RU2579997C2 - Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes - Google Patents

Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes

Info

Publication number
RU2579997C2
RU2579997C2 RU2014130726A RU2014130726A RU2579997C2 RU 2579997 C2 RU2579997 C2 RU 2579997C2 RU 2014130726 A RU2014130726 A RU 2014130726A RU 2014130726 A RU2014130726 A RU 2014130726A RU 2579997 C2 RU2579997 C2 RU 2579997C2
Authority
RU
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
cells
insulin
multipotent progenitor
progenitor cells
diabetes
Prior art date
Application number
RU2014130726A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2014130726A (en )
Inventor
Александр Михайлович Дыгай
Евгений Германович Скурихин
Алена Михайловна Резцова
Наталия Николаевна Ермакова
Ольга Викторовна Першина
Екатерина Сергеевна Хмелевская
Вячеслав Андреевич Крупин
Светлана Викторовна Комарова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Images

Abstract

FIELD: biotechnologies.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to cell technologies and can be used in regenerative medicine. Suspension of non-adhesive mononuclear cells from tissues of pancreas during diabetes, in obtained suspension is estimated amount of multipotent progenitor cell count oligopotent progenitor cells and insulin-producing β-cells. Then for 30 days in presence of growth factors: 4 ng/ml of epidermal growth factor and 10 ng/ml of hepatocyte growth factor, extended cell mass multipotent progenitor cells. Upon completion of cycle of cultivation of induced differentiation of obtained in vitro multipotent progenitor CD45- TER119-, c-Kit-, obtained 1- cells in βcells glucagon-like peptide GLP-1 in concentration of 6.7 mcl/ml.
EFFECT: invention enables to efficiently induce differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing β-cells in type I diabetes mellitus.
1 cl, 2 dwg, 2 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям и регенеративной медицине, и касается способа получения и индукции дифференцировки культуры мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы в инсулин-продуцирующие β-клетки при сахарном диабете. The invention relates to biotechnology, specifically to cellular technologies and regenerative medicine and a method for preparing and differentiation induction culture of multipotent progenitor cells of the pancreas into insulin-producing β-cells in diabetes. Изобретение может быть использовано для решения практических задач регенеративной медицины: поиска потенциальных лекарственных средств, способных избирательно стимулировать дифференцировку панкреатических мультипотентных прогениторных клеток в продуцирующие инсулин β-клетки при сахарном диабете, что может стать альтернативой инсулинзамещающей терапии, трансплантации поджелудочной железы либо отдельных типов ее клеток. The invention can be used to solve practical problems of regenerative medicine: searching for potential drugs that can selectively stimulate differentiation of pancreatic multipotent progenitor cells into insulin producing β-cells in diabetes mellitus, which may be an alternative insulinzameschayuschey therapy, transplantation of pancreas or certain types of its cells.

Сахарный диабет объединяет заболевания разной этиологии, но ключевое звено патогенеза одинаковое: разрушение β-клеток, ухудшение усвоения глюкозы различными тканями. Diabetes combines diseases of different etiology, pathogenesis but the key part identical: the destruction of β-cells, the deterioration of glucose uptake by different tissues. Недостаточная утилизация глюкозы приводит к нарушению не только углеводного, но и жирового, и белкового обмена. Insufficient utilization of glucose leads to a violation not only of carbohydrate, but also fat, and protein metabolism. Накопление продуктов гликозилирования в сочетании с другими метаболическими сдвигами лежит в основе поздних осложнений сахарного диабета - диабетической ангиопатии, ретинопатии, невропатии и нефропатии [1; Accumulation glycosylation products in combination with other metabolic changes underlies the late complications of diabetes - diabetic angiopathy, retinopathy, neuropathy and nephropathy [1; 2; 2; 3]. 3]. Наиболее агрессивным и прогностически тяжелым считается сахарный диабет I типа (инсулинозависимый сахарный диабет). The most aggressive and prognostically serious considered type I diabetes (insulin-dependent diabetes). Инсулинозависимый сахарный диабет - хроническое аутоиммунное заболевание, вызванное разрушением β-клеток островков поджелудочной железы [4]. Insulin-dependent diabetes mellitus - chronic autoimmune disorder caused by the destruction of β-islet cells of the pancreas [4]. Болезнь поражает детей, подростков и молодых людей, но может начинаться в любом возрасте. The disease affects children, adolescents and young adults, but can start at any age. Спонтанная аутоиммунная реакция возникает у лиц генетически предрасположенных к аутоиммунным нарушениям. Spontaneous autoimmune response occurs in people genetically predisposed to autoimmune disorders. Однако в подавляющем большинстве (более 90% всех случаев) сахарный диабет типа I возникает в силу вмешательства в иммунную систему различных провоцирующих факторов, в том числе токсических агентов. However, the vast majority (more than 90% of all cases), diabetes type I diabetes occurs due to interference in the immune system of different provoking factors, including toxic agents.

Общепринятые методы терапии аутоиммунного сахарного диабета - иммунодепрессия и инсулинотерапия, не излечивают больных и лишь тормозят развитие поздних осложнений. Conventional methods of treatment of autoimmune diabetes - immunosuppression and insulin, do not cure patients, and only inhibit the development of late complications. При введении экзогенного инсулина снижается риск развития различных диабетических осложнений. When administered exogenous insulin reduces the risk of the development of various diabetic complications. Тем не менее, экзогенным инсулином не возможно поддерживать уровень глюкозы в крови в пределах узкого физиологического диапазона подобно тому, как регулирует уровень глюкозы эндогенный инсулин, секретируемый β-клетками поджелудочной железы. However, exogenous insulin is not possible to maintain blood glucose levels within a narrow physiological range just as regulates glucose endogenous insulin secreted by pancreatic β-cells. С теоретической точки зрения наиболее эффективным способом восстановления клеток эндогенной и экзогенной секреции поджелудочной железы при аутоиммунном сахарном диабете и других его формах является трансплантация островков поджелудочной железы, изолированных β-клеток и других клеток, способных восстанавливать глюкозозависимую продукцию инсулина [5]. From a theoretical standpoint, the most effective way to restore endogenous and exogenous secretion of pancreatic cells in autoimmune diabetes, and other forms is the transplantation of pancreatic islets isolated β-cells, and other cells capable of reducing production of glucose-insulin [5]. Однако хроническая нехватка донорских органов и необходимость сопутствующей иммунносупрессивной терапии ограничивают широкое применение таких трансплантаций. However, the chronic shortage of donor organs and the need for concomitant therapy immunnosupressivnoy limit the widespread use of such transplants.

Альтернативой трансплантации поджелудочной железы и островков Лангерганса предлагается генерация инсулин-секретирующих клеток in vitro с последующей их трансплантацией больным диабетом I типа. An alternative to transplantation of the pancreatic islets of Langerhans and proposed generation of insulin-secreting cells in vitro followed by transplantation of type I diabetics. Изучается вопрос о возможной генерации инсулин-секретирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток (СК) [6], мезенхимальных СК костномозгового происхождения [7, 8] и поджелудочной железы [9]. We study the possible generation of insulin-secreting cells from the embryonic stem cell (SC) [6], bone marrow-derived mesenchymal SC [7, 8] and pancreatic cancer [9]. В качестве кандидатов для клеточной терапии диабета рассматриваются взрослые панкреатические α-клетки [10] и предшественники ацинарных клеток [11]. As candidates for cell therapy of diabetes treated adult pancreatic α-cells [10] and the precursors acinar cells [11]. Однако, несмотря на получение в результате трансдифференцировки стволовых/клеток-предшественников мононуклеаров с морфологией и фенотипом подобным β-клеткам, авторы признаются, что инсулиновый ответ на глюкозу у них значительно менее интенсивный, чем у родных β-клеток. However, despite receiving a result of transdifferentiation of stem / progenitor cells of mononuclear cells with the morphology and phenotype similar to β-cells, the authors recognized that the insulin response to glucose have considerably less intense than that of native β-cells. Известно, что клеточно-популяционная организация поджелудочной железы представлена мультипотентными прогениторными клетками и олигопотентными предшественниками эндокринных клеток [12]. It is known that cell population organization represented multipotent pancreatic progenitor cells and precursors oligopotentnymi endocrine cells [12]. Вместе с тем вопрос о регенераторном потенциале этих клеток при диабете до конца не изучен. However, the question of the regenerative potential of these cells in diabetes is not fully understood.

Таким образом, наиболее эффективным подходом, позволяющим восстановить популяцию эндогенно и экзогенно секретируемых клеток поджелудочной железы, может выступить фармакологическая стимуляция дифференцировки эндогенных СК и прогениторных β-клеток в инсулин-продуцирующие клетки. Thus, the most effective approach to restore the population exogenously and endogenously secreted by cells of the pancreas, can act as pharmacological stimulation of differentiation of endogenous SC and β-progenitor cells into insulin-producing cells.

Адекватных аналогов предлагаемый способ не имеет. Adequate analogues proposed method does not.

Задачей данного изобретения является оценка способности мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы дифференцироваться в инсулин-продуцирующие β-клетки, что может оптимизировать поиск лекарственных средств, способных избирательно стимулировать их дифференцировку в секретирующие инсулин β-клетки I типа и ускорять процессы регенерации при сахарном диабете. The object of the invention is to evaluate the ability of multipotent progenitor cells of the pancreas to differentiate into insulin-producing β-cells, which can optimize the search for drugs that can selectively stimulate their differentiation into insulin-secreting β-cells of type I and accelerate regeneration processes in diabetes.

Поставленная задача решается тем, что выделяют взвесь неадгезирующих мононуклеаров клеток из ткани поджелудочной железы при сахарном диабете, в полученной взвеси оценивают количество мультипотентных прогениторных клеток, олигопотентных прогениторных клеток и инсулин-продуцирующих β-клеток, затем в течение 30 дней в присутствии ростовых факторов, 4 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл фактора роста гепатоцитов, наращивают клеточную массу мультипотентных прогениторных клеток, по окончании цикла культивирования глюкагон-подобным The problem is solved in that the recovered slurry neadgeziruyuschih mononuclear cells from pancreatic tissue in diabetes, in the resulting slurry estimate the number of multipotent progenitor cells oligopotentnyh progenitor cells and insulin-producing β-cells, and then for 30 days in the presence of growth factors and 4 ng / ml epidermal growth factor 10 ng / ml hepatocyte growth factor, increase cell mass multipotent progenitor cells, after cultivation cycle glucagon-like пептидом GLP-1, в концентрации 6,7 мкл/мл, индуцируют дифференцировку полученных in vitro мультипотентных прогениторных клеток в β-клетки, у полученных β-клеток оценивают интенсивность секреции инсулина и реакцию на глюкозу. GLP-1 peptide at a concentration of 6.7 .mu.l / ml to induce differentiation in vitro derived multipotent progenitor cells into β-cells of the obtained β-cell insulin secretion is evaluated intensity and response to glucose.

Новым в предлагаемом способе является получение культуры мультипотентных прогениторных клеток диабетической поджелудочной железы, иммунофенотипическая и морфологическая оценка их способности дифференцироваться в β-клетки в присутствии специфических ростовых факторов, иммуноферментная оценка продукции и секреции инсулина у β-клеток, полученных в результате дифференцировки диабетических мультипотентных прогениторных клеток, в ответ на глюкозную нагрузку. The novelty of the proposed method is to obtain a culture of multipotent progenitor cells diabetic pancreas, immunophenotypic and morphological assessment of their ability to differentiate into β-cells in the presence of specific growth factors, immuno evaluation production and secretion of insulin from β-cells derived from the differentiation of diabetic multipotent progenitor cells in response to a glucose load.

Разрушение инсулин-продуцирующих β-клеток имеет аутоиммунную природу и обусловлено врожденным отсутствием или потерей толерантности к аутоантигенам β-клеток. The destruction of insulin-producing β-cells is caused by an autoimmune nature, and congenital absence or loss of tolerance to autoantigens β-cells. Причины аутоиммунного разрушения β-клеток до сих пор не выяснены. The causes of autoimmune destruction of β-cells has not yet been clarified. Однако совершенно ясно, что после запуска этого процесса активируется как клеточное, так и гуморальное звено иммунитета. However, it is clear that after the start of the process activates both cellular and humoral immunity. К тому времени, когда обнаруживается гипергликемия, около 80-95% β-клеток погибает, возникает абсолютный дефицит инсулина. By the time when it is detected hyperglycemia, about 80-95% β-cells are killed, there is an absolute shortage of insulin. Оставшиеся и жизнеспособные β-клетки не способны обеспечивать требуемым для усвоения тканями глюкозы количеством инсулина. And viable remaining β-cells are unable to provide the required amount of glucose assimilation tissue insulin. В результате этого развиваются тяжелые метаболические нарушения. As a result, severe metabolic disorders develop. В ряде случаев в качестве трансплантантов используют не островки, а предварительно культивированные микрофрагменты ткани поджелудочной железы. In some cases, as islets transplants using not, and pre-cultured Tiny Fragments pancreatic tissue. Алло- и ксетрансплантация микрофрагментов ткани поджелудочной железы у больных сахарном диабетом типа I мало эффективна. Allo- and ksetransplantatsiya microfragments pancreatic tissue in patients with diabetes mellitus type I is not effective enough.

В отличие от кроветворной ткани, печени, покровного эпителия и других быстро обновляющихся клеточных систем, поджелудочная железа - медленно обновляющаяся ткань. Unlike the hematopoietic tissue, the liver, the surface epithelium and other rapidly renewable cell systems, pancreas - slowly renewing tissues. Генетическое отслеживание отдельных клонов клеток на разных стадиях панкреатогенеза позволило охарактеризовать мультипотентные прогениторные клетки, способные дифференцироваться в направлении клеток ацинусов, протоков и островков. Genetic tracing individual clones of cells at different stages giving pankreatogeneza characterized multipotent progenitor cells capable of differentiating into acinar cells direction, ducts and islets. Генетически мультипотентные прогениторные клетки представляли собой Pdx1 + /Ptfla + /c-Myc + /Cpa1 + -клетки [13]. Genetically multipotent progenitor cells are Pdx1 + / Ptfla + / c- Myc + / Cpa1 + -cells [13]. Оценка экспрессии мембранных маркеров здоровых панкреатических клеток позволяет получать мультипотентные прогениторные клетки (экспрессия на поверхности рецептора к фактору роста гепатоцитов (c-Met), отсутствие антигенов гемопоэтических стволовых клеток и клеток эндотелия (Flk-1, c-Kit, CD45, TER119)) [12], олигопотентные предшественники с фенотипом CD133 + /CD49f low и экспрессирующие на поверхности Ngn3 [14], монопотентные предшественники β-клеток (некоторые авторы называют их транзиторными клетками) [1]. Qualification expression of membrane healthy pancreatic cell markers allows to obtain multipotent progenitor cells (expression on the receptor surface to hepatocyte growth factor (c-Met), the absence of antigens of hematopoietic stem cells and endothelial cells (Flk-1, c-Kit, CD45, TER119)) [ 12] oligopotentnye progenitors with the phenotype of CD133 + / CD49f low and expressing Ngn3 on the surface [14], β-monopotentnye progenitor cells (some authors called their transient cells) [1]. Рассматривается вопрос о возможности формирования здоровыми мультипотентными прогениторными клетками и олигопотентными предшественниками в культуре КОЕ и эндокринных, и экзокринных клеток. The question about the possibility of the formation of healthy multipotent progenitor cells and oligopotentnymi predecessors in culture CFU and endocrine and exocrine cells. В силу высокого пролиферативного потенциала и возможности дифференцироваться в направлении секреторных клеток в условиях оптимальной жизнедеятельности, наиболее интересными для использования в качестве мишени для фармакологического воздействия при патологии поджелудочной железы являются панкреатические мультипотентные прогениторные клетки. By high proliferative potential and the ability to differentiate towards the secretory cells under conditions optimal vital, most interesting for use as a target for pharmacological action in the pathology of the pancreas are multipotent pancreatic progenitor cells. Между тем, вопрос об их использовании при сахарном диабете остается открытым. Meanwhile, the question about their use in diabetes remains open.

В этой связи, необходимость изучения потенциала к самоподдержанию и дифференцировки мультипотентных прогениторных клеток при сахарном диабете возрастает многократно, так как потенциальные возможности регионарных прогениторных клеток взрослого организма могут определять стратегию лечения. In this regard, the need to explore the potential for self-renewal and differentiation of multipotent progenitor cells in diabetes increases many times, as potential regional progenitor cells of an adult organism can determine the treatment strategy.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. The features shown in the inventive set of new properties, is not explicitly derived from the prior art in the art and not obvious for a specialist.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе. Identical combination of features not found in the analyzed patent, scientific and medical literature.

Способ может быть использован для изучения регенераторного потенциала мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы с целью поиска потенциальных лекарственных средств для регенеративной медицины, в частности для лечения хронических заболеваний поджелудочной железы, связанных с поражением секретирующих инсулин β-клетки, механизм действия которых связан с индукцией дифференцировки панкреатических мультипотентных прогениторных клеток. The method may be used for studying the regenerative capacity of multipotential progenitor cells of the pancreas for potential drugs for regenerative medicine, particularly for chronic pancreatic diseases associated with lesions of insulin-secreting β-cells, the mechanism of action of which is associated with the induction of differentiation of pancreatic multipotent progenitor cells. Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость». Based on the foregoing, the claimed invention meets the patentability criteria "novelty" and "inventive level" and "Industrial Applicability".

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на 5-недельных мышах линии С57В 1/6 в количестве 102 штук. The proposed method has been studied in experiments on 5-week-old mice of the line S57V 06/01 in an amount of 102 pieces. Животные первой категории, инбредные мыши, получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Animals of the first category, inbred mice were obtained from the breeding department of experimental biomedical modeling FGBU "Institute of Pharmacology behalf of the ED Гольдберга» СО РАМН (сертификат имеется). Goldberg "SB RAMS (certificate available). Использование животных в экспериментах обосновано и согласовано с Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН. The use of animals in experiments justified and in accord with the Commission on control over the content and use of laboratory animals FGBI "Institute of Pharmacology" SB RAMS.

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему рисунков 1, 2. The invention will be understood from the following description and attached drawings 1 and 2.

На рис. Fig. 1 изображены дот-плоты, представляющие данные анализа количественной и качественной экспрессии CD45, TER119, c-Kit, Flk-1, CD133, CD491f low , полученные с помощью флуоресцентной цитометрии, на неадгезирующих мононуклеарах поджелудочной железы мышей линии С57В 1/6 на 21-й день после последнего введения стрептозотоцина: 1 - интактные животные; 1 shows the dot-plots representing data analysis of quantitative and qualitative expression of CD45, TER119, c-Kit, Flk- 1, CD133, CD491f low, obtained using fluorescence cytometry on neadgeziruyuschih mononuclear pancreatic S57V 1/6 mice at 21- days after the last injection of streptozotocin: 1 - intact animals; 2 - животные с сахарным диабетом; 2 - animals with diabetes mellitus; A1, A2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119 на двухмерных гистограммах; A1, A2 - phenotype confirmation and qualitative analysis of the expression of CD45 / TER119 on the two-dimensional histogram; Б1, Б2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119/c-Kit/Flk-1 на двухмерных гистограммах; B1, B2 - confirmation of the phenotype and qualitative analysis of the expression of CD45 / TER119 / c-Kit / Flk-1 in the two-dimensional histogram; B1, B2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119/CD133/CD49f на двухмерных гистограммах. B1, B2 - confirmation of the phenotype and qualitative analysis of the expression of CD45 / TER119 / CD133 / CD49f on the two-dimensional histogram.

На рис. Fig. 2 изображена морфология клеточных ассоциаций, полученных в результате культивирования неадгезирующих мононуклеаров поджелудочной железы мышей линии С57В 1/6 на 21-й день после введения стрептозотоцина: А - интактные животные; 2 shows the morphology of cell associations resulting neadgeziruyuschih culturing mononuclear pancreatic S57V 1/6 mice on the 21st day after administration of streptozotocin A - intact animals; Б - животные с сахарным диабетом. B - animals with diabetes. Увеличение ×100. Increasing × 100.

Способ осуществляют следующим образом. The process is carried out as follows.

Диабет моделировали стрептозотоцином («Sigma», USA). Diabetes simulated streptozotocin ( «Sigma», USA). Препарат вводили после 4-часовой голодовки животных внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг в 250 мкл фосфатного буфера 1 раз в сутки в течение 5-ти дней. The drug was administered after 4-hour hunger animals intraperitoneally in a dose of 40 mg / kg in 250 l of phosphate buffer 1 time per day for 5 days. Контролировался диабет по уровню глюкозы в крови при помощи глюкометра SencoCard («77 Электроника Кфт», Венгрия) и по количеству инсулин-продуцирующих клеток в поджелудочной железе [15]. Diabetes was monitored by the level of glucose in blood using glucometer SencoCard ( «77 Kft Electronics", Hungary) and the number of insulin-producing cells in the pancreas [15]. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 250 мкл фосфатного буфера. Control animals were injected intraperitoneally with 250 ml of phosphate buffer. Противоопухолевый препарат стрептозотоцин разрушает секреторные клетки поджелудочной железы (в том числе β-клетки). Antitumor drug streptozotocin secretory destroys pancreatic cells (including β-cells).

Уровень глюкозы в крови изучали за 24 ч до первого введения стрептозотоцина и на 21-й день после последнего введения стрептозотоцина. Blood glucose levels were studied for 24 hours before the first administration of streptozotocin and on the 21th day after the last administration of streptozotocin. На 21-й день после последнего введения стрептозотоцина проводили эвтаназию мышей передозировкой СО 2 , выделяли поджелудочную железу, получали неприлипающие мононуклеары. On the 21st day after the last administration of streptozotocin, the mice were euthanized by overdose CO 2, the pancreas was isolated, non-adherent mononuclear cells obtained. Неприлипающие мононуклеары разделяли на 3 группы. Non-adherent mononuclear cells were separated into 3 groups. У клеток 1 группы цитометрически изучали экспрессию CD45, TER119, CD117 (c-Kit), CD49f, Flk-1, CD133. Cells Group 1 cytometric studied expression of CD45, TER119, CD117 (c-Kit), CD49f, Flk-1, CD133. Для анализа использовался прибор FACS Canto II с программным обеспечением FACS Diva («Becton Dickinson», США). Was used for analysis FACS Canto II apparatus with software FACS Diva ( «Becton Dickinson», USA). У мононуклеаров 2 группы прижизненным окрашиванием дитизоном выявляли инсулин-продуцирующие клетки (Pancreatic Cell DTZ Detection Assay, США). We mononuclear 2 groups revealed dithizone staining of live insulin-producing cells (Pancreatic Cell DTZ Detection Assay, USA). У мононуклеаров 3 группы изучали потенциал к самоподдержанию при длительном культивировании. At mononuclear 3 groups studied the potential for self-maintenance during prolonged cultivation. Для этого мононуклеары в количестве 1×10 6 вносили в культуральный флакон («ТРР Techno Plastic Products AG», Швейцария) и инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО 2 , 100% влажность воздуха) в течение 30 дней в среду, содержащую 45% DMEM («Sigma», США), 45% DMEM/F-12 («Sigma», США), 10% инактивированной фетальной бычьей сывороткой («Sigma», США), 5 мг/л ITS+3 (смесь рекомбинантного человеческого инсулина, трансферина и селинита Na) («Sigma», США), 1×10 -7 М дексаметозона («Sigma», США), 10 ммоль/л никотиновой кислоты («Sigma», США), 5 ммоль/л фосфатного буфера (HEPES) («Sigma», США) раствор антибиотиков 100 е For this purpose, mononuclear cells at 1 × 10 June introduced into a culture flask ( "TPP Techno Plastic Products AG», Switzerland) and incubated under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2, 100% humidity) for 30 days in a medium containing 45% DMEM ( «Sigma», USA), 45% DMEM / F-12 ( «Sigma», USA), 10% inactivated fetal bovine serum ( «Sigma», USA), 5 mg / l ITS + 3 ( the mixture of recombinant human insulin, transferrin selinita Na) ( «Sigma», USA), 1 × 10 -7 M deksametozona ( «Sigma», USA), 10 mmol / l nicotinic acid ( «Sigma», USA), 5 mmol / l phosphate buffer (HEPES) ( «Sigma», USA) antibiotic solution 100 e ./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина («Sigma», США), 2 ммоль/л L-глутамина («Sigma», США), β-меркаптоэтанола 50 ммоль/л («Thermoscientific», США). ./ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin ( «Sigma», USA), 2 mmol / L L-glutamine ( «Sigma», USA), β-mercaptoethanol, 50 mmol / l ( «Thermoscientific», USA). Эпидермальный фактор роста 4 нг/мл («Sigma», США) и фактор роста гепатоцитов 10 нг/мл («Sigma», США) добавляли через 24 часа от начала культивирования. Epidermal growth factor 4 ng / ml ( «Sigma», USA) and hepatocyte growth factor 10 ng / ml ( «Sigma», USA) was added after 24 hours from the initiation of culture. Каждые 3-4 дня проводили смену среды. Every 3-4 days spent changing environment. По окончании цикла культивирования супернатанты от мононуклеаров собирали и исследовали уровень свободного инсулина. At the end of the cultivation cycle supernatants from mononuclear cells were collected and analyzed level of free insulin. Инсулин измерялся методом иммуноферментного анализа («Monobind Inc», США). Insulin was measured by ELISA ( «Monobind Inc», USA).

Полученные в результате культивирования мононуклеаров 3 группы клеток разделили на две подгруппы. The resulting 3 culturing mononuclear cell group was divided into two subgroups. У клеток 1 подгруппы оценивали экспрессию CD45, TER119, CD117 (c-kit), CD49f, Flk-1, CD133. Cells subgroup 1 expression evaluated CD45, TER119, CD117 (c-kit), CD49f, Flk-1, CD133. У 0,5×10 6 клеток 2 подгруппы с использованием глюкагон-подобного пептида GLP-1 (7-37) («Sigma», США) (2 мг/кг) изучали дифференцировку в инсулин-продуцирующие клетки по методикам Bonner-Weir S. et al. Y 0,5 × 10 6 cells 2 subgroups using glucagon-like peptide GLP-1 (7-37) ( «Sigma», USA) (2 mg / kg) was studied to differentiate into insulin-producing cells by techniques Bonner-Weir S . et al. (2000) и Suzuki A. et al. (2000) and Suzuki A. et al. (2004), модифицированных для панкреатических мультипотентных прогениторных клеток. (2004), modified for pancreatic multipotent progenitor cells. По окончании 30 дней у клеток 2 подгруппы прижизненным окрашиванием дитизоном выявляли инсулин-продуцирующие клетки и изучали секрецию инсулина. At the end of 30 days, the cells 2 of the subgroup identified by dithizone staining of live insulin-producing cells, and insulin secretion studied. Оценивали базальный уровень секреции (при концентрации глюкозы в фосфатном буфере 3 ммоль/л) и секреторную активность в условиях повышения концентрации глюкозы до 20 ммоль/л у 1×10 6 мононуклеаров [16, 17]. Evaluated basal secretion level (when the glucose concentration in phosphate buffer 3 mmol / l) and secretory activity in the context of increasing glucose concentration up to 20 mmol / L in the 1 × 10 6 mononuclear cells [16, 17].

Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Mathematical processing of the results was performed using standard methods of variation statistics. Достоверность различий оценивали с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Манна-Уитни. The significance of differences was assessed using a parametric Student's t test or the nonparametric Mann-Whitney U test.

Пример Example

Проведенные эксперименты позволили показать, что курсовое введение стрептозотоцина вызывает изменения, свойственные для сахарного диабета I типа. The experiments made it possible to show that the course administration of streptozotocin induces changes characteristic for type I diabetes. Так, на 21-й день после последней инъекции препарата уровень глюкозы в крови у мышей С57В 1/6 поднимается до 18,0±1,7 ммоль/л (Р<0,001). Thus, on the 21st day after the last injection the blood glucose level in mice S57V 1/6 rises to 18.0 ± 1.7 mmol / l (P <0.001). Исходный уровень глюкозы составляет 7,5±0,8 ммоль/л. Initial glucose levels of 7.5 ± 0.8 mmol / l. Окрашивание дитизоном демонстрирует разрушение панкреатических инсулин-продуцирующих клеток. Staining with dithizone demonstrates the destruction of insulin-producing pancreatic cells. По сравнению с животными интактного контроля их количество уменьшается в 5 раз (Р<0,01). Compared to the intact control animals reduced their number is 5 times (P <0.01). Цитометрические исследования позволяют выявить во фракции неприлипающих мононуклеаров поджелудочной железы у интактных мышей и мышей при сахарном диабете клетки с фенотипом CD45 - , TER119 - , c-Kit - , Flk-1 - (мультипотентные прогениторные клетки) и CD45 - , TER119 - , CD133 + , CD49f low (олигопотентные предшественники β-клеток) (рис. 1). Cytometric studies allow identify in the fraction of non-adherent mononuclear cells of the pancreas in naive mice and mice with diabetes cells with the phenotype CD45 -, TER119 -, c- Kit -, Flk- 1 - (multipotent progenitor cells) and CD45 -, TER119 -, CD133 + , CD49f low (oligopotentnye precursors β-cells) (Fig. 1). У больных мышей наблюдается значительное расширение популяции олигопотентных предшественников. Patients mice there is a significant expansion of the population oligopotentnyh predecessors. При этом стрептозотоцин не влияет на мультипотентные прогениторные клетки (таблица 1). In this streptozotocin does not affect the multipotent progenitor cells (Table 1).

Таблица 1 Table 1
Количество мультипотентных прогениторных клеток и олигопотентных предшественников β-клеток в поджелудочной железе у мышей линии С57В 1/6 и в культуре неприлипающих мононуклеаров поджелудочной железы мышей линии С57В 1/6 (% от всех меченых неприлипающих мононуклеаров) на 21-й день эксперимента (М±m) The number of multipotent progenitor cells and progenitor oligopotentnyh β-cells in the pancreas in mice S57V 1/6 and nonadherent mononuclear cells in culture pancreas S57V 1/6 mice (% of labeled non-adherent mononuclear cells) on day 21 of the experiment (M ± m)
Группы исследования study group Интактный контроль intact control Сахарный диабет Diabetes
Мультипотентные прогениторные клетки Multipotent progenitor cells
Поджелудочная железа Pancreas 36,176±2,239 36.176 ± 2.239 36,186±3,571 36.186 ± 3.571
Культура неприлипающих мононуклеаров поджелудочной железы Culture non-adherent mononuclear cells of the pancreas 46,755±4,541• 46,755 ± 4,541 • 56,852±5,619*• 56,852 ± 5,619 * •
Олигопотентные предшественники β-клеток Oligopotentnye β-cell precursors
Поджелудочная железа Pancreas 0,096±0,014 0.096 ± 0.014 0,224±0,028* 0,224 ± 0,028 *
Культура неприлипающих мононуклеаров поджелудочной железы Culture non-adherent mononuclear cells of the pancreas 0,118±0,019 0.118 ± 0.019 0,077±0,01*• 0,077 ± 0,01 * •
Приложение * р<0,05 по сравнению с интактным контролем; Appendix * p <0.05 compared with untreated control; • р<0,05 по сравнению с поджелудочной железой. • p <0.05 compared with the pancreas.

Как видно из представленных данных, на фоне гибели островковых β-клеток в поврежденной стрептозотоцином поджелудочной железе присутствуют мультипотентные прогениторные клетки и наблюдается расширение популяции олигопотентных предшественников β-клеток. As can be seen from the data, against destruction of islet β-cells in the pancreas of streptozotocin damaged present multipotent progenitor cells and have been expanding progenitor populations oligopotentnyh β-cells.

Клональный анализ показывает способность панкреатических неприлипающих мононуклеаров диабетических мышей образовывать клеточные агрегаты (колонии) при длительном культивировании - опытная группа (1 месяц) (рис. 2). Clonal analysis shows the ability of pancreatic nonadherent mononuclear diabetic mice to form cell aggregates (colonies) on prolonged culture - experimental group (1 month) (figure 2.). Однако плотность колоний и клеточность в образцах опытной группы ниже (1 колония/240 клеток/см 2 ), чем в культуре интактного контроля (7 колоний/602 клетки/см 2 ) (Р<0,05). However, the density of the colonies and cellularity of the samples following the experimental group (1 colony / 240 cells / cm 2) than in intact control culture (7 colonies / 602 cells / cm 2) (P <0.05). Мы проанализировали экспрессию антигенов стволовых и прогениторных β-клеток, полученных в результате культивирования. We analyzed the expression of antigens of stem and progenitor β-cells derived from culturing. Оказалось, что содержание CD45 - , TER119 - , cKit - , Flk-1 - -клеток в культуре контрольной группы значительно больше, чем в свежевыделенной поджелудочной железе у мышей с сахарным диабетом (контрольная группа) (+29,24%, Р<0,05). It was found that the content of CD45 -, TER119 -, cKit -, Flk- 1 - cells in the control group culture is considerably greater than in freshly isolated pancreas in mice with diabetes (control group) (+ 29.24%, p <0 , 05). При культивировании обогащение мультипотентными прогениторными клетками в образцах опытной группы происходит более интенсивно (+56,97%, Р<0,03), чем в образцах контрольной группы. When cultured enrichment multipotent progenitor cells in the experimental group samples occurs more intensively (+ 56.97%, p <0.03) than the control group samples. В противоположность этому, популяция CD45 - , TER119 - , CD133 + , CD49f low -клеток в культуре опытной группы сокращается (-65,6%; Р<0,02) (таблица 1). In contrast, CD45 population -, TER119 -, CD133 +, CD49f low cells in culture reduced the experimental group (-65.6%; P <0.02) (Table 1). Прижизненное окрашивание дитизоном мононуклеаров, полученных в результате культивирования, не выявило инсулин-продуцирующих клеток в контрольных и опытных образцах. Intravital dithizone staining mononuclear cells obtained by culturing, revealed no insulin-producing cells in control and test samples. В супернатантах не определяется инсулин. The supernatants determined not insulin.

Итак, культивирование позволяет наращивать панкреатические мультипотентные прогениторные клетки от мышей с диабетом, что указывает на их способность к самоподдержанию. So cultivation allows to increase pancreatic multipotent progenitor cells from mice with diabetes, indicating their ability to self-renew. При этом в образцах сокращается количество более зрелых олигопотентных предшественников β-клеток, не выявлены инсулин и инсулин-продуцирующие клетки. In the samples reduced the amount of more mature progenitor oligopotentnyh β-cells have been identified insulin and insulin-producing cells.

У полученных в результате культивирования мультипотентных прогениторных клеток изучали способность дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки (дитизон-положительные) в присутствии GLP-1 (7-37) in vitro. In the resulting culture of multipotent progenitor cells we studied the ability to differentiate into insulin-producing cells (dithizone-positive) in the presence of GLP-1 (7-37) in vitro. Полученные данные показывают, что по окончании цикла дифференцировки количество дитизон-положительных клеток в культуре опытной группы (предварительно обогащенной мультипотентными прогениторными клетками) более чем в 10 раз превышает (Р<0,001) их уровень в образцах интактного контроля (таблица 1). The data show that after differentiation cycle number dithizone-positive cells in the culture test group (pre-enriched multipotent progenitor cells) is more than 10 times (P <0.001) their level in intact control samples (Table 1). Биохимическое исследование позволило выявить инсулин в супернатантах от дитизон-положительных клеток контрольной и опытной группы под влиянием глюкозы в минимальной концентрации (3 ммоль/л). Biochemical revealed insulin in supernatants from dithizone-positive cells control and experimental groups under the influence of the concentration of glucose in the minimal (3 mmol / L). При повышении концентрации глюкозы до 20 ммоль/л увеличивается и уровень гормона в исследуемых жидкостях. With increasing glucose concentration up to 20 mmol / l and increased levels of the hormone in the examined fluids. Следует отметить, что базальный уровень инсулина и уровень инсулина при повышенной нагрузке в опытных образцах достоверно превосходит таковой в контрольной группе (таблица 2). It should be noted that the basal level of insulin and insulin level at high load in the test samples was significantly superior to that of the control group (Table 2).

Таким образом, исследование демонстрирует, что мультипотентные предшественники β-клеток (CD45 - , TER119 - , c-Kit - , Flk-1 - ) поджелудочной железы мышей со стрептозотоцин-индуцированным диабетом могут дифференцироваться в направлении инсулин-продуцирующих клеток, способных секретировать гормон инсулин в ответ на глюкозную нагрузку. Thus, the study demonstrated that multipotent progenitor β-cells (CD45 -, TER119 -, c -Kit -, Flk- 1 -) pancreas of mice with streptozotocin-induced diabetes can differentiate insulin producing cells in a direction capable of secreting the hormone insulin in response to a glucose load.

Таблица 2 table 2
Уровень базального инсулина и инсулина при глюкозной нагрузке в культуре дитизон-положительных клеток, полученных в результате GLP-1(7-37)-индуцированной дифференцировки мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы у мышей линии С57В 1/6 на 21-й день эксперимента (µlU/ml) (М±m) The level of insulin and basal insulin when glucose load in culture dithizone-positive cells derived from GLP-1 (7-37) -induced differentiation of multipotent progenitor cells of the pancreas in mice S57V 1/6 on Day 21 of the experiment (μlU / ml) (M ± m)
Группы исследования study group Базальный уровень глюкозы в культуре мультипотентных прогениторных клеток (3 ммоль/л) The basal level of glucose in the culture of multipotent progenitor cells (3 mmol / L) Глюкозная нагрузка для мультипотентных прогениторных клеток (20 ммоль/л) Glucose load for multipotent progenitor cells (20 mmol / l)
Интактный контроль intact control 15,6±1,2 15.6 ± 1.2 36,7±2,8• 36.7 ± 2.8 •
Сахарный диабет Diabetes 95,6±7,1* 95.6 ± 7.1 * 202,7±11,5*• 202,7 ± 11,5 * •
Приложение * р<0,05 по сравнению с интактным контролем; Appendix * p <0.05 compared with untreated control; • р<0,05 по сравнению с базальным уровнем глюкозы. • p <0.05 compared with the basal level of glucose.

Предлагаемый способ позволяет получить и определить способность к дифференцировке мультипотентных прогениторных клеток диабетической поджелудочной железы в секретирующие инсулин β-клетки, что поможет оценить выраженность поражения панкреатической железы и стратегию лечения сахарного диабета, основанную на избирательной стимуляции эндогенных мультипотентных прогениторных клеток больного. The proposed method makes it possible to receive and determine the ability for differentiation of multipotent progenitor cells of the pancreas in diabetic insulin-secreting β-cells, which help evaluate the severity of lesions and pancreatic diabetes treatment strategy based on selective stimulation of endogenous multipotent progenitor cells of the patient.

Литература Literature

1. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. 1. stem cell biology and cellular technologies. Том 2 / Под ред. Volume 2 / Ed. М.А. MA Пальцева. Paltseva. - М.: ОАО Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - 456 с.: ил. - Moscow .: Publishing house of "Meditsina" publisher "Shiko", 2009. - 456 p .: ill. (Учеб. Лит. Для студ. Мед. вузов). (Proc. Lit. For the studio. Med. High schools).

2. Дедов И.И. 2. Santa II Сахарный диабет - опаснейший вызов мировому сообществу // Вестник РАМН. Diabetes - the most dangerous challenge to the world community // Journal of Medical Sciences. - 2012. - Т. 1. - С. 7-13. - 2012. - T. 1. - P. 7-13.

3. Готье С.В. 3. S. Gauthier Сахарный диабет 1 типа, диабетическая невропатия: возможности трансплантологии. Type 1 diabetes, diabetic neuropathy: opportunities transplantation. Вестник РАМН. Bulletin of Medical Sciences. - 2012. - Т. 1. - С. 54-60. - 2012. - T. 1. - P. 54-60.

4. Atkinson М.А., Eisenbarth GS Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. 4. Atkinson MA, Eisenbarth GS Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. // Lancet. // Lancet. - 2001. - V. 358. - P. 221-229. - 2001. - V. 358. - P. 221-229.

5. Inverardi L., Kenyon NS, Ricordi C. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user′s guide. 5. Inverardi L., Kenyon NS, Ricordi C. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. // Stem Cells. // Stem Cells. - 2010. - Dev19. - 2010. - Dev19. - P. 1449-1470. - P. 1449-1470.

6. Minami К., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. 6. Minami K., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. // Journal of Diabetes investigation. // Journal of Diabetes investigation. - 2013. - V. 4 (2). - 2013. - V. 4 (2). - P. 131-141. - P. 131-141.

7. Dominguez-Bendala J., Lanzoni G., Inverardi L., Ricordi C. Concise Review: Mesenchymal Stem Cells for Diabetes. 7. Dominguez-Bendala J., Lanzoni G., Inverardi L., Ricordi C. Concise Review: Mesenchymal Stem Cells for Diabetes. // Stem cells Translation Medicine. // Stem cells Translation Medicine. - 2012. - V. 1. - P. 59-63. - 2012. - V. 1. - P. 59-63.

8. Zanini С., Bruno S., Mandili G., Baci D., Cerutti F., Cenacchi G., Izzi L., Camussi G., Forni M. Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Pancreatic Islets and Bone Marrow into Islet-Like Cell Phenotype. 8. Zanini C., Bruno S., Mandili G., Baci D., Cerutti F., Cenacchi G., Izzi L., Camussi G., Forni M. Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Pancreatic Islets and Bone Marrow into Islet-Like Cell Phenotype. // PLoS One. // PLoS One. - 2011. - V. 6(12). - 2011. - V. 6 (12). - e28175. - e28175.

9. Gopurappilly R., Bhat V., Bhonde R. Pancreatic tissue resident mesenchymal stromal cell (MSC)-like cells as a source of in vitro islet neogenesis. 9. Gopurappilly R., Bhat V., Bhonde R. Pancreatic tissue resident mesenchymal stromal cell (MSC) -like cells as a source of in vitro islet neogenesis. // J Cell biochem. // J Cell biochem. - 2013. - Apr 19. Doi: 10. 1002/jcb. - 2013. - Apr 19. Doi: 10. 1002 / jcb. 24572. [Epub ahead of print]. 24572. [Epub ahead of print].

10. Chung CH, Levine F. Adult Pancreatic Alpha-Cells: A New Soorce of Cells for Beta-Cells Regeneration. 10. Chung CH, Levine F. Adult Pancreatic Alpha-Cells: A New Soorce of Cells for Beta-Cells Regeneration. // Rev Diabet Stud. // Rev Diabet Stud. - 2010. - V. 7(2). - 2010. - V. 7 (2). - P. 124-131. - P. 124-131.

11. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki К., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. 11. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki K., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007. - V. 292(1). - 2007. - V. 292 (1). - P. 158-165. - P. 158-165.

12. Suzuki A., Nakauchi H., Taniguchi H. Prospective Isolation of Multipotent Pancreatic Progenitors Using Flow-Cytometric Cell Sorting. 12. Suzuki A., Nakauchi H., Taniguchi H. Prospective Isolation of Multipotent Pancreatic Progenitors Using Flow-Cytometric Cell Sorting. // Diabetes. // Diabetes. - 2004. - V. 53, N8. - 2004. - V. 53, N8. - P. 2143-2152. - P. 2143-2152.

13. Zhou Q., Law AC, Rajagopal J. et al. 13. Zhou Q., Law AC, Rajagopal J. et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis // Dev. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis // Dev. Cell. Cell. - 2007. - Vol. - 2007. - Vol. 13. - P. 103-114. 13. - P. 103-114.

14. Sugiyama Т., Rodriguez RT, McLean GW, Kim SK Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FASC // Proc. 14. Sugiyama T., Rodriguez RT, McLean GW, Kim SK Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FASC // Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA. USA. - 2007. - Vol. - 2007. - Vol. 104. - P. 175-180. 104. - P. 175-180.

15. Akira S., Masahide Y., Hiroshi Y. et al., Identification of insulinproducing cells derived from embryonic stem cells by zinc-chelating dithizone. 15. Akira S., Masahide Y., Hiroshi Y. et al., Identification of insulinproducing cells derived from embryonic stem cells by zinc-chelating dithizone. // Stem Cells. // Stem Cells. - 2002. - V. 20. - P. 284-292. - 2002. - V. 20. - P. 284-292.

16. Minami К., Okuno M., Miyawaki K., Okumachi A., Ishizaki K., Oyama K., Kawaquchi M., Ishizuka N., Iwanaqa Т., Seino S. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. 16. Minami K., Okuno M., Miyawaki K., Okumachi A., Ishizaki K., Oyama K., Kawaquchi M., Ishizuka N., Iwanaqa T., Seino S. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. // Proc Natl Acad Sci USA. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2005. - V. 102(42). - 2005. - V. 102 (42). - P. 15116-15121. - P. 15116-15121.

17. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki K., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. 17. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki K., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007. - V. 292(1). - 2007. - V. 292 (1). - P. 158-165. - P. 158-165.

Claims (1)

  1. Способ индукции дифференцировки мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы в инсулин-продуцирующие β-клетки при сахарном диабете I типа, характеризующийся тем, что выделяют взвесь неадгезирующих мононуклеаров клеток из ткани поджелудочной железы при сахарном диабете, в полученной взвеси оценивают количество мультипотентных прогениторных клеток, олигопотентных прогениторных клеток и инсулин-продуцирующих β-клеток, затем в течение 30 дней в присутствии ростовых факторов: 4 нг/мл эпидермального фактора роста и 10 нг/мл фак A method of inducing differentiation of multipotent progenitor cells of the pancreas into insulin-producing β-cells in diabetes I type, characterized in that the recovered slurry neadgeziruyuschih mononuclear cells from pancreatic tissue in diabetes, in the resulting slurry estimate the number of multipotent progenitor cells oligopotentnyh progenitor cells and the insulin-producing β-cells, and then for 30 days in the presence of growth factors: 4 ng / ml epidermal growth factor, and 10 ng / ml factor тора роста гепатоцитов, наращивают клеточную массу мультипотентных прогениторных клеток, по окончании цикла культивирования индуцируют дифференцировку полученных in vitro мультипотентных прогениторных клеток, характеризующихся CD45 - TER119 - , c-Kit - , Flk-1 - , в β-клетки глюкагон-подобным пептидом GLP-1 в концентрации 6,7 мкл/мл. hepatocyte growth torus, increasing cell mass multipotent progenitor cells, after cultivation cycle induce differentiation in vitro derived multipotent progenitor cells are characterized by CD45 - TER119 -, c-Kit -, Flk- 1 -, in β-cells, glucagon-like peptide GLP- 1 in a concentration of 6.7 .mu.l / ml.
RU2014130726A 2014-07-24 2014-07-24 Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes RU2579997C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014130726A RU2579997C2 (en) 2014-07-24 2014-07-24 Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014130726A RU2579997C2 (en) 2014-07-24 2014-07-24 Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014130726A true RU2014130726A (en) 2016-02-20
RU2579997C2 true RU2579997C2 (en) 2016-04-10

Family

ID=55313332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014130726A RU2579997C2 (en) 2014-07-24 2014-07-24 Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2579997C2 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2636044C1 (en) * 2016-05-26 2017-11-17 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольберга" Means for stimulation of differentiation of pancreatic progenitors of beta-cells into insulin producing and secreting beta-cell in case of insulin-dependent diabetes mellitus

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7202080B2 (en) * 2001-03-29 2007-04-10 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway
EP1438418B1 (en) * 2001-09-26 2010-11-24 The General Hospital Corporation Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
WO2012025914A1 (en) * 2010-08-22 2012-03-01 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic beta cells
RU2465323C2 (en) * 2007-07-18 2012-10-27 Лайфскен, Инк. Differentiation of human embryonic stem cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7202080B2 (en) * 2001-03-29 2007-04-10 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway
EP1438418B1 (en) * 2001-09-26 2010-11-24 The General Hospital Corporation Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
RU2465323C2 (en) * 2007-07-18 2012-10-27 Лайфскен, Инк. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2012025914A1 (en) * 2010-08-22 2012-03-01 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic beta cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
СКУРИХИН Е. Г. и др., Дифференцировка стволовых и прогениторных бета-клеток поджелудочной железы в инсулинсекретирующие клетки у мышей при сахарном диабете, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2013, Т.156, N 12, С.681-686. *

Also Published As

Publication number Publication date Type
RU2014130726A (en) 2016-02-20 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Anzalone et al. New emerging potentials for human Wharton’s jelly mesenchymal stem cells: immunological features and hepatocyte-like differentiative capacity
Yamada et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte‐like cells identified by cellular uptake of indocyanine green
Shi et al. Inducing embryonic stem cells to differentiate into pancreatic β cells by a novel three‐step approach with activin A and all‐trans retinoic acid
Kuwana et al. Human circulating CD14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation
Shiroi et al. Identification of insulin‐producing cells derived from embryonic stem cells by zinc‐chelating dithizone
US8057789B2 (en) Placental stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
Kobayashi et al. Wnt4-transformed mouse embryonic stem cells differentiate into renal tubular cells
Banerjee et al. Reversal of experimental diabetes by multiple bone marrow transplantation
Troyer et al. Concise review: Wharton's jelly‐derived cells are a primitive stromal cell population
Alipio et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic β-like cells
Smukler et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin
Fan et al. Therapeutic potentials of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord
Trucco Regeneration of the pancreatic β cell
Fiorina et al. Immunological applications of stem cells in type 1 diabetes
Scharner et al. The muscle satellite cell at 50: the formative years
US20020182728A1 (en) Method for transdifferentiation of non pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway
Huang et al. Phenotypic determination and characterization of nestin-positive precursors derived from human fetal pancreas
Anzalone et al. Wharton’s jelly mesenchymal stem cells as candidates for beta cells regeneration: extending the differentiative and immunomodulatory benefits of adult mesenchymal stem cells for the treatment of type 1 diabetes
Chen et al. Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells
Tomita et al. A comparison of neural differentiation and retinal transplantation with bone marrow‐derived cells and retinal progenitor cells
Lechner et al. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus
Tang et al. In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from murine bone marrow
US20070031384A1 (en) Regeneration of pancreatic islets by amniotic fluid stem cell therapy
Cregan et al. Identification of nestin-positive putative mammary stem cells in human breastmilk
US20080118477A1 (en) Umbilical cord mesenchymal stem cells support cord blood hematopoiesis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160725