RU2620074C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pDUALREP2 И ШТАММ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ЕЮ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ И СМЕСЕЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ БИОСИНТЕЗ БЕЛКА И/ИЛИ ВЫЗЫВАЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pDUALREP2 И ШТАММ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ЕЮ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ И СМЕСЕЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ БИОСИНТЕЗ БЕЛКА И/ИЛИ ВЫЗЫВАЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2620074C1 RU2620074C1 RU2016130354A RU2016130354A RU2620074C1 RU 2620074 C1 RU2620074 C1 RU 2620074C1 RU 2016130354 A RU2016130354 A RU 2016130354A RU 2016130354 A RU2016130354 A RU 2016130354A RU 2620074 C1 RU2620074 C1 RU 2620074C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- plasmid
- coli
- sos
- pdualrep2
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 title description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims abstract description 46
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 20
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims abstract description 20
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims abstract description 18
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000027151 SOS response Effects 0.000 claims abstract description 15
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims abstract description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 19
- 101150073502 sulA gene Proteins 0.000 claims description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 7
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 28
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 abstract description 13
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101100258211 Escherichia coli sulA gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101150071242 tolC gene Proteins 0.000 abstract 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 28
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 27
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 26
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 22
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 15
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 11
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 11
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 8
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 8
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 7
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 6
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 6
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N (E)-roxithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=N/OCOCCOC)/[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 5
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 5
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 5
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 5
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 5
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 description 5
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005224 roxithromycin Drugs 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 5
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 3
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IECPWNUMDGFDKC-UHFFFAOYSA-N Fusicsaeure Natural products C12C(O)CC3C(=C(CCC=C(C)C)C(O)=O)C(OC(C)=O)CC3(C)C1(C)CCC1C2(C)CCC(O)C1C IECPWNUMDGFDKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N Novobiocin Natural products O1C(C)(C)C(OC)C(OC(N)=O)C(O)C1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 3
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 3
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 3
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 3
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 3
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 3
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 229960000740 enrofloxacin Drugs 0.000 description 3
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 3
- NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N nitrofurantoin Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N 0.000 description 3
- 229960002950 novobiocin Drugs 0.000 description 3
- YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N novobiocin Chemical compound O1C(C)(C)[C@H](OC)[C@@H](OC(N)=O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N 0.000 description 3
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 3
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 3
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 3
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Klindomitsin Chemical compound 0.000 description 2
- 239000004104 Oleandomycin Substances 0.000 description 2
- RZPAKFUAFGMUPI-UHFFFAOYSA-N Oleandomycin Natural products O1C(C)C(O)C(OC)CC1OC1C(C)C(=O)OC(C)C(C)C(O)C(C)C(=O)C2(OC2)CC(C)C(OC2C(C(CC(C)O2)N(C)C)O)C1C RZPAKFUAFGMUPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000002271 gyrase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 229960003907 linezolid Drugs 0.000 description 2
- TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N linezolid Chemical compound O=C1O[C@@H](CNC(=O)C)CN1C(C=C1F)=CC=C1N1CCOCC1 TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 229960002351 oleandomycin Drugs 0.000 description 2
- RZPAKFUAFGMUPI-KGIGTXTPSA-N oleandomycin Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@H](C)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@]2(OC2)C[C@H](C)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C RZPAKFUAFGMUPI-KGIGTXTPSA-N 0.000 description 2
- 235000019367 oleandomycin Nutrition 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- HJHVQCXHVMGZNC-JCJNLNMISA-M sodium;(2z)-2-[(3r,4s,5s,8s,9s,10s,11r,13r,14s,16s)-16-acetyloxy-3,11-dihydroxy-4,8,10,14-tetramethyl-2,3,4,5,6,7,9,11,12,13,15,16-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-ylidene]-6-methylhept-5-enoate Chemical compound [Na+].O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C([O-])=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C HJHVQCXHVMGZNC-JCJNLNMISA-M 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 2
- DECBQELQORZLLP-UAIOPKHMSA-N 1-[(e)-[(e)-3-(5-nitrofuran-2-yl)prop-2-enylidene]amino]imidazolidine-2,4-dione Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=C\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 DECBQELQORZLLP-UAIOPKHMSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100007857 Bacillus subtilis (strain 168) cspB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241001455617 Sula Species 0.000 description 1
- 101100355952 Vibrio cholerae serotype O1 (strain ATCC 39315 / El Tor Inaba N16961) rcp gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 101150110403 cspA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150068339 cspLA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150016744 ermC gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000308 fosfomycin Drugs 0.000 description 1
- YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N fosfomycin Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H]1P(O)(O)=O YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N 0.000 description 1
- 229960002375 furazidin Drugs 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical compound O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 101150022325 ibpA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к методам поиска антибактериальных веществ природного и синтетического происхождения с одновременным анализом механизма их действия, и может быть использовано для идентификации соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий. Генетическая конструкция содержит гены двух флюоресцентных белков с различимыми спектрами флюоресценции. Экспрессия одного из генов флюоресцентных белков активируется при остановке трансляции предшествующего ему генетически модифицированного аттенюатора триптофанового оперона Escherichia coli. Экспрессия второго гена активируется при дерепрессии предшествующего ему промотора гена sulA Escherichia coli. Генетическая конструкция представляет собой плазмиду, которой трансформируют клетки бактерий Е. coli для получения штамма-репортера Е. coli ΔtolC. Полученный штамм Е. coli ΔtolC позволяет проводить высокопроизводительный анализ (скрининг) большого количества веществ или смесей для поиска среди них антибактериальных веществ, с одновременным выявлением тех из них, которые ингибируют биосинтез белка и/или вызывают SOS-ответ на повреждения ДНК. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, белковой и генной инженерии. Сконструирована генетическая конструкция/рекомбинантная плазмидная ДНК pDualrep2, содержащая гены RFP, Katushka2S, bla кодирующие красный, дальнекрасный флюоресцентные белки и бета-лактамазу, которой можно трансформировать клетки бактерий для получения штамма-репортера. Рекомбинантный штамм позволяет проводить высокопроизводительный анализ (скрининг) большого количества веществ или смесей для поиска среди них антибактериальных веществ, с одновременным выявлением тех из них, которые ингибируют биосинтез белка и/или вызывают SOS-ответ на повреждения ДНК. Предложенная группа изобретений найдет применение в научно-исследовательских целях, а также фармацевтическими компаниями для поиска новых антибактериальных препаратов с заранее известной мишенью действия.
Уровень техники
Хотя в настоящее время на вооружении медицины стоит несколько эффективных классов антибактериальных препаратов, среди патогенных бактерий наблюдается непрерывный рост числа изолятов, устойчивых к тем или иным классам антибиотиков. Для поиска новых антибактериальных препаратов проводят высокопроизводительный скрининг как природных, так и синтетических соединений.
В настоящее время поиск антибактериальных препаратов природного происхождения проводится по традиционной схеме. Сначала широкий набор культуральных жидкостей почвенных микроорганизмов тестируется на антибактериальную активность. Затем из образцов, имеющих антибактериальную активность, выделяют активное соединение, проводят анализ его строения и только затем изучают механизм действия. Подобная схема далека от оптимальной. Наиболее трудоемкие стадии выделения и определения строения активного вещества приходится проводить для множества соединений, а изучение механизма действия приходится начинать «с чистого листа», не имея представления о том, на какой процесс может влиять данное антимикробное соединение. В случае скрининга химически синтезированных соединений отсутствуют стадии очистки и идентификации соединения, но механизм действия также приходится проводить «с чистого листа».
Для эффективного поиска антибиотиков с одновременным эффективным и дешевым определением механизма их действия необходима система автоматизации, позволяющая вместе с обнаружением антибактериальной активности сразу идентифицировать те соединения, которые действуют на определенную мишень, в данном случае, систему биосинтеза белка.
Из уровня техники известны генетические конструкции pCSS3, pPHOL и pCSS1, содержащие гены люцифераз под контролем промотора pL фага лямбда, предназначенные для выявления ингибиторов биосинтезеа белка (Lampinen, J.; Virta, М; Karp, М. Use of controlled luciferase expression to monitor chemicals affecting protein synthesis. Applied and environmental microbiology 1995, 61, 2981-2989). Недостатками указанных конструкций является то, что они неспособны отличить ингибиторы биосинтеза белка от ингибиторов других стадий экспрессии генов, например, ингибиторов биосинтеза РНК и не позволяют детектировать одновременно два механизма действия антибиотиков.
Из уровня техники известна генетическая конструкция TetLux1, содержащая ген люциферазы под контролем тетрациклинового промотора, предназначенная для выявления ингибиторов биосинтезеа РНК и белка (Galluzzi, L.; Karp, М. Amplified detection of transcriptional and translational inhibitors in bioluminescent Escherichia coli K-12. Journal of biomolecular screening 2003, 8, 340-346). Недостатками указанной конструкции является то, что она неспособна отличить ингибиторы биосинтеза белка от ингибиторов других стадий экспрессии генов, например, ингибиторов биосинтеза РНК и не позволяет детектировать одновременно два механизма действия антибиотиков.
Из уровня техники известны генетические конструкции pCSBG и pIBPBG, содержащие ген бета-галактозидазы под контролем промоторов cspA и ibpA, предназначенные для выявления ингибиторов биосинтеза белка (Bianchi, А.А.; Baneyx, F. Stress responses as a tool to detect and characterize the mode of action of antibacterial agents. Applied and environmental microbiology 1999, 65, 5023-5027). Недостатками указанных конструкций является то, что они чувствительны не только к ингибиторам биосинтеза белка, а ко всем соединениям, вызывающим в клетке реакцию на холодовой и тепловой шок, соответственно. Также они не позволяют детектировать одновременно два механизма действия антибиотиков.
Из уровня техники известны генетические конструкции ptetA-luc и ptetA-luxCDABE, содержащие гены люцифераз под контролем тетерациклин-индуцируемого промотора, предназначенные для выявления тетрациклинов (Kurittu, J.; Karp, М.; Korpela, М. Detection of tetracyclines with luminescent bacterial strains. Luminescence: the journal of biological and chemical luminescence 2000, 15, 291-297). Недостатками указанных конструкций является слишком узкая специфичность только к одной известной группе ингибиторов биосинтеза белка. Также они не позволяют детектировать одновременно два механизма действия антибиотиков.
Из уровня техники известны генетические конструкции pEBZ511, EBZ512, pEBZ514, содержащие гены люциферазы под контролем индуцируемого макролидами промотора mphA, предназначенные для выявления макролидных антибиотиков (Mohrle, V.; Stadler, М.; Eberz, G. Biosensor-guided screening for macrolides. Analytical and bioanalytical chemistry 2007, 388, 1117-1125). Недостатками указанных конструкций является слишком узкая специфичность только к одной известной группе ингибиторов биосинтеза белка и невозможность детектировать одновременно два механизма действия антибиотиков.
Из уровня техники известна генетическая конструкция pERMZα, содержащая ген бета-галактозидазы под контролем индуцируемого макролидами регуляторного элемента гена ermC, предназначенные для выявления макролидных антибиотиков (Bailey, М.; Chettiath, Т.; Mankin, A.S. Induction of erm(c) expression by noninducing antibiotics. Antimicrobial agents and chemotherapy 2008, 52, 866-874). Недостатком указанной конструкции является слишком узкая специфичность только к одной известной группе ингибиторов биосинтеза белка и невозможность детектировать одновременно два механизма действия антибиотиков.
Из уровня техники известна генетическая конструкция pRFPCER-TrpL2A, содержащая гены RFP и CER, предназначенная для выявления ингибиторов биосинтеза белка (Osterman, LA.; Prokhorova, I.V.; Sysoev, V.O.; Boykova, Y.V.; Efremenkova, O.V.; Svetlov, M.S.; Kolb, V.A.; Bogdanov, A.A.; Sergiev, P.V.; Dontsova, O.A. Attenuation-based dual-fluorescent-protein reporter for screening translation inhibitors. Antimicrobial agents and chemotherapy 2012, 56, 1774-1783). Было показано, что созданный таким образом репортер является функциональным, т.е. реагирует предсказуемым образом на изменение концентрации триптофана в среде. Замена кодонов триптофана на кодоны аланина привели к потере зависимости от концентрации триптофана.
Поскольку среди антибиотиков, повреждающих ДНК, есть клинически значимые, например, ингибиторы гиразы фторхинолоны, выявление подобных веществ было бы желательным при первичном скрининге антимикробных соединений. Использование двух разных репортеров для характеристики новых потенциальных антибиотиков потребовало бы проведения двух последовательных экспериментов, что в случае высокопроизводительного подхода двукратно увеличит расход материалов и времени. Создание одного репортера для детектирования и ингибиторов синтеза белка, и вызывающих повреждение ДНК позволило решить данную проблему.
В вышеупомянутой конструкции уже закодировано два флуоресцентных белка, экспрессия белка CER зависит от природы действующего антибиотика, в то время как экспрессия RFP постоянна. Поэтому использование этой конструкции позволяет обнаружить только антибиотики, имеющие один механизм действия. Введение промотера гена sulA перед геном RFP позволило сделать двойной репортер. Однако недостатком указанной конструкции является низкая чувствительность, не позволяющая детектировать некоторые классы ингибиторов биосинтеза белка, например тетрациклин, и невозможность детектировать одновременно два механизма действия антибиотиков. Также не оптимальным является выбор флюоресцентного белка CER, поскольку он флюоресцирует в области спектра, где высока фоновая флюоресценция среды.
Репортерные штаммы, основанные на репортерных генетических конструкциях, разработанных за рубежом (pCSS3, pPHOL, pCSS1, TetLux1, pCSBG, pIBPBG, ptetA-luc, ptetA-luxCDABE, pEBZ511, EBZ512, pEBZ514, pERMZα), не обладают либо специфичностью по отношению именно к ингибиторам биосинтеза белка, либо универсальностью по отношению к ингибиторам биосинтеза белка разных классов. Репортерный штамм, основанный на репортерной генетической конструкции, разработанной коллективом заявителей ранее, имеет меньшую чувствительность. Все известные ранее репортерные штаммы не позволяют проводить одновременную детекцию нескольких механизмов действия.
Поэтому до сих пор остается актуальной задача разработки конструкции, позволяющей одновременно детектировать как ингибиторы синтеза белка, так и вызывающих повреждение ДНК.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание генетической конструкции, позволяющей при трансформировании ее штамма получить штамм-репортер, клетки которого способны изменять свои легко детектируемые свойства при воздействии веществ, ингибирующих биосинтез белка.
Поставленная задача решается рекомбинантной плазмидной ДНК pDualrep2, предназначенной для идентификации соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий, включающей:
- ориджин репликации, способный поддерживать стабильное число копий плазмиды в клетке,
- селективный маркер для отбора клеток, содержащих плазмиду,
- гены флюоресцентных белков с различимыми спектрами флюоресценции RFP и Katushka2S;
- аттенюатор триптофанового оперона, в котором произведены замены триптофановых кодонов UGG на аланиновые кодоны GCG;
- промотор гена sulA Е. coli, активирующийся при инактивации репрессора SOS-ответа LexA;
при этом перед геном флюоресцентного белка Katushka2S находится аттенюатор триптофанового оперона, а перед геном флюоресцентного белка RFP поставлен промотор гена sulA Е. coli.
Предпочтительно, что рекомбинантная плазмида имеет размер 3961 нуклеотид.
Предпочтительно ориджин репликации выбирать из CloDF13, ColE1, p15a.
Предпочтительно селективный маркер выбирать из генов бета-лактамазы, аминогликозид фосфотрансферазы.
Поставленная задача также решается штаммом бактерий 
, трансформированным вышеуказанной плазмидой для идентификации соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий.
Техническим результатом предлагаемой группы изобретений является, то что созданный штамм обладает характеристиками универсальности по отношению к ингибиторам биосинтеза белка, а именно способен реагировать на широкий спектр химических соединений и способен выявлять новые классы соединений, объединенных мишенью - процессом биосинтеза белка.
Репортерный штамм способен сигнализировать о ингибировании продвижения рибосомы.
Изобретение позволяет на этапе скрининга, одновременно с выявлением антибактериальной активности, выявлять и механизм действия, из двух возможных - ингибирование биосинтеза белка или индукция SOS-ответа, вызываемая повреждениями ДНК, что ускоряет процедуру поиска потенциальных антибиотиков.
Кроме того, предложенная группа изобретений позволяет находить новые классы соединений, действующих на биосинтез белка, что имеет важное значение для понимания молекулярных механизмов этого биологического процесса.
Еще одним преимуществом предлагаемой группы изобретений является то, что при использовании заявляемой плазмиды требуется минимальное количество пипетирований и не требуется использование дорогих реактивов.
Изобретение предназначено для усовершенствования поиска новых антимикробных соединений, ингибирующих биосинтез белка и вызывающих SOS-ответ на повреждение ДНК, а также расширяет спектр представленных на рынке плазмид, позволяющих проводить идентификацию соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий.
Плазмида pDualrep2 содержит следующие части: ориджин репликации, способный поддерживать стабильное число копий плазмиды в клетке, например, CloDF13, ColE1, p15a, селективный маркер для отбора клеток, содержащих плазмиду, например, ген бета-лактамазы, аминогликозид фосфотрансферазы, гены флюоресцентных белков с различимыми спектрами флюоресценции, такие как RFP и Katushka2S. Перед геном флюоресцентного белка Katushka2S находится аттенюатор триптофанового оперона, в котором произведены замены триптофановых кодонов UGG на аланиновые кодоны GCG. Для сохранения вторичной структуры РНК аттенюатора были проведены дополнительные замены (Фиг. 2). Перед геном флюоресцентного белка RFP поставлен промотор гена sulA Е. coli, активирующийся при инактивации репрессора SOS-ответа LexA.
Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК характеризуется следующими признаками:
- имеет размер 3961 п.о.;
- содержит ген флюоресцентного белка RFP, экспрессирующийся при активации SOS-ответа на повреждения ДНК; расположен в области 94-787 п.о.;
- содержит промотор гена sulA Е. coli перед геном RFP. Промотор расположен перед геном RFP и необходим для экспрессии гена RFP при активации SOS-ответа на повреждения ДНК; расположен в области 1-93 п.о.;
- содержит терминатор транскрипции гена RFP; расположен в области 895-930 п.о.;
- содержит ген флюоресцентного белка Katushka2S, экспрессирующийся при ингибировании биосинтеза белка; расположен в области 1195-1935 п.о.;
- содержит аттенюатор оперона trpLEDCBA Е. coli, с заменами нуклеотидов 28-33 с tggtgg на gcggcg, а 61-65 с cacca на gccgc; необходим для транскрипции гена Katushka2S при ингибировании биосинтеза белка; расположен в области 1044-1194 п.о.;
- содержит терминатор транскрипции гена Katushka2S; расположен в области 1974-2009 п.о.;
- содержит генетический маркер: ген бета-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных клеток E. coli к ампициллину; расположен в области 2969-2109 п.о.;
- содержит ориджин репликации (ori pCDF), необходимый для стабильной репликации плазмиды в клетках Е. coli; расположен в области 3228-4 п.о.
При этом необходимо отметить, что порядок расположения участков плазмиды не имеет принципиального значения, важно только, чтобы перед геном флюоресцентного белка Katushka2S находится аттенюатор триптофанового оперона, а перед геном флюоресцентного белка RFP поставлен промотор гена sulA Е. Coli.
Активация экспрессии гена Katushka2S происходит при остановке работы рибосомы во время трансляции лидерного пептида, закодированного в аттенюаторном участке гена. Этот участок РНК может укладываться в два различных варианта вторичной структуры, один из которых способствует терминации транскрипции, а другой способствует продолжению транскрипции и приводит к экспрессии генов, следующих за аттенюаторным участком. То, какой вариант вторичной структуры в действительности будет сформирован, зависит от скорости движения рибосомы, транслирующей лидерный пептид.
В природном, немодифицированном, триптофановом аттенюаторе, при недостатке триптофана рибосома будет задерживаться на двух триптофановых кодонах лидерной области, что будет способствовать продолжению транскрипции. При этом будут экспрессироваться гены, отвечающие за биосинтез триптофана. Наоборот, если рибосома движется быстро, произойдет терминация транскрипции и экспрессия расположенных далее генов не будет наблюдаться.
Для ведения промотера гена sulA перед геном RFP в конструкцию pRFPCER-TrpL2A была поставлена ПЦР, заменяющая конститутивный Т5 промотер перед геном RFP на промотер гена sulA. Для этого использовались олигонуклеотиды: 
. Циркуляризация продукта ПЦР под действием ДНК лигазы привела к плазмиде pRFP-sulA/CER-TrpL2A.
В связи с различной абсолютной интенсивностью между RFP и CER (красный более яркий), используемых в прототипе, тяжело отличить случаи совместной индукции двух белков от просто индукции RFP. Для устранения вышеуказанных недостатков было решено перейти к автоматической детекции, например, при помощи системы ChemiDoc. В этом случае использование белка CER не представляется оптимальным, так как в канале Cy2, где детектируется этот белок, виден сильный фон среды LB. Было решено заменить ген CER на ген флюоресцентного белка Katushka2S, флюоресцирующем в дальне-красном диапазоне длин волн 588/633 нм. Ген CER был удален при помощи обработки плазмиды pRFP-su1A/CER-TrpL2A эндонуклеазами рестрикции NdeI и NaeI, последовательность белка Katushka2S была получена при помощи ПЦР с плазмиды pKatushka2S-B (Евроген). Схема плазмиды представлена на фиг. 1, а ее последовательность оформлена в виде приложения.
Полученная плазмида позволяет вдвое сократить трудоемкость, время и стоимость скрининга, поскольку можно одновременно идентифицировать как антибиотики, ингибирующие биосинтез белка, так и вызывающие SOS-ответ.
Поскольку RFP флюоресцирует в красном диапазоне 584/607 нм, а Katushka2S в дальне-красном 588/633 нм, для наглядности экспериментальные картинки, полученные с помощью системы, документирующей флюоресценцию, мы окрашивали в псевдоцвета -RFP в зеленый, Katushka2S в красный. Сканирование в каналах Cy3 и Cy5 позволяет независимо детектировать сигнал от белков RFP и Katushka2S. Совмещение картинок позволяет красочно визуализировать результаты сканирования для легкой сортировки антибиотиков по механизму действия.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена схема плазмиды pDualrep2.
На фиг. 2 представлена вторичная структура природного (вверху) генетически модифицированного (внизу) триптофанового аттенюатора.
На фиг. 3 представлены примеры секвенирования нуклеотидной последовательности плазмиды pDualrep2 с праймеров 
и 
На фиг. 4 представлены результаты тестирования антибиотиков с использованием плазмиды pDualrep2. Представлена чашка с агаром, на который нанесен газон штамма BW25113, трансформированный плазмидой pDualrep2 и образцы антибиотиков согласно подписям. Чашка отсканирована в каналах Cy3 (530/605 нм), Cy5 (625/695 нм) после 16 часовой инкубации при 37°C. Цифрой 1 обозначены результаты сканирования при 530/605 нм, а цифрой 2 при 625/695 нм.
На фиг. 5 представлены результаты тестирования различных количеств (обозначены на рисунке) эритромицина (ERY) и левофлоксацина (LEV) с использованием плазмиды pDualrep2 на основе штамма 
.
Осуществление изобретения
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C; Работа с бактериями проводились в условиях стерильности.
Химические символы имеют свои обычные значения: мкм (микрометр(ы)), мкл (микролитр(микролитры)), мкг (микрограмм(микрограммы)), M (моль(моли) на литр), л (литр(литры)), мл (миллилитр(миллилитры)), г (грамм(граммы)), мг (миллиграмм(миллиграммы)), моль(моли), ммоль (миллимоль(миллимоли)).
Используемые сокращения:
| Е. coli | Escherichia coli, кишечная палочка |
| sulA | ген ингибитора деления бактерий |
| ПЦР | полимеразная цепная реакция |
| SOC, LB, M9 | среды для выращивания бактерий |
| РНК | рибонуклеиновые кислоты |
| RFP | красный флюоресцирующий белок |
| CER | циановый флюоресцирующий белок |
| нм | нанометры |
| ДМСО | диметилсульфоксид |
| Katushka2S | дальне-красный флюоресцирующий белок |
| ChemiDoc | Документирующая система |
| bla | Ген бета-лактамазы |
| ДНК | дезоксирибонуклеиновые кислоты |
Трансформирование штамма плазмидой pDualrep2.
Ранее было показано, что оптимально для скрининга использовать штамм . Для трансформации необходимо приготовить компетентные клетки штамма (Sambrook J, Russell DW. The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: "ultra-competent" cells. CSH Protoc. 2006 Jun 1; 2006(1).). К 50-200 мкл компетентных клеток на льду добавить 10-200 нг плазмиды pDualrep2, инкубировать 30-60 минут на льду, затем нагреть до 42°C в течение 1-2 минут. После инкубации при 42°C добавить 0.5-1 мл среды LB и инкубировать при 37°C в течение 45-60 минут. После инкубации клетки необходимо высеять на агаризованную среду LB с ампициллином. Чашку инкубировать при 37°C в течение 18-24 часов. Одиночную колонию клеток 
, трансформированную pDualrep2 плазмидой, перенести в питательную среду с ампициллином и инкубировать при температуре 37°C при перемешивании (100 об/мин) 12-18 часов. К полученной суспензии клеток добавить 50 мл 50% стерильного (автоклавированного) раствора глицерина, разделить на аликвоты по 0,5 мл, заморозить и хранить при -20°C или использовать сразу. Трансформировав этот штамм разработанной конструкцией, была получена система для высокопроизводительного поиска ингибиторов синтеза белка и соединений, вызывающих повреждение ДНК.
Использование штамма 
, трансформированного плазмидой pDualrep2.
На реакционную плашку с репортерным штаммом pDualrep2 были нанесены диски с антибиотиками Эритромицин, Азитромицин, Кларитромицин, Рокситромицин, Линкомицин, Левомицетин (Хлорамфеникол), Рифампицин, Сульфаниламид, Полимиксин, Левофлоксацин, Тетрациклин, Канамицин, Неомицин, Тобрамицин, Стрептомицин, Клиндомицин, Фурадонин, Норфлоксацин, Энрофлоксацин, Новобиоцин, Олеандромицин, Сапонин, Фурагин, Цефазолин, Налидиксовая кислота, Фосфомицин, Фузидин, Амоксициллин, Карбенициллин и Бацитрацин (Фиг. 4). Чашки с дисками, пропитанными растворами антибиотиков, инкубировали 16 часов при 37°C и документировали с помощью ChemiDoc MP system с целью обнаружения колец флюоресценции по краям зоны ингибирования.
Рост репортерного штамма Е. coli ингибировали антибиотики Левофлоксацин, Полимиксин, Тетрациклин, Канамицин, Эритромицин, Неомицин, Левомицетин, Тобрамицин, Норфлоксацин, Фурадонин, Стрептомицин, Линезолид, Азитромицин, Линкомицин, Фурагин, Клиндамицин, Налидиксовая кислота, Фосфомицин, Энрофлоксацин. Не ингибировали рост бактерий и не вызывали индукции репортерного штамма Новобиоцин, Сульфаниламид, Сапонин, Цефазолин, Фузидин, Амоксициллин, Карбенициллин. Это свидетельствует о том, что клетки были устойчивы к данным антибиотикам. В случае амоксициллина и карбенициллина устойчивость объясняется маркером (bla) используемой плазмиды. Индукция репортерной конструкции без ингибирования роста клеток происходила для антибиотиков Кларитромицин, Рокситромицин, Олеандомицин, Рифампицин, Бацитрацин. Это обусловлено, по всей видимости тем, что антибиотики действовали на бактерию, но не достигали летальной концентрации.
Антибиотики, останавливающие трансляцию, Эритромицин, Азитромицин, Кларитромицин, Рокситромицин, Линкомицин, Левомицетин (Хлорамфеникол), Линкомицин и Тетрациклин вызывали индукцию репортерного гена Katushka2S. Антибиотики, не связанные с трансляцией не вызывали индукцию репортерного гена Katushka2S. Антибиотики, вызывающие ошибки трансляции, но не ее ингибирование, такие, как Канамицин, Неомицин, Тобрамицин и Стрептомицин не вызывали индукции репортерного гена Katushka2S. Таким образом, система поиска антибактериальных препаратов - веществ-ингибиторов биосинтеза белка действительно, позволяет детектировать ингибиторы биосинтеза белка, но не более общую категорию веществ, действующих на биосинтез белка. Антибиотики фторхинолонового ряда, вызывающие повреждение ДНК за счет ингибирования гиразы, Левофлоксацин, Налидиксовая кислота, Норфлоксацин, Энрофлоксацин, а также некоторые другие, вызывающие повреждение ДНК опосредованно, вызывали индукцию репортерного гена RFP, находящегося под контролем промотора sulA, активируемого SOS-системой.
Для определения чувствительности штамма , трансформированного плазмидой pDualrep2, на чашку Петри с агаризованной средой с репортерным штаммом pDualrep2 нанесли раствор эритромицина в количестве 50 мкг, 30 мкг, 15 мкг, 10 мкг, 5 мкг, 2 мкг, 1 мкг, а на другую чашку Петри с агаризованной средой с репортерным штаммом pDualrep2 нанесли раствор левофлоксацина в количестве 20 мкг, 10 мкг, 5 мкг, 3 мкг, 1.5 мкг, 1 мкг, 0.5 нг и инкубировали 16 часов при 37°C. Чашки Петри документировали с помощью ChemiDoc MP system целью обнаружения колец флюоресценции на длинах волн поглощения/испускания 625/695 нм и 530/605 по краям зоны ингибирования (Фиг. 5). Результаты подтвердили, что предел обнаружения такого ингибитора биосинтеза белка, как эритромицин менее 1 мкг, в то время, как предел обнаружения ингибитора гиразы левофлоксацина менее 0.5 нг.
Приведенные примеры конкретного осуществления изобретения и реализации назначения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, и подразумевают, что приведенные примеры не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.
Пример 1.
В конструкцию pRFPCER-TrpL2A при помощи полимеразной цепной реакции был введен промотер гена sulA перед геном RFP. Замена конститутивного Т5 промотера перед геном RFP на промотер гена sulA была сделана при помощи следующих о лигонуклеотидов:
RFP-sulA R 
RFP-sulA F 
Затем ген CER был заменен на ген дальнего красного белка Katushka2S. Ген CER был удален при помощи обработки плазмиды pRFP-sulA/CER-TrpL2A эндонуклеазами рестрикции NdeI и NaeI, последовательность белка Katushka2S была получена при помощи ПЦР с использованием олигонуклеотидов:
Katushka2S-NdeI F 
Katushka2S R 
с плазмиды pKatushka2S-B вектор (Евроген).
Полученная конструкция была названа pDuelrep2. Достоверность созданной конструкции была подтверждена при помощи секвенирования (фиг. 3).
Пример 2. Трансформация штамма плазмидой pDualrep2
Клетки штамма высеяли со стоков штрихом до образования отдельных колоний на чашку Петри с агаром. Отдельную колонию клеток поместили в 50 мл стерильной питательной среды LB в 250 мл колбе и инкубировали при температуре 18°C до оптической плотности А600 ~ 0.6. Культуру клеток выдержали в течение 10 мин во льду, перенесли в центрифужные пробирки 50 мл и осадили центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. Промыли осадок дважды буферным раствором ТВ (10 мМ PIPES, 15 мМ CaCl2, 250 мМ KCl, 55 мМ MnCl2 pH 6,7) и ресуспендировали в 4 мл этого раствора, разделили на аликвоты по 100 мкл, заморозили в жидком азоте и хранили при -80°C.
Для дальнейшего использования пробирку со 100 мкл компетентных клеток разморозили во льду, добавили 100 нг плазмиды pDualrep2, инкубировали 30 мин при 0°C. Затем прогрели смесь на водяной бане в течение 45 сек при 42°C, добавили 800 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°C. Трансформационную смесь высеяли на чашку Петри с агаром и ампицилином. Одиночную колонию клеток Е. coli AtolC трансформированную pDualrep2 плазмидой перенесли в 50 мл питательной среды с ампициллином и инкубировали при температуре 37°C при перемешивании (100 об/мин) 15 часов (допустимый диапазон 12-18 часов). К полученной суспензии клеток добавили 50 мл 50% стерильного (автоклавированного) раствора глицерина, разделили на аликвоты по 0,5 мл и заморозили, хранили при -20°C.
Пример 3. Тестирование соединений с помощью штамма AtolC, трансформированного плазмидой pDualrep2
Пробирку с 0,5 мл замороженной суспензии клеток репортерного штамма, полученной как указано в примере 2, смешали с 1,5 мл питательной среды LB с ампициллином и равномерно распределили по поверхности реакционной плашки. Дали высохнуть суспензии клеток.
К анализируемым веществам в 96-лучноных планшетах, по 1 мг в лунке, добавили по 200 мкл ДМСО при помощи роботизированной системы. Образцы перемешали 10 раз до полного растворения.
По 1 мкл тестируемых образцов нанесли на подготовленные на предыдущей стадии реакционные плашки при помощи роботизированной системы по 576 образцов на одну плашку. На свободное от тестируемых образцов место нанесли по 1 мкл контрольных растворов эритромицина и левофлоксацина. Образцам дали высохнуть. Чашки закрыли и выдерживали при 37°C в течение 16 ч.
В результате эксперимента получили реакционные плашки, покрытые газоном клеток с зонами ингибирования в местах нанесения антибиотиков. Полученные плашки сканировали при помощи системы гель документации ChemiDoc MP system при длинах волн флюоресценции 625/695 нм и 530/605 нм. По размеру зоны ингибирования (в мм) судили об эффективности антибиотика, по увеличению интенсивности флюоресценции на длинах волн 625/695 нм на границе зоны ингибирования детектировали действие антибиотика на биосинтез белка. Для контрольного антибиотика эритромицина (ингибирует биосинтез белка) было видно заметное увеличение флюоресценции на длинах волн 625/695 нм на границе зоны ингибирования, для левофлоксацина (ингибирует биосинтез ДНК) увеличение флюоресценции происходило на длинах волн 530/605 нм.
Результаты представлены в Таблице 1.
Рост репортерного штамма Е. coli ингибировали антибиотики Левофлоксацин, Полимиксин, Тетрациклин, Канамицин, Эритромицин, Неомицин, Левомицетин, Тобрамицин, Норфлоксацин, Фурадонин, Стрептомицин, Линезолид, Азитромицин, Линкомицин, Фурагин, Клиндамицин, Налидиксовая кислота, Фосфомицин, Энрофлоксацин. Не ингибировали рост бактерий и не вызывали индукции репортерного штамма Новобиоцин, Сульфаниламид, Сапонин, Цефазолин, Фузидин, Амоксициллин, Карбенициллин. Это свидетельствует о том, что клетки были устойчивы к данным антибиотикам. В случае амоксициллина и карбенициллина устойчивость объясняется маркером (bla) используемой плазмиды. Индукция репортерной конструкции без ингибирования роста клеток происходила для антибиотиков Кларитромицин, Рокситромицин, Олеандомицин, Рифампицин, Бацитрацин. Это обусловлено, по всей видимости, тем, что антибиотики действовали на бактерию, но не достигали летальной концентрации.
Антибиотики, останавливающие трансляцию, Эритромицин, Азитромицин, Кларитромицин, Рокситромицин, Линкомицин, Левомицетин (Хлорамфеникол), Линкомицин и Тетрациклин вызывали индукцию репортерного гена Katushka2S. Антибиотики, не связанные с трансляцией, не вызывали индукцию репортерного гена Katushka2S. Антибиотики, вызывающие ошибки трансляции, но не ее ингибирование, такие как Канамицин, Неомицин, Тобрамицин и Стрептомицин, не вызывали индукции репортерного гена Katushka2S. Таким образом, система поиска антибактериальных препаратов - веществ-ингибиторов биосинтеза белка действительно позволяет детектировать ингибиторы биосинтеза белка, но не более общую категорию веществ, действующих на биосинтез белка. Антибиотики фторхинолонового ряда, вызывающие повреждение ДНК за счет ингибирования гиразы, Левофлоксацин, Налидиксовая кислота, Норфлоксацин, Энрофлоксацин, а также некоторые другие, вызывающие повреждение ДНК опосредованно, вызывали индукцию репортерного гена RFP, находящегося под контролем промотора sulA, активируемого SOS-системой.
Результаты представлены на фото (см. фиг. 4 и 5).
Claims (11)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pDualrep2, предназначенная для идентификации соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий, включающая:
- ориджин репликации, способный поддерживать стабильное число копий плазмиды в клетке,
- селективный маркер для отбора клеток, содержащих плазмиду,
- гены флюоресцентных белков с различимыми спектрами флюоресценции RFP и Katushka2S;
- аттенюатор триптофанового оперона, в котором произведены замены триптофановых кодонов UGG на аланиновые кодоны GCG;
- промотор гена sulA Е. coli, активирующийся при инактивации репрессора SOS-ответа LexA;
при этом перед геном флюоресцентного белка Katushka2S находится аттенюатор триптофанового оперона, а перед геном флюоресцентного белка RFP поставлен промотор гена sulA Е. coli.
2. Рекомбинантная плазмида по п. 1, характеризующаяся тем, что она имеет размер 3961 нуклеотид.
3. Рекомбинантная плазмида по п. 1, характеризующаяся тем, что ориджин репликации выбран из CloDF13, ColE1, p15a.
4. Рекомбинантная плазмида по п. 1, характеризующаяся тем, что селективный маркер выбран из генов бета-лактамазы, аминогликозид фосфотрансферазы.
5. Штамм бактерий Е. coli ΔtolC, трансформированный плазмидой по п. 1 для идентификации соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016130354A RU2620074C1 (ru) | 2016-07-25 | 2016-07-25 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pDUALREP2 И ШТАММ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ЕЮ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ И СМЕСЕЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ БИОСИНТЕЗ БЕЛКА И/ИЛИ ВЫЗЫВАЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016130354A RU2620074C1 (ru) | 2016-07-25 | 2016-07-25 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pDUALREP2 И ШТАММ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ЕЮ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ И СМЕСЕЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ БИОСИНТЕЗ БЕЛКА И/ИЛИ ВЫЗЫВАЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2620074C1 true RU2620074C1 (ru) | 2017-05-22 |
Family
ID=58881245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016130354A RU2620074C1 (ru) | 2016-07-25 | 2016-07-25 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pDUALREP2 И ШТАММ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ЕЮ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ И СМЕСЕЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ БИОСИНТЕЗ БЕЛКА И/ИЛИ ВЫЗЫВАЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2620074C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687046C1 (ru) * | 2017-12-28 | 2019-05-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Биосенсор на основе клеток Escherichia coli, продуцирующих флуоресцентный белок Katushka2S, для проведения ультравысокопроизводительного скрининга |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2311459C2 (ru) * | 2005-11-14 | 2007-11-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ биохимии СО РАМН) | Рекомбинантная плазмидная днк для обнаружения агентов, повреждающих генетический аппарат клетки (варианты) |
| US20140087362A1 (en) * | 2012-03-16 | 2014-03-27 | Aladar A. Szalay | Methods for assessing effectiveness and monitoring oncolytic virus treatment |
-
2016
- 2016-07-25 RU RU2016130354A patent/RU2620074C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2311459C2 (ru) * | 2005-11-14 | 2007-11-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ биохимии СО РАМН) | Рекомбинантная плазмидная днк для обнаружения агентов, повреждающих генетический аппарат клетки (варианты) |
| US20140087362A1 (en) * | 2012-03-16 | 2014-03-27 | Aladar A. Szalay | Methods for assessing effectiveness and monitoring oncolytic virus treatment |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| OSTERMAN I.A. et al., Attenuation-based dual-fluorescent-protein reporter for screening translation inhibitors, Antimicrob. Agents Chemother., 2012, v.56,n.4,p.1774-1783. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687046C1 (ru) * | 2017-12-28 | 2019-05-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Биосенсор на основе клеток Escherichia coli, продуцирующих флуоресцентный белок Katushka2S, для проведения ультравысокопроизводительного скрининга |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Osterman et al. | Sorting out antibiotics' mechanisms of action: a double fluorescent protein reporter for high-throughput screening of ribosome and DNA biosynthesis inhibitors | |
| Osterman et al. | Attenuation-based dual-fluorescent-protein reporter for screening translation inhibitors | |
| US20100291564A1 (en) | Methods for Detection of Micro-Organisms | |
| US20090203017A1 (en) | Use of Nucleic Acid Probes to Detect Nucleotide Sequences of Interest in a Sample | |
| Kästle et al. | rRNA regulation during growth and under stringent conditions in S taphylococcus aureus | |
| US11518973B2 (en) | Device and method for automated antibiotic susceptibility testing of gram-negative bacteria | |
| Pogmore et al. | The Gram-positive model organism Bacillus subtilis does not form microscopically detectable cardiolipin-specific lipid domains | |
| RU2620074C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pDUALREP2 И ШТАММ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ЕЮ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ И СМЕСЕЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ БИОСИНТЕЗ БЕЛКА И/ИЛИ ВЫЗЫВАЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ | |
| KR20170030746A (ko) | Lamp를 이용한 살모넬라 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| US11168077B2 (en) | Molecular rotor-based D-amino acids as tools for imaging peptidoglycan biosynthesis | |
| Winterhalter et al. | SirA inhibits the essential DnaA: DnaD interaction to block helicase recruitment during Bacillus subtilis sporulation | |
| Matsiota-Bernard et al. | Detection of Legionella pneumophila DNA in urine and serum samples from patients with pneumonia | |
| CN100422340C (zh) | 分离和鉴别在含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能的方法 | |
| RU2802080C1 (ru) | Бесклеточная система синтеза белка на основе клеток Staphylococcus aureus, способ синтеза белка на основе клеток Staphylococcus aureus с использованием бесклеточной системы синтеза белка на основе клеток Staphylococcus aureus и способ выявления ингибиторов синтеза белка с ее использованием | |
| Filippova et al. | Lateral Flow Hybridization Assay to Determine Transcripts of TEM-Type Beta-Lactamase Genes in Bacteria Resistant to Antibiotics | |
| JP4414000B2 (ja) | バチルス株および抗生物質スクリーニング法 | |
| Chaudhuri et al. | Modified methods for simple and rapid detection of bacterial deoxyribonuclease production | |
| US20230257802A1 (en) | Dnazyme-based sensor for staphylococcus aureus | |
| JP2015504684A (ja) | アゾレダクターゼ活性による微生物のインビトロ検出 | |
| Chaparian et al. | Hierarchical transcriptional regulation of quorum-sensing genes in Vibrio harveyi | |
| RU2355760C1 (ru) | НАБОР lux-БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕТЕРГЕНТОВ ГИДРОФОБНОЙ ПРИРОДЫ В СРЕДЕ | |
| Smetana et al. | Monitoring Protein Stability In Vivo Using an Intein-Based Biosensor | |
| Poddar et al. | Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins | |
| US20210380929A1 (en) | Methods, apparatus and kits for bacterial cell lysis | |
| Treat et al. | In vivo Imaging and Tracking of VRE-microbiota Interactions via Anaerobic Fluorescent Reporters in Extremely Drug-resistant Bacteria |