RU2548804C1 - ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ - Google Patents
ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2548804C1 RU2548804C1 RU2013157926/10A RU2013157926A RU2548804C1 RU 2548804 C1 RU2548804 C1 RU 2548804C1 RU 2013157926/10 A RU2013157926/10 A RU 2013157926/10A RU 2013157926 A RU2013157926 A RU 2013157926A RU 2548804 C1 RU2548804 C1 RU 2548804C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- wratislaviensis
- pcb
- pcbs
- congeners
- Prior art date
Links
- 241000168435 Rhodococcus wratislaviensis Species 0.000 title claims abstract description 32
- 150000003071 polychlorinated biphenyls Chemical class 0.000 title claims abstract description 29
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 26
- 239000000039 congener Substances 0.000 abstract description 23
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract description 19
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 abstract description 13
- 150000004074 biphenyls Chemical class 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 abstract 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 19
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 5
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- AGCPZMJBXSCWQY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,3,4-pentachlorobutane Chemical compound ClCC(Cl)C(Cl)C(Cl)Cl AGCPZMJBXSCWQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 4
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 4
- IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzoic acid Chemical class OC(=O)C1=CC=CC=C1Cl IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150049492 DVR gene Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 3
- MINPZZUPSSVGJN-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,4,4,4-hexachlorobutane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)CCC(Cl)(Cl)Cl MINPZZUPSSVGJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M Chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100084627 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pcb-4 gene Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000005165 hydroxybenzoic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 150000005206 1,2-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- BZTYNSQSZHARAZ-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichloro-1-(4-chlorophenyl)benzene Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl BZTYNSQSZHARAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical group CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N HMF acid Natural products OCC1=CC=C(C(O)=O)O1 PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012993 chemical processing Methods 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- -1 chlorobiphenyl-2-hydroxy-6-oxo- (chlorophenyl) hexa-2,4-dienoic acid Chemical compound 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Substances CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- SWHAQEYMVUEVNF-UHFFFAOYSA-N magnesium potassium Chemical class [Mg].[K] SWHAQEYMVUEVNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 обладает деструктивной активностью в отношении группы стойких токсичных хлорароматических соединений - полихлорированных бифенилов (ПХБ). Штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ас-2623D и может быть использован для разложения моно-, ди- и трихлорированных конгенеров, орто-, мета- и паразамещенных бифенилов, а также промышленной смеси ПХБ. 4 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый аэробный штамм бактерий, способный эффективно разлагать стойкие токсичные соединения - полихлорированные бифенилы (ПХБ), в том числе в условиях засоления.
Данные вещества включены в группу Стойких Органических Загрязнителей (СОЗ) [Стокгольмская конвенция, ФЗ-РФ №164 «О ратификации Стокгольмсокй конвенции…»] и подлежат полному уничтожению. Однако при реализации положений конвенции возникает проблема уничтожения соединений группы СОЗ, так как за длительный период производства и применения накоплены сотни тонн данных веществ, значительная часть которых попала в окружающую среду [Трегер Ю.А. Стойкие органические загрязнители. Проблемы и пути их решения // Вестник МИТХТ, 2011, т.6, №5].
Известен ряд способов термической и химической переработки ПХБ, однако эти способы являются высокозатратными и могут приводить к образованию более токсичных соединений - диоксинов [Полихлорбифенилы: Проблемы экологии, анализа и химической утилизации / отв. Ред. В.Н. Чарушин. - М.: КРАСАНД; Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - 400 с.].
Наиболее экологически безопасным способом утилизации полихлорированных бифенилов (ПХБ) является их биологическая деструкция с использованием бактерий [Васильева Г.К., Стрижакова Е.П. Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными бифенилами // Микробиология. 2007. Т.76. №6. С.725-741. и Beyer A., Biziuk М. Environmental fate and global distribution of polychlorinated biphenyls // Rev. Environ. Contamin. Toxic. 2009. V.201. P.137-158]. Известно, что в промышленных масштабах выпускались коммерческие смеси ПХБ, содержащие от 20 до 60 конгенеров с разной степенью хлорирования. Поэтому наибольший интерес представляют штаммы, способные утилизировать коммерческие смеси ПХБ.
В патентной литературе имеются сведения о бактериальных штаммах родов Pseudomonas, Burkcholderia и Rhodococcus [Патент US №4999300 А, 12.03.91; Патент US №6537797 В1, 25.03.2003; Патент РФ №2262531 С2, 20.10.2005], осуществляющих полное разложение отдельных конгенеров моно- и дихлорированных бифенилов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому решению является «Штамм бактерий Rhodococcus ruber (ИЭГМ 896) - деструктор полихлорированных бифенилов» (Патент РФ №2262531 С2, 20.10.2005 г., МПК C12N 1/20; C02F 3/34).
Недостатками аналогов и прототипа является ограниченность эффективного разложения стойких токсичных соединений - в классе полихлорированных бифенилов (ПХБ), в том числе в условиях засоления почв.
Задачей создания изобретения является создание нового штамма - деструктора полихлорированных бифенилов, а также расширение арсенала средств для эффективного разложения стойких токсичных соединений - в классе полихлорированных бифенилов (ПХБ), в том числе в условиях засоления почв.
Поставленная задача решается с помощью Штамма Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ac-2623D - который является активным деструктором полихлорированных бифенилов.
Ниже приведен сопоставительный анализ эффективности предлагаемого Штамма по сравнению с прототипом.
Для штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 описан рост на трех конгенерах ПХБ (ПХБ1, ПХБ3, ПХБ8), наиболее «легких» для бактериального разложения и не содержащих заместителей в метаположении. О полной утилизации данных ПХБ судится по косвенным признакам: рост бактериальной культуры, способность штамма расти на продуктах разложения данных ПХБ, а именно на хлорбензойных кислотах.
Предлагаемый штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 разлагает более широкий спектр конгенеров ПХБ (26 конгенеров), в том числе содержащих более 2 заместителей в молекуле и/или заместителей в метаположении (табл.1, 2). Четко показано, что происходит убыль каждого конкретного конгенера ПХБ (количества указаны в соответствующей концентрации), установлены промежуточные соединения для 11 конгенеров, позволяющие утверждать, что разложение происходит без накопления токсичных продуктов.
Для штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 описана «острая» деструкция 7 конгенеров ПХБ, содержащих от 1 до 3 заместителей в орто- и/или параположении, и показаны 2 возможных промежуточных продукта. Нет сведений об изменении концентрации начальных конгенеров ПХБ, а также не указано, будут ли проявляться данные свойства штамма в отношении остальных конгенеров ПХБ (их всего 209, содержащих от 1 до 10 заместителей).
Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
Ниже показана убыль 11 конгенеров ПХБ, содержащих от 1 до 3 заместителей в орто-, мета-, параположениях при деструкции каждого конгенера индивидуально, установлены основные промежуточные соединения, подтверждающие, что разложение происходит без накопления токсичных продуктов. Кроме того, показана убыль 26 конгенеров ПХБ в составе коммерческой смеси «Совол», содержащих от 3 до 6 заместителей. Приведенные результаты демонстрируют более высокий деградативный потенциал штамма Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
В прототипе нет сведений о способности штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 разлагать коммерческие смеси ПХБ, содержащие конгенеры с количеством заместителей больше трех. Способность разлагать отдельные (моно-три)-хлорированные бифенилы не позволяет предполагать, что штамм проявит деградативные свойства в отношении коммерческих смесей ПХБ.
Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
Показана способность разлагать коммерческую смесь ПХБ марки «Совол». Деструкция составляет 93.8%.
По прототипу нет сведений о способности штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 разлагать коммерческие смеси ПХБ в почве, а также при повышенном уровне засоления среды.
Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
Показана способность разлагать коммерческую смесь ПХБ марки «Совол» в почве, а также при содержании хлорида натрия в концентрации 30 г/л. Данные свойства уникальны и ранее описаны не были.
Технический результат от предлагаемого решения - Штамм R. wratislaviensis КТ112-7 осуществляет разложение индивидуальных конгенеров ПХБ: монозамещенных на 96.7-96.9%, ди- и трихлорированных (заместители расположены в одном кольце молекулы в орто-, мета- или параположении) на 69.4-89.0%, дихлорированных с заместителями в каждом кольце в положениях орто- и/или пара- на 78.0-96.4%, трихлорированных (расположение заместителей два в одном кольце и один во втором кольце в орто- или параположении) на 67.0-88.9% за 24 часа и коммерческой смеси ПХБ торговой марки «Совол» на 93.8% за 5 суток.
Предлагаемый штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, обладающий способностью к деструкции широкого спектра токсичных веществ, выделен из отходов (техногенно-минеральных образований) производства калийно-магниевых солей ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) методом накопительного культивирования на среде Раймонда состава (г/л): NH4NO3 - 2.0, MgSO4×7Н2O - 0.2, К2НРO4 - 2.0, Na2HPO4 - 3.0, СаСl2×6Н2O - 0.01, Na2CO3 - 0.1, с добавлением ортофталевой кислоты - 1 г/л. Полученный штамм бактерий депонирован 07.05.2013 г. во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ac-2623D.
Характеристика предлагаемого штамма.
Аэроб. Хемоорганотроф. В состав клеточной стенки входят миколовые кислоты. Клетки грамположительные, неподвижные, не образуют спор, каталазоположительные. При развитии бактериальная культура характеризуется жизненным циклом кокк-палочка-кокк. Штамм растет при температуре 10-45°C с оптимумом роста 28°C.
На богатой агаризованной среде Раймонда (состав среды см. выше), содержащей (г/л): триптон - 5, дрожжевой экстракт - 2.5, NaCl - 10, агар - 1, образует непрозрачные округлые, матовые, светло-розовые колонии. Штамм способен к росту в диапазоне концентрации NaCl от 0 до 10% в среде культивирования. При росте на минеральной среде Раймонда не нуждается в дополнительных факторах роста. Использует в качестве источника углерода нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол, opтoфталевую кислоту, бензойную кислоту.
По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082T. На основании морфофизиологических и молекулярно-генетических признаков штамм идентифицирован как Rhodococcus wratislaviensis. Методом ВОХ-ПЦР [Versalovic J., Schneider М., de Bruijn F.J., Lupski J.R. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence based-polymerase chain reaction // Methods Cell. Mol. Biol. 1994. V.5. P.25-40] и последующей разгонки в агарозном геле получен набор фрагментов ДНК, характерный только для штамма R. wratislaviensis КТ112-7 (=ВКМ Ac-2623D). Изучение генома штамма показало наличие двух плазмид размером около 470 т.п.н. и 500 т.п.н. Штамм содержит гены «верхнего» пути разложения бифенила/ПХБ, а также гены, кодирующие ферменты деструкции бензойной и opтoфталевой кислот, а также хлоркатехола. Анализ показал, что штамм КТ112-7 по морфофизиологическим, биохимическим, генетическим характеристкам имеет существенные отличия от других представителей данного вида.
Преимуществом данного изобретения является способность штамма R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагать без накопления токсичных продуктов моно-, ди- и тризамещенные хлорбифенилы (ПХБ1, ПХБ2, ПХБ3, ПХБ8, ПХБ12, ПХБ15, ПХБ17, ПХБ28, ПХБ29, ПХБ30) и коммерческую смесь ПХБ торговой марки «Совол» как в качестве субстрата, так и в качестве загрязняющего вещества в почве. R. wratislaviensis КТ112-7 является галотолерантным штаммом, способным эффективно осуществлять разложение ПХБ (индивидуально и в составе коммерческой смеси) в условиях повышенной солености среды (30 г/л NaCl).
Данные свойства штамма описываются впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Ниже приведены примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Разложение конгенеров ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7
Деструкцию ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками». Штамм выращивали в жидкой среде Раймонда состава (г/л): NH4NO3 - 2.0, MgSO4×7Н2O - 0.2, К2НРO4 - 2,0, Na2HPO4 - 3.0, СаСl2×6Н2O - 0.01, Na2CO3 - 0.1, содержащей 30 г/л NaCl и бифенил (1 г/л) в качестве источника углерода и энергии при 28°C до ОП600=1.0. Отмытые дважды в среде Раймонда клетки (1 мл, ОП600=2.0) переносили во флаконы с тефлоновыми крышками.
В качестве субстрата вносили ацетоновый раствор хлорбифенилов до конечной концентрации: моноХБ - 94.25 мг/л, диХБ - 22.3 мг/л, триХБ - 12.5 мг/л (табл.1).
Для выделения хлорированных бифенилов культуральную жидкость экстрагировали смесью конц. Н2SO4 - 12.5%-ный додецил-сульфат-натрия (ДДС-Na)-гексан (1:10:25) в течение 60 мин при 30°C, скорость перемешивания 200 об/мин. Экстракты обезвоживали Na2SO4 и анализировали на газовом хроматографе GC6890N ("Agilent Technology", США) с масс-селективным детектором MSD5973N ("Agilent Technology", США).
Количественное содержание выделенных хлорбифенилов оценивали на основании сравнения величины полученных пиков и стандартных соединений.
Продукты деградации хлорбифенилов определяли спектрофотометрически и методом ВЭЖХ.
Для выделения и идентификации продуктов биодеструкции хлорированных бифенилов культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток методом центрифугирования (9660 g в течение 3 мин на центрифуге miniSpin ("Eppendorf", Германия)). Для дальнейших анализов использовали надосадочную жидкость.
Образование продуктов метарасщепления ароматического кольца хлорбифенилов-2-гидроксо-6-оксо-(хлорфенил)гекса-2,4-диеновые кислоты (ГОФДК) определяли методом спектроскопии на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini ("Shimadzu", Япония) при λмакс от 390 нм до 440 нм.
Наличие в надосадочной жидкости хлор- и гидрокси-бензойных кислот (ХБК, (ОН)БК), а также катехолов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе LC-20A ("Shimadzu", Япония) с колонкой Discovery С18 (150×4.6 мм) ("Supelco", "Sigma-Aldrich", США) и УФ-детектором при 205 нм. Анализ проводили в системе ацетонитрил - 0.1%-ый Н3РO4 (70:30). Идентификацию проводили с помощью сравнения времени удержания на колонке исследуемых и стандартных соединений. Количество образовавшихся продуктов оценивали по величине площади и высоты пиков на хроматограмме относительно данных величин стандартных соединений.
В результате проведенных исследований было установлено, что штамм R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагает конгенеры ПХБ, содержащие заместителей в одном из колец молекулы (табл.1). Уровень деструкции составил 69.0-96.9%. При этом эффективность разложения зависела не от положения заместителя (орто-, мета-, пара-), а от количества заместителей во втором кольце молекулы бифенила. Так, уровень деструкции монозамещенных ХБ (ПХБ1, ПХБ2, ПХБ3) составил 96.7-96.9%, а ди- и тризамещенных (ПХБ12, ПХБ29, ПХБ30) - 69.0-89.0%. Также показано, что образующиеся при этом хлорбензойные кислоты не являются конечным продуктом (табл.1), а разлагаются через стадию образования гидрокси-производных ((ОН)БК) до соединений основного обмена.
Анализ деградационной активности по отношению к дихлорированным бифенилам, содержащим по одному заместителю в каждом кольце в орто- и/или параположении (ПХБ4, ПХБ8, ПХБ15), а также по отношению к трихлорированным бифенилам, у которых в одном из колец также располагается один заместитель в орто- или параположении, показал, что штамм КТ112-7 предпочтительнее окисляет ортохлорированное кольцо молекулы ПХБ (табл.1). На эффективность деструкции, в случае если заместители располагаются в обоих кольцах молекулы, влияют оба фактора: и расположение заместителей, и их количество.
Таким образом, эффективность разложения ПХБ штаммом КТ112-7 изменяется в ряду не замещенное > ортозамещенное > паразамещенное кольцо и моноХБ > диХБ ≥ триХБ.
| Таблица 1. | |||||||
| Разложение отдельных конгенеров ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 | |||||||
| Промежуточные продукты | |||||||
| ГОФДК | |||||||
| № ПХБ (по IUPAK) | Положение заместителей в молекуле | Время, ч | ПХБ, мг/л | Длина волнымакс,н.м. | ОП, о.е. | Хлорбензойные кислоты, мкг/л | Гидрокси-бензойные кислоты, мкг/л |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| ПХБ1 | 2-(орто-) | 0 | 94.25 | - | - | - | - |
| 2 | 20.6 | 390 | 0.268 | - | - | ||
| 24 | 3.0 | 390 | 0.247 | - | - | ||
| ПХБ2 | 3-(мета-) | 0 | 94.25 | - | - | - | - |
| 2 | 26.2 | 392 | 0.401 | - | - | ||
| 24 | 2.9 | 392 | 0.235 | - | - | ||
| ПХБ3 | 4-(пара-) | 0 | 94.25 | - | - | - | - |
| 2 | 41.7 | 416 | 0.196 | 18.7 | 25.9 | ||
| 24 | 3.1 | 416 | 0.291 | 23.0 | 19.2 | ||
| ПХБ12 | 3,4- | 0 | 22.3 | - | - | - | - |
| 2 | 7.68 | 390 | 0.372 | 5.51 | 0.48 | ||
| 24 | 5.57 | 390 | 0.235 | 0.53 | 0.19 | ||
| Продолжение табл.1 | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| ПХБ29 | 2,4,5- | 0 | 12.5 | - | - | - | - |
| 2 | - | 394 | 0.652 | 7.9 | - | ||
| 24 | 1.37 | 394 | 0.292 | 4.8 | - | ||
| ПХБ30 | 2,4,6- | 0 | 12.5 | - | - | - | |
| 2 | - | 449 | 0.249 | - | - | ||
| 24 | 3.87 | 449 | 0.297 | - | - | ||
| ПХБ4 | 2,2′- | 0 | 22.3 | - | - | - | - |
| 2 | 1.42 | 394 | 0.962 | 86.8 | - | ||
| 24 | 0.81 | 394 | 0.761 | 12.3 | - | ||
| ПХБ8 | 2,4′- | 0 | 22.3 | - | - | - | - |
| 2 | 15.4 | 390 | 0.246 | 1.2 | 2.5 | ||
| 24 | 2.2 | 390 | 0.245 | 0.7 | 0.6 | ||
| ПХБ15 | 4,4′- | 0 | 22.3 | - | - | - | - |
| 2 | 11.6 | 428 | 0.274 | 3.2 | 0.5 | ||
| 24 | 4.9 | 428 | 0.508 | 0.3 | 0.3 | ||
| ПХБ17 | 2,4,2′- | 0 | 12.5 | - | - | - | - |
| 2 | 6.25 | 449 | 0.277 | 3.8 | - | ||
| 24 | 1.38 | 449 | 0.209 | 2.4 | - | ||
| ПХБ28 | 2,4,4′- | 0 | 12.5 | - | - | - | - |
| 2 | - | 392 | 0.067 | 0.2 | 4.7 | ||
| 24 | 4.12 | 392 | 0.271 | 0.1 | 2.7 | ||
| «- » - вещества не определены | |||||||
Пример 2. Разложение штаммом Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 коммерческой смеси ПХБ торговой марки «Совол»
Деструкцию смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками» по схеме, описанной в примере 1.
В эксперименте использовали коммерческую смесь ПХБ марки «Совол» (ГСО №7821-2000), основной состав которой представлен тетра- (22%), пента- (53%) и гекса- (23%) замещенными конгенерами. «Совол» вносили в виде ацетонового раствора до конечной концентрации 0.8 г/л.
Экстракцию и анализ ПХБ, анализ возможных метаболитов проводили как описано в примере 1.
В результате проведенных исследований установлено, что штамм R. wratislaviensis КТ 112-7 эффективно разлагает коммерческую смесь ПХБ марки «Совол». За 5 суток концентрация «Совола» снизилась на 93.8%, при этом отмечена деградационная активность ко всем представленным в смеси конгенерам (таблица 2).
| Таблица 2. | |||||
| Разложение смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 | |||||
| № пика | № ПХБ по классификации IUPAK | Площадь пика | % деструкции | ||
| 1 сут. | 3 сут. | 5 сут. | |||
| 1 | 28 | 23521 | 8740 | 3812 | 83,8 |
| 2 | 52 | 8142 | 2391 | 1019 | 87,5 |
| 3 | 49 | 2476 | 0 | 0 | 100,0 |
| 4 | 44 | 10954 | 3706 | 1553 | 85,8 |
| 5 | 41\64 | 6132 | 2205 | 865 | 85,9 |
| 6 | 74 | 7139 | 2902 | 1087 | 84,8 |
| 7 | 70 | 21149 | 8209 | 3371 | 84,1 |
| 8 | 66\95 | 34511 | 12668 | 5279 | 84,7 |
| 9 | 91 | 5986 | 2475 | 1019 | 83,0 |
| 10 | 60\56 | 8942 | 2980 | 1137 | 87,3 |
| 11 | 84\101 | 45555 | 15421 | 6321 | 86,1 |
| 12 | 99 | 29093 | 9531 | 3866 | 86,7 |
| 13 | 97 | 12424 | 4046 | 1681 | 86,5 |
| 14 | 87 | 12685 | 6934 | 2837 | 77,6 |
| 15 | 85 | 45049 | 4267 | 1729 | 96,2 |
| 16 | 110 | 6324 | 15500 | 6247 | 1,2 |
| 17 | 82 | 3152 | 2427 | 423 | 86,6 |
| 18 | 119 | 2229 | 0 | 0 | 100,0 |
| 19 | 118 | 33262 | 0 | 0 | 100,0 |
| 20 | 153 | 1904 | 1773 | 641 | 66,3 |
| 21 | 105 | 17875 | 5613 | 2205 | 87,7 |
| 22 | 138 | 25900 | 9267 | 3347 | 87,1 |
| 23 | 128 | 7725 | 0 | 0 | 100,0 |
| 24 | 156 | 2487 | 1060 | 100,0 | |
| 25 | 180 | 29789 | 9700 | 3734 | 87,5 |
| 26 | 170 | 6472 | 2090 | 674 | 89,6 |
| Общий % деструкции смеси «Совол» | 51,3 | 84,2 | 93,8 | ||
При этом, как и в случае разложения индивидуальных конгенеров, происходит снижение концентрации образовавшихся метаболитов (табл.3).
| Таблица 3. | |||||
| Разложение смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 при разных концентрациях хлорида натрия в среде | |||||
| NaCl, г/л | Время деструкции, сут. | Совол, г/л | Промежуточные соединения | ||
| ГОФДК, ОП452 | ХБК, мг/л | (ОН)БК, мг/л | |||
| 0 | 0 | 0.8 | - | - | - |
| 1 | 0.39 | 0.145 | 25.1 | 46.2 | |
| 3 | 0.13 | 0.100 | 21.8 | 35.4 | |
| 5 | 0.05 | 0.091 | 20.4 | 31.9 | |
| 30 | 0 | 0.8 | - | - | - |
| 1 | 0.41 | 0.288 | 31.5 | 45.4 | |
| 3 | 0.12 | 0.259 | 28.4 | 25.4 | |
| 5 | 0.03 | 0.180 | 12.5 | 11.1 | |
| «-» - вещества не определены | |||||
Динамика изменения концентрации метаболитов свидетельствует об их утилизации штаммом R. wratislaviensis КТ112-7. Разложение метаболитов происходит до соединений основного обмена клетки, при этом повышение осмолярности среды не оказывает негативного влияния на данный процесс.
Пример 3. Разложение ПХБ в почве штаммом R. wratislaviensis КТ112-7
Для разложения ПХБ, содержащихся в почве, штамм R. wratislaviensis КТ112-7 вносили в почву, содержащую ПХБ (марка «Совол»), отобранную с промышленной площадки г. Чапаевск Самарской области из расчета 106 и 107 клеток на грамм. Бактерии выращивали на среде Раймонда состава (г/л): NH4NO3 - 2,0, MgSO4×7Н2O - 0,2, К2НРO4 - 2,0, Na2HPO4 - 3,0, СаСl2×6Н2O - 0,01, Na2CO3 - 0,1, бифенил - 1,0. Через 3 месяца оценивали содержание ПХБ в почве с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 6890N (Agilent Technology, США).
Через 3 месяца обработка загрязненной почвы бактериями R. wratislaviensis КТ112-7 привела к значительной убыли ПХБ (табл.4). Снижение концентрации ПХБ в загрязненной почве с внесенными бактериями относительно почвы без обработки составило в варианте с внесением 106 кл/г почвы в 4,2 раза, а в варианте с внесением 107 кл/г почвы в 4,1 раза.
| Таблица 4. | |||
| Концентрация смеси ПХБ «Совол» в почве после ее обработки бактериальным штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 | |||
| Соединение | Количество бактерий штамма КТ112-7, внесенных в почву, количество кл/г почвы | ||
| 0 | 106 | 107 | |
| смесь ПХБ, мг/кг | 0,997 | 0,235 | 0,241 |
Таким образом, штамм R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагает моно-, ди- и трихлорированные конгенеры орто-, мета- и паразамещенных бифенилов, а также промышленную смесь ПХБ марки «Совол» как в виде единственного источника углерода, так и в виде загрязнителя в почве.
Claims (1)
- Штамм Rhodococcus wratislaviensis, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ Ac-2623D - активный деструктор полихлорированных бифенилов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013157926/10A RU2548804C1 (ru) | 2013-12-25 | 2013-12-25 | ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013157926/10A RU2548804C1 (ru) | 2013-12-25 | 2013-12-25 | ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2548804C1 true RU2548804C1 (ru) | 2015-04-20 |
Family
ID=53289498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013157926/10A RU2548804C1 (ru) | 2013-12-25 | 2013-12-25 | ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2548804C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2262531C2 (ru) * | 2003-12-02 | 2005-10-20 | Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН | Штамм бактерий rhodococcus ruber - деструктор полихлорированных бифенилов |
| RU2410170C2 (ru) * | 2008-12-29 | 2011-01-27 | Вячеслав Иванович Быков | Способ очистки загрязненного грунта |
-
2013
- 2013-12-25 RU RU2013157926/10A patent/RU2548804C1/ru active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2262531C2 (ru) * | 2003-12-02 | 2005-10-20 | Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН | Штамм бактерий rhodococcus ruber - деструктор полихлорированных бифенилов |
| RU2410170C2 (ru) * | 2008-12-29 | 2011-01-27 | Вячеслав Иванович Быков | Способ очистки загрязненного грунта |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЕГОРОВА Д.О. и др., Новые галотолерантные штаммы " деструкторы бифенила рода Rhodococcus, Вестник Пермского Университета, Серия биология, 2010, вып1 (1), стр. 50-54 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Biodegradation of sulfonamide antibiotics in sludge | |
| Lin et al. | Oxidative dehalogenation and mineralization of polychlorinated biphenyls by a resuscitated strain Streptococcus sp. SPC0 | |
| Zhang et al. | Aerobic degradation of bisphenol A by Achromobacter xylosoxidans strain B-16 isolated from compost leachate of municipal solid waste | |
| Kim et al. | Triclosan susceptibility and co-metabolism–a comparison for three aerobic pollutant-degrading bacteria | |
| Del Rio et al. | Degradation of naphthenic acids by sediment micro‐organisms | |
| Li et al. | Waste water produced from an oilfield and continuous treatment with an oil-degrading bacterium | |
| Lin et al. | Biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas sp. BZ-3, isolated from crude oil contaminated soil | |
| Sirajuddin et al. | A comparative study on degradation of complex malathion organophosphate using of Escherichia coli IES-02 and a novel carboxylesterase | |
| Xu et al. | Mechanisms of the enhanced DDT removal from soils by earthworms: identification of DDT degraders in drilosphere and non-drilosphere matrices | |
| Deng et al. | Biodegradation of pyrene by a novel strain of Castellaniella sp. under denitrifying condition | |
| Hatamian-Zarmi et al. | Extensive biodegradation of highly chlorinated biphenyl and Aroclor 1242 by Pseudomonas aeruginosa TMU56 isolated from contaminated soils | |
| Verma et al. | Endosulfan degradation by a Rhodococcus strain isolated from earthworm gut | |
| Ma et al. | Characterization of an efficient chloramphenicol-mineralizing bacterial consortium | |
| Hoskeri et al. | Biodegradation of chloroaromatic pollutants by bacterial consortium immobilized in polyurethene foam and other matrices | |
| Singh et al. | Carbazole degradation and biosurfactant production by newly isolated Pseudomonas sp. strain GBS. 5 | |
| Lu et al. | Effects and mechanisms of phytoalexins on the removal of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by an endophytic bacterium isolated from ryegrass | |
| Miller et al. | Identification of wastewater bacteria involved in the degradation of triclocarban and its non-chlorinated congener | |
| Dobslaw et al. | Degradation of 2-chlorotoluene by Rhodococcus sp. OCT 10 | |
| Cai et al. | Degradation of piperazine by Paracoccus sp. TOH isolated from activated sludge | |
| Ceyhan | Biodegradation of pyrene by a newly isolated Proteus vulgaris | |
| Nowak et al. | Changes in fatty acid composition of Stenotrophomonas maltophilia KB2 during co-metabolic degradation of monochlorophenols | |
| Gautom et al. | Optimized approach for naphthalene wastewater biodegradation by Enterobacter ludwigii NS12 isolated from petroleum industry sludge: Bioreactor study and kinetic investigation | |
| Duc et al. | Thiobencarb Degradation by Pseudomonas sp. Th1 and Cupriavidus oxalaticus Th2 Isolated from Soil: HD Duc et al. | |
| Roy et al. | Exploring the potential of Meyerozyma caribbica and its combined application with bacteria for lindane bioremediation | |
| Pannu et al. | Characterization of bacteria capable of degrading lindane (γ-hexachlorocyclohexane) and study the dynamics of biodegradation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191226 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20210401 |