RU2518306C1

RU2518306C1 - Способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов

Info

Publication number: RU2518306C1
Application number: RU2012153849/10A
Authority: RU
Inventors: Ольга Николаевна Понаморева; Ирина Федоровна Чепкова; Максим Александрович Ануфриев; Валерий Анатольевич Алферов; Валентина Алексеевна Щеглова; Елена Петровна Иванова
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-06-10
Also published as: RU2012153849A

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов. Способ включает использование биосенсора на основе кислородного электрода, иммобилизацию целых клеток бактерий E.coli K-12 на поверхность кислородного электрода. Иммобилизацию осуществляют с помощью полупроницаемой мембраны. После иммобилизации измеряют дыхательную активность микроорганизмов в присутствии пробы и стандартных образцов положительного и отрицательного контроля. Далее рассчитывают индекс токсичности и оценивают токсичность пробы по величине индекса токсичности. Техническим результатом изобретения является упрощение оценки токсичности и улучшение достоверности результатов санитарно-гигиенической экспертизы. 2фиг., 1 табл., 3 пр.

Description

Техническое решение относится к области экологической и
промышленной (профилактической) токсикологии, а именно, к
аналитическому определению токсичности с применением биосенсора.
Изобретение может быть использовано для быстрой оценки индекса
токсичности образцов материалов, изделий и упаковок, включая полимеры и
полимерсодержашие материалы и изделия, а также товары для детей,
изготовленных из полимерных и текстильных материалов, материалов,
контактирующих с пищевыми продуктами (за исключением - целлюлозно-
бумажной продукции).

Известен способ токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий
и объектов окружающей среды, основанный на применении спермы крупного
рогатого скота (КРС) (Биотестирование продукции из полимерных и других
материалов.: Методические указания. - М.: Информационно-издательский
центр Госкомсанэпиднадзора России, 1996. -11 с.). Тест-объектом является КРС,
а тест-реакцией - двигательная активность КСР. Оценка токсичности
производится с применением анализатора токсичности АТ-05, принцип работы
которого основан на анализе микроскопических видеоизображений суспензии
сперматозоидов.

Известен способ определения токсичности полимеров, материалов и
изделий с помощью, основанный на способности специфических
микроорганизмов изменять интенсивность спонтанной биолюминесценции при
наличии в анализируемых пробах токсических веществ различной химической
природы (MP 01.018-07 Методика определения токсичности химических
веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста "Эколюм", MP
от 15.06.2007 N 01.018-07), что регистрирует прибор экологического
(токсикологического) контроля «БИОТОКС».

Оба способа совместно с устройствами позволяет определять острую токсичность. Недостатками этих способов оценки токсичности являются ложноположительные или ложноотрицательные результаты биотестирования, вызванные как специфической реакцией тест-объекта на воздействие токсикантов, так и другими факторами внешней среды. Вследствие этого предпочтительно комплексное использование нескольких биотестов, взаимно дополняющих друг друга по чувствительности к различным группам веществ. Рекомендуется проводить одновременное применение нескольких систем биотестирования, использующих разные жизненные функции (тест-реакции) тест-организмов. Применение дыхательной активности микроорганизмов в качестве тест-реакции на присутствие токсикантов в комбинации с оксиметрами позволяет расширить возможности применения биотестирования.

Наиболее близкими по своим признакам способ и устройство для оценки токсичности, принятыми за прототип являются способ экспресс-определения индекса токсичности с применением биосенсора, описанные в работе авторов изобретения: Чепкова И.Ф., Ануфриев М.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н., Щеглова В.А., Петрова С.Н. Применение биосенсора на основе иммобилизованных микроорганизмов для оценки токсичности продукции бытового назначения и товаров для детей. //Токсикологический вестник. 2010. V. 100, № 1, С. 34-40.

Способ оценки токсичности основан на регистрации дыхательной активности целых клеток микроорганизмов, иммобилизованных на поверхности кислородного электрода. Измерительная система для оценки токсичности состояла из гальванопотенциостата, кислородного электрода и биораспознающего элемента на основе иммобилизованных в агаровый гель целых клеток бактерий Escherichia coli К-12. К недостаткам прототипа относится следующее: 1) аналитический сигнал представлен значениями силы тока (нА), поэтому изменение дыхательной активности целых клеток микроорганизмов выражают как изменение силы тока во времени (нА/мин), а не изменение потребления кислорода (г O₂/дм³*мин), что затрудняет

интерпретацию результатов; 2) требуется время для адаптации микроорганизмов в течение суток после иммобилизации в агаровый гель (СКО более 7 %); 3) среднее время проведения единичного измерения с учетом троекратного промывания рецепторного элемента буферным раствором 10-15 мин; 4) неоднородность распределения целых клеток микроорганизмов в агаровом геле приводила к снижению воспроизводимости результатов; 5) стабильность биосенсора (при СКО не более 7%) - не более 14 дней; 6) отсутствие стандартного образца положительного контроля, что не позволяет контролировать качество биосенсорного анализа; 7) отсутствие четкого критерия оценки токсичности.

Задачей предлагаемого технического решения является упрощение способа оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов и улучшение достоверности результатов санитарно-гигиенической экспертизы путем увеличения стабильности биораспознающего элемента биосенсора и сравнительной оценке дыхательной активности иммобилизованных микроорганизмов в присутствии анализируемых проб.

Способ оценки токсичности товаров из полимерных и текстильных материалов, заключающийся в том, что используют биосенсор на основе кислородного электрода, иммобилизуют целые клетки микроорганизмов на поверхность кислородного электрода, измеряют дыхательную активность микроорганизмов в присутствии пробы, оценивают токсичность проб, причем иммобилизуют целые клетки бактерий E.coli К-12 на поверхность кислородного электрода с помощью полупроницаемой мембраны, измеряют дыхательную активность с помощью термооксиметра, дополнительно используют стандартные образцы положительного и отрицательного контроля, рассчитывают индекс токсичности по следующей формуле:

Т = (Rпроб - Rотр) / (Rпол - Roтp),

где Т - индекс токсичности,

Rпроб - ответ биосенсора на образец анализируемой пробы, О₂мкг/дм³*с;

Rпол - ответ биосенсора на образец положительного контроля, O₂мкг/дм³*с;

Rотр - ответ биосенсора на образец отрицательного контроля, O₂мкг/дм³*с,

и оценивают токсичность пробы по величине индекса токсичности (Т):

Индекс токсичности (Т)	Степень токсичности образца
менее 1.0	нетоксичен
1.0-10.0	токсичен
более 10.0	сильнотоксичен

Предложенный способ оценки токсичности характеризуется простотой, быстрым временем анализа (выполняется за 10 минут), достоверностью результатов, а устройство для его реализации - длительным временем функционирования (не менее 30 дней) без потери активности микроорганизмов, иммобилизованных на поверхности кислородного электрода.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется рисунками и примерами. На фиг. 1 представлено предлагаемое устройство для оценки токсичности бытовой продукции. На фиг. 2 представлена последовательность действий для иммобилизации целых клеток микроорганизмов на кислородном электроде с помощью полупроницаемой мембраны и схема устройства кислородного электрода с иммобилизованными клетками микроорганизмов.

Предлагаемое устройство содержит магнитную мешалку 1, на которой расположена измерительная кювета 2 с буферным раствором 3, в которую помещен кислородный электрод 4 с иммобилизованными микроорганизмами 5, термооксиметр 6 соединен с кислородным электродом 4 и компьютером 7.

Кислородный электрод с иммобилизованными клетками микроорганизмов состоит из индикаторного электрода (платиновая проволока, запаянная в стекло) 8, электрода сравнения (серебряная проволока, покрытая хлоридом серебра) 9, корпуса электрода 10, газопроницаемой полиэтиленовой мембраны 11, суспензии клеток

микроорганизмов 12; полупроницаемой мембраны 13, фиксирующего кольца 14. На полиэтиленовую мембрану 11 наносят суспензию клеток микроорганизмов 12 объемом 10,0 мм³. Полупроницаемую мембрану 13 с порами размером 0,2 мкм помещают сверху и фиксируют кольцом 14, обрезают излишки мембраны 13 и собирают электрод. Электрод 4 соединяют с термооксиметром 6 и помещают в измерительную кювету 2, заполненную буферным раствором 3. Способ оценки токсичности заключается в том, что регистрируют дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов с помощью термооксиметра, добавляют определенный объем контрольных или анализируемой проб (водных вытяжек из полимерных или текстильных материалов) и регистрируют изменение дыхательной активности микроорганизмов с помощью термооксиметра 6, результаты изменения содержания кислорода (ответ биосенсора R) выводятся на монитор компьютера 7. Проводят расчет индекса токсичности по формуле:

Т = (Rпроб - Rотр) / (Rпол - Roтp),

где Т - индекс токсичности;

Rпpoб - ответ биосенсора на образец анализируемой пробы, O₂мкг/дм³*с;

Rпол - ответ биосенсора на образец положительного контроля (раствор ацетальдегида 2,0 мг/дм³), O₂мкг/дм³*с;

Rотр - ответ биосенсора на образец отрицательного контроля (дистиллированная вода), O₂мкг/дм³*с.

Токсичность оценивают по величине индекса токсичности:

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.

Пример. 1. Подготовка проб. Из рабочих образцов текстильных материалов и одежды вырезают элементарные образцы массой (3,00 ± 0,01) г. Испытуемые товары из полимерных материалов и резины измельчают на кусочки сечением (3х3)-(5х5) мм и отбирают элементарные образцы массой (3,00 ± 0,01) г. Элементарные образцы перемещают в стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30 мм с притертой пробкой, заливают 10 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, добиваясь полного смачивания образцов водой. Экстракцию всех образцов проводят в суховоздушном термостате при температуре 37°С в течение 1 ч.

Пример 2. Приготовление стандартного образца положительного контроля. Стандартная проба положительного контроля - раствор ацетальдегида 2,0 мг/дм³ . Этот раствор готовят из основного раствора ацетальдегида с массовой концентрацией 100 мг/дм³. В мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят 1,0 см³ основного раствора, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для приготовления основного раствора ацетальдегида в мерную колбу вместимостью 100 см³ добавляют 50 см³ дистиллированной воды, охлажденной до (10-15)°С. Затем колбу переносят на аналитические весы и с помощью пипет-дозатора добавляют (0,0100±0,0005) г ацетальдегида. Когда температура раствора в колбе достигнет 20°С, доводят объём до метки дистиллированной водой.

Пример 3. Оценка токсичности. Кислородный электрод с иммобилизованными клетками бактерий E.coli К-12, погружают в измерительную кювету объемом 5 см³ с 1/15 моль/дм³ Na-K-фосфатного буферного раствора со значением рН 7,0 и регистрируют силу тока, отражающего содержание кислорода в среде (фоновое) с термооксиметра. Затем вносят последовательно пробы 100 мм³ : контрольные пробы (стандартные образцы отрицательного и положительного контроля) и анализируемую пробу (водную вытяжку из полимерных или текстильных материалов). Измерения проводят при непрерывном перемешивании с

помощью магнитной мешалки при комнатной температуре. Стандартная проба положительного контроля - раствор ацетальдегида 2,0 мг/дм³. Стандартная отрицательная проба - дистиллированная вода. Между измерениями проб кювету и электрод промывают тремя порциями фонового раствора по 4 см³ с интервалом в 5 мин. Ответы биосенсора, выраженные в О₂мкг/дм³*с, используют для расчета индекса токсичности: Т = (Rпроб - Rотр) / (Rпол - Rотр), где Т - индекс токсичности, Rпроб - ответ биосенсора на образец анализируемой пробы, О₂мкг/дм³*с; Rпол - ответ биосенсора на образец положительного контроля, О₂мкг/дм³*с; Rотр - ответ биосенсора на образец отрицательного контроля, О₂мкг/дм³*с. Токсичность пробы оценивают по величине индекса токсичности:

Предлагаемый способ оценки токсичности товаров из полимерных и текстильных материалов позволил упростить оценку токсичности и улучшить достоверность результатов санитарно-гигиенической экспертизы благодаря увеличению стабильности биораспознающего элемента до 30 дней функционирования при СКО не более 7%, возможности проведения анализа в первый день после иммобилизации микроорганизмов, использованию для оценки индекса токсичности Т.

Таблица 1
Сравнение прототипа и предложенного изобретения
Виды технического результата и их размерность	Показатели фактические или расчетные		Объяснение улучшения показателей
	Прототип	Заявляемого устройства
Возможность проведения анализа в первый день после иммобилизации микроорганизмов	Требуется время для адаптации микроорганизмов в течение суток (среднеквадратичное отклонение более 7%)	Возможно использование биосенсора для анализа в первый день после иммобилизации микроорганизмов (среднеквадратичное отклонение менее 7%)	В прототипе клетки микроорганизмов при иммобилизации в агаровый гель подвергаются нагреванию до 50-60°С, с учетом того, что хранятся они при низких температурах, такое воздействие высокой температуры приводит к стрессу и требуется время для адаптации. В заявляемом устройстве воздействие высоких температур исключено.
Среднее время проведения единичного измерения с учетом троекратного промывания рецепторного	10-15 мин	5-10 мин	Разница обусловлена тем, что в заявляемом устройстве нет механической преграды в виде агарового геля (как в прототипе), что увеличивает скорость диффузии кислорода и анализируемых веществ в пробе к ферментным системам клеток,
элемента буферным раствором				это сокращает время проведения анализа, увеличивает аналитический сигнал и чувствительность анализа
Долговременная стабильность, при среднеквадратичное отклонение не более 7%	Не более 14 дней	Не менее 30 дней		В прототипе клетки микроорганизмов вымываются из агарового геля, который постепенно разрушается, агаровый гель взаимодействует с веществами пробы, что снижает сходимость метода и время функционирования иммобилизованных микроорганизмов

Claims

Способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов, заключающийся в том, что используют биосенсор на основе кислородного электрода, иммобилизуют целые клетки микроорганизмов на поверхность кислородного электрода, измеряют дыхательную активность микроорганизмов в присутствии пробы, оценивают токсичность проб, отличающуюся тем, что иммобилизуют целые клетки бактерий E.coli К-12 на поверхность кислородного электрода с помощью полупроницаемой мембраны, измеряют дыхательную активность с помощью термооксиметра, дополнительно используют стандартные образцы положительного и отрицательного контроля, рассчитывают индекс токсичности по следующей формуле:
Т = (Rпроб - Rотр) / (Rпол - Rотр),
где Т - индекс токсичности,
Rпроб - ответ биосенсора на образец анализируемой пробы, О₂мкг/дм³*с;
Rпол - ответ биосенсора на образец положительного контроля, О₂мкг/дм³*с;
Rотр - ответ биосенсора на образец отрицательного контроля, О₂мкг/дм³*с,
и оценивают токсичность, учитывая индекс токсичности
Индекс токсичности (Т) Степень токсичности образца менее 1.0 нетоксичен 1.0-10.0 токсичен более 10.0 сильнотоксичен