RU2601128C2 - Animal model expressing luciferase under control of the myelin basic protein promoter (mbp-luci) and use of the model for bioluminescence in vivo imaging - Google Patents

Animal model expressing luciferase under control of the myelin basic protein promoter (mbp-luci) and use of the model for bioluminescence in vivo imaging Download PDF

Info

Publication number
RU2601128C2
RU2601128C2 RU2012130092A RU2012130092A RU2601128C2 RU 2601128 C2 RU2601128 C2 RU 2601128C2 RU 2012130092 A RU2012130092 A RU 2012130092A RU 2012130092 A RU2012130092 A RU 2012130092A RU 2601128 C2 RU2601128 C2 RU 2601128C2
Authority
RU
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
mbp
demyelination
mammal
model
human
Prior art date
Application number
RU2012130092A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2012130092A (en )
Inventor
Джеймс ЦАО
Карен ЧАНДРОСС
Кириякос Д. ЭКОНОМИДИС
Гарри Грегори ПОУЛИТС
Дэниел ВЕЙНСТОК
Сяою ИН
Original Assignee
Санофи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/05Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/20Animal model comprising regulated expression system
    • A01K2217/206Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00Animals characterised by species
    • A01K2227/10Mammal
    • A01K2227/105Murine
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03Animal model, e.g. for test or diseases
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393Animal model comprising a reporter system for screening tests

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to non-invasive visualization model based on luciferase under control of the myelin basic protein promoter for visualization and quantitative determination of demyelination events and remyelination in the central nervous system on transcription level in vivo. Luciferase expressing transgenic animals were created with myelin basic protein promoter (MBP), attached to the reporter - glow light's luciferase. Biovisualization model, MBP-luci, provides the agent for the myelination status monitoring and efficiency of the tested compounds, modulating remyelination. Advantage of biovisualization is that an individual in the long-term research can serve as its own control. One of the individual can be monitored during the process of demyelination and remyelination continuously for at least 10-weeks period. In addition, it is possible to reduce the number of the animals, required for the research of the compounds efficiency, due to absence of necessity of killing the longitudinal animals in different time points.
EFFECT: this model provides a possibility of the visualization response normalizing of individual animals and ensures quality data with significantly reduced variability.
11 cl, 24 dwg, 1 tbl

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ TECHNICAL FIELD

Настоящее изобретение относится к изготавливаемой модели биовизуализации люциферазы под контролем основного белка миелина (MBP-luci), используемой, например, для визуализации и количественного определения демиелинизации/ремиелинизации на уровне транскрипции в режиме реального времени на живых животных с использованием методик биовизуализации. The present invention relates to a manufactured model biovizualizatsii luciferase under control of the myelin basic protein (MBP-luci), used, e.g., for visualization and quantitation of demyelination / remyelination at the transcriptional level in real time in live animals using biovizualizatsii techniques.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ TECHNICAL FIELD

При разработке лекарственных средств степень потерь является высокой с учетом того, что только одно из пяти соединений проходит путь от разработки до разрешения к применению (DiMasi, JA, et al., J Health Econ 22,151-185). In drug loss ratio is high, given that only one of five compounds goes from development to permit the use (DiMasi, JA, et al. , J Health Econ 22,151-185). Более того, несмотря на значительно увеличившееся финансирование процент введения новых лекарственных средств на рынок остается относительно постоянным на протяжении последних 30 лет, с двумя-тремя веществами в новых классах лекарственных средств в итоге выходящими на рынок в год (Lindsay MA, Nature Rev Drug Discovery , 2, 831-838). Moreover, despite the considerable increase in funding percentage of the introduction of new drugs to market has remained relatively constant over the past 30 years, with two or three agents in new classes of drugs as a result of entering the market in the year (Lindsay MA, Nature Rev Drug Discovery , 2, 831-838).

Молекулярная и функциональная визуализация, используемая на начальных стадиях разработки лекарственных средств, может дать информацию о биологической активности и подтвердить мишеневые лекарственные эффекты. Molecular and functional imaging, used in the early stages of drug development, can provide information about the biological activity of the target and confirm medicinal effects. Соответственно ожидается, что вложения в технологию молекулярной визуализации улучшат разработку лекарственных соединений (Rudin M, et al., Progress in Drug Res , 2005, vol 62, 185-255). Accordingly, it is expected that molecular imaging technology attachment improve the development of drug compounds (Rudin M, et al., Progress in Drug Res, 2005, vol 62, 185-255). Преимущество методик молекулярной визуализации по сравнению с более общепринятыми способами получения данных состоит в том, что их можно проводить на интактном организме с достаточным пространственным и временным разрешением для изучения биологических процессов in vivo . The advantage of molecular imaging techniques in comparison with more conventional methods of obtaining the data is that they can be performed on the intact organism with sufficient spatial and temporal resolution for the study of biological processes in vivo. Кроме того, данные способы молекулярной визуализации позволяют повторное, неинвазивное, унифицированное и относительно автоматизированное исследование одного животного в различные точки времени, таким образом повышая статистическую мощность долгосрочных исследований и снижая требуемое число животных и стоимость исследований. In addition, these methods allow the repeated molecular imaging, non-invasive, relatively uniform and automated study of one animal at different points of time, thus increasing the statistical power of long-term research and reducing the number of animals required and the cost of research. Модель MBP-luci поддерживает как увеличение производительности первичного скрининга потенциальных лекарственных соединений in vivo , так и повышение чувствительности биологических анализов. Model MBP-luci supports both increased productivity primary screening of potential drug compounds in vivo, and increase sensitivity of biological assays. Исходные прототипные соединения часто неоптимальны в качестве лекарственных продуктов для продажи, однако детекция специфичной и значительной активности in vivo может повлечь оптимизацию химических структур для достижения приемлемого уровня активности и минимизации токсичности in vivo в отношении лечения определенных заболеваний ЦНС. The starting compounds are often not optimal prototype as medicinal products for sale, but the detection of specific and significant activity in vivo may involve optimization of chemical structures to achieve an acceptable level of activity and minimize toxicity in vivo in the treatment of certain CNS disorders.

Молекулярная визуализация molecular imaging

Молекулярная визуализация относится к объединению подходов из различных дисциплин (например, клеточной и молекулярной биологии, химии, медицины, фармакологии, физики, биоинформатики и инженерии) для использования и интеграции способов визуализации при оценке определенных молекулярных процессов на клеточном и субклеточном уровне в живом организме (Massoud TF, Genes Dev . 17:545-580). Molecular imaging refers to the unification of approaches from various disciplines (eg, cell and molecular biology, chemistry, medicine, pharmacology, physics, bioinformatics and engineering) for the use and integration of methods of visualization in the evaluation of specific molecular processes at the cellular and subcellular level in a living organism (Massoud TF, Genes Dev 17:. 545-580).

Возникновение генетической инженерии внесло, по-видимому, главные изменения в прикладную науку, включая, например, в направление поиска лекарственных средств. The emergence of genetic engineering has made, apparently, the main changes in the applied sciences, including, for example, in the direction of the search of drugs. Аналогичным образом, разработка и использование процедур визуализации на животных обеспечивает новое средство в области доклинических исследований (Maggie A, Ciana P. Nat. Rev. Drug Discvy . 4, 249-255). Similarly, development and use of imaging procedures on animals provides a new tool in the preclinical studies (Maggie A, Ciana P. Nat. Rev. Drug Discvy. 4, 249-255). Животные модели традиционно были трудоемкими вследствие сложности количественной оценки физиологических событий в реальном времени. Animal models have traditionally been time-consuming due to the complexity of quantifying physiological events in real time. Со временем были разработаны новые способы визуализации для преодоления данных сложностей (например, МРТ, КТ, ПЭТ). Over time, new imaging techniques to overcome these difficulties have been developed (eg, MRI, CT, PET). В последнее время для неинвазивной детекции активности генов-мишеней используют биолюминесцентную визуализацию на основе in vivo экспрессии люциферазы, светоизлучающего фермента светлячка. Recently, non-invasive detection of target gene activity using bioluminescence imaging on the basis of in vivo expression of luciferase, firefly light emitting enzyme.

В результате объединения генной инженерии животных со способами молекулярной визуализации стало возможным проводить динамические исследования определенных молекулярных процессов на живых животных. By combining genetic engineering of animals with the methods of molecular imaging it has become possible to perform dynamic studies of specific molecular processes in living animals. Этот подход мог бы потенциально оказать воздействие на протоколы доклинических исследований, таким образом, значительно меняя все аспекты медицины (Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci . 25, 337). This approach could potentially have an impact on the protocols of pre-clinical studies, thereby significantly changing all aspects of medicine (Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci. 25, 337).

Молекулярная визуализация: биолюминесцентная Molecular Imaging: bioluminescent

Биолюминесцентная визуализация in vivo (BLI) представляет собой чувствительный инструмент, основанный на детекции эмиссии света из клеток или тканей. Bioluminescent imaging in vivo (BLI) represents a sensitive tool based on the detection of light emission from the cells or tissues. Использование технологии репортерных генов делает возможным анализ определенных клеточных и биологических процессов в живом организме посредством способов визуализации in vivo . The use of reporter gene technology makes possible the analysis of certain cellular and biological processes in a living organism by visualization methods in vivo. Биолюминесценция, ферментативная выработка видимого света живым организмом, является природным феномером, наблюдаемым для многих видов животных, за исключением млекопитающих (Contag, CH, Mol. Microbiol . 18:593-603). Bioluminescence enzymatic production of visible light by a living organism is the natural fenomerom observed for many kinds of animals except mammals (Contag, CH, Mol Microbiol 18:.. 593-603). Люциферазы представляют собой ферменты, которые катализируют окисление субстрата, высвобождая фотоны света (Greer LFIII, Luminescence 17:43-74). Luciferases are enzymes that catalyze the oxidation of a substrate, releasing photons of light (Greer LFIII, Luminescence 17: 43-74). Наиболее широко используется биолюминесценция североамериканского светлячка. Most widely used North American firefly bioluminescence. При экспрессии гена люциферазы светлячка ( luc ) продуцируется фермент люцифераза, который превращает субстрат D-люциферин в нереакционноспособный оксилюциферин, в результате испуская зеленый свет при 562 нм. Upon expression of the firefly luciferase gene (luc) luciferase enzyme is produced, which turns the substrate D-luciferin to oxyluciferin unreactive, resulting in emission of green light at 562 nm. Вследствие того, что ткани млекопитающих обычно не испускают биолюминесценцию, in vivo BLI является перспективным методом, поскольку изображения можно получать с очень низким фоновым сигналом. Because the mammalian tissue is usually emit bioluminescence, in vivo BLI is a promising method, since images can be obtained with very low background signal.

BLI требует генетической инженерии клеток или тканей с использованием экспрессионной кассеты, состоящей из биолюминесцентного репортерного гена под контролем промотора выбранного гена, обеспечивающего экспрессию светового репортера (фиг. 1). BLI requires genetic engineering of cells or tissues using an expression cassette consisting of a bioluminescent reporter gene under the control of a promoter selected gene, providing the expression of the light reporter (FIG. 1). Для начала испускания света субстрат (например, люциферин) вводят с помощью интрацеребрально-вентрикулярной, внутрисосудистой, внутрибрюшинной или подкожной инъекции. To start the light emission substrate (e.g. luciferin) are administered via intracerebral-ventricular, intravascular, intraperitoneal or subcutaneous injection.

Свет, испускаемый люциферазой/люциферином способен проникать сквозь ткань толщиной от нескольких миллиметров до сантиметров; Light emitted by the luciferase / luciferin able to penetrate through the fabric thickness ranging from a few millimeters to centimeters; однако интенсивность потока фотонов снижается примерно в 10-раз на каждый сантиметр толщины ткани (Contag CH Mol. Microbio . 18: 593-603). however, the intensity of the photon flux is reduced approximately 10 times per cm of fabric thickness (Contag CH Mol Microbio 18:.. 593-603). Для детекции биолюминесценции in vivo необходимо использовать чувствительные инструменты светодетекции. For the detection of bioluminescence in vivo is necessary to use sensitive svetodetektsii tools. Детекторы измеряют число фотонов, испускаемых на единицу площади. The detectors measure the number of photons emitted per unit area. Низкий уровень света при длинах волн между 400 и 1000 нм можно детектировать с помощью камер с прибором с зарядовой связью (CCD), который превращает световые фотоны, ударяющие кремниевые пластины, в электроны (Spibey CP et al Electrophoresis 22:829-836). A low level of light at wavelengths between 400 and 1000 nm may be detected by cameras with charge-coupled device (CCD), which converts the light photons striking the silicon plate into electrons (Spibey CP et al Electrophoresis 22: 829-836). С помощью программного обеспечения можно конвертировать сигналы электронов в двумерное изображение. With software can convert electronic signals into two-dimensional image. С помощью программного обеспечения также можно количественно оценить интенсивность испускаемого света (число испускаемых фотонов, попадающих на детекторы) и превратить эти числовые величины в псевдоцветную графику. With software also can quantitatively evaluate the intensity of the emitted light (the number of emitted photons arriving at the detectors) and to convert these numeric values ​​in pseudocolor schedule. Фактические данные измеряются числом фотонов, но псевдоцветная графика обеспечивает возможность быстрой визуальной интерпретации. The actual data are measured number of photons, but false color graphics allows for quick visual interpretation. Количественные измерения в пределах области, представляющей интерес, могут быть необходимы для более тонких различий. Quantitative measurements within the region of interest, may be needed to more subtle differences. Использование охлаждаемых CCD-камер снижает температурный шум, а светонепроницаемый корпус позволяет оптимальную визуализацию и количественную оценку продуцируемого люциферазой света (Contag CH, Annu.Rev.Biomed.Eng . 4:235-260). Using a CCD-cooled chambers reduces thermal noise and light tight housing allows optimal visualization and quantification of produced luciferase light (Contag CH, Annu.Rev.Biomed.Eng 4:. 235-260).

Полезно иметь изображение люциферазного сигнала, наложенное на другой тип изображения, такой как автограф или радиоавтограф для анатомического положения испускаемого сигнала (фиг. 2). It is useful to have the image of the luciferase signal superimposed on the other image type, such as a signature or autoradiograph for anatomical position of the emitted signal (FIG. 2). Программное обеспечение осуществляет наложение изображений для визуализации и интерпретации. The software performs overlay images for visualization and interpretation.

Демиелинизирующее заболевание, олигодендроциты и основной белок миелина Demyelinating disease, oligodendrocytes and myelin basic protein

Основной белок миелина (МВР) требуется для нормального уплотнения и функционирования миелина. Myelin basic protein (MBP) is required for normal functioning of the seal and myelin. Совместно с гликопротеином миелина олигодендроцитов (MOG) и протеолипидным белком (PLP) эти белки составляют семейство структурных белков миелина и синтезируются клетками, продуцирующими миелин: олигодендроцитами в центральной нервной системе (ЦНС) и Шванновскими клетками в периферической нервной системе (ПНС). Together with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and proteolipid protein (PLP), these proteins constitute a family of structural proteins and synthesized myelin cells producing myelin: oligodendrocytes in the central nervous system (CNS), and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). В развивающейся ЦНС экспрессия МВР совпадает с временным периодом миелинизации. In the developing CNS of MBP expression coincides with the time period of myelination. Соответственно, в данной области МВР принят в качестве маркера созревания олигодендроцитов. Accordingly, those skilled in the TDM accepted as a marker of oligodendrocyte maturation. Высокий уровень экспрессии МВР (вместе с другими белками) совпадает с выработкой миелина, продолжается на всем протяжении миелиногенеза и снижается при разрушении аксона (Gupta et al. Brain Res . 464:133-141). High level expression of MBP (along with other proteins) coincides with the development of myelin continues throughout mielinogeneza and decreases in the destruction of the axon (Gupta et al Brain Res 464:.. 133-141).

Заболевания, которые влияют на целостность миелина приводят к нарушенной проводимости аксональных сигналов в затронутых нейронах и могут привести к нарушению восприятия, движения, познания или других функций в зависимости затронутых нейронов. Disorders that affect myelin integrity lead to impaired axonal conduction signals in affected neurons and may impair perception of movement, cognition or other functions depending on the affected neurons. Термин «демиелинизирующие заболевания» описывает эффект заболевания, а не его причину, и они могут быть вызваны генетическими причинами, инфекционными средствами, аутоиммунными реакциями и неизвестными факторами. The term "demyelinating disease" describes the effect of the disease rather than its cause, and they can be caused by genetic factors, infectious agents, autoimmune reactions, and unknown factors. Все эти заболевания остаются патологическими состояниями человека с огромной нереализованной необходимостью медицинского вмешательства, часто связанного с необходимостью восстановительных методов лечения. All these diseases are pathological condition of the person with enormous unrealized the need for medical intervention, often associated with the need for remedial treatment.

Демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы включают: central nervous system demyelinating diseases include:

- Рассеянный склероз (совместно с аналогичными заболеваниями, называемыми идиопатическими воспалительными демиелинизирующими заболеваниями); - Multiple sclerosis (together with the same disease called idiopathic inflammatory demyelinating disease);

- Поперечный миелит; - Transverse myelitis;

- Болезнь Девика; - Devic's disease;

- Прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию; - Progressive multifocal leukoencephalopathy;

- Оптический неврит; - optic neuritis;

- Лейкодистрофии; - leukodystrophy;

- Болезнь Пелицеуса-Мерцбахера; - Pelizaeus-Merzbacher disease;

- Дисфункцию/потерю миелина, также связанную с повреждением спинного мозга, болезнью Альцгеймера и Паркинсона и шизофренией. - Dysfunction / loss of myelin also associated with spinal cord injury, Alzheimer's and Parkinson's and schizophrenia.

Демиелинизирующие заболевания периферической нервной системы включают: peripheral nervous system demyelinating diseases include:

- Синдром Гийена-Барре и его хронический аналог, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию; - Guillain-Barré syndrome and its chronic counterpart, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy;

- Периферические нейропатии (вызываемые токсинами, диабетом анти-MAG, антителами и т.п.); - Peripheral neuropathy (caused by toxins, diabetes, anti-MAG, antibodies and the like);

- Болезнь Шарко-Мари-Тута. - The disease Charcot-Marie-Tooth disease.

In vivo модели демиелинизации In vivo model of demyelination

Общей стадией при разработке доклинических потенциальных соединений для борьбы с демиелинизирующими заболеваниями является оценка действия терапевтических потенциальных соединений на животных моделях, которые повторяют частично или полностью процесс демиелинизации, и которые обладают способностью к эндогенной ремиелинизации. A common step in the preclinical development of potential compounds for combating demyelinating diseases is to assess the potential therapeutic action of the compounds in animal models that mimic partially or fully demyelination process, and which have the ability to endogenous remyelination. Химически индуцированную демиелинизацию можно получить на животных моделях, и 6-8 недельные молодые самцы мышей восприимчивы к демиелинизации, получаемой в результате 4-6 недельной диеты, включающей 0,2%-ный купризон (бис-циклогексанон-оксалдигидразон) (Ludwin SK, 1978, Lab Invest 39: 597-612). Chemically induced demyelination can be obtained in animal models, and 6-8 week young male mice susceptible to demyelination of the resulting 4-6-week diet consisting of 0.2% kuprizon (bis-cyclohexanone-oksaldigidrazon) (Ludwin SK, 1978 , Lab Invest 39: 597-612). При воздействии купризона демиелинизация возникает по всему мозгу, но наиболее легко детектируется в области высокой концентрации белого вещества - мозолистом теле (Merkler et al., 2005, NMR Biomed 18: 395-403). When exposed kuprizona demyelination occurs throughout the brain, but is most readily detected in the high concentration of white matter - the corpus callosum (Merkler et al, 2005, NMR Biomed 18: 395-403.). Демиелинизация становится очевидной в течение 3 недель после начала диеты с купризоном. Demyelination becomes apparent within 3 weeks after the start of a diet kuprizonom. Замещение диеты нормальной пищей дает возможность практически полной ремиелинизации в течение 4-6 недель (Matsushima et al., 2001, Brain Pathol 11: 107-116). Replacement of normal food diet allows almost complete remyelination within 4-6 weeks (Matsushima et al, 2001, Brain Pathol 11:. 107-116). Иммуногистохимическое окрашивание аксональных повреждений с использованием белка-предшественника амилоида или импрегнации в серебро по Бильщовскому не выявляет значительных аксональных повреждений у 8-недельных мышей (Merkler). Immunohistochemical staining of axonal damage using amyloid precursor protein or silver by impregnation in Bilschovskomu reveals no significant axonal damage in 8-week-old mice (Merkler). Однако поперечное сечение аксонов значительно увеличивалось у 6-7 месячных мышей, частично способствуя задержке ремиелинизации, наблюдаемых у старых животных (Irvine KA, et al., 2006, J Neuroimmunol 175: 69-76). However, the cross-section of axons was significantly increased in mice, 6-7 month partially contributing delay remyelination observed in older animals (Irvine KA, et al, 2006, J Neuroimmunol 175:. 69-76). Количество клеток-предшественников олигодендроцитов, которые после дифференцировки замещают миелин, а также клеток микроглии и макрофагов, резко возрастает примерно через 4 недели на купризоновой диете и необходимо для эффективной ремиелинизации (Franco RJM, 2002, Nat Rev 3: 705-714). Number of oligodendrocyte progenitor cells which, after differentiation replaces myelin, as well as microglia and macrophage cells increases dramatically after about 4 weeks kuprizonovoy diet and is necessary for effective remyelination (Franco RJM, 2002, Nat Rev 3: 705-714).

Для количественной оценки измерений содержания миелина целый мозг или его субобласти можно выделить и провести оценку с помощью дот-блоттинга или Вестерн-блоттига. For quantification measurements of whole brain myelin or suboblasti can distinguish and evaluate by dot blotting or Western blotting. В альтернативном варианте, краткосрочный подход с высоким разрешением (относительно долгосрочного) для контроля субобластей потери и восстановления миелина включает количественную стереологию. Alternatively, the short-term approach to high resolution (relatively long) to control suboblastey myelin loss and recovery includes quantitative stereology. Например, компьютерную стереологическую систему (CAST) можно использовать для оценки измерения миелина, окрашенного люксолом быстрым синим (красителем миелина) в мозолистом теле. For example, computer system stereological (CAST) can be used to assess the measurement of myelin stained lyuksolom fast blue (myelin stain) in the corpus callosum. Толуидиновый синий и электронная микроскопия являются необходимыми конечными стадиями для гарантии того, что уплотненный миелин образует правильную оболочку ранее оголенных аксонов. Toluidine blue and electron microscopy are necessary final steps to ensure that the compacted myelin sheath forms a right previously denuded axons. В отношении долгосрочной оценки Т2-взвешенная МРТ является средством количественной оценки изменений миелина в мозолистом теле мышей на купризоновой диете (Sanofi-Aventis Neurology, 2008, неопубликованные данные). In the long-term evaluation of the T2-weighted MRI is a means of quantifying myelin changes in the corpus callosum of mice on a diet kuprizonovoy (Sanofi-Aventis Neurology, 2008, unpublished data).

Модель биовизуализации MBP-luci, которая отслеживает статус миелинизации in vivo в режиме реального времени Model biovizualizatsii MBP-luci, which monitors the status of myelination in vivo in real time

В статье 2003 года Farhadi et al. Article 2003 Farhadi et al. ( The Journal of Neuroscience , November 12, 2003, 23(32):10214-10223) было опубликовано, что промотор МВР содержит регуляторные элементы, четыре далеко отстоящих консервативных модуля, M1, M2, M3 и M4, размер которых находится в диапазоне 0,1-0,4 т.п.о., которые критичны для регуляции времени миелинизации и ремиелинизации (см. фиг. 1, 3 и 4). (The Journal of Neuroscience, November 12, 2003, 23 (32): 10214-10223) has been reported that MBP promoter comprises regulatory elements, four widely separated conservative modulus, M1, M2, M3 and M4, the size of which is in the range 0 , 1-0,4 kb, which are critical for the regulation time myelination and remyelination (see. Figs. 1, 3 and 4). С использованием Lac Z в качестве репортерного гена они продемонстрировали, что проксимальные модули M1 и M2 обеспечивают относительно низкий уровень экспрессии в олигодендроцитах в ходе развития ЦНС, в то время как расположенная выше (в 5'-направлении от них) М3-область обеспечивает высокий уровень экспрессии в олигодендроцитах в ходе развития ЦНС и в ЦНС взрослых животных. Using the Lac Z reporter gene as they demonstrated that the proximal modules M1 and M2 provide a relatively low level of expression in oligodendrocytes in the CNS development while located upstream (5 'direction from) an M3 region provides a high level expression in oligodendrocytes during development of the central nervous system and the central nervous system of adult animals. Более того, данная область М3 необходима для экспрессии в ходе ремиелинизации после демиелинизирующего повреждения. Moreover, this region is necessary for expression M3 during remyelination after demyelinating damage. М4 также обеспечивает экспрессию МВР в миелинизирующх Шванновских клетках. M4 also provides for expression of MBP mieliniziruyuschh Schwann cells.

Существующие способы с использованием животных моделей для оценки изменений в миелине in vivo являются затратными по времени, обычно занимающими 4-8 недель, и требуют большого числа животных. Existing methods using animal models to evaluate changes in myelin in vivo are time consuming, normally takes 4-8 weeks, and require large numbers of animals. МВР-промотор ДНК, который включает все 4 специфичные регуляторные области, экспрессирующий ген люциферазы, составляет основу трансгенной модели мыши биовизуализации MBP-luci, которая была разработана для отслеживания изменений в транскрипционной активности основного белка миелина (МВР) в мозге, спинном мозге и/или периферической нервной систем в режиме реального времени. MBP promoter DNA which includes all four specific regulatory regions expressing the luciferase gene, is the basis of transgenic mouse model biovizualizatsii MBP-luci, which has been developed to monitor changes in transcriptional activity of myelin basic protein (MBP) in the brain, spinal cord and / or peripheral nervous systems in real time. Эту трансгенную модель на грызунах можно использовать для in vitro и in vivo доказательства первичных исследований, направленных на отбор разрабатываемых кандидатов для лечения демиелинизирующих заболеваний человека, и она предлагает множество улучшений относительно существующих моделей: This transgenic rodent models can be used for in vitro and in vivo evidence of primary research focused on the selection of candidates under development for the treatment of demyelinating diseases in humans, and it offers a lot of improvements on existing models:

- Возможность неинвазивного отслеживания изменений в миелинизации нервной системы с помощью биолюминесценции снижает материальные и трудовые ресурсы, связанные с посмертными гистологическими анализами и анализами тканевой экспрессии. - The ability to non-invasively monitor changes in myelination of the nervous system by means of bioluminescence reduces material and labor associated with the post-mortem histological analyzes of tissue expression.

- Долгосрочные исследования значительно увеличивают чувствительность модели к изменениям в миелинизации. - Long-term studies significantly increase the sensitivity of the model to changes in myelination. В предшествующих методах анализа необходимо было использовать отдельные группы животных для каждой временной точки, и это ограничивало количество данных, которые можно было собрать в ходе исследования. In the foregoing analysis techniques separate groups of animals for each time point it was to be used, and this limited amount of data that can be collected during the study. Вводились дополнительные переменные из-за необходимости использования отдельных групп животных. Introduce additional variables because of the need for separate groups of animals.

- Данные биовизуализации обрабатываются быстро, обычно в течение того же дня, таким образом, позволяя регулирование (например, увеличение продолжительности исследования для достижения достоверности или более раннего окончания вследствие отсутствия влияния лекарственного соединения) для оптимизации схемы исследования и снижения ненужных затрат ресурсов. - Data biovizualizatsii processed quickly, usually within the same day, thereby allowing regulation (e.g., increase the duration of the study in order to achieve reliability or earlier closure due to lack of effect of the drug compound) to optimize circuit research and reducing unnecessary overhead.

- Группы животных и соответствующие воздействия можно оценивать в нулевой временной точке, что оптимизирует статистическую достоверность исследования, одновременно снижая число животных, необходимых на каждую группу воздействия. - Groups of animals and the corresponding effects can be evaluated at the zero time point, that optimizes the accuracy of the statistical research, while reducing the number of animals required for each exposure group. Данные исследований можно нормализовать на исходные значения, значительно снижая природную биологическую вариабельность, в тоже время обеспечивая более убедительные выводы по эффектам конкретных методов лечения. Research data can be normalized to the initial value, significantly reducing the natural biological variability, at the same time providing a more convincing conclusions on the effects of specific treatments.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ SUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к новой модели in vivo для оценки эффектов терапевтических соединений на степень демиелинизации (например, нейропротекцию, защиту миелина) и ремиелинизации (например, восстановление). The present invention relates to a novel in vivo model to assess the therapeutic effects of the compounds on the extent of demyelination (e.g., neuroprotection, protect myelin) and remyelination (e.g. restoration). Биовизуализация животных и способы скрининга соединений по настоящему изобретению позволяют скрининг и/или подтверждение первичной валидации фармацевтических соединений и других терапевтических агентов посредством получения в режиме реального времени соответствующих данных с высоким разрешением на живых животных. Biovizualizatsiya animals and methods for screening compounds of the present invention allow the screening and / or validation of the confirmation of the primary pharmaceutical compounds and other therapeutic agents by obtaining in real time the corresponding data with high resolution on live animals. Дополнительно, оценки можно получить относительно потенциальной токсичности, PK/PD и терапевтического окна, тем самым позволяя более точный прогноз в отношении дозировок для приматов и человека. Additionally, the estimates can be obtained with respect to potential toxicity, PK / PD and the therapeutic window, thereby allowing for more accurate forecasting of doses for primates and humans.

Настоящее изобретение относится к улучшенным инструментам и способам для изучения событий миелинизации с использованием живого трансгенного модельного организма. The present invention relates to improved methods and tools for studying myelination events using the transgenic model of the living organism. Изобретение снижает общее число требуемых индивидов по сравнению с другими моделями, поскольку каждый индивид может служить в качестве своего собственного базового контроля в долгосрочных исследованиях. The invention reduces the total number of required individuals, compared with other models because each individual can serve as its own baseline control in long-term studies. Таким образом, снижается вариабельность между организмами, повышая достоверность статистических результатов. This reduces variability among organisms, increasing the accuracy of statistical results. В различных аспектах изобретения достигаются различные преимущества. In various aspects of the invention different advantages are achieved. Несколько различных способов применения описаны в нижеследующем обсуждении. Several different methods of application are described in the following discussion.

Путем корреляции с экспрессией МВР настоящее изобретение обеспечивает способы мониторинга событий демиелинизации и/или ремиелинизации в живом модельном организме. By correlation with the expression of MBP, the present invention provides methods for monitoring events demyelination and / or remyelination in vivo model organism. Способ может включать трансгенно-модифицированные клетки-предшественники для получения модельного организма, в котором экспрессируется ген люциферазы под контролем МВР-промотора. The method may include transgenically modified progenitor cells to obtain a model organism in which the luciferase gene is expressed under the control of MBP promoter. Ген люциферазы при экспрессии может функционировать, продуцируя свет (биолюминесценция), в присутствии субстрата, такого как люциферин. Luciferase gene expression may be operated at, producing light (bioluminescence), in the presence of a substrate, such as luciferin. Миелинизирующую и демиелинизирующую активность можно оценить путем мониторинга биолюминесценции в организме. Myelinating and demyelinating activity may be assessed by monitoring bioluminescence in the body. Аппарат для визуализации и анализа предусматривает быструю корреляцию биолюминесценции и событий миелинизации относительно определенных участков тела организма. The device for the visualization and analysis provides a rapid correlation of bioluminescence and myelination events on specific areas of the body the body.

Для изучения событий в центральной и периферической нервной системе особенно подходящими модельными организмами являются позвоночные организмы, которые используют миелин в своей нервной ткани. In order to study the events in the central and peripheral nervous system particularly suitable model organisms are vertebrates that use myelin in their neural tissue. Млекопитающие являются организмами, которые используют миелин для усиления нейрональной проводимости как в ЦНС, так и ПНС. Mammals are organisms that are used to enhance the myelin neuronal conduction in the CNS and PNS. Общепринятые модели на млекопитающих, таких как грызуны (например, крысы, мыши), кролики, овцы, приматы, морские свинки и т.п., являются подходящими модельными организмами для использования в практическом применении настоящего изобретения. Conventional models on mammals such as rodents (e.g., rats, mice), rabbits, sheep, primates, guinea pigs, and the like are suitable model organisms for use in practicing the present invention.

Размер организма не является per se лимитирующим фактором. The body size is not per se a limiting factor. Однако размер аппарата можно оптимизировать к форме или размеру конкретного организма. However, the size of the device can be optimized to the shape or size of a particular organism.

Одно событие биовизуализации может обеспечить желаемую информацию. One biovizualizatsii event can provide the desired information. Однако преимущество настоящего изобретения относится к возможности повторять измерения одного животного в множестве временных точек и сравнивать данные множества измерений. However, the advantage of the present invention relates to the possibility of repeating the measurement of one animal in the plurality of time points and compare data sets of measurements. Один организм служит, таким образом, в качестве своего собственного контроля или базовой линии. One body thus serves as its own control or baseline.

Соответственно, возможна биовизуализация в течение одного или нескольких временных интервалов демиелинизации или ремиелинизации у одного организма. Accordingly, it is possible biovizualizatsiya during one or several time slots of demyelination or remyelination in one body. Более того, нормализация сигнала визуализации на протяжении интервалов демиелинизации или ремиелинизации, для которых визуализация на протяжении повторяющихся интервалов эффективна для детекции уровня транскрипта МВР в организме в течении одного или нескольких событий, обеспечивает более достоверные данные. Moreover, normalization imaging signal over intervals of demyelination or remyelination, for which imaging for repetitive intervals effective to detect transcript levels of MBP in the body for one or more events that provide more reliable data.

Биолюминесцентный сигнал ослабляется тканями тела. Bioluminescent signal is attenuated by body tissue. Соответственно, нервная ткань, ближайшая к поверхности тела, дает наиболее сильный сигнал. Accordingly, the nerve tissue closest to the body surface, provides the strongest signal. Сигнал на детекторе можно увеличивать, получая более высокий выход сигнала в результате внесения в реакцию большего количества люциферазы, например, используя более высокую концентрацию, или увеличивая активность фермента либо уровень экспрессии. The signal at the detector can be increased to obtain a higher output signal as a result of introduction into the reaction more luciferase, for example, using a higher concentration, or increasing the enzyme activity or expression level. Сбор данных также можно улучшить, используя более чувствительные детекторы. Data collection can also be improved by using a more sensitive detectors. Более чувствительные детекторы часто требуют охлаждающих аппаратов для получения достаточного уровня сигнала и для минимизации шума. More sensitive detectors often require cooling apparatus to obtain a sufficient signal level and to minimize noise. Время, в течение которого собирают данные, также служит для увеличения уровня сигнала. The time during which the collected data are also used to increase the signal level.

Модельным организмом по настоящему изобретению может быть трансгенное животное, содержащее ген люциферазы, который находится под контролем МВР-промотора. Model organism of the present invention may be a transgenic animal containing the luciferase gene which is under the control MBP promoter. Животным может быть млекопитающее, например, любое млекопитающее, используемое в качестве животной модели. Animals may be a mammal, e.g., any mammal, used as an animal model. Крысы и мыши являются общепринятыми животными моделями. Rats and mice are common animal models. Ген люциферазы под контролем МВР-промотора экспрессируется в определенных тканях-мишенях модели, когда промотор активируется или запускается Luciferase gene under the control of the MBP promoter expressed in certain tissues of the target model, when the promoter is activated or triggered

МВР-промотор может содержать М1-М3 или может содержать М1-М4. MBP promoter may comprise M1-M3 may comprise or M1-M4.

Сигнал можно усилить с помощью простых манипуляций, таких как выбор модели, чей волосяной покров меньше ослабляет сигнал. The signal can be enhanced by simple manipulation, such as the selection pattern whose scalp less attenuates the signal. Например, модель, чей волосяной покров меньше ослабляет сигнал по сравнению с мышами С57/В6, будет давать сигнал, превосходящий сигнал, получаемый от мышей С57/В6. For example, a model whose scalp less attenuates the signal compared to mice C57 / B6 will produce a signal exceeding a signal obtained from mice C57 / B6.

Настоящее изобретение также относится к способу разработки модельного организма для биовизуализации. The present invention also relates to a method for developing a model organism biovizualizatsii. Разработку можно осуществить, начиная, например, со штамма мышей и получая трансгенных животных, затем отбирая одну или несколько линий, у которых визуализация всей мыши in vivo на пике постнатальной миелинизации показывает, например, ЦНС-специфичную визуализацию; Development can be carried out, starting for example from a strain of mice and obtaining transgenic animals, then selecting one or more lines, whose whole mouse imaging in vivo at the peak shows postnatal myelination, such as CNS-specific visualization; затем отбирая одну или несколько линий, у которых визуализация ex vivo подтверждает экспрессию люциферазного трансгена в желаемой области, например, главным образом - в областях уплотненного белого вещества мозга. then selecting one or more lines, whose visualization ex vivo confirms expression of the luciferase transgene in the desired range, for example, mainly - in the densified areas of white matter of the brain. Затем можно отобрать одну или несколько линий, в которых интенсивность визуализации люциферазы четко коррелирует с изменениями в демиелинизации и ремиелинизации. You can then select one or more lines in which luciferase imaging intensity is strongly correlated with changes in demyelination and remyelination. Для улучшения данных можно отобрать одну или несколько линий, которые показывают ясную гистологическую демиелинизацию в ходе соответствующих манипуляций. To improve the data, you can select one or more lines, which show a clear histological demyelination in the relevant procedures.

Купризоновая модель демиелинизации подходит для использования с настоящим изобретением. Kuprizonovaya demyelination model is suitable for use with the present invention. Время проведения биовизуализации зависит от характеристик развития модельного организма, например, можно выбрать время, принимая во внимание то, что пик постнатальной миелинизации обычно приходится приблизительно на 3-5-ю неделю жизни мышей G1. Time of biovizualizatsii depends on the characteristics of a model organism, for example, can be chosen, taking into account the fact that the postnatal myelination peak usually have about 3-5-th week of life G1 mice.

Настоящее изобретение полезно для скрининга химических соединений, биологических соединений и других терапевтических элементов, которые могут влиять на миелиновые события в организме. The present invention is useful for screening chemical compounds, biological compounds of therapeutic and other elements that can affect myelin events in the body. Для влияния на миелиновые события соединение может модулировать экспрессию генов, или внутриклеточные либо межклеточные сигнальные события. To effect on myelin events compound may modulate gene expression or intracellular or intercellular signaling events. Эти примеры являются только некоторыми конкретными примерами и не должны рассматриваться в качестве полного объема изобретения, который описан в формуле. These examples are only some specific examples and should not be construed as the full scope of the invention as described in the claims.

Хотя МВР-промотор хорошо охарактеризован с использованием репортерного гена lac Z, как описано, например, Farhadi (см. выше), использование моделей MBP-lac Z ограничено вследствие требований к забору тканей и их фиксации для детекции β-галактозидазы (продукта репортерного гена lacZ ). Although MBP promoter is well characterized using the lac Z reporter gene, as described, e.g., Farhadi (cm. Above), the use of models MBP-lac Z is limited due to requirements for the fence tissues and their fixation to detect β-galactosidase (the product of the reporter lacZ gene ). Этот процесс требует гистохимических методик, несовместимых с детекцией в живых животных. This process requires histochemical techniques that are not compatible with the detection in live animals. Для того чтобы обойти эту проблему было предложено использование биолюминесцентных или флуоресцентных систем для создания трансгенной модели биовизуализации, в которой люциферазный или GFP-репортер избирательно контролируется крупными участками МВР-промотора. To get around this problem it was proposed to use bioluminescent or fluorescent systems for creating transgenic biovizualizatsii model in which a luciferase or GFP-reporter selectively controlled by large sections of MBP promoter.

Эта новая модель биовизуализации была разработана для визуализации и количественной оценки событий демиелинизации и/или ремиелинизации у живых животных, например, мышей, в режиме реального времени. This new model biovizualizatsii was developed to visualize and quantify demyelination events and / or remyelination in living animals, such as mice, in real time. Такой мониторинг можно использовать совместно с автоматизированными способами биовизуализации. Such monitoring can be used in conjunction with automated methods biovizualizatsii. Модель является полезным инструментом, например, для валидации мишени (например, когда модельных мышей для биовизуализации скрещивают с нокаутными и трансгенными мышами, имеющими желаемые признаки), а также для валидации соединений (например, для измерения эффективности соединения в модели, такой как купризоновый или экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит [EAE]) на сравнительной или количественной основе для принятия критических ключевых решений относительно выбора мишени и разработки соединений. The model is a useful tool, for example, for validation of the target (e.g., when a mouse model for biovizualizatsii crossed with knockout and transgenic mice with the desired characteristics), and also for the validation of the compounds (e.g., for measuring compound efficacy in the model, such as kuprizonovy or experimental autoimmune encephalomyelitis [EAE]) on a comparative or quantitative basis to make critical decisions on the selection of key target and develop compounds.

Настоящая модель биовизуализации (MBP-luci TG) была создана и использована для количественной оценки событий демиелинизации/ремиелинизации in vivo . This model biovizualizatsii (MBP-luci TG) was created and used to quantify the events demyelination / remyelination in vivo. Преимуществом модели биовизуализации является возможность проведения долгосрочных исследований, так что каждый организм может служить в качестве своего собственного контроля. The advantage of the model biovizualizatsii is the possibility of long-term studies, so that each body can serve as its own control. Таким образом, избегают умерщвления животных в определенных точках времени. Thus avoid killing animals at certain points of time. Можно постоянно отслеживать отдельных мышей на протяжении процесса демиелинизации и ремиелинизации. You can keep a track of individual mice during the process of demyelination and remyelination.

Способ биовизуализации требует меньше времени и ресурсов для отслеживания биологического ответа в живых мышах. Biovizualizatsii method requires less time and resources to monitor the biological response in living mice.

Краткое описание фигур BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

На фигуре 1 показана общая схема МВР-люциферазной трансгенной модели, которую используют для отслеживания изменений в экспрессии миелина в режиме реального времени. Figure 1 shows the general scheme of the ISI-luciferase transgenic model, which is used to track changes in the expression of myelin in real time.

На фигуре 2 показано, что эндогенный МВР-промотор имеет четыре элемента, которые дифференциально регулируют экспрессию МВР в олигодендроцитах в ходе развития животного и во взрослом состоянии. Figure 2 shows that MBP-endogenous promoter has four elements that differentially regulate the expression of MBP in oligodendrocytes during animal development and in adulthood. ( HF Farhadi: J.Neurosc. 2003, 23 (32), 10214-10223 ). (HF Farhadi: J.Neurosc 2003, 23 (32), 10214-10223.). M1/M2, оба регулируют транскрипты ранних постнатальных стадий. M1 / M2, both of transcripts regulated early postnatal stages. М3 вовлечен в транскрипционную регуляции экспрессии у зрелого животного. M3 is involved in transcriptional regulation of expression in the mature animal. М4 участвует в экспрессии транскриптов МВР в Шванновских клетках. M4 is involved in the expression of transcripts of MBP in Schwann cells. Структура трансгена MBP-luci имеет две формы МВР-промотора. Structure transgene MBP-luci has two forms MBP promoter. Линия 121 содержит элемент М4 и, как полагают, имеет экспрессию люциферазы в мозге, спинном мозге и периферической нервной системе. The line 121 comprises the M4 element and are believed to have a luciferase expression in brain, spinal cord and peripheral nervous system. Линия 171 состоит из более короткого МВР-промотора (например, лишена элемента М4), и люцифераза в ней экспрессируется главным образом в мозге, что подтверждено анализом биовизуализации. The line 171 consists of a short-MBP promoter (e.g., deprived of the M4 element), and luciferase therein is mainly expressed in the brain, which is confirmed by analysis biovizualizatsii.

На фигуре 3 показана кассета для экспрессии трансгена MBP-luci, включающая МВР-промотор с 5 т.п.о. Figure 3 shows a cassette for the expression transgene MBP-luci, MBP promoter comprising a 5 kb 5'-ДНК в векторе для экспрессии люциферазы. 5'-DNA vector for the expression of luciferase.

На фигуре 4 показана кассета для экспрессии трансгена MBP-luci, включающая МВР-промотор с 10 т.п.о. Figure 4 shows a cassette for the expression transgene MBP-luci, MBP promoter comprising 10 kb 5'-ДНК в векторе для экспрессии люциферазы. 5'-DNA vector for the expression of luciferase.

На фигуре 5 показан пример древа скрининга линии с трансгеном MBP-luci. Figure 5 shows an example of screening a line tree transgene MBP-luci.

На фигуре 6 показаны изображения сигнала люциферазы in vivo из скрининга первого уровня исходных животных с MBP-luci. Figure 6 shows an image of luciferase in vivo signal of the first level of screening animals starting with MBP-luci. Интенсивность люциферазы колеблется от 10 5 (+++) до 10 3 (+) (фотонов/см 2 /с). Luciferase intensity ranges from May 10 (+++) 10 3 (+) (photons / cm2 / s).

На фигуре 7 показан модельный организм, биовизуализацию которого проводили в семь недель (А) и в 10 месяцев (В), который иллюстрирует снижение интенсивности изображения сигнала люциферазы в мозге с возрастом, что коррелирует со снижением миелинизации, наблюдаемой после раннего постнатального развития. Figure 7 shows a model organism, which biovizualizatsiyu performed in seven weeks (A) and 10 months (B), which illustrates the reduction of luciferase image signal intensity in the brain with age, which correlates with a reduction in myelination observed after early postnatal development.

На фигуре 8 показана in vivo биовизуализация мышей MBP-luci. Figure 8 shows the in vivo mice biovizualizatsiya MBP-luci. Отрицательный трансген, мышь дикого типа (WT) находится слева с фоновой биолюминесценцией, измеренной в черепе (ROI: целевая область), которая равняется 2,7×10 3 фотонов/с. Negative transgene wild type mouse (WT) is left with the background bioluminescence measured in the skull (ROI: region of the target), which is equal to 2,7 × March 10 photons / sec. Справа представлена гетерозиготная мышь MBP-luci, и биолюминесценция в ROI равняется 1,327×10 5 фотонов/с. Right represented heterozygous mouse MBP-luci, bioluminescence and a ROI equal to 1,327 × May 10 photons / sec. Гомозиготная мышь MBP-luci представлена в центре с величиной биолюминесценции в ROI, составляющей 3,2924×10 5 фотонов/с, которая приблизительно превышает (как ожидалось) гетерозиготную величину в два раза. Homozygous mouse MBP-luci provided in the center with a bioluminescence value ROI, part 3,2924 × May 10 photons / s, which is greater than about (as expected) heterozygous value twice.

На фигуре 9 показана ЦНС-специфичная экспрессия люциферазы во времени. Figure 9 shows the CNS-specific expression of luciferase in time. Черепная биолюминесценция от MBP-luci-трансгенных мышей, как показано, снижается начиная с недели 4 (А и *) до недели 8 (В и **) и совпадает с уровнем транскриптов эндогенного МВР, определенных с помощью анализа Taqman (C). Cranial bioluminescence from MBP-luci-transgenic mice, as shown, reduced starting from week 4 (A and B *) to 8 weeks (B and **) and coincides with the level of transcripts of endogenous MBP determined using Taqman assay (C).

На фигуре 10 показана специфичная и субрегиональная экспрессия люциферазы в мыши MBP-luci. Figure 10 shows the specific subregional and expression of luciferase in mouse MBP-luci. Два сагиттальных среза (А и В) мозга трансгенной мыши MBP-luci с последующей биовизуализацией срезов выявили, что область мозолистого тела в мозге содержит наиболее интенсивный сигнал биолюминесценции и коррелирует с максимальной демиелинизацией и ремиелинизацией в модели поражения мозга, вызванного купризоном. Two sagittal sections (A and B) in the brain of transgenic mouse MBP-luci followed biovizualizatsiey slices revealed that the region of the corpus callosum in the brain contains the most intense bioluminescence signal and correlates with the maximum demyelination and remyelination in a model of brain damage caused by kuprizonom.

На фигуре 11 показана биовизуализация в модели MBP-luci и другие биологические ответы, которые, как известно, возникают при купризоновой диете. Figure 11 shows biovizualizatsiya model MBP-luci and other biological responses, which are known to occur when kuprizonovoy diet. В данном случае купризоновую диету поддерживали в течение четырех недель, и результаты биовизуализации и клеточных изменений показаны слева на графике. In this case, kuprizonovuyu diet was maintained for four weeks, and the results biovizualizatsii and cellular changes are shown in the graph on the left. Предполагается, что результаты еженедельной биовизуализации (указана стрелкой) изменяются параллельно уровню экспрессии эндогенного МВР (Matsushima GK and Morell P, Brain Pathology 11, 1-10, 2001). It is assumed that the results of the weekly biovizualizatsii (indicated by arrow) parallel to the change level of expression of endogenous MBP (Matsushima GK and Morell P, Brain Pathology 11, 1-10, 2001).

На фигуре 12 показаны изменения мРНК эндогенного МВР в ответ на непрерывное воздействие купризоновой диеты у мышей C57 BL/6J дикого типа. Figure 12 shows the changes of endogenous mRNA in response to MBP continuous exposure kuprizonovoy diet in mice C57 BL / 6J wild-type. 8-недельные мыши получали купризон в питании в течение интервала до 12 недель (закрашенные треугольники). 8 week old mice received kuprizon nutrition during an interval of 12 weeks (filled triangles). Во второй группе (незакрашенные треугольники) купризон из питания был убран через 6 недель, и мышам давали восстановиться в течение интервала до 6 дополнительных недель. In the second group (open triangles) kuprizon of power was removed after 6 weeks, and the mice allowed to recover in the interval of up to 6 additional weeks. Данные по уровню мРНК представляют собой однократное определение с помощью Нозерн-блоттинга и представлены относительно среднего из трех контролей (Jurevics H, et al., Journal of Neurochemistry , 2002, 82, 126-136). Data on the mRNA level are single determination by Northern blotting and presented relative to the average of the three controls (Jurevics H, et al., Journal of Neurochemistry, 2002, 82, 126-136).

На фигуре 13 показано продемонстрированное влияние купризоновой диеты на модель биовизуализации, MBP-luci. Figure 13 shows demonstrate the impact of diet on the model kuprizonovoy biovizualizatsii, MBP-luci. Сигнал визуализации может ясно имитировать профиль экспрессии эндогенного гена МВР. imaging signal can clearly mimic endogenous gene expression profile of the TDM. Наблюдается двух-трехкратное снижение сигнала визуализации на протяжении кормления пищей, содержащей купризон (от недели 0 до недели 4), а также трех-четырехкратное увеличение сигнала визуализации после отмены питания с купризоном (от недели 4 до недели 7). There is a two-threefold decrease imaging signal for feeding a diet containing kuprizon (from week 0 to week 4), and three-four-fold increase the visualization of the signal after cancellation supply kuprizonom (from week 4 to week 7).

На фигуре 14 показано окрашивание люксолом быстрым синим (LFB) мозолистого тела в модели MBP-luci. Figure 14 shows staining lyuksolom fast blue (LFB) of the corpus callosum in the MBP-luci model. Мыши получали либо купризон, либо нормальную пищу, в течение четырех недель, затем обе мыши были возвращены на обычную диету. Mice received either kuprizon or normal diet for four weeks, then both the mice were returned to their usual diet. Через 6 недель явную демиелинизацию в мозолистом теле (В) модели MBP-luci на купризоне можно было детектировать гистохимически с использованием окрашивания LFB по сравнению с группой на нормальной диете (А). After 6 weeks explicit demyelination in the corpus callosum (B) Model MBP-luci on kuprizone could be detected histochemically using LFB staining as compared to on normal diet group (A). Гистохимический анализ структурных изменений в миелинизации коррелировал с измерениями в сигнале биовизуализации у модели MBP-luci, получавшей воздействие. Histochemical analysis of structural changes in myelination correlated with measurements of the signal biovizualizatsii the model MBP-luci, receiving exposure.

На фигуре 15 показано, что действующее соединение - агонист рецептора дельта, активированного пролифератором пероксисом (PPARδ) (далее '517) - усиливает сигнал визуализации от люциферазы в линии 171 гетерозиготных мышей в течение периода спонтанной ремиелинизации. Figure 15 shows that the active compound - a delta receptor agonist, a peroxisome proliferator-activated (PPARδ) (hereinafter '517) - amplifies the imaging signal from the luciferase in line 171 heterozygous mice during the period of spontaneous remyelination. Восьминедельных мышей MBP-luci (линия 171 гетерозиготная, штамм B6C3H) помещали на диету, содержащую 0,2% купризона, в течение 4 недель, затем переводили на нормальную твердую диету, позволяя ремиелинизацию. Eight-week mice MBP-luci (line 171 heterozygous, B6C3H strain) were placed on a diet containing 0.2% kuprizona, for 4 weeks, then transferred to a normal solid diet, allowing remyelination. Мышам затем перорально вводили дважды в день либо носитель (0,6%-ную натриевую соль карбоксиметилцеллюллозы и 0,5%-ный Tween 80) или 30 мг/мг действующего соединения агониста PPARδ '517, в течение 8 дней в указанных временных точках. The mice were then orally administered twice a day with either vehicle (0.6% carboxymethylcellulose sodium salt cent and 0.5% Tween 80) or 30 mg / kg of active compound of agonist PPARδ '517, for 8 days at the indicated time points. Данные нормализовали по фоновым сигналам в нулевой неделе. The data were normalized to background signals in week zero. Действующее соединение '517 (n=12) вызывало 30-100%-ное относительное повышение сигнала люциферазы по сравнению с группой носителя (n=12), которое объясняли эффектом соединения на стимуляцию дифференцировки клеток-предшественников олигодендроцитов (например, в соответствии с данными in vitro ). The active compound '517 (n = 12) caused 30-100% relative increase bonus luciferase signal in comparison with the carrier group (n = 12), which explains the effect of the compound on the stimulation of the differentiation of oligodendrocyte precursor cells (e.g., in accordance with the data in vitro).

Фигура 16: действующее соединение агонист PPARδ, '517, усиливает окрашивание миелина люксолом быстрым синим (LFB) в течение фазы ремиелинизации (линия 171 гетерозиготная, штамм B6C3H). Figure 16: Active compound agonist PPARδ, '517, amplifies myelin staining lyuksolom fast blue (LFB) during remyelination phase (line 171 heterozygous, B6C3H strain). Парасагиттальные среды ткани фиксированного в формалине и заключенного в парафин мозга окрашивали LFB для качественной оценки миелина в мозолистом теле. Parasagittal environment tissue fixed in formalin and enclosed in paraffin brain stained with LFB for the qualitative evaluation of myelin in the corpus callosum. Окрашенные среды для каждой временной точки оценивали и выставляли баллы по шкале от 0 (полная миелинизация) до 5 (полная демиелинизация). Painted medium for each time point were evaluated and displayed on a scale of 0 (full myelination) to 5 (complete demyelination). Система оценки была следующая: 0 = нормальный миелин, демиелинизация отсутствует, 1 = минимальная, локальная демиелинизация, 2 = слабая до средней, локальная демиелинизация, 3 = средняя, местами интенсивная демиелинизация, 4 = тяжелая, местами интенсивная демиелинизация, 5 = тяжелая, диффузная демиелинизация. rating system was as follows: 0 = normal myelin, demyelination absent, 1 = minimum, local demyelination, 2 = weak to moderate local demyelination, 3 = medium, sometimes intense demyelination, 4 = severe, sometimes intense demyelination, 5 = severe, diffuse demyelination. Гистологическая оценка срезов LFB-окрашенного мозга мышей после 4 недель на купризоне подтвердила средне-тяжелую демиелинизацию мозолистого тела гетерозиготных мышей линии 171 (n=5). Histological evaluation of stained sections LFB-mouse brain after 4 weeks at kuprizone confirmed medium-heavy demyelination of the corpus callosum 171 heterozygous mice (n = 5). Обработка действующим соединением '517 (n=5) по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (n=3), с 4 по 5 неделю в течение фазы ремиелинизации привела к заметному увеличению количества миелина, определенному с помощью окрашивания LFB на 7-й неделе. Processing active compound '517 (n = 5) compared with the control group receiving vehicle (n = 3), 4 to 5 week for phase remyelination resulted in a marked increase in the number of myelin determined using LFB staining at week 7 . Несмотря на небольшое число животных в группах гистологические данные подтверждают in vivo данные биовизуализации люциферазы, указывая на увеличение ремиелинизации у мышей, обработанных соединением '517, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Despite the small number of animals in groups Histological data confirm the in vivo data biovizualizatsii luciferase, indicating an increase in remyelination in mice treated with a compound of '517, as compared with the control group treated with a carrier.

Фигура 17: агонист эстрогенового бета-рецептора (ERβ) (далее '5a) в количестве 30 мг/кг и положительный контроль Кветиапин в количестве 10 мг/кг обладают защитным действием в ходе фазы демиелинизации в купризоновой модели. Figure 17: the agonist estrogen receptor beta (ERβ) (hereinafter '5a) in an amount of 30 mg / kg and the positive control Quetiapine 10 mg / kg have a protective action during the phases in kuprizonovoy demyelination model. Гетерозиготные мыши B6C3H линии 171 MBP-luc получали купризоновую диету в течение 4 недель, и им перорально вводили '5a (10 мг/кг или 30 мг/кг) или положительный контроль Кветиапин (QTP). Heterozygous mice B6C3H line 171 MBP-luc prepared kuprizonovuyu diet for 4 weeks and were orally administered '5a (10 mg / kg or 30 mg / kg) or positive control quetiapine (QTP). Визуализацию мышей проводили в 0-ю неделю (базовая лини), данные 3-й недели и 4-й недели нормализовали на базовую линию 0-й недели. Imaging was performed in mice 0th week (base line) data 3rd week and 4 weeks were normalized to the baseline 0th week. Группа QTP показывала значительное увеличение сигнала при визуализации относительно контроля носителя для двух временных точек 3-й и 4-й недели в концентрации 10 мг/кг. QTP group showed a significant increase in signal with respect to imaging media control for two time points 3rd and 4th weeks at 10 mg / kg. Результаты для группы, получавшей воздействие QTP, соответствовали данным, опубликованным Yanbo Zhang et al. Results for the group receiving the impact of QTP, consistent with data published Yanbo Zhang et al. под названием «Quetiapine alleviates the cuprizone-induced white matter pathology in brain of C57BL/6 mouse» (Schizophrenia Research, 2008, Dec 106, 182-91). entitled «Quetiapine alleviates the cuprizone-induced white matter pathology in brain of C57BL / 6 mouse» (Schizophrenia Research, 2008, Dec 106, 182-91). Соединение '5a в количестве 30 мг/кг показывало усиленный сигнал по сравнению с носителем на 3-ю (тенденция) и 4-ю (достоверно) недели на купризоновой диете. Compound '5a in an amount of 30 mg / kg showed amplified signal is compared with a carrier in the third (trend) and 4th (significantly) kuprizonovoy weeks on diet. '5a в количестве 10 мг/кг не давало значительного эффекта ни на 3-й, ни на 4-й неделе. '5a in an amount of 10 mg / kg did not give any significant effect on the 3rd or the 4th week. Результаты позволяют предположить, что модель визуализации MBP-luci достаточно чувствительна для детекции дозозависимых изменений в купризоновой модели. The results suggest that the model to visualize the MBP-luci is sensitive enough to detect dose-dependent changes in kuprizonovoy model.

Фигура 18: группы, получавшие '5a (30 мг/кг) и QTP (10 мг/кг), имеют значительно более высокую активность трансгена по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, на 3-й и 4-й неделе. Figure 18: a group treated with '5a (30 mg / kg) and QTP (10 mg / kg), have a significantly higher activity of the transgene as compared to the control group that received a medium on the 3rd and 4th week. Данные модели визуализации подтверждают, что как QTP, так и '5a, ослабляют индуцированную купризоном демиелинизацию мозга и разрушение миелина. Data visualization model confirmed that both the QTP, and '5a, impaired brain kuprizonom induced demyelination and disruption of myelin.

На фигуре 19 показано сравнение сигнала визуализации купризоновой модели между гомозиготными и гетерозиготными мышами (B6C3H, линия 171). Figure 19 shows a comparison signal kuprizonovoy imaging model between homozygous and heterozygous mice (B6C3H, line 171). Поколение гетерозиготных мышей N3 скрещивали между собой для получения гомозиготных мышей по аллелю MBP-luci. Generation of heterozygous mice N3 intercrossed to obtain homozygous mice allele MBP-luci. Гомозиготные мыши показывали более чем двукратное окно сигнала биовизуализации относительно гомозиготных мышей в течение воздействия купризона. Homozygous mice showed more than twice biovizualizatsii signal window relative to homozygous mice during exposure kuprizona. Две копии репортерного гена у гомозигот показывали более чем двукратное снижение сигнала в течение фазы демиелинизации (например, после 4 недель на купризоновой диете) и двукратное увеличение сигнала в течение фазы ремиелинизации (например, через 1 неделю после отмены купризоновой диеты и возврата на нормальный твердый корм). Two copies of the reporter gene in homozygotes showed more than two-fold decrease in signal during demyelination phase (e.g., after 4 weeks kuprizonovoy diet) and a twofold increase in signal during remyelination phase (e.g., 1 week after withdrawal kuprizonovoy diet and return to normal solid feed ).

Хотя данные демонстрируют, что гетерозиготная линия 171 (штамм B6C3H) работает в купризоновой модели и может детектировать эффекты соединений, модель можно дополнительно улучшить скрещиванием до гомозиготности для усиления интенсивности сигнала биовизуализации. Although data indicate that heterozygous line 171 (B6C3H strain) operates in kuprizonovoy model and can detect the effects of the compounds, the model can be further improved by crossing to homozygosity to enhance signal intensity biovizualizatsii. Это также упрощает получение модели и снижает расходы на генотипирование, поскольку колонии мышей можно содержать как гомозиготные. This also simplifies the preparation of the model and reduces the cost of genotyping as mice colonies can contain both homozygous. В общем, большее окно визуализации может расширить детекции эффектов соединений в исследованиях характеристик фармакологических соединений. In general, increasing visualization window may extend for detecting effects of the compounds in the pharmacological characteristics of compounds studies.

Фигура 20: микрофотография мозолистого тела (темная продольная структура в квадратных скобках - 201) в парасагиттальном срезе ткани из фиксированного в формалине и заключенного в парафин мозга мыши, окрашенном LFB, демонстрирует оценку миелинового статуса области белого вещества. Figure 20: callosum photomicrograph (dark longitudinal structure in brackets - 201) in a parasagittal cut from tissue fixed in formalin, paraffin embedded mouse brain stained with LFB, demonstrates assessment status myelin of the white matter. Эту область использовали для количественного цифрового визуального анализа окрашивания люксолом быстрым синим (LFB) мозолистого тела. This area is used for the quantitative analysis of digital visual staining lyuksolom fast blue (LFB) callosum.

Фигура 21: сравнение окна визуализации и гистологического окна для трех различных линий MBP-luci (линия 171 B6C3H гетерозиготный штамм, линия 121 C57BL/6 гетерозиготный штамм и линия 171 B6C3H гомозиготный штамм). Figure 21: A comparison of histological visualization windows and windows for three different lines of MBP-luci (line 171 B6C3H heterozygous strain, line 121 C57BL / 6 strain heterozygous and homozygous line 171 B6C3H strain). Мышей помещали на диету, содержащую 0,2% купризона в течение 4 или 5 недель. Mice were placed on a diet containing 0.2% kuprizona for 4 or 5 weeks. Данные визуализации нормализовали на измерения базовой линии в 0-й неделе. imaging data were normalized to the baseline measurement in the 0-th week. В конце каждого исследования выделяли мозг мышей и серии парафиновых срезов окрашивали на миелин люксолом быстрым синим (LFB). At the end of each study, mice were isolated brain and a series of paraffin sections stained for myelin lyuksolom fast blue (LFB). В таблице приведены средние качественные оценки LFB-окрашивания (0-5). The table shows the average quality evaluation LFB-staining (0-5). Гомозиготные мыши линии 171 B6C3H демонстрировали максимальное снижение сигнала визуализации и также демонстрировали наиболее выраженную демиелинизацию, оценку которой проводили с помощью качественной гистологии. Homozygous mouse line 171 B6C3H demonstrated maximum reduction imaging signal, and also showed the most pronounced demyelination, which evaluation was performed by a qualitative histology. Гетерозиготные мыши линии 171 B6C3H показывали наименьшее окно визуализации и также наименьшую демиелинизации по гистологии на 4-й неделе. Heterozygous mice B6C3H line 171 showed the smallest visualization window and also the least demyelination of histology at the 4th week.

Фигура 22: Использование гомозиготных мышей линии 171 в купризоновой модели было дополнительно валидировано путем демонстрации ответа на воздействие кветиапина (QTP). Figure 22: Using mice homozygous line 171 kuprizonovoy model was further validated by demonstrating the response of the effect of Quetiapine (QTP). Мышей содержали на купризоновой диете в течение 5 недель, и одновременно они получали перорально ежедневно QTP (10 мг/кг). The mice are kept on kuprizonovoy diet for 5 weeks, and at the same time they received daily oral QTP (10 mg / kg). Визуализацию мышей проводили в 0-ю неделю (базовая линия), 3-ю и 5-ю неделю. Imaging was performed in mice 0th week (baseline), 3rd and 5th week. Данные нормализовали на измерения базовой линии в 0-й неделе. The data were normalized to the baseline measurement in the 0-th week. QTP (10 мг/кг) вызывал значительное повышение сигнала визуализации по сравнению с контролем (носителем) как на 3-й, так и на 4-й неделе. QTP (10 mg / kg) caused a significant increase imaging signal in comparison with control (vehicle) both the 3rd and the 4th week. Результаты соответствовали полученным на гетерозиготных мышах линии 171 (фигура 17 и 18). The results obtained corresponded to the heterozygous mice of the line 171 (Figure 17 and 18). Данные указывают на то, что гомозиготных мышей линии 171 можно использовать для оценки эффекта соединений на сохранение экспрессии и целостность миелина в купризоновой модели. The data indicate that mice homozygous line 171 can be used to assess the effect of compounds on the expression and integrity preservation myelin kuprizonovoy model.

Фигура 23: Ex vivo визуализация спинного мозга на мыши линии 121. Наложение люминесценции иллюстрирует, что экспрессия трансгена сосредоточена в областях белого вещества мозга и спинного мозга. Figure 23: Ex vivo imaging of the spinal cord in the mouse line 121. The imposition of luminescence shows that transgene expression is concentrated in the areas of the white matter of the brain and spinal cord. Это дополнительно поддерживает выводы, полученные из экспериментов по биовизуализации всего тела животного. This further supports the findings obtained from experiments on biovizualizatsii entire animal body.

Фигура 24: качественный анализ цифровых изображений окрашивания люксолом быстрым синим (LFB) мозолистого тела мышей C57Bl/6; Figure 24: The qualitative analysis of digital images staining lyuksolom fast blue (LFB) C57Bl / 6 mice callosum; дикого типа, гетерозиготной линии 171 и гомозиготной линии 171. Процентное значение площади с положительным LFB-окрашиванием в мозолистом теле вычисляли, используя алгоритм цветовой деконволюции Aperio® на вручную обведенных областях мозолистого тела на сканированных цифровых изображениях окрашенных слайдов. wild type, heterozygous and homozygous line 171 line 171. The area percentage value LFB-positive staining in the corpus callosum was calculated using the color deconvolution algorithm Aperio® manually circled areas of corpus callosum to the scanned digital images stained slides. Для каждого животного проводили количественную оценку одного среза. For each animal was performed quantify one slice. Число животных на группу варьировало от 9 до 10. Процентное содержание площадей, положительно окрашенных LFB, вычисляли для каждого животного и для групп. Number of animals per group ranged from 9 to 10. The percentage of area positively stained LFB, was calculated for each animal and for groups. Статистическую достоверность между группами вычисляли, используя парный t-тест. Statistical significance between groups was calculated using a paired t-test. И гомозиготные мыши линии 171, и мыши дикого типа C57 BL/6, демонстрировали сильную демиелинизацию (% положительного окрашивания составлял 40-60%) после 4 недель питания купризоном. And mice homozygous line 171, and mouse wild-type C57 BL / 6 exhibited strong demyelination (% positive staining was 40-60%) after 4 weeks of feeding kuprizonom. В отличие от этого, гетерозиготные мыши линии 171 демонстрировали только слабую демиелинизацию (% положительного окрашивания составлял 65-80%). In contrast, the heterozygous mouse lines 171 showed only mild demyelination (% positive staining was 65-80%). Поэтому, гомозиготные мыши линии 171 указаны в качестве предпочтительной линии для использования в модели демиелинизации, индуцированной купризоном. Therefore, homozygous mouse lines 171 are indicated as the preferred line for use in a model of demyelination induced kuprizonom.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ DESCRIPTION OF THE INVENTION

Следующие пять критериев были успешно применены последовательно для оптимизации отбора модели биовизуализации: The following five criteria have been successfully applied sequentially to optimize the selection biovizualizatsii model:

Определенные варианты осуществления можно создать на основе линий мышей, трансгенно-модифицированных либо векторами 5К, либо 10К, в соответствии с нижеследующим способом. Certain embodiments can be created on the basis of strains of mice, either transgenically modified vectors 5K or 10K in accordance with the following method. Результаты, описанные ниже, являются одним таким способом отбора, который начинался с 35 трансгенных линий. The results described below are one such selection method, which started with 35 transgenic lines. На фигуре 5 графически представлено краткое изложение этого способа. Figure 5 is a graphical representation of a summary of the process.

Из созданных трансгенных линий можно выбрать линии, в которых визуализация in vivo всего животного, например, мыши, на пике постнатальной миелинизации (например, на 3-5 неделе для мышей G1) дает ЦНС-специфичную визуализацию. Of created transgenic lines, you can select the line in which the in vivo visualization of the entire animal, such as a mouse, at the peak of postnatal myelination (eg, 3-5 weeks for G1 mice) gives the CNS-specific visualization. Шесть из отобранных 35 линий были выбраны для следующей стадии отбора. Six of the 35 selected lines were selected for the next stage of selection.

Затем были отобраны линии, в которых визуализация ex vivo подтверждает экспрессию люциферазного трансгена главным образом в области белого вещества мозга. Then lines were selected in which the ex vivo imaging confirms luciferase transgene expression primarily in the white matter of the brain. Пять из 6 линий из стадии 1 были отобраны для следующей стадии. Five out of six lines from step 1 were selected for the next step.

Затем были отобраны линии, у которых интенсивность визуализации люциферазы сильно коррелировала с изменениями в демиелинизации и ремиелинизации, индуцированными в этом примере модели демиелинизации с помощью купризона. It was then selected line in which the luciferase imaging intensity is strongly correlated with changes in demyelination and remyelination induced in this model of demyelination example via kuprizona. Три из 5 линий из стадии 2 были отобраны для следующей стадии. Three of the five lines from step 2 were selected for the next step.

Затем были отобраны линии, которые показывали явную гистологическую демиелинизацию в вышеуказанной купризоновой модели. Then there were the selected line, which showed clear histological demyelination in the above kuprizonovoy model. Две из 3 линий из стадии 3 были отобраны в качестве предпочтительных линий. Two of the three lines from step 3 were selected as the preferred lines.

В качестве итогового доказательства концепции авторы отобрали одну линию, в которой эффективность A003398711, PPARδ-селективного агониста, оптимально детектировалась в модели биовизуализации. As a final proof of concept we selected a line in which A003398711 efficiency, PPARδ-selective agonist, optimally detectable in biovizualizatsii model.

Типовая линия, названная «линия 171 (штамм B6C3, гетерозиготная)» была отобрана с использованием вышеуказанных пяти критериев и использована в качестве предпочтительной модели. Typical line, called "line 171 (strain B6C3, heterozygous)" has been selected using the above criteria and utilized five as the preferred pattern.

Более подробное описание этого способа описано в примерах ниже. A more detailed description of this method is described in the examples below.

Определения define

В контексте настоящего изобретения, если не указано иное, термины имеют значения, обычно используемые в научном языке, который может отличаться от общеупотребительного разговорного языка. In the present context, unless otherwise specified, terms have the meanings commonly used in scientific terms, which may differ from the spoken language commonly understood.

Ген следует истолковывать в широком смысле, включая транскрибируемые, а также нетранскрибируемые области. The gene to be construed in a broad sense, including transcribed and non-transcribed region.

Соединение следует истолковывать в широком смысле, включая химические соединения, например, органические химические молекулы, биологические соединения, например, антитела и антиген-узнающие фрагменты и конструкции, нуклеиновые кислоты, например, РНКи и т.п. The compound should be construed broadly, including chemical compounds, such as organic chemical molecules, organic compounds, such as antibodies and antigen-recognizing fragments and constructs, nucleic acids, e.g., RNAi, etc.

Были получены трансгенные мыши, в которых экспрессируется люцифераза светлячка. transgenic mice were generated in which firefly luciferase is expressed. У этих животных репортерный ген, ген люциферазы, соединен с МВР-промотором, таким образом, обеспечивающим экспрессию люциферазы в клетках области белого вещества (миелинизированной), например, ЦНС, при индукции экспрессии МВР. In these animals the reporter gene, the luciferase gene connected with MBP promoter, thus ensuring the expression of luciferase in cells of the white matter (myelinated), for example, central nervous system, induction of expression of MBP. Системная инъекция субстрата люциферина (внутривенная, внутрибрюшинная, подкожная) создает детектируемый и доступный для количественной оценки световой сигнал из головы живой мыши. Systemic substrate luciferin injection (intravenous, intraperitoneal, subcutaneous) produces a detectable and available for the quantification of the light signal from the head of a live mouse. Применяя купризоновую демиелинизирующую модель для отбора линий MBP-luci и повторно вводя с помощью инъекций этим животным люциферин можно периодически наблюдать и количественно оценивать демиелинизацию и ремиелинизацию посредством неинвазивной визуализации биолюминесценции во времени, например, в течение двухмесячного периода. Applying kuprizonovuyu model for demyelinating MBP-luci selection lines and repeatedly administered by injection these animals luciferin can periodically observe and quantitatively evaluate demyelination and remyelination by noninvasive imaging of bioluminescence over time, e.g., within two months. С помощью этой модели был успешно осуществлен количественный мониторинг индуцированной купризоном демиелинизации и индуцированной соединением PPARδ ремиелинизации. This model has been successfully implemented quantitative monitoring kuprizonom induced demyelination and remyelination induced compound PPARδ.

Успехи в технологии детекторов привели к значительному улучшению чувствительности и качества изображения. Advances in detector technology have led to a significant improvement in sensitivity and image quality. Фотоны на сегодняшний день детектируют с помощью специализированных камер с прибором с зарядовой связью (CCD), который превращает световые фотоны, ударяющие кремниевые пластины, в электроны. Photons currently detected by the specialized cells with a charge coupled device (CCD), which converts the light photons striking the wafers, into electrons. CCD-камеры пространственно кодируют интенсивность падающих фотонов в профили электрических зарядов, которые затем обрабатываются, создавая изображение. CCD-camera spatially encode the intensity of incident photons into electric charges profiles, which are then processed to create an image. Шум снижают путем интенсивного охлаждения CCD-камеры и установки камеры в светонепроницаемый корпус. Noise is reduced by intensive cooling CCD-cameras and camera settings in a lightproof housing. Эти камеры обычно управляются компьютером в ходе получения и анализа изображения. These cameras are generally computer controlled during the preparation and analysis of the image. Системы камер второго поколения, которые имеют гораздо меньший размер, и, поэтому, могут располагаться на лабораторных столах, сделали технологию реализуемой и практичной для ежедневных экспериментов. Systems of the second generation chamber which have a much smaller size, and therefore may be located on laboratory tables, made realizable technology and practical for daily experiments. Компания Xenogene имеет в продаже технологию биовизуализации. The company has Xenogene sale biovizualizatsii technology.

Наличие средств визуализации обусловило возникновение оптических методик, основанных на биолюминесценции или флуоресценции, как наиболее доступных и легких в обращении. Having determined the occurrence renderers optical methods based on bioluminescence or fluorescence, as the most available and easy to handle. Биолюминесцентная визуализация (BLI) отличается заметной чувствительностью, поскольку фоновая люминесценция (шум) от тканей является чрезвычайно низкой. Bioluminescent imaging (BLI) differs appreciable sensitivity since the background luminescence (noise) is extremely low from the tissues. На сегодняшний день BLI успешно использовали для наблюдений за биологическими процессами, такими как клеточное движение, развитие опухолей, экспрессия генов и вирусная инфекция, на множестве животных моделей. To date, BLI successfully used for biological processes of observation, such as cell movement, tumor development, gene expression and viral infection on the set of animal models.

Люцифераза светлячка требует внутриклеточных кофакторов, таких как АТФ, для активности. Firefly luciferase requires intracellular cofactors such as ATP for the activity. Это ограничивает ее использование клетками, которые были генно-инженерно модифицированы для экспрессии фермента. This limits its use cells that have been genetically modified for the expression of the enzyme. В результате, множество полезных применений визуализации, например, мониторинг распределения циркулирующих факторов, детекция экспрессии внеклеточных антигенов и мечение эндогенных клеток, не подходят для визуализации с использованием люциферазы светлячка. As a result, many useful imaging applications, e.g., monitoring the distribution of circulating factors, detection of expression of extracellular antigens and labeling of endogenous cells are not suitable for imaging using firefly luciferase. Дополнительным недостатком люциферазы светлячка является отсутствие альтернативных субстратов для детекции ее в фиксированных образцах клеток и тканей. An additional drawback is the absence of firefly luciferase alternative substrates for its detection in fixed tissue samples and cells. Это создает трудности в корреляции in vivo визуализации и микроскопического анализа. This creates difficulties in the correlation in vivo imaging and microscopic analysis.

Чувствительность детекции света, выделяемого из внутренних органов зависит от нескольких факторов, включая уровень экспрессии люциферазы, глубину меченных клеток в организме (расстояние, которое фотоны должны пройти сквозь ткань) и чувствительность системы детекции. The sensitivity of the detection light emitted from the internal organs is dependent on several factors, including the level of luciferase expression, the depth of labeled cells in the body (the distance that the photons must pass through the tissue) and the sensitivity of the detection system.

Описан мониторинг экспрессии кассет для экспрессии люциферазного репортера с использованием неинвазиной визуализации всего животного (Contag, C., патент США № 5650135, 22 июля, 1997, включен в настоящее описание в качестве ссылки; Contag, P., et al., Nature Medicine 4(2):245-247, 1998; Contag, C., et al., O SA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3:220-224, 1996; Contag, CH, Photochemistry and Photobiology 66(4):523-531, 1997; Contag, CH, et al., Molecular Microbiology 18(4):593-603, 1995). Described monitoring expression cassettes for the expression of the luciferase reporter using neinvazinoy whole animal imaging (Contag, C., U.S. Patent № 5,650,135, July 22, 1997, incorporated herein by reference; Contag, P., et al, Nature Medicine 4. (2): 245-247, 1998; Contag, C., et al, O SA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3:. 220-224, 1996; Contag, CH, Photochemistry and Photobiology 66 (4): 523- 531, 1997; Contag, CH, et al, Molecular Microbiology 18 (4): 593-603, 1995).. В такой визуализации обычно используют по меньшей мере один элемент фотодетекторного устройства, например, камеру с прибором с зарядовой связью (CCD). In such imaging is usually used at least one element of the photodetection device, such as a camera with charge-coupled device (CCD).

Контрольные элементы МВР-гена Control elements MBP gene

Основные белки миелина (МВР) представляют собой семейство полипептидов, которые в основном экспрессируются в нервной системе, где они исполняют главную роль в миелинизации. Myelin basic proteins (MBP) represent a family of polypeptides which are expressed mainly in the nervous system, where they play a major role in myelination. Экспрессия МВР, например, в дифференцирующихся олигодендроцитах, в основном регулируется на транскрипционном уровне. Expression of the MBP, for example, in differentiating oligodendrocytes, is mainly regulated at the transcriptional level. В Journal of Neuroscience Farhadi et al. The Journal of Neuroscience Farhadi et al. описывали новый регуляторный комбинаторный элемент, который контролирует экспрессию гена МВР во времени. describe new combinatorial regulatory element that controls the expression of MBP gene in time.

Farhadi et al. Farhadi et al. показали, что в глии используются различные комбинации регуляторных последовательностей для контроля экспрессии МВР на различных стадиях в течение и после начала миелинизации. showed that in glia, various combinations of regulatory sequences for control of expression of MBP at various stages during and after the onset of myelination.

Основной белок миелина (МВР) требуется для нормального уплотнения миелина и вовлечен как в экспериментальные, так и в возникающие у человека демиелинизирующие заболевания, такие как множественный склероз. myelin (MBP) protein main seals required for normal myelin and is involved in both experimental and occurring in a human demyelinating diseases such as multiple sclerosis.

Для дальнейших успехов в понимании биологии миелина и для тестирования соединений, увеличивающих количество миелина, в живых организмах. For further progress in understanding the biology of myelin and for testing compounds that increase the amount of myelin in living organisms. В настоящем изобретение использовали свойства МВР-промотора и наиболее чувствительную люциферазную репортерную технологию для создания настоящей модели MBP-luci. In the present invention was used properties MBP promoter and the luciferase reporter most sensitive technology to create this model MBP-luci. В данный момент модель позволяет чувствительные in vivo измерения транскрипционных ответов гена миелина в живых животных. Currently model allows sensitive in vivo measure of transcriptional responses myelin gene in living animals.

Конструирование репортерных кассет MBP-luci Construction of reporter cassettes MBP-luci

Проводили скрининг ВАС-библиотеки 129SvEv (Cell & Molecular Technologies) с пробой, расположенной в М3-области МВР-промотора. Were screened BAC library 129SvEv (Cell & Molecular Technologies) with a probe disposed in an M3 field MBP promoter. Проба составляла 507 п.о. The sample was 507 bp и была получена с парой праймеров (5'-actccttaccacacttcttgcagg-3' и 5'-tctattgggtgatgtgtgccatc-3). and it was obtained with a pair of primers (5'-actccttaccacacttcttgcagg-3 'and 5'-tctattgggtgatgtgtgccatc-3). ВАС-клоны МВР (SEQ ID NO:1 и 2) были подтверждены с этой же пробой с помощью Саузерн-анализа (фрагмент 7,6 т.п.о. после расщепления EcoRI и/или 13,8 т.п.о. после расщепления BamHI). BAC clones MBP (SEQ ID NO: 1 and 2) were confirmed with the same breakdown by Southern analysis (7.6 kb fragment after EcoRI digestion and / or 13.8 kb after BamHI cleavage).

«Длинный» МВР-промотор, содержащий М1-М4 (10 т.п.о.), амплифицированный с помощью высокоточной ПЦР с набором праймеров (MBP-L-SP2 5-gggggatccacctgggacgtagcttttgctg и MBP-AP1 5-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg) (SEQ ID NO:3 и 4), клонировали в вектор xl-topo (Invitrogen), получая промежуточный вектор (вектор Topo MBP10k). "Long" MBP promoter containing M1-M4 (10 kbp) was amplified using high-precision PCR with primer set (MBP-L-SP2 5-gggggatccacctgggacgtagcttttgctg and MBP-AP1 5-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg) (SEQ ID NO 3 and 4) cloned into vector xl-topo (Invitrogen), to give an intermediate vector (vector Topo MBP10k). Затем промотор MBP 10 т.п.о. Then 10 kb promoter MBP (фрагмент BamH1-PmeI) встраивали в вектор pGL3 hygro/neo (по сайтам BglII и PmeI). (BamH1-PmeI fragment) was inserted into the vector pGL3 hygro / neo (the sites BglII and PmeI). Итоговый вектор с фрагментом 10 т.п.о. Total vector with a fragment of 10 kb был назван pGL3-hygro-long MBP-luci (см., например, фиг. 4). was named pGL3-hygro-long MBP-luci (see., e.g., FIG. 4).

«Короткий» МВР-промотор, содержащий М1-М3 (5 т.п.о.), амплифицированный с помощью высокоточной ПЦР с набором праймеров (MBP-S-SP2 5-gggggatccatccctggatgcctcagaagag и MBP-AP1 5-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg) (SEQ ID NO:5 и 6) клонировали в вектор p2.1-topo (Invitrogen), получая промежуточный вектор (вектор Topo MBP5k). The "short" TDM-promoter containing M1-M3 (5 kbp) was amplified using high-precision PCR with primer set (MBP-S-SP2 5-gggggatccatccctggatgcctcagaagag and MBP-AP1 5-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg) (SEQ ID NO 5 and 6) were cloned into the vector p2.1-topo (Invitrogen), to give an intermediate vector (vector Topo MBP5k). Затем промотор MBP 5 т.п.о. Then MBP promoter 5 kb (фрагмент BamH1-PmeI) встраивали в вектор pGL3 hygro/neo (по сайтам BglII и PmeI). (BamH1-PmeI fragment) was inserted into the vector pGL3 hygro / neo (the sites BglII and PmeI). Итоговый вектор с фрагментом 5 т.п.о. Total vector with a fragment of 5 kb был назван pGL3-hygro-short MBP-luci (см., например, фиг. 3). was named pGL3-hygro-short MBP-luci (see., e.g., FIG. 3).

Последовательности ДНК из обеих плазмид pGL3-hygo-MBP подтверждали наличие последовательностей M1, M2, M3 и M4. The DNA sequences of both plasmids pGL3-hygo-MBP was confirmed by the presence of sequences M1, M2, M3 and M4. Кроме того, транзиентная трансфекция данных плазмид в клетки 293Т давала детектируемую люциферазную активность. Furthermore, transient transfection of plasmids into 293T cells yielded detectable luciferase activity.

Работа с животными и создание трансгенных мышей Working with animals and the creation of transgenic mice

Работу с животными проводили в соответствии с федеральными инструкциями. Work with animals were performed in accordance with federal regulations. Использовали три различных штамма мышей (FVB, B6C3 и C57 BL/6). Three different strains of mice (FVB, B6C3 and C57 BL / 6). Визуализацию проводили после ингаляционного наркоза изофлураном (Baxter, Deerfield, IL); Imaging was carried out after the inhalation anesthetic isoflurane (Baxter, Deerfield, IL); мышей наблюдали до полного восстановления. mice were monitored until full recovery.

Трансгенные мыши были получены следующим образом: либо плазмиду pGL3-hygro-MBP10k-luci, либо плазмиду pGL3-hygro-MBP5k-luci расщепляли ферментами NotI и BamH1. Transgenic mice were prepared as follows: a plasmid pGL3-hygro-MBP10k-luci, a plasmid pGL3-hygro-MBP5k-luci digested with NotI and BamH1. Фрагмент, содержащий МВР-промотор, люциферазу и сигнал полиаденилирования, затем очищали через гель. A fragment containing the MBP promotor, luciferase, and the polyadenylation signal was then purified through gel. Трансгенных мышей получали с помощью стандартных инъекций в проядра эмбрионов мышей FVB, B6C3 или C57BL/6. Transgenic mice were prepared by standard injection in embryos proyadra FVB mice, B6C3 or C57BL / 6. Кратко, в ходе микроинъекции в проядро ДНК кассеты гена MBP-luci вводили напрямую в яйцеклетку мыши сразу после оплодотворения. Briefly, during microinjection into proyadro DNA cassette MBP-luci gene was injected directly into the mouse egg immediately after fertilization. Используя тонкую иглу ДНК вводили с помощью инъекции в большое мужское проядро, которые образуется из сперматозоида. Using a fine needle DNA was introduced by injection in a large male proyadro which is formed from a sperm. ДНК стремится встроиться в виде множества тандемно расположенных копий в случайные положения в геноме, часто после прохождения одного или нескольких клеточных делений. DNA tends to fit into a plurality of tandemly arranged copies of a random position in the genome, often after the passage of one or more cell divisions. Поэтому, полученная мышь является только частично трансгенной. Therefore, a mouse is obtained only partially transgenic. Если трансгенные клетки участвуют в образовании зародышевой линии, то тогда будет продуцироваться некоторое количество трансгенных яйцеклеток или спермы и следующее поколение мышей будет полностью трансгенным. If the transgenic cells are involved in the formation of the germ line, then it will be produced by a number of transgenic ova or sperm, and the next generation of mice will be fully transgenic.

Исходные трансгенные животные и их потомство Tg+ G1 идентифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ДНК из хвостовой биопсии с использованием праймеров, специфичных к гену люциферазы светлячка (ПЦР-праймеры: 5'gaaatgtccgttcggttggcagaagc-3', и 5'ccaaaaccgtgatggaatggaacaaca-3') (SEQ ID NO:7 и 8). Initial transgenic animals and their progeny Tg + G1 identified by polymerase chain reaction (PCR) on DNA from tail biopsies using specific primers for the firefly luciferase gene (PCR primers: 5'gaaatgtccgttcggttggcagaagc-3 ', and 5'ccaaaaccgtgatggaatggaacaaca-3' ) (SEQ ID NO: 7 and 8).

Проводили визуализацию потомства 25 положительных исходных трансгенных животных с использованием In vivo Imaging System (IVIS 100; Xenogen, Alameda, CA), в результате были идентифицированы шесть трансгенных линий, которые показывали сигнал визуализации в мозге (две линии мышей FVB и четыре линии мышей B6C3HF1). Carried progeny visualization 25 positive initial transgenic animals using the In vivo Imaging System (IVIS 100; Xenogen, Alameda, CA), resulting in six transgenic lines were identified that showed imaging signal to the brain (two FVB mice and four B6C3HF1 mice) . Поскольку в данном эксперименте не было получено ни одного положительного сигнала в мозге для трансгенных мышей на основе штамма C57 BL/6, то для одной линии FVB проводили обратное скрещивание с мышами C57BL/6, чтобы получить штамм C57 BL6. Since in this experiment did not give any positive signal in the brain of transgenic mice based on strain C57 BL / 6, then for one line FVB carried backcross mice with C57BL / 6 to obtain strain C57 BL6. Мышей линии 171 B6C3 впоследствии размножали скрещиванием друг с другом для получения гомозиготных трансгенных скрещивающихся пар. 171 B6C3 mice were subsequently propagated by crossing with each other to produce homozygous transgenic skew pairs. Для линии 171 B6C3F 1 также проводили обратное скрещивание с линией альбиносов C57. For the line 171 is also conducted B6C3F 1 backcrossing with albino line C57.

Таблица 1. Table 1.

Для скрининга выбранных линий MBP-luci использовали биолюминесцентную визуализацию in vivo . For screening of selected MBP-luci lines using bioluminescent imaging in vivo. Мышей G1 анестезировали изофлюраном, и дозу 250 мг/кг люциферина вводили с помощью инъекций через хвостовую вену или подкожно. Mice were anesthetized with isoflurane G1 and the dose 250 mg / kg luciferin was administered by injection through the tail vein or subcutaneously. Через восемь минут после инъекции люциферина проводили визуализацию мышей. Eight minutes after luciferin injection, the mice were performed visualization. Были идентифицированы шесть линий, которые давали сигнал визуализации в мозге (фиг. 5, две линии штамма FVB: 58 и 121 и четыре линии штамма B6C3: 12, 23, 85 и 171). (. 58 and 121, and four line B6C3 strain: Figure 5, the two strain FVB lines 12, 23, 85 and 171), the six lines, which allowed visualization of the signal in the brain have been identified. За исключением линии 58 другие пять линий показывали ex vivo сигнал визуализации люциферазы в области белого вещества мозга. Except for the other five line 58 lines showed ex vivo luciferase imaging signal in the white matter of the brain.

В таблице 1 показаны данные для 35 положительных по трансгенной ДНК исходных мышей, идентифицированных вскоре после рождения посредством ПЦР-генотипирования на биопсии хвоста. Table 1 shows data for 35-positive transgenic mice DNA source identified shortly after birth by PCR genotyping on tail biopsy. Пятнадцать из полученных ДНК-положительных исходных линий несли MBP-10k luci, а двадцать ДНК-положительных исходных линий несли MBP-5k luci. Fifteen of the resulting DNA-positive baselines carried MBP-10k luci, and twenty-DNA positive baselines carried MBP-5k luci. В данной заявке трансген и трансгенных мышей сокращенно обозначали MBP-luci. In this application transgenic and transgenic mice abbreviated MBP-luci.

Таблица 1 Table 1
МВР-luci была получена в виде шести различных моделей для улучшения методов биовизуализации MBP-luci was obtained in the form of six different models to improve methods biovizualizatsii
Модель № model number Штамм Strain Гетерозиготная или гомозиготная Heterozygous or homozygous Характеристика Characteristic
538 538 FVB FVB Линия 121 гетерозиготная Line 121 heterozygous Экспрессия в ЦНС и спинном мозге Expression in the central nervous system and spinal cord
557 557 В6С3Н V6S3N Линия 171 гетерозиготная Line 171 heterozygous Экспрессия в ЦНС модулируется только обработкой купризоном Expression in the central nervous system is modulated only by treating kuprizonom
551 551 В6С3Н V6S3N Линия 171 гомозиготная Line 171 homozygous Экспрессия в ЦНС модулируется только обработкой купризоном Expression in the central nervous system is modulated only by treating kuprizonom
556 556 С57 BL/6J C57 BL / 6J Линия 121 гетерозиготная Line 121 heterozygous Экспрессия в ЦНС и спинном мозге Expression in the central nervous system and spinal cord
565 565 С57 альбинос C57 albino Линия 171 гомозиготная Line 171 homozygous Экспрессия в ЦНС модулируется только обработкой купризоном; Expression in the central nervous system is modulated only by treating kuprizonom; альбинизм улучшает визуализацию albinism improves visualization
595 595 С57 альбинос C57 albino Линия 121 гетерозиготная Line 121 heterozygous Экспрессия в ЦНС и спинном мозге; Expression in the central nervous system and spinal cord; альбинизм улучшает визуализацию albinism improves visualization

На фигурах 7 и 9 показано, что биолюминесценция в модели MBP-luci хорошо коррелировала с областью ЦНС и с возрастной миелинизацией. In Figures 7 and 9 show that the bioluminescence in the MBP-luci model correlated well with CNS myelination and age.

Визуализация ex vivo и анализ на люминометре Visualization ex vivo and in luminometer analysis

Визуализацию люциферазы ex vivo выделенных органов проводили сразу после эвтаназии животных с помощью СО 2 , через 10 мин после подкожной инъекции люциферина (250 мг/кг). Visualization ex vivo luciferase isolated organs were carried out immediately after the euthanasia of the animal with CO 2 10 minutes after subcutaneous injection of luciferin (250 mg / kg). Удаленные органы помещали на черную бумагу, покрытую листом пластика, и визуализировали с помощью IVIS; Distant organs were placed on black paper, covered with a plastic sheet, and visualized using IVIS; сильный сигнал биолюминесценции оставался детектируемым в пределах 20-30 мин после удаления органов. a strong signal of bioluminescence remained detectable within 20-30 minutes after the removal of organs. Анализ изображений и количественную оценку биолюминесценции проводили с использованием программного обеспечения Living Image (Xenogen Corp.). Image analysis and quantification of bioluminescence was performed using Living Image (Xenogen Corp.) software.

Образцы ткани помещали в буфер для лизиса с ингибиторами (Passive Lysis Buffer [Promega] и Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail [Roche, Indianapolis, IN]). Tissue samples were placed in lysis buffer with inhibitors (Passive Lysis Buffer [Promega] and Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail [Roche, Indianapolis, IN]). Ткани гомогенизировали с использованием гомогенизатора для тканей. Tissues were homogenized using a homogenizer for tissues. Ткани дополнительно гомогенизировали обработкой ультразвуком в течение короткого времени. Fabrics further homogenised by sonication for a short time. Гомогенаты тканей центрифугировали и осветленные лизаты использовали для анализа на люминометре. The tissue homogenates were centrifuged and the clarified lysates were used for analysis on a luminometer. Для анализа на люминометре субстрат для анализа люциферазы (Luciferase Assay System, Promega) готовили, как указано изготовителем. For the analysis on a luminometer for analysis of luciferase substrate (Luciferase Assay System, Promega) was prepared as described by the manufacturer. Гомогенаты тканей (20 мкл) и субстрата (100 мкл) смешивали и измеряли на люминометре. The tissue homogenates (20 ul) and the substrate (100 .mu.l) were mixed and were measured on a luminometer. Получали значения фоновой люминесценции и вычитали из данных по интенсивности люминесценции. Obtained values ​​of the background and was subtracted from the luminescence from the luminescence intensity data. Определяли концентрацию белка с использованием набора BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL), следуя протоколу изготовителя. Protein concentration was determined using the set of BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL), following the manufacturer's protocol. Вычисляли люминесценцию для каждого белкового лизата в виде относительных единиц света на микрограмм белка. Luminescence was calculated for each protein lysate as relative light units per microgram of protein.

Индуцируемая купризоном демиелинизация и гистологическая валидация Kuprizonom induced demyelination and histologic validation

Введение купризона мышам в течение четырех недель приводило к сильной демиелинизации мозолистого тела. Introduction kuprizona mice for four weeks led to severe demyelination of the corpus callosum. Индуцированная купризоном демиелинизация связана со значительным микроглиозом и привлечением макрофагов (Bakker and Ludwin, J Neurol Sci 78: 125-37, 1987; Hiremath et al., J Neuroimmunol 92: 38-49, 1998; McMahon et al., J Neuroimmunol 130: 32-45, 2002), но имела минимальные Т-клеточные ответы (Matsushima and Morell, Brain Pathol 11: 107-16, 2001). Kuprizonom induced demyelination is associated with significant microgliosis and attracting macrophages (Bakker and Ludwin, J Neurol Sci 78: 125-37, 1987; Hiremath et al, J Neuroimmunol 92:. 38-49, 1998; McMahon et al, J Neuroimmunol 130:. 32-45, 2002), but had minimal T-cell responses (Matsushima and Morell, Brain Pathol 11: 107-16, 2001). Постоянная и прогнозируемая природа места поражения миелина в данной модели обуславливает легкую количественную оценку изменений в миелинизации мозолистого тела. Permanent and predictable nature of the place of destruction of myelin in the model causes a slight change in the quantitative assessment of myelination of the corpus callosum. Эти измерения могут быть результатом миелинизации de-novo с помощью клеток-предшественников олигодендроцитов, однако предупреждение терминальной демиелинизации иммуномодуляторными механизмами (Pluchino et al., Nature 436: 266-71, 2005) может быть возможным альтернативным объяснением. These measurements can be the result of myelination de-novo using oligodendrocyte progenitor cells, but cautioned terminal demyelination immunomodulatory mechanisms (Pluchino et al, Nature 436:. 266-71, 2005) may be a possible alternative explanation.

Как указано выше, множество штаммов трансгенных мышей с МВР-люциферазой (MBP-luci Tg) были охарактеризованы с помощью in vivo оценки событий индуцированной купризоном демиелинизации/ремиелинизации. As indicated above, many strains of transgenic mice with a luciferase-MBP (MBP-luci Tg) were characterized using in vivo evaluation kuprizonom events induced demyelination / remyelination. Экспрессия люциферазы (luci) под управлением промотора основного белка миелина (МВР) позволяет количественную оценку in vivo биовизуализации миелина в мозге трансгенных (Tg) млекопитающих, экспрессирующих белок МВР. Expression of luciferase (luci) under control of the promoter of myelin basic protein (MBP) allows to quantify in vivo biovizualizatsii myelin in the brain of transgenic (Tg) of mammals expressing MBP protein. В модели, например, можно использовать мышей дикого типа C57/BL6, получающих 0,2% купризона в своей диете. In the model, for example, possible to use wild type mice C57 / BL6, receiving 0.2% kuprizona in their diet. Предшествующие модели требовали конечного умерщвления животных во временных точках для оценки миелина после обработки различными соединениями. The foregoing model animals required sacrifice in the final timepoints for evaluation of various compounds of myelin after processing. Вследствие необходимости большого числа животных вариабельность между животными являлась фактором, требующим дополнительных индивидов исследования (большего числа животных (n) в группе) для достижения достоверности. Because of the need of a large number of animals was variability between animals factor requiring additional individuals study (a large number of animals (n) in the group) to achieve reliability.

Мыши линии 171 (B6C3) MBP 5k-luci показывали выраженную и достоверную демиелинизацию в мозолистом теле мозга, которую оценивали гистохимическим окрашиванием люксолом быстрым синим (LFB) после 4 недель на диете с 0,2%-ным содержанием купризона. line 171 Mice (B6C3) MBP 5k-luci showed a pronounced and significant demyelination in the brain corpus callosum, as assessed by histochemical staining lyuksolom fast blue (LFB) after 4 weeks on a diet containing 0.2% kuprizona. Данная демиелинизация дополнительно коррелировала с падением сигнала люциферазы при in vivo биовизуализации. This demyelination is further correlated with the fall of the luciferase signal upon in vivo biovizualizatsii.

Однако штамм мышей FVB линии 121 MBP 10-Luci не показывал сравнимую демиелинизацию. However FVB strain mice line 121 MBP-Luci 10 did not show comparable demyelination. На мышах FVB были проведены дополнительные исследования в попытках идентифицировать возможную схему варьирования количества купризона в диете и варьирования периодов времени воздействия купризона, которая могла бы привести к значительной демиелинизации. FVB mice were conducted additional research in an attempt to identify a possible scheme of varying the amount of kuprizona in diet and varying periods of time kuprizona exposure, which could lead to significant demyelination. Результаты показали только средний уровень демиелинизации при оценке с помощью окрашивания LFB в мозолистом теле. The results showed only an average level of demyelination as assessed by LFB staining in the corpus callosum. Соответственно, предпочтение было отдано разработке линии 171. Accordingly, preference was given to the development of the line 171.

Влияние различных штаммов на купризоновую модель: Effect of different strains on kuprizonovuyu model:

Трансгенных мышей часто создают, используя штамм FVB/NJ (FVB) вследствие его высокой плодовитости. Transgenic mice often created using FVB / NJ strain (FVB) due to its high fecundity. Мышей штамма FVB также интенсивно используют для трансгенной модели биовизуализации благодаря белому цвету их меха, который относительно не поглощает свет. FVB strain mice also intensively used for transgenic biovizualizatsii model thanks to the white color of their fur, which is relatively not absorb light. Удаление волосяного покрова, например, с помощью бритья также можно использовать для снижения потери сигнала вследствие поглощения или рассеивания волосяным покровом или мехом в FVB или других штаммах. Removal of hair, e.g., by means of shaving can also be used to reduce signal loss due to absorption or scattering scalp or to the fur or other FVB strains.

Вследствие того что для купризоновой модели наблюдались различия между штаммами, то выбор штамма может повлиять на результаты. Due to the fact that the observed differences between strains, the strain of choice may affect the results for kuprizonovoy model. Выбор оптимального штамма для конкретной цели рассматривается как рутинная оптимизация, зависящая, например, от выбранного метода анализа и оборудования. Selection of an optimal strain for a particular purpose is considered as a routine optimization, depending, for example, the chosen method of analysis and equipment. Однако создание трансгенного млекопитающего не считается ограничивающим фактором; However, the creation of the transgenic mammal is not considered a limiting factor; скорее, восприимчивость конкретного штамма и трансгенной линии, например, к условиям, влияющим на демиелинизацию, используют в качестве критерия отбора для улучшения качества данных. Rather, the susceptibility of the particular strain and the transgenic lines, for example, conditions affecting the demyelination, is used as a selection criterion to improve data quality. В зависимости от выбранного события миелинизации/демиелинизации выбор штамма или генетической основы может повлиять на результаты. Depending on the selected event myelination / demyelination choice of strain or genetic basis may affect the results. Полагают, что определенные модели демиелинизации могут работать лучше в конкретных штаммах. It is believed that certain demyelination model may work better in certain strains. Такой выбор модели и штамма будет считаться рутинным в качестве части разработки метода анализа. This choice of model and the strain would be considered routine as part of developing an analytical method. Хотя потребление в пищу купризона является превосходной моделью для исследования демиелинизации и ремиелинизации, в этой модели присутствуют сильные генетические факторы, по-видимому, выражающиеся в разнице между штаммами. Although the consumption of food kuprizona is an excellent model for the study of demyelination and remyelination, in this model there is a strong genetic factors, it appears to be expressed in the difference between the strains.

Штамм FVB: Strain FVB:

Мыши штамма FVB были выбраны частично благодаря своему белому цвету меха. FVB mouse strain were selected in part because of its white color fur. Мыши FVB представляют собой систему, подходящую для большинства трансгенных экспериментов и последующих генетических анализов. FVB mice represent a system that is suitable for most transgenic experimentation and subsequent genetic analysis. Например, инбредный штамм FVB отличается мощными репродуктивными способностями и постоянными большими пометами. For example, FVB inbred strain differs powerful reproductive capacity and constant large litters. Это снижает стоимость и время при получении больших популяций. This reduces the cost and time in the production of large populations. Более того, оплодотворенные яйцеклетки мышей FVB содержат крупные и выраженные проядра, что облегчает микроинъекции ДНК. Moreover, FVB mice fertilized ovum contain large and expressed proyadra that facilitates the microinjection of DNA. Кроме того, штамм FVB имеет белый цвет меха альбиносов и представляет собой наилучший выбор для биовизуализации. Moreover, FVB strain is white albino fur and represents the best choice for biovizualizatsii. Эти признаки делают штамм FVB предпочтительным для использования в исследованиях с трансгенными моделями биовизуализации. These attributes make the FVB strain is preferred for use in studies with transgenic models biovizualizatsii. Однако можно использовать другие штаммы, если они проявляют желаемые характеристики. However, other strains can be used if they exhibit desirable characteristics.

Мыши штамма FVB очень чувствительны к 0,2%-ному купризону в отношении потери веса. FVB mouse strain is very sensitive to kuprizonu 0.2% solution for weight loss. Для того чтобы избежать сильной потери веса и токсичности необходимо использовать двух-трехкратную норму питания/добавки Transgel в неделю. To avoid severe weight loss and toxicity is necessary to use two or three times the rate of supply / Transgel additive per week. Кроме того, авторы изобретения показали, что у мышей штамма FVB наблюдается минимальная гистологическая демиелинизация при различных схемах кормления купризоном. Moreover, the inventors have shown that a strain of FVB mice show histological demyelination minimum at different feeding schemes kuprizonom.

Соответственно, для облегчения будущей валидации и применения проводили возвратное скрещивание линии 121 MBP 10k-luci (штамм FVB) с C57 Bl/6. Accordingly, to facilitate future validation and application was carried backcrossing line 121 MBP 10k-luci (FVB strain) with C57 Bl / 6.

Штамм В6С3/Тас: Strain V6S3 / Tas:

Гибридный штамм В6С3 можно создать скрещиванием самок мышей C57 BL/6Ntac с самцами мышей C3H/HeNTac из коммерческих колоний компании Taconic US. Hybrid strain V6S3 can create mating female mice C57 BL / 6Ntac with male mice C3H / HeNTac commercial colonies Taconic US companies. Данный штамм имеет цвет меха черный или агути. This strain has the color of fur is black or agouti. В6С3 будет гетерозиготным по локусам, которые отличаются у C57BL/6 и C3H, и гомозиготным по локусам, которые одинаковы для данных штаммов. V6S3 will be heterozygous for loci that differ from the C57BL / 6 and C3H, and homozygous for loci that are common to the strains.

У мышей B6C3/Tac наблюдалась явная гистологическая демиелинизация. In mice B6C3 / Tac observed a clear histological demyelination. Более конкретно, демиелинизация у гомозиготных мышей линии 171 MBP 5k-Luci модели биовизуализации была лишь немного менее интенсивной с небольшой вариабельностью по сравнению с мышами C57BL6 дикого типа. More specifically, demyelination homozygous mice 171 MBP 5k-Luci biovizualizatsii model was only slightly less intense with little variability as compared to C57BL6 wild-type mice. Демиелинизация у гетерозиготных мышей линии 171 MBP 5k-Luci была значительно менее выражена, более локализована и более вариабельна по сравнению с мышами C57BL6 и гомозиготными мышами линии 171 MBP 5k-Luci. Demyelination in heterozygous mice 171 MBP 5k-Luci was significantly less pronounced, more localized and more variable as compared to C57BL6 mice and mice homozygous line 171 MBP 5k-Luci. Эти результаты иллюстрируют, что модель MBP-luci может быть полезна для определения чувствительности индивидуума, штамма или вида к событию, влияющему на миелинизацию. These results illustrate that MBP-luci model may be useful to determine the sensitivity of the individual, species or strain to events affecting myelination. Кроме того, конструкция MBP-luci не теряет своей полезности даже у млекопитающих с черным мехом. In addition, MBP-luci design does not lose its usefulness even in mammals with black fur.

Штамм BALB/cJ: The strain BALB / cJ:

Также исследовали эффект купризона на кортикальную демиелинизацию в мышах BALB/cJ. Also investigated the effect on cortical kuprizona demyelination in mice BALB / cJ. У этих мышей кортикальная демиелинизация была только частичной. These mice cortical demyelination was only partial.

Более того, кортикальное накопление микроглии было заметно увеличено у мышей BALB/cJ, в то время как микроглия отсутствовала в коре головного мозга мышей C57BL/6. Furthermore, cortical accumulation of microglia was significantly increased in mice BALB / cJ, while microglia absent in C57BL / 6 mice cerebral cortex. Эти отличия штаммов могут быть полезны для осуществления различных исследовательских целей. These strains differences may be useful for various research purposes.

Штамм C57 BL/6J Jax: Strain C57 BL / 6J Jax:

Животные с генетической основой C57BL/6 подходят для многих купризоновых модельных исследований и использовались в нескольких лабораториях в течение последних трех десятилетий. Animals with a genetic basis for C57BL / 6 suitable for many kuprizonovyh model studies and have been used in several laboratories over the past three decades. При кормлении 8-недельных мышей C57BL/6 0,2%-ным купризоном в диете специфично наносится ущерб зрелой олигодендроглие (она не может соответствовать метаболическим требованиям обеспечивать большое количество миелина), и она входит в апоптоз. When feeding an 8-week-old mice C57BL / 6 0.2% kuprizonom specifically in the diet causes damage mature oligodendroglioma (it can not meet the metabolic requirements of providing a greater number of myelin), and it enters apoptosis. За этим событием сразу следует привлечение микроглии и фагоцитоз миелина. This event immediately follows the involvement of microglia and phagocytosis of myelin. Исследование экспрессии гена миелина, согласованное с морфологическими исследованиями, указывает на то, что даже при постоянном метаболическом стрессе, клетки-предшественники олигодендроглии пролиферируют и проникают в демиелинизированные области. Investigation of myelin gene expression, consistent with the morphological studies indicate that even at constant metabolic stress, oligodendroglial precursor cells proliferate and penetrate into the demyelinated region. При прекращении воздействия купризона происходит практически полная ремиелинизация в течение нескольких недель. Upon termination kuprizona impact is almost complete remyelination in a few weeks. Можно предположить наличие межклеточного взаимодействия между различными типами клеток. One can assume the presence of intercellular interactions between different cell types. Поэтому, способ и модель по изобретению могут быть полезны для исследования событий межклеточных взаимодействий, например, определения участия потенциального фактора в инициации миелинизации, скрининга соединений, которые обеспечивают инициацию и скрининга соединений, ингибирующих инициацию. Therefore, the method and model of this invention may be useful for studying the events intercellular interactions, e.g., identifying potential participation factor in the initiation of myelination, screening of compounds that provide initiation and screening for compounds inhibiting the initiation.

Кроме того, воспроизводимость модели MBP-luci указывает на то, что она может позволять тестирование манипуляций (например, доступных методов нокаута или получения трансгенных животных на общей генетической основе, методов интерферирующих РНК или фармакологических воздействий), которые могут ускорить или замедлить процесс демиелинизации и/или ремиелинизации. Furthermore, reproducibility MBP-luci model indicates that it can allow testing manipulations (e.g., available knockout techniques or the production of transgenic animals on a common genetic basis, methods of interfering RNA or pharmacological effects), that can speed up or slow down the process of demyelination and / or remyelination.

Улучшение модели MBP-luci Improving model MBP-luci

Хотя было показано, что линия 171 (штамм B6C3H, гетерозиготная) работает в исследованиях миелинизации/демиелинизации, модель можно дополнительно улучшить путем (1) скрещивания до гомозиготности для увеличения интенсивности сигнала биовизуализации и снижения стоимости получения модели и генотипирования; Although it has been shown that the line 171 (B6C3H strain heterozygous) operates in studies myelination / demyelination model can be further improved by (1) cross-breeding to homozygosity to increase the signal intensity biovizualizatsii and reduce the cost of obtaining models and genotyping; (2) скрещивания со штаммом животных-альбиносов, таким как штамм С57, для уменьшения ослабления сигнала визуализации вследствие белого меха и для снижения реакции кожи после множественных депиляций; (2) mating with the strain albino animals, such as strain C57, to reduce attenuation due to signal visualization white fur and to reduce the skin reaction after multiple depilation; (3) скрещивания линии 121 со штаммом C57 BL/6 для соответствия разработанному в компании штамму для купризоновой модели воздействия на ЦНС. (3) crossing the line 121 with the strain C57 BL / 6 for matching the strain developed in the company for kuprizonovoy model effects on the central nervous system.

На настоящий момент авторы продемонстрировали, что гомозиготные животные линии 171 показывали более чем 2-кратное окно биовизуализации относительно гетерозиготных животных линии 171 (две копии кассеты репортерного гена на клетку). At the moment, we have demonstrated that animals homozygous line 171 shows a more than 2-fold relative to window biovizualizatsii heterozygous animals lines 171 (two copies of the cassette of the reporter gene in the cell). Другие эксперименты также демонстрировали, что мыши-альбиносы С57 отвечали на купризоновую модель. Other experiments have also shown that the albino mouse C57 answered kuprizonovuyu model.

Система визуализации и анализ данных Imaging System and Data Analysis

Биолюминесценцию измеряли неинвазивным способом, используя систему визуализации IVIS (Xenogen Corp., Alameda, CA). Bioluminescence was measured noninvasively, using IVIS imaging system (Xenogen Corp., Alameda, CA). Изображения получали через 10 мин после внутриперитонеальной инъекции люциферина (250 мг/кг; Xenogene Corp.) с 60-секундным накоплением сигнала, биннинг 10, если в тексте не указано иное. Images were obtained within 10 min after intraperitoneal injection of luciferin (250 mg / kg; Xenogene Corp.) with a 60-second accumulation signal binning 10, unless indicated otherwise in the text. В ходе получения изображений, мышей анестезировали непрерывно посредством ингаляции ~2%-ным изофлураном (Abbott Laboratories Ltd., Kent, United Kingdom). During imaging, mice were anesthetized by inhalation continuous ~ 2% isoflurane (Abbott Laboratories Ltd., Kent, United Kingdom).

Описание системы визуализации: Description visualization system:

Систему визуализации IVIS® Imaging System 100 (Xenogene) использовали для сбора данных, относящихся к данному изобретению. Imaging system 100 IVIS® Imaging System (Xenogene) was used to collect data relating to the present invention. Чувствительные системы визуализации IVIS® 100-й серии от компании Xenogen предлагают регулируемое прямоугольное поле зрения, например, 10-25 см, позволяя получать изображения для 5 мышей или 2 крупных крыс, а также одного стандартного микротитровочного планшета. Sensitive imaging systems IVIS® 100 series from the company Xenogen offer adjustable rectangular field of view, such as 10-25 cm, allowing you to take images for the 5 mice or 2 large rats, and also a standard microtiter plate. Система включает CCD-камеру (с прибором с зарядовой связью), имеющую 25 мм (1,0 дюймовую) квадратную истонченную матрицу с задней засветкой, которая криогенно охлаждается примерно от -90 до -120°C, например, до -105°C посредством системы охлаждения замкнутого цикла (без жидкого азота) для минимизации электронного фона и максимизации чувствительности. The system comprises a CCD-camera (a charge-coupled device) having a 25 mm (1.0 inch) square matrix with a thinned backlight, which cryogenically cooled from about -90 to -120 ° C, for example up to -105 ° C by closed loop cooling system (without the liquid nitrogen) to minimize electronic background and maximize sensitivity. CCD-камера создана для высокоэффективной детекции фотонов, в частности, в красной области спектра. CCD-camera set up for high-performance detection of photons, in particular in the red region of the spectrum. Она может детектировать очень маленькое число фотонов, а также работать в качестве традиционной камеры; It can detect a very small number of photons, and work as a traditional camera; представление изображений в этом широком диапазоне сигнала является функцией программного обеспечения Living Image® от компании Xenogen. representation of images in this wide band signal is a function of the software from the company Living Image® Xenogen. В ней присутствует шестипозиционный диск со светофильтрами для выделения различных полос спектра. It present disc six-position with filters to separate different spectral bands. Эта спектральная информация может дать больше данных о глубине и распределении клеток-источников излучения. This spectral information can give more information about the depth and distribution of the radiation source cells. CCD-камера охлаждается, и электронный выход оптимизирован таким образом, чтобы данные, собранные для создания in vivo изображений в режиме реального времени, имели необычайно низкий уровень шума. CCD-camera is cooled, and the electronic output is optimized so that the data collected to create the in vivo image in real time, have extremely low noise levels.

Светонепроницаемый корпус для визуализации Light-tight enclosure to render

В высшей степени светонепроницаемый корпус для визуализации (с низким фоновым сигналом) позволяет использовать приборы 100-й серии системы визуализации IVIS® в стандартных лабораторных условиях освещенности. In highly light-tight enclosure for imaging (with low background signal) allows devices 100 minutes IVIS® imaging system in a series of standard laboratory light conditions. Полка для образца в камере для визуализации двигается вверх и вниз для регулировки поля зрения. Shelf for a sample in the chamber to visualize moves up and down to adjust the field of view. Исследователь может видеть все животное или может сфокусироваться на одном участке для более подробного изучения. The researcher can see the whole animal, or may focus on one area for more detailed study. Полка подогревается для улучшения состояния анестезированных животных, например, мышей или крыс. Shelf heated to improve the anesthetized animals such as mice or rats. Система включает характеристики, важные для работы с животными, такие как полка для образцов с подогревом, соединения для газовой анестезии и опцию полноценной газовой анестезии от Xenogen - систему XGI-8 Gas Anesthesia System, показанную на интернет-странице компании. The system includes features that are important for working with animals, such as a shelf for sample heating, connections for gas anesthesia and anesthesia gas option full of Xenogen - system of the XGI-8 Gas Anesthesia System, shown on the website of the company. Более вместительная камера позволяет использование более крупных тестируемых индивидов или большее число тестируемых индивидов. More accommodating chamber allows the use of larger test of individuals or a larger number of individuals tested.

Приготовление люциферина для биолюминесцентного анализа in vivo : Preparation of luciferin bioluminescence assay in vivo:

В примерах использовали следующие материалы: In the examples we used the following materials:

калиевую соль D-люциферина светлячка 1,0 г на ампулу (например, Xenogen XR-1001 или Biosynth L-8220). potassium salt of D-luciferin firefly 1.0 g per vial (e.g., Xenogen XR-1001 or Biosynth L-8220).

DPBS без Mg 2+ и Ca 2+ . DPBS without Mg 2+ and Ca 2+.

Фильтр на флакон (0,2 мкм). Filter vial (0.2 microns).

Следующую процедуру использовали для визуализации: The following procedure was used for visualization:

Готовили концентрированный раствор люциферина (25 мг/мл в DPBS) и стерилизовали через фильтр 0,2 мкм. We are preparing a concentrated solution of luciferin (25 mg / ml in DPBS) and sterilized through a 0.2 micron filter. Аликвоты по 5 мл хранили при -20°C. Aliquots of 5 ml were stored at -20 ° C. Доза инъекции составляла 10 мкл/г веса тела. injection dose was 10 l / g body weight. Количество рассчитывали, чтобы каждая мышь получала по 250 мг люциферина на кг веса тела (например, для 20-граммовой мыши объем инъекции составлял 200 мкл, чтобы мышь получила 2,0 мг люциферина). The amount was calculated that each mouse received 250 mg luciferin per kg body weight (e.g., for a 20-gram mouse injection volume was 200 .mu.l to mouse received 2.0 mg luciferin). Люциферин вводили с помощью подкожных, внутрибрюшинных или внутривенных инъекций за несколько минут до проведения визуализации. Luciferin was administered via subcutaneous, intraperitoneal or intravenous injection for several minutes prior to imaging. Кинетические исследования для люциферина необязательно проводили для каждой животной модели, чтобы определить окно пикового сигнала. Kinetic studies for luciferin optionally performed for each animal model to determine the peak signal appears.

3.6 Способ визуализации MBP-luci: 3.6 Imaging method MBP-luci:

Как описано выше, мышам вводили с помощью инъекций 250 мг/кг D-люциферина подкожно, внутрибрюшинно или внутривенно. As described above, mice were treated with injections of 250 mg / kg D-luciferin subcutaneously, intraperitoneally or intravenously. Через 5 минут (для внутривенного введения) или через 8 минут (для внутрибрюшинного или подкожного введения) проводили визуализацию мышей, используя IVIS 100 (Xenogen), в течение 16 минут (визуализация в течение 60-секунд и 60-секундный интервал для 8 фотографий с биннингом 8). After 5 minutes (for intravenous administration) or after 8 minutes (for intraperitoneal or subcutaneous administration) was performed mice visualization using IVIS 100 (Xenogen), for 16 minutes (visualization within 60 seconds and a 60 second intervals for 8 photos binning 8). Для количественной оценки биолюминесценции идентичные круглые области выделяли вокруг головы каждой мыши и количественно оценивали сигнал визуализации в среднюю интенсивность свечения (фотоны/с/см 2 /стерадиан), используя программное обеспечение LIVINGIMAGE software (version 2.5, Xenogen). For quantifying bioluminescence identical circular area around the head of each isolated and quantitated mouse imaging signal to the average light intensity (photons / s / cm2 / sr) using software LIVINGIMAGE software (version 2.5, Xenogen) . Выделенные области сохраняли постоянными по площади и положению во всех экспериментах. Selected areas are kept constant in size and position in all experiments. Данные нормализовали на биолюминесценцию в начале воздействия для каждого животного. The data were normalized to the bioluminescence in the beginning of exposure for each animal.

3.7 Статистический анализ 3.7 The statistical analysis

Для статистического анализа использовали пакеты статистического программного обеспечения EverStat V5 и Sigma Stat. For statistical analysis using a statistical software packages EverStat V5 and Sigma Stat. В качестве средних значений брали среднее значение визуализации в группе и вычисляли SE (стандартную ошибку) для всех групп. As the average values ​​take the mean value in the group and visualization calculated SE (standard error) for all groups.

При сравнению средних величин для двух групп использовали парный тест Вилкоксона или непарный тест Вилкоксона. When compared to the average values ​​for the two groups using paired Wilcoxon test or the unpaired Wilcoxon test. Двусторонние значения P<0,05 считали статистически достоверными. Bilateral value P <0,05 was considered statistically significant.

ПРИМЕРЫ EXAMPLES

Создание трансгенных мышей Generation of Transgenic Mice

«Длинный» промотор имеет длину примерно 10 т.п.о., содержащих M1, M2, M3, M4, а «короткий» промотор имеет длину примерно 5 т.п.о., содержащих M1, M2 и M3. The "long" promoter has a length of about 10 kbp containing the M1, M2, M3, M4, and "short" promoter has a length of about 5 kb comprising M1, M2 and M3. Эти промоторы были клонированы с помощью высокоточной ПЦР из бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) мыши, содержащей ген МВР. These promoters were cloned with the help of high-precision PCR from the bacterial artificial chromosome (BAC) mouse containing MBP gene. Затем каждый фрагмент промотора клонировали в вектор, например, в полилинкерный участок вектора pGL3-hygro (фиг. 1 и фиг. 2). Then each fragment was cloned into the vector promoter, e.g., a polylinker portion of the vector pGL3-hygro (FIG. 1 and FIG. 2).

Плазмиды расщепляли рестриктазами NotI и BamHI для высвобождения кассет для экспрессии трансгена MBP-luci (фиг. 3), которые использовали для создания трансгенных мышей с использованием штаммов FVB/Tac и B6C3/Tac и стандартных методик микроинъекций в проядра. Plasmids were digested with BamHI and NotI to release the expression cassette for transgene MBP-luci (FIG. 3) that are used to create transgenic mouse strains using FVB / Tac and B6C3 / Tac and microinjection standard techniques in proyadra.

Общие стратегии получения трансгенных (Tg) животных хорошо известны в данной области, например, описаны в Pinkert, CA (ed.) 1994. Transgenic animal technology: A laboratory handbook. General strategy for the production of transgenic (Tg) animals are well known in the art, such as described in Pinkert, CA (ed.) 1994. Transgenic animal technology: A laboratory handbook. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Academic Press, Inc., San Diego, Calif .; Monastersky GM and Robl, JM (ed.) (1995) Strategies in transgenic animal science. Monastersky GM and Robl, JM (ed .) ( 1995) Strategies in transgenic animal science. ASM Press. ASM Press. Washington DC). Washington DC).

Сигнал трансгена MBP-Luci, сопоставленный с событиями демиелинизации/ремиелинизации Signal transgene MBP-Luci, mapped to events demyelination / remyelination

Для валидации экспериментов трансгенную линию 121 (штамм FVB) MBP10K-luci с наблюдаемой экспрессией люциферазы в области белого вещества использовали в купризоновой модели. For validation experiments line 121 transgenic (FVB strain) MBP10K-luci with the observed luciferase expression in white matter used kuprizonovoy model. Как показано на фиг. As shown in FIG. 11, первое исследование на купризоне проводили с повторной визуализацией люциферазы в 1-ю, 2-ю и 4-ю неделю (на диете, содержащей 0,2% купризона) с последующим возвращением к нормальному питанию без купризона с визуализацией на 5-й, 6-й и 7-й неделе (недели 1-3 ремиелинизации). 11, the first study was carried out on kuprizone re-imaging of luciferase in the 1st, 2nd and 4th week (on a diet containing 0.2% kuprizona) followed by returning to a normal diet without kuprizona with visualization on the 5th, 6 th and 7 th week (week 1-3 remyelination). Как показано на фигуре экспрессия люциферазы в этой линии 121 четко коррелировала с динамикой индуцированной купризоном демиелинизации и ремиелинизации. As shown in the figure luciferase expression in this line 121 is clearly correlated with the dynamics induced demyelination and remyelination kuprizonom. Эти данные согласуются с опубликованными данными по экспрессии мРНК МВР (Jurevics et al., Journal of Neurochemistry , 2002, 82, 126-136). These data are in agreement with published data on the expression of MBP mRNA (Jurevics et al., Journal of Neurochemistry, 2002, 82, 126-136). Известно, что мыши штамма FVB чувствительны к 0,2%-ному купризону, что видно по потере веса. It is known that the FVB mouse strain sensitive to 0.2% solution kuprizonu that seen for weight loss. Обычно, чтобы избежать сильной потери веса и токсичности для данного штамма необходимо использовать двух-трехкратную норму питания/добавки Transgel в неделю. Usually, to avoid weight loss and severe toxicity to the strain necessary to use two or three times the rate of supply / Transgel additive per week.

Валидация купризоновой модели: Validation kuprizonovoy model:

Хорошо известной и широко используемой моделью демиелинизации/ремиелинизации является купризоновая модель на мышах. A well-known and widely used model of demyelination / remyelination is kuprizonovaya mouse model. Эта модель включает потребление с пищей купризона, вещества, хелатирующего медь (обычно в количестве 0,2% по весу; бис-циклогексанон-оксалдигидразон, CAS# 370-81-0, Sigma C9012), вводимого в измельченное питание для лабораторных грызунов в течение, например, четырех-шести последовательных недель (см., например: Matsushima and Morell, 2001). This model includes dietary intake kuprizona, a substance chelating the copper (typically in an amount of 0.2% by weight; cyclohexanone bis-oksaldigidrazon, CAS # 370-81-0, Sigma C9012), introduced into the milled diet for laboratory rodents for For example, four to six consecutive weeks (see, for example:. Matsushima and Morell, 2001). Было показано, что купризон избирательно токсичен для зрелых олигодендроцитов. It was shown that kuprizon selectively toxic to mature oligodendrocytes. Последующее переключение с купризонового питания на нормальное создает условия, способствующие восстановлению, так что через четыре-шесть недель после удаления купризона из питания у мышей будет наблюдаться интенсивная ремиелинизация в мозолистом теле. The subsequent switching from the normal power kuprizonovogo creates an environment conducive to recovery, so that after four to six weeks after the removal of power kuprizona mice will experience intense remyelination in the corpus callosum. Таким образом, купризоновая модель обеспечивает завершенный in vivo подход для исследования аспектов демиелинизации и ремиелинизации (фиг. 11 и 12). Thus kuprizonovaya model provides a complete in vivo approach to study aspects of demyelination and remyelination (FIG. 11 and 12).

В качестве дополнительного доказательства была протестирована линия 171 (штамм В6С3) MBP 5k-luci. As additional proof of the line 171 (strain V6S3) MBP 5k-luci was tested. Этот штамм также показывал коррелирующий ответ визуализации на события индуцированной купризоном демиелинизации и ремиелинизации, как показано на фиг. This strain also showed correlating imaging response to events induced demyelination and remyelination kuprizonom, as shown in FIG. 13. 7 Tg+ мышей получали воздействие 0,2%-ного купризона в течение 6 недель, а 3 Tg+ мыши получали нормальное питание в течение 6 недель. 13. 7 Tg + mice received exposure to a 0.2% kuprizona for 6 weeks and 3 Tg + mice were fed a normal diet for 6 weeks. Все 7 мышей перенесли диету с 0,2%-ным содержанием купризона и имели среднюю потерю веса 15-25%. All 7 mice were transferred to the diet containing 0.2% kuprizona and had an average weight loss of 15-25%. Наблюдалось значительное падение сигнала визуализации при воздействии купризона (демиелинизации). There was a significant drop when exposed imaging signal kuprizona (demyelination). Например, наблюдалось 43%-ное падение сигнала с 0-й недели до 4-й недели и 74%-ное падение сигнала с 0-й недели до 6-й недели. For example, there was a 43% drop in the signal from the 0th week to the 4th week and 74% drop signal from the 0th week to the 6 th week.

Гистологическая валидация купризоновой модели на мышах MBP-luci Histological validation kuprizonovoy mouse model MBP-luci

Для гистологической валидации задачей было подтверждение в модели биовизуализации того, что ответ репортерного гена в течение воздействия купризона коррелирует с структурно детектируемой демиелинизацией в мозолистом теле мышей, получавших купризон. For histological validation task was confirmed by the model biovizualizatsii that the response of the reporter gene for kuprizona exposure correlates with structural detectable demyelination in the corpus body mice treated kuprizon. Это патологическое состояние визуализировали окрашиванием люксолом быстрым синим (LFB) (см. фигуры 20 и 24). This pathological condition visualized by staining lyuksolom fast blue (LFB) (see FIG. 20 and 24).

Более конкретно, для линии 121 MBP 10k-luci (штамм FVB) при питании 0,2%-ным купризоном в первоначальных исследованиях только минимальная демиелинизация была детектирована при окрашивании LFB. More specifically, lines 121 to MBP 10k-luci (FVB strain) when supplied with 0.2% in the initial studies kuprizonom only minimal demyelination was detected by staining LFB. Для того чтобы получить ясную гистологическую картину демиелинизации на данных мышах штамма FVB следовали различным схемам кормления купризоном в попытках избежать сильной потери веса. In order to get a clear histological demyelination in these mice strain FVB followed different patterns of feeding kuprizonom in an attempt to avoid severe weight loss. Группам с дозировкой купризона 0,2%, 0,175% и 0,15% (6-недельное исследование) требовалось в 3-4 раза больше нормы питания/добавки Transgel в неделю, чтобы избежать сильной потери веса и токсичности. Kuprizona groups with a dosage of 0.2%, 0.175% and 0.15% (6-week study) required 3-4 times more than normal power / Transgel additive per week to avoid severe weight loss and toxicity. Также дополнительно снижали концентрацию купризона и увеличивали время воздействия. Also kuprizona concentration was further reduced and increased exposure time. Исследования с концентрациями купризона (0,14%, 0,12% и 0,1%) и временем воздействия (7 недель и 9 недель) тестировали с нормальным питанием/добавкой Transgel до одного раза в неделю. Studies kuprizona concentrations (0.14%, 0.12% and 0.1%) and exposure time (7 weeks and 9 weeks) were tested with normal food / Transgel additive to once a week. Однако все данные показывали, что мыши штамма FVB (8-недельные, вес 28,5 г ±3 г) имели меньшую гистологическую демиелинизацию при различных схемах питания купризоном. However, the data showed that the FVB strain mice (8-week-old, weight 28.5 g ± 3 g) had a lower histological demyelination in various schemes kuprizonom supply. Линия FVB не была выбрана в качестве особенно предпочтительного варианта для предварительной разработки данной исследовательской модели. FVB line was not selected as a particularly preferred embodiment of the pre-development of the research model. Хотя штамм FVB хорошо подходит для визуализации, а также по чувствительности к токсичности купризона, потеря веса может вносить искажающие выходные данные переменные, которые легко исключить в данных предварительных исследованиях, выбрав другой штамм. Although the FVB strain is well suited for imaging, as well as sensitivity to kuprizona toxicity, weight loss can make distort the output variables that are easy to eliminate in these preliminary studies, selecting a different strain.

В другом штамме мыши линии 171 MBP 5k-luci (B6C3) (8-недельные, вес 25 г±3 г) показывали ясную гистологическую демиелинизацию. In another line of mouse strain 171 MBP 5k-luci (B6C3) (8 week old, weight 25 g ± 3 g) showed clear histological demyelination.

Ткани мозга мышей собирали в конце шести недель воздействия 0,2%-ным купризоном. Mouse brain tissue was collected at the end of six weeks of exposure to 0.2% kuprizonom. Все семь мышей, получавших купризон, имели явную демиелинизацию в области мозолистого тела, а все три контрольные мыши показывали нормальную миелинизацию в области мозолистого тела. All seven mice treated kuprizon had obvious demyelination in the corpus area of ​​the body, and three control mice showed normal myelination in the area of ​​the corpus callosum. Эти данные, полученные на линии 171 MBP 5K-luci, обеспечивают дополнительные доказательства, что сигнал визуализации отслеживает индуцированную купризоном фазу демиелинизации. These data received on line 171 MBP 5K-luci, provide additional evidence that imaging signal tracks kuprizonom phase induced demyelination.

Дополнительный количественный LFB-анализ (фиг. 14) продемонстрировал, что гомозиготные мыши линии 171 MBP-Luci (B6C3) (8-недельные, вес 21 г±3 г) показывали более согласованную и немного более интенсивную демиелинизацию на 4-й неделе по сравнению с гетерозиготными мышами линии 171 (B6C3H) (8-недельные, вес 25,5 г±3 г). Additional quantitative LFB-analysis (Fig. 14) demonstrated that homozygous mouse lines 171 MBP-Luci (B6C3) (8 week old, weight 21 g ± 3 g) showed a more consistent and slightly more intense demyelination at week 4 compared with heterozygous mice line 171 (B6C3H) (8 week old, weight 25.5 g ± 3 g). Области с большей плотностью в овалах показывают окрашенный миелин. Areas with a higher density in the colored ovals show myelin.

Кроме того, самцы мышей дикого типа штамма C57Bl/6 (8-недельные, вес 20 г±3 г), получавшие питание с 0,2%-ным содержанием купризона, показывали более интенсивную и более согласованную демиелинизацию. In addition, male wild type mice of the strain C57Bl / 6 (8 week old, weight 20 g ± 3 g) were fed a 0.2% content kuprizona, showed a more intense and more consistent demyelination. Штамм C57 BL/6 служит в качестве положительной контрольной линии для купризоновой модели и эффекта тестируемого соединения PPARσ, описанного в предварительных исследованиях. Strain C57 BL / 6 serves as a positive control for kuprizonovoy line model and the effect of the test compound PPARσ described in preliminary studies.

1. Подтверждение на мышах MBP-luci положительного эффекта действующего соединения селективного агониста PPARσ на ремиелинизацию ЦНС: 1. Confirmation of MBP-luci mice positive effect of active compound on selective agonist PPARσ CNS remyelination:

Мышей с МВР-люциферазой использовали для оценки возможности использования данной модели биовизуализации in vivo для детекции эффекта действующего соединения агониста рецептора дельта, активированного пролифератором пероксисом (PPARδ), ('571), на ремиелинизацию ЦНС. Mice with MBP-luciferase was used to assess the possibility of using this model in vivo biovizualizatsii for detecting the effect of the active compound of delta receptor agonist, a peroxisome proliferator-activated (PPARδ), ( '571) for CNS remyelination.

Рецепторы, активированные пролифератором пероксисом (PPAR), принадлежат к суперсемейству ядерных рецепторов, которые функционируют в качестве транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов-мишеней. Receptors, peroxisome proliferator-activated (PPAR), belong to the superfamily of nuclear receptors that function as transcription factors that regulate expression of target genes. В отличие от других транскрипционных факторов активность ядерных рецепторов можно модулировать связыванием с соответствующими лигандами - небольшими липофильными молекулами, легко проникающими сквозь биологические мембраны. Unlike other transcription factors nuclear receptor activity can be modulated by binding to respective ligands - small lipophilic molecules readily penetrate through biological membranes. Несмотря на сложность клеточных сигнальных путей для семейства ядерных рецепторов их давно успешно используют в качестве мишеней лекарственных соединений. Despite the complexity of cellular signaling pathways for nuclear receptor family their long been successfully used as targets of drug compounds. PPAR необходимы для регуляции клеточной дифференцировки, развития и метаболизма. PPAR are necessary for the regulation of cell differentiation, development and metabolism. PPAR имеют три близкородственные изоформы, кодируемые отдельными генами, идентифицированными к настоящему времени - обычно известными как PPARα, PPARγ и PPARδ, также известный как PPARβ; PPAR has three closely related isoforms encoded by separate genes identified to date - usually known as PPARα, PPARγ and PPARδ, also known as PPARβ; J. Berger and DE Miller, Annu. J. Berger and DE Miller, Annu. Rev. Rev. Med ., 2002, 53, 409-435). Med., 2002, 53, 409-435). Каждый подтип рецептора имеет характерный ДНК-связывающий домен (DBD) и лиганд-связывающий домен (LBD), оба необходимые для активированной лигандом экспрессии генов. Each receptor subtype has a characteristic DNA-binding domain (DBD) and ligand binding domain (LBD), both of the activated ligand required for gene expression. PPAR связываются в качестве гетеродимеров с рецептором ретиноидов Х (RXR). PPAR bind as heterodimers with the retinoid X receptor (RXR).

PPARδ, по-видимому, в значительной степени экспрессируется в ЦНС; PPARδ, apparently largely expressed in the CNS; однако большинство его функций все еще остается неизвестными. however, most of its functions is still unknown. Однако отдельный интерес представляет открытие, что PPARδ экспрессируется в олигодендроцитах грызунов, главных липид-продуцирующих клетках ЦНС (J. Granneman, et al., J. Neurosci. Res ., 1998, 51, 563-573). However, of particular interest is the discovery that PPARδ is expressed in rodent oligodendrocytes, the major lipid producing cells of the CNS (J. Granneman, et al., J. Neurosci. Res., 1998, 51, 563-573). Однако также было найдено, что селективный агонист PPARδ значительно усиливает экспрессию генов миелина и диаметр миелиновой оболочки в культуре клеток мыши (I. Saluja et al., Glia , 2001, 33, 194-204). However, it was also found that a selective PPARδ agonist significantly enhances myelin gene expression and myelin sheath diameter in mouse cell cultures (I. Saluja et al., Glia , 2001, 33, 194-204). Мыши, нокаутные по PPARδ, имели меньший общий размер мозга и меньшую степень миелинизации белого вещества ( Mol cell Biology 200 20:5119). Mouse knockout PPARδ, have a smaller overall size of the brain and less white matter myelination (Mol cell Biology 20, 200: 5119). Дополнительно, агонисты PPARδ проявляют защитные эффекты в экспериментальной аутоиммунной энцефаломиелитной (ЕАЕ) модели множественного склероза (Polak et al., J Neuroimmunology 2005 168:65-75). Further, PPARδ agonists exhibit protective effects in experimental autoimmune entsefalomielitnoy (EAE) model of multiple sclerosis (Polak et al, J Neuroimmunology 2005 168:. 65-75).

Коллеги авторов ранее продемонстрировали, что селективные агонисты PPARδ играют функциональную роль в нейрональной ткани и стимулируют дифференцировку клеток-предшественников олигодендроцитов. Colleagues authors previously demonstrated that PPARδ selective agonists play a functional role in neuronal tissue and stimulate the differentiation of oligodendrocyte progenitor cells. SAR117145, перорально биодоступный, проникающий через гемато-энцефалический барьер селективный агонист PPARδ стимулировал дифференцировку клеток-предшественников олигодендроцитов грызунов и человека in vitro концентрационнозависимым образом; SAR117145, oral bioavailability, penetration through the blood-brain barrier selective PPARδ agonist stimulated the differentiation of precursor oligodendrocyte cells of rodents and human in vitro concentration-dependent manner; эффект, который мог быть блокирован селективным антагонистом PPARδ. an effect that could be blocked by selective antagonist of PPARδ.

В олигодендроцитах крыс повышенной экспрессии основного белка миелина предшествовала повышенная экспрессия мРНК расположенной ниже в сигнальном каскаде мишени PPAR, Angptl4, и это повышение блокировалось «нокдауном» PPARδ с помощью лентивирусных кшРНК. In oligodendrocytes rats increased expression of the myelin basic protein was preceded by increased expression of the mRNA in a downstream signal cascade PPAR target, Angptl4, and this increase was blocked «knockout» PPARδ using lentiviral kshRNK. В мышиной купризоновой модели острой демиелинизации, в которой мышей кормили диетой с 2% купризона в течение 4 недель, SAR117145 усиливало ремиелинизацию ЦНС, усиливало экспрессию мРНК Angptl4 и улучшало аксональную проводимость по мозолистому телу. In a mouse model of acute kuprizonovoy demyelination in which mice fed a diet with 2% kuprizona for 4 weeks, SAR117145 intensified CNS remyelination, Angptl4 mRNA to enhance expression and improve axonal conduction along the corpus callosum. Активация Angptl4 в ЦНС сопровождалась повышенной экспрессией в икроножной мышце, позволяя предположить, что это явление может служить потенциальным заместительным маркером. Angptl4 activation in the CNS was accompanied by increased expression in gastrocnemius muscle, suggesting that this phenomenon may be a potential marker of substitution. Эти данные демонстрируют, что агонисты PPARδ могут усиливать ремиелинизацию ЦНС и улучшать аксональную функцию, и позволяют предложить их возможное применение в стимуляции эндогенных процессов восстановления для лечения демиелинизирующих заболеваний (патентная заявка США 20070149580, ПРИМЕНЕНИЕ АГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРА ДЕЛЬТА, АКТИВИРУЕМОГО ПРОЛИФЕРАТОРОМ ПЕРОКСИСОМ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МС И ДРУГИХ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ). These data demonstrate that agonists of PPARδ may enhance remyelination of central nervous system and improve axonal function and allow us to offer their possible use in the stimulation of endogenous recovery processes for the treatment of demyelinating diseases (US patent application 20070149580, APPLICATION receptor agonist DELTA, peroxisome proliferator-activated for the treatment of MS and other demyelinating diseases).

Действующее соединение агониста PPARδ ('517; фиг. 15) было протестировано на гетерозиготных мышах линии 171 В6С3Н. The active compound is an agonist PPARδ ( '517;. Figure 15) was tested on mice heterozygous line 171 V6S3N. 8-недельных мышей помещали на диету, содержащую 0,2% купризона, в течение 4 недель, затем давали нормальное питание для ремиелинизации. 8-week-old mice were placed on a diet containing 0.2% kuprizona, for 4 weeks, then allowed normal diet for remyelination. Мышам затем перорально вводили дважды в день либо носитель (0,6%-ную натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы и 0,5%-ный Tween 80) или 30 мг/мг действующего соединения агониста PPARδ '517, в течение 8 дней и визуализировали во временных точках, указанных на графике. The mice were then orally administered twice a day with either vehicle (0.6% -ing sodium carboxymethylcellulose and 0.5% Tween 80) or 30 mg / kg of active compound of agonist PPARδ '517, for 8 days and visualized in timepoints indicated on the chart. Данные нормализовали на сигналы базовой линии в 0-й неделе. The data were normalized to baseline signals in the 0-th week. Наблюдалось относительное повышение люциферазного сигнала на 30-100% в группе действующего соединения '517 (n=15) относительно группы носителя (n=13), что, как полагают авторы, является следствием усиления дифференцировки клеток-предшественников олигодендроцитов. There was a relative increase in the luciferase signal by 30-100% in the active compound '517 (n = 15) relative to the carrier group (n = 13), that the authors considered to be a consequence of enhancing the differentiation of oligodendrocyte precursor cells.

Эффект '517 дополнительно подтверждали гистологически окрашиванием люксолом быстрым синим (LFB) в этом же исследовании (фигура 16). The effect of '517 further confirmed histologically staining lyuksolom fast blue (LFB) in the same study (Figure 16). Парасагиттальные тканевые срезы из фиксированного в формалине, заключенного в парафин мозга окрашивали LFB для количественной оценки миелина в мозолистом теле. Parasagittal tissue sections from formalin-fixed, paraffin brain enclosed in stained LFB for the quantification of myelin in the corpus callosum. Окрашенные среды для каждой временной точки оценивали и выставляли баллы по шкале от 0 (полная миелинизация) до 5 (полная демиелинизация). Painted medium for each time point were evaluated and displayed on a scale of 0 (full myelination) to 5 (complete demyelination). Система оценки была следующая: 0 = нормальный миелин, демиелинизация отсутствует, 1 = минимальная, локальная демиелинизация, 2 = слабая до средней, локальная демиелинизация, 3 = средняя, местами интенсивная демиелинизация, 4 = тяжелая, местами интенсивная демиелинизация, 5 = тяжелая, диффузная демиелинизация. rating system was as follows: 0 = normal myelin, demyelination absent, 1 = minimum, local demyelination, 2 = weak to moderate local demyelination, 3 = medium, sometimes intense demyelination, 4 = severe, sometimes intense demyelination, 5 = severe, diffuse demyelination. Гистологическая оценка срезов LFB-окрашенного мозга мышей после 4 недель на купризоне подтвердила средне-тяжелую демиелинизацию мозолистого тела гетерозиготных мышей линии 171 (n=5). Histological evaluation of stained sections LFB-mouse brain after 4 weeks at kuprizone confirmed medium-heavy demyelination of the corpus callosum 171 heterozygous mice (n = 5). Обработка действующим соединением '517 (n=5) по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (n=3), с 4-й по 5-ю неделю в течение фазы ремиелинизации привела к заметному увеличению количества миелина, определенному с помощью окрашивания LFB на 7-й неделе. Processing active compound '517 (n = 5) compared with the control group receiving vehicle (n = 3), 4 th 5 th week for phase remyelination resulted in a marked increase in the number of myelin determined using LFB staining 7th week. Несмотря на небольшое число животных в группах гистологические данные подтверждают in vivo данные биовизуализации люциферазы, указывая на увеличение ремиелинизации у мышей, получавших соединение '517, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Despite the small number of animals in groups Histological data confirm the in vivo data biovizualizatsii luciferase, indicating an increase in remyelination in mice treated with Compound '517, as compared with the control group treated with a carrier.

Второе исследование PPARδ 517 с гетерозиготными мышами линии 171 показало аналогичные результаты (данные не показаны, и также воздействие '517 было увеличено на три недели). The second study PPARδ 517 with line 171 heterozygous mice showed similar results (data not shown, and also the impact '517 was increased at three weeks). В согласии с первым исследованием (фигура 15) второе исследование также позволяет предположить, что '517 ускоряло дифференцировку клеток-предшественников олигодендроцитов на ранней стадии восстановления в ходе процесса ремиелинизации (M Lindner and S Heine, et al., Neuropathology and Applied Neurobiology , 34, 105-114, 2008). In accordance with the first study (figure 15) The second study also suggests that the '517 accelerates the differentiation of precursor cells of oligodendrocytes in the early stage of recovery during remyelination process (M Lindner and S Heine, et al., Neuropathology and Applied Neurobiology, 34, 105-114, 2008).

2. Детекция с помощью мышей MBP-luci эффектов агониста ERβ, '5a, или соединения положительного контроля, QTP, на экспрессию миелина. 2. Detection using mouse MBP-luci agonist effects ERβ, '5a, compound or positive control, QTP, the expression of myelin.

Эстрогеновые рецепторы (ER) принадлежат к семейству стероидных ядерных рецепторов, которые действуют напрямую на ДНК через специфичные респонсивные элементы и модулируют экспрессию генов. Estrogen receptors (ER) belong to the family of steroid nuclear receptors that act directly on through specific DNA responsive elements and modulate gene expression. Существует два подтипа ER - ERα и ERβ. There are two subtypes of ER - ERα and ERβ. ERα имеет высокий уровень экспрессии в матке, простате, яичниках, костной ткани, ткани молочных желез и мозге, в то время как ERβ присутствует в ткани толстой кишки, простаты, яичников, костного мозга и головного мозга. ERα has a high level of expression in the uterus, the prostate, ovary, bone, breast tissue, and brain, whereas ERβ is present in colon tissue, prostate, ovary, bone marrow and brain. Избирательное воздействие на ERβ представляет собой перспективный терапевтический подход, позволяющий избежать побочных эффектов от ERα. Selective effects on ERβ represents a promising therapeutic approach for avoiding adverse effects of ERα. На сегодняшний момент идентифицированы соединения, избирательно воздействующие на определенный подтип ER. To date, the identified compounds that selectively act on a specific subtype of ER.

Например, показано, что агонисты ERβ (а не ERα) обладают защитным действием в отношении олигодендроцитов и апоптоза клеток нейробластомы in vitro . For example, it is shown that agonists of ERβ (not ERα) have a protective effect against oligodendrocytes and apoptosis of neuroblastoma cells in vitro. Кроме того, ERβ или агонист ER ослабляет EAE и обладает нейропротекторным эффектом (сохранение миелина и аксонов). Furthermore, ERβ or ER agonist attenuates EAE and possesses neuroprotective effect (maintaining myelin and axons). Исходя из применения предшествующего действующего соединения агониста PPARδ, '517, линию MBP-luci использовали для определения профиля действа агониста ERβ, '5a, в купризоновой модели. Based on the application of the foregoing active agonist compounds PPARδ, '517, MBP-luci line was used to determine agonist activity profile ERβ,' 5a, in kuprizonovoy model. Кроме того, авторы включили лекарство против шизофрении от компании AstraZeneca, Кветиапин (в количестве 10 мг/кг, перорально, ежедневно), в качестве положительного контроля, исходя из его защитного эффекта на индуцированную купризоном демиелинизацию ( Schizophrenia Research , 2008 Dec 106, 182-91). Furthermore, the incorporated drug against schizophrenia is powered by AstraZeneca, Quetiapine (10 mg / kg, p.o., daily), as a positive control, on the basis of its protective effect on induced demyelination kuprizonom (Schizophrenia Research, 2008 Dec 106 182- 91). Было проведено два независимых исследования на гетерозиготных мышах линии 171 B6CH. Two independent studies were conducted on mice heterozygous line 171 B6CH.

Первое исследование (фигура 17) показало, что агонист ERβ, '5a, и положительный контроль, Кветиапин (QTP) обладали защитным действием на протяжении периода демиелинизации в купризоновой модели. The first study (Figure 17) showed that the agonist ERβ, '5a, and a positive control, quetiapine (QTP) has a protective effect for a period of demyelination in kuprizonovoy model. Гетерозиготных мышей B6C3H линии 171 MBP-luc кормили диетой, содержащей купризон, в течение 4 недель, и им перорально вводили '5a (10 мг/кг, N=12, или 30 мг/кг, N=16) или QTP (10 мг/кг, N=14). Heterozygous mice B6C3H line 171 MBP-luc were fed diets containing kuprizon, for 4 weeks, and they were orally administered '5a (10 mg / kg, N = 12, or 30 mg / kg, N = 16) or QTP (10mg / kg, N = 14). Визуализацию мышей проводили в 0-ю неделю (базовая линия), данные 3-й и 4-й недели нормализовали на базовую линию в 0-й неделе. Imaging was performed in mice 0th week (baseline), the data of 3rd and 4th weeks were normalized to the baseline in the 0th week. Аналогично предшествующему исследованию (фигура 15) группа носителя давала 49%-ное (3-я неделя) и 45%-ное (4-я неделя) снижение сигнала биовизуализации. Similarly, previous studies (Figure 15) gave the vehicle group 49% bonus (Week 3) and 45% cent (Week 4) reduction biovizualizatsii signal. Группа QTP показывала значительное увеличение сигнала относительно группы контроля-носителя как на 3-й неделе, так и на 4-й неделе в количестве 10 мг/кг. QTP group showed a significant increase in signal relative to the control group of the carrier as the third week and at the 4th week in an amount of 10 mg / kg. Результаты для воздействия QTP соответствовали данным, опубликованным Zhang et al. Results for exposure QTP matched data published by Zhang et al. ( Schizophrenia Research , 2008, 106:182-91). (Schizophrenia Research, 2008, 106: 182-91). Соединение '5a в количестве 30 мг/кг показывало значительное увеличение сигнала относительно носителя на 4-й неделе, однако не показывало достоверной разницы относительно сигнала в количестве 10 мг/кг на 3-й или 4-й неделе. Compound '5a in an amount of 30 mg / kg showed a significant increase in signal relative to the carrier at the 4th week, but did not show significant difference relative to the signal at 10 mg / kg on the 3rd or 4th week. Эти результаты позволяют предположить, что модель визуализации MBP-luci можно использовать для исследования дозозависимых защитных эффектов на купризоновой модели. These results suggest that the model to visualize the MBP-luci can be used to study dose-dependent protective effect on kuprizonovoy model.

Дополнительное исследование (фигура 18) было спланировано для подтверждения результата первого исследования (фигура 17), но с большей когортой для групп носителя и соединения '5a в количестве 30 мг/кг. An additional study (Figure 18) was designed to confirm the result of the first study (Figure 17), but with a larger cohort for the carrier and compound '5a group in an amount of 30 mg / kg. В согласии с результатами первого исследования воздействие на мышей QTP в количестве 10 мг/кг (N=17) давало статистически значимое ингибирование индуцированного купризоном снижения сигнала по сравнению с контрольной группой носителя (N=25) на 3-й неделе (25%-ное относительно 47%-ного снижения, p =0,028) и на 4-й неделе (6%-ное повышение относительно 25%-ного снижения). In agreement with the results of the first study on the effect of mice QTP in an amount of 10 mg / kg (N = 17) yielded a statistically significant inhibition of the induced signal kuprizonom reduction compared to vehicle control group (N = 25) at week 3 (25% concerning 47% reduction, p = 0,028) and week 4 (6% increase with respect to a 25% reduction). Кроме того, '5a в количестве 30 мг/кг (N=27) приводил к значительно большей активности трансгена по сравнению с контрольной группой носителя на 3-й неделе (31%-ное относительно 47%-ного снижения, p=0,0079) и 4-й неделе (6%-ное снижение относительно 25%-ного снижения, p=0,0015). In addition, '5a in an amount of 30 mg / kg (N = 27) resulted in significantly greater activity of the transgene as compared to vehicle control group on the 3rd week (31% bonus relative 47% reduction, p = 0,0079 ) and week 4 (6% reduction relative to 25% reduction, p = 0,0015).

Эти два исследования продемонстрировали, что соединение '5a в количестве 30 мг/кг предупреждало в значительной степени индуцированное купризоновой диетой снижение сигнала биовизуализации в ЦНС хотя и не до такой же степени как положительный контроль, QTP, в количестве 10 мг/кг (в условиях, используемых в данных экспериментах). These two studies demonstrate that compound '5a in an amount of 30 mg / kg prevented largely induced kuprizonovoy diet reduction biovizualizatsii signal in the CNS though not to the same extent as the positive control, QTP, in an amount of 10 mg / kg (in terms used in these experiments). Поскольку в предшествующих исследованиях показано прямое взаимодействие между выраженностью миелинизации ЦНС и сигналом биовизуализации от MBP-luci, данные результаты позволяют предположить, что оба соединения, '5a и QTP, предупреждают демиелинизацию в ЦНС на протяжении введения купризоновой диеты. As in previous studies have shown a direct interaction between the severity of CNS myelination and biovizualizatsii signal from MBP-luci, these results suggest that both compounds, '5a and QTP, prevent demyelination in CNS throughout administration kuprizonovoy diet. Данные модели визуализации позволяют предположить, что и QTP, и '5a, ослабляют индуцированную купризоном демиелинизацию мозга и разрушение миелина. Data visualization models suggest that QTP, and '5a, impaired brain kuprizonom induced demyelination and disruption of myelin.

3. Сравнение линий MBP-luci в купризоновой модели. 3. Comparison of the MBP-luci lines kuprizonovoy model.

Для определенных вариантов применения биовизуализации было создано шесть трансгенных линий на основе различных штаммов. For certain embodiments biovizualizatsii application was created six transgenic lines based on different strains.

Проводили сравнение сигнала визуализации от гомозиготных и гетерозиготных мышей линии 171 В6С3Н в купризоновой модели (фиг.19). Comparisons were visualization signal from homozygous and heterozygous mice in 171 V6S3N kuprizonovoy model (19). Две копии репортерного гена у гомозиготных животных показывали более чем двукратное снижение сигнала на протяжении фазы демиелинизации и более чем двукратное увеличение сигнала в течение фазы ремиелинизации. Two copies of the reporter gene in homozygous animals showed a more than twofold decrease in signal over demyelination phase and more than two-fold increase in signal during remyelination phase. Хотя продемонстрировано, что гетерозиготная линия 171 (штамм B6C3H) работает в купризоновой модели и может детектировать эффекты соединений, ожидается, что модель можно дополнительно улучшить скрещиванием до гомозиготности для повышения интенсивности сигнала биовизуализации. Although shown that heterozygous line 171 (B6C3H strain) operates in kuprizonovoy model and can detect the effects of the compounds, it is expected that the model can be further improved by crossing to homozygosity for increasing the intensity biovizualizatsii signal. Это упростило бы получение моделей и снизило бы расходы на генотипирование, поскольку колонии мышей можно содержать как гомозиготные. This would make it easier to obtain the models and reduce the costs to the genotyping as mice colonies can contain both homozygous. Более того, чем больше окно визуализации, тем более чувствительна модель в отношении детекции индуцированных соединениями изменений. Moreover, the larger the imaging window, the more sensitive model for detecting in respect of changes induced by the compounds.

На фигуре 20 показано сравнение гистологических данных окрашивания LFB для трех различных линий в купризоновой модели. Figure 20 shows a comparison of histological staining LFB data for three different lines in kuprizonovoy model. Количественные данные окрашивания LFB подтвердили результаты биовизуализации, полученные с линией 171 B6C3H, что гомозиготные мыши имеют более ярко выраженную демиелинизации, индуцированную купризоном; Quantitative data LFB staining biovizualizatsii confirmed the results obtained with the line 171 B6C3H, that homozygous mice have more pronounced demyelination induced kuprizonom; аналогичную тяжести, наблюдаемой для обычно используемого штамма мышей C57 BL/6 дикого типа. similar to gravity, that observed for the commonly used mouse strain C57 BL / 6 wild type. Гетерозиготные мыши линии 171 показывали менее тяжелую демиелинизацию, в то время как эти гетерозиготные мыши линии 171 показывали наименьшую степень индуцированной купризоном демиелинизации. Heterozygous mice line 171 showed less severe demyelination, while the heterozygous mouse lines 171 showed the lowest degree kuprizonom induced demyelination.

На фигуре 21 продемонстрировано, что линия MBP-luci с наибольшим снижением сигнала биовизуализации также имела наибольшую демиелинизацию, оцениваемую гистологически. Figure 21 demonstrated that MBP-luci line with the greatest decrease biovizualizatsii signal also had the greatest demyelination as assessed histologically. Три различных линии MBP-luci (гетерозиготный штамм B6C3H линии 171, гетерозиготный штамм C57BL/6 линии 121 и гомозиготный штамм B6C3H линии 171) сравнивали с помощью биовизуализации и гистологического окрашивания люксолом быстрым синим (LFB; окрашивание миелина). Three different lines MBP-luci (heterozygous strain B6C3H line 171, heterozygous strain C57BL / 6 homozygous lines 121 and line 171 B6C3H strain) were compared using biovizualizatsii and histological staining lyuksolom fast blue (LFB; myelin staining). Мышей помещали на диету, содержащую 0,2% купризона в течение 4 или 5 недель. Mice were placed on a diet containing 0.2% kuprizona for 4 or 5 weeks. Данные визуализации нормализовали на измерения базовой линии в 0-й неделе. imaging data were normalized to the baseline measurement in the 0-th week. В конце каждого исследования собирали мозг мышей и окрашивали серии парафиновых срезов на миелин с помощью LFB. At the end of each study, we collected the brains of mice and stained with a series of paraffin sections on myelin using LFB. Средняя качественная LFB-оценка (0-5) показана в таблице на фигуре 21. Гомозиготные мыши линии 171 B6C3H показывали наибольшее снижение сигнала визуализации и также демонстрировали наиболее интенсивную демиелинизацию, определенную с помощью качественной гистологической оценки. LFB-average quality score (0-5) is shown in the table in Figure 21. Homozygous mice B6C3H line 171 showed the greatest reduction imaging signal, and also showed the most intense demyelination as determined by a qualitative histological evaluation. Гетерозиготные мыши линии 171 B6C3H показывали наименьшее окно визуализации, а также наименьшую гистологическую демиелинизацию на 4-й неделе. Heterozygous mice B6C3H line 171 showed the smallest imaging window, as well as the lowest histological demyelination in the 4th week. Гомозиготные мыши линии 171 B6C3H имели наибольшее снижение сигнала биовизуализации на протяжении кормления животных пищей с купризоном относительно своей базовой линии до начала кормления купризоном. Homozygous mouse line 171 B6C3H had the greatest reduction biovizualizatsii signal for feeding food kuprizonom with respect to its base line to start feeding kuprizonom. Например, через три недели на купризоновой диете гомозиготные мыши 171 B6C3H имели 72%-ное снижение сигнала (отношение сигнала на 3-й неделе к сигналу в 0-й неделе, p<0,05), в то время как гетерозиготные мыши линии 171 B6C3H имели 45%-ное снижение сигнала биовизуализации (относительно 0-й недели, p<0,05). For example, after three weeks on the diet kuprizonovoy 171 B6C3H homozygous mouse had 72% reduction of the signal (ratio of signal to the 3rd week to the signal on the 0-th week, p <0,05), whereas heterozygous mouse lines 171 B6C3H had 45% reduction biovizualizatsii signal (relative to the 0-th weeks, p <0,05). Гетерозиготные мыши линии 121 C57 BL/6 имели наименьшее снижение люциферазного сигнала (33%-ное снижение на 3-й неделе относительно 0-й недели, p<0,05). Heterozygous mouse lines 121 C57 BL / 6 had the least decrease in luciferase signal (33% reduction at Week 3 relative 0th weeks, p <0,05).

Чувствительность и ответную реакцию модели MBP-luci дополнительно подтверждали воздействием QTP (10 мг/кг) на гомозиготных мышей 171 B6C3H, которое показано на фигуре 22. В согласии с результатами, полученными с использованием гетерозиготных мышей 171 B6C3H (фигуры 17 и 18), показано, что QTP (10 мг/кг) значительно предупреждает снижение сигнала биовизуализации. The sensitivity and response of MBP-luci model further confirmed exposure QTP (10 mg / kg) on ​​mice homozygous 171 B6C3H, which is shown in Figure 22. Consistent with the results obtained using mice heterozygous 171 B6C3H (figures 17 and 18) is shown that QTP (10 mg / kg) significantly decrease biovizualizatsii warning signal. Исходя из этих результатов гомозиготные мыши линии 171 B6C3H были идентифицированы в качестве оптимальной линии для модели биовизуализации индуцированной купризоном демиелинизации. Based on these results, mice homozygous line 171 B6C3H been identified as the best line for the model biovizualizatsii kuprizonom induced demyelination.

4. Дополнительное применение модели MBP-luci 4. Additional application MBP-luci model

Мыши MBP-luci экспрессируют люциферазу как в головном, так и в спинном мозге. Mouse MBP-luci express luciferase in the brain and in the spinal cord. Как показано на фигуре 23, люминесцентный сигнал в основном наблюдался в области белого вещества головного и спинного мозга. As shown in Figure 23, the luminescent signal is generally observed in the white matter of the brain and spinal cord. Кроме того, что визуализация люциферазы в головном мозге была успешно продемонстрирована для применения в купризоновой модели, сигнал визуализации люциферазы в спинном мозге можно использовать в экспериментальной аллергической энцефалитной (ЕАЕ) модели рассеянного склероза или применять в качестве модели спинного мозга. Besides that visualization of luciferase in the brain has been successfully demonstrated for use in the Model kuprizonovoy, luciferase imaging signal in the spinal cord can be used as experimental allergic encephalitis (EAE) model of multiple sclerosis, or used as a model of spinal cord.

Claims (11)

  1. 1. Способ мониторинга демиелинизации или ремиелинизации в живом млекопитающем, не являющемся человеком, где указанный способ включает: 1. A method of monitoring demyelination or remyelination in a living mammal other than a human, wherein said method comprises:
    трансгенную модификацию указанного млекопитающего, не являющегося человеком, для экспрессии гена люциферазы под контролем промотора основного белка миелина (МВР), где указанный МВР-промотор содержит регуляторные модули М1-М4 или содержит модули М1-М3; modification of said transgenic mammal, non-human, for the expression of the luciferase gene under the control of a promoter of myelin basic protein (MBP) MBP wherein said promoter contains regulatory modules M1-M4 or contains modules M1 to M3;
    мониторинг биолюминесценции указанного млекопитающего; monitoring the bioluminescence of said mammal; и and
    корреляцию указанного светового выхода с определенными участками тела указанного млекопитающего, не являющегося человеком; correlation of said light output with certain portions of said mammal's body, is not a man;
    повторение указанного мониторинга в том же млекопитающем, не являющемся человеком, в отличное от времени указанного исходного мониторинга; repeating said monitoring in the same mammal other than a human, in different from said initial monitoring time; и and
    сравнение выхода событий указанного мониторинга для наблюдения изменения миелинизации в организме того же млекопитающего, не являющегося человеком. comparing the output of said monitoring events to monitor changes in myelination in the body of the mammal, non-human.
  2. 2. Способ по п. 1, где указанным млекопитающим, не являющимся человеком, является мышь. 2. A method according to Claim. 1, wherein said mammal, non-human, a mouse.
  3. 3. Способ по п. 1, дополнительно включающий: . 3. The method of claim 1, further comprising:
    нормализацию сигнала визуализации на протяжении интервалов демиелинизации или ремиелинизации, причем указанная визуализация на протяжении интервалов эффективно определяет изменения в уровне транскрипта МВР в указанном млекопитающем, не являющемся человеком, на протяжении указанных интервалов. normalizing the imaging signal over the intervals of demyelination and remyelination, said visualization during intervals effectively detects changes in transcript levels of MBP in said mammal other than a human, for specified intervals.
  4. 4. Трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, для мониторинга демиелинизации или ремиелинизации, содержащее введенную генную кассету, содержащую ген люциферазы, управляемый промотором основного белка миелина (МВР), где указанный МВР-промотор содержит регуляторные модули М1-М4 или содержит модули М1-М3. 4. The transgenic mammal, non-human, for monitoring demyelination or remyelination, comprising administering a gene cassette comprising the luciferase gene driven by promoter, myelin basic protein (MBP) MBP wherein said promoter contains regulatory M1-M4 or modules comprises modules M1 to M3 .
  5. 5. Трансгенное млекопитающее по п. 4, где указанное млекопитающее, не являющееся человеком, является мышью. 5. A transgenic mammal according to claim. 4, wherein said mammal is non-human, a mouse.
  6. 6. Способ по п. 1, где указанное млекопитающее, не являющееся человеком, имеет белый волосяной покров или редеющий волосяной покров. 6. The method of claim. 1, wherein the mammal is not a human, has a white scalp or body hair thinning.
  7. 7. Способ по п. 6, где волосяной покров указанного млекопитающего, не являющегося человеком, поглощает меньше света в диапазоне длин волн 530-640 нм по сравнению с мышью С57/В6. 7. The method of claim. 6 where pelage said mammal a non-human absorbs less light in the wavelength range 530-640 nm as compared to the mouse C57 / B6.
  8. 8. Способ по п. 1, где указанным способом осуществляют мониторинг эффекта соединения по меньшей мере на одно событие демиелинизации или ремиелинизации. 8. The method of claim. 1 wherein said method is carried out monitoring the effect of a compound is at least one event demyelination or remyelination.
  9. 9. Способ по п. 1, в котором указанным способом осуществляют мониторинг эффекта генного события. 9. A method according to Claim. 1, wherein said process monitor genetic events effect.
  10. 10. Способ по п. 1, где определенный участок тела указанного млекопитающего, не являющегося человеком, выбран из группы, состоящей из периферической нервной системы и центральной нервной системы. 10. The method of claim. 1, where a specific area of ​​the body of said mammal, non-human is selected from the group consisting of peripheral nervous system and the central nervous system.
  11. 11. Способ определения эффекта соединения или агента на демиелинизацию или ремиелинизацию в живом млекопитающем, не являющемся человеком, где указанный способ включает: 11. A method for determining the effect of the compound or agent to demyelination and remyelination in a living mammal other than a human, wherein said method comprises:
    трансгенную модификацию указанного млекопитающего для экспрессии гена люциферазы под контролем промотора основного белка миелина (МВР); modifying said mammal transgenic for expression of the luciferase gene under the control of a promoter of myelin basic protein (MBP);
    мониторинг биолюминесценции указанного млекопитающего, не являющегося человеком; monitoring bioluminescence said mammal a non-human;
    корреляцию указанного светового выхода с определенными участками тела указанного млекопитающего, не являющегося человеком; correlation of said light output with certain portions of said mammal's body, is not a man;
    введение соединения или агента, эффект на демиелинизацию и ремиелинизацию которого определяется в живом млекопитающем, не являющемся человеком; administering the compound or agent, the effect on the demyelination and remyelination is determined in a living mammal other than a human;
    повторение указанного мониторинга в том же млекопитающем, не являющемся человеком, после введения соединения или агента; repeating said monitoring in the same mammal other than a human, after administration of the compound or agent;
    сравнение выхода событий указанного мониторинга; comparing the output of said monitoring events; и and
    определение эффекта соединения или агента на миелинизацию на основании сравнения событий указанного мониторинга, где уменьшение сигнала визуализации соответствует увеличению демиелинизации, а увеличение сигнала визуализации соответствует увеличению ремиелинизации. determining compound effects on myelination or agent on the basis of comparing said monitoring events, where the reduction imaging signal corresponding to an increase of demyelination and increase imaging signal corresponds to increasing remyelination.
RU2012130092A 2009-12-17 2010-12-03 Animal model expressing luciferase under control of the myelin basic protein promoter (mbp-luci) and use of the model for bioluminescence in vivo imaging RU2601128C2 (en)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28737109 true 2009-12-17 2009-12-17
US61/287,371 2009-12-17
US33463710 true 2010-05-14 2010-05-14
US61/334,637 2010-05-14
FR1057581 2010-09-21
FR1057581 2010-09-21
PCT/US2010/058823 WO2011084281A1 (en) 2009-12-17 2010-12-03 Animal model expressing luciferase under control of the myelin basic protein promoter (mbp-luci) and use of the model for bioluminescence in vivo imaging

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012130092A true RU2012130092A (en) 2014-01-27
RU2601128C2 true RU2601128C2 (en) 2016-10-27

Family

ID=44305684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012130092A RU2601128C2 (en) 2009-12-17 2010-12-03 Animal model expressing luciferase under control of the myelin basic protein promoter (mbp-luci) and use of the model for bioluminescence in vivo imaging

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20130117868A1 (en)
EP (2) EP3138396A1 (en)
JP (2) JP6068981B2 (en)
KR (1) KR20120107113A (en)
CN (2) CN104975042A (en)
CA (1) CA2784652A1 (en)
RU (1) RU2601128C2 (en)
WO (1) WO2011084281A1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101510252B1 (en) * 2013-11-15 2015-04-10 대한민국 Specific light wavelength BrEXPA1 promoter from brassica rapa and uses thereof
USD810293S1 (en) 2017-01-20 2018-02-13 Garrison Dental Solutions, Llc Dental instrument

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2085587C1 (en) * 1986-06-30 1997-07-27 ППЛ Терепьютикс (Скотленд) Лимитед Method of transgenic sheep producing
WO2008022045A2 (en) * 2006-08-10 2008-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Differential labeling of cells
WO2009023517A2 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 Wayne State University Compositions and methods for detecting and modulating cell death by a translation regulated gene expression system

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5650135A (en) 1994-07-01 1997-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
WO2002051981A3 (en) * 2000-12-13 2004-12-02 Baylor College Medicine Defects in periaxin associated with myelinopathies
US7285415B2 (en) * 2002-07-11 2007-10-23 The Regents Of The University Of California Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
JP2005532814A (en) * 2002-07-17 2005-11-04 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company The transgenic non-human mammal expressing a reporter nucleic acid under the control of androgen responsive element
JP2004242419A (en) * 2003-02-05 2004-08-26 Sumitomo Heavy Ind Ltd Overload detection device for motor
EP2073833A2 (en) * 2006-10-20 2009-07-01 Biogen Idec MA Inc. Treatment of demyelinating disorders with soluble lymphotoxin-beta-receptor
JP2008125452A (en) * 2006-11-21 2008-06-05 Tohoku Univ Nonhuman mammal of oligodendrocyte developmental disorder model

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2085587C1 (en) * 1986-06-30 1997-07-27 ППЛ Терепьютикс (Скотленд) Лимитед Method of transgenic sheep producing
WO2008022045A2 (en) * 2006-08-10 2008-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Differential labeling of cells
WO2009023517A2 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 Wayne State University Compositions and methods for detecting and modulating cell death by a translation regulated gene expression system

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FARHADI H.F. ET AL., A COMBINATORIAL NETWORK OF EVOLUTIONARILY CONSERVED MYELIN BASIC PROTEIN REGULATORY SEQUENCES CONFERS DISTINCT GLIAL-SPECIFIC PHENOTYPES, JOURNAL OF NEUROSCIENCE, 2003 v. 23, no. 32, p. 10214-10223. LUO J. ET AL., Bioluminescence in vivo imaging of autoimmune encephalomyelitis predicts disease, JOURNAL OF NEUROINFLAMMATION, 2008, v. 5, no.6, p.1-6. *

Also Published As

Publication number Publication date Type
EP2512227B1 (en) 2016-11-02 grant
RU2012130092A (en) 2014-01-27 application
JP6068981B2 (en) 2017-01-25 grant
US20160066550A1 (en) 2016-03-10 application
CA2784652A1 (en) 2011-07-14 application
JP2013514534A (en) 2013-04-25 application
CN102770020B (en) 2015-07-15 grant
EP2512227A1 (en) 2012-10-24 application
CN104975042A (en) 2015-10-14 application
CN102770020A (en) 2012-11-07 application
WO2011084281A1 (en) 2011-07-14 application
US20130117868A1 (en) 2013-05-09 application
EP3138396A1 (en) 2017-03-08 application
JP2017102120A (en) 2017-06-08 application
KR20120107113A (en) 2012-09-28 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Iijima et al. Dissecting the pathological effects of human Aβ40 and Aβ42 in Drosophila: a potential model for Alzheimer's disease
Shin et al. The temporal requirement for endothelin receptor-B signalling during neural crest development
Mi et al. LINGO-1 negatively regulates myelination by oligodendrocytes
Roberson et al. Amyloid-β/Fyn–induced synaptic, network, and cognitive impairments depend on tau levels in multiple mouse models of Alzheimer's disease
Feany et al. A Drosophila model of Parkinson's disease
Alexander et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors
Kelley et al. Potentiation of excitotoxicity in transgenic mice overexpressing neuronal cyclooxygenase-2
Chen et al. Fragile X mice develop sensory hyperreactivity to auditory stimuli
Kempermann et al. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice
Friedman et al. Disrupted autophagy leads to dopaminergic axon and dendrite degeneration and promotes presynaptic accumulation of α-synuclein and LRRK2 in the brain
Maries et al. The role of α-synuclein in Parkinson's disease: insights from animal models
Jones et al. Prevention of the neurocristopathy Treacher Collins syndrome through inhibition of p53 function
Terman Garbage catastrophe theory of aging: imperfect removal of oxidative damage?
Revest et al. Adult hippocampal neurogenesis is involved in anxiety-related behaviors
Baker et al. The structure of the chromosomes in human primordial oocytes
Tsai et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice
MacLennan et al. An essential role for the H218/AGR16/Edg‐5/LPB2 sphingosine 1‐phosphate receptor in neuronal excitability
Nakazawa et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis
Berman et al. Germ-cell loss extends C. elegans life span through regulation of DAF-16 by kri-1 and lipophilic-hormone signaling
Vila et al. Bax ablation prevents dopaminergic neurodegeneration in the 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease
Meziane et al. Estrous cycle effects on behavior of C57BL/6J and BALB/cByJ female mice: implications for phenotyping strategies
Kupchik et al. Coding the direct/indirect pathways by D1 and D2 receptors is not valid for accumbens projections
Buxbaum et al. Transthyretin protects Alzheimer's mice from the behavioral and biochemical effects of Aβ toxicity
Comery et al. Acute γ-secretase inhibition improves contextual fear conditioning in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease
Stork et al. Increased intermale aggression and neuroendocrine response in mice deficient for the neural cell adhesion molecule (NCAM)