RU2585537C1 - ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР УСТОЙЧИВЫХ ТОКСИЧНЫХ ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ - Google Patents
ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР УСТОЙЧИВЫХ ТОКСИЧНЫХ ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2585537C1 RU2585537C1 RU2015113129/10A RU2015113129A RU2585537C1 RU 2585537 C1 RU2585537 C1 RU 2585537C1 RU 2015113129/10 A RU2015113129/10 A RU 2015113129/10A RU 2015113129 A RU2015113129 A RU 2015113129A RU 2585537 C1 RU2585537 C1 RU 2585537C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- lindane
- hexachlorocyclohexane
- hexachlorobenzene
- rhodococcus wratislaviensis
- Prior art date
Links
- 241000168435 Rhodococcus wratislaviensis Species 0.000 title claims abstract description 25
- 150000004045 organic chlorine compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 title claims description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 title claims description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 title claims 2
- JLYXXMFPNIAWKQ-GNIYUCBRSA-N gamma-hexachlorocyclohexane Chemical compound Cl[C@H]1[C@H](Cl)[C@@H](Cl)[C@@H](Cl)[C@H](Cl)[C@H]1Cl JLYXXMFPNIAWKQ-GNIYUCBRSA-N 0.000 claims abstract description 30
- JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N gamma-hexachlorocyclohexane Natural products ClC1C(Cl)C(Cl)C(Cl)C(Cl)C1Cl JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 150000003071 polychlorinated biphenyls Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 229960002809 lindane Drugs 0.000 claims abstract description 19
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- CKAPSXZOOQJIBF-UHFFFAOYSA-N hexachlorobenzene Chemical compound ClC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl CKAPSXZOOQJIBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 abstract description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 14
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 13
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 8
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 8
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 8
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 150000004074 biphenyls Chemical class 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 3
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 3
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- VAHKBZSAUKPEOV-UHFFFAOYSA-N 1,4-dichloro-2-(4-chlorophenyl)benzene Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1=CC(Cl)=CC=C1Cl VAHKBZSAUKPEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzoic acid Chemical class OC(=O)C1=CC=CC=C1Cl IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000005165 hydroxybenzoic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007057 medium with biphenyl Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- AGCPZMJBXSCWQY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,3,4-pentachlorobutane Chemical compound ClCC(Cl)C(Cl)C(Cl)Cl AGCPZMJBXSCWQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000005206 1,2-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- IUYHQGMDSZOPDZ-UHFFFAOYSA-N 2,3,4-trichlorobiphenyl Chemical group ClC1=C(Cl)C(Cl)=CC=C1C1=CC=CC=C1 IUYHQGMDSZOPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFNIBRDIUNVOMX-UHFFFAOYSA-N 2,4'-dichlorobiphenyl Chemical group C1=CC(Cl)=CC=C1C1=CC=CC=C1Cl UFNIBRDIUNVOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTYNSQSZHARAZ-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichloro-1-(4-chlorophenyl)benzene Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl BZTYNSQSZHARAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAXBNTIAOJWAOP-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobiphenyl Chemical group ClC1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 LAXBNTIAOJWAOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GQKDZDYQXPOXEM-UHFFFAOYSA-N 3-chlorocatechol Chemical compound OC1=CC=CC(Cl)=C1O GQKDZDYQXPOXEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTBRNEUEFCNVHC-UHFFFAOYSA-N 4,4'-dichlorobiphenyl Chemical group C1=CC(Cl)=CC=C1C1=CC=C(Cl)C=C1 YTBRNEUEFCNVHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N HMF acid Natural products OCC1=CC=C(C(O)=O)O1 PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000008953 bacterial degradation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000010429 evolutionary process Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Substances CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- -1 polychlorinated biphenyl-2,4′-dichlorobiphenyl Chemical group 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000006042 reductive dechlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625, обладающий способностью эффективно разлагать комплекс хлорорганических соединений: полихлорированные бифенилы, гексахлорбензол, γ-гексахлорциклогексан (линдан), дихлордифенилтрихлорэтан, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ Ас-2631D. Изобретение позволяет повысить эффективность деструкции полихлорированных бифенилов, гексахлорбензола, γ-гексахлорциклогексана (линдана), дихлордифенилтрихлорэтана. 3 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый аэробный штамм бактерий, способный эффективно разлагать комплекс хлорорганических соединений: полихлорированные бифенилы, гексахлорбензол, γ-гексахлорциклогексан (линдан), дихлордифенилтрихлорэтан.
Данные вещества включены в группу стойких органических загрязнителей (см. Федеральный закон РФ от 27.06.2011 N 164-ФЗ "О ратификации Стокгольмской конвенции о стойких органических загрязнителях".
Однако при реализации положений Стокгольмской конвенции возникает проблема уничтожения соединений группы стойких органических загрязнителей, так как за длительный период производства и применения накоплены сотни тонн данных веществ (см., например, Трегер Ю.А. Стойкие органические загрязнители. Проблемы и пути их решения // Вестник МИТХТ, 2011, т. 6, №5), значительная часть которых попала в окружающую среду.
Исследования последних десятилетий показали, что наиболее экологически безопасным способом утилизации полихлорированных бифенилов, гексахлорбензола, γ-гексахлорциклогексана (линдана), дихлордифенилтрихлорэтана является их биологическая деструкция с использованием бактерий (см., например, Васильева Г.К., Стрижакова Е.П. Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными бифенилами //Микробиология. 2007. Т.76. №6. С.725-741; Beyer A., Biziuk М. Environmental fate and global distribution of polychlorinated biphenyls // Rev. Environ. Contamin. Toxic. 2009. V. 201. P. 137-158). Имеются сведения о бактериальных штаммах родов Pseudomonas, Burkcholderia и Rhodococcus, осуществляющих полное разложение отдельных конгенеров низкохлорированных бифенилов (см., например, описание изобретения «Bacterial degradation of 4-biphenil» к патенту US 4999300 А, дата публикации 12.03.1991; описание изобретения Compositions and methods useful in bioremediation of polychlorinated biphenyls» к патенту US 6537797 (B1), дата публикации 25.03.2003; описание изобретения «Штамм бактерии Rhodococcus ruber - деструктор полихлорированных бифенилов» к патенту RU 2262531 С2, дата публикации 20.10.2005). Выделены и описаны штаммы бактерий, осуществляющих разложение дихлордифенилтрихлорэтана, линдана и α (β)-гексахлорциклогексана (см., например, Xie H., Zhu L., Xu Q., Wang J., Liu W., Jiang J., Meng Y. Isolation and degradation ability of the DDT-degrading bacterial strain KK // Environ. Earth Sci. 2011. V. 62. P. 93 - 99; Ortiz I., Velasco A., Le Borgne S., Revah S. Biodegradation of DDT by stimulation of indigenous microbial populations in soil with cosubstrates // Biodegradation. 2013. V. 24. P. 215-225; Kumar M., Gupta S.K., Garg S.K., Kumar A. Biodegradation of hexachlorocyclohexaneisomers in contaminated soils // Soil Biology Biochemistry. 2006. V. 38. P. 2318 - 2327; Camacho-Perez В., Rios-Leal E., Rinderknecht-Seijas N., Poggi-Varaldo H.M. Enzymes involved in the biodegradation of hexachlorocyclohexane: A mini review // J. Environmental Management. V. 95. P. S306-S318; Abhilash P.C., Srivastava S., Singh N. Comparative bioremediation potential of four rhizospheric microbial species against lindane // Chemosphere. 2011. V. 82. P. 56-63; Benimeli C.S., Castro G.R., Chaile A.P., Amoroso MJ. Lindane uptake and degradation by aquatic Streptomyces sp.strain M7 // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2007. V.59. P. 148-155).
Имеются ограниченные сведения об анаэробном разложении гексахлорбензола микроорганизмами (см., например, Reineke W. Aerobic and anaerobic biodegradation potentials of microorganisms //The handbook of environmental chemistry Vol.2, Part К / Biodegradation and persistence (ed. by B. Beek), Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg. 2001. 161 p.; Brahushi F., Dorfler U., Schroll R., Munch J.Ch. Stimulation of reductive dechlorination of hexachlorobenzene in soil by inducing the native microbial activity // Chemosphere. 2004. V. 55. P. 1477-1484).
Сведения о бактериальных штаммах, эффективно утилизирующих несколько соединений группы стойких органических загрязнителей в общедоступных информационных источниках, отсутствуют.
Задача изобретения - выделение и описание аэробного бактериального штамма, эффективно разлагающего несколько соединений группы стойких органических загрязнителей, а именно полихлорированных бифенилов, гексахлорбензола, γ-гексахлорциклогексана (линдана) и дихлордифенилтрихлорэтана.
Технический результат выражается в высокой эффективности разложения (деструкции) нескольких соединений группы стойких органических загрязнителей, а именно полихлорированных бифенилов, гексахлорбензола, γ-гексахлорциклогексана (линдана) и дихлордифенилтрихлорэтана.
Для достижения технического результата предлагается изоляция из загрязненной химическими соединениями почвы нового аэробного бактериального штамма, который в результате эволюционных процессов, вызванных длительным загрязнением, приобрел способность разрушать ряд соединений группы стойких органических загрязнителей.
Штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 выделен из почвы, загрязненной соединениями группы стойких органических загрязнителей и отобранной на территории бывшего Открытого Акционерного Общества «Средне-Волжский завод химикатов» (г. Чапаевск, Самарская обл., РФ). Морфо-физиологические признаки штамма: при росте в течение 3 суток на агаризованной богатой среде образует округлые, с изогнутым профилем (скопление биомассы в центре колонии), матовые, светло-розовые колонии размером 2-3 мм; характеризуется жизненным циклом кокк-палочка-кокк, способен к росту в широком диапазоне температур - от 8 до 42°С, с оптимумом 25-30°С; активный рост культуры происходит при рН среды 6-9. Штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 депонирован 07.05.2013 Всероссийской коллекцией микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) по адресу проспект Науки, д. 5, г. Пущино, Московская обл., 142290 под регистрационным номером ВКМ AC-2631D.
Генетические признаки: по нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК наиболее близок (гомология 100%) к штамму Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082T.
На основании морфо-физиологических и молекулярно-генетических признаков штамм идентифицирован как Rhodococcus wratislaviensis.
Преимуществом данного изобретения является способность штамма Rhodococcus wratislaviensis Ch625 разлагать несколько соединений группы стойких органических загрязнителей, а именно полихлорированных бифенилов, гексахлорбензола, γ-гексахлорциклогексана (линдана) и дихлордифенилтрихлорэтана без накопления токсичных продуктов разложения. Деструктивная активность штамма проявляется в стандартных экологических условиях и не требует серьезных экономических затрат для их создания.
Штамм с такими свойствами описан впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Пример 1.
Выделение штамма из загрязненной почвы.
Для выделения штамма-деструктора использовали метод накопительных культур: 1 г почвы, загрязненной соединениями группы СОЗ и отобранной на территории бывшего Открытого Акционерного Общества «Средне-Волжский завод химикатов» (г. Чапаевск, Самарская обл., РФ), помещали в колбы (объем 250 мл), содержащие 100 мл минеральной среды К1 (состав, г/л: К2НРO4×3Н2O-4.0; NaH2PO4×2Н2O-0.4; (NH4)2SO4-0.5;
MgSO4×7H2O-0.15; Ca(NO3)2×4H2O-0.01; NaMoO4×2H2O-0.18, FeSO4×7H2O-1.98) и бифенил в качестве источника углерода в количестве 1 г/л. Инкубация проводилась 1 месяц при 28°С.
Чистые культуры бактерий-деструкторов выделяли высевом накопительной культуры на чашки Петри с агаризованной минеральной средой К1 (концентрация агар-агара 15 г/л) и бифенилом в качестве единственного источника углерода и энергии с последующим отбором единичных колоний. Чистоту культур контролировали высевом на среду LB (состав, г/л: триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10, агар -15).
Штаммы, полученные из единичных колоний, проверяли на способность к разложению полихлорированных бифенилов, дихлордифенилтрихлорэтана, гексахлорциклогексана (линдана) и гексахлорбензола.
По результатам анализа деградационной активности был отобран штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625, эффективно разлагающий весь спектр представленных соединений.
Пример 2.
Разложение штаммом Rhodococcus wratislaviensis Ch625 полихлорированных бифенилов (отдельных конгенеров и коммерческих смесей).
Деструкцию полихлорированных бифенилов штаммом Rhodococcus wratislaviensis Ch625 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками». Штамм выращивали в жидкой среде К1 с бифенилом (1 г/л) при 28°С до ОП600=1-0. Отмытые дважды в среде К1 клетки (1 мл, ОП600=2.0) переносили во флаконы с тефлоновыми крышками.
В качестве субстрата вносили ацетоновый раствор хлорбифенилов до конечной концентрации: монохлорбифенил - 100 мг/л, дихлорбифенил - 50 мг/л, трихлорбифенил -50 мг/л, «Делор 103» - 0.14 мг/л, «Совол» - 0.53 мг/л.
Для выделения хлорированных бифенилов культуральную жидкость экстрагировали смесью конц. Н2SO4-12.5%-ный додецилсульфат-Na-гексан (1:10:25) в течение 60 мин при 30°С, скорость перемешивания 200 об/мин. Экстракты обезвоживали Na2SO4 и анализировали на газовом хроматографе GC6890N ("Agilent Technology", США) с масс-селективным детектором MSD5973N ("Agilent Technology", США).
Количественное содержание выделенных хлорбифенилов оценивали на основании сравнения величины полученных пиков и стандартных соединений.
Продукты деградации хлорбифенилов определяли спектрофотометрически и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Для выделения и идентификации продуктов биодеструкции хлорированных бифенилов культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток методом центрифугирования (9660 g в течение 3 мин на центрифуге miniSpin ("Eppendorf', Германия). Для дальнейших анализов использовали надосадочную жидкость.
Образование продуктов мета-расщепления ароматического кольца хлорбифенилов - 2-гидроксо-6-оксо-(хлорфенил)гекса-2,4-диеновые кислоты (ГОФДК) определяли методом спектроскопии на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini ("Shimadzu", Япония) при γмакс от 390 нм до 440 нм.
Наличие в надосадочной жидкости хлорбензойной и гидроксибензойной кислот (ХБК и (ОН)БК), а также катехолов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - анализа на хроматографе LC-20A ("Shimadzu", Япония) с колонкой Discovery С18 (150×4.6 мм) ("Supelco", "Sigma-Aldrich", США) и УФ-детектором при 205 нм. Анализ проводили в системе ацетонитрил-0.1%-ый Н3РО4 (70:30). Идентификацию проводили с помощью сравнения времени удержания на колонке исследуемых и стандартных соединений. Количество образовавшихся продуктов оценивали по величине площади и высоты пиков на хроматограмме относительно данных величин стандартных соединений.
В результате проведенных исследований было установлено, что штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 разлагает монохлорированные бифенилы (далее в таблицах 1, 2 ПХБ1, ПХБ3 (№по классификации IUPAC) на 99.9%, дихлорированные бифенилы (далее в таблицах 1, 2 ПХБ8 (№ по классификации IUPAC) на 97.8%, трихлорированные бифенилы (далее в таблицах 1, 2 ПХБ17, ПХБ28 (№ по классификации IUPAC) на 82.2% за 2 суток, коммерческие смеси полихлорированные бифенилы марок «Делор 103» и «Совол» - на 99% за 8 суток (таблицы 1, 2).
При разложении полихлорированных бифенилов штаммом Rhodococcus wratislaviensis Ch625 фиксируются незначительные количества промежуточных соединений, при этом отмечается тенденция к их дальнейшей утилизации. Спектр обнаруженных метаболитов свидетельствует о разложении полихлорированных бифенилов до соединений основного обмена веществ клетки.
Таким образом, штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 является активным деструктором как отдельных конгенеров полихлорированных бифенилов, так и их коммерческих смесей.
Пример 3.
Разложение штаммом Rhodococcus wratislaviensis Ch625 пестицидов группы стойких органических загрязнителей: γ-гексахлорциклогексана (линдана), гексахлорбензола, дихлордифенилтрихлорэтана.
Деструкцию пестицидов штаммом Rhodococcus wratislaviensis Ch625 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками». Штамм выращивали в жидкой среде К1 с бифенилом (1 г/л) при 28°С до ОП600~1.0. Отмытые дважды в среде К1 клетки (1 мл, ОП600=2.0) переносили во флаконы с тефлоновыми крышками.
В качестве субстрата вносили раствор γ- гексахлорциклогексана (линдана) (200 мкг/мл), гексахлорбензола (2.5 мг/мл), дихлордифенилтрихлорэтана (200 мкг/мл). Анализ проводили методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на газовом хроматографе GC6890N ("Agilent Technology", США) с масс-селективным детектором MSD5973N ("Agilent Technology", США) и кварцевой капиллярной колонкой HP-5MS SN US15189741-1 (30 м×0.25 мм) ("Agilent Technology", США). Газ-носитель - гелий (1 мл/мин), температура испарителя 230°С. Объем пробы 0.2 мкл. Предварительно образцы экстрагировали хлороформом в течение 3 часов.
Количественное содержание выделенных пестицидов оценивали на основании сравнения величины полученных пиков и стандартных соединений.
Продукты деградации пестицидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как описано выше (пример 2).
Штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 осуществляет деструкцию γ-гексахлорциклогексана (линдана) на 27%, гексахлорбензола на 20% и дихлордифенилтрихлорэтана на 31% (см. таблица 3).
Накопление промежуточных продуктов (хлорбензол, хлоркатехол, хлорбензойные кислоты), образующихся при разложении данных пестицидов штаммом Rhodococcus wratislaviensis Ch625, было незначительным, что свидетельствует об эффективной утилизации исходного субстрата.
Пример 4.
Анализ деградационной активности штамма Rhodococcus wratislaviensis Ch625 после культивирования на различных субстратах.
Активность штамма Rhodococcus wratislaviensis Ch625 исследовали по отношению к модельному конгенеру полихлорированного бифенила- 2,4′-дихлорбифенилу (ПХБ8) в экспериментах с «отмытыми клетками» после культивирования штамма на различных субстратах.
Наращивание биомассы штамма Rhodococcus wratislaviensis Ch625 проводили методом периодического культивирования в жидкой среде К1 в течение 48 часов при 28°С до ОП600=1.0. В качестве источника углерода и энергии вносили: 1) бензоат натрия - 1 г/л, 2) бензоат натрия+бифенил, 1 г/л и 0.2 г/л соответственно, 3) бифенил - 1 г/л. Бензоат натрия использован как вещество, являющееся доступным субстратом (свободно производится, низкая цена, широко используется в промышленности). Отмытые дважды в среде К1 клетки (1 мл, ОП600=2.0) переносили во флаконы с тефлоновыми крышками. 2,4′-дихлорбифенил вносили в концентрации 90 мг/л. Анализ деструкции и метаболитов проводили, как описано в примере 2.
В результате проведенного исследования установлено, что наращивание биомассы штамма Rhodococcus wratislaviensis Ch625 происходит с высокой и практически одинаковой скоростью при культивировании на всех трех вариантах субстратов. Удельная скорость роста составила: 1) на бензоате - 0.076 ч-1, 2) на бензоате+бифениле - 0.078 ч-1, 3) на бифениле - 0.077 ч-1. Различия лежат в пределах интервала достоверности, следовательно, можно утверждать, что удельная скорость роста при использовании в качестве источника углерода и энергии бензоата натрия изменяется несущественно.
Анализ полученных результатов показал, что после культивирования на бензоате натрия, штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 разлагает за 4 суток 99.6% ПХБ8, после культивирования на смешанном субстрате (бензоат натрия и бифенил) - 99.8% ПХБ8, а после культивирования на бифениле - 97.8% ПХБ8.
Анализ метаболического профиля показал, что ароматическое кольцо хлорбифенилов - 2-гидроксо-6-оксо-(хлорфенил)гекса-2,4-диеновой кислоты незначительно накапливается только в течение первых 24 часов деструкции в варианте 2 (после смешанного субстрата) и далее ее концентрация снижается до ноля. Накопление хлорбензойных кислот и их метаболитов гидроксибензойных кислот было зафиксировано во всех трех вариантах, однако после предварительного культивирования на бензоате скорость убыли метаболитов выше на 20%, чем в двух других вариантах опыта.
Доказано, что штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 сохраняет высокую деградационную активность по отношению к полихлорированным бифенилам после культивирования на бензоате натрия, и данное соединение (бензоат натрия) может быть рекомендовано для наращивания больших объемов культуры штамма как легкодоступное сырье.
Таким образом, штамм Rhodococcus wratislaviensis Ch625 эффективно разлагает несколько соединений группы стойких органических загрязнителей, а именно: полихлорированный бифенил, гексахлорбензол, γ-гексахлорциклогексан (линдан) и дихлордифенилтрихлорэтан, и может быть рекомендован для разработки на его основе биопрепарата по утилизации комплекса данных соединений.
Claims (1)
- Штамм Rhodococcus wratislaviensis - деструктор стойких токсичных хлорорганических соединений: полихлорированных бифенилов, гексахлорбензола, γ-гексахлорциклогексана (линдана), дихлордифенилтрихлорэтана, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ Ас-2631D.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015113129/10A RU2585537C1 (ru) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР УСТОЙЧИВЫХ ТОКСИЧНЫХ ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015113129/10A RU2585537C1 (ru) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР УСТОЙЧИВЫХ ТОКСИЧНЫХ ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2585537C1 true RU2585537C1 (ru) | 2016-05-27 |
Family
ID=56096186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015113129/10A RU2585537C1 (ru) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР УСТОЙЧИВЫХ ТОКСИЧНЫХ ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2585537C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2803633C1 (ru) * | 2023-05-22 | 2023-09-18 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" | Способ биодеградации гидроксилированных бензойных кислот с использованием штамма Rhodococcus ruber P25 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4999300A (en) * | 1988-03-28 | 1991-03-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Bacterial degradation of 4-chlorobiphenyl |
| US6537797B1 (en) * | 1999-03-31 | 2003-03-25 | Indiana University, Advanced Research And Technology Institute | Compositions and methods useful in bioremediation of polychlorinated biphenyls |
| RU2262531C2 (ru) * | 2003-12-02 | 2005-10-20 | Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН | Штамм бактерий rhodococcus ruber - деструктор полихлорированных бифенилов |
-
2015
- 2015-04-09 RU RU2015113129/10A patent/RU2585537C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4999300A (en) * | 1988-03-28 | 1991-03-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Bacterial degradation of 4-chlorobiphenyl |
| US6537797B1 (en) * | 1999-03-31 | 2003-03-25 | Indiana University, Advanced Research And Technology Institute | Compositions and methods useful in bioremediation of polychlorinated biphenyls |
| RU2262531C2 (ru) * | 2003-12-02 | 2005-10-20 | Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН | Штамм бактерий rhodococcus ruber - деструктор полихлорированных бифенилов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BEYER A., BIZIUK M., Environmental fate and global distribution of polychlorinated biphenyls, Rev.Environ. Contamin. Toxic., 2009, v.201, p.137-158. ВАСИЛЬЕВА Г.К. и др., Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными бифенилами, Ж. Микробиология, 2007, т.76, N6, стр. 725-741. BENI CAMACHO-PEREZ, et. al., Enzymes involved in the biodegradation of hexachlorocyclohexane: A mini review, J. Environmental Management. 2012, V. 95, p. 5306-5318. DORFLER U., et.al., Stimulation of reductive dechlorination of hexachlorobenzene in soil by inducing the native microbial activity., Chemosphere, 2004, v.55, p. 1477-1484. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2828844C2 (ru) * | 2021-12-08 | 2024-10-21 | Максим Николаевич Соколов | Штамм Rhodococcus qingshengii VER34 биодеструктор органических загрязняющих соединений, содержащих в своей структуре лактонное кольцо |
| RU2803633C1 (ru) * | 2023-05-22 | 2023-09-18 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" | Способ биодеградации гидроксилированных бензойных кислот с использованием штамма Rhodococcus ruber P25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Saeed et al. | Biodegradation of PAHs by Bacillus marsiflavi, genome analysis and its plant growth promoting potential | |
| Gao et al. | Biodegradation of phthalate acid esters by different marine microalgal species | |
| Yang et al. | Biodegradation of sulfonamide antibiotics in sludge | |
| Khalid et al. | Biodegradation potential of pure and mixed bacterial cultures for removal of 4-nitroaniline from textile dye wastewater | |
| Ghosh et al. | Biodegradation of pyrene by a Pseudomonas aeruginosa strain RS1 isolated from refinery sludge | |
| Yue et al. | Bioaugmentation of strain Methylobacterium sp. C1 towards p-nitrophenol removal with broad spectrum coaggregating bacteria in sequencing batch biofilm reactors | |
| Zhang et al. | Identification and biodegradation efficiency of a newly isolated 2, 2′, 4, 4′-tetrabromodiphenyl ether (BDE-47) aerobic degrading bacterial strain | |
| Egorova et al. | Bioremediation of hexachlorocyclohexane-contaminated soil by the new Rhodococcus wratislaviensis strain Ch628 | |
| Pugazhendi et al. | Biodegradation of 1, 4-dioxane by Rhodanobacter AYS5 and the role of additional substrates | |
| Verma et al. | Endosulfan degradation by a Rhodococcus strain isolated from earthworm gut | |
| Lang et al. | Isolation and characterization of a quinclorac-degrading Actinobacteria Streptomyces sp. strain AH-B and its implication on microecology in contaminated soil | |
| Lu et al. | Effects and mechanisms of phytoalexins on the removal of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by an endophytic bacterium isolated from ryegrass | |
| Ceyhan | Biodegradation of pyrene by a newly isolated Proteus vulgaris | |
| Chang et al. | Biodegradation of alkylphenols by rhizosphere microorganisms isolated from the roots of Hosta undulata | |
| Xu et al. | Spirodela polyrhiza stimulates the growth of its endophytes but differentially increases their fenpropathrin-degradation capabilities | |
| Jimenez-Torres et al. | Biodegradation of malathion, α-and β-endosulfan by bacterial strains isolated from agricultural soil in Veracruz, Mexico | |
| Roy et al. | Exploring the potential of Meyerozyma caribbica and its combined application with bacteria for lindane bioremediation | |
| Yang et al. | Fungi extracellular enzyme-containing microcapsules enhance degradation of sulfonamide antibiotics in mangrove sediments | |
| Kaur et al. | In vitro study of mycoremediation of cypermethrin-contaminated soils in different regions of Punjab | |
| Adams et al. | Chlorpyrifos degradation by Bacillus sp. strain UPMB10 isolated from polluted environment: Analysis and characterization of the metabolite by GC-MS | |
| Naloka et al. | A low-cost, ready-to-use Mycolicibacterium-Bacillus bioaugmentation strategy: Impacts on soil microbial community and enhanced diesel oil removal | |
| Kumar et al. | Co-degradation study of lindane and chlorpyrifos by novel bacteria | |
| Gu et al. | Isolation of phylogenetically diverse nonylphenol ethoxylate-degrading bacteria and characterization of their corresponding biotransformation pathways | |
| Wang et al. | Mechanisms of naphthalene biodegradation in microalgal-bacterial co-culture systems: role of photosynthesis, antioxidant and extracellular polymeric substances | |
| Garbi et al. | Biodegradation of oxadiazon by a soil isolated Pseudomonas fluorescens strain CG5: Implementation in an herbicide removal reactor and modelling |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20190326 |