RU2443777C2

RU2443777C2 - Method of single-step telomere length and population division quantity measurement of proliferative cells in vitro

Info

Publication number: RU2443777C2
Application number: RU2010111327/10A
Authority: RU
Inventors: Владимир Сергеевич Кожевников (RU); Владимир Сергеевич Кожевников; Вячеслав Игоревич Борисов (RU); Вячеслав Игоревич Борисов
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2012-02-27
Also published as: RU2010111327A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method involves telomere length measurement by flow-FISH method in cells differentiated by a number of population divisions with a vital stain without preliminary recovery of proliferative cells with using Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3) amino group cross-linker.

EFFECT: invention provides the single-step telomere length measurement in cells with a common division quantity.

3 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к исследованию биологического материала, в частности к определению длины теломер.The invention relates to the study of biological material, in particular to determining the length of telomeres.

Теломерные районы ДНК (теломеры) представляют собой концевые участки хромосом, не несущие смысловой нагрузки, которые состоят из повторяемых гексаповторов TTAGGG, имеющих тандемное расположение и идентичных для всех позвоночных [1, 8]. При делении клетки в результате концевой недорепликации ДНК вновь синтезированная сестринская хроматида становится короче, и происходит это за счет потери теломерных повторов [9]. Укорочение теломер является ограничением к безостановочному делению клеток, поэтому длина теломер определяет репликативный потенциал клетки, а также является косвенным маркером ее репликативной истории. Короткие теломеры являются признаком «стареющих» клеток.The telomeric regions of DNA (telomeres) are the terminal sections of chromosomes that do not carry semantic load, which consist of repeat TTAGGG hexa repeats that have a tandem arrangement and are identical for all vertebrates [1, 8]. During cell division as a result of terminal under-replication of DNA, the newly synthesized sister chromatid becomes shorter, and this occurs due to the loss of telomeric repeats [9]. The shortening of telomeres is a limitation to non-stop cell division, therefore the length of the telomeres determines the replicative potential of the cell, and is also an indirect marker of its replicative history. Short telomeres are a sign of aging cells.

Длина теломер является одной из основных динамических функций жизнедеятельности клетки, и изучение таких изменений имеет важное фундаментальное и клиническое значение. Изменение длины теломер с возрастом и возможность ее регуляции имеют большое значение в изучении биологии старения и геронтологии [2, 6]. Достаточно широко используется измерение длины теломер в диагностике, оценке эффективности лечения и прогноза онкологических заболеваний, а также состояний, связанных с патологией иммунной системы [4, 13, 15]. Изучение теломер на клеточном уровне, изменения, связанные с делением клетки, имеют особое значение для понимания биологии старения, поскольку затрагивает процессы, определяющие продолжительность жизни клетки.The length of telomeres is one of the main dynamic functions of the cell’s life, and the study of such changes is of fundamental and clinical importance. Changing the length of telomeres with age and the possibility of its regulation are of great importance in the study of the biology of aging and gerontology [2, 6]. The measurement of telomere length is widely used in diagnostics, evaluating the effectiveness of treatment and prognosis of cancer, as well as conditions associated with the pathology of the immune system [4, 13, 15]. Studying telomeres at the cellular level, changes associated with cell division are of particular importance for understanding the biology of aging, since it affects the processes that determine the life span of a cell.

Измерение длины теломер стало рутинным методом благодаря разработке методики Flow-FISH-гибридизация in situ с анализом на проточном цитофлуориметре. Эта методика позволяет определять длину теломер в единичных клетках целевой популяции [11]. Измерение теломер в пролиферирующих клетках возможно несколькими способами. Наиболее простой - это выделение пролиферирующих клеток с помощью ДНК красителей, когда клетки в фазе S-G2-M имеют большее количество ДНК, что позволяет их дифференцировать по более высокому уровню флуоресценции по каналу светимости ДНК красителя [3]. Эта методика включена в метод Flow-FISH для измерения теломер, поэтому нет необходимости для отдельного сортинга пролиферирующих клеток. Однако этот метод позволяет определять длину теломер только в клетках, которые делились в момент исследования, и не учитывает клетки, которые поделились ранее.Measurement of telomere length has become a routine method thanks to the development of the Flow-FISH in situ hybridization technique with flow cytometer analysis. This technique allows one to determine the telomere length in single cells of the target population [11]. Measuring telomeres in proliferating cells is possible in several ways. The simplest one is the isolation of proliferating cells using DNA dyes, when cells in the S-G2-M phase have a larger amount of DNA, which allows them to be differentiated by a higher level of fluorescence according to the luminosity channel of the dye DNA [3]. This technique is included in the Flow-FISH method for measuring telomeres, so there is no need for a separate sorting of proliferating cells. However, this method allows you to determine the length of telomeres only in cells that were divided at the time of the study, and does not take into account cells that were previously shared.

Другой метод - это инкубирование живых клеток в растворе, содержащем бромдеоксиуридин (BrdU), который встраивается во вновь синтезируемые цепи ДНК. Затем добавляют анти-BrdU моноклональные антитела, меченные флуорохромом и анализируют на проточном цитофлуориметре. Это позволяет точно выделить все поделившиеся клетки, поскольку они содержат встроенный меченый нуклеотид независимо от времени исследования.Another method is the incubation of living cells in a solution containing bromodeoxyuridine (BrdU), which integrates into newly synthesized DNA strands. Then add anti-BrdU monoclonal antibodies labeled with fluorochrome and analyzed on a flow cytometer. This allows you to accurately select all shared cells, because they contain an integrated labeled nucleotide, regardless of the time of the study.

Еще одна методика, взятая авторами за прототип, позволяет выделить пролиферирующие клетки, используя витальный флуоресцентный краситель. Принцип метода заключается в окрашивании клеток витальным красителем, который прочно связывается с белками клетки, и после деления распределяется между дочерними клетками [14]. Неподелившиеся клетки имеют максимальную светимость по каналу флуоресценции витального красителя, а клетки, совершившие хотя бы одно деление, будут иметь уровень флуоресценции значительно ниже. Чтобы определить длину теломер в пролиферирующих клетках, нужно их сперва выделить из общей популяции, т.е. провести сортировку, например, на клеточном сортере, поскольку флуорохромы не выдерживают нагрева до 80°С, необходимого для проведения метода гибридизации in situ [3, 5, 14]. Этот метод, как и предыдущий, очень затратный и трудоемкий, требующий значительного количества времени и, помимо специального клеточного сортера, необходима подготовка большого количества клеток.Another technique taken by the authors as a prototype allows us to isolate proliferating cells using a vital fluorescent dye. The principle of the method is staining the cells with a vital dye that binds strongly to the proteins of the cell and after division it is distributed between daughter cells [14]. Unshared cells have a maximum luminosity along the fluorescence channel of the vital dye, and cells that have completed at least one division will have a much lower fluorescence level. To determine the telomere length in proliferating cells, they must first be distinguished from the general population, i.e. sort, for example, on a cell sorter, since fluorochromes cannot withstand heating to 80 ° C, which is necessary for the in situ hybridization method [3, 5, 14]. This method, like the previous one, is very costly and time-consuming, requiring a significant amount of time and, in addition to a special cell sorter, the preparation of a large number of cells is necessary.

Окраска клеток витальным красителем позволяет также определить точное количество совершенных клетками делений в культуре. После деления материнской клетки краситель равномерно распределяется между дочерними клетками, которые имеют уровень флуоресценции в два раза ниже, что повторяется с каждым новым делением. По количеству пиков флуоресценции витального красителя можно определить количество клеточных делений [7].Staining the cells with a vital dye also makes it possible to determine the exact number of cell divisions perfect in the culture. After the division of the mother cell, the dye is evenly distributed between daughter cells, which have a fluorescence level two times lower, which is repeated with each new division. By the number of fluorescence peaks of the vital dye, the number of cell divisions can be determined [7].

Авторами был проведен ряд опытов, в которых было показано, что витальный краситель CFSE не выдерживает нагрева до 80°С в формамиде, и после гибридизации in situ невозможно определить количество делений по количеству раздельных пиков по каналу флуоресценции CFSE. Существуют способы для сохранения флуорохрома на клетке при нагревании до 80°С, один из которых - это использование специального химического вещества BS3 (Bis(sulfosuccinimidyl)suberat), который используется в методе Flow-FISH для дифференцировании клеток по поверхностным антигенам [12]. Основываясь на этом методе, было предположено, что использование BS3 будет способствовать сохранению витального красителя на клетке после нагрева до 80°С, что позволит одномоментно определять длину теломер и количество совершенных делений в культурах пролиферирующих клеток.The authors conducted a series of experiments in which it was shown that the vital dye CFSE does not withstand heating to 80 ° C in formamide, and after in situ hybridization it is impossible to determine the number of divisions by the number of separate peaks from the CFSE fluorescence channel. There are ways to preserve fluorochrome on the cell when heated to 80 ° C, one of which is the use of a special chemical BS3 (Bis (sulfosuccinimidyl) suberat), which is used in the Flow-FISH method to differentiate cells by surface antigens [12]. Based on this method, it was suggested that the use of BS3 will help preserve the vital dye on the cell after heating to 80 ° C, which will simultaneously determine the telomere length and the number of perfect divisions in the cultures of proliferating cells.

Целью изобретения является создание способа одномоментного определения длины теломер в клетках с известным количеством совершенных делений.The aim of the invention is to provide a method for simultaneously determining the length of telomeres in cells with a known number of perfect divisions.

Способ заключается в том, что клетки дифференцируют по количеству совершенных делений с помощью витального красителя по градуальному снижению уровня его флуоресценции. Одномоментно с этим, без процедуры предварительного выделения целевой пролиферирующей популяции клеток из общей популяции, применяют метод flow-FISH (гибридизация in situ) для определения длины теломер в клетках, дифференцированных по количеству совершенных делений и поверхностному маркеру. Процедуры производят с участием кросслинкера аминогрупп Bis(sulfosuccinimidyl)suberat(BS3).The method consists in the fact that cells are differentiated by the number of perfect divisions using a vital dye according to the gradual decrease in its fluorescence level. At the same time, without the procedure for preliminary isolation of the target proliferating cell population from the general population, the flow-FISH method (in situ hybridization) is used to determine the telomere length in cells, differentiated by the number of perfect divisions and surface marker. The procedures are performed with the participation of the crosslinker amino groups Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3).

Способ позволяет определить длину теломер на уровне единичной клетки с помощью гибридизации in situ, а также определить количество делений, совершенных этой клеткой in vitro с последующим анализом на проточном цитофлуориметре.The method allows to determine the telomere length at the level of a single cell using in situ hybridization, as well as to determine the number of divisions performed by this cell in vitro, followed by analysis on a flow cytometer.

Это делает метод более доступным, значительно увеличивает информативность и производительность, сокращает время исследования и финансовые затраты.This makes the method more accessible, significantly increases the information content and productivity, reduces research time and financial costs.

Описание способа с примерами конкретной реализацииDescription of the method with examples of specific implementation

Исследуемые клетки окрашивают витальным красителем CFSE (Molecular probes, USA) с конечной концентрацией 2µМ в RPMI 1640 15 минут, затем отмывают в RPMI с 10% FCS (HyClone, UK). После этого клетки культивируют in vitro.Test cells were stained with vital CFSE stain (Molecular probes, USA) with a final concentration of 2 µM in RPMI 1640 for 15 minutes, then washed in RPMI with 10% FCS (HyClone, UK). After that, the cells are cultured in vitro.

После культивирования клетки отмывают в ЗФР с 0,1% БСА (Sigma, США) (ЗФР-БСА) и метят биотинилированными антителами против целевого антигена. Инкубируют 20 минут, отмывают ЗФР-БСА и добавляют стрептавидин, меченный флуорохромом, и инкубируют 20 минут. После отмывки добавляют раствор BS³ 4 мМ (Bis(sulfosuccnimidyl)suberat, Pierce, USA) 30 минут при 37°С [12]. Затем добавляют Tris (Sigma, США) в конечной концентрации 20 мМ, инкубируют 15 минут и отмывают ЗФР-БСА. Осадок ресуспендируют в 300 мкл гибридизационного раствора, состоящего из 70% формамида (Sigma, США), 20 мМ Tris и 1% БСА. Зонд PNA комплиментарный теломерной последовательности ДНК и меченный флуорохромом (Bio-Synthesis, Inc., USA), добавляют в концентрации 0,3 мкг/мл [10]. Параллельно ставят пробу с контрольными клетками, которые используют как стандарт гибридизации. Пробы нагревают 10 минут при 80°С и гибридизуют 3 часа при +20°С. Затем клетки переносят в пробирки для цитометрии, дважды отмывают раствором 70% формамида и однократно ЗФР-БСА + 0,1% Tween. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл ЗФР-БСА. Анализ проб проводят на проточном цитофлуориметре. По параметрам прямого и бокового светорассеивания выделяют регион лимфоцитов, в котором определяют позитивные клетки по CD4 антигену по каналу флуоресценции используемого флуорохрома. Из позитивного региона строят гистограмму по сигналу флуоресценции витального красителя CFSE, на которой будут видны пики распределения клеток по количеству прошедших делений. На данной гистограмме пик с наиболее высокой флуоресценцией определяет неподелившееся клетки, а с минимальной флуоресценцией клетки, совершившие максимальное количество делений. После выделения популяции клеток с нужным количеством делений строят гистограмму по флуоресценции флуорохрома Су3, которым мечен PNA зонд, комплиментарный теломерной ДНК.After cultivation, the cells are washed in PBS with 0.1% BSA (Sigma, USA) (PBS-BSA) and labeled with biotinylated antibodies against the target antigen. Incubated for 20 minutes, washed with PBS-BSA and added streptavidin labeled with fluorochrome, and incubated for 20 minutes. After washing, a BS ³ 4 mM solution (Bis (sulfosuccnimidyl) suberat, Pierce, USA) was added for 30 minutes at 37 ° C [12]. Then Tris (Sigma, USA) was added at a final concentration of 20 mM, incubated for 15 minutes and washed with PBS-BSA. The pellet was resuspended in 300 μl of a hybridization solution consisting of 70% formamide (Sigma, USA), 20 mM Tris and 1% BSA. A PNA probe complementary to the telomeric DNA sequence and fluorochrome-labeled (Bio-Synthesis, Inc., USA) was added at a concentration of 0.3 μg / ml [10]. At the same time, they put a test with control cells, which are used as a hybridization standard. Samples are heated for 10 minutes at 80 ° C and hybridized for 3 hours at + 20 ° C. Then the cells are transferred to cytometry tubes, washed twice with a solution of 70% formamide and once PBS-BSA + 0.1% Tween. The precipitate was resuspended in 0.5 ml PBS-BSA. Sample analysis is carried out on a flow cytometer. According to the parameters of direct and lateral light scattering, a region of lymphocytes is distinguished, in which positive cells are determined by the CD4 antigen by the fluorescence channel of the used fluorochrome. A histogram is constructed from the positive region according to the fluorescence signal of the vital dye CFSE, on which peaks of the distribution of cells by the number of past divisions will be visible. In this histogram, the peak with the highest fluorescence determines the unshared cells, and with the minimum fluorescence, the cells that made the maximum number of divisions. After isolating a population of cells with the required number of divisions, a histogram is constructed using the fluorescence of Su3 fluorochrome, which is used to label a PNA probe complementary to telomeric DNA.

Длину теломер в клетках определяют как средний уровень флуоресценции клеток по каналу флурохрома Су3 после гибридизации в присутствии PNA зонда за вычетом фоновой (аутофлуоресценции) клеток, прошедших те же условия в отсутствие PNA зонда. Отношение показателя средней длины теломер в клетках к показателю контрольных клеток отражает среднюю длину теломер относительно контрольных клеток.The length of the telomeres in cells is defined as the average level of cell fluorescence by the Su3 fluorochrome channel after hybridization in the presence of a PNA probe minus the background (autofluorescence) of cells that underwent the same conditions in the absence of a PNA probe. The ratio of the average length of telomeres in cells to the indicator of control cells reflects the average length of telomeres relative to control cells.

Ниже приведен пример, поясняющие данный способ определения относительной средней длины теломер в пролиферирующих клетках.The following is an example explaining this method for determining the relative average length of telomeres in proliferating cells.

Пример. Определение изменения длины теломер с каждым новым делением в субпопуляциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов человека в культуре in vitro за 7 суток в ответ на активацию анти-СD3 моноклональными антителами.Example. Determination of changes in telomere length with each new division in a subpopulation of human CD4 + and CD8 + lymphocytes in vitro for 7 days in response to activation of anti-CD3 monoclonal antibodies.

От 6 доноров 5 мл периферической крови, стабилизированной гепарином, стерильно центрифугируют в градиенте фиколл-верографина в течение 20 минут при 3 тыс. об/мин, после чего кольцо мононуклеарных клеток собирают и отмывают дважды с 5 мл стерильного забуференного физиологического раствора (ЗФР) по 5 минут при 1 тыс.об/мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл ЗФР и подсчитывают количество клеток в камере Горяева.From 6 donors, 5 ml of heparin-stabilized peripheral blood is centrifuged sterilely in a ficoll-verographin gradient for 20 minutes at 3 thousand rpm, after which the ring of mononuclear cells is collected and washed twice with 5 ml of sterile buffered saline solution (PBS). 5 minutes at 1 thousand rpm. The pellet was resuspended in 1 ml PBS and the number of cells in the Goryaev chamber was counted.

Лимфоциты окрашивают витальным красителем CFSE и культивируют в 24 луночных планшетах в CO₂ инкубаторе 5% СО₂ 7 суток в количестве 2 млн на 1 мл полной среды (RPMI, FCS 10%, глютамин 0,3 мг/мл, гентамицин 50 мкг/мл, тиенам 25 мкг/мл) с добавлением анти-СD3 антител 1 мкг/мл (МедБиоСпектр, Россия) и ИЛ-2 100 ед/мл (Биотех, Россия). После 7 суток клетки собирают и проводят гибридизацию in situ используя мышиные анти-СD4 и анти-CD8 биотинилированные антитела (Becton Dickinson, США). Гибридизацию in situ проводят с PNA зондом, комплиментарным теломерной последовательности ДНК (СССТАА)₃, меченным флуорохромом Су3 (Bio-Synthesis, Inc., USA) с конечной концентрацией 0,3 мкг/мл [10]. За контрольные клетки были взяты мышиные спленоциты линии C57B L/6 (Питомник «Рассвет», г.Томск). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения Cell Quest^PRO (Becton Dickinson, США). После выделения гейта лимфоцитов по прямому и боковому светорассеиванию выделяли клетки, позитивные по CD4+ (или CD8+) антигену, из которых определяли количество пиков по каналу флуоресценции витального красителя CFSE (Рисунок 1). Было определено, что за 7 суток клетки совершили максимально 7 делений. Из каждого гейта, соответствующего определенному количеству совершенных лимфоцитами делений, была определена средняя длина теломер путем определения уровня флуоресценции по каналу светимости зонда PNA-Су3; дополнительно была измерена средняя длина теломер в спленоцитах, как контрольных клетках, с использованием аналогичного зонда (Рисунок 2). Были определены относительные длины теломер в неподелившихся клетках и клетках, прошедших от 1 до 7 делений по субпопуляциям CD4+ (CD8+) лимфоцитов. Из Рисунка 3 видно, что неподелившиеся клетки имеют самые короткие теломеры, а при делении происходит постепенное удлинение теломер с пиком на 3 делении для CD4+ лимфоцитов и на 4-5 делений для CD8+ лимфоцитов. Было определено, что при культивировании in vitro после активации лимфоцитов aнти-CD3 антителами происходит удлинение теломер, с большим значением для CD8+ клеток. Полученные данные свидетельствуют о значительном влиянии активации и культивирования in vitro на молекулярные изменения в лимфоцитах.Lymphocytes are stained with CFSE vital dye and cultured in 24 well plates in a CO ₂ incubator of 5% CO ₂ 7 days in an amount of 2 million per 1 ml of complete medium (RPMI, FCS 10%, glutamine 0.3 mg / ml, gentamicin 50 μg / ml , thienam 25 μg / ml) with the addition of anti-CD3 antibodies 1 μg / ml (MedBioSpektr, Russia) and IL-2 100 units / ml (Biotech, Russia). After 7 days, cells were harvested and in situ hybridization was performed using murine anti-CD4 and anti-CD8 biotinylated antibodies (Becton Dickinson, USA). In situ hybridization was carried out with a PNA probe complementary to the telomere DNA sequence (CCSTAA) ₃ labeled with Cy3 fluorochrome (Bio-Synthesis, Inc., USA) with a final concentration of 0.3 μg / ml [10]. The control cells were taken mouse splenocytes line C57B L / 6 (Nursery "Dawn", Tomsk). The analysis was performed on a FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, USA) using Cell Quest ^PRO software (Becton Dickinson, USA). After isolation of the lymphocyte gate by direct and lateral light scattering, cells positive for the CD4 + (or CD8 +) antigen were isolated, from which the number of peaks was determined by the fluorescence channel of the vital dye CFSE (Figure 1). It was determined that in 7 days the cells completed a maximum of 7 divisions. From each gate corresponding to a certain number of divisions performed by lymphocytes, the average telomere length was determined by determining the level of fluorescence by the luminosity channel of the PNA-Cy3 probe; additionally, the average telomere length in splenocytes was measured as control cells using a similar probe (Figure 2). The relative lengths of telomeres were determined in unshared cells and cells that had passed from 1 to 7 divisions by subpopulations of CD4 + (CD8 +) lymphocytes. It can be seen from Figure 3 that unshared cells have the shortest telomeres, and during division, telomeres with a peak at 3 divisions for CD4 + lymphocytes and 4-5 divisions for CD8 + lymphocytes gradually lengthen. It was determined that during in vitro cultivation after activation of anti-CD3 lymphocytes by antibodies, elongation of telomeres occurs, with a high value for CD8 + cells. The data obtained indicate a significant effect of activation and in vitro culture on molecular changes in lymphocytes.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности применения метода для измерения средней длины теломер в клетках в зависимости от количества пройденных ими делений. Значительным преимуществом этого метода является одномоментное разделение клеток по количеству совершенных делений, поверхностному маркеру и определение в них средней длины теломер.Thus, the results obtained indicate the possibility of using the method for measuring the average length of telomeres in cells, depending on the number of divisions passed by them. A significant advantage of this method is the simultaneous separation of cells according to the number of perfect divisions, surface marker and determination of the average telomere length in them.

Источники информацииInformation sources

Claims

A method for measuring the telomere length in cells, differentiated by the number of perfect divisions using a vital dye according to the gradual decrease in its fluorescence level, using the flow-FISH method (in situ hybridization) and subsequent analysis on a flow cytometer, characterized in that the telomere length is measured in proliferating cells of the general population simultaneously with their differentiation by the number of divisions and differentiation by surface marker, for which the crosslinker of amino groups Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) is used.