RU2452499C1 - Method of modifying carbon haemosorbent and carbon haemosorbent with immobilised protein - Google Patents
Method of modifying carbon haemosorbent and carbon haemosorbent with immobilised protein Download PDFInfo
- Publication number
- RU2452499C1 RU2452499C1 RU2011113927/15A RU2011113927A RU2452499C1 RU 2452499 C1 RU2452499 C1 RU 2452499C1 RU 2011113927/15 A RU2011113927/15 A RU 2011113927/15A RU 2011113927 A RU2011113927 A RU 2011113927A RU 2452499 C1 RU2452499 C1 RU 2452499C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- carbon
- hemosorbent
- haemosorbent
- hours
- concentration
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к технологии получения сорбентов с иммобилизованным белком, позволяющих селективно сорбировать вещества пептидной природы, в том числе белки, которые появляются и накапливаются в организме при определенных заболеваниях. Предназначено для применения в сорбционной терапии, протеомике, медицинской диагностике, биотехнологии.The invention relates to a technology for the production of sorbents with immobilized protein, allowing selective sorption of substances of a peptide nature, including proteins that appear and accumulate in the body in certain diseases. Designed for use in sorption therapy, proteomics, medical diagnostics, biotechnology.
В настоящее время уделяется большое внимание созданию гемосорбентов, избирательно поглощающих из крови токсические вещества белкового происхождения, накапливающиеся в организме при развитии патологических процессов (онкологических, аутоиммунных и т.д.). Создание сорбентов с повышенной адсорбционной активностью по отношению к веществам белковой природы путем регулирования химической природы их поверхности (химическое модифицирование) позволяет создать широкий спектр эффективных сорбентов, специфически связывающих пептиды и белки. В качестве матрицы для производства специфических сорбентов все большее применение находят углеродные сорбенты. Данный выбор обусловлен рядом их уникальных свойств, прежде всего хорошей совместимостью с биологическими жидкостями и инертностью к тканям внутренних органов, а также высокой прочностью их гранул.Currently, much attention is paid to the creation of hemosorbents that selectively absorb toxic substances of protein origin from the blood that accumulate in the body during the development of pathological processes (oncological, autoimmune, etc.). The creation of sorbents with increased adsorption activity with respect to substances of protein nature by regulating the chemical nature of their surface (chemical modification) allows you to create a wide range of effective sorbents that specifically bind peptides and proteins. As a matrix for the production of specific sorbents, carbon sorbents are increasingly used. This choice is due to a number of their unique properties, primarily good compatibility with biological fluids and inertness to tissues of internal organs, as well as high strength of their granules.
Известны способы получения биосовместимых и селективных гемосорбентов введением разнополярных групп, капсулированием и нанесением полимерного слоя на поверхность сорбента (В.В.Стрелко, С.В.Михайловский, Н.В.Сухаренко, Н.Т.Картель и др. О возможности создания биоспецифических материалов на основе биосовместимых углеродных матриц. // Доклады АН СССР. Т.274. №5. С.1236-1239; Горчаков В.Д., Сергиенко В.И. Селективные гемосорбенты. - М.: Медицина, 1989. С.139-147; Бакалинская О.Н., Сухаренко Н.В., Стрелко В.В Сорбционные свойства углеродных гемосорбентов с иммобилизованными белками. // Украинский химический журнал, 1989, №12. С.1273-1276; Лисичкин Г.В. Химия привитых поверхностных соединений. - М.: Физматлит, 2003, 592 с; патент РФ №2064429).Known methods for producing biocompatible and selective hemosorbents by introducing bipolar groups, encapsulating and applying a polymer layer to the surface of the sorbent (V.V. Strelko, S.V. Mikhaylovsky, N.V. Sukharenko, N.T. Kartel and others. On the possibility of creating biospecific materials based on biocompatible carbon matrices // Reports of the USSR Academy of Sciences, vol.274. No. 5. P.1236-1239; Gorchakov V.D., Sergienko V.I. Selective hemosorbents. - M .: Medicine, 1989. P. 139-147; Bakalinskaya O.N., Sukharenko N.V., Strelko V.V. Sorption properties of carbon hemosorbents with immobi . Izovannymi proteins // Ukrainian Chemical Journal, 1989, №12 S.1273-1276; Lisichkin GV Chemistry grafted surface compounds - M .: FIZMATLIT, 2003, 592;.. RF patent №2064429).
Известен способ модифицирования углеродных сорбентов за счет покрытия его поверхности пленкой альбумина (Albumin Coated Activated Charcoal, АСАС-угли) (Terman D.S. Extracorporeal immunoadsorbens for extraction of circulating immune reactants // Sorbents and their clinical applications / Ed. C.Giordano. - N.-Y. - London Academic Press. 1980. - P.469-491).A known method for modifying carbon sorbents by coating its surface with an albumin film (Albumin Coated Activated Charcoal, ACAC-coals) (Terman DS Extracorporeal immunoadsorbens for extraction of circulating immune reactants // Sorbents and their clinical applications / Ed. C. Giordano. - N. Y. - London Academic Press. 1980. - P.469-491).
Данные способы модифицирования направлены на улучшение качества углеродных адсорбентов: повышение прочности гранул и снижение «пылевыделения» в раствор адсорбата, выравнивание рельефа поверхности модифицирующей пленкой, повышение совместимости с биологической жидкостью. Однако основным недостатком данных способов модифицирования является практически полное закрытие пор в сорбентах пленкой полимерного модификатора, приводящее к ухудшению динамики процесса сорбции биологических жидкостей.These methods of modification are aimed at improving the quality of carbon adsorbents: increasing the strength of granules and reducing "dust" in the adsorbate solution, aligning the surface topography with a modifying film, increasing compatibility with biological fluid. However, the main disadvantage of these methods of modification is the almost complete closure of the pores in the sorbents with a polymer modifier film, which leads to a deterioration in the dynamics of the sorption of biological fluids.
Известен способ получения гемосорбента, включающий модифицирование активированного угля путем его обработки метилтолуолсульфонат-N-циклогексил-N-1-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидом в присутствии меланина при их массовом соотношении (2,3-2,6):1 соответственно и инкубацию модифицированного угля в присутствии глутатиона (патент РФ №2316392). Недостатком получаемого гемосорбента является его низкая прочность и поверхностная неоднородность.A known method of producing hemosorbent, including the modification of activated carbon by treating methyltoluene sulfonate-N-cyclohexyl-N-1- (2-morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide in the presence of melanin in their mass ratio (2.3-2.6): 1 accordingly, incubation of modified coal in the presence of glutathione (RF patent No. 2316392). The disadvantage of the resulting hemosorbent is its low strength and surface heterogeneity.
Все вышеописанные сорбенты обладают неспецифичностью и низкой адсорбционной способностью к веществам белковой природы. Для того чтобы обеспечить биоспецифическое взаимодействие биологических молекул и увеличить емкость аффинного сорбента, необходимо перевести имеющиеся на полимерной пленке функциональные группы в реакционноспособные и иммобилизовать на активированной поверхности биолиганд, способный к эффективному связыванию определенных токсичных веществ белковой природы. Необходимым условием является ковалентное его присоединение к модифицированной поверхности сорбента.All of the above sorbents have nonspecificity and low adsorption ability to substances of protein nature. In order to ensure biospecific interaction of biological molecules and increase the capacity of the affinity sorbent, it is necessary to transfer the functional groups on the polymer film into reactive groups and immobilize on the activated surface bioligands capable of efficiently binding certain toxic substances of a protein nature. A necessary condition is its covalent attachment to the modified surface of the sorbent.
Известен способ получения биоспецифического углеродного сорбента, в котором в качестве исходного углеродного сорбента используется гемосорбент марки «СУМС-1». Иммобилизацию биолигандов (противоэнцефалитного гамма-глобулина, белка А, нейтральной протеазы Протосубтилина П10Х) осуществляли простой циркуляцией изотоничсекого раствора белка через слой гемосорбента в динамических условиях (Коваленко Г.А. Методы получения биоспецифических гемосорбентов. // Химико-фармацевтический журнал, 1998, №3. С.36-40). Недостатками полученных при таком способе иммобилизации сорбентов является низкая концентрация биолиганда на поверхности сорбента; уменьшение ферментативной активности используемых белков после иммобилизации; использование полученных сорбентов при заболеваниях, сопровождающихся накоплением только определенных соединений белковой природы с известным строением и высокой молекулярной массой.A known method of producing a biospecific carbon sorbent, in which the SUMS-1 brand hemosorbent is used as the initial carbon sorbent. Immobilization of bioligands (anti-encephalitis gamma globulin, protein A, neutral protease Protosubtilin P10X) was carried out by simple circulation of an isotonic protein solution through a hemosorbent layer under dynamic conditions (G. Kovalenko. Methods for the production of biospecific hemosorbents. // Pharmaceutical Chemistry Journal, 1998, No. 3 P.36-40). The disadvantages obtained with this method of immobilization of sorbents is the low concentration of bioligand on the surface of the sorbent; a decrease in the enzymatic activity of the used proteins after immobilization; the use of the obtained sorbents in diseases accompanied by the accumulation of only certain compounds of protein nature with a known structure and high molecular weight.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ обработки углеродного мезопористого гемосорбента, включающий обработку пористого углеродного материала воздухом при контактировании с воздушно-водяной смесью в кипящем слое и обработку гемосорбента в стационарном слое 4-6% раствором азотной кислоты, подаваемым в зону реакции порциями через определеннее интервалы времени, с последующей подачей воздуха с объемной скоростью 8 м3/ч для перемешивания сорбента. Обработку кислотой проводят в течение 7 часов, соотношение кислоты и сорбента составляет 1:(29-32). Полученный сорбент сушат при температуре 200°С до остаточной влажности 0,2% (патент РФ №2362733, прототип).Closest to the proposed method is a method of treating a carbon mesoporous hemosorbent, comprising treating the porous carbon material with air by contact with an air-water mixture in a fluidized bed and treating the hemosorbent in a stationary layer with a 4-6% nitric acid solution supplied to the reaction zone in portions at predetermined intervals time, followed by air supply with a space velocity of 8 m 3 / h for mixing the sorbent. The acid treatment is carried out for 7 hours, the ratio of acid to sorbent is 1: (29-32). The resulting sorbent is dried at a temperature of 200 ° C to a residual moisture content of 0.2% (RF patent No. 2362733, prototype).
Наиболее близким к предлагаемому гемосорбенту является углеродный мезопористый гемосорбент ВНИИТУ-1, который состоит из гранул размером 0,5-1,0 мм, характеризуется высокой химической чистотой (содержание углерода не менее 99,5%), удельной адсорбционной поверхностью 300-400 м3/г, присутствием на поверхности кислородсодержащих функциональных групп в количестве 0,060-0,070 мэкв/г, из них содержание карбоксильных групп 0,051-0,058 мэкв/г, фенольных 0,009-0,022 мэкв/г (Суровикин В.Ф., Пьянова Л.Г., Лузянина Л.С. Новые гемо- и энтеросорбенты на основе нанодисперсных углерод-углеродных материалов // Российский химический журнал. 2007 - Т.LI. - №5. С.159-165).Closest to the proposed hemosorbent is the carbon mesoporous hemosorbent VNIITU-1, which consists of granules with a size of 0.5-1.0 mm, is characterized by high chemical purity (carbon content of at least 99.5%), specific adsorption surface of 300-400 m 3 / g, the presence on the surface of oxygen-containing functional groups in the amount of 0.060-0.070 meq / g, of which the content of carboxyl groups is 0.051-0.058 meq / g, phenolic 0.009-0.022 meq / g (Surovikin V.F., Pyanova L.G., Luzyanina LS New hemo- and enterosorbents based on nanodispersed carbon Erode-carbon materials // Russian Chemical Journal, 2007 -. T.LI. - №5 S.159-165)..
К недостатку углеродного гемосорбента можно отнести невысокую адсорбционную емкость по отношению к токсичным соединениям белковой природы, накапливающимся в организме при определенных заболеваниях.The disadvantage of carbon hemosorbent is the low adsorption capacity with respect to toxic compounds of a protein nature that accumulate in the body in certain diseases.
Целью изобретения является получение углеродного гемосорбента с высокой адсорбционной активностью, настроенного на извлечение патологических веществ белковой природы.The aim of the invention is to obtain a carbon hemosorbent with high adsorption activity, configured to extract pathological substances of a protein nature.
Предлагаемый способ модифицирования углеродного гемосорбента включает обработку водным раствором оксикислоты с концентрацией 5-20% при соотношении гемосорбент : раствор оксикислоты 1:10-1:20 при температуре 25°С в течение 2-4 ч с последующим декантированием и выдержкой пропитанного гемосорбента в инертной среде в течение 0,25-6 ч при температуре 120-350°С, кипячением в дистиллированной воде в течение 1-2 ч, сушкой и последующей пропиткой 1М растворами N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в органическом растворителе (диметиламид) при перемешивании реакционной смеси в течение 0,5-3 ч с последующем добавлением приготовленного в буферном растворе с рН 7,3-7,5 сывороточного альбумина с концентрацией 0,5-2,0 мг/мл при перемешивании в течение 16-24 ч, отмывку 0,9% раствором хлорида натрия.The proposed method for modifying carbon hemosorbent involves treating with an aqueous solution of hydroxy acid with a concentration of 5-20% at a ratio of hemosorbent: hydroxy acid solution of 1: 10-1: 20 at a temperature of 25 ° C for 2-4 hours, followed by decantation and soaking of the impregnated hemosorbent in an inert medium for 0.25-6 hours at a temperature of 120-350 ° C, boiling in distilled water for 1-2 hours, drying and subsequent impregnation with 1M solutions of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and pentafluorophenol in an organic solvent (dimethylamide) under alternating curing the reaction mixture for 0.5-3 hours, followed by the addition of serum albumin prepared in a buffer solution with a pH of 7.3-7.5 with a concentration of 0.5-2.0 mg / ml with stirring for 16-24 hours, washing with 0.9% sodium chloride solution.
Предлагаемый углеродный гемосорбент с иммобилизованным белком в виде гранул округлой формы размером 0,5-1,0 мм, с гладким рельефом поверхности, характеризуется содержанием на поверхности белка, удельной адсорбционной поверхностью 250-280 м2/г, общим объемом пор 0,40-0,50 см3/г, преимущественно мезопор 0,35-0,48 см3/г, концентрацией кислородсодержащих групп на поверхности гранул 0,20-0,40 мэкв/г и содержанием общего азота 3-5%.The proposed carbon hemosorbent with immobilized protein in the form of round granules of 0.5-1.0 mm in size, with a smooth surface topography, is characterized by a content on the protein surface, a specific adsorption surface of 250-280 m 2 / g, a total pore volume of 0.40- 0.50 cm 3 / g, predominantly mesopore 0.35-0.48 cm 3 / g, with a concentration of oxygen-containing groups on the surface of the granules 0.20-0.40 meq / g and a total nitrogen content of 3-5%.
Отличительными признаками данного изобретения являются:Distinctive features of this invention are:
- модифицирование поверхности углеродного гемосорбента нетоксичной оксикислотой, содержащей в своем составе не менее двух функциональных групп: карбоксильную -СООН и гидроксильную -ОН;- surface modification of the carbon hemosorbent with a non-toxic hydroxy acid containing at least two functional groups: carboxyl-COOH and hydroxyl-OH;
- активация модифицированного гемосорбента путем обработки растворами N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в органическом растворителе (диметиламид кислот);- activation of the modified hemosorbent by treatment with solutions of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and pentafluorophenol in an organic solvent (acid dimethylamide);
- иммобилизация сывороточного альбумина на поверхности гемосорбента. - immobilization of serum albumin on the surface of the hemosorbent.
Повышение адсорбционной емкости достигается за счет нанесения на гидрофобную пористую поверхность углеродного сорбента нетоксичной органической оксикислоты, содержащей в своем составе не менее двух функциональных групп (карбоксильная -СООН и гидроксильная -ОН). Бифункциональность модифицирующего соединения создает условия для протекания реакции гомополиконденсации с образованием олигомерных или полимерных молекул, обладающих низкой растворимостью в воде. Протекающие межмакромолекулярные реакции на твердой поверхности сорбента при полимеризации позволяют изменять состояние модифицирующего соединения при полимеризации (олиго- и полимеров), переводя их из состояния изолированных макромолекул в состояние единой пространственной сетчатой структуры с принципиально новыми свойствами: происходит резкое снижение необратимых деформаций, потери текучести, растворимости, улучшение прочностных свойств. Данное обстоятельство обеспечивает постоянство химического состава образованного полимера на поверхности модифицированного сорбента в процессе работы при контактах с биологическими жидкостями. Наличие карбоксильной группы в данном случае выступает как собственный кислотный катализатор, обеспечивая процесс самокатализируемой поликонденсации.The increase in adsorption capacity is achieved by applying to the hydrophobic porous surface of the carbon sorbent a non-toxic organic hydroxy acid containing at least two functional groups (carboxyl-COOH and hydroxyl-OH). The bifunctionality of the modifying compound creates the conditions for a homopolycondensation reaction to form oligomeric or polymeric molecules with low solubility in water. The ongoing intermacromolecular reactions on the solid surface of the sorbent during polymerization make it possible to change the state of the modifying compound during polymerization (oligo- and polymers), transferring them from the state of isolated macromolecules to a state of a single spatial network structure with fundamentally new properties: a sharp decrease in irreversible deformations, loss of fluidity, solubility , improvement of strength properties. This circumstance ensures the constancy of the chemical composition of the formed polymer on the surface of the modified sorbent during operation in contact with biological fluids. The presence of a carboxyl group in this case acts as its own acid catalyst, providing a process of self-catalyzed polycondensation.
Присутствие закрепленных на углеродной поверхности концевых функциональных групп молекулы оксикислот -СООН повышает гидрофильность поверхности гемосорбента и соответственно увеличивает сорбционную активность к белковым соединениям.The presence of terminal functional groups of the oxyacid-COOH molecule attached to the carbon surface increases the hydrophilicity of the surface of the hemosorbent and, accordingly, increases the sorption activity to protein compounds.
Активация карбоксильных групп (придание повышенной реакционоспособности) на концах образованных полимерных цепей на поверхности углеродного сорбента позволяет увеличить количество активных центров, ковалентно связанных с иммобилизованным белком - биолигандом. Используемый в качестве биолиганда белок сывороточный альбумин обеспечивает селективные (аффинные) свойства получаемого сорбента по отношению к соединениям белковой природы. Уникальность выбранного биолиганда обусловлена его физико-химическими и физиологическими свойствами, наличием в его структуре большого количества реакционоспособных центров, способных связываться с токсинами белковой природы и инактивировать их (детоксикационные свойства).Activation of carboxyl groups (giving increased reactivity) at the ends of the formed polymer chains on the surface of the carbon sorbent allows you to increase the number of active centers covalently linked to an immobilized protein - a bioligand. The serum albumin protein used as a bioligand provides selective (affinity) properties of the resulting sorbent with respect to compounds of protein nature. The uniqueness of the chosen bioligand is due to its physicochemical and physiological properties, the presence in its structure of a large number of reactive centers that can bind to toxins of protein nature and inactivate them (detoxification properties).
Модифицирование углеродной поверхности приводит к изменениям параметров пористой текстуры углеродного гемосорбента: полностью закрываются микропоры, снижается объем макропор. В целом пористая структура модифицированных образцов гемосорбента характеризуется меньшими значениями величины удельной адсорбционной поверхности SБЭТ и более высокими значениями среднего диаметра пор.Modification of the carbon surface leads to changes in the parameters of the porous texture of the carbon hemosorbent: micropores are completely closed, and the volume of macropores is reduced. In general, the porous structure of the modified hemosorbent samples is characterized by lower values of the specific adsorption surface S BET and higher values of the average pore diameter.
Проведение модифицирования полимерами оксикислот и последующая активация поверхностных карбоксильных групп углеродного гемосорбента приводит к значительному увеличению кислородсодержащих групп, образующих активные адсорбционные центры, способные адсорбировать белковые соединения за счет их специфического взаимодействия с функциональными поверхностными группами модифицированного сорбента. Количество кислородсодержащих групп на поверхности модифицированных углеродных сорбентов после их активации возрастает в 4 раза: содержание общих кислых групп для модифицированных сорбентов после активации на поверхности увеличивается от 0,060-0,070 до 0,20-0,40 мэкв/г.Carrying out polymer modification of hydroxy acids and subsequent activation of the surface carboxyl groups of the carbon hemosorbent leads to a significant increase in oxygen-containing groups forming active adsorption centers capable of adsorbing protein compounds due to their specific interaction with the functional surface groups of the modified sorbent. The amount of oxygen-containing groups on the surface of modified carbon sorbents after their activation increases 4 times: the content of total acid groups for modified sorbents after activation on the surface increases from 0.060-0.070 to 0.20-0.40 meq / g.
Увеличение концентрации кислородсодержащих групп, в том числе карбоксильных групп, на поверхности гемосорбента вносит определенный вклад в адсорбцию белковых веществ. После проведения активации карбоксильных групп на поверхности углеродного сорбента с прочно закрепленной полимерной пленкой ковалентно присоединяется белок-лиганд.An increase in the concentration of oxygen-containing groups, including carboxyl groups, on the surface of the hemosorbent makes a certain contribution to the adsorption of protein substances. After the activation of carboxyl groups on the surface of the carbon sorbent with a firmly fixed polymer film, a protein ligand covalently attaches.
Определение физико-химических характеристик образцов исходного и модифицированного углеродного гемосорбента проводилось стандартными методами, применяемыми при исследовании пористых материалов: количественное содержание кислородсодержащих групп - химическим методом (метод Boehm Н.Р.) по взаимодействию с химическими реагентами различной природы и потенциометрическим титрованием. Основные текстурные характеристики - удельную адсорбционную поверхность, суммарный объем пор и распределение пор по размерам - определяли по изотермам адсорбции-десорбции азота, полученным на приборе «Sorptomatic-1900» фирмы «Carlo Erba». Расчет величины адсорбционной удельной поверхности проводили по уравнению БЭТ. Рельеф и морфологию поверхности исследуемых образцов углеродного сорбента изучали методом растровой электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа «JSM-6460 LV» («JEOL», Япония). Снимки просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР) получали на электронном микроскопе «JEM-2010» («JEOL», Япония) с разрешением по решетке 0.14 нм при ускоряющем напряжении 200 кВ. Рентгеновский микроанализ поверхности исследуемых образцов проводили на энергодисперсионном спектрометре EDAX («EDAX», Япония), оснащенном Si (Li) детектором с энергетическим разрешением 130 эВ. Исследование поверхности образцов углерод-углеродного сорбента проводили методом атомно-силовой микроскопии на микроскопе «Solver Р47» («NT-MDT», Россия) в полуконтактном режиме.The physicochemical characteristics of the samples of the initial and modified carbon hemosorbent were determined by standard methods used in the study of porous materials: the quantitative content of oxygen-containing groups was determined by the chemical method (Boehm N.R. method) by interaction with chemical reagents of various nature and potentiometric titration. The main texture characteristics — specific adsorption surface, total pore volume and pore size distribution — were determined by nitrogen adsorption-desorption isotherms obtained with a Sorptomatic-1900 instrument from Carlo Erba. The calculation of the adsorption specific surface area was carried out according to the BET equation. The relief and surface morphology of the studied carbon sorbent samples were studied by scanning electron microscopy using a JSM-6460 LV electron microscope (JEOL, Japan). High resolution transmission electron microscopy (HRTEM) photographs were taken on a JEM-2010 electron microscope (JEOL, Japan) with a lattice resolution of 0.14 nm at an accelerating voltage of 200 kV. X-ray microanalysis of the surface of the studied samples was performed on an EDAX energy dispersive spectrometer (EDAX, Japan) equipped with a Si (Li) detector with an energy resolution of 130 eV. The surface of the carbon-carbon sorbent samples was studied by atomic force microscopy using a Solver P47 microscope (NT-MDT, Russia) in a semi-contact mode.
Влияние модифицирования поверхности углеродного гемосорбента на адсорбционные свойства по отношению к малым М-белкам (белковая фракция «Глобулин γ-1») исследовано в Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии на плазме крови больных микс-гепатитами (стендовые испытания). Определение сорбции малых М-белков проводили методом капиллярного белкового электрофореза.The effect of modifying the surface of the carbon hemosorbent on the adsorption properties with respect to small M-proteins (protein fraction “Gloulin γ-1”) was studied at the Central Research Laboratory of the Omsk State Medical Academy on the blood plasma of patients with mix hepatitis (bench tests). The sorption of small M proteins was determined by capillary protein electrophoresis.
На фиг.1 приведены электронно-микроскопические (ПЭМВР) снимки образца, модифицированного полимером молочной кислоты, с активированными карбоксильными группами и иммобилизованным сывороточным альбумином (частицы с размерами ~10 нм), закрепленные на поверхности глобул сорбента.Figure 1 shows electron microscopic (PEMVR) images of a sample modified with a lactic acid polymer with activated carboxyl groups and immobilized serum albumin (particles with sizes of ~ 10 nm), mounted on the surface of the sorbent globules.
На фиг.2 приведен спектр рентгеновского энергодисперсионного микроанализа поверхности образца модифицированного гемосорбента с иммобилизированным на его поверхности сывороточным альбумином. Анализ полученных спектров показал наличие спектральной линии азота, входящего в структуру молекулы белка сывороточного альбумина (модификатор - молочная кислота не имеет элемента азота в своей структуре).Figure 2 shows the spectrum of x-ray energy dispersive microanalysis of the surface of a sample of a modified hemosorbent with serum albumin immobilized on its surface. The analysis of the obtained spectra showed the presence of the spectral line of nitrogen, which is part of the structure of the protein molecule of serum albumin (modifier - lactic acid does not have a nitrogen element in its structure).
Для исследования структуры поверхности и определения сил межмолекулярного взаимодействия был использован метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). На фиг.3 - трехмерное представление образцов углеродного гемосорбента. Методом АСМ было показано, что поверхность гранул исходного сорбента имеет сложную организацию (фиг.3а). Установлено, что модифицирование сорбента молочной кислотой и его активация не оказывают влияния на топографические характеристики поверхности гранул в пределах разрешения использованного метода (≈20 нм) (фиг.3б). Изучение поверхности образца, модифицированного молочной кислотой после активации, через который пропущена плазма крови здорового человека, выявило сглаживание рельефа - заполнение каньонов и ямок, и уменьшение высоты шиловидных образований (фиг.3в). Наиболее ярко сглаживание рельефа наблюдается на образце углеродного гемосорбента, модифицированного молочной кислотой, активированного, с иммобилизованным альбумином, через который пропущена плазма крови здорового человека (фиг.3г).To study the surface structure and determine the forces of intermolecular interaction, the atomic force microscopy (AFM) method was used. Figure 3 is a three-dimensional representation of carbon hemosorbent samples. By the AFM method it was shown that the surface of the granules of the initial sorbent has a complex organization (figa). It was found that the modification of the sorbent with lactic acid and its activation do not affect the topographic characteristics of the surface of the granules within the resolution of the method used (≈20 nm) (Fig.3b). A study of the surface of the sample modified with lactic acid after activation, through which the blood plasma of a healthy person is passed, revealed a smoothing of the relief — filling of canyons and pits, and a decrease in the height of the awl-shaped formations (Fig.3c). The most pronounced smoothing of the relief is observed on a sample of carbon hemosorbent modified with lactic acid, activated, with immobilized albumin, through which the blood plasma of a healthy person is passed (Fig. 3d).
На фиг.4 приведены ИК-спектры углеродных гемосорбентов: по прототипу (1), модифицированного молочной кислотой (2) и модифицированного молочной кислотой, активированного с иммобилизованным альбумином (3). Иммобилизацию альбумина на поверхности модифицированного гемосорбента подтверждает наличие связи -NH(CO)-, характерное для белков, которое проявляется в области 1500-1700 см-1 в виде двух полос поглощения 1500-1600 см-1 и 1600-1700 см-1 с максимумом при 1659 см-1 (Шиманучи Т. Новые аспекты колебательной спектроскопии полимеров. В кн.: Структурные исследования макромолекул спектроскопическими методами. М: Химия, 1980. С.60-72).Figure 4 shows the IR spectra of carbon hemosorbents: according to the prototype (1), modified with lactic acid (2) and modified with lactic acid, activated with immobilized albumin (3). The immobilization of albumin on the surface of the modified hemosorbent confirms the presence of the -NH (CO) - bond, characteristic of proteins, which appears in the region of 1500-1700 cm -1 in the form of two absorption bands of 1500-1600 cm -1 and 1600-1700 cm -1 with a maximum at 1659 cm -1 (Shimanouchi T. New aspects of vibrational spectroscopy of polymers. In the book: Structural studies of macromolecules by spectroscopic methods. M: Chemistry, 1980. P.60-72).
Эффективность способа модифицирования поверхности углеродного гемосорбента полимерами оксикислот с последующей иммобилизацией сывороточного альбумина для избирательной сорбции патологических веществ белковой природы доказывают примеры сорбции малых М-белков (мембранные белки, молекулярная масса 30000-70000 г/моль) из плазмы крови больных гепатитами полученными сорбентами (см. таблицу). Сорбционные свойства повышаются по сравнению с прототипом в отношении к извлекаемым токсичным белкам: снижение концентрации токсичных белков для прототипа до 13,6%, для модифицированных образцов - до 8,7%.The effectiveness of the method of modifying the surface of a carbon hemosorbent with hydroxy acid polymers followed by the immobilization of serum albumin for the selective sorption of pathological substances of a protein nature is proved by the examples of sorption of small M-proteins (membrane proteins, molecular weight of 30000-70000 g / mol) from the blood plasma of hepatitis patients with obtained sorbents (see table). Sorption properties are increased compared with the prototype in relation to recoverable toxic proteins: a decrease in the concentration of toxic proteins for the prototype to 13.6%, for modified samples to 8.7%.
Для иллюстрации изобретения приведены следующие примеры.The following examples are provided to illustrate the invention.
Пример 1 (по прототипу).Example 1 (prototype).
Навеску гемосорбента 0,05 г заливают плазмой крови больного микс-гепатитом с содержанием малых М-белков в белковой фракции «Глобулин γ-1» 19,3% и перемешивают на шейкере в течение часа при комнатной температуре. Концентрацию белков во фракции до и после контакта с гемосорбентом определяют методом капиллярного белкового электрофореза и далее расчетным путем. Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 18,2%.A sample of 0.05 g of hemosorbent is poured into the blood plasma of a patient with mix hepatitis with a content of small M-proteins in the protein fraction Globulin γ-1 of 19.3% and stirred on a shaker for one hour at room temperature. The concentration of proteins in the fraction before and after contact with hemosorbent is determined by capillary protein electrophoresis and then calculated. The amount of proteins in the studied fraction after contact with hemosorbent was 18.2%.
Пример 2.Example 2
Навеску гемосорбента 0,05 г пропитывают 18% раствором молочной кислоты при соотношении гемосорбент : раствор кислоты=1:10 при температуре 25°С в течение 3 ч, затем гемосорбент отделяют фильтрованием, высушивают при температуре 105°С до постоянного веса, выдерживают в инертной среде при температуре 200°С в течение 2 ч, кипятят в дистиллированной воде в течение 1 ч, после чего гемосорбент высушивают при комнатной температуре в течение 10 ч.A sample of hemosorbent 0.05 g is impregnated with an 18% lactic acid solution at a ratio of hemosorbent: acid solution = 1: 10 at a temperature of 25 ° C for 3 hours, then the hemosorbent is separated by filtration, dried at a temperature of 105 ° C to constant weight, kept in an inert medium at a temperature of 200 ° C for 2 hours, boil in distilled water for 1 hour, after which the hemosorbent is dried at room temperature for 10 hours
Затем проводят активацию обработкой 1М растворами N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в диметилформамиде при соотношении объем раствора : сорбент=5:1 при перемешивании реакционной смеси в течение 2 ч с последующей отмывкой диметилформамидом, затем водой и проводят адсорбцию белков плазмы крови больного микс-гепатитом по примеру 1.Then, activation is carried out by treatment with 1M solutions of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and pentafluorophenol in dimethylformamide with a ratio of solution volume: sorbent = 5: 1 with stirring of the reaction mixture for 2 hours, followed by washing with dimethylformamide, then with water and adsorption of blood plasma proteins of the patient mixed hepatitis in example 1.
Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 13,6%.The amount of proteins in the studied fraction after contact with hemosorbent was 13.6%.
Пример 3.Example 3
Модифицирование гемосорбента проводят по примеру 2, затем добавляют 1 мл приготовленного в буферном растворе с рН 7,4 сывороточного альбумина с концентрацией 1,0 мг/мл при перемешивании в течение 24 ч с последующей отмывкой 0,9% раствором хлорида натрия и проводят адсорбцию белков плазмы крови больного микс-гепатитом по примеру 1. Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 12,5%.Modification of the hemosorbent is carried out according to example 2, then 1 ml of serum albumin prepared in a buffer solution with a pH of 7.4 is added at a concentration of 1.0 mg / ml with stirring for 24 hours, followed by washing with a 0.9% sodium chloride solution and protein adsorption is carried out the blood plasma of the patient with hepatitis mix according to example 1. The amount of proteins in the studied fraction after contact with hemosorbent was 12.5%.
Пример 4.Example 4
Модифицирование и активацию гемосорбента проводят по примеру 2, но сразу после отмывки диметилформамидом добавляют сывороточный альбумин по примеру 3 и проводят адсорбцию белков плазмы крови больного микс-гепатитом по примеру 1.Modification and activation of hemosorbent is carried out according to example 2, but immediately after washing with dimethylformamide, serum albumin is added according to example 3 and the plasma proteins of the patient with mixed hepatitis are adsorbed according to example 1.
Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 8,7%.The amount of proteins in the studied fraction after contact with hemosorbent was 8.7%.
Как следует из приведенных примеров, модифицирование поверхности углеродного гемосорбента растворами оксикислот на примере молочной кислоты с последующей активацией и иммобилизацией белка приводит к снижению его удельной адсорбционной поверхности SБЭТ от 400 м2/г до 274 м2/г и сохранению мезопористой структуры. Важную роль в процессе модифицирования для образования ковалентной связи с иммобилизованным белком играет увеличение количества карбоксильных групп на поверхности гемосорбента при активации. Заявленный способ модифицирования позволяет избирательно сорбировать токсичные белки при микс-гепатитах.As follows from the above examples, modifying the surface of the carbon hemosorbent with hydroxy acid solutions using the example of lactic acid with subsequent activation and immobilization of the protein leads to a decrease in its specific adsorption surface S BET from 400 m 2 / g to 274 m 2 / g and the preservation of the mesoporous structure. An important role in the modification process for the formation of a covalent bond with an immobilized protein is played by an increase in the number of carboxyl groups on the surface of the hemosorbent upon activation. The claimed method of modification allows you to selectively sorb toxic proteins with mix hepatitis.
Как следует из таблицы, модифицирование поверхности углеродного гемосорбента полимером оксикислоты с последующей активацией карбоксильных групп и иммобилизацией сывороточного альбумина позволяет повысить его адсорбционную активность по отношению к токсичным белковым молекулам определенной природы и молекулярной массы. Повышенная активность модифицированного образца по отношению к малым М-белкам подтверждена стендовыми медицинскими испытаниями на плазме крови больных микс-гепатитами.As follows from the table, the modification of the surface of the carbon hemosorbent with an oxyacid polymer with the subsequent activation of carboxyl groups and the immobilization of serum albumin can increase its adsorption activity in relation to toxic protein molecules of a certain nature and molecular weight. The increased activity of the modified sample in relation to small M-proteins is confirmed by bench medical tests on the blood plasma of patients with mixed hepatitis.
Таким образом, сорбционная способность образцов углеродного гемосорбента, модифицированного молочной кислотой, активированного с иммобилизованным альбумином, через который пропущена плазма крови больного человека микс-гепатитом, значительно превосходит адсорбционную способность исходного углеродного гемосорбента.Thus, the sorption capacity of samples of carbon hemosorbent modified with lactic acid, activated with immobilized albumin, through which the blood plasma of a sick person with mixed hepatitis is passed, significantly exceeds the adsorption capacity of the initial carbon hemosorbent.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011113927/15A RU2452499C1 (en) | 2011-04-08 | 2011-04-08 | Method of modifying carbon haemosorbent and carbon haemosorbent with immobilised protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011113927/15A RU2452499C1 (en) | 2011-04-08 | 2011-04-08 | Method of modifying carbon haemosorbent and carbon haemosorbent with immobilised protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2452499C1 true RU2452499C1 (en) | 2012-06-10 |
Family
ID=46679898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011113927/15A RU2452499C1 (en) | 2011-04-08 | 2011-04-08 | Method of modifying carbon haemosorbent and carbon haemosorbent with immobilised protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2452499C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2534805C1 (en) * | 2013-04-09 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем переработки углеводородов Сибирского отделения Российской академии наук (ИППУ СО РАН) | Method of modifying carbon hemosorbent |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2090186C1 (en) * | 1992-03-20 | 1997-09-20 | Институт сорбции и проблем эндоэкологии АН Украины | Sorbent for extraction of antibodies raised to insulin from biological fluids and a method of its preparing |
| RU2161987C2 (en) * | 1998-08-24 | 2001-01-20 | Петросян Эдуард Арутюнович | Method of modification of carbon sorbent |
| RU2362733C1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-07-27 | Институт проблем переработки углеводородов Сибирского отделения Российской Академии Наук (ИППУ СО РАН) | Method for processing of carbon mesoporous hemosorbent |
-
2011
- 2011-04-08 RU RU2011113927/15A patent/RU2452499C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2090186C1 (en) * | 1992-03-20 | 1997-09-20 | Институт сорбции и проблем эндоэкологии АН Украины | Sorbent for extraction of antibodies raised to insulin from biological fluids and a method of its preparing |
| RU2161987C2 (en) * | 1998-08-24 | 2001-01-20 | Петросян Эдуард Арутюнович | Method of modification of carbon sorbent |
| RU2362733C1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-07-27 | Институт проблем переработки углеводородов Сибирского отделения Российской Академии Наук (ИППУ СО РАН) | Method for processing of carbon mesoporous hemosorbent |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| А.В.ВЕСЕЛОВСКАЯ и др. Адсорбция белков на углеродных сорбентах, модифицированных кислородсодержащими группами. Опубликовано 26.03.2010. [он-лайн] [найдено 08.11.11]. Найдено в Интернет <URL: http://conf.omgtu.ru/node/43>. ВЕСЕЛОВСКАЯ А.В. и др. Особенности адсорбции белка альбумина на образцах углеродного гемосорбента. // Материалы Всероссийской научной молодежной школы-конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии». - Омск, 19-23 мая 2008, с.62-64. ГРИГОРЬЕВ И.В. и др. Модифицирование углеродных сорбентов азот- и кислородсодержащими группами путем нанесения мономеров с их последующей полимеризации. // Материалы Всероссийской научной молодежной школы-конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии». - Омск, 19-23 мая 2008, с.84-85. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2534805C1 (en) * | 2013-04-09 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем переработки углеводородов Сибирского отделения Российской академии наук (ИППУ СО РАН) | Method of modifying carbon hemosorbent |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Acet et al. | O-carboxymethyl chitosan Schiff base complexes as affinity ligands for immobilized metal-ion affinity chromatography of lysozyme | |
| Kempe et al. | Molecularly imprinted polymer nanocarriers for sustained release of erythromycin | |
| CN107690355B (en) | Method for preparing hydrogel containing reduced graphene oxide | |
| JP2019532018A (en) | Method for solid-phase crystallization of metal-organic structure in mesoporous material and its hybrid material | |
| Xu et al. | Creating magnetic ionic liquid-molecularly imprinted polymers for selective extraction of lysozyme | |
| Timin et al. | Synthesis and application of amino-modified silicas containing albumin as hemoadsorbents for bilirubin adsorption | |
| Wang et al. | Analysis of tetracyclines from milk powder by molecularly imprinted solid‐phase dispersion based on a metal–organic framework followed by ultra high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry | |
| Chen et al. | A dual-step immobilization/imprinting approach to prepare magnetic molecular imprinted polymers for selective removal of human serum albumin | |
| Qian et al. | Zwitterionic polymer chain-assisted lysozyme imprinted core-shell carbon microspheres with enhanced recognition and selectivity | |
| Göktürk et al. | Protein depletion with bacterial cellulose nanofibers | |
| Chao | Preparation of porous chitosan/GPTMS hybrid membrane and its application in affinity sorption for tyrosinase purification with Agaricus bisporus | |
| CN114259991A (en) | Molecular imprinting material for efficiently adsorbing and removing fluoroquinolone antibiotics and preparation method and application thereof | |
| Ferenc et al. | Haemolytic activity and cellular toxicity of SBA-15-type silicas: elucidating the role of the mesostructure, surface functionality and linker length | |
| Chrzanowska et al. | Effect of geometric modification of fumed nanoscale silica for medical applications on adsorption of human serum albumin: Physicochemical and surface properties | |
| Dinc et al. | Inhibitor-assisted synthesis of silica-core microbeads with pepsin-imprinted nanoshells | |
| RU2452499C1 (en) | Method of modifying carbon haemosorbent and carbon haemosorbent with immobilised protein | |
| Biswas et al. | Engineering of Metal–Organic Frameworks/Gelatin Hydrogel Composites Mediated by the Coacervation Process for the Capture of Acetic Acid | |
| Tan et al. | Fabrication of a biomimetic adsorbent imprinted with a common specificity determinant for the removal of α-and β-amanitin from plasma | |
| RU2362733C1 (en) | Method for processing of carbon mesoporous hemosorbent | |
| Lie et al. | Molecularly imprinted mesoporous silica: Potential of the materials, synthesis and application in the active compound separation from natural product | |
| Yu et al. | Preparation of polyamine-functionalized copper specific adsorbents for selective adsorption of copper | |
| Leshchinskaya et al. | Selective sorption of uric acid by novel molecularly imprinted polymers | |
| Tilkin et al. | Protein encapsulation in mesoporous silica: influence of the mesostructured and pore wall properties | |
| Isaieva et al. | Peculiarities of the sorption of amino acids and their metabolites by medicinal carbon sorbents | |
| Zhao et al. | Organized cryogel composites with 3D hierarchical porosity as an extraction adsorbent for nucleosides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20200602 |