RU2563621C2 - Bioresorbable polymer cell matrix - Google Patents
Bioresorbable polymer cell matrix Download PDFInfo
- Publication number
- RU2563621C2 RU2563621C2 RU2013142296/15A RU2013142296A RU2563621C2 RU 2563621 C2 RU2563621 C2 RU 2563621C2 RU 2013142296/15 A RU2013142296/15 A RU 2013142296/15A RU 2013142296 A RU2013142296 A RU 2013142296A RU 2563621 C2 RU2563621 C2 RU 2563621C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- matrix
- micro
- recesses
- tissue
- dimensional matrices
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Техническое решение относится к медицине, в частности, к травматологии, ортопедии, регенеративной медицине, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и может быть использовано в процессах регенерации и создания новых тканей и органов при проведении терапевтической реконструкции поврежденных органов.The technical solution relates to medicine, in particular to traumatology, orthopedics, regenerative medicine, dentistry, maxillofacial surgery and can be used in the processes of regeneration and creation of new tissues and organs during the therapeutic reconstruction of damaged organs.
Известна биорезорбируемая полимерная клеточная матрица для тканеинженерии (описание к патенту РФ №2234514 на изобретение, МПК: 7 C08B 37/08, C08J 9/28, C08L 5/08, C12N 5/00), выполненная в виде макропористых гранул с порами диаметром от 30 до 150 мкм из хитозана.Known bioresorbable polymer cell matrix for tissue engineering (description of the patent of the Russian Federation No. 2234514 for the invention, IPC: 7 C08B 37/08, C08J 9/28, C08L 5/08,
Гранулы характеризуются развитой адгезивной поверхностью, к которой легко прикрепляются клетки. Указанный размер пор обуславливает, во-первых, заселение клеток и, во-вторых, хорошую диффузию питательных веществ. Гранулы также характеризуются высокой биосовместимостью с клетками, являются биодеградируемыми, как следствие, пригодными для роста клеток и антиогенеза, поскольку хитозан не является биоинертным материалом. Биоактивность хитозана связана с тем, что в его основе лежит N-ацетил глюкозамин-углеводная составляющая внеклеточной основы костной и хрящевой ткани. В связи с этим гранулы хитозана в качестве матрицы не всегда пригодны для формирования в объеме адгезивных клеточных структур. Приведенные в указанном техническом решении гранулы из хитозана, по мнению авторов-разработчиков, найдут применение в качестве матриксов для стволовых клеток, в частности, для исследования их дифференцировки в хондро-, остеогенном направлениях.Granules are characterized by a developed adhesive surface to which cells are easily attached. The indicated pore size determines, firstly, the population of cells and, secondly, good diffusion of nutrients. Granules are also characterized by high biocompatibility with cells, are biodegradable, as a result, suitable for cell growth and antigenesis, since chitosan is not a bioinert material. The bioactivity of chitosan is due to the fact that it is based on the N-acetyl glucosamine-carbohydrate component of the extracellular base of bone and cartilage. In this regard, chitosan granules as a matrix are not always suitable for the formation of adhesive cell structures in the bulk. The granules from chitosan given in the indicated technical solution, according to the authors, will be used as matrices for stem cells, in particular, to study their differentiation in chondro- and osteogenic directions.
За ближайший аналог к заявляемому техническому решению принята биорезорбируемая полимерная клеточная матрица для тканеинженерии (описание к патенту США №7842097 на изобретение, МПК: 8 A61F 2/28), содержащая каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов из водонерастворимых минерализованных полимерных волокон биологического происхождения и водорастворимого связующего, посредством которого указанные волокна связаны друг с другом, а за счет перекрестного сшивания волокон обеспечена нерастворимость в матрице, причем указанные минерализованные полимерные волокна минерализованы посредством преципитации ионов кальция и соли фосфорной кислоты в присутствии указанных волокон, указанные минерализованные полимерные волокна иммобилизованы в матрицу за счет указанного связующего, кроме того матрица выполнена с возможностью ее деформации, с изменением исходных размера, формы и пористости до соответствующих деформированному состоянию и возвратом от деформированного состояния к исходным размеру, форме и пористости без ухудшения в отношении указанных волокон и связующего. Каркас-носитель выполнен трехмерным.For the closest analogue to the claimed technical solution adopted bioresorbable polymer cell matrix for tissue engineering (description of US patent No. 7842097 for invention, IPC: 8
В конкретном случае реализации рассматриваемой матрицы она выполнена содержащей добавки. В качестве добавок могут быть использованы лекарственные средства. В качестве минерализованных полимерных волокон биологического происхождения использованы волокна минерализованного коллагена с весовым содержанием коллагена от 30 до 95%. В качестве связующего использовано средство из группы: растворимый коллаген, желатин, полимолочная кислота, полигликолиевая кислота, сополимеры молочной и гликолиевой кислот, поликапролактон, карбоксиметилцеллюлоза, эфиры целлюлозы, декстроза, декстран, хитозан, гиалуроновая кислота, хондроитин сульфата, поливиниловый спирт, полиакриловая кислота, полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль, водорастворимые полиакрилаты и водорастворимые полиметилакрилаты.In the specific case of the implementation of the considered matrix, it is made containing additives. As additives, drugs can be used. As mineralized polymer fibers of biological origin, fibers of mineralized collagen with a weight content of collagen from 30 to 95% were used. As a binder, an agent from the group was used: soluble collagen, gelatin, polylactic acid, polyglycolic acid, copolymers of lactic and glycolic acids, polycaprolactone, carboxymethyl cellulose, cellulose ethers, dextrose, dextran, chitosan, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, polyvinyl acid, polyvinyl acid polypropylene glycol, polyethylene glycol, water soluble polyacrylates and water soluble polymethyl acrylates.
В отношении приведенных решений не может быть реализовано: достижение возможности управления процессом регенерации ткани, локализации процесса; повышение эффективности регенерации ткани, а также достижение воспроизводимости процессов и результатов регенерации ткани.In relation to the above solutions, the following cannot be realized: achieving the ability to control the process of tissue regeneration, localization of the process; increasing the efficiency of tissue regeneration, as well as achieving reproducibility of the processes and results of tissue regeneration.
Причины, препятствующие реализации, заключаются в том, что приведенные матрицы не позволяют при получении тканеинженерного эквивалента максимально копировать структуру восстанавливаемой ткани на микро- и наноуровне. Матрицы далеко не в полном объеме удовлетворяют ряду требований, предъявляемых к конструкциям для тканевой инженерии, а именно: способности имитировать структуру и биологические функции; способности к обеспечению механической поддержки, дифференцировки и пролиферации клеток для управления структурой и функцией формируемой ткани. Следует отметить также отсутствие в подходе конструирования указанных матриц системного подхода к архитектуре матрицы, учитывающего роль микро- и наноструктурирования, недопонимание роли наноструктурирования, его системности. Процесс регенерации ткани с использованием вышеприведенных матриц носит спонтанный характер, а результат зачастую невоспроизводим и далек от ожидаемого.The reasons that impede implementation are that the matrices presented do not allow the maximum copy structure of the tissue being restored at the micro- and nanoscale when obtaining the tissue-engineering equivalent. Matrices far from fully satisfy a number of requirements for designs for tissue engineering, namely: the ability to imitate the structure and biological functions; the ability to provide mechanical support, differentiation and proliferation of cells to control the structure and function of the formed tissue. It should also be noted that the approach to constructing the indicated matrices lacks a systematic approach to matrix architecture that takes into account the role of micro- and nanostructuring, a misunderstanding of the role of nanostructuring, its systematic nature. The process of tissue regeneration using the above matrices is spontaneous, and the result is often irreproducible and far from expected.
Кроме того, известные матрицы не позволяют проводить направленный ангиогенез, в частности, для костной ткани за счет включения в матрицу гаверсовой системы и сосудов, связывающих лакуны.In addition, the known matrices do not allow directed angiogenesis, in particular, for bone tissue due to the inclusion of Haversian system and blood vessels connecting the gaps in the matrix.
Техническим результатом предлагаемого решения является:The technical result of the proposed solution is:
- реализация возможности управления процессом регенерации ткани, локализации и направленности процесса;- implementation of the ability to control the process of tissue regeneration, localization and focus of the process;
- повышение эффективности регенерации ткани;- increasing the efficiency of tissue regeneration;
- достижение воспроизводимости в процессах и результатах регенерации ткани.- achieving reproducibility in the processes and results of tissue regeneration.
Технический результат достигается в биорезорбируемой полимерной клеточной матрице для тканеинженерии, содержащая каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, в которой каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц с N≥1 с возможностью их фиксации в стопку после заселения клетками для тканевой инженерии, каждая из двумерных матриц сформирована с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.The technical result is achieved in a bioresorbable polymer cell matrix for tissue engineering, containing a carrier frame for cell cultures and biological agents, in which the frame is assembled from N oriented two-dimensional matrices with N≥1 oriented relative to each other with the possibility of fixing them in a pile after populating cells for tissue engineering, each of the two-dimensional matrices is formed using lithography in the form of a polymer film with surface arrays of micro- and / or nano-objects, characterized individually architecture, system and interconnectivity location in the architecture of micro- and / or nano-objects, with the ability to specify the structure of the bone to be formed, taking into account its biological functions, with the ability to provide mechanical support, process control of cell differentiation and proliferation.
В матрице каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц, устанавливаемых с примыканием друг к другу или с зазором.In the matrix, the frame is made of assembled from N two-dimensional matrices oriented relative to each other, which are installed adjacent to each other or with a gap.
В матрице N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц выполнены плоской или криволинейной формы, с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов, выполненными на одной или обеих поверхностях.In the matrix N of two-dimensional matrices oriented relative to each other, they are made of a flat or curvilinear shape, with surface arrays of micro- and / or nano-objects made on one or both surfaces.
В матрице в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток реализованы с возможностью максимального копирования матрицей микро- и наноструктуры костей, системы гаверсовых каналов и лакун, а также соединяющих их каналов.In the matrix for each of N two-dimensional matrices with N≥1, surface arrays of micro- and / or nano-objects, characterized by individual architecture, systematic and interconnected arrangement of micro- and / or nano-objects in the architecture, with the possibility of specifying the structure of bone tissue to be formed, accounting its biological functions, with the possibility of providing mechanical support, controlling the processes of differentiation and proliferation of cells are implemented with the possibility of maximum copying by a matrix of micro- and nanostructures Keturah bone Haversian canal system and gaps, as well as their connecting channels.
В матрице в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов выполнены содержащими массив продольных углублений для формирования гаверсовых каналов, массив локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, массив углублений, соединяющих продольные и локальные углубления - для соединения лакун с гаверсовыми каналами, массив наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массив наноотверстий в локальных областях для улучшения адгезии клеток в локальных областях и улучшения их дифференцировки и пролиферации.In the matrix for each of N two-dimensional matrices with N≥1, surface arrays of micro- and / or nano-objects are made containing an array of longitudinal recesses for forming Haversian channels, an array of local recesses located along longitudinal recesses, for forming gaps in orthogonal to each other, an array recesses connecting longitudinal and local recesses - for connecting lacunae with haversian channels, an array of nanochannels located over the entire surface of the polymer film at an angle relative to ial pits, an array of nanoholes in local areas to improve cell adhesion in local areas and improve their differentiation and proliferation.
В матрице продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, шириной и глубиной, превосходящими размеры клеток и достаточными для формирования структурной единицы костной ткани.In the matrix, longitudinal recesses for the formation of haversian channels are made along the entire surface of the polymer film, with a width and depth exceeding the cell sizes and sufficient to form a structural unit of bone tissue.
В матрице продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, шириной и глубиной от 14 до 25 мкм включительно, с периодом от 200 до 400 мкм включительно, локальные углубления для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, расположенные вдоль продольных углублений, по обе стороны, выполнены размером около 6 мкм × 6 мкм × 16 мкм, углубления, соединяющие продольные и локальные углубления - соединения лакун с гаверсовыми каналами, выполнены размером около 1 мкм × 2 мкм, наноканалы, расположенные по всей поверхности пленки полимера под углом 45 градусов относительно продольных углублений, выполнены глубиной от 100 до 180 нм включительно, шириной около 120 нм, периодом от 200 до 400 нм включительно, наноотверстия для улучшения адгезии выполнены диаметром от 10 до 30 нм, средней поверхностной плотностью 100000000 мм-2.In the matrix, longitudinal recesses for forming haversian channels are made along the entire surface of the polymer film, with a width and depth of 14 to 25 μm inclusive, with a period of 200 to 400 μm inclusive, local recesses for forming gaps in orthogonal to each other, located along the longitudinal recesses , on both sides, made about 6 μm × 6 μm × 16 μm in size, the recesses connecting the longitudinal and local recesses — the gaps with havers channels, made about 1 μm × 2 μm in size, nanoc channels located over the entire surface of the polymer film at an angle of 45 degrees relative to the longitudinal recesses are made with a depth of 100 to 180 nm inclusively, a width of about 120 nm, a period of 200 to 400 nm inclusive, nanoholes for improving adhesion are made with a diameter of 10 to 30 nm, the average surface density of 100,000,000 mm -2 .
В матрице в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы нанообъектов, выполнены в составе наноканалов, или ноноотверстий, или наношипов, или в сочетании указанных нанообъектов, расположенных с периодом, согласованным с размерами молекул адгезии или центров адгезии, равным величине от 100 до 420 нм включительно.In the matrix with respect to each of N two-dimensional matrices with N≥1, the surface arrays of nanoobjects are made up of nanochannels, or non-holes, or nanoships, or in a combination of these nanoobjects located with a period consistent with the sizes of adhesion molecules or adhesion centers equal to 100 to 420 nm inclusive.
В матрице в качестве полимера использован полимер молочной кислоты или полимер молочной кислоты с сополимерами.In the matrix, the polymer used is a lactic acid polymer or a lactic acid polymer with copolymers.
В матрице каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга с возможностью фиксации двумерных матриц с N≥1, а именно, с использованием для фиксации геля на основе гиалуроновой кислоты с содержанием последней от 1 до 3% включительно или с использованием фибринового клея.In the matrix, the frame is assembled from N oriented relative to each other with the possibility of fixing two-dimensional matrices with N≥1, namely, using for fixing a gel based on hyaluronic acid with a content of the latter from 1 to 3% inclusive or using fibrin glue.
Сущность технического решения поясняется нижеследующим описанием и прилагаемыми фигурами.The essence of the technical solution is illustrated by the following description and the accompanying figures.
На Фиг. 1 показаны фотографии, сделанные с помощью оптического микроскопа: а) кремниевого мастер-штампа с элементами для формирования в матрице лакун с вертикальным расположением; б) поперечного скола мастер-штампа в месте расположения элемента для формирования гаверсового канала; в) поперечного скола мастер-штампа в местах расположения элемента для формирования капилляров, соединяющих гаверсовы каналы с лакунами; г) двумерной клеточной матрицы, изготовленной с использованием пленки полилактила посредством промежуточного силиконового штампа с рисунком, задающим матрице структуру костной ткани.In FIG. 1 shows photographs taken with an optical microscope: a) a silicon master stamp with elements for forming gaps with a vertical arrangement in the matrix; b) the transverse cleavage of the master stamp at the location of the element for the formation of the haversian channel; c) transverse cleavage of the master stamp at the locations of the element for forming capillaries connecting the Haversian channels to the gaps; d) a two-dimensional cell matrix made using a polylactyl film by means of an intermediate silicone stamp with a pattern that defines the matrix structure of bone tissue.
На Фиг. 2 представлены фотографии: а) многоуровневого микро-, наноструктурированного штампа; б) увеличенный фрагмент многоуровневого микро-, наноструктурированного штампа, демонстрирующий на неоднородной границе наноструктурированной области полосы, расположенные под углом 45 градусов относительно элемента для формирования в матрице при задании структуры костной ткани гаверсова канала, в штампе наноструктурированная область представляет собой массив элементов для формирования наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы для формирования лакун.In FIG. 2 presents photographs: a) a multi-level micro-, nanostructured stamp; b) an enlarged fragment of a multilevel micro-, nanostructured stamp, showing at an inhomogeneous boundary of the nanostructured region of the strip, located at an angle of 45 degrees relative to the element for forming in the matrix when setting the bone structure of the Haversian channel, in the stamp the nanostructured region is an array of elements for forming nanochannels oriented at an angle of 45 degrees and connecting elements to form gaps.
На Фиг. 3 представлен результат сканирования посредством атомно-силового микроскопа наноструктурированной области штампа, представляющей собой массив элементов для формирования в матрице при задании структуры костной ткани наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы для формирования лакун.In FIG. Figure 3 shows the result of scanning by means of an atomic force microscope of a nanostructured region of the stamp, which is an array of elements for forming nanochannels oriented at an angle of 45 degrees and connecting elements for forming gaps in the matrix when setting the bone tissue structure.
На Фиг. 4 показано топографическое изображение, полученное посредством атомно-силового микроскопа, наноструктурированной области штампа, представляющей собой массив элементов для формирования в матрице при задании структуры костной ткани наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы для формирования лакун.In FIG. Figure 4 shows a topographic image obtained by means of an atomic force microscope, a nanostructured stamp region, which is an array of elements for forming nanochannels oriented at a 45-degree angle and connecting elements for forming gaps in the matrix when setting the bone tissue structure.
На Фиг. 5 показаны фотографии, сделанные с помощью оптического микроскопа, кремниевых штампов с двумя типами расположения элементов для формирования в матрице при задании структуры костной ткани лакун: а) и в) - горизонтальное расположение; б) и г) - вертикальное расположение.In FIG. Figure 5 shows photographs taken with an optical microscope, silicon stamps with two types of arrangement of elements for forming lacunae in the matrix when setting the bone tissue structure: a) and c) - horizontal arrangement; b) and d) - vertical arrangement.
На Фиг. 6 представлен обзорный снимок поверхности двумерной биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы из полилактида с рельефом в виде периодического массива пирамидальных углублений с периодом 40 мкм и размером у основания 20 мкм.In FIG. Figure 6 presents a survey image of the surface of a two-dimensional bioresorbable polymer cell matrix made of polylactide with a relief in the form of a periodic array of pyramidal depressions with a period of 40 μm and a base size of 20 μm.
На Фиг. 7 представлен обзорный снимок поверхности двумерной биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы с рельефом в виде периодического массива пирамидальных углублений с периодом 10 мкм и размером у основания 7 мкм.In FIG. Figure 7 presents a survey image of the surface of a two-dimensional bioresorbable polymer cell matrix with a relief in the form of a periodic array of pyramidal depressions with a period of 10 μm and a base size of 7 μm.
На Фиг. 8 представлен обзорный снимок поверхности двумерной биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы с рельефом в виде периодического массива пирамидальных углублений с периодом 10 мкм и размером у основания 7 мкм, с визуализированными на нем точками выполнения рентгеноспектрального микроанализа.In FIG. Figure 8 presents a survey image of the surface of a two-dimensional bioresorbable polymer cell matrix with a relief in the form of a periodic array of pyramidal depressions with a period of 10 μm and a base size of 7 μm, with the points of X-ray spectral microanalysis visualized on it.
На Фиг. 9 показано полученное посредством электронного микроскопа изображение отпечатка в пленке полимера молочной кислоты после штамповки штампом площадью 160 см2 с рельефом в форме наноканалов, расположенных с периодом 200 нм.In FIG. 9 shows an electron microscope image of a fingerprint in a lactic acid polymer film after stamping with a 160 cm 2 die with a relief in the form of nanochannels arranged with a period of 200 nm.
На Фиг. 10 иллюстрируется морфология поверхности пленки полимера молочной кислоты после штамповки силиконовым штампом с наноканалами: а) топографическое изображение, полученное с помощью атомно-силового микроскопа; б) профиль, полученный методом атомно-силовой микроскопии при сканировании вдоль линии «L», показанной на топографическом изображении.In FIG. 10 illustrates the morphology of the surface of the film of the polymer of lactic acid after stamping with a silicone stamp with nanochannels: a) topographic image obtained using an atomic force microscope; b) the profile obtained by atomic force microscopy during scanning along the line "L" shown in the topographic image.
На Фиг. 11 представлено топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы, полученное с помощью атомно-силового микроскопа, демонстрирующее решетчатый рельеф с периодом 200 нм и размером углублений 180 нм × 120 нм.In FIG. 11 is a topographic image of a region of a two-dimensional polylactide matrix obtained using an atomic force microscope, showing a lattice relief with a period of 200 nm and a recess size of 180 nm × 120 nm.
На Фиг. 12 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы с периодом 200 нм и размером углублений 180 нм × 120 нм, полученной штамповкой при давлении 80 атм.In FIG. 12 shows a topographic image obtained using an atomic force microscope of a region of a two-dimensional polylactide matrix with a period of 200 nm and a recess size of 180 nm × 120 nm, obtained by stamping at a pressure of 80 atm.
На Фиг. 13 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы с периодом 200 нм и размером углублений 180 нм × 120 нм, полученной штамповкой при давлении 60 атм.In FIG. 13 shows a topographic image obtained using an atomic force microscope of a region of a two-dimensional polylactide matrix with a period of 200 nm and a recess size of 180 nm × 120 nm, obtained by stamping at a pressure of 60 atm.
На Фиг. 14 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение наноструктурированной поверхности двумерной матрицы из полилактида, полученной штамповкой силиконовым штампом, сформированной с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов с видимым диаметром шипа, варьируемым от 30 до 50 нм в связи с напылением на полилактид золота толщиной от 10 нм, что необходимо для получения качественного снимка, с реальным диаметром шипа, варьируемым от 10 до 30 нм.In FIG. 14 shows an electron microscope image of a nanostructured surface of a two-dimensional polylactide matrix obtained by stamping with a silicone stamp formed with a relief in the form of periodic arrays of nanometer spikes with a visible spike diameter ranging from 30 to 50 nm due to sputtering of gold polylactide from 10 to a thickness of 10 nm, which is necessary to obtain a high-quality image, with a real diameter of the spike, varying from 10 to 30 nm.
На Фиг. 15 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение кремниевого штампа с диаметром отверстий, варьируемым от 15 до 60 нм.In FIG. Figure 15 shows an electron microscope image of a silicon stamp with a hole diameter ranging from 15 to 60 nm.
На Фиг. 16 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение наноструктурированной поверхности полилактида, полученной с использованием кремниевого штампа с диаметром отверстий, варьируемым от 15 до 60 нм, с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов с ожидаемым диаметром от 10 до 50 нм.In FIG. 16 shows an electron microscope image of a nanostructured polylactide surface obtained using a silicon stamp with a hole diameter ranging from 15 to 60 nm, with a relief in the form of periodic arrays of nanometer spikes with an expected diameter of 10 to 50 nm.
На Фиг. 17 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы: вид сверху периодического массива отверстий диаметром от 10 до 30 нм.In FIG. 17 shows a topographic image of a region of a two-dimensional polylactide matrix obtained using an atomic force microscope: a top view of a periodic array of holes with a diameter of 10 to 30 nm.
На Фиг. 18 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы: трехмерное изображение периодического массива отверстий диаметром от 10 до 30 нм.In FIG. 18 shows a topographic image of a region of a two-dimensional polylactide matrix obtained using an atomic force microscope: a three-dimensional image of a periodic array of holes with a diameter of 10 to 30 nm.
На Фиг. 19 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение массива наноотверстий в двумерной матрице из полилактида с размерами отверстий от 10 до 30 нм и средней поверхностной плотностью 100000000 мм-2, полученного с использованием мастер-штампа из Al2O3, при формировании нанорельефа, улучшающего адгезию клеток.In FIG. 19 shows an electron microscope image of an array of nanoholes in a two-dimensional polylactide matrix with hole sizes from 10 to 30 nm and an average surface density of 100,000,000 mm -2 , obtained using a master die of Al 2 O 3 , when forming a nanorelief that improves adhesion cells.
Достижение технического результата в предлагаемом решении базируется на следующем.The achievement of the technical result in the proposed solution is based on the following.
При разработке конструкции матрицы был сделан акцент на получение тканеинженерного эквивалента с максимальным заданием (копированием) структуры формируемой (восстанавливаемой) ткани на микро- и наноуровне. Конструкцией матрицы учитывается по возможности максимально полное удовлетворение требований - способности имитировать структуру и биологические функции, обеспечить механическую поддержку, дифференцировку и пролиферацию клеток для управления структурой и функцией формируемой ткани. Реализована возможность более полного подражания, задания или копирования природных свойств материалов и процессов их формирования.When developing the design of the matrix, emphasis was placed on obtaining the tissue-engineering equivalent with the maximum task (copying) of the structure of the formed (restored) tissue at the micro- and nanoscale. The design of the matrix takes into account the fullest possible satisfaction of requirements - the ability to imitate the structure and biological functions, provide mechanical support, differentiation and proliferation of cells to control the structure and function of the formed tissue. The possibility of a more complete imitation, assignment or copying of the natural properties of materials and the processes of their formation is realized.
Реализована возможность осуществления направленного ангиогенеза, в частности, для костной ткани за счет включения в матрицу элементов, являющихся заготовками для формирования гаверсовой системы и сосудов, связывающих лакуны. Указанное стало осуществимым благодаря литографии, посредством которой сформирован поверхностный микро- и/или нанорельеф с массивами микро- и/или нанообъектов двумерных полимерных матриц, являющихся основными конструктивными единицами каркаса-носителя клеточных культур и биологических агентов, из которых собрана с реализацией их фиксации биорезорбируемая полимерная клеточная матрица.The possibility of implementing directed angiogenesis, in particular for bone tissue, has been realized due to the inclusion in the matrix of elements that are blanks for the formation of the Haversian system and the vessels that bind the gaps. This has become possible thanks to lithography, by means of which a surface micro- and / or nanorelief is formed with arrays of micro- and / or nano-objects of two-dimensional polymer matrices, which are the main structural units of the carrier frame of cell cultures and biological agents from which the bioresorbable polymer is assembled with their fixation cell matrix.
Литография - широко известный инструмент из арсенала пленарной технологии изготовления полупроводниковых приборов. Литография используется для формирования пленарной топологической структуры интегральной схемы. При формировании топологии этот инструмент позволяет реализовать широкое разнообразие рисунков. Основной характеристикой литографического процесса является разрешающая способность, выражающаяся в способности раздельно воспроизводить мелкие элементы рисунка. Под разрешающей способностью (разрешением) понимается размер и точность формирования заданного рельефа (рисунка). Развитие литографических методов привело к тому, что к настоящему времени в микроэлектронике преодолен барьер в получении элементов с минимальными размерами 32 нм. Кроме того, современные литографические методы, безотносительно к микроэлектронике, позволяют получать рисунки с элементами размером от 5 до 10 нм. Разработка предлагаемой матрицы для тканеинженерии базируется на современных достижениях в развитии литографических методов. Привнесение литографии в качестве инструмента копирования или задания микро- и наноструктуры ткани, подлежащей формированию, в частности, при регенерации поврежденной ткани или создании новой ткани, в разработку матрицы лежит в основе достижения технического результата. Ключевым моментом является возможность реализации рисунка любой формы в сочетании с высокой разрешающей способностью, достаточными для полноценного копирования или задания структуры ткани.Lithography is a well-known tool from the arsenal of plenary technology for the manufacture of semiconductor devices. Lithography is used to form the plenary topological structure of the integrated circuit. When forming a topology, this tool allows you to implement a wide variety of drawings. The main characteristic of the lithographic process is the resolution, expressed in the ability to separately reproduce small elements of the picture. By resolution (resolution) is understood the size and accuracy of the formation of a given relief (pattern). The development of lithographic methods has led to the fact that by now in microelectronics the barrier in obtaining elements with a minimum size of 32 nm has been overcome. In addition, modern lithographic methods, regardless of microelectronics, make it possible to obtain patterns with elements ranging in size from 5 to 10 nm. The development of the proposed matrix for tissue engineering is based on modern achievements in the development of lithographic methods. The introduction of lithography as a tool for copying or specifying the micro- and nanostructure of the tissue to be formed, in particular, when regenerating damaged tissue or creating a new tissue, in the development of the matrix is the basis for achieving a technical result. The key point is the ability to implement a pattern of any shape in combination with high resolution, sufficient for full copying or setting the fabric structure.
Так, при создании предлагаемой матрицы были задействованы возможности штамповой (импринт) литографии. Для получения микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов используется единый штамп, который в едином процессе формирует отпечаток (импринт) всей четырехуровневой структуры матрицы, в частности, при задании структуры костной ткани посредством нижерассматриваемых штампов (Фиг. 1 - Фиг. 5 и Фиг. 15). Кроме того, достоинством такой литографии является ее дешевизна, быстрота, возможность формирования микро- и нанорельефов на больших площадях или даже при непрерывном пропускании ленты с пленкой, на которой формируют рельеф, через вращающийся цилиндрический штамп.So, when creating the proposed matrix, the possibilities of stamped (imprint) lithography were used. To obtain micro- and / or nanorelief with arrays of micro- and / or nano-objects, a single stamp is used, which in a single process forms an imprint (imprint) of the entire four-level structure of the matrix, in particular, when setting the bone tissue structure using the dies below (Fig. 1 - Fig. 5 and Fig. 15). In addition, the advantage of such lithography is its cheapness, speed, the ability to form micro- and nanoreliefs over large areas or even with continuous transmission of a tape with a film on which a relief is formed through a rotating cylindrical stamp.
Использование литографии в отношении предлагаемой матрицы обеспечивает рисунки микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов, задающие (копирующие) с высокой точностью структуру ткани, подлежащей формированию (восстановлению поврежденной ткани или созданию новой ткани). Литографически обеспечивается возможность реализации с высокой точностью индивидуальной архитектуры каждой из N двумерных матриц с N≥1 с копированием микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов ткани, локализация с высокой точностью в архитектуре микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов. Каркас-носитель выполнен собираемым из N двумерных матриц с N≥1 в стопку, в которой матрицы ориентированы друг относительно друга таким образом, чтобы задать, скопировать структуру ткани, которую надлежит сформировать посредством предлагаемой матрицы. Каждая из двумерных матриц задает двумерную структуру формируемой ткани - структуру в плоскости, сборка матриц в стопку ориентированным образом друг относительно друга обеспечивает задание трехмерной структуры -структуры в объеме. В результате матрица, собранная на основе указанных двумерных матриц, ориентированных друг относительно друга, максимально полно учитывает структуру ткани, подлежащей формированию, и ее биологические функции, обеспечивает механическую поддержку, управление процессами дифференцировки и пролиферации клеток.The use of lithography in relation to the proposed matrix provides drawings of micro- and / or nanorelief with arrays of micro- and / or nano-objects that specify (copy) with high accuracy the structure of the fabric to be formed (repair damaged tissue or create new tissue). Lithographically, it is possible to implement with high accuracy the individual architecture of each of N two-dimensional matrices with N≥1 with copying micro- and / or nanorelief with arrays of micro- and / or nano-objects of fabric, localization with high accuracy in the architecture of micro- and / or nanorelief with arrays micro and / or nanoobjects. The carrier frame is assembled from N two-dimensional matrices with N≥1 into a stack in which the matrices are oriented relative to each other in such a way as to define, copy the fabric structure to be formed by the proposed matrix. Each of the two-dimensional matrices defines a two-dimensional structure of the fabric being formed — a structure in the plane; assembly of the matrices into a stack in an oriented manner relative to each other provides a three-dimensional structure-structure in volume. As a result, the matrix, assembled on the basis of these two-dimensional matrices oriented relative to each other, fully takes into account the structure of the tissue to be formed and its biological functions, provides mechanical support, and controls the processes of differentiation and proliferation of cells.
Рассмотренный подход конструирования матрицы дает возможность разрабатывать конструкции не только для восстановления существующих в природе биологических тканей - регенерировать ткани, но и создавать искусственные ткани, не существующие в природе, с заданной структурой и свойствами.The considered approach to matrix design makes it possible to develop designs not only for the restoration of biological tissues existing in nature - to regenerate tissues, but also to create artificial tissues that do not exist in nature with a given structure and properties.
Поскольку приведенный подход к реализации матрицы с использованием литографии позволяет успешно задавать (копировать) с высокой точностью как микро-, так и наноструктуру ткани, то в предлагаемой матрице для тканеинженерии наиболее полным образом учтена роль наноструктурирования. Благодаря литографии к наноструктурированию применен системный подход. Реализация матрицы на базе использования литографии позволяет осуществлять наноструктурирование полимерной пленки заданным образом, с соблюдением системности, локальности в архитектуре матрицы. Поэтому в предлагаемой матрице обеспечивается высокая адгезия клеток при заселении двумерных матриц клеточной культурой, распределение клеток оптимальным образом для эффективного протекания процесса регенерации ткани. Развитая адгезивная поверхность, к которой легко прикрепляются клетки, строго локализована в архитектуре матрицы.Since the above approach to the implementation of the matrix using lithography makes it possible to successfully set (copy) both micro- and nanostructures of tissue with high accuracy, the role of nanostructuring is most fully taken into account in the proposed matrix for tissue engineering. Thanks to lithography, a systematic approach has been applied to nanostructuring. The implementation of the matrix based on the use of lithography allows nanostructuring of the polymer film in a predetermined manner, subject to systemicity, locality in the matrix architecture. Therefore, the proposed matrix provides high cell adhesion upon population of two-dimensional matrices with a cell culture, the distribution of cells in an optimal way for the efficient course of tissue regeneration. A developed adhesive surface to which cells are easily attached is strictly localized in the matrix architecture.
Кроме того, что в реализацию матрицы для достижения технического результата привнесена литография, следует отметить, что конструктивно матрица выполнена в виде комплекта двумерных матриц, собираемых в цельную конструкцию после заселения клеток для тканевой инженерии. Это является существенным для достижения указанного технического результата, поскольку способствует оптимизации при заселении матрицы в целом клеточной культурой, распределению клеток оптимальным образом для эффективного протекания процесса регенерации ткани.In addition to the fact that lithography was introduced in the implementation of the matrix to achieve a technical result, it should be noted that the matrix is structurally made in the form of a set of two-dimensional matrices assembled into an integral structure after populating cells for tissue engineering. This is essential for achieving the indicated technical result, since it helps to optimize the cell distribution in the cell culture as a whole, and optimizes the distribution of cells for the efficient process of tissue regeneration.
Для практической реализации предлагаемой матрицы на базе штамповой литографии вначале литографическими методами изготавливают структурно-формирующие штампы, представляющие собой комплект штампов, с помощью которого осуществляется задание (копирование) в матрице, структуры ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клетокFor the practical implementation of the proposed matrix based on stamp lithography, structurally forming stamps are first made by lithographic methods, which are a set of stamps, with which the task (copying) in the matrix, the structure of the tissue to be formed, taking into account its biological functions, the possibility of providing mechanical support, control processes of cell differentiation and proliferation
В частности, указанные штампы изготавливают из кремния, используют также, например, промежуточные штампы из силикона и других материалов, например, Al2O3. Штампы снабжены рисунком, позволяющим задавать или копировать структуру, например, костной ткани (см. Фиг. 1-5, 15). Рисунок штампа для задания структуры костной ткани в матрице выполняют с возможностью отпечатка на пленке полимера массивов микро- и/или нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун в ортогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов (Фиг. 1а) и б), Фиг. 2, Фиг. 5), массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений (Фиг. 1а) и б), Фиг. 2), массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток (Фиг. 15).In particular, these dies are made of silicon; intermediate dies are also used, for example, from silicone and other materials, for example, Al 2 O 3 . The stamps are equipped with a pattern that allows you to set or copy the structure of, for example, bone tissue (see Fig. 1-5, 15). A stamp pattern for setting the structure of bone tissue in the matrix is performed with the possibility of imprinting on the polymer film arrays of micro- and / or nano-objects, characterized by individual architecture, systematic and interconnected arrangement in the architecture of micro- and / or nano-objects, with the possibility of setting the structure of the tissue to be formed, taking into account its biological functions, with the possibility of providing mechanical support, controlling the processes of differentiation and proliferation of cells: an array of longitudinal recesses, to form in the matrix of blanks of haversian channels, an array of local recesses located along longitudinal recesses, for forming in the matrix of blanks of lacunae in orthogonal directions to each other, an array of recesses connecting longitudinal and local recesses, for connecting blanks of lacunae with blanks for haversian channels (Fig. 1a) and b), FIG. 2, FIG. 5), an array of nanochannels located over the entire surface of the polymer film at an angle relative to the longitudinal recesses (Fig. 1a) and b), FIG. 2), an array of nanoholes in local regions to create nanostructured regions in the matrix to improve cell adhesion (Fig. 15).
Приведенные штампы обеспечивают высококачественное микро- и наноструктурирование полимерной пленки из полилактида.The above stamps provide high-quality micro- and nanostructuring of a polylactide polymer film.
Так, возможность высокого качества штампа для наноструктурирования полимерной пленки, с рисунком приведенным на Фиг. 2, подтверждается результатами сканирования посредством атомно-силового микроскопа (см. Фиг. 3) наноструктурированной области штампа, представляющей собой массив элементов для формирования наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы-заготовки для формирования лакун, а также соответствующим топографическим изображением, полученным посредством атомно-силового микроскопа, наноструктурированной области штампа (см. Фиг. 4).Thus, the possibility of a high quality die for nanostructuring a polymer film, with the pattern shown in FIG. 2, is confirmed by scanning by means of an atomic force microscope (see Fig. 3) of the nanostructured region of the stamp, which is an array of elements for forming nanochannels oriented at an angle of 45 degrees and connecting blank elements for forming gaps, as well as the corresponding topographic image obtained by means of an atomic force microscope, a nanostructured region of the stamp (see Fig. 4).
Возможность получения высококачественного микро- и нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток на полимерной пленке также подтверждается приведенными графическими материалами (см. Фиг. 6-14, 16-18).The ability to obtain high-quality micro- and nanorelief with arrays of micro- and / or nano-objects, characterized by individual architecture, systematic and interconnected arrangement of micro- and / or nano-objects in the architecture, with the ability to specify the tissue structure to be formed, taking into account its biological functions, with the possibility of ensuring mechanical support, control processes of differentiation and proliferation of cells on a polymer film is also confirmed by the graphical materials (see Fig. . 6-14, 16-18).
Так, снимки поверхности пленки полилактида, подвергнувшейся обработке штампами, формирующими пирамидальные углубления с размером у основания 20 мкм и периодом расположения 40 мкм (Фиг. 6), с размером у основания 7 мкм и периодом расположения 10 мкм (Фиг. 7), показывают четкий отпечаток штампа. Формируемые массивы пирамидальных углублений отличного качества.Thus, surface images of a polylactide film subjected to dies forming pyramidal recesses with a size at the base of 20 μm and a location period of 40 μm (Fig. 6), with a size at the base of 7 μm and a location period of 10 μm (Fig. 7), show a clear stamp imprint. The formed massifs of pyramidal deepenings of excellent quality.
Проведенный ренгеноспектральный анализ в отношении пленки полилактида, подвергнувшейся обработке штампом, формирующим пирамидальные углубления с размером у основания 7 мкм и периодом расположения 10 мкм (Фиг. 8), показал, что в составе после обработки присутствуют преимущественно кислород и углерод. Наличие в спектре пика, соответствующего золоту, объясняется использованием золота при подготовке образцов для исследований. Присутствие пиков в спектре, соответствующих натрию и хлору, обусловлено помещением образцов перед проведением исследований в физиологический раствор. Незначительные пики в спектре, соответствующие кремнию, скорее всего, обусловлены применением кремниевого штампа. Таким образом, предлагаемая матрица вполне приемлема в отношении токсичности.The X-ray spectral analysis performed with respect to the polylactide film subjected to stamping to form pyramidal depressions with a base size of 7 μm and a location period of 10 μm (Fig. 8) showed that mainly oxygen and carbon are present in the composition after processing. The presence of a peak in the spectrum corresponding to gold is explained by the use of gold in the preparation of samples for research. The presence of peaks in the spectrum corresponding to sodium and chlorine is due to the placement of samples before carrying out the studies in physiological saline. Slight peaks in the spectrum corresponding to silicon are most likely due to the use of a silicon stamp. Thus, the proposed matrix is quite acceptable in terms of toxicity.
Возможность высококачественного наноструктурирования с получением рельефа в виде массива периодически расположенных наноканалов демонстрирует изображение отпечатка в пленке полилактида, полученное с помощью электронного микроскопа (Фиг. 9), а также топографическое изображение и профиль, полученные с помощью атомно-силового микроскопа (Фиг. 10). Видны четкие формы наноканалов. Снимки подтверждают также высокую воспроизводимость форм наноканалов при «печати».The possibility of high-quality nanostructuring with obtaining a relief in the form of an array of periodically arranged nanochannels is demonstrated by the image of a print in a polylactide film obtained using an electron microscope (Fig. 9), as well as the topographic image and profile obtained using an atomic force microscope (Fig. 10). Clear forms of nanochannels are visible. The pictures also confirm the high reproducibility of the forms of nanochannels during “printing”.
На качество отпечатка могут влиять условия проведения штамповки. Так, в отношении отпечатка наноканалов (Фиг. 11), выполненных с периодичностью 200 нм с размерами углублений 180 нм × 120 нм, проводилось варьирование давления при штамповке. Изображения отпечатков наноканалов, выполненных штамповкой при давлении 80 атм. (см. Фиг. 12) и при давлении 60 атм. (см. Фиг. 13), показывают, что более высокое качество отпечатка получают при давлении 80 атм., что обусловлено полнотой заполнения штампа. При меньшем давлении, 60 атм., происходит неполное заполнение штампа, что видно из соответствующего изображения (см. Фиг. 13). Однако даже в этом случае наноструктурирование вполне приемлемого качества.The quality of the print may be affected by the stamping conditions. So, in relation to the imprint of the nanochannels (Fig. 11), made with a periodicity of 200 nm with dimensions of the recesses 180 nm × 120 nm, pressure was varied during stamping. Images of prints of nanochannels made by stamping at a pressure of 80 atm. (see Fig. 12) and at a pressure of 60 atm. (see Fig. 13), show that a higher print quality is obtained at a pressure of 80 atm., due to the completeness of the stamp. At a lower pressure, 60 atm., The stamp is incompletely filled, as can be seen from the corresponding image (see Fig. 13). However, even in this case, nanostructuring is of quite acceptable quality.
Кроме того, возможность высококачественного наноструктурирования демонстрируют снимки наноструктурированной поверхности полилактида с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов (Фиг. 14), а также с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов (Фиг. 16), которые в последнем случае получены с использованием кремниевого штампа с диаметром отверстий, варьируемым от 15 до 60 нм (см. изображение штампа на Фиг. 15). Также о высоком качестве наноструктурирования свидетельствуют снимки наноструктурированной поверхности полилактида с рельефом в виде периодических массивов отверстий диаметром от 10 до 30 нм (см. Фиг. 17 и 18) и массивов отверстий с этими же размерами, неоднородно расположенные по площади, со средней плотностью до 100000000 мм-2 (см. Фиг. 19).In addition, the possibility of high-quality nanostructuring is demonstrated by photographs of the nanostructured polylactide surface with a relief in the form of periodic arrays of nanometer spikes (Fig. 14), as well as with a relief in the form of periodic arrays of nanometer spikes (Fig. 16), which in the latter case were obtained using a silicon stamp with hole diameters ranging from 15 to 60 nm (see stamp image in FIG. 15). The high quality of nanostructuring is also evidenced by photographs of the nanostructured polylactide surface with a relief in the form of periodic arrays of holes with a diameter of 10 to 30 nm (see Figs. 17 and 18) and arrays of holes with the same sizes, heterogeneous in area, with an average density of up to 100,000,000 mm -2 (see Fig. 19).
Биорезорбируемая полимерная клеточная матрица для тканеинженерии содержит каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов. Указанный каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц с N≥1 с возможностью их фиксации в стопку после заселения клеток для тканевой инженерии. Каждая из двумерных матриц сформирована с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов. Указанные массивы характеризуются индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.The bioresorbable polymer cell matrix for tissue engineering contains a carrier framework for cell cultures and biological agents. The specified frame is made assembled from N oriented two-dimensional matrices relative to each other with N≥1 with the possibility of their fixation in a stack after the population of cells for tissue engineering. Each of the two-dimensional matrices is formed by lithography in the form of a polymer film with surface arrays of micro- and / or nano-objects. These arrays are characterized by individual architecture, systematic and interconnected arrangement of micro- and / or nano-objects in the architecture, the ability to specify the structure of bone tissue to be formed, take into account its biological functions, with the possibility of providing mechanical support, controlling the processes of cell differentiation and proliferation.
Каркас может быть реализован собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц, устанавливаемых с примыканием друг к другу или с зазором. Конкретное количество матриц в конкретном случае выбирается исходя из получения необходимых размеров формируемой ткани, например, размеров восстанавливаемой кости, толщин матриц и учета того, как они устанавливаются друг относительно друга, с зазором (учитывается величина зазора) или вплотную друг к другу.The frame can be implemented assembled from N oriented two-dimensional matrices relative to each other, which are installed adjacent to each other or with a gap. The specific number of matrices in a particular case is selected on the basis of obtaining the necessary dimensions of the tissue being formed, for example, the size of the restored bone, the thickness of the matrices and taking into account how they are installed relative to each other, with a gap (the size of the gap is taken into account) or close to each other.
В матрице N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц могут иметь плоскую форму или же криволинейную форму. Поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов могут быть выполнены на одной или обеих поверхностях.In the matrix N, two-dimensional matrices oriented relative to each other can have a flat shape or a curved shape. Surface arrays of micro- and / or nano-objects can be made on one or both surfaces.
В частном случае реализации биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для тканеинженерии в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток реализованы с возможностью максимального копирования матрицей микро- и наноструктуры костей, системы гаверсовых каналов и лакун, а также соединяющих их каналовIn the particular case of the implementation of a bioresorbable polymer cell matrix for tissue engineering with respect to each of N two-dimensional matrices with N≥1 surface arrays of micro and / or nano objects, characterized by individual architecture, consistency and interconnected location in the architecture of micro and / or nano objects, with the possibility of setting the structure of bone tissue to be formed, taking into account its biological functions, with the possibility of providing mechanical support, controlling the processes of differentiation and proliferation to etok implemented with the possibility of maximum copy matrix of micro- and nanostructures bone Haversian canal system and gaps, as well as their connecting channels
В отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов выполнены содержащими следующее. Во-первых, массив продольных углублений для формирования гаверсовых каналов. Во-вторых, массив локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях. В-третьих, массив углублений, соединяющих продольные и локальные углубления - для соединения лакун с гаверсовыми каналами. В-четвертых, массив наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений. В-пятых, массив наноотверстий в локальных областях для улучшения адгезии клеток в указанных локальных областях и улучшения их дифференцировки и пролиферации. Приведенные массив продольных углублений для формирования гаверсовых каналов, массив локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, массив углублений, соединяющих продольные и локальные углубления - для соединения лакун с гаверсовыми каналами являются заготовками для получения в ткани, подлежащей формирования, в данном случае в костной ткани, системы гаверсовых каналов, лакун и сосудов.With respect to each of N two-dimensional matrices with N≥1, surface arrays of micro- and / or nano-objects are made containing the following. Firstly, an array of longitudinal recesses for the formation of haversian channels. Secondly, an array of local depressions located along the longitudinal depressions for the formation of lacunae in orthogonal directions to each other. Thirdly, an array of recesses connecting longitudinal and local recesses - for connecting lacunae with haversian channels. Fourth, an array of nanochannels located over the entire surface of the polymer film at an angle relative to the longitudinal recesses. Fifth, an array of nanoholes in local areas to improve cell adhesion in these local areas and to improve their differentiation and proliferation. The given array of longitudinal recesses for forming haversian channels, an array of local recesses located along longitudinal recesses, for forming gaps in orthogonal to each other, an array of recesses connecting longitudinal and local recesses - for connecting lacunae with haversian channels are blanks for receiving into the fabric to be the formation, in this case in the bone tissue, of the Haversian canal system, lacunae and blood vessels.
Продольные углубления, представляющие собой заготовки для формирования гаверсовых каналов, выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера. Их ширина и глубина по величине выбрана, превосходящей размеры клеток и достаточной для формирования структурной единицы костной ткани.Longitudinal recesses, which are blanks for the formation of haversian channels, are made lengthwise over the entire surface of the polymer film. Their width and depth are selected to be larger in size than the size of the cells and sufficient for the formation of a structural unit of bone tissue.
В частном случае реализации матрицы для регенерации костной ткани она характеризуется следующими геометрическими параметрами. Продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, а шириной и глубиной от 14 до 25 мкм включительно. Период их расположения составляет от 200 до 400 мкм включительно. Локальные углубления для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, расположенные вдоль продольных углублений, по обе стороны, выполнены размером около 6 мкм × 6 мкм ×16 мкм. Углубления, соединяющие продольные и локальные углубления - соединения заготовок для формирования лакун и заготовок для гаверсовых каналов, выполнены размером около 1 мкм × 2 мкм. Наноканалы, расположенные по всей поверхности пленки полимера под углом 45 градусов относительно продольных углублений, выполнены глубиной от 100 до 180 нм включительно, шириной около 120 нм, периодом от 200 до 400 нм включительно. Наноотверстия для улучшения адгезии выполнены диаметром от 10 до 30 нм, средней поверхностной плотностью 100000000 мм-2.In the particular case of the implementation of the matrix for bone tissue regeneration, it is characterized by the following geometric parameters. Longitudinal recesses for the formation of haversian channels are made lengthwise over the entire surface of the polymer film, and a width and depth of 14 to 25 microns inclusive. The period of their location is from 200 to 400 microns inclusive. Local recesses for forming gaps in orthogonal to each other directions, located along the longitudinal recesses, on both sides, are made about 6 μm × 6 μm × 16 μm in size. The recesses connecting the longitudinal and local recesses - the connection of the blanks for the formation of lacunae and blanks for havers channels, are made about 1 μm × 2 μm in size. Nanochannels located over the entire surface of the polymer film at an angle of 45 degrees relative to the longitudinal recesses are made with a depth of 100 to 180 nm inclusive, a width of about 120 nm, and a period of 200 to 400 nm inclusive. Nanoholes for improving adhesion are made with a diameter of 10 to 30 nm, an average surface density of 100,000,000 mm -2 .
В другом частном случае реализации матрицы в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы нанообъектов, выполнены в составе наноканалов, или ноноотверстий, или наношипов, или в сочетании указанных нанообъектов. Периодичность расположения их согласована с размерами молекул адгезии или центров адгезии. Период составляет от 100 до 420 нм включительно.In another particular case of the implementation of the matrix for each of N two-dimensional matrices with N≥1, the surface arrays of nanoobjects are made up of nanochannels, or non-holes, or nano-spikes, or in a combination of these nanoobjects. The frequency of their arrangement is consistent with the size of the adhesion molecules or adhesion centers. The period is from 100 to 420 nm inclusive.
В качестве полимера использован полимер молочной кислоты или полимер молочной кислоты с сополимерами. Так, матрицы могут быть изготовлены с использованием следующих типов биорезорбируемого поли-L-лактида: «PURASORB PL 18», «PURASORB PL 38» и «PURASORB PL 65». Процесс изготовления двумерной матрицы заключается в отпечатывании пленок полилактида изготовленными структурно-формирующими штампами. Пленки поли-L-лактидов получают из их порошков. Толщина пленок, из которых формируют двумерные матрицы, составляет от 20 до 50 мкм.The polymer used is a lactic acid polymer or a lactic acid polymer with copolymers. Thus, matrices can be made using the following types of bioresorbable poly-L-lactide: “PURASORB PL 18”, “PURASORB PL 38” and “PURASORB PL 65”. The manufacturing process of a two-dimensional matrix consists in imprinting polylactide films with fabricated structural forming dies. Poly-L-lactide films are prepared from their powders. The thickness of the films from which two-dimensional matrices are formed is from 20 to 50 microns.
При сборке каркаса-носителя из N ориентированных друг относительно друга с возможностью фиксации двумерных матриц с N≥1, возможность фиксации реализована посредством геля на основе гиалуроновой кислоты с содержанием последней от 1 до 2% включительно. Также для фиксации может быть использован фибриновый клей.When assembling the carrier frame from N oriented relative to each other with the possibility of fixing two-dimensional matrices with N≥1, the possibility of fixing is realized by means of a gel based on hyaluronic acid with a content of the latter from 1 to 2% inclusive. Also for fixation can be used fibrin glue.
Биорезорбируемая полимерная клеточная матрица используется следующим образом. Рассмотрим пример костной ткани.Bioresorbable polymer cell matrix is used as follows. Consider an example of bone tissue.
Использование бирезорбируемой полимерной клеточной матрицы для замещения обширных дефектов трубчатых костей включает следующие этапы.The use of a bioresorbable polymeric cell matrix to replace extensive defects of the tubular bones includes the following steps.
Получение мезенхимальных стволовых клеток из костномозговых предшественников.Obtaining mesenchymal stem cells from bone marrow precursors.
Экспансия костномозговых мезенхимальных стволовых клеток в культуре.Expansion of bone marrow mesenchymal stem cells in culture.
Осуществление направленной дифференцировки в остеогенез.Implementation of directed differentiation into osteogenesis.
Заселение тканеинженерного эквивалента костной ткани мезенхимальными стволовыми клетками.The population of tissue-engineering equivalent bone tissue with mesenchymal stem cells.
Формирование послойного свитка из тканеинженерного эквивалента костной ткани.The formation of a layered scroll of tissue engineering equivalent bone tissue.
Имплантация в область дефекта.Implantation in the area of the defect.
После формирования N двумерных матриц с N≥1 из поликлатида проводят заселение клеток для тканевой инженерии при температуре 36,5°C, используя в качестве насаживаемых мезенхимальные стволовые клетки,CO2-инкубатор и культуральную среду ДМЕМ. После заселения клеток в матрицы, их распространения, миграции проводят сборку матриц, ориентируя их друг относительно друга и осуществляя фиксацию в стопку. Далее в условиях, поддерживающих рост и остеогенез клеточной популяции, осуществляют формирование ткани.After the formation of N two-dimensional matrices with N≥1 from polyclatide, tissue engineering cells are colonized at a temperature of 36.5 ° C, using mesenchymal stem cells, a CO 2 incubator, and a DMEM culture medium as implanted cells. After the cells are populated into the matrices, their distribution, migration, the matrices are assembled, orienting them relative to each other and fixing into a stack. Further, under conditions that support the growth and osteogenesis of the cell population, tissue formation is performed.
Адгезивный потенциал предлагаемой матрицы существенно превышает потенциал контрольного образца, в качестве которого использована пленка из поли-L-лактида с гладкой (без какого-либо рельефа) поверхностью. Так, регистрируется более чем пяти- и двенадцатикратное превосходство по степени адгезии по сравнению с контрольным образцом для популяций клеток МНФ (мононуклеарная фракция клеток) и МСК (мезенхимальные стволовые клетки костномозгового происхождения), соответственно.The adhesive potential of the proposed matrix significantly exceeds the potential of the control sample, which is used as a film of poly-L-lactide with a smooth (without any relief) surface. Thus, more than five and twelvefold superiority in adhesion is recorded compared to the control sample for populations of MNF cells (mononuclear fraction of cells) and MSCs (mesenchymal stem cells of bone marrow origin), respectively.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013142296/15A RU2563621C2 (en) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | Bioresorbable polymer cell matrix |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013142296/15A RU2563621C2 (en) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | Bioresorbable polymer cell matrix |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013142296A RU2013142296A (en) | 2015-04-27 |
| RU2563621C2 true RU2563621C2 (en) | 2015-09-20 |
Family
ID=53282852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013142296/15A RU2563621C2 (en) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | Bioresorbable polymer cell matrix |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2563621C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2622009C1 (en) * | 2015-12-25 | 2017-06-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физики полупроводников им. А.В. Ржанова Сибирского отделения Российской академии наук (ИФП СО РАН) | Method for biooresorable polymer cell matrix formation for tissue regeneration |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996028117A1 (en) * | 1995-03-13 | 1996-09-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Biodegradable implant for fracture nonunions |
| US6143293A (en) * | 1998-03-26 | 2000-11-07 | Carnegie Mellon | Assembled scaffolds for three dimensional cell culturing and tissue generation |
| WO2002053193A2 (en) * | 2001-01-02 | 2002-07-11 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Tissue engineering of three-dimensional vascularized using microfabricated polymer assembly technology |
| RU2217171C2 (en) * | 1997-10-10 | 2003-11-27 | Эд Гейштлих Зёне Аг Фюр Хемише Индустрие | Membrane usable in controlled tissue regeneration |
| US20050276791A1 (en) * | 2004-02-20 | 2005-12-15 | The Ohio State University | Multi-layer polymer scaffolds |
| WO2006099176A2 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | 3-d interconnected multi-layer microstructure of thermoplastic materials |
| US7842097B2 (en) * | 1995-10-16 | 2010-11-30 | Depuy Spine, Inc. | Tissue repair matrix |
| WO2011102991A1 (en) * | 2010-02-22 | 2011-08-25 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of generating engineered innervated tissue and uses thereof |
-
2013
- 2013-09-16 RU RU2013142296/15A patent/RU2563621C2/en active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996028117A1 (en) * | 1995-03-13 | 1996-09-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Biodegradable implant for fracture nonunions |
| US7842097B2 (en) * | 1995-10-16 | 2010-11-30 | Depuy Spine, Inc. | Tissue repair matrix |
| RU2217171C2 (en) * | 1997-10-10 | 2003-11-27 | Эд Гейштлих Зёне Аг Фюр Хемише Индустрие | Membrane usable in controlled tissue regeneration |
| US6143293A (en) * | 1998-03-26 | 2000-11-07 | Carnegie Mellon | Assembled scaffolds for three dimensional cell culturing and tissue generation |
| WO2002053193A2 (en) * | 2001-01-02 | 2002-07-11 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Tissue engineering of three-dimensional vascularized using microfabricated polymer assembly technology |
| US20050276791A1 (en) * | 2004-02-20 | 2005-12-15 | The Ohio State University | Multi-layer polymer scaffolds |
| WO2006099176A2 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | 3-d interconnected multi-layer microstructure of thermoplastic materials |
| WO2011102991A1 (en) * | 2010-02-22 | 2011-08-25 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of generating engineered innervated tissue and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Л.В. ТКАЛИЧ и др., "Физические основы наноэлектроники", учебное пособие, Санкт-Петербург, 2011[on-line] [Найден 26.01.2015] найдено в Интернет на <URL: fictionbook.ru/pages/download_prew/?file=8265529>. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013142296A (en) | 2015-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10238496B2 (en) | Bone regeneration using biodegradable polymeric nanocomposite materials and applications of the same | |
| JP7187453B2 (en) | articular cartilage repair | |
| Limongi et al. | Fabrication and applications of micro/nanostructured devices for tissue engineering | |
| Cheng et al. | 3D printing of micro-and nanoscale bone substitutes: a review on technical and translational perspectives | |
| Nuernberger et al. | The influence of scaffold architecture on chondrocyte distribution and behavior in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts | |
| US20050276791A1 (en) | Multi-layer polymer scaffolds | |
| Seunarine et al. | 3D polymer scaffolds for tissue engineering | |
| DE10312144B4 (en) | Carrier material for tissue and cell culture and the production of implant materials | |
| Abdollahiyan et al. | Nanotechnology, and scaffold implantation for the effective repair of injured organs: An overview on hard tissue engineering | |
| US8936805B2 (en) | Bone regeneration using biodegradable polymeric nanocomposite materials and applications of the same | |
| US11306406B2 (en) | Electrochemical processing of materials, methods and production | |
| Su et al. | Biomimetic 3D hydroxyapatite architectures with interconnected pores based on electrospun biaxially orientated PCL nanofibers | |
| CN101032430A (en) | Method for preparing integrated frame fabrication of cartilage of tissue-engineered bone having function interface | |
| CN101528822A (en) | Porous polymeric articles | |
| Mansouri | The influence of topography on tissue engineering perspective | |
| EP3203935B1 (en) | Bone regeneration using biodegradable polymeric nanocomposite materials and applications of the same | |
| Li et al. | Fabrication of patterned multi-walled poly-l-lactic acid conduits for nerve regeneration | |
| Lee | 3D nanoprinting technologies for tissue engineering applications | |
| Ravoor et al. | Comprehensive review on design and manufacturing of bio-scaffolds for bone reconstruction | |
| Gittard et al. | Two-photon polymerization microstructuring in regenerative medicine | |
| RU2563621C2 (en) | Bioresorbable polymer cell matrix | |
| Giavaresi et al. | In vitro and in vivo response to nanotopographically-modified surfaces of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and polycaprolactone | |
| Yadegari et al. | Specific considerations in scaffold design for oral tissue engineering | |
| EP0772425A1 (en) | Membrane for regenerating body tissues and use of said membrane as a wound covering and substitute skin | |
| KR20190012786A (en) | Cell culture scaffold for tissue regeneration and kit including the same |