RU2669354C1 - Means for delivery of active agent - Google Patents
Means for delivery of active agent Download PDFInfo
- Publication number
- RU2669354C1 RU2669354C1 RU2017131557A RU2017131557A RU2669354C1 RU 2669354 C1 RU2669354 C1 RU 2669354C1 RU 2017131557 A RU2017131557 A RU 2017131557A RU 2017131557 A RU2017131557 A RU 2017131557A RU 2669354 C1 RU2669354 C1 RU 2669354C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chitosan
- liposomes
- peg
- groups
- conjugate
- Prior art date
Links
- 239000013543 active substance Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 158
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 144
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 14
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 28
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 17
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 50
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 35
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 26
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 23
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 22
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 22
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 16
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 15
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 15
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 14
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 13
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 13
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 10
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 10
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 7
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- -1 Ca 2+ Chemical class 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002375 Hand-Foot Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 229920005605 branched copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 3beta-hydroxyolean-12-en-28-oic acid Chemical class C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLALYHDPUIEJKC-UHFFFAOYSA-N ON1C(CCC1=O)=O.C(CCC(=O)O)(=O)O.ON1C(CCC1=O)=O Chemical compound ON1C(CCC1=O)=O.C(CCC(=O)O)(=O)O.ON1C(CCC1=O)=O QLALYHDPUIEJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940115080 doxil Drugs 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- 125000003929 folic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
- A61K31/722—Chitin, chitosan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к средствам для доставки активного агента, содержащим стабилизатор липосомальных суспензий. Стабилизатор представляет собой хитозан молекулярной массы 15-120 кДа, модифицированный цепями полиэтиленгликоля или остатками фолиевой кислоты. Изобретение может быть использовано в системах фармацевтического назначения, как стабилизатор липосом, загруженных различными лекарственными препаратами. Комплексы липосом с данным стабилизатором могут быть использованы как системы доставки лекарственных препаратов.The invention relates to biotechnology, in particular to means for delivering an active agent containing a stabilizer of liposomal suspensions. The stabilizer is a chitosan of molecular weight 15-120 kDa, modified by chains of polyethylene glycol or folic acid residues. The invention can be used in pharmaceutical systems, as a stabilizer of liposomes loaded with various drugs. Liposome complexes with this stabilizer can be used as drug delivery systems.
Уровень техникиState of the art
Липосомы представляют собой частицы, которые образованы одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислоями, внутренний объем которых изолирован от внешней среды. В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев различают следующие липосомы: 1) малые моноламеллярные, образованные одиночным липидным бислоем (диаметр 20-50 нм); 2) крупные моноламеллярные (макровезикулярные), образованные также одиночным бислоем (диаметр 50-200 нм и выше); 3) многослойные (мультиламеллярные), насчитывающие до несколько десятков и даже сотен липидных бислоев (диаметр до 5000-10000 нм).Liposomes are particles that are formed by one or more concentric closed lipid bilayers, the internal volume of which is isolated from the external environment. The following liposomes are distinguished depending on the particle size and the number of lipid layers forming them: 1) small monolamellar, formed by a single lipid bilayer (diameter 20-50 nm); 2) large monolamellar (macrovesicular), also formed by a single bilayer (diameter 50-200 nm and above); 3) multilayer (multilamellar), counting up to several tens and even hundreds of lipid bilayers (diameter up to 5000-10000 nm).
Липосомы представляются перспективными системами для доставки лекарственных средств. Липосомы обладают рядом значительных преимуществ, таких как биосовместимость, низкая имунногенность [Yasuda, Т., Dancey, G.F., Kinsky, S.С. Immunogenicity of liposomal model membranes in mice: Dependence on phospholipid composition. // Proc. Natl. Acad. Sci USA: Immunology 1977, V. 74, p. 1234-1236]. Размер липосом позволяет им более эффективно проникать в опухоли. При этом опухоль не имеет собственной лимфатической системы, что приводит к накоплению лекарственного препарата. Схожесть по химическому составу липосом с клеточными мембранами обеспечивает эффективную внутриклеточную доставку. Следует также отметить, что липосомы могут служить системами доставки как гидрофобных веществ, так и гидрофильных лекарств в виду амфифильной природы липидов.Liposomes appear to be promising drug delivery systems. Liposomes have a number of significant advantages, such as biocompatibility, low immunogenicity [Yasuda, T., Dancey, G.F., Kinsky, S.C. Immunogenicity of liposomal model membranes in mice: Dependence on phospholipid composition. // Proc. Natl. Acad. Sci USA: Immunology 1977, V. 74, p. 1234-1236]. The size of liposomes allows them to penetrate into the tumor more efficiently. Moreover, the tumor does not have its own lymphatic system, which leads to the accumulation of the drug. The similarity in chemical composition of liposomes to cell membranes ensures efficient intracellular delivery. It should also be noted that liposomes can serve as delivery systems for both hydrophobic substances and hydrophilic drugs in view of the amphiphilic nature of lipids.
Однако до сих пор применение липосом в медицине ограничено вследствие низкой термодинамической стабильности липосом, склонности к агрегации и окислению. Было установлено, что включение лекарственных препаратов в липосомы может ускорить процесс разрушения мембраны [Fonseca М, van Winden Е., Crommelin D. Doxorubicin induces aggregation of small negatively charged liposomes. // Eur. J. Pharm and Biopharm. 1997, V. 43, p. 9-17]. Более того, ряд препаратов, часто использующихся в химиотерапии, характеризуется низкой эффективностью загрузки [Abraham S., Waterhouse D.N., Mayer L.D, Cullis P.R, Madden T.D., Bally M.B. The liposomal formulation of doxorubicin. // Methods in enzymology 2005, V. 331, p. 71-97].However, the use of liposomes in medicine is still limited due to the low thermodynamic stability of liposomes, a tendency to aggregation and oxidation. It was found that the inclusion of drugs in liposomes can accelerate the process of membrane destruction [Fonseca M, van Winden E., Crommelin D. Doxorubicin induces aggregation of small negatively charged liposomes. // Eur. J. Pharm and Biopharm. 1997, V. 43, p. 9-17]. Moreover, a number of drugs often used in chemotherapy are characterized by low loading efficiency [Abraham S., Waterhouse D.N., Mayer L.D., Cullis P.R, Madden T.D., Bally M.B. The liposomal formulation of doxorubicin. // Methods in enzymology 2005, V. 331, p. 71-97].
Липосомы как коллоидные системы с термодинамической точки зрения нестабильны и находятся под влиянием кинетического контроля [Ulrich A. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. // Bioscience reports 2002, V. 22, p. 129-150.]. Таким образом, липосомальные системы стабильны при разбавлении, в отличие от мицеллярных систем или микроэмульсий [Chung Н., Kim T.W., Kwon М., Kwon I.C., Jeong S.Y. Oil components modulate physical characteristics and function of the natural oil emulsions as drug or gene delivery system. // J. Control. Release 2001, V. 71, p. 339-350]. Согласно теории Дерягина - Ландау - Фервея - Овербека (ДЛФО) стабильность системы в растворе электролитов достигается, когда электростатическое отталкивание между двумя заряженными частицами превышает по модулю значение силы Ван-дер-Ваальса. Заряженные липосомы медленнее агрегируют в растворах с низкой ионной силой [Ulrich A. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. // Bioscience reports 2002, V. 22, p. 129-150], в то время как в растворах с высокой концентрацией липидов или в присутствии многозарядных ионов, например Са2+ наблюдается агрегация [Lasic D.D. Liposomes in Gene Delivery. Boca Raton: CRC Press, 1997, 303 р]. Таким образом, на стабильность липосом влияют два основных процесса: агрегация и слияние [Riaz М. Review article: stability and uses of liposomes. // Pakistan j pharm sci 1995, V. 8, p. 69-79].From the thermodynamic point of view, liposomes as colloidal systems are unstable and are influenced by kinetic control [Ulrich A. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. // Bioscience reports 2002, V. 22, p. 129-150.]. Thus, liposomal systems are stable upon dilution, in contrast to micellar systems or microemulsions [Chung N., Kim TW, Kwon M., Kwon IC, Jeong SY Oil components modulate physical characteristics and function of the natural oil emulsions as drug or gene delivery system. // J. Control. Release 2001, V. 71, p. 339-350]. According to the theory of Deryagin – Landau – Fairway – Overbeck (DLVO), the stability of the system in an electrolyte solution is achieved when the electrostatic repulsion between two charged particles exceeds the absolute value of the van der Waals force. Charged liposomes aggregate more slowly in solutions with low ionic strength [Ulrich A. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. // Bioscience reports 2002, V. 22, p. 129-150], while in solutions with a high concentration of lipids or in the presence of multiply charged ions, such as Ca 2+ , aggregation [Lasic DD Liposomes in Gene Delivery. Boca Raton: CRC Press, 1997, 303 p]. Thus, two main processes affect liposome stability: aggregation and fusion [Riaz M. Review article: stability and uses of liposomes. // Pakistan j pharm sci 1995, V. 8, p. 69-79].
С другой стороны, при хранении липиды могут подвергаться окислению. Липосомы могут храниться замороженными в форме лиофилизованного порошка, однако для предупреждения фазовых переходов и повреждения мембраны необходимо использовать криопротекторы, такие как мочевина. Даже при условии использования криопротекторов каждую новую порцию липосом, полученных из подобного порошка, необходимо изучать для определения размера и морфологии, что делает такой метод хранения удобным только при редком использовании липосом.On the other hand, lipids can undergo oxidation during storage. Liposomes can be stored frozen in the form of lyophilized powder; however, cryoprotectants such as urea must be used to prevent phase transitions and damage to the membrane. Even with the use of cryoprotectants, each new batch of liposomes obtained from such a powder must be studied to determine the size and morphology, which makes this storage method convenient only with rare use of liposomes.
Следует учитывать влияние среды на стабильность липосом. Если in silica и in vitro основными факторами, влияющими на стабильность липосом, являются липидный состав и температура, то в системах in vivo обнаруживается множество факторов, способных также оказывать влияние на стабильность липосом. Так, было показано, что в крови липиды из липосом способны переходить к липопротеинам плазмы. Особенно этот эффект был заметен для липидов с одной углеводородной цепью или содержащих короткие цепи и липосом в жидкокристаллической фазе.The effect of the medium on liposome stability should be considered. While in silica and in vitro the main factors affecting liposome stability are lipid composition and temperature, many factors are found in in vivo systems that can also influence liposome stability. So, it was shown that in blood lipids from liposomes are able to pass to plasma lipoproteins. This effect was especially noticeable for lipids with a single hydrocarbon chain or containing short chains and liposomes in the liquid crystalline phase.
Из уровня техники известен способ стабилизации липосомальных систем на основе так называемых Stealth липосом [Immordino М., Dosio F., Cartel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // Int. J. Nanomed. 2006, V. 1, p. 297-315]. Суть данного подхода заключается в использовании липидов, модифицированных с помощью цепей PEG. Липосомы, содержащие в себе модифицированные липиды, получили название Stealth и хорошо себя зарекомендовали в терапии рака молочной железы и яичников.The prior art method for stabilizing liposome systems based on the so-called Stealth liposomes [Immordino M., Dosio F., Cartel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // Int. J. Nanomed. 2006, V. 1, p. 297-315]. The essence of this approach is the use of lipids modified with PEG chains. Liposomes containing modified lipids are called Stealth and have proven themselves in the treatment of breast and ovarian cancer.
Однако, лекарственные препараты на основе Stealth-липосом, такие как Doxil и Caelyx вызывают в качестве побочного эффекта так называемый hand-foot синдром, проявляющийся в повреждении кожных покровов стоп и ладоней пациентов. Установлено, что причиной hand-foot синдрома являются РЕGилированные липиды [Yokomichi, N., Nagasawa, Т., Coler-Reilly, A., Suzuki, Н., Kubota, Y., Yoshioka, R., Tozawa, A., Suzuki, N., Yamaguchi, Y. Pathogenesis of Hand-Foot Syndrome induced by PEG-modified liposomal Doxorubicin. // Human Cell 2013, V. 26, p. 8-18.]. Более того, из-за гидрофильной поверхности Stealth-липосомы не могут эффективно взаимодействовать с клеточной мембраной. Следует также отметить, что биораспределение Stealth липосом основано только на эффекте пассивного нацеливания.However, drugs based on Stealth liposomes such as Doxil and Caelyx cause, as a side effect, the so-called hand-foot syndrome, which manifests itself in damage to the skin of the feet and hands of patients. It has been established that the cause of the hand-foot syndrome is PEGylated lipids [Yokomichi, N., Nagasawa, T., Coler-Reilly, A., Suzuki, N., Kubota, Y., Yoshioka, R., Tozawa, A., Suzuki , N., Yamaguchi, Y. Pathogenesis of Hand-Foot Syndrome induced by PEG-modified liposomal Doxorubicin. // Human Cell 2013, V. 26, p. 8-18.]. Moreover, due to the hydrophilic surface, Stealth liposomes cannot effectively interact with the cell membrane. It should also be noted that the biodistribution of Stealth liposomes is based only on the effect of passive targeting.
Таким образом, несмотря на повышение времени циркуляции в крови, подход, связанный с использованием РЕGилированных липидов имеет ряд существенных недостатков.Thus, despite the increase in circulation time in the blood, the approach associated with the use of REGylated lipids has a number of significant drawbacks.
Из уровня техники также известен подход, заключающийся в использовании полимерных оболочек для липосом [Watanabe K., Kaneko М., Maitani Y. Functional coating of liposomes using a folate-polymer conjugate to target folate receptors. // Int. J. Nanomed. 2012, V. 7, p. 3679-3688]. Полимерные оболочки привлекают внимание исследователей как перспективные и удобные стабилизирующие добавки, открывающие широкие возможности для модификации поверхности липосом. Полимерные оболочки должны отвечать ряду требований, помимо стабилизации, а именно: эффективное взаимодействие с липосомальной мембраной, биосовместимость, отсутствие иммунного ответа, возможность химической модификации и ковалентной сшивки с адресными метками.The prior art also knows the approach of using polymer shells for liposomes [Watanabe K., Kaneko M., Maitani Y. Functional coating of liposomes using a folate-polymer conjugate to target folate receptors. // Int. J. Nanomed. 2012, V. 7, p. 3679-3688]. Polymeric membranes attract the attention of researchers as promising and convenient stabilizing additives that open up wide possibilities for modifying the surface of liposomes. Polymeric membranes must meet a number of requirements, in addition to stabilization, namely: effective interaction with the liposomal membrane, biocompatibility, lack of an immune response, the possibility of chemical modification and covalent crosslinking with address labels.
Среди исследуемых полимеров встречаются как полимеры синтетические, так и природного происхождения. На протяжении длительного времени исследователи проявляют значительный интерес к хитозану, как к перспективному лиганду для стабилизации липосом.Among the studied polymers, both synthetic and natural polymers are found. For a long time, researchers have shown significant interest in chitosan as a promising ligand for stabilization of liposomes.
Однако широко известно, что хитозан образует гели в нейтральных и щелочных средах [Варламов В.П., Немцев С.В., Тихонов В.Е. Хитин и хитозан: природа, получение и применение. М.: Российское Хитиновское Общество, 2010.]. Поэтому в последнее десятилетие применяются производные хитозана, например [Khameneh В., Momen-nejad М., Tafaghodi М. In vivo evaluation of mucoadhesive properties of nanoliposomal formulations upon coating with trimethylchitosan polymer. // Nanomed. J. 2014, V. 1, p. 147-154]. В работе [Prabaharan M. Review paper: chitosan derivatives as promising materials for controlled drug delivery. // J biomaterials app 2008, V. 23, p. 5-36.] приведен широкий спектр производных хитозана, которые нашли свое применение в системах доставки лекарств, например, N-аминоалкилхитозан, тиолхитозан, сополимеры хитозана с полиакриловой кислотой. В ряде работ предложено получение РЕGилированного хитозана. РЕGилирование позволяет существенно повысить растворимость хитозана. РЕGилирование позволяет получать большое количество различных полимеров для биомедицинского применения с разветвленной архитектурой и варьируемыми свойствами. Следует отметить, что получаемые сополимеры растворимы в широком интервале рН и обладают существенно более низкой вязкостью по сравнению с немодифицированным хитозаном.However, it is widely known that chitosan forms gels in neutral and alkaline media [Varlamov VP, Nemtsev SV, Tikhonov V.E. Chitin and chitosan: nature, preparation and use. M .: Russian Khitinovskoe Society, 2010.]. Therefore, chitosan derivatives have been used in the past decade, for example [Khameneh B., Momennejad M., Tafaghodi M. In vivo evaluation of mucoadhesive properties of nanoliposomal formulations upon coating with trimethylchitosan polymer. // Nanomed. J. 2014, V. 1, p. 147-154]. In [Prabaharan M. Review paper: chitosan derivatives as promising materials for controlled drug delivery. // J biomaterials app 2008, V. 23, p. 5-36.] Shows a wide range of chitosan derivatives that have found their application in drug delivery systems, for example, N-aminoalkylchitosan, thiolchitosan, copolymers of chitosan with polyacrylic acid. In a number of studies, obtaining Regulated chitosan was proposed. REGylation can significantly increase the solubility of chitosan. REGylation allows to obtain a large number of different polymers for biomedical applications with a branched architecture and variable properties. It should be noted that the resulting copolymers are soluble in a wide pH range and have a significantly lower viscosity compared to unmodified chitosan.
Из уровня техники известен способ получения липосомальной суспензии, стабилизированной хитозаном и PEG [CN 102772802 «Chitosan and polyethylene glycol-modified oleanolic acid joint nanoliposomes»]. Однако, простая смесь полимеров не позволяет добиться однородности системы, что важно для биомедицинского применения. Ключевым отличием заявляемого изобретения от данного аналога является наличие ковалентной сшивки PEG с хитозаном, а не использование простой смеси. Ковалентная сшивка позволяет добиться большей однородности системы, что важно для биомедицинского применения.The prior art method for producing a liposome suspension stabilized by chitosan and PEG [CN 102772802 "Chitosan and polyethylene glycol-modified oleanolic acid joint nanoliposomes"]. However, a simple mixture of polymers does not allow achieving uniformity of the system, which is important for biomedical applications. The key difference of the claimed invention from this analogue is the presence of covalent crosslinking of PEG with chitosan, and not the use of a simple mixture. Covalent crosslinking allows for greater system uniformity, which is important for biomedical applications.
Из уровня техники известен способ стабилизация липосомальных систем (US 2011118200 (А1) «А pegylated and fatty acid grafted chitosan olygosaccharide, synthesis method and application for drug delivery systemʺ) за счет комплексообразования с хитозаном, модицированным одновременно PEG и остатком жирной кислоты. Однако, подобный подход может приводить к нарушению структуры бислоя и неконтролируемому высвобождению лекарственного препарата за счет интеграции остатка жирной кислоты в бислой.The prior art method for stabilization of liposomal systems (US 2011118200 (A1) "A pegylated and fatty acid grafted chitosan olygosaccharide, synthesis method and application for drug delivery systemʺ) due to complexation with chitosan, simultaneously modified by PEG and a fatty acid residue. However, such an approach can lead to disruption of the structure of the bilayer and the uncontrolled release of the drug due to the integration of the fatty acid residue into the bilayer.
Метод получения ПЭГ-хитозана описан в патенте CN 103524750 (A) ʺPolyethylene glycol chitosan self-assembled nanoparticlesʺ. Однако, авторами предложен иной, менее эффективный способ синтеза PEG-хитозана. Синтез отличается большим числом стадий и нагреванием реакционной смеси до 60 С. Более того, не обсуждается возможность применения полученного конъюгата для стабилизации липосомA method for producing PEG chitosan is described in CN 103524750 (A) ʺ Polyethylene glycol chitosan self-assembled nanoparticles ʺ. However, the authors proposed a different, less effective method for the synthesis of PEG-chitosan. The synthesis is distinguished by a large number of stages and heating of the reaction mixture to 60 ° C. Moreover, the possibility of using the obtained conjugate to stabilize liposomes is not discussed.
Из уровня техники известны способы синтеза конъюгата хитозана с фолиевой кислотой.The prior art methods for the synthesis of conjugate of chitosan with folic acid.
В патенте CN 103520720 A ʺPreparation method of folic acid coupled carboxymethyl chitosan nanoparticle serving as photo-release NO carrierʺ используется не сам хитозан, а его производное карбоксиметилхитозан. Данный факт усложняет использование изобретения в промышленности. Более того, в синтезе не используется предварительная активация фолиевой кислоты, что уменьшает выход реакции.CN 103520720 A, ʺPreparation method of folic acid coupled carboxymethyl chitosan nanoparticle serving as photo-release NO carrierʺ, does not use chitosan itself, but its carboxymethylchitosan derivative. This fact complicates the use of the invention in industry. Moreover, the preliminary activation of folic acid is not used in the synthesis, which reduces the yield of the reaction.
В патенте ЕР 2706988 А2 ʺLiposomes comprising polymer-conjugated lipids and related usesʺ предлагается ковалентная модификация липида хитозаном и фолиевой кислотой. Подобный подход может привести к нарушению структуры липосомы, вплоть до разрушения.EP 2706988 A2, “Liposomes comprising polymer-conjugated lipids and related uses”, proposes a covalent modification of a lipid by chitosan and folic acid. Such an approach can lead to disruption of the liposome structure, up to destruction.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является решение по патенту RU 2529179. Согласно данному патенту, предложенный средство включает стабилизатор, представляющий собой модифицированный хитозан, который получают путем модификации частиц хитозана, находящихся в эмульсии органический растворитель - вода с рН 6,0-6,5, путем воздействия сначала смесью, состоящей из карбоновой кислоты в органическом растворителе и конденсирующего агента, а затем органическим основанием, при этом в качестве карбоновых кислот используют или пальмитиновую, или стеариновую, или додекановую кислоту, в качестве конденсирующего агента - смесь из гидроксисукцинимида и алифатического карбодиимида или формальдегида и алифатического изоцианида, а в качестве органического основания - триэтиламин. Таким образом, вместо PEG используются остатки жирных кислот.Closest to the claimed invention is the solution according to patent RU 2529179. According to this patent, the proposed tool includes a stabilizer, which is a modified chitosan, which is obtained by modifying the particles of chitosan in the emulsion of an organic solvent - water with a pH of 6.0-6.5, by first exposure to a mixture consisting of a carboxylic acid in an organic solvent and a condensing agent, and then an organic base, with palmitic acid or silt being used as carboxylic acids and stearic or dodecanoic acid, as a condensing agent, a mixture of hydroxysuccinimide and aliphatic carbodiimide or formaldehyde and aliphatic isocyanide, and triethylamine as an organic base. Thus, fatty acid residues are used instead of PEG.
Однако, подобный стабилизатор не придает системе эффект активного нацеливания, способен изменять структурные свойства бислоя за счет взаимодействия жирных остатков стабилизатора и липидов. За счет изменения гидрофобно-гидрофильного баланса может уменьшиться растворимость хитозана, что приводит к образованию неравномерной суспензии и агрегатов. Синтез занимает длительное время и осложнен дополнительной очисткой.However, such a stabilizer does not give the system an active targeting effect, it is able to change the structural properties of the bilayer due to the interaction of the stabilizer fatty residues and lipids. Due to changes in the hydrophobic-hydrophilic balance, the solubility of chitosan may decrease, which leads to the formation of an uneven suspension and aggregates. The synthesis takes a long time and is complicated by additional purification.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей изобретения является создание средства для доставки активного агента, содержащего комплекс липосомальной суспензии с конъюгатом хитозана, и обладающего улучшенными свойствами.The objective of the invention is to provide a means for the delivery of an active agent containing a complex of a liposomal suspension with a conjugate of chitosan, and with improved properties.
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является повышение стабильности липосомальных суспензий за счет эффективного связывания с липосомами. Структура и размер комплекса липосом со стабилизатором остается неизменной, по крайней мере, в течение 30 дней, за счет улучшения электростатического взаимодействия стабилизатора с поверхностью липосом. Кроме того, получаемый стабилизатор легко растворим в нейтральных и щелочных средах, включая физиологические растворы, что обеспечивает однородность получаемых систем. Кроме того, получаемые средства доставки - липосомы, покрытые конъюгатом хитозан - PEG не обнаруживаются ретикуло-эндетелиальной системой, а липосомы, покрытые конъюгатом хитозан - фолиевая кислота, обнаруживают эффект активного нацеливания. При этом упрощается процесс получения стабилизатора, а именно, стабилизатор получают из хитозана через минимальное число стадий, причем значения рН реакционной смеси находится в интервале от 4 до 9, время протекания реакции варьируется от 1 до 4 часов. Очистку производят путем диализа против дистиллированной воды, буферного раствора или хроматографически. Полученный стабилизатор нековалентно связывается с липосомами, образуя комплекс, стабильный в течение не менее 30 дней.The technical result to which the claimed invention is directed is to increase the stability of liposome suspensions due to effective binding to liposomes. The structure and size of the complex of liposomes with a stabilizer remains unchanged for at least 30 days, due to improved electrostatic interaction of the stabilizer with the surface of the liposomes. In addition, the resulting stabilizer is readily soluble in neutral and alkaline environments, including physiological solutions, which ensures the uniformity of the resulting systems. In addition, the resulting delivery vehicles — liposomes coated with chitosan – PEG conjugate are not detected by the reticulo-endethelial system, and liposomes coated with chitosan – folic acid conjugate exhibit an active targeting effect. This simplifies the process of obtaining a stabilizer, namely, the stabilizer is obtained from chitosan through a minimum number of stages, the pH of the reaction mixture being in the range from 4 to 9, the reaction time varies from 1 to 4 hours. Purification is carried out by dialysis against distilled water, a buffer solution, or chromatographically. The stabilizer obtained non-covalently binds to liposomes, forming a complex that is stable for at least 30 days.
Поставленная задача решается тем, что средство для доставки активного агента включает комплекс липосомальной суспензии с конъюгатом хитозана, представляющим собой соединение формулы (C6O4H9NH2)m(C6O4H9NHX)n, где в качестве заместителя по аминогруппе X выступает остаток производного полиэтиленгликоля, представляющего собой монометокси-ПЭГ-сукцинат, хитозан использован с молекулярой массой от 15 до 120 тысяч Дальтон, a m и n - количество звеньев в молекуле, где соотношение m/n составляет от 6 до 19, при этом липосомы связаны с конъюгатом хитозана нековалентно.The problem is solved in that the means for delivering the active agent comprises a complex of a liposomal suspension with a chitosan conjugate, which is a compound of the formula (C 6 O 4 H 9 NH 2 ) m (C 6 O 4 H 9 NHX) n , where amino group X is the remainder of the polyethylene glycol derivative, which is a monomethoxy-PEG succinate, chitosan is used with a molecular weight of 15 to 120 thousand Daltons, am and n are the number of units in the molecule, where the m / n ratio is from 6 to 19, with liposomes linked to chitosan n conjugate covalently.
Кроме того, в липосомальной суспензии основомольное соотношение фосфатных липидов на поверхности липосом к немодицифированным аминогруппам может составлять от 1:0,25 до 1:20.In addition, in a liposomal suspension, the basic ratio of phosphate lipids on the surface of liposomes to unmodified amino groups can be from 1: 0.25 to 1:20.
Стабилизатор для липосомальных суспензий может быть получен посредством смешения раствора, модифицирующего аминогруппу хитозана агента с кислым раствором хитозана и доведение полученной смеси до рН 7,5-8,0. При этом в качестве раствора агента, модифицирующего аминогруппу хитозана (или модифицирующего агента), может быть использован раствор N-гидроксисукцинимидного эфира ПЭГ5000-гемисукцината в диметилформамиде или диметилсульфоксиде, или раствор фолиевой кислоты, предварительно активированной раствором карбодиимида.The stabilizer for liposomal suspensions can be obtained by mixing a solution that modifies the amino group of the chitosan agent with an acidic solution of chitosan and adjusting the resulting mixture to a pH of 7.5-8.0. In this case, as a solution of an agent modifying the amino group of chitosan (or a modifying agent), a solution of PEG5000 hemisuccinate N-hydroxysuccinimide ester in dimethylformamide or dimethyl sulfoxide, or a solution of folic acid pre-activated with a carbodiimide solution can be used.
Наилучший результат достигается при использовании раствора модифицирующего агента в концентрации от 0,08 М до 0,8 М, а также при использовании в качестве карбодиимида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в мольном соотношении 1-1. В кислом растворе хитозан используют с молекулярной массой 15-120 кДа.The best result is achieved when using a solution of modifying agent in a concentration of from 0.08 M to 0.8 M, as well as when using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide as a carbodiimide in a molar ratio of 1-1. In an acidic solution, chitosan is used with a molecular weight of 15-120 kDa.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлена схема синтеза PEG-хитозана, на фиг. 2 представлена схема синтеза конъюгата хитозана с фолиевой кислотой, на фиг. 3 и на фиг. 4 представлены графики стабильности липосомальных суспензий. Позициями на фигуре 3 обозначены: а - смещение полос поглощения νCH2as при хранении свободных липосом, б - липосом в комплексе с хитозаном, в - в комплексе с РЕG-хитозаном-25. Положение соответствующих полос поглощения для свободных липосом в агрегированном состоянии (г). Позициями на фигуре 4 обозначены: а - Смещение полос поглощения νCO при хранении свободных липосом, б - липосом в комплексе с хитозаном, в - в комплексе с РЕG-хитозаном-25. Положение соответствующих полос поглощения для свободных липосом в агрегированном состоянии (г).The invention is illustrated by drawings, where in FIG. 1 shows a synthesis scheme for PEG-chitosan, FIG. 2 shows a synthesis scheme for a conjugate of chitosan with folic acid, FIG. 3 and in FIG. 4 presents graphs of the stability of liposomal suspensions. The positions in figure 3 indicate: a - shift of the absorption bands of νCH 2 as during storage of free liposomes, b - liposomes in complex with chitosan, c - in complex with PEG-chitosan-25. The position of the corresponding absorption bands for free liposomes in the aggregated state (g). The positions in figure 4 indicate: a - Shift of νCO absorption bands during storage of free liposomes, b - liposomes in combination with chitosan, c - in complex with PEG-chitosan-25. The position of the corresponding absorption bands for free liposomes in the aggregated state (g).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Для стабилизации липосомальных суспензий, согласно настоящего изобретения, предложено использование производных хитозана, в качестве которых может выступать конъюгат хитозана формулы (C6O4H9NH2)m(C6O4H9NHX)n, где в качестве заместителя по аминогруппе X выступает ПЭГ или фолиевая кислота, где m и n - количество звеньев в молекуле.To stabilize liposomal suspensions, according to the present invention, the use of chitosan derivatives is proposed, which may be a chitosan conjugate of the formula (C 6 O 4 H 9 NH 2 ) m (C 6 O 4 H 9 NHX) n , where as an amino substituent X stands for PEG or folic acid, where m and n are the number of units in the molecule.
Для разработки стабилизированной липосомальной системы предложено использовать разветвленные сополимеры на основе хитозана, модифицированного полиэтиленгликолем (PEG-хитозан). Синтез сополимеров хитозана проводят с активированным производным PEG, монометокси-PEG-N-гидроксисукцинимидилсукцинатом (mPEG-suc-NHS, М 5 кДа), которое отличается высокой реакционной способностью и в мягких условиях ацилирует аминогруппы биомолекул с высоким выходом.To develop a stable liposomal system, it is proposed to use branched copolymers based on chitosan modified with polyethylene glycol (PEG-chitosan). Chitosan copolymers are synthesized with an activated PEG derivative, monomethoxy-PEG-N-hydroxysuccinimidyl succinate (mPEG-suc-NHS, M 5 kDa), which is highly reactive and under mild conditions acylates the amino groups of biomolecules in high yield.
Преимущества предложенной методики синтеза по сравнению с уже известными - мягкие условия проведения реакции за счет высокой реакционной способности mPEG-suc-NHS и возможность получать сополимеры с широким диапазоном степеней модификации. Следует отметить также методическую простоту получения сополимера без необходимости проведения предварительных стадий длительного синтеза.The advantages of the proposed synthesis procedure compared to the already known ones are the mild reaction conditions due to the high reactivity of mPEG-suc-NHS and the ability to obtain copolymers with a wide range of modification levels. It should also be noted the methodological simplicity of obtaining a copolymer without the need for preliminary stages of long-term synthesis.
Синтез конъюгата хитозан-фолиевая кислота проводили с предварительной активацией карбоксильной группы с помощью N-(3-Диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида. Следует отметить экспрессность данной методики и высокий выход реакции.The synthesis of the chitosan-folic acid conjugate was carried out with the preliminary activation of the carboxyl group using N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide. It should be noted the rapidity of this technique and a high yield of the reaction.
Комплексообразование происходит простым смешением анионных липосом и модифицированного хитозана в основомольном соотношении от 1:0,25 до 1:20, в пересчете на фосфатные группы анионного липида на поверхности липосом и немодифицированные аминогруппы хитозана. Причем насыщение обнаруживается при изначальном основомольном соотношении 1:7. После смешения комплексы в течение получаса инкубируются при температуре 37 С, затем несвязанный полимер отделяют хроматографически или с помощью центрифугирования. Подобный подход выгодно отличается простой и эффективностью.Complexation occurs by simple mixing of anionic liposomes and modified chitosan in a basic ratio of 1: 0.25 to 1:20, calculated on the basis of the phosphate groups of the anionic lipid on the surface of the liposomes and the unmodified amino groups of chitosan. Moreover, saturation is detected at the initial base-grinding ratio of 1: 7. After mixing, the complexes are incubated for half an hour at a temperature of 37 ° C, then the unbound polymer is separated chromatographically or by centrifugation. This approach compares favorably with simple and efficient.
Структура получаемых комплексов определяется с помощью метода ИК-спектрокопии Фурье и метода динамического светорассеяния. По смещению основных полос поглощения на ИК-спектре делается вывод о состоянии и микроокружении основных функциональных группы липидов: карбонильных, фосфатных групп в полярной головной части и метиленовых групп в жирном хвосте. Изменения в области поглощения карбонильной и фосфатной групп могут свидетельствовать о электростатическом взаимодействии с лигандом, изменения в области поглощения метиленовых групп указывают на существенные изменения в укладке жирных хвостов в бислое, возможное изменение фазового состояния липосом.The structure of the resulting complexes is determined using the method of infrared spectroscopy Fourier and the method of dynamic light scattering. Based on the shift of the main absorption bands in the IR spectrum, a conclusion is drawn about the state and microenvironment of the main functional groups of lipids: carbonyl, phosphate groups in the polar head and methylene groups in the fat tail. Changes in the absorption region of the carbonyl and phosphate groups may indicate electrostatic interaction with the ligand, changes in the absorption region of methylene groups indicate significant changes in the placement of fatty tails in a bilayer, and a possible change in the phase state of liposomes.
Увеличение размера везикул после добавления полимера указывает на образование комплекса липосома - конъюгат хитозана. Данные о изменении ζ - потенциала поверхности везикул также могут свидетельствовать об образовании комплекса. Данные методы вкупе с результатами анализа ИК-спектров позволяют судить о структуре и стабильности липосомальных систем во времени.An increase in the size of the vesicles after addition of the polymer indicates the formation of a complex of liposome – chitosan conjugate. Data on a change in the ζ - surface potential of the vesicles can also indicate the formation of a complex. These methods, together with the results of the analysis of IR spectra, allow us to judge the structure and stability of liposomal systems over time.
Примеры осуществленияExamples of implementation
Синтез сополимеров PEG-хитозан. Хитозан растворяли в 3% уксусной кислоте при интенсивном перемешивании. После получения прозрачного раствора его рН доводили до 6.5 добавлением 5 мМ натрий-фосфатного буфера; финальная концентрация хитозана составила 3 мг/мл. В него по каплям при перемешивании вводили 5-20-кратный молярный избыток раствора mPEG-suc-NHS (М 5 кДа) в ДМСО в пересчете на моль дезацилированных аминогрупп хитозана, при этом рН раствора доводили до рН 7.5 натрий-фосфатным буфером. Смесь интенсивно перемешивали в течение 1-4 ч. Очистку производили путем диализа против буферного раствора. Полноту очистки контролировали ИК- и УФ-спектроскопией.Synthesis of copolymers of PEG-chitosan. Chitosan was dissolved in 3% acetic acid with vigorous stirring. After obtaining a clear solution, its pH was adjusted to 6.5 by the addition of 5 mM sodium phosphate buffer; the final concentration of chitosan was 3 mg / ml. Under stirring, a 5-20-fold molar excess of a solution of mPEG-suc-NHS (M 5 kDa) in DMSO in terms of a mole of deacylated amino groups of chitosan was added dropwise with stirring, while the pH of the solution was adjusted to pH 7.5 with sodium phosphate buffer. The mixture was vigorously stirred for 1-4 hours. Purification was performed by dialysis against a buffer solution. The completeness of purification was controlled by IR and UV spectroscopy.
Синтез конъюгата Хитозан-Фолиевая кислота. 10 мг хитозана 90-120 кДа растворяли в 2 мл 0,2 М ацетатного буфера с рН 4,5 в течение часа при перемешивании. 5 мг фолиевой кислоты и 2 мг N-(3-диметеиламинопропил)-N'-этилкарбодимиид гидрохлорида растворяли в 2 мл ДМСО в темноте. Растворы объединяли, полученную реакционную смесь перемешивали в течение 15 часов при комнатной температуре в темноте. В реакционную смесь вводили 0,7 мл буфера PBS, 0,3 мл NaOH 0,2 М до рН 9. Раствор очищали диализом против дистиллированной воды в течение суток, против раствора PBS в течение 2 суток. Итоговая концентрация составила 3 мг\мл.Synthesis of Chitosan-Folic Acid Conjugate. 10 mg of chitosan 90-120 kDa was dissolved in 2 ml of 0.2 M acetate buffer with a pH of 4.5 for one hour with stirring. 5 mg of folic acid and 2 mg of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride were dissolved in 2 ml of DMSO in the dark. The solutions were combined, the resulting reaction mixture was stirred for 15 hours at room temperature in the dark. 0.7 ml of PBS buffer, 0.3 ml of NaOH 0.2 M to pH 9 was added to the reaction mixture. The solution was purified by dialysis against distilled water for a day, against a PBS solution for 2 days. The final concentration was 3 mg / ml.
Приготовление комплексов липосом с хитозаном, PEG-хитозаном, хитозан-фолиевой кислотой. К раствору требуемых липосом в боратном буфере, рН 9.0, (5 мг/мл) добавляли по каплям при перемешивании раствор полимера в 5 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7.0-7.5 в соотношении липосомы - полимер от 1:0,25 до 1:20 основомоль. После смешения комплексы в течение часа инкубируются при температуре 37 С, затем несвязанный полимер отделяют хроматографически или с помощью центрифугирования.Preparation of complexes of liposomes with chitosan, PEG-chitosan, chitosan-folic acid. To a solution of the required liposomes in borate buffer, pH 9.0, (5 mg / ml) was added dropwise with stirring a polymer solution in 5 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0-7.5 in the ratio of liposome-polymer from 1: 0.25 to 1: 20 groundwater. After mixing, the complexes are incubated for one hour at 37 ° C, then the unbound polymer is separated by chromatography or centrifugation.
ИсследованиеStudy
Синтез и характеризация PEG-хитозанаSynthesis and characterization of PEG chitosan
Для разработки стабилизированной липосомальной системы в представленной работе предложено использовать разветвленные сополимеры на основе хитозана, модифицированного полиэтиленгликолем (PEG-хитозан). Был проведен синтез сополимеров хитозана (М 90-100 кДа и 5 кДа) с активированным производным PEG, монометокси-PEG-N-гидроксисукцинимидилсукцинатом (mPEG-suc-NHS, М 5 кДа), которое отличается высокой реакционной способностью и в мягких условиях ацилирует аминогруппы биомолекул с высоким выходом.To develop a stable liposomal system, it is proposed in the present work to use branched copolymers based on chitosan modified with polyethylene glycol (PEG-chitosan). A synthesis of copolymers of chitosan (M 90-100 kDa and 5 kDa) with an activated derivative of PEG, monomethoxy-PEG-N-hydroxysuccinimidyl succinate (mPEG-suc-NHS, M 5 kDa), which is highly reactive and acylates amino groups under mild conditions, was carried out high yield biomolecules.
Преимущества предложенной методики синтеза по сравнению с уже известными - мягкие условия проведения реакции за счет высокой реакционной способности mPEG-suc-NHS и возможность получать сополимеры с широким диапазоном степеней модификации. Следует отметить также методическую простоту получения сополимера без необходимости проведения предварительных стадий длительного синтеза.The advantages of the proposed synthesis procedure compared to the already known ones are the mild reaction conditions due to the high reactivity of mPEG-suc-NHS and the ability to obtain copolymers with a wide range of modification levels. It should also be noted the methodological simplicity of obtaining a copolymer without the need for preliminary stages of long-term synthesis.
Следует ожидать, что свойства сополимеров PEG-хитозан будут существенным образом зависеть от их состава и структуры. Так, при повышении содержания PEG-цепей в сополимере, с одной стороны, повышается растворимость продукта, а с другой стороны - уменьшается число свободных аминогрупп хитозана, доступных для электростатического взаимодействия с фосфолипидами липосом. Для выбора сополимера с оптимальным стабилизирующими свойствами в отношении липосом, мы синтезировали образцы PEG-хитозана с различным содержанием PEG-цепей (фигура 1)It should be expected that the properties of PEG-chitosan copolymers will substantially depend on their composition and structure. Thus, with an increase in the content of PEG chains in the copolymer, on the one hand, the solubility of the product increases, and on the other hand, the number of free amino groups of chitosan available for electrostatic interaction with liposome phospholipids decreases. To select a copolymer with optimal stabilizing properties against liposomes, we synthesized PEG chitosan samples with different contents of PEG chains (Figure 1)
Для характеристики полученных сополимеров использовали ИК-спектроскопию Фурье (FTIR). Метод позволяет определять содержание характеристических функциональных групп в структуре изучаемых молекул и, соответственно, степень модификации биополимеров.To characterize the resulting copolymers, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was used. The method allows you to determine the content of characteristic functional groups in the structure of the studied molecules and, accordingly, the degree of modification of biopolymers.
Из анализа ИК-спектра PEG-хитозана следует, что в результате модификации хитозана активированным производным PEG (mPEG-suc-NHS) наблюдается появление высокоинтенсивной полосы поглощения при 1089 см-1, которая соответствует валентным колебаниям С-О-С-связи и является основной характеристической полосой поглощения молекулы PEG. Следует отметить, что полоса поглощения хитозана в области 1200-950 см-1 существенно менее интенсивна по сравнению с полосой поглощения С-О-С-связи в PEG и вносит лишь незначительный вклад в общую интенсивность поглощения при 1089 см-1 в PEG-хитозане. Наблюдаемое увеличение интенсивности данной полосы в спектре PEG-хитозана по сравнению с исходным хитозаном подтверждает прошедшую модификацию.From an analysis of the IR spectrum of PEG chitosan, it follows that as a result of the modification of chitosan with an activated PEG derivative (mPEG-suc-NHS), a high-intensity absorption band appears at 1089 cm -1 , which corresponds to stretching vibrations of the C-O-C bond and is the main the characteristic absorption band of the PEG molecule. It should be noted that the absorption band of chitosan in the region of 1200–950 cm –1 is substantially less intense than the absorption band of the С – О – С bond in PEG and makes only a small contribution to the total absorption intensity at 1089 cm – 1 in PEG chitosan . The observed increase in the intensity of this band in the spectrum of PEG chitosan compared to the initial chitosan confirms the past modification.
Степени РЕGилирования синтезированных в работе сополимеров были определены как 5, 15 и 25% по отношению к исходному числу дезацилированных аминогрупп в хитозане (соответственно, РЕG-хитозан-5, -15, -25), что соответствует 25(±2), 40(±5) и 60(±5) остатков молекулы PEG-5000 на каждую молекулу хитозана М 90-100 кДа.The degrees of REGylation of the copolymers synthesized in the work were determined as 5, 15, and 25% with respect to the initial number of deacylated amino groups in chitosan (respectively, REG-chitosan-5, -15, -25), which corresponds to 25 (± 2), 40 ( ± 5) and 60 (± 5) residues of the PEG-5000 molecule for each chitosan M molecule of 90-100 kDa.
Для контроля полученных результатов независимым методом было проведено титрование свободных аминогрупп хитозана в препаратах сополимеров с использованием TNBS. Степень модификации, определенная данным методом составила 18±3, 45±5 и 57±5 остатков PEG-5000 в пересчете на молекулу хитозана, что показывает хорошую сходимость результатов, полученных двумя методами.To control the results obtained, an independent method was used to titrate the free amino groups of chitosan in copolymer preparations using TNBS. The degree of modification determined by this method was 18 ± 3, 45 ± 5, and 57 ± 5 PEG-5000 residues in terms of the chitosan molecule, which shows good convergence of the results obtained by the two methods.
Синтез и характеризация конъюгата хитозан-фолиевая кислота.Synthesis and characterization of conjugate chitosan-folic acid.
Синтез конъюгата хитозан-фолиевая кислота проводили с предварительной активацией карбоксильной группы с помощью N-(3-Диметиламинопропил)-]-N'-этилкарбодиимида. Следует отметить экспрессность данной методики и высокий выход реакции. Схема синтеза приведена на фигуре 2.The synthesis of the chitosan-folic acid conjugate was carried out with the preliminary activation of the carboxyl group using N- (3-Dimethylaminopropyl) -] - N'-ethylcarbodiimide. It should be noted the rapidity of this technique and a high yield of the reaction. The synthesis scheme is shown in figure 2.
Степень модификации определяли спектрофотометрически по поглощению А217. На спектре выделяется ряд выраженных пиков: 360 нм, 280 нм, 253 нм и 217 нм. Для аналитических целей выбрали полосу поглощения 217 нм, как наиболее интенсивную и узкую.The degree of modification was determined spectrophotometrically by the absorption of A 217 . A number of pronounced peaks stand out on the spectrum: 360 nm, 280 nm, 253 nm and 217 nm. For analytical purposes, an absorption band of 217 nm was chosen as the most intense and narrowest.
В независимом эксперименте получали калибровочную кривую зависимости оптической плотности раствора А217 фолиевой кислоты от концентрации. По полученной калибровочной кривой степень модификации конъюгата хитозан-фолиевая кислота была определена как 15%.In an independent experiment, a calibration curve was obtained that shows the concentration dependence of the optical density of folic acid solution A 217 . According to the obtained calibration curve, the degree of modification of the chitosan-folic acid conjugate was determined as 15%.
Анализ структуры и свойств комплексов липосом с конъюгатами хитозанаAnalysis of the structure and properties of liposome complexes with chitosan conjugates
Из анализа ИК-спектров следует, что образование комплексов между липосомами и конъюгатами хитозана, как и с немодифицированным хитозаном, приводит к смещению основных полос поглощения липосом, а именно, полос поглощения ацильных цепей, а также карбонильной и фосфатной групп липидов.From the analysis of IR spectra, it follows that the formation of complexes between liposomes and chitosan conjugates, as with unmodified chitosan, leads to a shift in the main absorption bands of liposomes, namely, absorption bands of acyl chains, as well as carbonyl and phosphate groups of lipids.
Обнаружено, что в области поглощения ацильных цепей липосом (3000-2800 см-1) при образовании комплекса липосом с сополимером РЕG-хитозан-25 наблюдался существенный сдвиг полос поглощения в область меньших волновых чисел (рис. 24а). Так, для свободных липосом полосы поглощения νCH2as и νCH2s расположены соответственно при 2920 см-1 и 2851 см-1, тогда как в комплексе с PEG-хитозаном соответствующие частоты составили 2917 и 2849 см-1. Отметим, что наблюдаемые различия являются статистически значимыми, так как точность определения частот валентных колебаний липосом, соответствующих симметричным и асимметричным валентным колебаниям СН2-групп νCH2as и νCH2s), составляет не более 1 см-1. Комплексообразование с немодифицированным хитозаном также приводит к низкочастотным сдвигам полос поглощения νCH2as и νCH2s в спектре липосом. Но наблюдаемые сдвиги менее существенны: полосы поглощения для комплекса липосом с хитозаном расположены соответственно на 2919 см-1 и 2850 см-1.It was found that, in the region of absorption of the acyl chains of liposomes (3000–2800 cm –1 ), a significant shift of the absorption bands to the region of lower wave numbers was observed upon the formation of a complex of liposomes with the PEG-chitosan-25 copolymer (Fig. 24a). So, for free liposomes, the absorption bands of νCH 2 as and νCH 2 s are located at 2920 cm -1 and 2851 cm -1 , respectively, while in the complex with PEG chitosan, the corresponding frequencies were 2917 and 2849 cm -1 . Note that the observed differences are statistically significant, since the accuracy of determining the frequencies of stretching vibrations of liposomes corresponding to symmetric and asymmetric stretching vibrations of CH 2 groups νCH 2 as and νCH 2 s) is not more than 1 cm -1 . Complexation with unmodified chitosan also leads to low-frequency shifts of the absorption bands of νCH 2 as and νCH 2 s in the liposome spectrum. But the observed shifts are less significant: the absorption bands for the liposome complex with chitosan are located at 2919 cm -1 and 2850 cm -1, respectively.
Низкочастотные сдвиги полос поглощения в гидрофобной области соответствуют о снижении подвижности ацильных цепей в липосомах. По-видимому, образование комплексов с хитозаном и его сополимерами приводит к ограничению подвижности ацильных цепей в структуре бислоя.Low-frequency shifts of the absorption bands in the hydrophobic region correspond to a decrease in the mobility of acyl chains in liposomes. Apparently, the formation of complexes with chitosan and its copolymers leads to a limitation of the mobility of acyl chains in the structure of the bilayer.
На основе анализа величин наблюдаемых низкочастотных сдвигов полос поглощения ацильных цепей в ИК-спектре липосом можно заключить, что в случае сополимера PEG-хитозан взаимодействие с липосомами более эффективно сравнительно со случаем свободного аминополисахарида. Данный результат является несколько неожиданным ввиду того, что PEG-хитозан имеет меньше свободных аминогрупп, способных взаимодействовать с анионными группами липосом. Для выяснения молекулярных причин наблюдаемых эффектов нами было изучено влияние хитозана и PEG-хитозана на потенциальные сайты связывания липидов с аминогруппами (анионными группами липидов).Based on the analysis of the observed low-frequency shifts of the absorption bands of the acyl chains in the IR spectrum of liposomes, it can be concluded that in the case of the PEG-chitosan copolymer, the interaction with liposomes is more effective compared to the case of free aminopolysaccharide. This result is somewhat unexpected in view of the fact that PEG-chitosan has fewer free amino groups capable of interacting with the anionic groups of liposomes. To elucidate the molecular causes of the observed effects, we studied the effect of chitosan and PEG-chitosan on potential binding sites of lipids with amino groups (anionic groups of lipids).
Необходимо отметить, что конъюгат хитозана с фолиевой кислотой не влияет на состояние ацильных цепей.It should be noted that the conjugate of chitosan with folic acid does not affect the state of the acyl chains.
Влияние хитозана и его производных на положение полосы поглощения фосфатной группы в ИК-спектре липидов.The effect of chitosan and its derivatives on the position of the absorption band of the phosphate group in the IR spectrum of lipids.
Основным потенциальным сайтом связывания анионных липосом (DPPC/CL) с аминополисахаридами (хитозаном и его производными) по электростатическому механизму являются фосфатные группы кардиолипина. Действительно, нами было обнаружено, что наиболее существенные смещения полос поглощения при образовании комплексов наблюдаются для фосфатных групп липосом. Полоса поглощения фосфатной группы в свободных липосомах расположена при 1225 см-1, что соответствует высокой степени ее гидратации. Взаимодействие с хитозаном, конъюгатом хитозан с фолиевой кислотой и PEG-хитозаном приводит к значительному смещению полосы поглощения в высокочастотную область к 1244, 1258, 1263 см-1, соответственно.The main potential binding site of anionic liposomes (DPPC / CL) with aminopolysaccharides (chitosan and its derivatives) by the electrostatic mechanism are phosphate groups of cardiolipin. Indeed, we have found that the most significant shifts of the absorption bands during the formation of complexes are observed for phosphate groups of liposomes. The absorption band of the phosphate group in free liposomes is located at 1225 cm -1 , which corresponds to a high degree of hydration. Interaction with chitosan, a conjugate of chitosan with folic acid and PEG-chitosan leads to a significant shift of the absorption band to the high-frequency region to 1244, 1258, 1263 cm -1 , respectively.
Заметим, что в максимально высушенных пленках липосом данная полоса расположена на 1265 см-1. Это означает, что взаимодействие с полимерными лигандами приводит к дегидратации фосфатных групп, и в случае взаимодействия с PEG-хитозаном состояние гидратации липосом приближается к состоянию в высушенной пленке. По-видимому, это связано с разрывом большей части водородных связей фосфатной группы за счет образования электростатических связей с полимерами.Note that in the most dried liposome films, this band is located at 1265 cm -1 . This means that the interaction with polymer ligands leads to dehydration of phosphate groups, and in the case of interaction with PEG-chitosan, the state of hydration of liposomes approaches the state in the dried film. Apparently, this is due to the breakdown of most of the hydrogen bonds of the phosphate group due to the formation of electrostatic bonds with polymers.
Таким образом, фосфатные группы кардиолипина выступают основными сайтами связывания как в случае хитозана, так и в случае его конъюгатов. При этом наиболее существенное смещение полосы поглощения наблюдается в случае комплекса с конъюгатами хитозана. Это указывает, что в случае комплексообразования с конъюгатами хитозана реализуется более эффективное электростатическое взаимодействие между фосфатными группами липосом и полимером по сравнению с немодифицированным хитозаном.Thus, the phosphate groups of cardiolipin act as the main binding sites both in the case of chitosan and in the case of its conjugates. The most significant shift of the absorption band is observed in the case of a complex with chitosan conjugates. This indicates that in the case of complexation with chitosan conjugates, a more effective electrostatic interaction between the phosphate groups of liposomes and the polymer is realized in comparison with unmodified chitosan.
Влияние хитозана и его производных на положение полосы поглощения карбонильной группы в ИК-спектре липидов.The effect of chitosan and its derivatives on the position of the absorption band of the carbonyl group in the IR spectrum of lipids.
Другим потенциальным сайтом связывания производных хитозана с липосомами является карбонильная группа, несущая частично отрицательный заряд на кислороде. Обнаружено, что образование комплекса как с немодифицированным хитозаном, так и с конъюгатами приводит к существенным изменениям в области поглощения карбонильной групп. В исследуемых липосомах полоса поглощения карбонильной группы расположена при 1739 см-1. Известно, что полоса поглощения карбонильной группы в липосомах является чувствительной к степени гидратации на поверхности раздела фаз липид-вода. Так, из независимого эксперимента было установлено, что при максимальной гидратации липосом полоса поглощения карбонильной группы наблюдается при 1725 см-1. В максимально обезвоженных липосомах (в высушенной пленке) полоса поглощения карбонильной группы смещается в сторону 
Нами было найдено, что взаимодействие липосом с PEG-хитозаном и конъюгатом хитозан-фолиевая кислота приводит к заметному сдвигу полосы поглощения в область
Следует отметить, что взаимодействие с хитозаном, в отличие от его конъюгатов, приводит к низкочастотному сдвигу полосы поглощения от 1740 к 1735 см-1, что соответствует повышению степени гидратации карбонильных групп липидов. Можно также отметить, что рассматриваемая полоса в случае комплексов липосом с хитозаном, а также свободных липосом включает в себя несколько компонентов, соответствующих различному состоянию карбоксильных групп. Для более детального анализа данной полосы поглощения было проведено разложение пика на компоненты. Для определения позиций индивидуальных компонентов в составе полосы поглощения С=O-групп использовали метод второй производной.It should be noted that the interaction with chitosan, in contrast to its conjugates, leads to a low-frequency shift of the absorption band from 1740 to 1735 cm -1 , which corresponds to an increase in the degree of hydration of lipid carbonyl groups. It can also be noted that the considered band in the case of complexes of liposomes with chitosan, as well as free liposomes, includes several components corresponding to different states of carboxyl groups. For a more detailed analysis of this absorption band, the peak was decomposed into components. To determine the positions of individual components in the absorption band of C = O groups, the second derivative method was used.
Анализ интегральных интенсивностей индивидуальных компонентов показывает, что в случае свободных липосом полоса карбонильной группы раскладывается на два компонента (1742-1 и 1730 см-1), вклады которых составляют соответственно 56% и 44%. В результате взаимодействия с хитозаном происходит изменение в распределении карбонильных групп по степеням гидратации в сторону возрастания доли низкочастотных компонентов: вклад полосы при 1718 см-1, соответствующей высокогидрагированным С=O-группам, составляет 26%, а также наблюдается появление компонента при 1730 см-1, доля которого составляет 45%. При этом происходит уменьшение доли высокочастотного компонента (1742 см-1) от 81 до 28% по сравнению со свободными липосомами (1739 см-1). Следует отметить, что в случае конъюгатов хитозана полоса карбонильной группы удовлетворительно описывается одним компонентом, соответствующим низкогидратированному состоянию С=O групп (1744 см-1). Данный результат указывает на однородность комплексов липосом с PEG-хитозаном в отличие от комплексов с хитозаном.An analysis of the integrated intensities of the individual components shows that in the case of free liposomes, the band of the carbonyl group is decomposed into two components (1742 -1 and 1730 cm -1 ), the contributions of which are 56% and 44%, respectively. As a result of interaction with chitosan, there is a change in the distribution of carbonyl groups over the degrees of hydration towards an increase in the fraction of low-frequency components: the contribution of the band at 1718 cm -1 , corresponding to highly hydrogenated C = O groups, is 26%, and the appearance of the component at 1730 cm is also observed - 1 , whose share is 45%. Thus there is a decrease in the proportion of high-frequency component (1742 cm -1) from 81 to 28% compared with the free liposomes (1739 cm -1). It should be noted that in the case of chitosan conjugates, the band of the carbonyl group is satisfactorily described by one component corresponding to the low hydrated state of C = O groups (1744 cm -1 ). This result indicates the homogeneity of liposome complexes with PEG-chitosan in contrast to complexes with chitosan.
По-видимому, структура и равновесное состояние комплекса липосом с немодифицированным хитозаном отличается от структуры комплекса с конъюгатами хитозана. Последние комплексы характеризуется более высокой подвижностью цепей полимера, что проявляется, в частности, в резком уменьшении вязкости раствора при модификации хитозана. Это приводит к более эффективному электростатическому многоточечному взаимодействию между карбонильными группами и аминогруппами конъюгата, основная масса зарядов на полиэлектролите становится компенсированной, в результате чего наблюдается снижение степени гидратации С=O-группы. В случае комплексов с немодифицированным хитозаном эффективного многоточечного электростатического взаимодействия с карбонильными группами липосом, по-видимому, не происходит: за счет низкой подвижности цепей хитозан образует неравновесные комплексы с большим числом петель и большая часть зарядов нескомпенсирована, что обуславливает высокую степень гидратации вблизи поверхности липосом.Apparently, the structure and equilibrium state of the complex of liposomes with unmodified chitosan differs from the structure of the complex with chitosan conjugates. The latter complexes are characterized by higher mobility of the polymer chains, which is manifested, in particular, in a sharp decrease in the viscosity of the solution upon modification of chitosan. This leads to a more efficient electrostatic multipoint interaction between the carbonyl groups and the amino groups of the conjugate; the bulk of the charges on the polyelectrolyte become compensated, as a result of which a decrease in the degree of hydration of the C = O group is observed. In the case of complexes with unmodified chitosan, an effective multipoint electrostatic interaction with the carbonyl groups of liposomes does not seem to occur: due to the low mobility of the chains, chitosan forms nonequilibrium complexes with a large number of loops and most of the charges are uncompensated, which leads to a high degree of hydration near the surface of the liposomes.
Таким образом, взаимодействие липосом с хитозаном и его производными влияет на состояние гидратации электростатических сайтов связывания в липосомах - фосфатных и карбонильных групп, - за счет взаимодействия с дезацилированными аминогруппами хитозана. Важно, что связывание липидной мембраны с конъюгатами хитоазан происходит более эффективно, чем с немодифицированным хитозаном.Thus, the interaction of liposomes with chitosan and its derivatives affects the state of hydration of electrostatic binding sites in liposomes - phosphate and carbonyl groups - due to interaction with deacylated amino groups of chitosan. It is important that the binding of the lipid membrane to chitosan conjugates is more effective than with unmodified chitosan.
Для установления молекулярных деталей взаимодействия хитозана и его конъюгатов с липосомами была изучена роль электростатических и адсорбционных взаимодействий в комплексообразовании, а также исследованы структурные особенности полученных комплексов.To establish the molecular details of the interaction of chitosan and its conjugates with liposomes, the role of electrostatic and adsorption interactions in complex formation was studied, and the structural features of the resulting complexes were studied.
Механизм взаимодействия лиганда с липосомами.The mechanism of interaction of the ligand with liposomes.
Выше было высказано предположение, что основными сайтами связывания полимера на липосомах являются карбонильные и фосфатные группы, которые способны электростатически взаимодействовать с аминогруппами хитозана и его конъюгатов. Нельзя также исключать вклад неспецифической адсорбции в данное взаимодействие.It was suggested above that the main polymer binding sites on liposomes are carbonyl and phosphate groups, which are able to electrostatically interact with the amino groups of chitosan and its conjugates. The contribution of nonspecific adsorption to this interaction cannot also be ruled out.
Если основной вклад вносят электростатические взаимодействия, то данные комплексы будут неустойчивы при увеличении ионной силы. Напротив, если основную роль играет адсорбция, можно полагать, что комплексы будут стабильны и в растворах с высокой ионной силой. Для выяснения роли электростатического взаимодействия методом ИК-спектроскопии было изучено, как изменяется состояние функциональных групп липидов, ответственных за электростатические взаимодействия с аминополисахаридами, в растворах с высокой ионной силой.If the main contribution is made by electrostatic interactions, then these complexes will be unstable with increasing ionic strength. On the contrary, if adsorption plays the main role, it can be assumed that the complexes will be stable in solutions with high ionic strength. To clarify the role of electrostatic interaction by IR spectroscopy, we studied how the state of the functional groups of lipids responsible for electrostatic interactions with aminopolysaccharides in solutions with high ionic strength changes.
Было установлено, что в присутствии хитозана или его конъюгатов в условиях ослабленного электростатического взаимодействия (I=0.2 М) полосы поглощения карбонильной и фосфатной группы в липосомах не претерпели никаких изменений по сравнению с исходным состоянием липосом при низкой ионной силе. Более того, существенных изменений не претерпела и область спектра, соответствующая поглощению ацильных цепей. Полученные данные указывают на то, что обсуждаемые выше сдвиги полос поглощения при взаимодействии бислоя с хитозаном и его производными в растворах со слабой ионной силой вызваны именно электростатическими взаимодействиями.It was found that in the presence of chitosan or its conjugates under conditions of weakened electrostatic interaction (I = 0.2 M), the absorption bands of the carbonyl and phosphate groups in liposomes did not undergo any changes compared to the initial state of liposomes at low ionic strength. Moreover, the spectral region corresponding to the absorption of acyl chains did not change significantly. The data obtained indicate that the shifts of the absorption bands discussed above during the interaction of a bilayer with chitosan and its derivatives in solutions with weak ionic strength are caused precisely by electrostatic interactions.
Для выяснения роли адсорбционных взаимодействий в образовании комплексов нами было исследовано, взаимодействуют ли полимеры с липосомами в растворах с высокой ионной силой. Для этого влияние комплексообразования с хитозаном и его конъюгатами на размеры липосом при низкой и высокой ионной силе было изучено методом динамического светорассеяния.To clarify the role of adsorption interactions in the formation of complexes, we investigated whether polymers interact with liposomes in solutions with high ionic strength. For this, the effect of complexation with chitosan and its conjugates on the size of liposomes at low and high ionic strengths was studied by dynamic light scattering.
Определение размеров частиц в липосомальных препаратах методом динамического светорассеяния (DLS).Determination of particle sizes in liposome preparations by dynamic light scattering (DLS).
Метод DLS позволяет оценить толщину слоя, образуемого полимером на поверхности липосом, исходя из полученных значений радиусов свободных липосом и липосом в комплексе с полимером. Обнаружено, что радиус несвязанных в комплекс липосом при низкой ионной силе составляет 60±2 нм. Комплексообразование с PEG-хитозаном и конъюгатом хитозана с фолиевой кислотой приводит к увеличению размера частиц до 85±4 и 120±6 нм.The DLS method allows one to estimate the thickness of the layer formed by the polymer on the surface of liposomes based on the obtained radii of free liposomes and liposomes in combination with the polymer. It was found that the radius of liposomes not connected into a complex at low ionic strength is 60 ± 2 nm. Complexation with PEG-chitosan and conjugate of chitosan with folic acid leads to an increase in particle size to 85 ± 4 and 120 ± 6 nm.
Нами было обнаружено, что конъюгаты хитозана способны взаимодействовать с липосомами как при низкой, так и при высокой ионной силе - за счет неспецифической адсорбции, так как размер частиц достоверно превышает таковой, определенный для свободных липосом в тех же условиях. Так, включение в систему PEG-хитозана при ионной силе 0.2 М приводит к увеличению радиуса липосом с 64±2 нм до 72±2 нм. Прирост размера липосом при высокой ионной силе составляет 8±2 нм, что, хотя и существенно ниже прироста, наблюдаемого при низкой ионной силе, является значимой величиной, так как заметно превышает ошибку измерения. Таким образом, неспецифическая адсорбция вносит вклад в образование и стабилизацию комплекса липосом с конъюгатами хитозана.We found that chitosan conjugates are able to interact with liposomes at both low and high ionic strength due to non-specific adsorption, since the particle size significantly exceeds that determined for free liposomes under the same conditions. Thus, the inclusion of PEG chitosan in the system at an ionic strength of 0.2 M leads to an increase in the radius of liposomes from 64 ± 2 nm to 72 ± 2 nm. The increase in the size of liposomes at high ionic strength is 8 ± 2 nm, which, although significantly lower than the increase observed at low ionic strength, is significant, since it significantly exceeds the measurement error. Thus, nonspecific adsorption contributes to the formation and stabilization of the complex of liposomes with chitosan conjugates.
Влияние комплексообразования с конъюгатами хитозана на фазовый переход липосом.The effect of complexation with chitosan conjugates on the liposome phase transition.
Для разработки стабилизированных липосомальных систем медицинского назначения важно, чтобы получаемые комплексы были устойчивы при температуре человеческого тела. Еще более важным явялется тот факт, что в интервале фазового перехода происходит высвобождение лекарственного средства. Таким образом, сами комплексы должны были устойчивыми, но претерпевать фазовый переход в области физиологических температур. Отдельно стоит отметить, что важным является определение условий оптимального образования комплексов.For the development of stabilized liposomal medical systems, it is important that the resulting complexes are stable at human body temperature. Even more important is the fact that in the interval of the phase transition there is a release of the drug. Thus, the complexes themselves should have been stable, but undergo a phase transition in the range of physiological temperatures. It should be noted separately that it is important to determine the conditions for the optimal formation of complexes.
Было обнаружено, что комплексообразование с производными хитозана приводит к повышению температуры фазового перехода липосом до 38 С. Напротив, нагрев комплексов липосом с хитозаном до температуры человеческого тела приводил к образованию неравновесных систем.It was found that complexation with chitosan derivatives leads to an increase in the temperature of the phase transition of liposomes to 38 ° C. On the contrary, heating of liposome complexes with chitosan to human body temperature led to the formation of nonequilibrium systems.
Влияние комплексообразования с конъюгатами хитозана на стабильность липосом.The effect of complexation with chitosan conjugates on liposome stability.
Как уже обсуждалось выше, липосомы недостаточно стабильны при хранении, склонны к образованию дефектов в бислое, к агрегации и окислению, что ограничивает их применение в медицине в качестве носителя для доставки лекарственных средств. Как было продемонстрировано выше, липосомы образуют прочные комплексы с аминополисахаридами в широком интервале значений ионной силы. Мы предположили, что применение PEG-хитозана может существенно повысить стабильность липосом при хранении и предотвратить их агрегацию за счет электростатического отталкивания полимерных цепей связанного с липосомами полиэлектролита. В качестве критерия стабильности использовали величину частот асимметричных валентных колебаний связи С-Н (νCH2as) как «сенсор» состояния гидрофобной части бислоя, а также величину частот валентных колебаний связи С=O карбонильной группы липидов, микроокружение которых существенным образом изменяется при нарушении структурной целостности липосом. Известно, что данные полосы весьма чувствительны также к состоянию агрегации и окислению липосом. В качестве предельного агрегированного состояния липосом нами были использованы липосомы, хранившиеся в течение 6 мес при охлаждении. В независимом эксперименте методом DLS были определены размеры частиц данного препарата липосом. Было установлено, что препарат характеризовался широким разбросом частиц по размерам (от 30 до 600 нм), что свидетельствует о высокой степени агрегации липосом.As discussed above, liposomes are not stable enough during storage, are prone to the formation of defects in the bilayer, to aggregation and oxidation, which limits their use in medicine as a carrier for drug delivery. As shown above, liposomes form strong complexes with aminopolysaccharides in a wide range of ionic strengths. We suggested that the use of PEG-chitosan can significantly increase the stability of liposomes during storage and prevent their aggregation due to electrostatic repulsion of the polymer chains of the polyelectrolyte associated with liposomes. As a stability criterion, we used the value of the frequencies of asymmetric stretching vibrations of the С-Н bond (νCH 2 as) as a “sensor” of the state of the hydrophobic part of the bilayer, as well as the frequency of stretching vibrations of the С = O bond of the carbonyl group of lipids, the microenvironment of which significantly changes when the structural liposome integrity. It is known that these bands are also very sensitive to the state of aggregation and oxidation of liposomes. As the ultimate aggregated state of liposomes, we used liposomes stored for 6 months during cooling. In an independent experiment, the particle sizes of a given liposome preparation were determined by DLS. It was found that the drug was characterized by a wide dispersion of particle sizes (from 30 to 600 nm), which indicates a high degree of liposome aggregation.
Было найдено, что при длительном хранении липосом полоса поглощения νCH2as претерпевает существенные изменения: наблюдается сдвиг с 2920 см-1 к 2926 см-1, что свидетельствует об агрегации и разрушении структуры липидных мембран.It was found that during long-term storage of liposomes, the νCH 2 as absorption band undergoes significant changes: a shift is observed from 2920 cm -1 to 2926 cm -1 , which indicates aggregation and destruction of the structure of lipid membranes.
Из фигуры 3 и фигуры 4 следует, что при хранении свободных липосом серьезные изменения в структуре бислоя наблюдаются через 10-14 сут. За это время положение полосы поглощения ацильных групп достигает 2925 см-1 и приближается к состоянию, характерному для агрегированных липосом.From figure 3 and figure 4 it follows that during storage of free liposomes, serious changes in the structure of the bilayer are observed after 10-14 days. During this time, the position of the absorption band of the acyl groups reaches 2925 cm -1 and approaches the state characteristic of aggregated liposomes.
В случае липосом в комплексе с хитозаном наблюдается иная ситуация. Полоса поглощения претерпевает сначала низкочастотный сдвиг - с 2920 см-1 к 2916 см-1, но далее характеристическое волновое число повышается до 2921 см-1. Нестабильность положения полосы поглощения указывает на изменения в структуре и нарушении целостности комплекса липосом с хитозаном.In the case of liposomes in combination with chitosan, a different situation is observed. The absorption band first undergoes a low-frequency shift - from 2920 cm -1 to 2916 cm -1 , but then the characteristic wave number rises to 2921 cm -1 . The instability of the position of the absorption band indicates changes in the structure and violation of the integrity of the complex of liposomes with chitosan.
Наибольшую стабильность продемонстрировал препарат комплекса липосом с PEG-хитозаном. В этом случае положение полосы поглощения νCH2-групп оставалось неизменным в течение как минимум 1 месяца хранения, что указывает на образование равновесного комплекса и его стабильность при дальнейшем хранении.The greatest stability was demonstrated by the preparation of a complex of liposomes with PEG-chitosan. In this case, the position of the absorption band of νCH 2 groups remained unchanged for at least 1 month of storage, which indicates the formation of an equilibrium complex and its stability during further storage.
Любопытными представляются данные о смещении полосы поглощения связи С=O в липосомах при хранении изучаемых образцов (фигура 4). В случае свободных липосом полоса поглощения С=O-групп претерпевает плавный сдвиг в область больших волновых чисел в течение 3-5 дней, что свидетельствует о понижении степени гидратации данной группы. Наиболее вероятно, что это связано с образованием дефектов, слипанием липосом и агрегации при хранении. Отметим, что для модельных агрегированных липосом частота валентных колебаний С=O-групп расположена в районе 1725 см-1, что соответствует максимально высокой степени гидратации; данный результат объясняется разрушением структуры липосом в процессе длительного хранения.Curious are the data on the shift of the absorption band of the C = O bond in liposomes during storage of the studied samples (figure 4). In the case of free liposomes, the absorption band of C = O groups undergoes a smooth shift to high wavenumbers within 3-5 days, which indicates a decrease in the degree of hydration of this group. Most likely, this is due to the formation of defects, liposome adhesion and aggregation during storage. Note that for model aggregated liposomes, the frequency of stretching vibrations of C = O groups is located in the region of 1725 cm -1 , which corresponds to the highest degree of hydration; This result is explained by the destruction of the liposome structure during long-term storage.
При хранении комплекса липосом с хитозаном в течение 3-4 дней наблюдалось снижение характеристического волнового числа С=O-групп, что указывает на повышение степени их гидратации. Данный факт может отражать процесс гелеобразования системы, которое характерно для препаратов высокомолекулярного хитозана и которое наблюдалось визуально. Изменение состояния препарата липосом в комплексе с немодифицированным хитозаном при хранении указывает на сложность его использования в медицинских целях. Напротив, в случае комплекса липосом с PEG-хитозаном положение полосы поглощения карбонильной группы оставалось неизменным, что в совокупности с неизменностью состояния -СН2-групп в бислое, указывает на образование квази-равновесного комплекса липосом с PEG-хитозаном и его структурную стабильность при хранении как минимум в течение 30 дней.When storing the complex of liposomes with chitosan for 3-4 days, a decrease in the characteristic wave number of C = O groups was observed, which indicates an increase in the degree of their hydration. This fact may reflect the process of gelation of the system, which is typical for high molecular weight chitosan preparations and which was observed visually. A change in the state of the liposome preparation in combination with unmodified chitosan during storage indicates the difficulty of its use for medical purposes. On the contrary, in the case of a complex of liposomes with PEG-chitosan, the position of the absorption band of the carbonyl group remained unchanged, which, together with the unchanged state of the -CH 2 groups in the bilayer, indicates the formation of a quasi-equilibrium complex of liposomes with PEG-chitosan and its structural storage stability at least 30 days.
Аналогичные данные по стабильности липосом были получены для комплексов с конъюгатом хитозан-фолиевая кислота. По данным ИК-спектроскопии, полученная система доставки сохраняла свои физико-химические и структурные свойства в течение как минимум 30 дней.Similar data on liposome stability were obtained for complexes with chitosan-folic acid conjugate. According to IR spectroscopy, the resulting delivery system retained its physicochemical and structural properties for at least 30 days.
Оценка цитотоксичности in vitroIn vitro cytotoxicity assessment
Для определения противоопухолевой активности in vitro были выбраны две клеточные линии. Клеточная линия А549 немелкоклеточной карциномы легкого человека характеризуется нормальным уровнем фолтаных рецепторов и представляется удобной системой для оценки противоопухолевой активности. Клеточная линия Сасо-2 колоректальной аденокарциномы человека характеризуется избытком фолатных рецепторов на поверхности и позволяет оценить эффект активного нацеливания для систем с фолатной адресной меткой.To determine the antitumor activity in vitro, two cell lines were selected. The A549 cell line of non-small cell lung carcinoma of a person is characterized by a normal level of foltany receptors and seems to be a convenient system for evaluating antitumor activity. The Saso-2 cell line of human colorectal adenocarcinoma is characterized by an excess of folate receptors on the surface and allows us to evaluate the effect of active targeting for systems with a folate address tag.
МТТ-тест - удобный способ оценки токсичности препарата. В работе изучали цитотоксичность несвязанных в комплекс с конъюгатами липосом, загруженных доксорубицином, и комплексов липосом, загруженных доксорубицином, с конъюгатами хитозана. Концентрация доксорубицина была равна 1 микромоль/литр.The MTT test is a convenient way to assess the toxicity of a drug. We studied the cytotoxicity of liposomes unloaded in conjunction with conjugates loaded with doxorubicin and liposome complexes loaded with doxorubicin with chitosan conjugates. The concentration of doxorubicin was equal to 1 micromol / liter.
Было установлено, что для клеточной линии А 549 активность комплексов с PEG-хитозаном-25 примерно равна активности липосом, несвязанных в комплекс. Это означает, что комплексообразование не приводит к потере противоопухолевой активности и не препятствует высвобождению препарата в клетках. При этом стабильность комплексов превышает стабильность несвязанных липосом при хранении в несколько раз. Совокупность данных фактов указывает на значительные преимущества разрабатываемой системы по сравнению с несвязанными липосомами.It was found that for cell line A 549, the activity of complexes with PEG-chitosan-25 is approximately equal to the activity of liposomes that are not bound to the complex. This means that complexation does not lead to a loss of antitumor activity and does not interfere with the release of the drug in the cells. Moreover, the stability of the complexes exceeds the stability of unbound liposomes during storage several times. The totality of these facts indicates significant advantages of the developed system compared to unbound liposomes.
С другой стороны, для клеточной линии Сасо-2 с избытком фолатных рецепторов на поверхности было обнаружно, что наибольшую цитотоксическую активность проявляют комплексы с конъюгатом хитозан-фолиевая кислота, что указывает на эффект активного нацеливания.On the other hand, for the Caco-2 cell line with an excess of folate receptors on the surface, it was found that the complexes with the chitosan-folic acid conjugate show the highest cytotoxic activity, which indicates the effect of active targeting.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017131557A RU2669354C1 (en) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Means for delivery of active agent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017131557A RU2669354C1 (en) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Means for delivery of active agent |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015102945A Division RU2642786C2 (en) | 2015-01-30 | 2015-01-30 | Liposomal suspensions stabiliser |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2669354C1 true RU2669354C1 (en) | 2018-10-10 |
Family
ID=63798222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017131557A RU2669354C1 (en) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Means for delivery of active agent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2669354C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2266915C1 (en) * | 2004-08-18 | 2005-12-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") | Method for preparing chitosan polyethylene glycol ester |
| RU2411077C1 (en) * | 2009-06-09 | 2011-02-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверской государственный технический университет" | Method for producing chitosan and alginic acid coats for microcapsules containing phospholipid micelles |
| RU2529179C1 (en) * | 2013-04-23 | 2014-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Уральский центр биофармацевтических технологий" | Liposome suspension stabiliser and method for production thereof |
-
2017
- 2017-09-08 RU RU2017131557A patent/RU2669354C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2266915C1 (en) * | 2004-08-18 | 2005-12-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") | Method for preparing chitosan polyethylene glycol ester |
| RU2411077C1 (en) * | 2009-06-09 | 2011-02-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверской государственный технический университет" | Method for producing chitosan and alginic acid coats for microcapsules containing phospholipid micelles |
| RU2529179C1 (en) * | 2013-04-23 | 2014-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Уральский центр биофармацевтических технологий" | Liposome suspension stabiliser and method for production thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Sugimoto Masatoshi et al. Preparation and characterization of water-soluble chitin and chitosan derivatives / Carbohydrate Polymers, 1998, Vol.36, N.1, pp.49-59. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ding et al. | Host–guest interactions initiated supramolecular chitosan nanogels for selective intracellular drug delivery | |
| Guo et al. | Self-assembled nanoparticles based on galactosylated O-carboxymethyl chitosan-graft-stearic acid conjugates for delivery of doxorubicin | |
| Liu et al. | Enhanced oral insulin delivery via surface hydrophilic modification of chitosan copolymer based self-assembly polyelectrolyte nanocomplex | |
| Elsabee et al. | Surface active properties of chitosan and its derivatives | |
| Singh et al. | Bovine serum albumin as a nanocarrier for the efficient delivery of ginsenoside compound K: Preparation, physicochemical characterizations and in vitro biological studies | |
| Zhang et al. | Hydrogen sulfide triggered charge-reversal micelles for cancer-targeted drug delivery and imaging | |
| Qiao et al. | Polymersomes from dual responsive block copolymers: drug encapsulation by heating and acid-triggered release | |
| Lachowicz et al. | Blood-compatible, stable micelles of sodium alginate–curcumin bioconjugate for anti-cancer applications | |
| Yan et al. | Fabrication of hyaluronic acid-based micelles with glutathione-responsiveness for targeted anticancer drug delivery | |
| Kurmi et al. | Dual cancer targeting using estrogen functionalized chitosan nanoparticles loaded with doxorubicin-estrone conjugate: A quality by design approach | |
| Baier et al. | Surface click reactions on polymeric nanocapsules for versatile functionalization | |
| Luo et al. | ATB 0,+ transporter-mediated targeting delivery to human lung cancer cells via aspartate-modified docetaxel-loading stealth liposomes | |
| Lu et al. | Folate-conjugated cell membrane mimetic polymer micelles for tumor-cell-targeted delivery of doxorubicin | |
| Liu et al. | Cell membrane-inspired polymeric micelles as carriers for drug delivery | |
| Ning et al. | Carboxymethyl dextran-coated liposomes: Toward a robust drug delivery platform | |
| Vasi et al. | Poly (acrylic acid)–poly (ethylene glycol) nanoparticles designed for ophthalmic drug delivery | |
| Guo et al. | Novel alginate coated hydrophobically modified chitosan polyelectrolyte complex for the delivery of BSA | |
| Santos et al. | Multifunctional antitumor magnetite/chitosan-L-glutamic acid (core/shell) nanocomposites | |
| Piras et al. | Methyl-β-cyclodextrin quaternary ammonium chitosan conjugate: Nanoparticles vs macromolecular soluble complex | |
| Pawar et al. | Efficacy interactions of PEG–DOX–N-acetyl glucosamine prodrug conjugate for anticancer therapy | |
| Muvaffak et al. | Preparation and characterization of a biodegradable drug targeting system for anticancer drug delivery: Microsphere-antibody conjugate | |
| Kou et al. | Preparation and application of a polymer with pH/temperature-responsive targeting | |
| Srinivasan et al. | Influence of surface modification and the pH on the release mechanisms and kinetics of erlotinib from antibody-functionalized chitosan nanoparticles | |
| Divsalar et al. | The design and characterization of a novel beta-casein nano-vehicle loaded with platinum anticancer drug for drug delivery | |
| Craparo et al. | Biocompatible polymeric micelles with polysorbate 80 for use in brain targeting |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180806 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20191220 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210131 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20211215 |