RU2628704C2

RU2628704C2 - Method for detection of copper ions in the environment and biosensor for its implementation

Info

Publication number: RU2628704C2
Application number: RU2015152945A
Authority: RU
Inventors: Алексей Владимирович Назаров; Анатолий Анатольевич Отрощенко; Екатерина Сергеевна Корсакова; Светлана Витальевна Боронникова; Игорь Юрьевич Макарихин; Михаил Сергеевич Шумков
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2017-08-21
Also published as: RU2015152945A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: strain of bacteria Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP is suggested for detection of copper ions, biosensor and method for detecting copper ions in the liquid medium under analysis. The biosensor includes a housing with microchannels for the liquid medium under analysis, inside of trap microchannels in form of a series of micropillars with immobilized agarous spheres. Moreover, the agarose spheres contain genetically modified Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP bacterial cells, which are capable of synthesizing the fluorescent protein RFP. The method is carried out by means of the above biosensor and includes immobilizing bacterial Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP cells into agarous spheres with diameter of 50 to 70 mcm, placing them in biosensor traps, feeding the analyzed liquid medium into biosensor, measuring the glow of the agarous spheres, processing and comparing the results with the control ones.

EFFECT: inventions provide detection of copper ions in medium and an assessment of contamination degree using a small sample volume and a small amount of genetically modified bacterial cells necessary for the detection of one sample.

5 cl, 5 dwg, 3 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области охраны окружающей среды, а именно к способам и устройствам для экспресс-анализа проб на наличие ионов меди, а также к биосенсорам на базе микрожидкостных систем, проводящих химикобиологическую детекцию с использованием малых объемов жидких реагентов и бактериальных клеток, выступающих как биоселективный элемент биосенсора.The invention relates to the field of environmental protection, and in particular to methods and devices for express analysis of samples for the presence of copper ions, as well as to biosensors based on microfluidic systems that conduct chemical-biological detection using small volumes of liquid reagents and bacterial cells acting as a bioselective element biosensor.

Уровень техникиState of the art

Известны способы определения загрязнителей в окружающей среде химическими методами [Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984. 448 с.; Практикум по агрохимии / Под ред. В.Г. Минеева. М.: Изд-во МГУ, 2001. 689 с.]. Данные методы основаны на определении загрязнителей в среде с помощью спектрофотомерии, атомно-абсорбциононной спектрофотомерии, высокоразрешающей хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием и др. Недостатком данных методов является необходимость использования дорогостоящей аппаратуры, а также сложность проведения анализа в полевых условиях.Known methods for the determination of pollutants in the environment by chemical methods [Lurie, Yu.Yu. Analytical chemistry of industrial wastewater. M .: Chemistry, 1984. 448 p .; Workshop on Agrochemistry / Ed. V.G. Mineeva. M.: Publishing House of Moscow State University, 2001. 689 p.]. These methods are based on the determination of pollutants in the medium using spectrophotometry, atomic absorption spectrophotometry, high-resolution chromatography with mass spectrometric detection, etc. The disadvantage of these methods is the need to use expensive equipment, as well as the complexity of the analysis in the field.

Известен способ, где [Патент US №6329160, 12.11.2001] предлагается в качестве основы биосенсора использовать клетки генномодифицированной бактерии E. coli, содержащей luxCDABE-гены, находящиеся под контролем регуляторных элементов оперона/гена деградации толуола. При этом по изменению интенсивности свечения клеток бактерий в биосенсоре возможна оценка концентрации в среде бензола, толуола, ксилола. С помощью соответствующих генетических конструкций в генномодифицированных клетках бактерий предлагается измерять концентрацию в среде взрывчатых веществ [Патент US №5972638, 26.10.1999], органических и неорганических соединений мышьяка [Патент ЕР №1367134, 12.03.2003], детергентов [Патент РФ №2355760, 20.05.2009], гептила [Патент РФ №2297450, 20.04.2007] и ионов тяжелых металлов [Патент US №8697388, МПК C12Q 1/02; G01N 33/20, опубл. 15.04.2014]. Последний взят нами за прототип для способа. Предложен состав биосенсоров, содержащих бактериальные клетки, и способы обнаружения некоторых тяжелых металлов.There is a method where [US Patent No. 6329160, 12.11.2001] proposes to use genetically modified E. coli bacteria cells containing luxCDABE genes under the control of the regulatory elements of the operon / toluene degradation gene as the basis of the biosensor. In this case, by changing the intensity of the glow of bacterial cells in the biosensor, it is possible to estimate the concentration in the medium of benzene, toluene, xylene. Using appropriate genetic constructs in genetically modified bacterial cells, it is proposed to measure the concentration of explosives in the medium [US Patent No. 59972638, 10.26.1999], arsenic organic and inorganic compounds [EP Patent No. 1367134, 03/12/2003], detergents [RF Patent No. 2355760, 05/20/2009], heptyl [RF Patent No. 2297450, 04/20/2007] and heavy metal ions [US Patent No. 8697388, IPC C12Q 1/02; G01N 33/20, publ. 04/15/2014]. The latter is taken by us as a prototype for the method. A composition of biosensors containing bacterial cells and methods for detecting certain heavy metals are proposed.

Биосенсоры на основе генетически модифицированных бактериальных клеток Caulobacter crescentus, содержащих ген, кодирующий репортерный белок (зеленый флуоресцентный белок (GFP). Данный ген экспрессируется в присутствии ионов тяжелых металлов.Biosensors based on genetically modified bacterial cells of Caulobacter crescentus containing a gene encoding a reporter protein (green fluorescent protein (GFP). This gene is expressed in the presence of heavy metal ions.

Недостатком способа прототипа является трудоемкость и продолжительность процесса, при этом гибель клеток из-за присутствия токсичных веществ может вызывать ошибку измерения концентрации тяжелых металлов в растворе.The disadvantage of the prototype method is the complexity and duration of the process, while cell death due to the presence of toxic substances can cause an error in measuring the concentration of heavy metals in solution.

Задача, на решение которой направлена группа изобретений, заключается в разработке биосенсора, состоящего из генномодифицированных клеток бактерий и микрожидкостного устройства как платформы, на которой осуществляется процесс детекции, а также расширение арсенала средств для определения ионов меди в окружающей среде.The task to which the group of inventions is directed is to develop a biosensor consisting of genetically modified bacterial cells and a microfluidic device as a platform on which the detection process is carried out, as well as expanding the arsenal of means for determining copper ions in the environment.

Поставленная задача решается с помощью предлагаемого в п. 1 формулы изобретения биосенсор для детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде, который включает корпус (1) из прозрачного материала, такого как пластмасса или стекло, или полидиметилсилоксан, с микроканалами (2) для анализируемой жидкой среды, причем внутри микроканалов выполнены ловушки, представляющие собой заграждение в виде ряда микропилларов (3), в которых иммобилизованы агарозные сферы (5), содержащие генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющие собой биоселективный элемент, способный к синтезу флуоресцентного белка RFP.The problem is solved using the proposed in paragraph 1 of the claims, a biosensor for the detection of copper ions in the analyzed liquid medium, which includes a housing (1) made of a transparent material, such as plastic or glass, or polydimethylsiloxane, with microchannels (2) for the analyzed liquid medium moreover, traps are made inside the microchannels, which are a barrier in the form of a series of micropillars (3), in which agarose spheres (5) containing genetically modified bacterial cells of Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP are immobilized, representing s bioselective an element capable to synthesize fluorescent protein RFP.

Особенности выполнения биосенсора нашли отражение в пунктах 2-3 формулы изобретения, а именно: Биосенсор включает три микроканала с 10 ловушками в каждом, а ряд микропилларов (4) выполнен в форме подковы.Features of the biosensor are reflected in paragraphs 2-3 of the claims, namely: The biosensor includes three microchannels with 10 traps in each, and a number of micropillars (4) is made in the shape of a horseshoe.

Поставленная задача решается с помощью признаков, указанных в пункте 4 формулы изобретения, общих с прототипом, таких как способ детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде с помощью биосенсора по пп. 1-3, характеризующийся тем, что клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP иммобилизуют в агарозные сферы с диаметром от 50 до 70 мкм, помещают их в ловушки биосенсора, осуществляют подачу анализируемой жидкой среды в биосенсор, измеряют свечение агарозных сфер с помощью флуоресцентного микроскопа с камерой или флуориметра, после чего полученные в анализируемой жидкой среде результаты обрабатывают и сравнивают с контрольными, при этом контрольными считают результаты флуоресцентного свечения агарозных сфер в ловушках до заполнения их анализируемой жидкой среды для детекции.The problem is solved using the features specified in paragraph 4 of the claims common to the prototype, such as a method for detecting copper ions in an analyzed liquid medium using a biosensor according to claims. 1-3, characterized in that Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP bacteria cells are immobilized in agarose spheres with diameters from 50 to 70 μm, placed in biosensor traps, the analyzed liquid medium is fed into the biosensor, and the luminescence of agarose spheres is measured using a fluorescence microscope with camera or fluorimeter, after which the results obtained in the analyzed liquid medium are processed and compared with the control, while the control is considered the results of fluorescence of agarose spheres in traps until they are analyzed th liquid medium for detection.

Поставленная задача решается согласно п. 5 формулы изобретения, а именно с помощью штамма бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющего собой биоселективный элемент для детекции ионов меди.The problem is solved in accordance with paragraph 5 of the claims, namely, using a bacterial strain Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, which is a bioselective element for the detection of copper ions.

Преимуществом предлагаемого способа детекции является использование вновь созданного компактного, миниатюрного биосенсора, содержащего внутри генномодифицированные клетки бактерий; снижение объема анализируемой жидкой среды (до 1 микролитра), который требуется для введения в устройство (на 1 ловушку микрожидкостного чипа необходимо до 40 нанолитров); уменьшение количества генномодифицированных клеток бактерий (до 3×10⁵), необходимых для анализа одной пробы; снижение времени детекции до 10 минут.An advantage of the proposed detection method is the use of the newly created compact, miniature biosensor containing genetically modified bacterial cells; reduction in the volume of the analyzed liquid medium (up to 1 microliter), which is required for introduction into the device (up to 40 nanoliters are required per 1 microfluidic chip trap); a decrease in the number of genetically modified bacterial cells (up to 3 × 10 ⁵ ) required for the analysis of one sample; Detection time reduction up to 10 minutes.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой группы изобретений, заключается в том, что детекция, проводимая на биосенсоре, позволяет обнаружить наличие ионов меди в среде и оценить степень загрязненности среды с использованием малого объема пробы, вводимой в биосенсор, и малого количества генномодифицированных клеток бактерий, необходимых для детекции одной пробы. Различия в объеме пробы и количестве генномодифицированных клеток бактерий, используемых для работы биосенсора, между предлагаемым изобретением и ранее созданными аналогами, в т.ч. прототипом, составляют до 10 и более раз.The technical result that can be obtained using the proposed group of inventions is that the detection carried out on the biosensor allows to detect the presence of copper ions in the medium and to assess the degree of pollution of the medium using a small sample volume introduced into the biosensor and a small amount of genetically modified bacterial cells necessary for the detection of a single sample. Differences in the volume of the sample and the number of genetically modified bacterial cells used to operate the biosensor between the proposed invention and previously created analogs, including prototype, make up to 10 or more times.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами. The invention is illustrated by the following drawings.

На фиг. 1 представлен эскиз общего вида корпуса биосенсора (позиция 1) с тремя микроканалами (позиция 2) по 10 ловушек в каждом микроканале (позиция 3).In FIG. 1 is a sketch of a general view of the biosensor case (position 1) with three microchannels (position 2) of 10 traps in each microchannel (position 3).

На фиг. 2 представлен увеличенный эскиз одной ловушки биосенсора, выполненной в виде микропилларов (позиция 4) диаметром 40 мкм расположенных в форме подковы с расстоянием менее 40 мкм между микропилларами таким образом, что общий объем одной ловушки не превышает 40 нл. В центре ловушки размещены агарозные сферы с клетками бактерий (позиция 5).In FIG. Figure 2 shows an enlarged sketch of one biosensor trap made in the form of micropillars (position 4) with a diameter of 40 μm arranged in the shape of a horseshoe with a distance of less than 40 μm between the micropillars so that the total volume of one trap does not exceed 40 nl. Agarose spheres with bacterial cells are located in the center of the trap (position 5).

На фиг. 3 представлена фотография оптического изображения одной ловушки биосенсора с агарозными сферами, содержащими генномодифицированные клетки бактерий (позиция 4).In FIG. 3 is a photograph of an optical image of a single biosensor trap with agarose spheres containing genetically modified bacterial cells (position 4).

На фиг. 4 представлена фотография флуоресцентного изображения ловушки биосенсора в начальный момент детекции и спустя 10 минут.In FIG. 4 is a photograph of a fluorescence image of a biosensor trap at the initial moment of detection and after 10 minutes.

На фиг. 5 представлен график зависимости ответа биосенсора на основе клеток бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP от содержания ионов меди в пробе.In FIG. Figure 5 shows a plot of the response of a biosensor based on bacterial cells of Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP on the content of copper ions in the sample.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Биосенсор (фиг. 1) выполнен в виде микрожидкостного устройства, содержащего корпус 1 из прозрачного материала с микроканалами (2) для анализируемой жидкой среды, внутри которых выполнены ловушки (3) для агарозных сфер (5) (фиг. 2 и 3), содержащих генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP (биоселективный элемент) (фиг. 3), способные к синтезу флуоресцентного белка.The biosensor (Fig. 1) is made in the form of a microfluidic device containing a housing 1 of a transparent material with microchannels (2) for the analyzed liquid medium, inside which traps (3) are made for agarose spheres (5) (Figs. 2 and 3) containing gene-modified bacterial cells of Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP (bioselective element) (Fig. 3), capable of synthesizing a fluorescent protein.

Корпус (1) выполнен из пластмассы или стекла, или полидиметилсилоксана.The housing (1) is made of plastic or glass, or polydimethylsiloxane.

Корпус биосенсора выполнен с тремя микроканалами (позиция 2 фиг. 1) по 10 ловушек в каждом.The biosensor case is made with three microchannels (position 2 of Fig. 1) with 10 traps in each.

Ловушки представляют собой заграждение в виде ряда микропилларов (5) в форме подковы.Traps are a fence in the form of a series of micropillars (5) in the shape of a horseshoe.

Иммобилизованные агарозные сферы (5) используют диаметром от 50 до 70 мкм. Как для способа, так и для биосенсора, в качестве биоселективного элемента для детекции ионов меди, используют штамм бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP.Immobilized agarose spheres (5) are used with a diameter of 50 to 70 μm. For both the method and the biosensor, the bacterial strain Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP is used as a bioselective element for detecting copper ions.

Осуществление группы изобретений заключается в том, что для детекции загрязненности среды используют оптически прозрачный корпус биосенсора с микроканалами, по которым подается анализируемая жидкая среда. Внутри микроканалов имеются специально сконструированные ловушки для агарозных сфер диаметром от 50 до 70 мкм. Агарозные сферы содержат в себе генетически модифицированные клетки бактерий (биоселективный элемент), способные к синтезу флуоресцентного белка. При взаимодействии клеток бактерий, заключенных в агарозные сферы, с анализируемой жидкой средой происходит изменение интенсивности флуоресцентного свечения.An embodiment of the group of inventions consists in the use of an optically transparent biosensor housing with microchannels through which an analyzed liquid medium is used to detect environmental pollution. Inside the microchannels there are specially designed traps for agarose spheres with diameters from 50 to 70 microns. Agarose spheres contain genetically modified bacterial cells (a bioselective element) capable of synthesizing a fluorescent protein. During the interaction of bacterial cells enclosed in agarose spheres with the analyzed liquid medium, a change in the fluorescence intensity occurs.

Пример 1. В качестве примера использованы генномодифицированные клетки Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, несущие в геноме репортерное clc::rfp-слияние, способные к продукции флуоресцентного белка RFP (длина волны света возбуждения флуоресценции - 585; длина регистрируемой волны - 610) для определения в среде ионов меди. Синтез RFP белка в клетках Е. coli BL21 DE3 («Stratagen», США), трансформированных плазмидой pClcRFP, созданной на основе вектора pGEM-T («Promega», США), происходит в результате ИПТГ-зависимой активации транскрипции с T7_lac-промотора. Под этот промотор, лежащий перед полилинкерным участком плазмиды pGEM-T, введено трансляционное слияние промоторной области clc-оперона с беспромоторным геном красного флуоресцентного белка RFP. При периодическом культивировании клеток Е. coli BL21 DE3 pClcRFP в экспоненциальной фазе в культуру вводится неметаболизируемый аналог лактозы ИНН, что приводит к наработке ClcA::Rfp-гибридного белка и накоплению его в цитоплазме. Затем бактериальные клетки включают в состав агарозных сфер и помещают в ловушку микрофлюидного чипа, где RFP белок уже и подвергается воздействию ионов меди, что приводит к детектируемому изменению его флуоресценции.Example 1. As an example, we used genetically modified Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP cells carrying the clc :: rfp fusion in the genome, capable of producing a fluorescent RFP protein (fluorescence excitation light wavelength - 585; registered wavelength - 610) for determination in environment of copper ions. Synthesis of RFP protein in E. coli BL21 DE3 cells (Stratagen, USA) transformed with pClcRFP plasmid based on pGEM-T vector (Promega, USA) results from IPTG-dependent activation of transcription from the T7 _lac promoter . Under this promoter, which lies in front of the polylinker region of the plasmid pGEM-T, a translational fusion of the promoter region of the clc operon with the non-promoter gene of the red fluorescent RFP protein was introduced. During periodic cultivation of E. coli BL21 DE3 pClcRFP cells in an exponential phase, a non-metabolizable lactose analog of the INN is introduced into the culture, which leads to the production of the ClcA :: Rfp hybrid protein and its accumulation in the cytoplasm. Then, the bacterial cells are included in the agarose spheres and placed in a trap of the microfluidic chip, where the RFP protein is already exposed to copper ions, which leads to a detectable change in its fluorescence.

Пример 2. Для определения ионов меди в анализируемой жидкой среде культуру клеток Е. coli BL21 DE3 pClcRFP выращивали с единичной колонии на среде LB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина в течение 18 часов при 37°C с аэрацией на термошейкере при 100 об/мин. Рост культуры оценивали на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония), определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм в кюветах с длиной оптического пути 1,0 см. Оптическая плотность культуры составляла 1,5 о.е. (около 4×10⁹ клеток бактерий на 1 мл среды).Example 2. To determine the copper ions in the analyzed liquid medium, an E. coli BL21 DE3 pClcRFP cell culture was grown from a single colony on LB medium in the presence of 100 μg / ml ampicillin for 18 hours at 37 ° C with aeration on a thermo shaker at 100 rpm . Culture growth was evaluated on a UV-Visible BioSpec-mini spectrophotometer (Shimadzu, Japan), determining the optical density at a wavelength of 600 nm in cuvettes with an optical path length of 1.0 cm. The optical density of the culture was 1.5 p.u. (about 4 × 10 ⁹ bacterial cells per 1 ml of medium).

В дальнейшем культуру клеток отмывали дважды физиологическим раствором. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. Конечная оптическая плотность клеточной суспензии составляла около 150 о.е. (около 4×10¹¹ клеток бактерий на 1 мл среды).Subsequently, the cell culture was washed twice with physiological saline. The resulting cell pellet was resuspended in 1 ml of physiological saline. The final optical density of the cell suspension was about 150 p.u. (about 4 × 10 ¹¹ bacterial cells per 1 ml of medium).

Затем проводили инкапсуляцию полученной суспензии репортерных клеток в агарозные сферы с последующим их фракционированием до размера 50-70 мкм.Then, the resulting suspension of reporter cells was encapsulated in agarose spheres, followed by their fractionation to a size of 50-70 μm.

Штамм Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP отличается следующими признаками: Грамотрицательные палочки. Перитрихи. Колонии на питательном агаре правильной округлой формы с ровными краями, плоские, полупрозрачные, бело-серого цвета, при длительном культивировании слегка красноватые, консистенция мягкая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует. Факультативный анаэроб. Клетки способны расти как на полноценных питательных средах (Luria-Bertani, мясо-пептонный бульон), так и на синтетических (среда М-9 с глюкозой, лактозой, ацетатом, сукцинатом и другими сахарами или короткоцепочечными органическими кислотами в качестве единственного источника углерода и энергии). Устойчивы к ампициллину вследствие наличия в плазмиде гена bla. Является коммерческим штаммом BL21 DE3, трансформированным рекомбинантной плазмидной ДНК pClcRFP. Трансформация штамма Е. coli BL21 DE3 («Stratagen», США) плазмидой pClcRFP, полученной на основе плазмиды pGEM-T («Promega», США), в которую был клонирован участок clc-оперона Rhodococcus opacus 1СР, слитый с геном красного флуоресцентного белка rfp. Хранение на скошенном LB-агаре под вазелиновым маслом - до полугода, в столбиках полужидкого агара - до года. Необходимы периодические пересевы. Возможно замораживание на -70°C в 10-20% растворе глицерина.The strain Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP is characterized by the following features: Gram-negative rods. Peritrichi. Colonies on nutrient agar of regular round shape with smooth edges, flat, translucent, white-gray in color, with long-term cultivation, slightly reddish, soft texture. The pigment released into the medium is absent. Optional anaerobic. Cells can grow both on high-grade nutrient media (Luria-Bertani, meat-peptone broth), and synthetic (M-9 medium with glucose, lactose, acetate, succinate and other sugars or short-chain organic acids as the only source of carbon and energy ) Resistant to ampicillin due to the presence of the bla gene in the plasmid. It is a commercial strain BL21 DE3 transformed with recombinant plasmid DNA pClcRFP. Transformation of E. coli strain BL21 DE3 (Stratagen, USA) with pClcRFP plasmid derived from pGEM-T plasmid (Promega, USA) into which a clod portion of the Rhodococcus opacus 1CP clc operon was fused to the red fluorescent protein gene rfp. Storage on slanted LB agar under liquid paraffin - up to six months, in columns of semi-liquid agar - up to a year. Periodic reseeding required. It is possible to freeze at -70 ° C in a 10-20% glycerol solution.

Пример 3. Инкапсулирование бактерийExample 3. Encapsulation of bacteria

1. В микроцентрифужную пробирку (объемом 10 мл) добавляли при непрерывном перемешивании на приборе Vortex V-1 plus («BioSan», Латвия) 200 мкл бактериальной культуры, 30 мкл 10% плурониковой кислоты («Sigma», США), 1 мл 2% TopVision агарозы, («Thermo Scientific)), США) температура, которой не превышала 39-40°C.1. In a microcentrifuge tube (10 ml), 200 μl of bacterial culture, 30 μl of 10% pluronic acid (Sigma, USA), 1 ml 2 were added with continuous stirring on a Vortex V-1 plus instrument (BioSan, Latvia) % TopVision agarose, (Thermo Scientific), USA) temperature, which did not exceed 39-40 ° C.

2. Полученную суспензию замешивали 1-2 минуты в однокомпонентном масле вязкостью 60-110 мПа×с, капая по 10-20 мкл суспензии.2. The resulting suspension was kneaded for 1-2 minutes in a single component oil with a viscosity of 60-110 MPa × s, dropping 10-20 μl of the suspension.

3. Пробирку помещали в водно-ледяную баню на 5 минут.3. The tube was placed in an ice-water bath for 5 minutes.

4. Образовавшиеся агарозные сферы собирали центрифугированием 2200 об/мин 10 минут, с последующей промывкой физиологическим раствором.4. The resulting agarose spheres were collected by centrifugation at 2200 rpm for 10 minutes, followed by washing with physiological saline.

Фракционирование полученного материала осуществляли с помощью фильтрования через нейлоновые фильтры с размерами пор 70 и 50 мкм («BD Falcon», США).Fractionation of the obtained material was carried out by filtration through nylon filters with pore sizes of 70 and 50 μm (BD Falcon, USA).

Готовые агарозные сферы с бактериальными клетками были иммобилизованы в ловушки биосенсора следующим образом.Ready-made agarose spheres with bacterial cells were immobilized into biosensor traps as follows.

1. Шприц заправляли физиологическим раствором, содержащим агарозные сферы.1. The syringe was filled with saline containing agarose spheres.

2. Шприц устанавливали в систему дозирования TS-1B/W0109-1B («Baoding Longer Presion Pump Co., Ltd», Китай) и соединяли при помощи тефлоновой трубки (внутренний диаметр 100 мкм) с биосенсором.2. The syringe was inserted into the dosing system TS-1B / W0109-1B (Baoding Longer Presion Pump Co., Ltd, China) and connected using a Teflon tube (inner diameter 100 μm) with a biosensor.

3. Биосенсор помещали под микроскоп для визуального контроля заполнения агарозными сферами ловушек.3. The biosensor was placed under a microscope to visually control the filling of traps with agarose spheres.

4. Устанавливали расход жидкости на системе дозирования TS-1B/W0109-1B в 1,5 мкл/мин.4. The flow rate of the dosing system TS-1B / W0109-1B was set to 1.5 μl / min.

5. Отслеживали заполнение сферами ловушек биосенсора.5. Tracked the filling of spheres of the biosensor traps.

Устройство работает следующим образом.The device operates as follows.

1. В микроканалы (2) биосенсора подают анализируемую жидкую среду на выявление наличия ионов меди.1. In the microchannels (2) of the biosensor serves the analyzed liquid medium to detect the presence of copper ions.

2. Измеряют свечение агарозных сфер (5) в ловушках (3) микрожидкостного чипа (1), содержащих генномодифицированные клетки бактерий. Для измерения свечения используют флуоресцентный микроскоп с камерой или флуориметр.2. Measure the luminescence of agarose spheres (5) in the traps (3) of the microfluidic chip (1) containing genetically modified bacterial cells. To measure the glow using a fluorescence microscope with a camera or fluorimeter.

3. Полученные результаты в исследуемых образцах обрабатывают и сравниваются с контрольными. Контрольным считается флуоресцентное свечение агарозных сфер в ловушках биосенсора до заполнения анализируемой жидкой средой.3. The results obtained in the studied samples are processed and compared with the control. The control is considered to be the fluorescence of agarose spheres in the biosensor traps before filling with the analyzed liquid medium.

На фиг. 5 представлены зависимости ответа биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP от содержания ионов меди в пробе. Флуоресценцию измеряли с помощью микроскопа Nikon LV100D («Nikon», Япония). Изображение фиксировали при помощи видео/фотокамеры DS-Fil Nikon, интегрированной с микроскопом, до внесения растворов CuSO₄ и через 10 мин. Расчет флуоресценции проводили с использованием программного обеспечения NIS-Elements BS («Nikon», Япония), яркость флуоресценции сфер с клетками бактерий выражали в условных единицах свечения (УЕС).In FIG. Figure 5 shows the dependences of the response of a biosensor based on bacterial cells of E. coli BL21 DE3 pClcRFP on the content of copper ions in the sample. Fluorescence was measured using a Nikon LV100D microscope (Nikon, Japan). The image was recorded using a DS-Fil Nikon video / camera integrated with a microscope prior to the addition of CuSO ₄ solutions and after 10 minutes. Fluorescence was calculated using NIS-Elements BS software (Nikon, Japan), the fluorescence brightness of the spheres with bacterial cells was expressed in arbitrary luminescence units (UES).

Для оценки жизнеспособности бактериальных клеток в агарозных сферах использован набор красителей Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit («Invitrogen», США). Известно, что токсическое действие ионов меди обусловлено, прежде всего, образованием связи с SH-группами аминокислотных остатков белков [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления. М.: Медицина, 1989. 419 с.; Maksymiec W. Effect of copper on cellular processes in higher plants // Photosynthetica, 1997, V. 34, P. 132-342]. В результате этого происходит изменение конформации белков и потеря выполняемой ими функции, в частности, происходит снижение флуоресценции RFP белка, продуцируемого бактериями Е. coli BL21 DE3 pClcRFP. Ответ на наличие тяжелых металлов (в том числе и меди) в среде, демонстрируемый биосенсором, предложенным ранее [Патент US №8697388, 15.04.2014], основан на индукции ионами тяжелых металлов синтеза в клетках генномодифицированной бактерии Caulobacter crescentus зеленого флуоресцирующего белка (GFP) и на измерении свечения клеток. В данном случае гибель клеток из-за присутствия токсичных веществ в растворе будет снижать свечение клеточной культуры, что будет вызывать ошибку в измерении концентрации ионов тяжелых металлов. Так как ответ биосенсора, предлагаемого в данной заявке, основан на действии ионов меди на белок RFP, нахождение клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP в жизнеспособном состоянии для работы биосенсора не является необходимым условием. Например, введение в чип 75% этанола вызывало гибель около 90% клеток, но не снижало их флуоресценцию (данные не представлены).To assess the viability of bacterial cells in agarose spheres, the Live / Dead BacLight Bacterial Viability kit (Invitrogen, USA) was used. It is known that the toxic effect of copper ions is primarily due to the formation of a bond with the SH groups of amino acid residues of proteins [Luzhnikov EA, Kostomarova LG Acute poisoning. M .: Medicine, 1989.419 s .; Maksymiec W. Effect of copper on cellular processes in higher plants // Photosynthetica, 1997, V. 34, P. 132-342]. As a result of this, the conformation of proteins changes and the function they perform is lost, in particular, the fluorescence of the RFP protein produced by the bacteria E. coli BL21 DE3 pClcRFP decreases. The response to the presence of heavy metals (including copper) in the medium, demonstrated by the biosensor proposed earlier [US Patent No. 8697388, 04/15/2014], is based on the induction by heavy metal ions of the synthesis of green fluorescent protein (GFP) in genetically modified bacteria Caulobacter crescentus cells. and on measuring the luminescence of cells. In this case, cell death due to the presence of toxic substances in the solution will reduce the glow of the cell culture, which will cause an error in measuring the concentration of heavy metal ions. Since the response of the biosensor proposed in this application is based on the action of copper ions on the RFP protein, the presence of E. coli BL21 DE3 pClcRFP bacteria cells in a viable state for the biosensor to function is not a necessary condition. For example, the introduction of 75% ethanol into the chip caused the death of about 90% of the cells, but did not reduce their fluorescence (data not shown).

Таким образом, наличие токсичных веществ в анализируемой жидкой среде не оказывает влияния на работу биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP, в отличие от биосенсоров, предложенных в прототипе. Кроме того, время ответа ранее разработанного биосенсора [Патент US №8697388, 15.04.2014] составляет от 2 часов и более, а время ответа предлагаемого биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP составляет 10 минут.Thus, the presence of toxic substances in the analyzed liquid medium does not affect the operation of the biosensor based on bacterial cells of E. coli BL21 DE3 pClcRFP, in contrast to the biosensors proposed in the prototype. In addition, the response time of the previously developed biosensor [US Patent No. 8697388, 04/15/2014] is 2 hours or more, and the response time of the proposed biosensor based on bacterial cells of E. coli BL21 DE3 pClcRFP is 10 minutes.

Изобретение создано в результате работ, выполненных по проекту в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение №14.574.21.0028 от 17.06.2014 (уникальный идентификатор RFMEFI57414X0028).The invention was created as a result of work carried out under the project as part of the implementation of the federal target program “Research and Development in Priority Directions for the Development of the Scientific and Technological Complex of Russia for 2014-2020”, agreement No. 14.574.21.0028 of June 17, 2014 (unique identifier RFMEFI57414X0028).

Claims

1. A biosensor for the detection of copper ions in the analyzed liquid medium, characterized in that it includes a housing (1) made of a transparent material, such as plastic or glass, or polydimethylsiloxane, with microchannels (2) for the analyzed liquid medium, and traps are made inside the microchannels, representing a barrier in the form of a series of micropillars (3) in which agarose spheres are immobilized (5) containing genetically modified bacterial cells of Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, which are a bioselective element capable of synthesizing fluorescence RFP protein.

2. The biosensor according to claim 1, characterized in that it includes three microchannels with 10 traps in each.

3. The biosensor according to claim 1, characterized in that the row of micropillars (4) is made in the shape of a horseshoe.

4. A method for detecting copper ions in an analyzed liquid medium using a biosensor according to paragraphs. 1-3, characterized in that Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP bacteria cells are immobilized in agarose spheres with diameters from 50 to 70 μm, placed in biosensor traps, the analyzed liquid medium is fed into the biosensor, and the luminescence of agarose spheres is measured using a fluorescence microscope with camera or fluorimeter, after which the results obtained in the analyzed liquid medium are processed and compared with the control, while the control is considered the results of fluorescence of agarose spheres in traps until they are analyzed th liquid medium for detection.

5. The bacterial strain Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, which is a bioselective element for the detection of copper ions.