RU2671411C1 - Способ получения меченных тритием белков - Google Patents
Способ получения меченных тритием белков Download PDFInfo
- Publication number
- RU2671411C1 RU2671411C1 RU2017133991A RU2017133991A RU2671411C1 RU 2671411 C1 RU2671411 C1 RU 2671411C1 RU 2017133991 A RU2017133991 A RU 2017133991A RU 2017133991 A RU2017133991 A RU 2017133991A RU 2671411 C1 RU2671411 C1 RU 2671411C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tritium
- protein
- vessel
- suspension
- proteins
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims abstract description 67
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 60
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims abstract description 22
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000002113 nanodiamond Substances 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 8
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 claims description 8
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 5
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 4
- 239000002109 single walled nanotube Substances 0.000 claims description 4
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 abstract 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 10
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical group NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007725 thermal activation Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical class OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 2
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 carbon-14 amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N Carbon-14 Chemical compound [14C] OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N Protium Chemical class [1H] YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 241000720974 Protium Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005574 cross-species transmission Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000005474 detonation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-JMRXTUGHSA-N ditritium Chemical compound [3H][3H] UFHFLCQGNIYNRP-JMRXTUGHSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011981 lindlar catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
- C07B59/008—Peptides; Proteins
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
- B82B3/0009—Forming specific nanostructures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/13—Labelling of peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения изотопно-меченых веществ и может быть использовано для введения радиоактивной метки в белки с целью изучения их поведения в различных системах, включая биологические. Описан способ получения меченных тритием белков при использовании в качестве метящего агента атомарного трития, получаемого при термической каталитической диссоциации молекул трития на вольфрамовой проволоке. Принципиальное отличие предлагаемого способа от ранее описанных заключается в том, что предварительно белок наносят на углеродные наноматериалы, а затем обрабатывают атомарным тритием. При проведении реакции с атомарным тритием температура стенок реакционного сосуда поддерживается в интервале 291-298 K, при охлаждении до 77 K только нижней части сосуда, на которой нет вещества. Способ позволяет получить меченные тритием белки с увеличенной удельной радиоактивностью до 9000 Ки/моль. 3 з.п. ф-лы, 4 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к изотопно-меченным веществам и может быть использовано для введения радиоактивной метки в белки с целью изучения их использования как радиоактивного индикатора в химических, биохимических и медицинских исследованиях.
Уровень техники
Меченные тритием вещества широко используются при проведении биохимических и фармакокинетических испытаний. Разработано много способов получения меченных тритием низкомолекулярных соединений. Однако набор методов введения трития в белки ограничен.
В работе [Ротт Г.М., Семин Ю.А., Домбровский В.И., Поверенный A.M., Вязов C.O., Дорошенко Н.В. Способ получения меченного белка. SU 968036] описан способ введения трития и углерода-14 в белки с помощью формальдегида, который сначала подвергали взаимодействию с меченной тритием или углеродом-14 аминокислотой. Такой способ позволяет получать модифицированный 3Н-лизином альбумин с удельной радиоактивностью 273 мкКи/мг. При молекулярной массе альбумина 69 кДа удельная активность белка составляет 18 Ки/ммоль или 0,65 атомов трития на молекулу.
В работе [Yu.A. Zolotarev, А.К. Dadayan, Е.V. Bocharov, Yu.A. Borisov, В.V. Vaskovsky, Е.М. Dorokhova, N.F. Myasoedov New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid catalytic isotopic exchange with spillover-tritium // Amino Acids 2003, 24, 325-333. DOI 10.1007/s00726-002-0404-7] описан способ получения пяти- и шестичленных пептидов с помощью твердофазного каталитического замещения протия на тритий и сделан вывод о том, что этим способом может быть достигнута радиоактивность белков 1000 Ки/ммоль (до 34 атомов трития в молекуле белка), хотя примеров получения белков с такой удельной активностью не приводится. Этот подход использовали в работе [Ю.А. Золотарев, А.К. Дадаян, B.C. Козик, Е.В. Гасанов, И.В. Назимов, Р.Х. Зиганшин, Б.В. Васьковский, А.Н. Мурашов, А.Л. Ксенофонтов, О.Н. Харыбин, Е.Н. Николаев, Н.Ф. Мясоедов. Твердофазный изотопный обмен водорода на дейтерий и тритий в генно-инженерном инсулине человека // Биоорг. Хим. 2014, 40, 31-41] для введения трития в инсулин. Получен препарат с удельной радиоактивностью 40 Ки/ммоль, то есть в молекуле белка среднее содержание трития составило 1,4 атома на молекулу.
Повышение удельной радиоактивности низкомолекулярных веществ может быть достигнуто использованием углеродных наноматериалов в качестве подложки. Нанесение 4-(2-аминоэтил)пирокатехола на поверхность наноалмазов способствовало увеличению в 3 раза (с 44 до 135 Ки/ммоль) его удельной радиоактивности при введении трития с помощью каталитического гидрогенолиза в присутствии катализатора Линдлара [Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В., Бадун Г.А., Чернышева М.Г., Федосеев В.М. Равномерно меченный дейтерием или тритием 4-(2-аминоэтил)пирокатехол с использованием наноалмазного порошка. RU 2422436]. Однако условия проведения реакции (нагревание реакционной смеси до 180°С в течение 15 минут) не позволяет использовать данный подход к веществам, которые подвергаются деструкции в этих условиях, в частности, этот подход неприменим ко многим белкам.
Наиболее близким к заявляемому является способ введения тритиевой метки в белки с помощью метода термической активации трития [RU 2499785, 27.11.2013], в котором раствор белка наносили на стенки стеклянного реакционного сосуда и лиофильно высушивали. После чего проводили обработку атомарным тритием, полученным атомизацией молекулярного трития на вольфрамовом катализаторе при температурах атомизатора 1500-2000 К. Показано, что при проведении реакции при температуре мишени 295 К возможно получать меченный тритием альбумин с удельной радиоактивностью 3,32 ТБк/ммоль (89,7 Ки/ммоль), что соответствует введению 3 атомов трития в молекулу белка. Увеличение продолжительности обработки белка атомарным тритием не позволяет существенно увеличить его удельную радиоактивность, но приводит к снижению его радиохимического выхода. Более высокие значения удельной радиоактивности необходимы для повышения чувствительности и нижнего предела обнаружения белка в биохимических исследованиях.
С целью увеличения удельной активности меченых белков предлагается использовать метод термической активации, но предварительно белок наносить на углеродные наноматериалы: наноалмазы детонационного синтеза, углеродные одностенные нанотрубки и оксид графена.
Раскрытие изобретения
Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является разработка способа получения меченных тритием белков с удельной радиоактивностью не менее 1000 Ки/ммоль.
Технический результат настоящего изобретения заключается в повышении удельной радиоактивности меченных тритием белков, получаемых с помощью метода термической активации, с 90 Ки/ммоль до 1000-9000 Ки/ммоль. Предлагаемый метод позволяет получить меченный тритием белок с прочносвязанной меткой за счет того, что связывание трития происходит по связи С-Н.
Указанный технический результат достигается благодаря тому, что для введения трития в белок его наносят не на стеклянную поверхность реакционного сосуда, а предварительно адсорбируют на углеродный материал, который затем размещают на стенках реакционного сосуда. Нанесение белка на углеродные наноматериалы обеспечивает увеличение доступности белка атомам трития при проведении процедуры введения метки, при этом для увеличения доступной для атомов трития поверхности белка используется развитая поверхность углеродных материалов таких как наноалмаз, оксид графена и углеродные нанотрубки.
Поставленная задача решается тем, что способ получения меченных тритием белков с высокой удельной радиоактивностью методом термической активации трития, включает: приготовление водной суспензии углеродных наноматериалов, нанесение на их поверхность белка, равномерное нанесение полученной суспензии на стенки сосуда с последующей лиофилизацией и удалением воздуха, причем упомянутый сосуд содержит установленную с возможностью подключения электрического тока вольфрамовую нить для активации трития, охлаждение дна сосуда, не содержащего мишень, до температуры жидкого азота (77 К), при этом стенки сосуда с нанесенной мишенью поддерживают при температуре 290-298 К, введение газообразного трития и его активацию на вольфрамовой нити в течении 5-15 с. Для введения трития предлагаемым способом можно использовать любые белки, способные адсорбироваться на углеродных материалах из водных растворов, таким образом изобретение можно применить к любым водорастворимым глобулярным белкам.
Осуществление изобретения
Сначала готовится водная суспензия углеродного наноматериала (наноалмаз, оксид графена, одностенные углеродные нанотрубки) с концентрацией 1-2 г/л, например, 5-50 мг углеродного материала суспендируют в 5-50 мл воды. 1-5 мл суспензии переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10-30 минут при скорости от 10000 до 14000 об./мин. Затем отбирают водную фазу и замещают отобранный объем водным раствором глобулярного белка, например, бычьего сывороточного альбумина, с концентрацией 2-5 мг/мл в объемном соотношении от 1÷3 до 3÷1 с обеспечением гомогенности раствора.
Полученную суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течении 5±2 мин с помощью ультразвуковой ванны при максимальной мощности для увеличения поверхности сорбции, затем термостатируют при 20-25°С в течении 12-24 часов до достижения равновесной адсорбции альбумина. После термостатирования суспензию центрифугируют в течении времени достаточного для осаждения наноматериалов. В среднем указанное время составляет 10-20 минут. Определяют равновесное количество белка в растворе при помощи окрашивания Coomassie G250. Количество адсорбированного белка на поверхности углеродного материала определяют по уменьшению его концентрации в растворе. Затем отбирают раствор над наноматериалом и промывают осадок водой от несвязанного белка. Удаление свободного несвязавшегося белка от наноматериала проводят центрифугированием с отделением надосадочного раствора и добавкой новой порции воды в объеме не менее исходного объема промываемой суспензии; процедура отмывки повторяется 4-5 раз для уменьшения концентрации свободного белка не менее чем в 1000 раз от исходной. Таким образом получают суспензию наноматериала, на которую нанесен мономолекулярный слой белка.
После этого полученную суспензию в количестве от 0,001 до 0,01 мг/см2 вносят в сосуд для работы с газообразным тритием, описанный в работе [И.А. Разживина, Г.А. Бадун, М.Г. Чернышева, В.И. Коробков, А.Е. Жирнов. Полимерные пленки как индикатор спилловера водорода через газовую фазу. Радиохимия. 2017. Т. 59, N 3, С. 248-254], раскатывают по стенкам, полностью замораживают жидким азотом и высушивают с помощью лиофилизации. Сосуд с нанесенным веществом присоединяют к вакуумной установке для работы с газообразным тритием, заполняют сосуд газообразным тритием или смесью трития с водородом до давления 1,3±0,5 Па. Дно сосуда охлаждали до температуры 77-78 К, для обеспечения вымораживания побочных продуктов (аммиак, углекислый газ, вода). Для замораживания может быть использован жидкий азот. Нагревают вольфрамовый катализатор до 1750-1950 К помощью электрического тока в течении 5-20 с. После реакции систему вакуумируют, сосуд с облученной мишенью заполняют воздухом и снимают с установки. Для удаления трития из лабильных положений суспензию упаривают на роторном испарителе, твердую фазу ресуспензируют в воде.
Продолжительность нагревания вольфрамового катализатора в течение 5-20 с обеспечивает оптимальные условия по введению трития в белки: при более короткой экспозиции не успевает установиться стационарный режим атомизации, за 20 с проходит активация всего трития.
Для определения удельной радиоактивности белка с помощью аминокислотного анализа по стандартной методике Спэкмена, Штейна и Мура [Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. // Anal. Chem. 1958. V. 30. 1185-1190] твердую фазу суспендируют в гидролизной смеси, содержащей смесь соляной и трифторуксусной кислот в соотношении объемов 2:1 с 0,001% добавкой β-меркаптоэтанола. Суспензию переносили в стеклянные ампулы, замораживали жидким азотом, откачивали воздух и запаивали. Для получения гидролизата белка ампулы помещают в печь, прогретую до 155±5°С и оставляют на 60±5 минут. По окончании гидролиза ампулы охлаждают до комнатной температуры, раствор над наноматериалом отбирают и упаривают с помощью лиофилизации. Остаток растворяют в 0,1 М соляной кислоте и проводят аминокислотный анализ. Радиоактивность белка рассчитывают как сумму радиоактивностей аминокислотных остатков. Найденная радиоактивность относится к тритию, прочно связанному в белке по связям С-Н, так как легко обменный тритий был удален в результате процедур обработки: сначала обменом в воде при комнатной температуре, затем при гидролизе белка в кислой среде при 155±5°С; после проведения такой обработки раствор упаривали досуха для удаления трития, перешедшего из белка в воду.
Используемые наноматериалы должны иметь удельную поверхность не менее 200 м2/г, размер отдельных частиц наноматериалов может быть любой.
Соотношение объемов растворов суспензии наноматериалов и белка, а также их концентрации выбирают из условия возможности покрытия материалов мономолекулярным слоем белка.
Способ позволяет получить меченный тритием белок с прочносвязанной меткой за счет того, что связывание трития происходит по связи С-Н, это подтверждается результатами аминокислотного анализа.
Реализация предложенного изобретения описана в Примерах.
Пример 1. Получение суспензии наноматериала с адсорбированным альбумином.
Водную суспензию углеродного наноматериала (наноалмаз, оксид графена, одностенные углеродные нанотрубки), содержащую 1 мг твердой фазы осаждали с помощью центрифугирования, отбирали водную фазу и добавляли 1 мл раствора бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 2,5 мг/мл. Суспензии подвергали ультразвуковой обработке в течении 10 мин с помощью ультразвуковой ванны при максимальной мощности и термостатировали в течении суток при 25°С. Суспензии центрифугировали и определяли равновесное количество белка в растворе при помощи окрашивания Coomassie G250. Количество адсорбированного альбумина на поверхности углеродного материала определяли по уменьшению концентрации в растворе. Отбирали раствор над наноматериалом, промывали осадок водой от несвязанного белка, для чего проводили добавку новой порции воды, центрифугировали в течение 10 минут, отделяли надосадочный раствор и повторяли эту процедуру 4 раза.
Пример 2. 1 мг наноалмаза с нанесенным альбумином, полученного способом по примеру 1, суспендировали в 1 мл воды и наносили на стенки реакционного сосуда для работы с газообразным тритием, замораживали жидким азотом и высушивали с помощью лиофилизации. Сосуд с нанесенным веществом присоединяли к вакуумной установке для работы с газообразным тритием, заполняли сосуд газообразной тритий-протиевой смесью (содержание трития 31%) до давления 1,3 Па. Дно сосуда охлаждали жидким азотом. Нагревали вольфрамовый катализатор до 1800±30 К помощью электрического тока в течении 10 с. После реакции систему вакуумировали, сосуд с облученной мишенью заполняли воздухом и снимали с установки. Для удаления трития из лабильных положений суспензию упаривали на роторном испарителе, твердую фазу ресуспензировали в воде и повторяли процедуру упаривания. Твердую фазу суспендировали в гидролизной смеси, содержащей смесь соляной и трифторуксусной кислот в соотношении 2:1 с 0,001% добавкой β-меркаптоэтанола. Суспензию переносили в стеклянную ампулу, замораживали жидким азотом, откачивали воздух и запаивали. Ампулы помещали в печь, прогретую до 155°С и оставляли на 1 час. По окончании гидролиза ампулы охлаждали при комнатной температуре, вскрывали, раствор над наноалмазами отбирали и упаривали с помощью лиофилизации. Осадок растворяли в 0,1 М соляной кислоте, исследовали на аминокислотном анализаторе Amino Acid Analyzer Hitachi L-800 (Япония) по стандартной методике Спэкмена, Штейна и Мура [Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. // Anal. Chem. 1958. V. 30. 1185-1190.]. Данные, полученные с аминокислотного анализатора и проточного счетчика (оптическое поглощение элюата по реакции с нингидрином при длинах волн 570 и 440 нм и радиоактивность элюата), обрабатывали при помощи программы «МультиХром для Windows». Радиоактивность белка, рассчитанная как сумма радиоактивностей аминокислотных остатков, составила 2,7×103 Ки/ммоль (в пересчете на 100% содержание трития в тритий-протиевой смеси, составила 8,7×103 Ки/ммоль или 300 атомов трития в молекуле белка).
Пример 3. 1 мг углеродных нанотрубок с нанесенным альбумином, полученного способом аналогичным примеру 1, суспендировали в 1 мл воды и наносили на стенки реакционного сосуда для работы с газообразным тритием, замораживали жидким азотом и высушивали с помощью лиофилизации. Введение метки проводили по методике, описанной в примере 1. Радиоактивность белка, рассчитанная как сумма радиоактивностей аминокислотных остатков, составила 1,6×103 Ки/ммоль (в пересчете на 100% содержание трития в тритий-протиевой смеси, составила 5,2×103 Ки/ммоль или 300 атомов трития в молекуле белка).
Пример 4. 1 мг углеродных оксида графена с нанесенным альбумином, полученного способом аналогичным примеру 1, суспендировали в 1 мл воды и наносили на стенки реакционного сосуда для работы с газообразным тритием, замораживали жидким азотом и высушивали с помощью лиофилизации. Введение метки проводили по методике, описанной в примере 1. Радиоактивность белка, рассчитанная как сумма радиоактивностей аминокислотных остатков, составила 1,6×103 Ки/ммоль (в пересчете на 100% содержание трития в тритий-протиевой смеси, составила 5,2×103 Ки/ммоль или 300 атомов трития в молекуле белка).
Claims (12)
1. Способ получения меченных тритием водорастворимых глобулярных белков, включающий:
- приготовление водной суспензии углеродного наноматериала с концентрацией 1-2 г/л;
- приготовление водного раствора белка с концентрацией 2-5 г/л;
- смешение водной суспензии наноматериала с водным раствором белка в объемном соотношении от 1÷3 до 3÷1 с обеспечением гомогенности раствора;
- выдерживание полученной суспензии не менее 12 часов до достижения равновесной адсорбции белка на наноматериале;
- удаление свободного несвязавшегося белка из смеси центрифугированием;
- нанесение полученной суспензии на стенки сосуда, содержащего вольфрамовую нить, в количестве от 0,001 до 0,01 мг/см2 с последующей лиофильной сушкой до образования пленки;
- заполнение сосуда газообразным тритием или смесью трития с водородом;
- активацию трития посредством нагрева вольфрамовой нити до температуры 1750-1950 K в течение 5-20 с с одновременным охлаждением дна сосуда до температуры жидкого азота с получением пленки, содержащей меченные тритием белки, и последующим ресуспендированием пленки в воде и извлечением из сосуда полученной суспензии.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве углеродного наноматериала используют наноалмаз, оксид графена, одностенные углеродные нанотрубки с удельной наноповерхностью не менее 200 м2/г.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что центрифугирование для удаления свободного несвязавшегося белка повторяют 4-5 раз с добавлением новой порции воды не менее объема суспензии.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что нанесение суспензии на стенки сосуда реализуют раскатыванием по стенкам, обеспечивающим возможность равномерного распределения наноматериала с белком на его стенках.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017133991A RU2671411C1 (ru) | 2017-09-29 | 2017-09-29 | Способ получения меченных тритием белков |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017133991A RU2671411C1 (ru) | 2017-09-29 | 2017-09-29 | Способ получения меченных тритием белков |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2671411C1 true RU2671411C1 (ru) | 2018-10-31 |
Family
ID=64103421
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017133991A RU2671411C1 (ru) | 2017-09-29 | 2017-09-29 | Способ получения меченных тритием белков |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2671411C1 (ru) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2295510C8 (ru) * | 2005-12-19 | 2008-01-10 | Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова | Способ получения меченных тритием гуминовых и гуминоподобных веществ |
RU2499785C2 (ru) * | 2011-07-01 | 2013-11-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) | Способ увеличения радиоактивности меченных тритием органических соединений при их получении с помощью метода термической активации трития |
RU2538862C2 (ru) * | 2013-03-18 | 2015-01-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Меченные тритием наноалмазы и способ их получения |
-
2017
- 2017-09-29 RU RU2017133991A patent/RU2671411C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2295510C8 (ru) * | 2005-12-19 | 2008-01-10 | Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова | Способ получения меченных тритием гуминовых и гуминоподобных веществ |
RU2499785C2 (ru) * | 2011-07-01 | 2013-11-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) | Способ увеличения радиоактивности меченных тритием органических соединений при их получении с помощью метода термической активации трития |
RU2538862C2 (ru) * | 2013-03-18 | 2015-01-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Меченные тритием наноалмазы и способ их получения |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Novel Fe3O4@ TiO2 core− shell microspheres for selective enrichment of phosphopeptides in phosphoproteome analysis | |
Peng | Metal–organic frameworks in proteomics/peptidomics-a review | |
Chen et al. | Facile preparation of core–shell magnetic metal–organic framework nanoparticles for the selective capture of phosphopeptides | |
Chen et al. | Tailor-made stable Zr (IV)-based metal–organic frameworks for laser desorption/ionization mass spectrometry analysis of small molecules and simultaneous enrichment of phosphopeptides | |
Li et al. | Functionalized magnetic nanoparticles for sample preparation in proteomics and peptidomics analysis | |
Wang et al. | Facile preparation of SiO2/TiO2 composite monolithic capillary column and its application in enrichment of phosphopeptides | |
Qin et al. | Metal chelation dual-template epitope imprinting polymer via distillation-precipitation polymerization for recognition of porcine serum albumin | |
US9932415B2 (en) | Formyl group-containing porous support, adsorbent using same, method for producing same, and method for producing the adsorbent | |
JP6506554B2 (ja) | 吸着体、及びそれを用いた精製方法 | |
Badun et al. | A novel approach radiolabeling detonation nanodiamonds through the tritium thermal activation method | |
US8298414B2 (en) | Separation process | |
JP2015091953A (ja) | 2−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 | |
He et al. | Graft modification of cotton with phosphate group and its application to the enrichment of phosphopeptides | |
Wang et al. | A rational route to hybrid aptamer-molecularly imprinted magnetic nanoprobe for recognition of protein biomarkers in human serum | |
WO2019181018A1 (ja) | ホウ素同位体を含有するナノシリカ粒子のホウ素中性子捕捉剤 | |
Han et al. | Molecular mechanism of loading sulfur hexafluoride in γ-cyclodextrin metal–organic framework | |
Wei et al. | Mesoporous zirconium phenylphosphonates for selective enrichment of phosphopeptides | |
Wang et al. | Antifouling hydrogel-coated magnetic nanoparticles for selective isolation and recovery of circulating tumor cells | |
RU2671411C1 (ru) | Способ получения меченных тритием белков | |
Li et al. | Synthesis of crystalline covalent organic framework as stationary phase for capillary electrochromatography | |
Wang et al. | In situ synthesis of a novel metal oxide affinity chromatography affinity probe for the selective enrichment of low‐abundance phosphopeptides | |
Yan et al. | In-tip nanoreactors for cancer cells proteome profiling | |
Salimi et al. | Ti (IV) attached‐phosphonic acid functionalized capillary monolith as a stationary phase for in‐syringe‐type fast and robust enrichment of phosphopeptides | |
RU2538862C2 (ru) | Меченные тритием наноалмазы и способ их получения | |
RU2672741C1 (ru) | Способ получения меченных тритием наноалмазов |