RU2568059C1 - Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells - Google Patents
Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2568059C1 RU2568059C1 RU2014145167/10A RU2014145167A RU2568059C1 RU 2568059 C1 RU2568059 C1 RU 2568059C1 RU 2014145167/10 A RU2014145167/10 A RU 2014145167/10A RU 2014145167 A RU2014145167 A RU 2014145167A RU 2568059 C1 RU2568059 C1 RU 2568059C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- medium
- fibroblast
- cultivation
- stem cells
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и трансплантологии (клеточной терапии). Изобретение позволяет получать донор- и пациент-специфические фибробластоподобные клетки для использования их в трансплантологии и в качестве аутологичного фидерного (питающего) слоя для культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и поддержания их в недифференцированном состоянии.The invention relates to biotechnology and transplantology (cell therapy). The invention allows to obtain donor and patient-specific fibroblast-like cells for use in transplantology and as an autologous feeder (feeding) layer for the cultivation of induced human pluripotent stem cells and maintaining them in an undifferentiated state.
В 2006 г. японским исследователям Такахаши и Яманака [1] удалось осуществить репрограммирование взрослых и эмбриональных фибробластов мыши в плюрипотентные стволовые клетки путем введения в эти клетки с помощью ретровирусных векторов, четырех транскрипционных факторов Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4. Авторы назвали эти клетки индуцированными плюрипотентными стволовыми (ИПС) клетками. Полученные в результате такой обработки ИПС клетки своей морфологией, ростовыми свойствами и экспрессией специфических маркеров были аналогичны эмбриональным стволовым (ЭС) клеткам. Уже через год Такахаши [2] и Накагава [3] из той же лаборатории Киотского университета сообщили об успешной дедифференцировке фибробластов взрослого человека и получении ИПС клеток с помощью тех же факторов (Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4). Недифференцированное состояние ИПС клеток характеризуется различными признаками и поддерживается, в частности, культивированием на слое питающих клеток. Эти клетки ингибируют и предотвращают дифференцировку ИПС клеток, обеспечивая их всеми необходимыми факторами (Lif, FGF, TGFβ, Activin, Wnt и др.) для поддержания роста и самообновления. Слой питающих клеток, называемых фидерными клетками, обычно представляет собой слой эмбриональных мышиных фибробластов или фибробластов человека, полученных из крайней плоти, инактивированных митомицином С или гамма-облучением. Недифференцированные ЭС и ИПС клетки характеризуются высокой активностью щелочной фосфатазы [2], экспрессией протеогликанов TRA-1-60 и TRA-1-81, гликолипида SSEA-4 и в меньшей степени гликолипида SSEA-3 [4]. SSEA-4 и SSEA-3 характерны только для ЭС и ИПС клеток человека и приматов, ЭС клетки мыши несут на своей поверхности только гликопротеин SSEA-1 [1]. Внутриклеточными маркерами недифференцированного состояния являются транскрипционные факторы (ТФ), необходимые для поддержания плюрипотентности ИПС и ЭС клеток, такие как Oct4, Nanog и Sox2 [1-3]. Недифференцированные ЭС и ИПС клетки растут плотными чаще всего круглыми колониями. Размер клеток составляет около 20 микрон, наблюдается высокое соотношение ядро-цитоплазма, хорошо видны ядрышки, характерно перинуклеарное расположение митохондрий, низкое содержание АТФ, высокий уровень потребления кислорода и низкий уровень содержания митохондриальной ДНК [5-8].In 2006, Japanese researchers Takahashi and Yamanaka [1] were able to reprogram adult and embryonic mouse fibroblasts into pluripotent stem cells by introducing four transcription factors Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, and Klf4 into these cells using retroviral vectors. The authors called these cells induced pluripotent stem (IPA) cells. The IPS cells obtained as a result of this treatment by their morphology, growth properties, and expression of specific markers were similar to embryonic stem (ES) cells. A year later, Takahashi [2] and Nakagawa [3] from the same laboratory at Kyoto University reported the successful dedifferentiation of adult fibroblasts and the production of IPA cells using the same factors (Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4). The undifferentiated state of IPA cells is characterized by various signs and is supported, in particular, by cultivation on a layer of feeding cells. These cells inhibit and prevent the differentiation of IPS cells, providing them with all the necessary factors (Lif, FGF, TGFβ, Activin, Wnt, etc.) to support growth and self-renewal. The layer of feeder cells, called feeder cells, is usually a layer of human embryonic murine fibroblasts or fibroblasts derived from the foreskin, inactivated by mitomycin C or gamma radiation. Undifferentiated ES and IPS cells are characterized by high alkaline phosphatase activity [2], expression of proteoglycans TRA-1-60 and TRA-1-81, glycolipid SSEA-4, and to a lesser extent glycolipid SSEA-3 [4]. SSEA-4 and SSEA-3 are characteristic only for ES and IPS cells of humans and primates, mouse ES cells carry only SSEA-1 glycoprotein on their surface [1]. Intracellular markers of an undifferentiated state are transcription factors (TFs) necessary for maintaining pluripotency of IPA and ES cells, such as Oct4, Nanog, and Sox2 [1-3]. Undifferentiated ES and IPS cells grow dense most often in round colonies. The cell size is about 20 microns, a high ratio of nucleus-cytoplasm is observed, nucleoli are clearly visible, the perinuclear arrangement of mitochondria is characteristic, low ATP content, high oxygen consumption and low levels of mitochondrial DNA [5-8].
ИПС клетки, находясь в недифференцированном состоянии, являются неисчерпаемым источником для получения любых дифференцированных клеток организма и поэтому представляются весьма перспективными для индивидуализированной клеточной терапии различных патологий человека. ИПС и ЭС клетки способны неограниченно пролиферировать in vitro, не теряя своих плюрипотентных свойств. В этих клетках работают каскады сигнальных путей, которые блокируют дифференцировку и способствуют поддержанию и активации ТФ плюрипотентности. В конце 20 века определили три главных ТФ, необходимых для поддержания плюрипотентности: Oct3/4 (POU5F1), Sox2 и Nanog. [9-11]. Они тесно взаимодействуют как между собой, так и с множеством активных и, что не менее важно, не активных генов. Часть генов ответственны за поддержание плюрипотентности ЭС и ИПС клеток, а часть за дифференцировку в экто-, энто- и мезодермальном направлении, а также в экстраэмбриональные ткани.IPA cells, being in an undifferentiated state, are an inexhaustible source for obtaining any differentiated cells of the body and therefore appear to be very promising for individualized cell therapy of various human pathologies. IPA and ES cells are capable of unlimited proliferation in vitro without losing their pluripotent properties. In these cells, cascades of signaling pathways work that block differentiation and contribute to the maintenance and activation of TF pluripotency. At the end of the 20th century, three major TFs needed to maintain pluripotency were identified: Oct3 / 4 (POU5F1), Sox2, and Nanog. [9-11]. They closely interact with each other, as well as with many active and, no less important, inactive genes. Some of the genes are responsible for maintaining the pluripotency of ES and IPS cells, and partly for differentiation in the ecto-, ento-, and mesodermal direction, as well as in extraembryonic tissues.
Дифференцировка ИПС и ЭС клеток в определенные типы клеток происходит вследствие восстановления маркеров метилирования, которые, в свою очередь, позволяют регулировать экспрессию тканеспецифичных генов.The differentiation of IPA and ES cells into certain cell types occurs due to the restoration of methylation markers, which, in turn, allow the expression of tissue-specific genes to be regulated.
Недавно были описаны способы получения фибробластоподобных клеток из ЭС клеток человека [12, 13]. Клетки имели схожий с фибробластами фенотип, и было показано, что фибробластоподобные клетки экспрессируют паттерн генов, характерных для первичных фибробластов (коллагены I, III, IV и V типов, фибронектин). При этом уровень экспрессии был в несколько раз выше, чем у первичных фибробластов. Для получения фибробластоподобных клеток использовали фактор роста фибробластов и проводили неоднократные пассирования, чтобы добиться моногенной культуры.Recently, methods for producing fibroblast-like cells from human ES cells have been described [12, 13]. The cells had a phenotype similar to fibroblasts, and it was shown that fibroblast-like cells express a pattern of genes characteristic of primary fibroblasts (type I, III, IV and V collagens, fibronectin). Moreover, the expression level was several times higher than that of primary fibroblasts. To obtain fibroblast-like cells, the fibroblast growth factor was used and repeated passages were performed to achieve a monogenic culture.
Однако работ по получению фибробластов из ИПС клеток к настоящему времени не известно.However, to date, the production of fibroblasts from IPA cells is not yet known.
Фибробласты являются важной составляющей частью технологии культивирования как ЭС, так и ИПС клеток человека в недифференцированном состоянии, выступая для них в качестве фидерного слоя.Fibroblasts are an important component of the cultivation technology of both ES and IPA of human cells in an undifferentiated state, acting for them as a feeder layer.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является получение пациент-специфических или индивидуализированных фибробластов из ИПС клеток в больших количествах, что открывает широкие перспективы для их использования не только в качестве фидерного слоя, но и в качестве материала для аутологичной трансплантации человеку при различных травмах или заболеваниях. Указанный технический результат достигается за счет подобранных условий диссоциации ИПС клеток до моноклеточной суспензии и дальнейшего культивирования в специальных ростовых средах.The technical result achieved by the implementation of the present invention is to obtain patient-specific or individualized fibroblasts from IPA cells in large quantities, which opens up wide prospects for their use not only as a feeder layer, but also as a material for autologous transplantation to humans with various injuries or diseases. The specified technical result is achieved due to the selected conditions for the dissociation of IPA cells to a single cell suspension and further cultivation in special growth media.
Под индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека понимаются клетки, полученные из дифференцированных соматических клеток человека путем репрограммирования.Under induced human pluripotent stem cells refers to cells obtained from differentiated somatic human cells by reprogramming.
Под фидерным слоем понимается слой фибробластов, на котором проходит культивирование ЭС и ИПС клеток человека.Under the feeder layer is meant a layer of fibroblasts, on which the cultivation of ES and IPS human cells.
ПримерыExamples
Авторы настоящего изобретения установили, что ИПС клетки человека способны дифференцироваться в производные трех зародышевых листков: эктодерму, мезодерму и энтодерму и что ИПС клетки человека способны дифференцироваться в фибробласты (фибробластоподобные клетки).The authors of the present invention have found that human IPA can differentiate into derivatives of three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm, and that human IPA can differentiate into fibroblasts (fibroblast-like cells).
Было установлено, что фибробласты, полученные из ИПС клеток человека, могут служить эффективным фидерным слоем для культивирования аутологичных ИПС клеток и ИПС клеток от других доноров и поддержания их в недифференцированном состоянии.It was found that fibroblasts obtained from human IPA cells can serve as an effective feeder layer for culturing autologous IPA cells and IPA cells from other donors and maintaining them in an undifferentiated state.
Пример 1.Example 1
Проводили исследование возможности дифференцировки ИПС клеток человека в фибробласты и способности полученных фибробластов служить эффективным фидерным слоем для культивирования ИПС клеток и поддержания их в недифференцированном состоянии.A study was made of the possibility of differentiating human IPA cells into fibroblasts and the ability of the obtained fibroblasts to serve as an effective feeder layer for culturing IPA cells and maintaining them in an undifferentiated state.
Эксперименты были проведены на линиях ИПС клеток человека. Для получения фибробластов были использованы 2 линии клеток от здорового донора.The experiments were carried out on the lines of human IPS cells. To obtain fibroblasts, 2 cell lines from a healthy donor were used.
ИПС клетки линия ПО2, 56 пассаж,IPS cells line PO2, 56 passage,
ИПС клетки линия ПО6, 32 пассаж.IPS cell line PO6, 32 passage
Способность сохранять плюрипотентность ИПС клеток на полученных фибробластах проверяли на линиях здорового донора (ПО2 и ПО6 - аутологичные клетки), а также на линиях от трех пациентов с болезнью Паркинсона: Тр5, Ку15 и Бл6.The ability to maintain the pluripotency of IPA cells on the obtained fibroblasts was tested on the lines of a healthy donor (PO2 and PO6 - autologous cells), as well as on lines from three patients with Parkinson's disease: Tr5, Ku15 and Bl6.
Способность сохранять плюрипотентность на полученных фибробластах также проверяли на линии ЭС клеток человека huES09 (клетки любезно предоставлены М.А. Лагарьковой, Институт Общей генетики им. Н.И. Вавилова, РАН).The ability to maintain pluripotency on the obtained fibroblasts was also tested on the huES09 human ES cell line (cells were kindly provided by M.A. Lagarkova, N.I. Vavilov Institute of General Genetics, RAS).
Недифференцированные ИПС клетки снимали стандартным способом с применением диспазы, далее клетки аккуратно ресуспендировали до моноклеточной суспензии и помещали в среду, состоящую из среды для культивирования недифференцированных ЭС клеток (mTeSr)+среда для культивирования эмбриоидных тел (ЭТ среда) в соотношении 1:1.Undifferentiated IPA cells were removed in a standard manner using dispase, then the cells were gently resuspended to a monocellular suspension and placed in a medium consisting of medium for culturing undifferentiated ES cells (mTeSr) + medium for culturing embryoid bodies (ET medium) in a 1: 1 ratio.
Среда для эмбриоидных тел:Medium for embryoid bodies:
DMEM/F12, 20% фетальной сыворотки коровы, 2 мМ L-глутамин, 1% заменимых аминокислот, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанол, пенициллин/стрептомицин (50 ед.мл / 50 мкг мл).DMEM / F12, 20% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 1% non-essential amino acids, 0.1 mM beta-mercaptoethanol, penicillin / streptomycin (50 units / 50 μg ml).
Для получения эмбриоидных тел ИПС клетки культивировали в СО-2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2 методом «висячей капли» или помещали в 96-луночный круглодонный планшет из расчета 3000-6000 клеток на лунку в 100 мкл среды. Суть метода «висячей капли» заключалась в следующем: на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри по каплям наносили суспензию клеток, в 20 мкл которой содержалось 2000 клеток. Капли наносили на таком расстоянии друг от друга, чтобы они не слились, когда крышку переворачивают и возвращают на чашку. В саму чашку наливали 4 мл среды DMEM, содержащей пенициллин/стрептомицин (50 ед. в мл / 50 мкг в мл), аккуратно переворачивали крышку с капельками суспензии и закрывали ею чашку. Через сутки наблюдали появление ЭТ в каплях. В случае посева клеток в 96-луночный круглодонный планшет также через сутки наблюдали образование ЭТ (фиг. 1).To obtain embryoid bodies, IPA cells were cultured in a CO-2 incubator at 37 ° C and 5% CO 2 by the “hanging drop” method or placed in a 96-well round-bottom plate at the rate of 3000-6000 cells per well in 100 μl of medium. The essence of the “hanging drop” method was as follows: a suspension of cells was applied dropwise to the inner surface of the lid of the Petri dish, 20 μl of which contained 2000 cells. Drops were applied at such a distance from each other that they did not merge when the lid was turned over and returned to the cup. 4 ml of DMEM containing penicillin / streptomycin (50 units per ml / 50 μg per ml) were poured into the cup itself, the lid with droplets of suspension was carefully turned over and the cup was closed with it. After a day, the appearance of ET in drops was observed. In the case of seeding cells in a 96-well round-bottom plate, ET formation was also observed after 24 hours (Fig. 1).
Далее трехдневные ЭТ переносили на 24-луночный планшет, покрытый 0,1% желатином или матригелем из расчета по 1 ЭТ на лунку в 1 мл среды для ЭТ. Прикрепление происходило одинаково хорошо как на желатиновую подложку, так и на подложку из матригеля. Через сутки по периметру ЭТ начинали появляться фибробластоподобные клетки (фиг. 2). Смену ростовой среды осуществляли каждые 2-3 дня. Культивирование проводили в СО-2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2 в течение 8-10 суток, за это время клетки достигали 50-60% монослоя.Next, three-day ETs were transferred to a 24-well plate coated with 0.1% gelatin or matrigel at the rate of 1 ET per well in 1 ml of ET medium. The attachment occurred equally well on both the gelatin substrate and the matrigel substrate. After a day, fibroblast-like cells began to appear around the perimeter of ET (Fig. 2). The growth medium was changed every 2-3 days. Cultivation was carried out in a CO-2 incubator at 37 ° C and 5% CO 2 for 8-10 days, during which time the cells reached 50-60% of the monolayer.
Для того чтобы при первом пересеве получить моногенную культуру из фибробластоподобных клеток, было необходимо механически отделить остатки эмбриоидного тела (на фиг. 2 выглядит как темное пятно в центре) от слоя фибробластоподобных клеток. Под микроскопом, при увеличении ×50, стерильным наконечником для автоматического дозатора на 200 мкл аккуратно отделяли остатки ЭТ и удаляли его из лунки. Клетки промывали средой DMEM пенициллин/стрептомицин (50ед.мл / 50 мкг мл) и в лунки вносили теплый (37°С) 0,05% раствор трипсина. Планшеты инкубировали 3-5 мин в СО-2-инкубаторе и пипетировали клетки в ЭТ среде до моноклеточной суспензии. Затем клетки переносили на чашку Петри (диаметр 35 мм) в 2 мл среды для ЭТ. Использовали как необработанные чашки Петри, так и покрытые матригелем и 0,1% желатином. Фибробластоподобные клетки одинаково хорошо росли на всех чашках. Через сутки делали смену среды с заменой ее на среду для роста фибробластов (среда DMEM, содержащая 10% фетальной сыворотки, 1% заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамин, пеницилин/стрептомицин (50ед.мл / 50 мкг мл) (фиг. 3). Все последующие смены среды и пересевы осуществляли на этой же среде для фибробластов. Через 3-4 дня по достижении монослоя клеток осуществляли пересев в соотношении 1:2 на новые чашки Петри диаметром 35 мм (фиг. 4). Как видно из фотографии, представленной на фиг. 4, полученные клетки морфологически схожи с фибробластами кожи человека. Имунноцитохимическое окрашивание антителами к AFP-alfa («abcam», ab28244) показал наличие специфического для фибробластов антигена в 100% клетках (фиг. 5).In order to obtain a monogenic culture from fibroblast-like cells at the first pass, it was necessary to mechanically separate the remains of the embryoid body (in Fig. 2 it looks like a dark spot in the center) from a layer of fibroblast-like cells. Under a microscope, at a magnification of × 50, a sterile tip for an automatic dispenser of 200 μl accurately separated the residues of ET and removed it from the well. The cells were washed with penicillin / streptomycin DMEM medium (50 U / ml / 50 μg ml) and a warm (37 ° C) 0.05% trypsin solution was added to the wells. The plates were incubated for 3-5 min in a CO-2 incubator and cells were pipetted in ET medium to a monocellular suspension. Then the cells were transferred to a Petri dish (diameter 35 mm) in 2 ml of medium for ET. Used both untreated Petri dishes, and coated with matrigel and 0.1% gelatin. Fibroblast-like cells grew equally well on all plates. After a day, a medium change was made with its replacement with fibroblast growth medium (DMEM medium containing 10% fetal serum, 1% non-essential amino acids, 2 mM L-glutamine, penicillin / streptomycin (50 units / 50 μg ml) (Fig. 3 ). All subsequent medium changes and transfers were carried out on the same medium for fibroblasts. After 3-4 days, upon reaching the monolayer of cells, 1: 2 transfer was performed on new Petri dishes with a diameter of 35 mm (Fig. 4). As can be seen from the photograph, shown in Fig. 4, the obtained cells are morphologically similar to fibroblasts of human skin. cytochemical staining with antibodies to AFP-alfa ( «abcam», ab28244) showed the presence of fibroblast-specific antigen in 100% of the cells (FIG. 5).
Полученные фибробласты (фибробластоподобные клетки) были способны проходить до 20 пассажей, при этом до 10-го пассажа они сохраняли активный пролиферативный потенциал. Далее он несколько снижался, что характерно и для первичных фибробластов кожи человека.The resulting fibroblasts (fibroblast-like cells) were able to pass up to 20 passages, while up to the 10th passage they retained active proliferative potential. Further, it decreased slightly, which is also characteristic of primary fibroblasts of human skin.
На полученных фибробластоподобных клетках (дериватах) в разных экспериментах культивировали ИПС клетки линий ПО2, Бл6, Ку15, Тр5, ПО6, а также ЭС клетки линии huES09. Для культивирования использовали среду DMEM/F12, содержащую 20% заменителя сыворотки, 2 мМ глутамин, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанол, 1% заменимых аминокислот, пенициллин/стрептомицин (50 ед. мл / 50 мкг мл). Все 6 линий клеток успешно культивировались на фидерном слое из полученных дериватов, при этом они сохраняли морфологию недифференцированных плюрипотентных клеток даже после 3-5 пассажей (фиг. 6-8). Не было отмечено фенотипических и морфологических отличий при культивировании на дериватах, полученных из линий ПО2 и ПО6 между аутологичными ИПС клетками (дериваты из линии ПО2 - ИПС клетки линии ПО2, дериваты из линии ПО6 - ИПС клетки линии ПО6) и ИПС клетками от других доноров (дериваты из линии ПО2 - ИПС клетки линий Тр5, Бл6, Ку15; дериваты ПО6 - ИПС клетки Тр5, Бл6, Ку15). Схожий фенотип сохраняли также ЭС клетки huES09 как на дериватах ПО2, так и на ПО6.On the obtained fibroblast-like cells (derivatives) in different experiments, IPS cells of the PO2, Bl6, Ku15, Tr5, PO6 lines, as well as ES cells of the huES09 line were cultivated. For cultivation, DMEM / F12 medium containing 20% serum substitute, 2 mM glutamine, 0.1 mM beta-mercaptoethanol, 1% non-essential amino acids, penicillin / streptomycin (50 units ml / 50 μg ml) was used. All 6 cell lines were successfully cultured on the feeder layer from the obtained derivatives, while they retained the morphology of undifferentiated pluripotent cells even after 3-5 passages (Fig. 6-8). There were no phenotypic and morphological differences during cultivation on derivatives obtained from PO2 and PO6 lines between autologous IPA cells (derivatives from the PO2 line - IPA cells of the PO2 line, derivatives from PO6 line - IPA cells of the PO6 line) and IPA cells from other donors ( Derivatives from the PO2 line — IPS cells of the Tr5, Bl6, Ku15 lines; Derivatives PO6 — IPS cells of the Tr5, Bl6, Ku15 lines). A similar phenotype was also retained by huES09 ES cells both on PO2 and PO6 derivatives.
ИПС клетки линий Тр5 и Ку15 были впоследствии перенесены на подложку из матригеля в ростовую среду mTeSr и прошли еще несколько пассажей, после чего были окрашены на меркеры плюрипотентности SSEA4 и Sox2 (фиг. 9). На линии ЭС huES09 методом ОТ-ПЦР была показана экспрессия генов Nanog, Oct4, Klf4, FoxD3, Hesx1, DPPA4, Sox. Экспрессия в ЭС клетках прошедших 5 пассажей на линии фибробластоподобных клеток, затем 4 пассажа на подложке из матригеля в среде mTeSr была сравнима с экспрессией в клетках, культивирующихся в стандартных условиях только на подложке из матригеля в среде mTeSr. (фиг. 10).IPS cells of the Tr5 and Ku15 lines were subsequently transferred onto a substrate from matrigel into mTeSr growth medium and passed several more passages, after which they were stained with pluripotency merckers SSEA4 and Sox2 (Fig. 9). On the huES09 ES line, the expression of the Nanog, Oct4, Klf4, FoxD3, Hesx1, DPPA4, Sox genes was shown by RT-PCR. Expression in ES cells of the past 5 passages on a fibroblast-like cell line, then 4 passages on a matrigel substrate in mTeSr medium was comparable to expression in cells cultured under standard conditions only on a matrigel substrate in mTeSr medium. (Fig. 10).
Надо отметить, что ИПС и ЭС клетки после переноса их на дериваты значительно улучшают свою морфологию, практически все колонии имеют правильную округлую форму, количество дифференцированных клеток, которые неизбежно появляются в процессе культивирования на матригеле, практически сводится к нулю.It should be noted that after transferring them to derivatives, IPA and ES cells significantly improve their morphology, almost all colonies have a regular round shape, the number of differentiated cells that inevitably appear during cultivation on matrigel is practically reduced to zero.
При стандартных условиях культивирования ИПС и ЭС клеток человека с использованием подложки из матригеля и специально созданной среды mTeSr необходима ежедневная смена среды. Было показано, что при культивировании ЭС и ИПС клеток человека на полученных нами фибробластоподобных клетках смену среды можно проводить через 2-3 суток без потери этими клетками свойств плюрипотентности.Under standard conditions for the cultivation of human IPA and ES cells using a matrigel substrate and a specially created mTeSr medium, a daily change of medium is necessary. It was shown that during the cultivation of ES and IPS human cells on the obtained fibroblast-like cells, a medium change can be carried out after 2-3 days without loss of pluripotency properties by these cells.
Полученные фибробластоподобные клетки можно подвергать криозамораживанию в фетальной сыворотке с 10% ДМСО, 1 час при -20°С, с последующим переносом в кельвинатор на -70°С. Для длительного хранения клетки переносятся в жидкий азот (-196°С).The obtained fibroblast-like cells can be subjected to cryo-freezing in fetal serum with 10% DMSO, 1 hour at -20 ° C, followed by transfer to -70 ° C in a kelvinator. For long-term storage, cells are transferred to liquid nitrogen (-196 ° C).
Разморозка полученных дериватов.Defrosting Derivatives Received.
Разморозку можно проводить двумя способами.Defrosting can be done in two ways.
1. Ампулы с клетками помещаются в водяную баню на 37°С, после полной разморозки суспензия клеток переносится на чашку Петри (диаметр 35 мм) в 2 мл среды для культивирования фибробластов, через 3-4 часа после прикрепления клеток делается полная замена среды на свежую.1. Ampoules with cells are placed in a water bath at 37 ° C, after complete defrosting, the cell suspension is transferred to a Petri dish (diameter 35 mm) in 2 ml of fibroblast culture medium, 3-4 hours after the cells are attached, the medium is completely replaced with fresh .
2. Ампулы с клетками помещаются в водяную баню на 37°С, после полной разморозки суспензия клеток переносится в 15 мл пробирку с 10 мл теплой среды DMEM, центрифугируется 5 мин, 2 тыс. об. мин. Надосадочная жидкость удаляется, клетки аккуратно ресуспендируются в ростовой среде для фибробластов и переносятся на чашку Петри (диаметр 35 мм) в 2 мл среды для культивирования фибробластов. Фибробластоподобные клетки можно размораживать как на чашки, обработанные желатином, так и на необработанные чашки Петри.2. Ampoules with cells are placed in a water bath at 37 ° C, after complete defrosting, the cell suspension is transferred to a 15 ml tube with 10 ml of warm DMEM medium, centrifuged for 5 min, 2 thousand vol. min The supernatant is removed, the cells are gently resuspended in the growth medium for fibroblasts and transferred to a Petri dish (diameter 35 mm) in 2 ml of medium for culturing fibroblasts. Fibroblast-like cells can be thawed on both gelatin-treated plates and untreated Petri dishes.
ЛитератураLiterature
1. Takahashi К., Yamanaka S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126: 663-676.1. Takahashi, K., Yamanaka S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126: 663-676.
2. Takahashi K., Tanabe K., et al. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131: 861-872.2. Takahashi K., Tanabe K., et al. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131: 861-872.
3. Nakagawa M., Koyanagi M., Tanabe K., et al. (2008) Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts, Nature Biotechnology, 26(1): 101-106.3. Nakagawa M., Koyanagi M., Tanabe K., et al. (2008) Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts, Nature Biotechnology, 26 (1): 101-106.
4. Park I. - H., Arora N., Huo H., et al. (2008) Disease-specific induced pluripotent stem (iPS) cells, Cell. 134(5): 877-886.4. Park I. - H., Arora N., Huo H., et al. (2008) Disease-specific induced pluripotent stem (iPS) cells, Cell. 134 (5): 877-886.
5. Parker, G.C., Acsadi, G., Brenner, C.A. (2009) Mitochondria: determinants of stem cell fate? Stem Cells and Development, 18, 803-806.5. Parker, G.C., Acsadi, G., Brenner, C.A. (2009) Mitochondria: determinants of stem cell fate? Stem Cells and Development, 18, 803-806.
6. Facucho-Oliveira, J.M., St John, J.C. (2009) The relationship between pluripotency and mitochondrial DNA proliferation during early embryo development and embryonic stem cell differentiation, Stem Cell Reviews and Reports, 5, 140-158.6. Facucho-Oliveira, J. M., St John, J. C. (2009) The relationship between pluripotency and mitochondrial DNA proliferation during early embryo development and embryonic stem cell differentiation, Stem Cell Reviews and Reports, 5, 140-158.
7. Mattout, Α., Meshorer, E. (2010) Chromatin plasticity and genome organization in pluripotent embryonic stem cells, Current Opinion in Cell Biology, 22, 334-341.7. Mattout, Α., Meshorer, E. (2010) Chromatin plasticity and genome organization in pluripotent embryonic stem cells, Current Opinion in Cell Biology, 22, 334-341.
8. Park, S.H., Kook, M.C, Kim, E.Y., Park, S., Lim, J. (2004) Ultra structure of human embryonic stem cells and spontaneous and retinoic acid-induced differentiating cells, Ultra structural Pathology, 28, 229-238.8. Park, SH, Kook, MC, Kim, EY, Park, S., Lim, J. (2004) Ultra structure of human embryonic stem cells and spontaneous and retinoic acid-induced differentiating cells, Ultra structural Pathology, 28, 229 -238.
9. Chambers, I., Colby, D., Robertson, M, Nichols, J., Lee, S., Tweedie, S., Smith, A. (2003) Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells, Cell, 113, 643-655.9. Chambers, I., Colby, D., Robertson, M, Nichols, J., Lee, S., Tweedie, S., Smith, A. (2003) Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells, Cell, 113, 643-655.
10. Schöler, H.R., Hatzopoulos, A.K., Balling, R., Suzuki, N., Gruss, P. (1989) A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germlinespecific expression of an Oct factor, The EMBO Journal, 8, 2543-2550.10. Schöler, HR, Hatzopoulos, AK, Balling, R., Suzuki, N., Gruss, P. (1989) A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germlinespecific expression of an Oct factor, The EMBO Journal, 8, 2543-2550.
11. Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C, Dailey, L. (1995) Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3, Genes & Development, 9, 2635-2645.11. Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C, Dailey, L. (1995) Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3, Genes & Development, 9, 2635-2645.
12. Hsin-Fu Chen, Ching-Yu Chuang, Yu-Kai Shieh, Hao-Wei Chang, Hong-Nerng Ho, and Hung-Chih Kuo. (2009) Novel autogenic feeders derived from human embryonic stem cells (hESCs) support an undifferentiated status of hESCs in xeno-free culture conditions, Human Reproduction, Vol. 24, No.5 pp. 1114-1125.12. Hsin-Fu Chen, Ching-Yu Chuang, Yu-Kai Shieh, Hao-Wei Chang, Hong-Nerng Ho, and Hung-Chih Kuo. (2009) Novel autogenic feeders derived from human embryonic stem cells (hESCs) support an undifferentiated status of hESCs in xeno-free culture conditions, Human Reproduction, Vol. 24, No.5 pp. 1114-1125.
13. Chunhui Xu, Jianjie Jiang, Virginie Sottile, Jim McWhir, Jane Lebkowski, Melissa K. Carpentera. (2004) Immortalized Fibroblast-Like Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Support Undifferentiated Cell Growth, STEM CELLS, 22, 972-980.13. Chunhui Xu, Jianjie Jiang, Virginie Sottile, Jim McWhir, Jane Lebkowski, Melissa K. Carpentera. (2004) Immortalized Fibroblast-Like Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Support Undifferentiated Cell Growth, STEM CELLS, 22, 972-980.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145167/10A RU2568059C1 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145167/10A RU2568059C1 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2568059C1 true RU2568059C1 (en) | 2015-11-10 |
Family
ID=54537299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014145167/10A RU2568059C1 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2568059C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2555149A (en) * | 2016-04-21 | 2018-04-25 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| JPWO2020111271A1 (en) * | 2018-11-30 | 2021-10-14 | 株式会社 資生堂 | Compositions for treating or preventing skin pigmentation |
| CN114787341A (en) * | 2019-12-09 | 2022-07-22 | 株式会社大熊制药 | Method for preparing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells prepared thereby |
| RU2823729C1 (en) * | 2020-12-09 | 2024-07-29 | Тэвун Фармасьютикал Ко., Лтд. | Method of producing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells obtained according to this method |
-
2014
- 2014-11-11 RU RU2014145167/10A patent/RU2568059C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HSIN-FU CHEN et al, Novel autogenic feeders derived from human embryonic stem cells (hESCs) support an undifferentiated status of hESCs in xeno-free culture conditions, Human Reproduction, 2009, Vol. 24, No.5 pp. 1114-1125,RU 2492232 C2, 10.09.2013 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11591471B2 (en) | 2016-04-21 | 2023-02-28 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US10273549B2 (en) | 2016-04-21 | 2019-04-30 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US10711136B2 (en) | 2016-04-21 | 2020-07-14 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11091639B2 (en) | 2016-04-21 | 2021-08-17 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11377559B2 (en) | 2016-04-21 | 2022-07-05 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| GB2555149B (en) * | 2016-04-21 | 2022-10-05 | King S College London | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| GB2555149A (en) * | 2016-04-21 | 2018-04-25 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11739217B2 (en) | 2016-04-21 | 2023-08-29 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11999853B2 (en) | 2016-04-21 | 2024-06-04 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| JPWO2020111271A1 (en) * | 2018-11-30 | 2021-10-14 | 株式会社 資生堂 | Compositions for treating or preventing skin pigmentation |
| EP3888756A4 (en) * | 2018-11-30 | 2022-07-13 | Shiseido Company, Ltd. | Composition for treating or preventing skin pigmentation |
| CN114787341A (en) * | 2019-12-09 | 2022-07-22 | 株式会社大熊制药 | Method for preparing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells prepared thereby |
| RU2823729C1 (en) * | 2020-12-09 | 2024-07-29 | Тэвун Фармасьютикал Ко., Лтд. | Method of producing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells obtained according to this method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7053551B2 (en) | Mediums, cell cultures and methods for culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state | |
| US8609417B2 (en) | Methods and compositions for stem cell cultures | |
| CN106893692B (en) | Cell culture platform for single cell sorting and enhanced IPSC reprogramming | |
| Yusuf et al. | Embryonic fibroblasts represent a connecting link between mesenchymal and embryonic stem cells | |
| EP2038404A2 (en) | Cell growth medium | |
| RU2010147817A (en) | PLURIPOTENT CELLS | |
| JP2017532047A (en) | Generation of pluripotent stem cell-derived keratinocytes and maintenance of keratinocyte culture | |
| Zhang et al. | Retinol (vitamin A) maintains self‐renewal of pluripotent male germline stem cells (mGSCs) from adult mouse testis | |
| Choi et al. | A novel feeder-free culture system for expansion of mouse spermatogonial stem cells | |
| Lim et al. | In Vitro Culture‐Induced Pluripotency of Human Spermatogonial Stem Cells | |
| RU2568059C1 (en) | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells | |
| US9068167B2 (en) | Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions using matrix overlay methods | |
| EP3504324B1 (en) | Differentiation of pluripotent stem cells into corneal cells | |
| KR20120118407A (en) | Placenta-derived cells conditioned media and animal-free, feeder-free culture method for maintaining undifferentiated stem cells using the same | |
| JP2016202172A (en) | Production method of pseudoislet | |
| AU2021101223A4 (en) | METHOD FOR LONG-TERM IN VITRO CULTURE OF CHICKEN PGCs | |
| Tomizawa et al. | Activin A maintains pluripotency markers and proliferative potential of human induced pluripotent stem cells | |
| Wang et al. | Activin A can induce definitive endoderm differentiation from human parthenogenetic embryonic stem cells | |
| TWI280280B (en) | Culture system and method for expansion and undifferentiated growth of human embryonic stem cells | |
| CA3221435A1 (en) | Serum free media for suspension culture of mammalian livestock pluripotent stem cells | |
| Mohammadi et al. | Generation of rat embryonic germ cells via inhibition of TGFss and MEK pathways | |
| Li et al. | Converting mouse epiblast stem cells into mouse embryonic stem cells by using small molecules | |
| Wu et al. | Induced multilineage differentiation of chicken embryonic germ cells via embryoid body formation | |
| EP3153576A1 (en) | Improved expansion of eukaryotic cells | |
| WO2008018684A1 (en) | Culture medium for co-culturing of human stem cells and their feeder cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201112 |