, as well as optimal indicators for the implementation of the molecular-target mechanism of action of PCMPT,
Техническим результатом изобретения являются субмикронный размер частиц и высокие показатели специфичности полимерного комплекса, что достигается без проведения стадии химической модификации полимерной основы и/или полученных частиц.The technical result of the invention is submicron particle size and high specificity of the polymer complex, which is achieved without carrying out the stage of chemical modification of the polymer base and / or the resulting particles.
Для достижения указанного технического результата предложен полимерный комплекс для молекулярно-прицельной противоопухолевой терапии в виде лиофилизата для приготовления суспензии частиц с размером 50-600 нм, содержащий активный компонент - доцетаксел, полимерный компонент - сополимер молочной и гликолевой кислот с соотношением полимерных звеньев 50:50, векторный компонент - додециламид фолиевой кислоты, поливиниловый спирт, плюроник F-127 и D-маннитол, при следующем соотношении компонентов, % масс.:To achieve this technical result, a polymer complex for molecular-targeted antitumor therapy in the form of a lyophilisate for preparing a suspension of particles with a size of 50-600 nm is proposed, containing the active component docetaxel, the polymer component is a copolymer of lactic and glycolic acids with a ratio of polymer units of 50:50, the vector component is folic acid dodecylamide, polyvinyl alcohol, Pluronic F-127 and D-mannitol, in the following ratio,% wt.:
доцетаксел 1.0-5.0docetaxel 1.0-5.0
сополимер молочной и гликолевой кислот 58.0-65.0copolymer of lactic and glycolic acids 58.0-65.0
додециламид фолиевой кислоты 0.01-0.50folate dodecylamide 0.01-0.50
поливиниловый спирт 0.01-1.0polyvinyl alcohol 0.01-1.0
плюроник F-127 0.1-2.0Pluronic F-127 0.1-2.0
D-маннитол 27.0-35.0D-mannitol 27.0-35.0
Полимерный комплекс отличается тем, что количество частиц с размером 50-600 нм составляет не менее 90% от общего количества частиц в суспензии.The polymer complex is characterized in that the number of particles with a size of 50-600 nm is at least 90% of the total number of particles in suspension.
Также предложен способ получения полимерного комплекса, характеризующийся тем, что он включает стадии: растворения сополимера молочной и гликолевой кислоты, доцетаксела и плюроника F-127 в хлористом метилене; растворения додециламида фолиевой кислоты в смеси N,N-диметилформамид-плюроник F-127 в соотношении 80:20 по массе и внесения полученной смеси в 1% водный раствор поливинилового спирта; смешивания указанных растворов в условиях обработки ультразвуком с образованием эмульсии; удаления из полученной эмульсии хлористого метилена путем перемешивания на воздухе или в вакууме до получения суспензии частиц; центрифугирования, с последующим получением восстановленной суспензии; добавления к восстановленной суспензии раствора D-маннитола; замораживания суспензии и последующей ее лиофилизации в течение суток с получением лиофилизата.Also proposed is a method for producing a polymer complex, characterized in that it comprises the steps of: dissolving a copolymer of lactic and glycolic acid, docetaxel and pluronic F-127 in methylene chloride; dissolving folic dodecylamide in a mixture of N, N-dimethylformamide-pluronic F-127 in a ratio of 80:20 by weight and adding the resulting mixture to a 1% aqueous solution of polyvinyl alcohol; mixing said solutions under ultrasonic treatment to form an emulsion; removing methylene chloride from the resulting emulsion by stirring in air or in vacuum to obtain a suspension of particles; centrifugation, followed by obtaining a reconstituted suspension; adding to the reconstituted suspension a solution of D-mannitol; freezing the suspension and subsequent lyophilization during the day to obtain a lyophilisate.
Технический результат заявленного изобретения заключается в том, что предложен полимерный комплекс, состоящий из полимерного компонента-носителя, активного компонента и векторного компонента в виде субмикронных частиц, обладающий оптимальными характеристиками для реализации молекулярно-прицельного механизма и технологичным способом получения, что позволит широко использовать предложенный комплекс в составе лекарственных средств, предназначенных для молекулярно-прицельной терапии. Преимуществом предложенного способа получения комплекса является способ введения плохо растворимого в органической и водной среде додециламида фолиевой кислоты (векторный компонент) с использованием N,N-диметилформамида и поверхностно-активного вещества (ПАВ) плюроника F-127. Плюроник F-127 образует мицеллы с инкорпорированным додециламидом фолиевой кислоты и способствует его растворению в водном растворе ПАВ, а также обеспечивает последующее включение молекул векторного компонента на поверхность капель эмульсии раствора полимера и активного вещества. Далее, при потере каплями эмульсии летучего растворителя происходит формирование суспензии.The technical result of the claimed invention lies in the fact that the proposed polymer complex, consisting of a polymer component carrier, an active component and a vector component in the form of submicron particles, which has optimal characteristics for the implementation of the molecular-target mechanism and a technological method of production, which will make it possible to widely use the proposed complex as part of drugs intended for molecular targeted therapy. An advantage of the proposed method for producing the complex is the method of introducing poorly soluble in organic and aqueous medium of folic acid dodecylamide (vector component) using N, N-dimethylformamide and surfactant pluronic F-127. Pluronic F-127 forms micelles with incorporated folic dodecylamide and promotes its dissolution in an aqueous surfactant solution, and also ensures the subsequent inclusion of the vector component molecules on the surface of the emulsion drops of the polymer solution and the active substance. Further, when droplets lose the emulsion of a volatile solvent, a suspension forms.
Предложенный способ отличается от известных тем, что осуществляется без проведения стадии химической модификации блоксополимера или поверхности предварительно полученных частиц с последующим трудоемким удалением побочных продуктов химической реакции, которые могут обладать собственной фармакологической активностью. Использование ранее синтезированного и очищенного векторного компонента для введения его в поверхностный слой формируемой частицы значительно упрощает процесс получения готового продукта и исключает использование специализированного оборудования для химического синтеза.The proposed method differs from the known ones in that it is carried out without carrying out the stage of chemical modification of the block copolymer or the surface of previously obtained particles, followed by laborious removal of by-products of the chemical reaction, which may have their own pharmacological activity. The use of a previously synthesized and purified vector component for introducing it into the surface layer of the formed particle greatly simplifies the process of obtaining the finished product and eliminates the use of specialized equipment for chemical synthesis.
Иммунофлуоресцентный анализ показал, что векторные молекулы располагаются на поверхности частиц полученной суспензии и способны связываться с моноклональными антителами к фолиевой кислоте, что свидетельствует о высоких показателях специфичности полимерного комплекса и способности связываться с фолатными рецепторами на поверхности клеток.Immunofluorescence analysis showed that vector molecules are located on the surface of the particles of the resulting suspension and are able to bind to monoclonal antibodies to folic acid, which indicates high specificity of the polymer complex and the ability to bind to folate receptors on the cell surface.
Описанный технический результат достигается по совокупности всех существующих признаков созданного полимерного комплекса для молекулярно-прицельной терапии.The described technical result is achieved by the totality of all existing features of the created polymer complex for molecular targeted therapy.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На Фиг. 1 представлена схема введения производного фолиевой кислоты в поверхностный слой полимерных частиц с указанием стадий: I - эмульсия, окруженная мицеллами, содержащими производное фолиевой кислоты; II - внедрение мицелл в поверхностный слой эмульсии за счет амфифильных свойств мицеллообразующего вещества (плюроник F-127); III - формирование частицы, содержащей производное фолиевой кислоты на поверхности. Условные обозначения на Фиг. 1: А - активное вещество, включенное в состав полимерных частиц; В - производное фолиевой кислоты, содержащее гидрофобный фрагмент; С - мицелла, образованная плюроником F-127; D - мицелла (С), содержащая производное фолиевой кислоты; Е - полимерная частица.In FIG. 1 shows a scheme for introducing a folic acid derivative into the surface layer of polymer particles, indicating the steps: I - an emulsion surrounded by micelles containing a folic acid derivative; II - the introduction of micelles into the surface layer of the emulsion due to the amphiphilic properties of the micelle-forming substance (Pluronic F-127); III - the formation of a particle containing a folic acid derivative on the surface. The legend in FIG. 1: A - active substance included in the composition of polymer particles; B is a folic acid derivative containing a hydrophobic moiety; C is a micelle formed by Pluronic F-127; D is a micelle (C) containing a folic acid derivative; E is a polymer particle.
На Фиг. 2 представлена гистограмма распределения частиц по размерам с указанием планок погрешностей (мин-макс) для каждой фракции. По оси абсцисс - диаметр частиц, нм; по оси ординат - относительное содержание фракций, %. Средний размер частиц: 227.6 нм; стандартное отклонение: ±1.5%In FIG. Figure 2 presents a histogram of the particle size distribution with indication of error bars (min-max) for each fraction. The abscissa is the particle diameter, nm; along the ordinate axis is the relative content of fractions,%. Average particle size: 227.6 nm; standard deviation: ± 1.5%
На Фиг. 3 представлены результаты анализа содержания производного фолиевой кислоты на поверхности частиц с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. По оси абсцисс - образцы частиц: ОО-016 - образец, не содержащий производного фолиевой кислоты, ОФ-020 и ОФ-021 - образцы, содержащие различное количество производного фолиевой кислоты. По оси ординат - интенсивность флуоресценции, отн. ед.In FIG. Figure 3 presents the results of the analysis of the content of a folic acid derivative on the surface of the particles using indirect immunofluorescence staining. On the abscissa axis are particle samples: OO-016 is a sample not containing a folic acid derivative, OF-020 and OF-021 are samples containing a different amount of a folic acid derivative. The ordinate axis shows the fluorescence intensity, rel. units
Осуществление и примеры реализации изобретенияThe implementation and examples of implementation of the invention
Разработка состава и способа получения комплекса для молекулярно-прицельной терапии в виде частиц является необходимым элементом в создании технологического процесса получения. Для достижения указанных целей, необходимо было, оптимизировать состав и разработать методики получения полимерных частиц с включенным доцетакселом и разработать технологически приемлемый способ введения векторного компонента.The development of the composition and method of producing a complex for molecular targeted therapy in the form of particles is a necessary element in creating the technological process of obtaining. To achieve these goals, it was necessary to optimize the composition and develop methods for producing polymer particles with docetaxel turned on and develop a technologically acceptable method for introducing the vector component.
Полимерные частицы, описываемые в настоящем изобретении, представляют собой субмикронные частицы, размер которых лежит в диапазоне от 50 до 600 нм. Полимер-носитель, в который включено активное вещество и молекулы векторного компонента, выбирался из сополимеров молочной и гликолевой кислоты с соотношением полимерных звеньев молочной и гликолевой кислоты от 75:25 до 25:75. Использовались коммерчески доступные полимеры ПЛГА. В качестве активного вещества использовали доцетаксел (в виде тригидрата). В качестве векторного компонента использовалось производное фолиевой кислоты - додециламид фолиевой кислоты (Санжаков М.А., Игнатов Д.В., Прозоровский В.Н. и др. Синтез адресного коньюгата для фосфолипидной системы транспорта лекарств // Биомед. химия, 2014. - Т. 60, вып. 6. - С. 713-716). В качестве растворителя полимера и активного вещества использовался метиленхлорид. При растворении додециламида фолиевой кислоты применяли N,N-диметилформамид. В качестве ПАВ применяли поливиниловый спирт (Sigma) и плюроник F-127 (Sigma). Концентрации полимера ПЛГА и активного вещества в неводной фазе подбирались аналогично ранее описанным подходам (Муравьёва А.И., Воронцов Е.А., Гукасова Н.В. и др. Разработка полимерной формы противоопухолевого препарата этопозид // Российские нанотехнологии. 2016. - Т. 11, №3.4. С. 84-91).The polymer particles described in the present invention are submicron particles, the size of which lies in the range from 50 to 600 nm. The carrier polymer, which includes the active substance and the molecules of the vector component, was selected from copolymers of lactic and glycolic acid with a ratio of polymer units of lactic and glycolic acid from 75:25 to 25:75. Commercially available PLGA polymers were used. As the active substance, docetaxel (in the form of a trihydrate) was used. A folic acid derivative, folic acid dodecylamide, was used as a vector component (Sanzhakov M.A., Ignatov D.V., Prozorovsky V.N. et al. Synthesis of targeted conjugate for a phospholipid drug transport system // Biomed. Chemistry, 2014. - T. 60, issue 6. - S. 713-716). Methylene chloride was used as a solvent for the polymer and the active substance. When dissolving folic acid dodecylamide, N, N-dimethylformamide was used. Polyvinyl alcohol (Sigma) and Pluronic F-127 (Sigma) were used as surfactants. The concentrations of the PLGA polymer and the active substance in the non-aqueous phase were selected similarly to the previously described approaches (Muravyova A.I., Vorontsov E.A., Gukasova N.V. et al. Development of the polymer form of the antitumor drug etoposide // Russian Nanotechnologies. 2016. - T 11, No. 3.4. P. 84-91).
Были подобраны условия, позволяющие получать полимерные частицы с содержанием включенного доцетаксела от 1 до 5% масс. Для достижения этого показателя наиболее оптимальным оказался сополимер молочной и гликолевой кислот с соотношением полимерных звеньев молочной и гликолевой кислоты 50:50 (ПЛГА 50/50).Conditions were selected that made it possible to obtain polymer particles with the content of incorporated docetaxel from 1 to 5% of the mass. To achieve this indicator, the most optimal was a copolymer of lactic and glycolic acids with a ratio of polymer units of lactic and glycolic acid 50:50 (PLGA 50/50).
В ходе экспериментальных исследований был предложен способ введения в состав частиц плохо растворимого в органической и водной средах додециламида фолиевой кислоты (векторный компонент) с использованием N,N-диметилформамида и ПАВ - плюроника F-127. Плюроник F-127 образует мицеллы с инкорпорированным додециламидом фолиевой кислоты и способствует его растворению в водном растворе ПАВ, а также обеспечивает последующее включение молекул векторного компонента на поверхность полимерных частиц. Для дополнительной стабилизации эмульсии, а затем и полученной из нее суспензии используется водный раствор ПАВ - поливинилового спирта, в который вводится солюбилизированный в растворе N,N-диметилформамида и плюроника F-127 векторный компонент.In the course of experimental studies, a method was proposed for introducing folic acid dodecylamide (vector component) poorly soluble in organic and aqueous media using N, N-dimethylformamide and a surfactant - Pluronic F-127. Pluronic F-127 forms micelles with incorporated folic acid dodecylamide and promotes its dissolution in an aqueous surfactant solution, and also ensures the subsequent incorporation of the vector component molecules onto the surface of the polymer particles. To further stabilize the emulsion, and then the suspension obtained from it, an aqueous solution of a surfactant is used - polyvinyl alcohol, into which the vector component is solubilized in a solution of N, N-dimethylformamide and Pluronic F-127.
Примененные подходы позволили получить продукт в виде лиофилизата для приготовления суспензии частиц субмикронного размера (диапазон 50-600 нм).The approaches used allowed us to obtain a product in the form of a lyophilisate for the preparation of a suspension of particles of submicron size (range 50-600 nm).
Таким образом, экспериментально были подобраны условия технологического процесса, позволяющие стабильно, воспроизводимо и с высоким выходом получать продукт в виде лиофилизата с указанными выше характеристиками.Thus, the conditions of the technological process were experimentally selected, which made it possible to stably, reproducibly and in high yield produce the product in the form of a lyophilizate with the above characteristics.
Подробное описание получения полимерного комплекса для молекулярно-прицельной терапии, представлено ниже в примере 1.A detailed description of the preparation of the polymer complex for molecular targeted therapy is presented below in Example 1.
Размер частиц определяли методом динамического светорассеяния. Полученные частицы имели субмикронные размеры - средний диаметр 90% частиц из диапазона 90-600 нм. Пример изображения распределения частиц по размерам суспензии образца в графическом виде приведен на Фиг. 2.Particle size was determined by dynamic light scattering. The resulting particles had submicron sizes — an average diameter of 90% of particles from the range of 90–600 nm. An example of the image of the particle size distribution of the sample suspension in graphical form is shown in FIG. 2.
Для анализа содержания производного фолиевой кислоты на поверхности частиц проводили непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание образцов. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что молекулы векторного компонента располагаются на поверхности частиц и способны связываться с моноклональными антителами к фолиевой кислоте, что свидетельствует о высоких показателях специфичности полимерного комплекса. Подробное описание эксперимента представлено ниже в примере 2.To analyze the content of the folic acid derivative on the surface of the particles, indirect immunofluorescence staining of the samples was performed. Immunofluorescence analysis showed that the molecules of the vector component are located on the surface of the particles and are able to bind to monoclonal antibodies to folic acid, which indicates high specificity of the polymer complex. A detailed description of the experiment is presented below in example 2.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1Example 1
Навески 190 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (PURASORB® PDLG 5004, PURAC Biochemicals, Нидерланды) и 10 мг доцетаксела тригидрата растворяли в 5.0 мл хлористого метилена. В полученный раствор вносили 4 мг плюроника F-127 (Pluronic® F-127) с последующим его растворением.Samples of 190 mg of a copolymer of lactic and glycolic acids (PURASORB ® PDLG 5004, PURAC Biochemicals, Netherlands) and 10 mg of docetaxel trihydrate were dissolved in 5.0 ml of methylene chloride. 4 mg of Pluronic F-127 (Pluronic ® F-127) was added to the resulting solution, followed by its dissolution.
Навеску 5 мг додециламида фолиевой кислоты растворяли в 1 мл смеси N,N-диметилформамид-плюроник F-127, взятых в соотношении 80:20 по массе. 200 мкл полученного раствора додециламида фолиевой кислоты (1 мг) вносили в 35 мл 1% водного раствора поливинилового спирта, приготовленного ранее, и тщательно перемешивали.A portion of 5 mg of folic acid dodecylamide was dissolved in 1 ml of a mixture of N, N-dimethylformamide-pluronic F-127, taken in a ratio of 80:20 by weight. 200 μl of the resulting folic acid dodecylamide solution (1 mg) was added to 35 ml of a 1% aqueous solution of polyvinyl alcohol prepared previously and mixed thoroughly.
Раствор сополимера молочной и гликолевой кислот, доцетаксела и плюроника F-127 в метиленхлориде вносили в 1% водный раствор поливинилового спирта, содержащий мицеллы додециламида фолиевой кислоты, и дважды обрабатывали ультразвуком с энергией 35 Дж в течение 1 минуты с перерывом в 1 минуту. В полученную эмульсию вносили якорь магнитной мешалки и оставляли перемешиваться при комнатной температуре на ночь. Сформировавшуюся суспензию переносили в центрифужную пробирку и далее центрифугировали с ускорением не менее 20000 g (20000-30000 g) в течение 15 минут при температуре рабочей камеры центрифуги 4°С.A solution of a copolymer of lactic and glycolic acids, docetaxel and pluronic F-127 in methylene chloride was introduced into a 1% aqueous solution of polyvinyl alcohol containing folic acid dodecylamide micelles, and was twice treated with 35 J ultrasound for 1 minute with an interval of 1 minute. An anchor of a magnetic stirrer was introduced into the resulting emulsion and allowed to mix at room temperature overnight. The formed suspension was transferred to a centrifuge tube and then centrifuged with an acceleration of at least 20,000 g (20000-30000 g) for 15 minutes at a temperature of the working chamber of the centrifuge 4 ° C.
Супернатант отбирали, добавляли к осадку 20 мл воды (использовали воду для инъекций). С помощью встряхивания осадок ресуспендировали. К восстановленной суспензии добавляли 0.75 мл 10% раствора D-маннитола, затем замораживали и лиофилизировали в течение суток.The supernatant was collected, 20 ml of water was added to the precipitate (water was used for injection). By shaking, the precipitate was resuspended. 0.75 ml of a 10% solution of D-mannitol was added to the reconstituted suspension, then it was frozen and lyophilized during the day.
В полученном лиофилизате определяли содержание доцетаксела, которое составило 3.0±0.5%.In the obtained lyophilisate, docetaxel content was determined, which amounted to 3.0 ± 0.5%.
Определяли средний размер частиц методом динамического светорассеяния, который составил 227.6 нм, стандартное отклонение ±1.5%, индекс полидисперсности - 0,069. Среднее значение дзета-потенциала частиц, в восстановленной из лиофилизата суспензии составило около минус 4.0±0.15 мВ.The average particle size was determined by dynamic light scattering, which was 227.6 nm, the standard deviation was ± 1.5%, the polydispersity index was 0.069. The average value of the zeta potential of the particles in the suspension recovered from the lyophilisate was about minus 4.0 ± 0.15 mV.
Содержание додециламида фолиевой кислоты на поверхности частиц восстановленной из лиофилизата суспензии определяли качественно, с использованием метода непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. Было подтверждено наличие на поверхности частиц фрагментов, содержащих фолиевую кислоту, которые способны связываться со специфическими антителами к фолиевой кислоте. Подробное описание эксперимента, представлено ниже в примере 2.The folic acid dodecylamide content on the surface of the particles of the suspension reconstituted from the lyophilisate was determined qualitatively using the method of indirect immunofluorescence staining. The presence of fragments containing folic acid on the surface of the particles, which are capable of binding to specific antibodies to folic acid, has been confirmed. A detailed description of the experiment is presented below in example 2.
Пример 2Example 2
Для проведения исследования использовали образцы лиофилизатов, содержащие додециламид фолиевой кислоты (серии образцов ОФ-020, ОФ-021) и не содержащие додециламид фолиевой кислоты (контрольный образец серии ОО-016). Содержание додециламида фолиевой кислоты на поверхности частиц восстановленной из лиофилизата суспензии определяли качественно, с использованием метода непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. Для проведения исследования использовали моноклональные антитела к фолиевой кислоте - клоны FA1, FA2, FA3 (ОАО «ВНЦМДЛ», Россия), поликлональные антитела козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Biolegend, США).For the study, lyophilisates samples containing folic acid dodecylamide (series of samples OF-020, OF-021) and not containing folic acid dodecylamide (control sample of the OO-016 series) were used. The folic acid dodecylamide content on the surface of the particles of the suspension reconstituted from the lyophilisate was determined qualitatively using the method of indirect immunofluorescence staining. Monoclonal antibodies to folic acid — clones FA1, FA2, FA3 (VNTSMDL, Russia), polyclonal goat antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with Alexa Fluor 488 (Biolegend, USA) were used for the study.
Для анализа образцы лиофилизатов (по 1.5 мг для каждого определения) ресуспендировали в деионизованной воде. Для удаления криопротектора (маннита) частицы центрифугировали с помощью настольной микроцентрифуги (5415R, Eppendorf, ФРГ) 10 мин при 10000 об/мин при 4°С. Супернатант удаляли, частицы ресуспендировали в фосфатном буферном растворе, рН 7.2. К суспензии частиц добавляли моноклональные антитела в концентрациях 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. После окончания инкубации частицы трижды промывали фосфатным буферным раствором, осаждая центрифугированием, как указано выше. Отмытые частицы ресуспендировали в фосфатном буферном растворе, добавляли вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488, в разведении 1:1000 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте при перемешивании. Далее частицы трижды отмывали фосфатным буферным раствором, ресуспендировали в 200 мкл фосфатного буферного раствора, переносили в 96-луночный планшет и измеряли интенсивность флуоресценции с помощью планшетного спектрофотометра-флуориметра VICTOR (Perkin Elmer, США).For analysis, lyophilisate samples (1.5 mg for each determination) were resuspended in deionized water. To remove the cryoprotectant (mannitol), the particles were centrifuged using a tabletop microcentrifuge (5415R, Eppendorf, Germany) for 10 min at 10,000 rpm at 4 ° C. The supernatant was removed, the particles were resuspended in phosphate buffered saline, pH 7.2. Monoclonal antibodies were added to the particle suspension at concentrations of 1 μg / ml, 5 μg / ml, 10 μg / ml and incubated for 1 h at room temperature with stirring. After incubation, the particles were washed three times with phosphate buffer solution, precipitating by centrifugation, as described above. The washed particles were resuspended in phosphate buffered saline, secondary antibodies conjugated with Alexa Fluor 488 were added at a 1: 1000 dilution and incubated for 1 h at room temperature in the dark with stirring. Then, the particles were washed three times with phosphate buffer solution, resuspended in 200 μl of phosphate buffer solution, transferred to a 96-well plate, and the fluorescence intensity was measured using a VICTOR plate spectrophotometer-fluorimeter (Perkin Elmer, USA).
Результаты анализа способности трех исследованных клонов моноклональных антител к фолиевой кислоте (МоАт к ФК) взаимодействовать с додециламидом фолиевой кислоты на поверхности частиц представлены в таблице. Показаны данные связывания различных клонов МоАт к ФК с частицами, содержащими додециламид фолиевой кислоты (серия образца ОФ-020) и не содержащими додециламид фолиевой кислоты (серия образца ОО-016).The results of the analysis of the ability of the three studied clones of monoclonal antibodies to folic acid (MoAt to FC) to interact with folic dodecylamide on the surface of the particles are presented in the table. Data are shown on the binding of various MoAt clones to FA with particles containing folic acid dodecylamide (series of sample OF-020) and free of folic acid dodecylamide (series of sample OO-016).
По данным иммунофлуоресцентного анализа был выбран клон МоАт (FA3) к ФК, обладающий не только высокой аффинностью к антигену, но и низкой неспецифической сорбцией на полимере. В отдельном эксперименте проведено исследование образцов, отличающихся по содержанию додециламида фолиевой кислоты - образцы серий ОФ-020 и ОФ-021.According to immunofluorescence analysis, a MoAt clone (FA3) for PK was selected, which possesses not only high affinity for the antigen, but also low non-specific sorption on the polymer. In a separate experiment, a study was conducted of samples differing in the content of folic acid dodecylamide - samples of the OF-020 and OF-021 series.
Результаты эксперимента, представленные на Фиг. 3, показали, что интенсивность флуоресценции изменяется пропорционально содержанию додециламида фолиевой кислоты.The experimental results shown in FIG. 3, showed that the fluorescence intensity varies in proportion to the content of folic acid dodecylamide.
Таким образом, иммунофлуоресцентный анализ показал, что молекулы векторного компонента располагаются на поверхности частиц полученной суспензии и способны связываться со моноклональными антителами к фолиевой кислоте, что свидетельствует о высоких показателях специфичности полимерного комплекса и его способности связываться с фолатными рецепторами на поверхности клеток для реализации молекулярно-прицельного механизма.Thus, immunofluorescence analysis showed that the molecules of the vector component are located on the surface of the particles of the resulting suspension and are able to bind to monoclonal antibodies to folic acid, which indicates high specificity of the polymer complex and its ability to bind to folate receptors on the cell surface to realize molecular-targeted mechanism.
Таким образом, по совокупности всех полученных результатов испытаний полимерный комплекс, содержащий: активный компонент - доцетаксел, полимерный компонент - сополимер молочной и гликолевой кислот, векторный компонент - додециламид фолиевой кислоты, представляющий собой лиофилизат для приготовления суспензии частиц субмикронного размера, обладает технологичным способом получения и оптимальными характеристиками для реализации молекулярно-прицельного механизма, что позволит широко использовать предложенный комплекс в составе лекарственных средств, предназначенных для молекулярно-прицельной терапии.Thus, according to the totality of all the test results obtained, the polymer complex containing: the active component is docetaxel, the polymer component is a copolymer of lactic and glycolic acids, the vector component is folic acid dodecylamide, which is a lyophilisate for preparing a suspension of submicron-sized particles, has a technologically advanced method for producing and optimal characteristics for the implementation of the molecular-targeting mechanism, which will make it possible to widely use the proposed complex as part of the drug idents of funds intended for molecular targeted therapy.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144561A RU2675810C1 (en) | 2017-12-19 | 2017-12-19 | Polymeric complex for molecular targeting therapy and method for its obtaining |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144561A RU2675810C1 (en) | 2017-12-19 | 2017-12-19 | Polymeric complex for molecular targeting therapy and method for its obtaining |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2675810C1 true RU2675810C1 (en) | 2018-12-25 |
Family
ID=64753647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017144561A RU2675810C1 (en) | 2017-12-19 | 2017-12-19 | Polymeric complex for molecular targeting therapy and method for its obtaining |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2675810C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110293730A1 (en) * | 2006-03-24 | 2011-12-01 | Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag | Polylactide nanoparticles |
| WO2015023775A1 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-19 | Baylor College Of Medicine | A novel plga-modified polyethylenimine self-assembly nanotechnology for nucleic acid and drug delivery |
| RU2595859C1 (en) * | 2015-07-20 | 2016-08-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Polymer containing medicinal agent based on antitumor agent etoposide |
-
2017
- 2017-12-19 RU RU2017144561A patent/RU2675810C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110293730A1 (en) * | 2006-03-24 | 2011-12-01 | Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag | Polylactide nanoparticles |
| WO2015023775A1 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-19 | Baylor College Of Medicine | A novel plga-modified polyethylenimine self-assembly nanotechnology for nucleic acid and drug delivery |
| RU2595859C1 (en) * | 2015-07-20 | 2016-08-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Polymer containing medicinal agent based on antitumor agent etoposide |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ESMAEILI F. et al. Folate-receptor-targeted delivery of docetaxel nanoparticles prepared by PLGA-PEG-folate conjugate. // J. Drug Target. 2008. - V. 16 (5). - P. 415-423. * |
| ESMAEILI F. et al. Folate-receptor-targeted delivery of docetaxel nanoparticles prepared by PLGA-PEG-folate conjugate. // J. Drug Target. 2008. - V. 16 (5). - P. 415-423. АWANG Y. et al. Targeted delivery of 5-fluorouracil to HT-29 cells using high efficient folic acid-conjugated nanoparticles // Drug Delivery. 2015. V.22 (2). P.191-198. ZHAO X. et al. Targeted drug delivery via folate receptors. // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. - V. 5 (3). - P. 309-319. * |
| ZHAO X. et al. Targeted drug delivery via folate receptors. // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. - V. 5 (3). - P. 309-319. * |
| АWANG Y. et al. Targeted delivery of 5-fluorouracil to HT-29 cells using high efficient folic acid-conjugated nanoparticles // Drug Delivery. 2015. V.22 (2). P.191-198. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Perinelli et al. | PEGylated polylactide (PLA) and poly (lactic-co-glycolic acid)(PLGA) copolymers for the design of drug delivery systems | |
| Choudhury et al. | Strategizing biodegradable polymeric nanoparticles to cross the biological barriers for cancer targeting | |
| Choudhury et al. | Recent advances in TPGS-based nanoparticles of docetaxel for improved chemotherapy | |
| Öztürk et al. | Novel advances in targeted drug delivery | |
| US9789195B2 (en) | Particulate drug delivery methods | |
| Estanqueiro et al. | Nanotechnological carriers for cancer chemotherapy: the state of the art | |
| Pushpalatha et al. | Nanocarrier mediated combination drug delivery for chemotherapy–A review | |
| Anajafi et al. | Polymersome-based drug-delivery strategies for cancer therapeutics | |
| US9295651B2 (en) | Nanoconjugates and nanoconjugate formulations | |
| Tomasina et al. | Nanocarriers for the targeted treatment of ovarian cancers | |
| JP2022031484A (en) | Antibody-mediated autocatalytic, targeted delivery of nanocarriers to tumors | |
| JP2017165780A (en) | Long circulating nanoparticles for sustained release of therapeutic agents | |
| Zhang et al. | EGFP–EGF1-conjugated nanoparticles for targeting both neovascular and glioma cells in therapy of brain glioma | |
| US20060078624A1 (en) | Microparticles and nanoparticles containing a lipopolymer | |
| JP2013209373A (en) | System for targeted delivery of therapeutic agent | |
| Zou et al. | α3β1 integrin-targeting polymersomal docetaxel as an advanced nanotherapeutic for nonsmall cell lung cancer treatment | |
| Lv et al. | Enhanced antiglioblastoma efficacy of neovasculature and glioma cells dual targeted nanoparticles | |
| Cao et al. | Polymer nanoparticulate drug delivery and combination cancer therapy | |
| Marta et al. | What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future | |
| Al-Amili et al. | Self-assembled micelles of amphiphilic PEGylated drugs for cancer treatment | |
| RU2675810C1 (en) | Polymeric complex for molecular targeting therapy and method for its obtaining | |
| KR20180101462A (en) | Therapeutic nanoparticles comprising therapeutic agents and methods for their manufacture and use | |
| Dhankar et al. | HER-2 targeted immunonanoparticles for breast cancer chemotherapy | |
| Dahiya et al. | Organic nanocarriers for targeted delivery of anticancer agents | |
| Qu et al. | Recent progress of doxorubicin nanomedicine in hematologic malignancies |