RU2622006C2 - Application of recombinant strain of bacillus subtilis eo-11 rncim b-11978 as the product of subtitlisin-like proteinase, substances with thrombolytic and anticoagulant properties - Google Patents

Application of recombinant strain of bacillus subtilis eo-11 rncim b-11978 as the product of subtitlisin-like proteinase, substances with thrombolytic and anticoagulant properties Download PDF

Info

Publication number
RU2622006C2
RU2622006C2 RU2015122902A RU2015122902A RU2622006C2 RU 2622006 C2 RU2622006 C2 RU 2622006C2 RU 2015122902 A RU2015122902 A RU 2015122902A RU 2015122902 A RU2015122902 A RU 2015122902A RU 2622006 C2 RU2622006 C2 RU 2622006C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
blood
thrombolytic
subtilisin
bacillus subtilis
proteinase
Prior art date
Application number
RU2015122902A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2015122902A (en
Inventor
Юлия Васильевна Данилова
Нелли Павловна Балабан
Маргарита Рашидовна Шарипова
Айслу Миркасымовна Марданова
Екатерина Олеговна Михайлова
Галина Николаевна Руденская
Людмила Васильевна Лютова
Original Assignee
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУВПО КФУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУВПО КФУ) filed Critical Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУВПО КФУ)
Priority to RU2015122902A priority Critical patent/RU2622006C2/en
Publication of RU2015122902A publication Critical patent/RU2015122902A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2622006C2 publication Critical patent/RU2622006C2/en

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46Hydrolases (3)
    • A61K38/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention can be used for lysis (dissolution) of blood clots formed in the blood vessels (thrombus) that disrupt normal blood circulation and threaten life, and prevention of blood clots formation. This is achieved by using the product of vital activity of recombinant strain Bacillus subtilis EO-11 RNCIM B-11978 - subtilisin-like proteinase - a substance with thrombolytic and anticoagulant properties.
EFFECT: increasing the effectiveness of thrombus lysis, accelerating the process of thrombolysis without adverse side effects, preventing thrombus formation in the circulatory system of organisms, increasing the effectiveness and quality of treatment.
3 cl, 3 dwg

Description

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, может быть использовано в медицине и ветеринарии для лизиса (растворения) образовавшихся в кровеносных сосудах сгустков крови (далее по тексту - тромбов), нарушающих нормальную циркуляцию (крови) и угрожающих жизни (тромболитические свойства), и предотвращения (профилактики) образования тромбов (антикоагулянтные свойства). The invention relates to the field of human necessities, it can be used in human and veterinary medicine for lysis (dissolution) formed in blood vessels of blood clots (hereinafter - thrombus) breaking normal circulation (blood) and life-threatening (thrombolytic properties), and prevention (prophylaxis) of blood clots (anticoagulant properties).

Известен тромболитический фармацевтический препарат стафилокиназа [1]. Known thrombolytic pharmaceutical staphylokinase [1]. Сущностью является бифункциональное рекомбинантное производное стафилокиназы с активностями тромболитического и антикоагулирующего агента, отличающееся от стафилокиназы дикого типа тем, что один или более аминокислотных остатков между аминокислотными остатками 104 и 113 стафилокиназы дикого типа замещены другими аминокислотами с образованием последовательности RGD или последовательности KGD, вследствие чего его способность к полимеризации, а также клеточная и гуморальная иммуногенность существенно понижены по сравнению со стафилокин The essence is a bifunctional recombinant staphylokinase derivatives with activities of a thrombolytic and anticoagulant agent, characterized by staphylokinase wild type in that one or more amino acid residues between amino acid residues 104 and 113 of wild-type staphylokinase are substituted with other amino acids to form the RGD sequence or KGD sequence, whereby its ability to polymerization, as well as cellular and humoral immunogenicity significantly lowered compared with stafilokin азой дикого типа, или его усеченный с NH 2 -конца вариант, сохраняющий активности полноразмерной формы. wild type RNase, or a truncated variant NH 2 terminus that retains the activity of the full-length form.

Недостатком [1] является то, что рассасывание тромба (сгустка крови), например, образовавшегося в кровеносном сосуде и нарушившего кровообращение, происходит весьма замедленно вследствие крайне медленной активации плазминогена под ее (стафилокиназы) воздействием [2]. The disadvantage [1] is that the absorption of the thrombus (blood clot), for example, formed in a blood vessel and disrupt blood flow, there is a very slowed down due to the extremely slow plasminogen activation under its (staphylokinase) exposure [2]. Весьма замедленное лечебное действие препарата приводит к нарушениям кровоснабжения живых тканей и органов, вплоть до их отмирания с угрозой жизни живого организма. Very slow therapeutic effect of the drug leads to impaired blood supply to the tissues and organs of living up to their dying off with the threat of life of a living organism.

Известен тромболитический фармацевтический препарат урокиназа [3]. Known thrombolytic pharmaceutical urokinase [3]. Недостатком [3] являются многочисленные осложнения, выражающиеся в возникновении кровотечений, обусловленных повышением в крови продуктов деградации фибрина. A disadvantage of [3] are numerous complications lead to bleeding occurs due to an increase in the blood of fibrin degradation products. Кроме того, при использовании урокиназы системно снижается концентрация фибриногена и других факторов свертывания. Furthermore, when using urokinase systemically decreased fibrinogen concentration or other clotting factors. Недостатки [3] приводят к угрожающему для жизни живого организма нарушению коагуляционного звена системы гемостаза. Disadvantages [3] lead to life-threatening for the living body disruption coagulation hemostasis.

Известен тромболитический препарат тканевый активатор плазминогена [4]. Known thrombolytic drug is tissue plasminogen activator [4]. Недостатком [4] является быстрое выведение препарата из циркуляции в кровеносной системе. A disadvantage of [4] is a rapid clearance of the drug from the circulation in the circulatory system. В связи с этим необходима длительная обработка пациента системным введением активатора. In this regard, prolonged treatment is required systemic administration the patient activator. А системное введение активатора стимулирует фибринолитическую систему, результатом чего являются опасные кровотечения из-за разрушения фибриногена, нарушающие жизнедеятельность органов, например головного мозга, и сопровождающиеся неврологической симптоматикой. A systemic administration activator stimulates fibrinolytic system, resulting in dangerous bleeding due to the destruction of fibrinogen breaking vital functions of organs such as the brain, and accompanied by neurological symptoms. Кроме того, наличие у больных сопутствующих сердечно-легочных заболеваний ограничивает область применения [4] из-за отрицательного влияния препарата так, что введение и увеличение его (препарата) дозы чревато непредсказуемыми тяжелыми геморрагическими осложнениями [5] с возникновением угрозы жизни живого организма. Moreover, the presence in patients with concomitant cardiopulmonary diseases limit the scope of [4] due to the negative influence of the drug so that the introduction and increasing it (drug) dose may have unpredictable severe hemorrhagic complications [5] with the occurrence of a living organism life threats.

Наиболее близким по существу заявляемого изобретения, выбранным заявителем в качестве прототипа, является изобретение «Способ получения рекомбинантной стрептокиназы», продуктом которого является тромболитический препарат стрептокиназа [6]. The closest to the claimed invention substantially chosen by the applicant as the prototype, the invention is "A method for producing recombinant streptokinase", product of which is a thrombolytic drug streptokinase [6]. Недостатком прототипа является отсутствие специфического сродства стрептокиназы к фибрину. The disadvantage of the prototype is the absence of a specific affinity for fibrin streptokinase. Поэтому в случае необходимости применения препарата в высоких дозах, для достижения требуемого терапевтического эффекта, указанный препарат способствует истощению свертывающей системы крови и возникновению неконтролируемых кровотечений. Therefore, in case of need of the drug at high doses, to achieve the desired therapeutic effect, said preparation contributes to the depletion of blood coagulation and induce uncontrolled bleeding.

Целью предлагаемого изобретения является одновременное повышение эффективности лизиса тромба (повышение эффективности растворения тромба в кровеносной системе) и исключение (предотвращение) тромбообразования в кровеносной системе организмов. The aim of the invention is the simultaneous efficiency thrombolysis (clot dissolution efficiency into the circulatory system) and deletion (preventing) thrombotic organisms in the circulatory system.

Сущность заявляемого изобретения заключается в применении рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978 [7] в качестве продуцента субтилизиноподобной протеиназы, т.е. The essence of the claimed invention is the use of recombinant Bacillus subtilis strain SW-11 strain VKPM B-11978 [7] as producing subtilisin proteases, i.e. вещества, обладающего одновременно тромболитическими и антикоагулянтными свойствами. substance having both thrombolytic and anticoagulant properties.

Заявленное техническое решение поясняется следующими иллюстрациями. The technical solution illustrated in the following illustrations.

На Фиг. FIG. 1 показана мультикопийная плазмида pCS9 с геном субтилизиноподобной протеиназы. 1 shows a multicopy plasmid with the gene pCS9 subtilisin proteases. На Фиг. FIG. 2 представлена схема тромбоэластограммы, которая позволяет охарактеризовать весь процесс образования сгустка, от момента выпадения первых нитей фибрина до стабилизации сгустка или его лизиса. 2 is a diagram thromboelastogram, which allows to characterize the entire clotting process from the time the first strands of fibrin deposition to stabilize the clot or lysis. На Фиг. FIG. 3 изображены тромбоэластограммы: 3-1 - проба без фермента субтилизиноподобная протеиназа (контроль), где ОС-К - Образование Сгустка в Контроле; 3 shows thromboelastogram: 3-1 - sample without enzyme subtilisin protease (control), where OS-K - clot formation in the controls; 3-2 - проба с субтилизиноподобной протеиназой, где ОС-С - Образование Сгустка в присутствии Субтилизиноподобной протеиназы. 3-2 - the sample with proteinase subtilisin, wherein the OC-C - clot formation in the presence of subtilisin proteases.

Заявленное техническое решение описывается в следующей последовательности: The technical solution is described in the following sequence:

Для доказательства того, что заявленное техническое решение обладает одновременно как тромболитическими, так и антикоагулянтными свойствами заявителем далее приведены результаты экспериментов в следующей последовательности, на одном и том же препарате, а именно в первую очередь описаны эксперименты по получению фермента, а далее описаны эксперименты в отношении его тромболитической и антикоагулянтной активности, соответственно. To prove that the claimed technical solution has both a thrombolytic and anticoagulant properties Applicant further shows results of experiments in the following sequence, at one and the same preparation, namely primarily described experiments for the preparation of the enzyme, and further experiments are described in relation to its thrombolytic and anticoagulant activity, respectively.

Заявляемое изобретение осуществляют, например, следующим путем. The claimed invention is carried out, for example, as follows.

1. Создают рекомбинантную субтилизиноподобную протеиназу. 1. Create a recombinant subtilisin protease.

Для этого: For this:

1.1. 1.1. Создают рекомбинантный штамм Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978. Creating a recombinant strain of Bacillus subtilis EO 11 VKPM B-11978.

1.1.1. 1.1.1. Известным способом [8] конструируют мультикопийную плазмиду pCS9 (Фиг. 1) с геном субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus под контролем собственных регуляторных элементов. Known method [8] constructed multicopy plasmid pCS9 (FIG. 1) from the genome of Bacillus pumilus subtilisin proteases under the control of their own regulatory elements. На Фиг. FIG. 1 показана мультикопийная плазмида pCS9 с геном субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus, где: aprBp - ген субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus; 1 shows a multicopy plasmid with the gene pCS9 proteinase subtilisin Bacillus pumilus, wherein: aprBp - Protease subtilisin gene Bacillus pumilus; PaprBp - промотор гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus; PaprBp - Protease subtilisin gene promoter Bacillus pumilus; bla - ген устойчивости к ампициллину; bla - the ampicillin resistance gene; erm - ген устойчивости к эритромицину. erm - erythromycin resistance gene. Регуляторный элемент - это участок ДНК или РНК, регулирующий работу генов [9], находящихся на той же молекуле (ДНК или РНК). Regulatory element - a segment of DNA or RNA regulating gene operation [9], which are on the same molecule (DNA or RNA). Выполняют трансформацию клеток Bacillus subtilis BG2036 плазмидной ДНК, например, по известному методу [10]. Operate transformation Bacillus subtilis BG2036 plasmid DNA, for example, by a known method [10]. В штамм (Bacillus subtilis BG2036) помещают полученную плазмиду с геном субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus (Фиг. 1). The strain (Bacillus subtilis BG2036) placed the resulting plasmid with proteinase gene of subtilisin Bacillus pumilus (FIG. 1). В результате трансформации получают рекомбинантный штамм Bacillus subtilis ЕО-11. As a result of the transformation is obtained recombinant Bacillus subtilis strain EO-11. Bacillus subtilis ЕО-11 задепонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов, как ВКПМ-11979 [7]. Bacillus subtilis EO-11 zadeponirovan in the Russian National Collection of Industrial Microorganisms as VKPM B-11979 [7].

1.1.2. 1.1.2. Полученный рекомбинантный штамм Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978 культивируют в питательной среде, например, состава (%): бактериологический пептон («Sigma») - 2,00; The resulting recombinant strain Bacillus subtilis VKPM B-11 EO B-11978 is cultured in a culture medium, e.g., composition (%): bacteriological peptone ( «Sigma») - 2,00; CaCl 2 ⋅2Н 2 О - 0,06; CaCl 2 ⋅2N 2 O - 0.06; MgSO 4 ⋅Н 2 О - 0,05; MgSO 4 ⋅N 2 O - 0.05; NaCl - 0,30; NaCl - 0,30; NH 4 Cl - 0,02; NH 4 Cl - 0,02; MnSO 4 - 0,01; MnSO 4 - 0.01; Na 2 HPO 4 - 0,04; Na 2 HPO 4 - 0.04; pH - 8,5 (пептонсодержащая среда); pH - 8,5 (peptonsoderzhaschaya medium); L-бульон (среда LB, Лурия-Бертани) состава: триптон - 10,00 г/л; L-broth (LB medium Luria-Bertani) composition: trypton - 10.00 g / l; дрожжевой экстракт - 5,00 г/л; Yeast extract - 5.00 g / l; NaCl - 5,00 г/л; NaCl - 5,00 g / l; рН 8,5. pH 8.5. Для получения максимальной продукции субтилизиноподобной протеиназы используют колламин в концентрации 1,2 об.% в качестве добавки к среде LB и пептонсодержащей среде. For maximum production kollamin subtilisin proteases used in a concentration of 1.2 vol.% As an additive to a medium and LB medium peptonsoderzhaschey. Непосредственно перед посевом в среду культивирования добавляют эритромицин в концентрации 20 мкг/мл. Immediately prior to inoculation into the culture medium added erythromycin at a concentration of 20 ug / ml. Культивирование проводят при атмосферном давлении на лабораторных качалках BIOSAN, при температуре от плюс 25 до плюс 35°С, с интенсивностью качания 200 об/мин. Culturing is carried out at atmospheric pressure in laboratory shakers BIOSAN, at a temperature of plus 25 to plus 35 ° C, with oscillation intensity of 200 revolutions / min.

1.2. 1.2. Из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978 выделяют и очищают заявляемый фермент - субтилизиноподобную протеиназу методом ионообменной хроматографии с использованием КМ-целлюлозы [11] и в системе FPLC на колонке Mono S [12]. From the culture fluid of the recombinant Bacillus subtilis strain SW-11 strain VKPM B-11978 was isolated and purified by the inventive enzyme - subtilisin protease by ion exchange chromatography using CM-cellulose [11] and a FPLC system on Mono S column [12]. По завершении очистки получают фермент - субтилизиноподобную протеиназу - в буферном растворе (применяемом в процессе очистки), например в 0,05М Трисе HCl, рН 8,5. On completion of the cleaning enzyme produced - subtilisin protease - in a buffer solution (used in the cleaning process), for example in 0.05 M Tris HCl, pH 8.5. Полученный и очищенный фермент - субтилизиноподобную протеиназу, упаковывают и хранят, например, при температуре не выше плюс 4°С, применяют по назначению, например, в качестве тромболитического препарата. Produced and purified enzyme - subtilisin protease, packaged and stored, for example, at a temperature not higher than + 4 ° C and used for other purposes, e.g., as a thrombolytic agent. Неоднократная заморозка/разморозка вещества понижает активность препарата. Repeated freezing / defrosting substance lowers the activity of the drug.

Далее согласно «Паспорту штамма микроорганизма» (приложение к [7]) приведены основные характеристики и сведения о гарантированном неоднократном воспроизведении созданного рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ЕО-11 [8]. Further, according to the "Passport microorganism strain" (annex to [7]) shows the basic specifications and guaranteed repeated playback created recombinant Bacillus subtilis strain SW-11 [8].

- Родовое и видовое название культуры: Bacillus subtilis, Семейство: Bacillaceae. - The generic and specific name of culture: Bacillus subtilis, Family: Bacillaceae.

- Номер или наименование штамма: Bacillus subtilis ЕО-11. - The number or name of the strain: Bacillus subtilis EO-11.

- Область применения штамма: в биотехнологии как продуцент субтилизиноподобной протеиназы, обладающей тромболитическими свойствами. - Application of the strain: in biotechnology like producing subtilisin proteases having thrombolytic properties.

- Продукт, синтезируемый штаммом: Внеклеточная субтилизиноподобная протеиназа. - The product is synthesized by a strain of: extracellular protease subtilisin.

- Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели: Активность субтилизиноподобной протеиназы в культуральной жидкости составляет 0,1 мг/мл. - activity (productivity) strain and other performance indicators Activity subtilisin proteases in the culture fluid is 0.1 mg / ml.

- Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: - The process conditions and composition of the media for long-term storage of the strain:

длительное время хранения (до трех лет) - метод лиофилизации и замораживание культуры с 50% глицерином при минус 80°С. prolonged storage times (up to three years) - the method of lyophilization and freezing culture with 50% glycerol at -80 ° C. По мере необходимости хранимый штамм обновляют путем его культивирования; As necessary, update the stored strain by culturing it;

при хранении до года: 1,2 мл 0,7% агара с антибиотиком эритромицином (20 мкг/мл) заливают в пробирки столбиком, посев делается уколом, после выращивания в течение суток при плюс 37°С заливают сверху стерильным вазелиновым маслом (2 мл) и культуру хранят в темноте при комнатной температуре. during storage up to one year: 1.2 ml of 0.7% agar with erythromycin antibiotic (20 ug / ml) was filled into a column tube, seeding is prick, after growth overnight at 37 ° C plus poured on top with sterile liquid paraffin (2 ml ) and the culture is stored in the dark at room temperature.

- Способ, условия и состав сред для размножения штамма: оптимальная температура роста +37°С. - The process conditions and composition of the mediums for reproduction strain: Optimum growth temperature + 37 ° C. Среда: Лурия-Бертани (LB) (триптон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 0,5; рН 8,5) с антибиотиком эритромицином в конечной концентрации 20 мкг/мл. Medium: Luria-Bertani (LB) (tryptone - 1.0; yeast extract - 0.5; NaCl - 0.5; pH 8.5) with antibiotic erythromycin at a final concentration of 20 ug / ml. Для создания твердой питательной среды дополнительно вносят 2% агар. additionally make 2% agar to create a solid nutrient medium.

- Оптимальные условия и состав среды для ферментации: 1% глюкозы; - Optimal conditions and the composition of the fermentation medium: 1% glucose; 2% пептона; 2% peptone; 0,05% MgSO 4 *7H 2 O; 0,05% MgSO 4 * 7H 2 O; 0,01% CaCl 2 *2H 2 O; 0,01% CaCl 2 * 2H 2 O; 0,01% MnSO 4 ; 0,01% MnSO 4; 0,30% NaCl; 0,30% NaCl; 0,01% NH 4 Cl; 0,01% NH 4 Cl; 0,04% Na 2 HPO 4 ; 0,04% Na 2 HPO 4; эритромицин 20 мкг/мл; erythromycin, 20 ug / ml; рН 8,5. pH 8.5. Культивирование на вибростенде (2…3 с -1 ) при температуре плюс 30 ± 1°С. Culturing on a shaker (3 ... 2 s -1) at a temperature of 30 ± 1 ° C. Соотношение среда в колбе: воздух равно 1:7,5. The ratio of the medium in the flask: the air is 1: 7.5.

2. Действие субтилизиноподобной протеиназы на кровяные сгустки 2. Action subtilisin proteases in the blood clots

Для определения тромболитических свойств протеиназы в чистую пробирку отбирают аликвоту (определенное количество) анализируемой крови, например - крыс. To determine the properties of thrombolytic proteinase to a clean tube aliquot (certain number) of the analyzed blood, for example - rats. Кровь, в количестве 0,10 мл, смешивают с 0,05 мл раствора тромбина, в концентрации 2,00 мг/мл в 0,14М NaCl. Blood in an amount of 0.10 mL is mixed with 0.05 ml of thrombin solution at a concentration of 2.00 mg / ml in 0.14M NaCl. Раствор выдерживают в течение 10 мин в водяном термостате при плюс 37°С и получают сгусток крови. The solution was kept for 10 minutes in a water bath at + 37 ° C to give a blood clot. Пробирку со сгустком крови закрывают ватной пробкой. Tube with blood clot close cotton plug. Таким путем заготавливают несколько пробирок со сгустками крови. In this way, harvest a few test tubes with blood clots.

К сгустку крови в отдельной пробирке добавляют (предварительно сняв ватную пробку) 0,50 мл раствора препарата заявляемого фермента - субтилизиноподобной протеиназы, в концентрации 0,10 мг/мл раствора препарата. To a blood clot in a separate test tube was added (after removing a plug of cotton) 0.50 ml of a solution of the enzyme preparation claimed - subtilisin proteases at a concentration of 0.10 mg / ml of the drug solution. Пробирку закрывают ватной пробкой. The tube was sealed with a cotton plug. Сгусток с ферментом помещают в термостат, куда устанавливают контрольные пробирки со сгустками крови без фермента, но с добавкой NaCl в концентрации 0,14 М. Отмечают время полного лизиса (растворения) сгустков. Clot enzyme placed in an incubator, where the set control tubes with blood clots without enzyme but with the addition of NaCl at a concentration of 0.14 M. Note the time of complete lysis (dissolution) clots. Полноту лизиса определяют путем выливания содержимого пробирок - с добавленным заявляемым ферментом и контрольных - на бумажные фильтры. Completeness of lysis is determined by pouring the contents of the tubes - with an added enzyme and the claimed control - on paper filters. Полная, без остатков в виде сгустков крови, фильтрация содержимого пробирки через фильтр свидетельствует о полном лизисе сгустков. Complete, without a trace in the form of blood clots, content filtering tube through the filter indicates a complete clot lysis. Наличие оставшихся на фильтре сгустков свидетельствует о неполноте растворения сгустков крови. The presence of remaining in the filter clots indicates incomplete dissolution of blood clots.

Вышеописанные действия с пробирками со сгустками крови поочередно выполняют, изменяя концентрацию заявляемого фермента, вливаемого в каждую отдельную пробирку со сгустком крови, доведя концентрацию фермента до 0,80 мг/мл. The above-described actions with clotted blood tubes alternately operate by changing the concentration of the inventive enzyme infused into each separate tube with a blood clot, increasing enzyme concentration to 0.80 mg / ml.

Показано, что заявляемый фермент субтилизиноподобная протеиназа в концентрации 0,2 и 0,4 мг/мл лизирует (растворяет) тромб за 11000 с (183 мин) и 7500 с (125 мин) соответственно. It was shown that the inventive enzyme subtilisin protease in concentration of 0.2 and 0.4 mg / ml lyses (dissolves) for a clot to 11000 (183 minutes) and 7500 (125 min), respectively. В этих же концентрациях прототип лизирует тромб за 18000 с (300 мин) и 15200 с (253 мин) соответственно. In these same concentrations prototype for clot lyses to 18000 (300 minutes) and 15200 s (253 min), respectively.

Таким образом, доказано наличие у заявляемого фермента лизирующей (растворяющей тромб) способности, причем заявляемый фермент растворяет тромб быстрее прототипа, например, в 1,64 раза (1,64=18000 с/11000 с) при концентрации фермента 0,2 мг/мл и в 2,03 раза (2,03=15200 с/7500 с) при концентрации фермента 0,4 мг/мл. Thus, it is proved the existence of the claimed lysing enzyme (clot dissolving) ability, and the inventive enzyme clot dissolves rapidly prototype, for example, 1.64 times (= 1.64 to 18000/11000 s) at an enzyme concentration of 0.2 mg / ml and 2.03 times (= 2.03 to 15,200 / 7500) at an enzyme concentration of 0.4 mg / ml. Кроме того, полученные данные показывают, что протеиназа рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978 обладает дозозависимой тромболитической активностью. Moreover, the data show that recombinant proteinase strain Bacillus subtilis VKPM B-11 EO B-11978 has the thrombolytic dose dependent activity. Это свойство фермента позволяет растворять и удалять образовавшиеся в кровеносных сосудах тромбы. This property allows the enzyme to dissolve and remove the resulting blood clots in blood vessels.

При увеличении дозы субтилизиноподобной протеиназы расщепление тромба происходит более интенсивно и эффективно, не влияя при этом на состояние свертывающей системы крови. With increasing doses of thrombus subtilisin proteinase cleavage occurs more intensively and efficiently without affecting the state of the blood coagulation system. При использовании субтилизиноподобной протеиназы в качестве тромболитического средства сопровождающие применение препарата побочные явления, в том числе возникновение антител к бациллам, не наблюдаются. When used subtilisin proteases as thrombolytic agents accompanying use of the drug side effects, including the occurrence of antibodies against bacilli not observed. При применении субтилизиноподобной протеиназы в концентрации менее 0,6 мг/мл препарат нетоксичен для животных. In applying subtilisin proteases at a concentration of less than 0.6 mg / ml formulation is non-toxic to animals.

3. Антикоагулянтные свойства фермента субтилизиноподобная протеиназа 3. The anticoagulant properties of the enzyme subtilisin protease

Способность заявляемого фермента предотвращать образование фибриновых сгустков, например в профилактических целях, исследуют с помощью тромбоэластографа (например, фирмы "Hellige", Австрия). The ability of the inventive enzyme prevent the formation of fibrin clots, for example, prophylactically, examined by Thromboelastography (e.g., "Hellige" company, Austria).

Методика тромбоэластографии позволяет охарактеризовать весь процесс образования сгустка, от момента выпадения первых нитей фибрина до стабилизации сгустка или его лизиса. thromboelastography technique allows to characterize the entire clotting process from the time the first strands of fibrin deposition to stabilize the clot or lysis. Для этого в небольшую кювету, например, объемом 50 мл помещают исследуемую пробу (образец), кювету закрывают соприкасающейся с образцом крышечкой, подвешенной на тонкой чувствительной нити. For this purpose, a small cell, e.g., a 50 ml test sample was placed (sample), the cuvette is closed is in contact with the sample cap suspended by a fine filament sensitive. Кювету заставляют совершать непрерывные попеременные вращательные движения по часовой и против часовой стрелки вокруг оси. The cuvette is forced to commit continuous alternate rotational movements in clockwise and counterclockwise around the axis. Пока проба в кювете остается жидкой, вращение не передается на крышку. While the sample in the cuvette remains liquid, the rotation is not transmitted to the cover. С момента, когда происходит образование первых нитей фибрина сгустка, начинается передача вращения с кюветы на крышку и, соответственно, на удерживающую крышку в подвешенном состоянии нить. From the moment when the formation of the first strands of fibrin clot begins with the transmission of rotation to the cell cover and, respectively, retaining the cover in a suspended state filament. С нити вращение регистрируется и для дальнейшей обработки передается на тромбоэластограф с самописцем. With the rotation of the yarn to be recorded and transmitted for further processing to a recorder thromboelastography. В зависимости от величины поступающего с прибора сигнала меняется амплитуда колебания пишущего пера самописца, рисующего картину, называемую тромбоэластограммой. Depending on the magnitude of the incoming signal from the unit varies the amplitude of the vibrations of the stylus recorder, drawing a picture, called tromboelastogramma. Схему тромбоэластограммы показывает Фиг. Thromboelastogram diagram showing FIG. 2, где изображены: по горизонтали - время, по вертикали - величина амплитуды колебаний крышки кюветы с пробой при колебательном вращении кюветы, R - время от момента постановки пробы до начала образования первых нитей фибрина (тромбообразования); 2, which shows: horizontal - time vertically - the value of the oscillation amplitude of the cell lid with the sample cell rotates at oscillatory, R - time from the moment of the sample prior to the formation of the first strands of fibrin (thrombus formation); K - время от начала образования первых нитей фибрина до достижения сгустком амплитуды 20 мм; K - time from the start of formation of the first fibrin strands to achieve clot amplitude 20 mm; α - угол касательной к кривой из точки начала времени образования сгустка; α - angle of the tangent to the curve start point of the time of clot formation; МА - максимальная амплитуда расхождения кривых на тромбоэластограмме; MA - maximum amplitude difference curves in tromboelastogramma; Ly30 - процент, на который уменьшается величина (амплитуда) сгустка в течение 30 мин (min) после достижения MA; Ly30 - percentage by which decreases the magnitude (amplitude) of the clot for 30 minutes (min) after reaching MA; I - общий индекс коагуляции. I - a common coagulation index. I=160×tg α. I = 160 × tg α.

На тромбоэластограмме (Фиг. 2) с некоторого момента наблюдается расхождение охватывающих картину кривых. On tromboelastogramma (Fig. 2) there is a discrepancy pattern covering a certain moment curves. Момент расхождения кривых соответствует началу образования фибриновых нитей и формированию сгустка. Torque curves divergence corresponds to the beginning formation of fibrin strands and the formation of clot. После завершения процесса формирования сгустка вращательные колебания кюветы в полной мере, без проскальзывания, передаются соприкасающейся с пробой (образцом) крышке и далее, в виде электрического сигнала - на тромбоэластограф с самописцем, а пишущее перо самописца рисует картину, где охватывающие кривые представляют прямую на Фиг. After the process of clot formation rotational oscillations cuvette fully without slippage passed in contact with a sample (sample of) the cover and further, as an electric signal - by thromboelastography with the recorder, and the stylus recorder draws a picture, wherein covering curves represent straight FIG . 2. В дальнейшем, при растворении сгустка, перо самописца рисует картину, ограничиваемую сходящимися кривыми (Фиг. 2). 2. Thereafter, when dissolved clot stylus draws a picture, bounded by converging curves (Fig. 2).

По тромбоэластограмме (Фиг. 2) выполняют расчет характеризующих процесс основных параметров): R - время от момента постановки пробы до начала образования первых нитей фибрина (тромбообразования); By tromboelastogramma (. Figure 2) operate the main parameters characterizing calculation process): R - time from the moment of the sample prior to the formation of the first strands of fibrin (thrombus formation); K - время от начала образования первых нитей фибрина до достижения сгустком амплитуды 20 мм; K - time from the start of formation of the first fibrin strands to achieve clot amplitude 20 mm; α - угол касательной к кривой из точки начала времени образования сгустка; α - angle of the tangent to the curve start point of the time of clot formation; МА - максимальная амплитуда расхождения кривых на тромбоэластограмме; MA - maximum amplitude difference curves in tromboelastogramma; LY30 - процент, на который уменьшается величина (амплитуда) сгустка в течение 30 мин (min) после достижения MA; LY30 - percentage by which decreases the magnitude (amplitude) of the clot for 30 minutes (min) after reaching MA; I - общий индекс коагуляции. I - a common coagulation index. I=160×tg α. I = 160 × tg α.

Для снятия тромбоэластограммы при применении субтилизиноподобной протеиназы используют, например, плазму крови человека, титрованную цитратом натрия (3,8 об.%) в соотношении 9:1. To remove the thromboelastogram when used subtilisin proteases used, e.g., human blood plasma, titrated with sodium acetate (3.8 vol.%) In a ratio of 9: 1. Аликвоту плазмы крови в пробирке, в количестве 0,20 мл, смешивают с 0,10 мл субтилизиноподобной протеиназы в буферном растворе (в концентрациях 0,20 и 0,40 мг/мл протеиназы) и выдерживают в течение 10 мин при температуре плюс 22°С. An aliquot of blood plasma in vitro, in an amount of 0.20 mL is mixed with 0.10 ml subtilisin proteases in a buffer solution (at concentrations of 0.20 and 0.40 mg / ml proteinase) and incubated for 10 minutes at a temperature of 22 ° WITH. Затем в пробирку добавляют по 0,06 мл 1,3%-ного раствора CaCl 2 , тем самым запускают коагуляционный каскад. The test tube is added 0.06 ml of a 1.3% strength CaCl 2 solution, thereby trigger coagulation cascade. В контрольные пробирки вместо белка добавляют 0,14 М NaCl. The control tubes instead protein added 0.14 M NaCl. За процессом тромбообразования следят по кривой тромбоэластографа. The process of thrombus formation is monitored by thromboelastography curve. При инкубации крови с ферментом (субтилизиноподобной протеиназой) сгусток не образуется. When blood incubation with an enzyme (subtilisin protease) clot is not formed. Это связано с тем, что добавленная к крови субтилизиноподобная протеиназа разрушает компоненты гемостаза и предотвращает образование сгустка. This is due to the fact that added to a blood subtilisin protease destroys components of hemostasis and prevent clot formation. Результат действия протеиназы во времени подтверждает тромбоэластограмма (Фиг. 3) плазмы крови после инкубации ее (плазмы) с ферментом, где время отложено по горизонтальной оси. Result proteinase action in time confirms tromboelastogramma (FIG. 3) of blood plasma after incubation it (plasma) with the enzyme, where the time delayed by the horizontal axis. На Фиг. FIG. 3 изображены: 3-1 - проба без фермента субтилизиноподобная протеиназа (контроль), где ОС-К - Образование Сгустка в Контроле; 3 depicts: 3-1 - sample without enzyme subtilisin protease (control), where OS-K - clot formation in the controls; 3-2 - проба с субтилизиноподобной протеиназой, где ОС-С - Образование Сгустка в присутствии Субтилизиноподобной протеиназы; 3-2 - the sample with proteinase subtilisin, wherein the OC-C - clot formation in the presence of proteinase subtilisin; РФН - растворение фибриновых нитей. RFN - the dissolution of fibrin strands. R - продолжительность времени от момента постановки пробы до начала образования первых нитей фибрина - тромбообразования; R - the length of time from the moment of the sample prior to the formation of the first fibrin strands - thrombogenesis; R1 - в контроле (без фермента), R2 - с субтилизиноподобной протеиназой; R1 - in the control (without enzyme), R2 - a subtilisin protease; R1<R2. R1 <R2.

На Фиг. FIG. 3 видно, что в пробе с субтилизиноподобной протеиназой зона образования сгустка (ОС) существенно (участок ОС-С кратно<ОС-K) меньше, чем в контрольной пробе. 3 shows that in a sample with the proteinase subtilisin clot formation zone (OS) is substantially (OS C-fold portion <OS-K) less than the control sample. Этот участок характеризует максимум динамических свойств соединения фибрина и тромбоцитов посредством факторов свертывания крови и отображает максимальную прочность сгустка. This region characterizes the maximum dynamic properties of the compound by a fibrin and platelet clotting factor and indicates the maximum clot strength. То есть в присутствии в крови продуцируемой Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978 субтилизиноподобной протеиназы сгусток (крови) не образуется. That is, in the presence of blood produced by Bacillus subtilis EO-11 strain VKPM B-11978 clot subtilisin proteases (blood) is formed. Это свойство продуцируемого штаммом фермента позволяет предупредить тромбообразование в кровеносных сосудах организмов. This property of the enzyme produced by the strain can prevent thrombosis in blood vessels organisms.

В опытах с пробой без фермента (контроль) по истечении времени R1 начинается образование сгустка. In experiments with the sample without the enzyme (control) on R1 starts time after clot formation. По истечении времени ОС-K образование сгустка завершается и в дальнейшем масса крови остается в состоянии сгустка. When the time of OS-K clot formation is completed and further mass of blood remains in the bunch. Сгусток сохраняется во времени, то есть растворения фибриновых нитей не происходит. The curd is preserved in time, that is, the dissolution of the fibrin strands does not occur. Это подтверждается тем, что на тромбоэластограмме (Фиг. 3-1) амплитуда вращательных колебательных движений крышки кюветы не уменьшается вследствие того, что движения кюветы (с пробой) крышке кюветы передаются без проскальзывания. This is confirmed by the fact that the thromboelastogram (FIGS. 3-1), the amplitude of the rotational oscillation movement of the cell cover is not reduced because the movement of the cuvette (with sample) cover the cell are transmitted without slippage. В кровеносном сосуде такой сгусток был бы тромбом, нарушающим кровоток. In the blood vessel such clot would thrombus violating the bloodstream.

В опытах с содержащей субтилизиноподобную протеиназу пробой по истечении времени R2 также начинается образование сгустка, причем R1<R2. In experiments with proteinase subtilisin containing sample after time and R2 clot formation begins, wherein R1 <R2. Затем по истечении времени ОС-С образование сгустка прекращается. Then, after the time of OS-C clot formation ceases. При этом ОС-K>ОС-С. In this case, the OS-K> OS-C. В дальнейшем начинается растворение фибриновых нитей, разрушение сгустка, масса сгустка крови разжижается, что на тромбоэластограмме (Фиг. 3-2) показывает уменьшение амплитуды колебательных движений крышки кюветы, соприкасающейся с образцом в кювете. Subsequently begins dissolution of fibrin filaments destruction clot weight Clot liquefies that tromboelastogramma (FIG. 3-2) shows the decrease in the amplitude of oscillatory motion of the cell cover, contact with the sample in the cuvette. То есть при наличии заявляемой субтилизиноподобной протеиназы в пробе начавшееся образование сгустка прекращается, образовавшийся сгусток разрушается. That is, if the claimed subtilisin proteases in the sample started clot formation ceases, the clot breaks. Это подтверждается тем, что на тромбоэластограмме (Фиг. 3-2) уменьшается амплитуда вращательных колебательных движений крышки кюветы вследствие того, что движения кюветы с пробой крышке кюветы передаются с нарастающим проскальзыванием. This is confirmed by the fact that the thromboelastogram (FIGS. 3-2) reduced the amplitude of the rotational oscillation movement of the cell cover because the movement of the cuvette with the probe cover of the cell is transmitted with increasing slip.

Таким образом, доказано, что в условиях in vitro субтилизиноподобная протеиназа рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ОЕ-11 ВКПМ В-11978 обладает антикоагулянтной активностью. Thus, we have shown that under conditions in vitro recombinant subtilisin protease strain Bacillus subtilis VKPM DE-B-11 11978 possesses anticoagulant activity. То есть продуцируемый штаммом Bacillus subtilis ОЕ-11 ВКПМ В-11978 фермент может быть активным ингредиентом медицинских лекарственных средств для предотвращения тромбообразования, например для предотвращения закупорки кровеносных сосудов ног человека при тромбофлебите. That is produced by a strain of Bacillus subtilis OE-11 strain VKPM B-11978, the enzyme may be an active ingredient of medical drugs for preventing thrombus formation, such as to prevent blockage of the blood vessels of human feet thrombophlebitis.

Как видно из приведенных данных, изобретение охватывает область создания и применения препаратов для ферментативного гидролиза образующих тромбы белков. As seen from the above data, the invention encompasses the development and application of preparations for enzymatic hydrolysis of proteins forming thrombi. Проявленные и доказанные в опытах свойства предполагаемого изобретения показывают также его полезность для профилактики и/или лечения заболеваний людей в медицине и сельскохозяйственных животных в ветеринарии. The developed and proven in the experiments of the intended properties of the invention also demonstrate its utility for the prevention and / or treatment of diseases in human medicine and agricultural animals in veterinary medicine. Применение продуцируемой штаммом Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-1197 субтилизиноподобной протеиназы - вещества с тромболитическими и антикоагулянтными свойствами - способствует предупреждению тромбообразования в кровеносной системе, например, когда под влиянием внешних воздействий возникает или возрастает опасность образования тромбов. Use of Bacillus subtilis strain produced EO-11 strain VKPM B-1197 subtilisin proteases - a substance with thrombolytic and anticoagulant properties - helps prevent thrombus formation in the circulatory system, for example, when under external influences arises or increases the risk of blood clots. Возможность образования тромбов возрастает, например, при длительном пребывании на ногах работающего человека с нарушенной структурой кровеносных сосудов ног. The possibility of formation of blood clots is increased, for example, prolonged exposure to the legs of the working person with impaired legs of the structure of blood vessels. В последующем образовавшиеся в венах тромбы могут оторваться от стенок кровеносного сосуда, могут быть унесены кровотоком и занесены в сердце, что угрожает летальным исходом. Subsequently, the resulting blood clots in the veins can break away from the walls of the blood vessel, blood flow can be carried out and recorded in the heart, which threatens death.

Уменьшение вероятности тромбообразования, профилактика тромбообразования путем применения продукта жизнедеятельности штамма Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978 или растворения образовавшегося тромба на ранних стадиях заболевания способствуют предупреждению опасного заболевания или более раннему началу лечения, когда оно (лечение) наиболее эффективно, производится с меньшей затратой лечебных препаратов, труда и времени медицинских работников, с наименьшим ущербом для здоровья пациентов по сравнению с лечением болезней в поздней, запущенной с Reducing the likelihood of thrombus formation, the prevention of thrombus formation by application of strain waste product Bacillus subtilis EO-11 strain VKPM B-11978 or dissolving the formed thrombus in the early stages of the disease contribute to the prevention of dangerous disease or earlier treatment when it is (treatment) is most efficiently produced with less expenditure therapeutic drugs, labor and time health care workers with the least damage to the health of patients as compared to the treatment of disease in later fired from адии. adii.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения. The present invention satisfies the criteria of novelty, since the determination has been detected prior art means, which has features that are identical (i.e. they coincide in executable form and function execution of these attributes) all characteristics listed in the claims, including the destination characteristic.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т.к. The claimed technical solution meets the criterion of "inventive step", imposed upon an invention, as из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат, кроме указанного заявленное техническое решение является не очевидным для специалиста, т.к. investigated from the prior art did not reveal technical solutions having features identical to the features of the invention and is not set known effect on the distinguishing features specified technical result other than that of the technical solution is not obvious to the skilled person, since обеспечивает разрешение казалось бы неразрешимой проблемы, т.к. provides a resolution of seemingly intractable problem, since одновременно обеспечивает лизис (растворение) образовавшихся тромбов (сгустков крови) в кровеносной системе организмов (обеспечивает тромболитическое свойство) и предупреждение образования тромбов в кровеносной системе организмов (обеспечивает антикоагулянтное свойство). simultaneously provides lysis (dissolution) of the formed thrombus (blood clots) in the circulatory system of the body (which provides thrombolytic property) and the prevention of blood clots in the circulatory system of the body (which provides anticoagulant properties).

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве лекарственных средств, в деятельности организаций здравоохранения, животноводства посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. The technical solution can be implemented in the industrial production of medicinal products, in the activities of public health organizations, animal husbandry by utilizing known standard of technical devices and equipment. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям. It meets the criterion of "industrial applicability", imposed upon an invention.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ USED ​​SOURCES

1. Патент RU №2283863, приоритеты: подача заявки: 23.01.2001; 1. Patent RU №2283863, priorities application filing: 23.01.2001; начало действия патента: 23.01.2001; of the patent: 23.01.2001; публикация патента: 20.09.2006 Рекомбинантное производное стафилокиназы, его получение и применение // Сонг Хоуян (CN), СонгГ Ганг (CN) / Университет Фудан (CN). Patent Publication: 20.09.2006 Recombinant staphylokinase derivative, its preparation and use // Song Houyan (CN), SongG Ganga (CN) / Fudan University (CN).

2. Марков В.А., Вышлов Е В. Тромболитическая терапия при инфаркте миокарда. 2. Markov VA, went EV Thrombolytic therapy for acute myocardial infarction. - Томск.: STT, 2011. - С. 148. - Tomsk .: STT, 2011. - S. 148.

3. Патент RU №2259212, приоритеты: подача заявки: 15.03.2002; 3. Patent RU №2259212, priorities application filing: 15.03.2002; начало действия патента: 15.03.2002; of the patent: 15.03.2002; публикация патента: 27.08.2005. Patent Publication: 27.08.2005. Способ получения фармацевтически активных рекомбинантных белков // Арини Акилле (СН), Копполеккия Раффаэлла (СН), Пагани Франческа Паола (IT), Хербст Детлев (СН), Тоньини Антонио (СН) / Сербиос-Фарма С.А. A process for preparing a pharmaceutically active recombinant proteins // Arini Achille (CH), Raffaella Koppolekkiya (CH), Pagani Francesco Paolo (IT), Herbst Detlev (CH), Antonio Tonini (CH) / Serbios-Pharma SA (СН). (CH).

4. Патент RU №2107727, приоритеты: подача заявки: 28.10.1988; 4. Patent RU №2107727, priorities application filing: 28.10.1988; публикация патента: 27.03.1998. Patent Publication: 27.03.1998. Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена и способ его получения // Ясуси Каваути[JP], Тосиюки Такемото[JP], Макото Такаяма[JP], Масами Екотак[JP], Macao KaTo[JP], Кимио Катсутак[JP], Хироси Гусима[JP]/ Яманути Фармасьютикал Ко., Лтд. Recombinant tissue plasminogen activator and a method for its preparation // Yasushi Kavauti [JP], Toshiyuki Takemoto [JP], Makoto Takayama [JP], Masami Ekotak [JP], Macao KaTo [JP], Kimio Katsutak [JP], Hiroshi Gusima [JP ] / Yamanuti Pharmaceutical Co., Ltd. (JP). (JP).

5. Леонтьев С.Г., Чуриков Д.А. 5. SG Leontiev, DA Churikov Стрептокиназа и тканевой активатор плазминогена в лечении массивной легочной эмболии. Streptokinase and tissue plasminogen activator in the treatment of massive pulmonary embolism. Что эффективнее? What's better? Флебология, 2001. - №13. Phlebology, 2001. - №13. - С. 24. - S. 24.

6. Патент RU №2127758, приоритеты: подача заявки: 03.04.1995; 6. Patent RU №2127758, priorities application filing: 03.04.1995; публикация патента: 20.03.1999. patent publication: 20/03/1999. Способ получения рекомбинантной стрептокиназы // Хоуйан Сонг (CN) / Шангай Медикал Юниверсити (CN). A method for producing recombinant streptokinase // Houyan Song (CN) / Shagai Medical University (CN).

7. Справка о депонировании культуры Bacillus subtilis ЕО-11. 7. Certificate of deposit of culture Bacillus subtilis EO-11. Регистрационный номер ВКПМ: В-11979. Registration number VKPM: B-11979. Дата депонирования 10 декабря 2014 г. date of deposit December 10, 2014

8. Rebrikov DV, Akimkina TV, Shevelev А.В., Demiduyk IV, Bushueva AM, Kostrov SV, Chestukhina GG, Stepanov VM Molecular cloning and nucleotide sequence of Bacillus intermedius glutamylendopeptidase gene. 8. Rebrikov DV, Akimkina TV, Shevelev AV, Demiduyk IV, Bushueva AM, Kostrov SV, Chestukhina GG, Stepanov VM Molecular cloning and nucleotide sequence of Bacillus intermedius glutamylendopeptidase gene. J. Prot. J. Prot. Chem, 1999. - V. 18. - P. 21-26. Chem, 1999. - V. 18. - P. 21-26.

9. Wray GA The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. 9. Wray GA The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nature Reviews Genetics, 2007. - V. 8(3). Nature Reviews Genetics, 2007. - V. 8 (3). - P. 206-216. - P. 206-216.

10. Anagnostopoulos C, Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. 10. Anagnostopoulos C, Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J Bacteriol, 1961. - V.81. J Bacteriol, 1961. - V.81. - №5. - №5. - P. 741-746. - P. 741-746.

11. Фритц Дж., Гьертде Д., Поланд К. Ионная хроматография. 11. Fritz J., Gertde D., K. Poland's ion chromatography. - М.: Мир, 1984. - С. 221. - M .: Mir, 1984. - P. 221.

12. Скоупс Р. Методы очистки белков. 12. R. Scopes Protein Purification Methods. - М.: Мир, 1985. - С. 358. - M .: Mir, 1985. - 358 pp.

Claims (3)

1. Применение рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ЕО-11 ВКПМ В-11978 в качестве продуцента субтилизиноподобной протеиназы, вещества с тромболитическими и антикоагулянтными свойствами. 1. Use of recombinant strain of Bacillus subtilis EO-11 strain VKPM B-11978 as a producer of subtilisin proteinase with thrombolytic agents and anticoagulant properties.
2. Применение рекомбинантного штамма по п. 1 в качестве продуцента субтилизиноподобной протеиназы, обеспечивающего лизис (растворение) образовавшихся тромбов (сгустков крови) в кровеносной системе организмов - тромболитическое свойство. 2. Use of recombinant strain according to claim 1 as producing subtilisin proteases providing lysis (dissolution) of the formed thrombus (blood clot) in the circulatory system of the body -. Thrombolytic property.
3. Применение рекомбинантного штамма по п. 1 в качестве продуцента субтилизиноподобной протеиназы, обеспечивающего предупреждение образования тромбов в кровеносной системе организмов - антикоагулянтное свойство. 3. Use of recombinant strain according to claim 1 as producing subtilisin proteinase, providing a warning of blood clots in the circulatory system of the body -. Anticoagulant property.
RU2015122902A 2015-06-15 2015-06-15 Application of recombinant strain of bacillus subtilis eo-11 rncim b-11978 as the product of subtitlisin-like proteinase, substances with thrombolytic and anticoagulant properties RU2622006C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015122902A RU2622006C2 (en) 2015-06-15 2015-06-15 Application of recombinant strain of bacillus subtilis eo-11 rncim b-11978 as the product of subtitlisin-like proteinase, substances with thrombolytic and anticoagulant properties

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015122902A RU2622006C2 (en) 2015-06-15 2015-06-15 Application of recombinant strain of bacillus subtilis eo-11 rncim b-11978 as the product of subtitlisin-like proteinase, substances with thrombolytic and anticoagulant properties

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015122902A RU2015122902A (en) 2017-01-10
RU2622006C2 true RU2622006C2 (en) 2017-06-08

Family

ID=57955570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015122902A RU2622006C2 (en) 2015-06-15 2015-06-15 Application of recombinant strain of bacillus subtilis eo-11 rncim b-11978 as the product of subtitlisin-like proteinase, substances with thrombolytic and anticoagulant properties

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2622006C2 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995026202A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Boehringer Mannheim Gmbh Combinations of thrombolytically active proteins and anticoagulants, and uses thereof
RU2416643C2 (en) * 2008-12-05 2011-04-20 ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management, "SFM") Immobilised bacillus licheniformis bacteria produced subtilisin showing thrombolytic and anticoagulant properties

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995026202A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Boehringer Mannheim Gmbh Combinations of thrombolytically active proteins and anticoagulants, and uses thereof
RU2416643C2 (en) * 2008-12-05 2011-04-20 ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management, "SFM") Immobilised bacillus licheniformis bacteria produced subtilisin showing thrombolytic and anticoagulant properties

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
МИХАЙЛОВА Е.О. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста. Авто дисс. к.б.н., Казань, 2007,стр.1-24. ДАНИЛОВА Ю.В. и др. Бациллярные протеиназы как основа для создания лекарственных препаратов.Студенческий научный журнал "Грани науки", 2014,т.2. N3, стр.23-27. *
МИХАЙЛОВА Е.О. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста. Автореферат дисс. к.б.н., Казань, 2007,стр.1-24. ДАНИЛОВА Ю.В. и др. Бациллярные протеиназы как основа для создания лекарственных препаратов.Студенческий научный журнал "Грани науки", 2014,т.2. N3, стр.23-27. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015122902A (en) 2017-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nagai et al. Tadpole collagenase. Preparation and purification
Beesley et al. Pesticins III. Expression of coagulase and mechanism of fibrinolysis
Matsuzaki et al. Experimental protection of mice against lethal Staphylococcus aureus infection by novel bacteriophage ϕMR11
von Pawel‐Rammingen et al. IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G
US6159468A (en) Activated protein C formulations
Lukomski et al. Inactivation of Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease significantly decreases mouse lethality of serotype M3 and M49 strains.
US5350578A (en) Inhibition of arterial thrombotic occlusion or thromboembolism
AU618714B2 (en) Novel bacteriocin compositions for use as enhanced broad range bactericides and methods of preventing and treating microbial infection
Abedon et al. Phage treatment of human infections
Sodeinde et al. A surface protease and the invasive character of plague
JP3459416B2 (en) The modified factor ▲ vii ▼
Fischetti Bacteriophage lytic enzymes: novel anti-infectives
Fischetti Bacteriophage endolysins: a novel anti-infective to control Gram-positive pathogens
Schmelcher et al. Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials
Fischetti Bacteriophage lysins as effective antibacterials
US6238661B1 (en) Use of bacterial phage associated lysing enzymes for treating various illnesses
Kapur et al. A conserved Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease cleaves human fibronectin and degrades vitronectin
Tidrick et al. Fibrin fixation of skin transplants
US5009889A (en) Treatment of dysfunctional vascular endothelium using activated protein C
US6254866B1 (en) Use of phage associated lytic enzymes for treating bacterial infections of the digestive tract
RU2337108C2 (en) Polypeptides for induction of protective immune response against staphylococcus aureus
US4552760A (en) Method for stabilizing tissue plasminogen activator and a stable aqueous solution or powder containing the same
Esmon The regulation of natural anticoagulant pathways
EP1587520B1 (en) Bacteriophage for the treatment of bacterial biofilms
US6248324B1 (en) Bacterial phage associated lysing enzymes for treating dermatological infections