RU2322453C2 - Antibodies raised against protein related to human parathyroid hormone - Google Patents

Antibodies raised against protein related to human parathyroid hormone Download PDF

Info

Publication number
RU2322453C2
RU2322453C2 RU2002124875/13A RU2002124875A RU2322453C2 RU 2322453 C2 RU2322453 C2 RU 2322453C2 RU 2002124875/13 A RU2002124875/13 A RU 2002124875/13A RU 2002124875 A RU2002124875 A RU 2002124875A RU 2322453 C2 RU2322453 C2 RU 2322453C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
chain
antibody
region
dna
human
Prior art date
Application number
RU2002124875/13A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2002124875A (en
Inventor
Кох САТО (JP)
Кох САТО
Юдзи ВАКАХАРА (JP)
Юдзи ВАКАХАРА
Наохиро ЙАБУТА (JP)
Наохиро ЙАБУТА
Original Assignee
Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чугаи Сейяку Кабусики Кайся filed Critical Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Publication of RU2002124875A publication Critical patent/RU2002124875A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2322453C2 publication Critical patent/RU2322453C2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, oncology, endocrinology, pharmacy.
SUBSTANCE: invention relates to an agent used in prophylaxis or treatment of patients suffering from anorexia and containing antibody raised against protein relates to the human parathyroid hormone (PTHrP) as an active component. Agent can comprise antibody raised against human PTHrP wherein antibody can represent human, humanized or chimeric one and shows the low antigenicity. Using the proposed agent provides improving a patient state suffering from malignant tumor.
EFFECT: valuable medicinal properties of agent.
6 cl, 6 tbl, 10 ex

Description

Настоящее изобретение относится к химерному антителу человека/мыши, содержащему вариабельную область (V-область) моноклонального антитела мыши против белка, родственного паращитовидному гормону, и константную область (С-область) антитела человека; к очеловеченному антителу, в котором гипервариабельные участки, V-областей легкой цепи (L-цепь) и тяжелой цепи (Н-цепь) моноклонального антитела мыши против белка, родственного паращитовидному гормону (PTHrP), трансплантированы в антитело человека; к L- и Н-цепям указанного антитела, а также к полипептиду, который имеет V-область, состоящую из L- или Н-цепи указанного антитела.The present invention relates to a human / mouse chimeric antibody comprising a variable region (V region) of a monoclonal mouse antibody against a parathyroid hormone protein and a constant region (C region) of a human antibody; to a humanized antibody in which hypervariable regions of the light chain V regions (L chain) and heavy chain (H chain) of a mouse monoclonal antibody against a parathyroid hormone related protein (PTHrP) are transplanted into a human antibody; to the L and H chains of the indicated antibodies, as well as to the polypeptide that has a V region consisting of the L or H chains of the indicated antibodies.

Настоящее изобретение относится также к ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую вышеуказанное антитело, в частности, его V-область, и к ДНК, кодирующей L- или Н-цепь, образующую V-область. Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантному вектору, содержащему данную ДНК, и к хозяину, трансформированному указанным вектором.The present invention also relates to DNA containing a base sequence encoding the aforementioned antibody, in particular its V region, and to DNA encoding an L or H chain forming the V region. The present invention further relates to a recombinant vector containing this DNA and to a host transformed with said vector.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения химерных и очеловеченных антител против PTHrP. Настоящее изобретение далее относится к фармацевтической композиции и лекарственному средству для подавления гиперкальциемии или улучшения при гипофосфатемии, которое содержит антитело против PTHrP в качестве активного ингредиента.In addition, the present invention relates to methods for producing chimeric and humanized antibodies against PTHrP. The present invention further relates to a pharmaceutical composition and a medicament for suppressing hypercalcemia or improving hypophosphatemia, which contains an anti-PTHrP antibody as an active ingredient.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Гиперкальциемия, обусловленная злокачественной опухолью, является серьезным осложняющим симптомом, обнаруженным у 5-20% всех субъектов, имеющих злокачественную опухоль. Это считается терминальным симптомом злокачественной опухоли и неизбежно ведет к смерти субъекта при отсутствии соответствующего лечения. Контролирование гиперкальциемии может в значительной степени повлиять на прогноз и качество жизни субъекта, поэтому его назначение очень велико.Hypercalcemia due to a malignant tumor is a serious complicating symptom found in 5-20% of all subjects with a malignant tumor. This is considered a terminal symptom of a malignant tumor and inevitably leads to the death of the subject in the absence of appropriate treatment. Controlling hypercalcemia can significantly affect the prognosis and quality of life of the subject, so its purpose is very large.

Как правило, гиперкальциемию у субъектов, имеющих злокачественную опухоль, можно грубо классифицировать как гуморальную гиперкальциемию злокачественного заболевания (ННМ), возникающую под воздействием опухолеобразующих гуморальных факторов резорбции костной ткани, и как локальную остеолитическую гиперкальциемию (LOH), возникающую в результате местного воздействия опухоли, перенесенной или инфильтрованной в костную ткань. Считается, что в случае гуморальной гиперкальциемии злокачественного заболевания, содержание потока кальция повышается из-за резорбции костной ткани или из-за остеолизации, ведущих к гиперкальцемии в сочетании с ухудшением способности почек выводить кальций (S.Wada and N.Nagata, Internal Medicine, 69, 644-648).As a rule, hypercalcemia in subjects with a malignant tumor can be roughly classified as humoral hypercalcemia of malignant disease (HNM), which occurs under the influence of tumor-forming humoral factors of bone resorption, and as local osteolytic hypercalcemia (LOH), resulting from local exposure to a tumor transferred or infiltrated into bone tissue. In the case of malignant humoral hypercalcemia, it is believed that calcium flow increases due to bone resorption or due to osteolysis leading to hypercalcemia combined with impaired renal ability to excrete calcium (S. Wada and N. Nagata, Internal Medicine, 69 , 644-648).

Симптомы гиперкальциемии обычно проявляютя при концентрации кальция в сыворотке более 12 мг/мл; хотя ее неспецифические симптомы, такие как анорексия (отсутствие аппетита), тошнота и рвота, наблюдаются уже на ранней стадии злокачественного заболевания. По мере развития гиперкальциемии у субъекта снижается способность концентрировать воду вследствие поражения почечных периферических канальцев, что ведет к повышенному выделению мочи (полиурии), при этом анорексия и тошнота сопровождаются обезвоживанием организма из-за недостаточного поглощения воды.Symptoms of hypercalcemia usually occur with a serum calcium concentration of more than 12 mg / ml; although its non-specific symptoms, such as anorexia (lack of appetite), nausea and vomiting, are already observed at an early stage of the malignant disease. As hypercalcemia develops, the subject's ability to concentrate water decreases due to damage to the renal peripheral tubules, which leads to increased excretion of urine (polyuria), while anorexia and nausea are accompanied by dehydration due to insufficient water absorption.

Мозелей Дж.М. и др. обнаружили, что одним из гуморальных факторов, вызывающих гуморальную гиперкальциемию злокачественного заболевания, является белок, родственный паращитовидному гормону (РТН) (далее определяется как "PTHrP") (Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1987) 8-4, 5048-5052).Moseli J.M. et al. found that one of the humoral factors causing humoral hypercalcemia of malignant disease is a protein related to parathyroid hormone (PTH) (hereinafter referred to as “PTHrP”) (Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1987) 8- 4, 5048-5052).

Вслед за этим был выделен ген, кодирующий PTHrP (Suva L.J. et al.. Science (1987) 237, 893). Анализ этого гена показал наличие трех типов PTHrP человека, имеющих 139, 141 и 173 аминокислоты, вследствие поочередного сплайсинга этого гена, и присутствие в крови различных фрагментов в результате ограниченного расщепления PTHrP (1-139) с полной структурой (Baba, H., Clinical Calcium (1995)5,229-223). В PTHrP 8 аминокислот из N-концевых 13 аминокислот идентичны указанным аминокислотам паращитовидного гормона. Из этого следует, что аминокислотный сайт, соответствующий положениям 14-34, имеет пространственную структуру, которая также подобна паращитовидному гормону. Таким образом, PTHrP и РТН связываются с общим рецептором РТН/PTHrP по крайней мере в N-концевой области (Jueppner, H. et al., Science (1991) 254, 1024-1026; Abou-Samra, A-B. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1992) 89, 2732-2736.Following this, a gene encoding PTHrP was isolated (Suva L.J. et al .. Science (1987) 237, 893). Analysis of this gene showed the presence of three types of human PTHrP having 139, 141 and 173 amino acids, due to the sequential splicing of this gene, and the presence of various fragments in the blood as a result of limited cleavage of PTHrP (1-139) with a complete structure (Baba, H., Clinical Calcium (1995) 5,229-223). In PTHrP, 8 amino acids from the N-terminal 13 amino acids are identical to the indicated amino acids of the parathyroid hormone. It follows that the amino acid site corresponding to positions 14-34 has a spatial structure, which is also similar to the parathyroid hormone. Thus, PTHrP and PTH bind to the common PTH / PTHrP receptor in at least the N-terminal region (Jueppner, H. et al., Science (1991) 254, 1024-1026; Abou-Samra, AB. Et al, Proc . Natl. Acad. Sci., USA (1992) 89, 2732-2736.

Как известно, PTHrP продуцируется разными опухолевыми тканями, при этом установлено, что PTHrP вырабатывается не только в опухоли, но и в разных нормальных тканях начиная с плода и кончая взрослыми субъектами. К таким тканям относятся кожа, центральная нервная система, матка, плацента, молочные железы в период лактации, щитовидная железа, пара-щитовидная железа, надпочечник, печень, почки и мочевой пузырь (Burtis, W.J., Clin. Chem. (1992) 38, 2171-2183; Stew-art. A.F. & Broadus, A.E., J.Clin. Endocrmol. (1991)71, 1410-1414). Кроме того, считается, что PTHrP играет важную роль в метаболической регуляции кальция, содержание которого выше у плода и новорожденного, чем у матери.As you know, PTHrP is produced by different tumor tissues, while it was found that PTHrP is produced not only in the tumor, but also in different normal tissues from the fetus to adult subjects. Such tissues include the skin, central nervous system, uterus, placenta, mammary glands during lactation, the thyroid gland, parathyroid gland, adrenal gland, liver, kidneys and bladder (Burtis, WJ, Clin. Chem. (1992) 38, 2171-2183; Stew-art. AF & Broadus, AE, J. Clin. Endocrmol. (1991) 71, 1410-1414). In addition, it is believed that PTHrP plays an important role in the metabolic regulation of calcium, the content of which is higher in the fetus and newborn than in the mother.

Известно, что рецепторы РТН/PTHrP находятся главным образом в костях и почках (C.Shigeno, Clinical Calcium (1995) 5, 355-359) и активируют несколько систем внутриклеточной передачи сигналов путем связывания PTHrP с рецепторами. Одним из них является аденилатциклаза, а другим - фосфолипаза С. Активация аденилатциклазы увеличивает концентрацию внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (уАМФ), активирующего протеинкиназу А. Фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфонат с образованием инозитол-1,4,5-трифосфоната и диацилглицерола. В указанных системах передачи сигналов используется G-белок (Coleman, D.T. et al., Biochemical mechanisms of parathyroid hormone action. In: "The parathyroids" (Bilezikian, J.P. et al), Raven Press, New York (1994) 239).PTH / PTHrP receptors are known to be found mainly in bones and kidneys (C. Shigeno, Clinical Calcium (1995) 5, 355-359) and activate several intracellular signaling systems by binding PTHrP to receptors. One of them is adenylate cyclase, and the other is phospholipase C. Activating adenylate cyclase increases the concentration of intracellular cyclic adenosine monophosphate (uAMP), activating protein kinase A. Phospholipase C cleaves phosphatidylinositol-4,5-bisphosphonate to form inositol-1,4,5-trifolisulfonate . In these signaling systems, G-protein is used (Coleman, D.T. et al., Biochemical mechanisms of parathyroid hormone action. In: "The parathyroids" (Bilezikian, J.P. et al), Raven Press, New York (1994) 239).

Под воздействием этих систем передачи сигналов PTHrP вызывает гиперкальциемию и гипофосфатемию, снижает способность резорбцию фосфата почками, увеличивает выделения уАМФ почками и определяет другие подобные процессы, которые имеют место в случае гиперкальциемии злокачественного заболевания (ННМ).Under the influence of these signaling systems, PTHrP causes hypercalcemia and hypophosphatemia, reduces the ability of phosphate resorption by the kidneys, increases the excretion of uAMP by the kidneys, and determines other similar processes that occur in the case of hypercalcemia of malignant disease (HMN).

Таким образом, установлено, что PTHrP имеет непосредственное отношение к гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью. Для лечения гиперкальциемии, связанной со злокачественной опухолью, используют кальцитонин, стероидные средства, индометацин, неорганические соли фосфата, бифосфонаты и тому подобные средства, а также средства для восполнения жидкости. Однако для указанных средств характерно снижение эффективности при длительном применении, возникновение серьезных побочных эффектов и медленное проявление их фармакологического действия, поэтому необходимы новые лекарственные средства, обладающие более сильным терапевтическим действием и менее выраженными побочными эффектами.Thus, it was found that PTHrP is directly related to hypercalcemia caused by a malignant tumor. For the treatment of hypercalcemia associated with a malignant tumor, calcitonin, steroidal agents, indomethacin, inorganic phosphate salts, bisphosphonates and the like, as well as liquid replenishing agents are used. However, these drugs are characterized by a decrease in effectiveness with prolonged use, the occurrence of serious side effects and the slow manifestation of their pharmacological action, therefore, new drugs with a stronger therapeutic effect and less pronounced side effects are needed.

Кукрейя С.С. и др. (Kukreja, S.C. et al.) сообщили, что для лечения гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью, они использовали нейтрализующую антисыворотку против PTHrP. При введении этой антисыворотки бестимусным мышам, которым были трансплантированы клетки рака легкого или гортани человека, вызывающего гиперкальциемию, наблюдалось снижение содержания кальция в крови и уровня уАМФ в моче (J.Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802). Каньи Сато и др. сообщили, что при введении антитела против PTHrP (1-34) "голым" мышам, которым была имплантирована PTHrP-продуцирующая опухоль человека, симптомы гиперкальциемии стали менее выраженными и срок жизни мышей существенно увеличился (J.Bone &. Mine. Res. (1993) 8, 849-860). Далее, в открытой публикации заявки на патент Японии №4-228089 описываются химерные антитела мыши/человека против PTHrP человека (1-34).Kukreya S.S. et al. (Kukreja, S.C. et al.) reported that they used a neutralizing antiserum against PTHrP to treat hypercalcemia due to a malignant tumor. When this antiserum was administered to athymic mice that had transplanted human lung or laryngeal cancer cells causing hypercalcemia, a decrease in blood calcium and urinary uAMP levels was observed (J. Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802). Kanyi Sato et al. Reported that administration of an anti-PTHrP antibody (1-34) to “nude” mice implanted with a human PTHrP-producing tumor, the symptoms of hypercalcemia became less pronounced and the lifespan of mice significantly increased (J.Bone &. Mine Res. (1993) 8, 849-860). Further, Japanese Patent Application Publication No. 4-228089 discloses chimeric mouse / human antibodies against human PTHrP (1-34).

Моноклональные антитела мыши оказывают в организме человека сильное иммуногенное действие (иногда оно определяется как "антигенное"), что ограничивает использование моноклональных антител для лечения людей. Например, антитело мыши, введенное человеку, может быть метаболизировано как чужеродное вещество; поэтому период полувыведения антитела мыши из организма человека является относительно коротким, и оно не оказывает требуемого действия. Кроме того, повышение уровня вырабатывающихся в организме человека антител против мыши (НАМА), при введении антител мыши может вызвать иммунные реакции, которые неприемлемы или опасны для пациента, например, сывороточные болезни и другие аллергические реакции. Поэтому моноклональные антитела мыши часто непригодны для введения людям.Mouse monoclonal antibodies have a strong immunogenic effect in the human body (sometimes referred to as "antigenic"), which limits the use of monoclonal antibodies to treat humans. For example, a mouse antibody administered to humans can be metabolized as a foreign substance; therefore, the half-life of mouse antibodies from the human body is relatively short, and it does not have the desired effect. In addition, an increase in the level of anti-mouse antibodies (NAMAs) produced in the human body with the introduction of mouse antibodies can cause immune reactions that are unacceptable or dangerous for the patient, for example, serum diseases and other allergic reactions. Therefore, mouse monoclonal antibodies are often unsuitable for administration to humans.

Чтобы решить эти проблемы, были разработаны методы, направленные на снижение иммуногенности нечеловеческих антител, в частности, моноклональных антител мыши. Одним из таких методов является создание химерного антитела, в котором вариабельная область (V-область) выделена из моноклонального антитела мыши и константная область (С-область) выделена из соответствующего антитела человека.To solve these problems, methods have been developed aimed at reducing the immunogenicity of non-human antibodies, in particular, mouse monoclonal antibodies. One such method is the creation of a chimeric antibody in which the variable region (V region) is isolated from a monoclonal mouse antibody and the constant region (C region) is isolated from the corresponding human antibody.

Поскольку полученное химерное антитело имеет интактную вариабельную область исходного антитела мыши, можно ожидать, что данное химерное антитело будет связываться с антигеном с той же специфичностью, что и исходное антитело мыши. Кроме того, такое химерное антитело имеет значительно меньшую часть аминокислотной последовательности, полученной у животного; из вышесказанного следует, что иммуногенность этого антитела должна быть ниже по сравнению с исходным антителом мыши. Хотя химерное антитело связывается со своим антигеном подобно исходному моноклональному антителу мыши, характеризуясь при этом более низкой иммуногенностью, некоторые иммунные реакции на вариабельную область мыши по-прежнему могут иметь место (LoBuglip, A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).Since the resulting chimeric antibody has an intact variable region of the original mouse antibody, it can be expected that this chimeric antibody will bind to the antigen with the same specificity as the original mouse antibody. In addition, such a chimeric antibody has a significantly smaller portion of the amino acid sequence obtained from the animal; from the above it follows that the immunogenicity of this antibody should be lower compared to the original mouse antibody. Although a chimeric antibody binds to its antigen similar to the original mouse monoclonal antibody, while being less immunogenic, some immune responses to the variable region of the mouse may still occur (LoBuglip, AF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4220-4224, 1989).

Второй метод уменьшения иммуногенности антител мыши является более сложным, но, как считается, позволяет еще больше снизить потенциальную иммуногенность антител мыши. В соответствии с этим методом в вариабельную область человека трансплантируют только гипервариабельный участок (CDR) вариабельной области антитела мыши с целью создания реконструированной вариабельной области человека. При необходимости в вариабельную область человека можно трансплантировать частичную аминокислотную последовательность каркасной области (FR), содержащей гипервариабельные участки в вариабельной области антитела мыши, с целью создания структуры гипервариабельных участков в реконструированной вариабельной области человека, которая ближе структуре исходного антитела мыши.The second method of reducing the immunogenicity of mouse antibodies is more complex, but is believed to further reduce the potential immunogenicity of mouse antibodies. According to this method, only the hypervariable region (CDR) of the variable region of the mouse antibody is transplanted into the human variable region in order to create a reconstructed human variable region. If necessary, a partial amino acid sequence of the framework region (FR) containing the hypervariable regions in the variable region of the mouse antibody can be transplanted into the human variable region to create a structure of the hypervariable regions in the reconstructed human variable region, which is closer to the structure of the original mouse antibody.

Затем эти очеловеченные реконструированные вариабельные области человека соединяют с константными областями человека. В окончательно реконструированном очеловеченном антителе чужеродными аминокислотными последовательностями являются только гипервариабельные участки и очень небольшая часть каркасной области. Гипервариабельные участки состоят из гипервариабельной аминокислотной последовательности и не имеют каких-либо видоспецифичных последовательностей. Поэтому очеловеченное антитело, содержащее гипервариабельные участки мыши, обладает не более сильной иммуногенностью, чем натуральное антитело человека, содержащее гипервариабельные участки человека.Then, these humanized reconstructed variable regions of the person are connected to the constant regions of the person. In a finally reconstructed humanized antibody, only hypervariable regions and a very small part of the framework region are foreign amino acid sequences. Hypervariable regions consist of a hypervariable amino acid sequence and do not have any species-specific sequences. Therefore, a humanized antibody containing hypervariable regions of a mouse has no stronger immunogenicity than a natural human antibody containing hypervariable regions of a human.

Использование очеловеченных антител рассматривается в следующих ссылках: Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. et al. Protein Engng, 4, 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; German, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol, 148, 1149-1154, 1992 and Sato, К. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.The use of humanized antibodies is discussed in the following references: Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. et al. Protein Engng, 4, 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; German, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio / Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol, 148, 1149-1154, 1992 and Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

Хотя считается, что очеловеченные антитела должны быть полезны для лечебных целей, в вышеуказанных ссылках отсутствуют какие-либо упоминания об очеловеченном антителе против PTPrH. Кроме того, до сих пор не разработан стандартизированный метод, который мог быть применен к любым антителам для получения очеловеченных антител; поэтому существует необходимость в создании эффективных методов получения очеловеченного антитела, характеризующегося достаточной активностью связывания и нейтрализации специфического антигена (см., например, Sato, К. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993).Although it is believed that humanized antibodies should be useful for therapeutic purposes, in the above references there is no mention of a humanized anti-PTPrH antibody. In addition, a standardized method has not yet been developed that could be applied to any antibody to produce humanized antibodies; therefore, there is a need to create effective methods for producing a humanized antibody, characterized by sufficient binding activity and neutralization of a specific antigen (see, for example, Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993).

Краткое изложение существа изобретенияSummary of the invention

Объектом настоящего изобретения является химерное антитело человека/мыши, содержащее вариабельную область (V-область) моноклонального антитела мыши против PTPrH и константную область (С-область) антитела человека; очеловеченное антитело, в котором гипервариабельные участки V-областей легкой цепи (L-цепи) и тяжелой цепи (Н-цепи) моноклонального антитела мыши против PTPrH трансплантированы в антитело человека; L- и Н-цепи указанного антитела, а также полипептид, содержащий V-область, состоящую из L- или Н-цепи указанного антитела.An object of the present invention is a human / mouse chimeric antibody comprising a variable region (V region) of a mouse anti-PTPrH monoclonal antibody and a constant region (C region) of a human antibody; a humanized antibody in which hypervariable portions of the V regions of the light chain (L chain) and heavy chain (H chain) of the anti-PTPrH mouse monoclonal antibody are transplanted into a human antibody; The L and H chains of the indicated antibodies, as well as the polypeptide containing the V region, consisting of the L or H chains of the indicated antibodies.

Другим объектом настоящего изобретения является получение ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую вышеуказанное антитело, в частности, его V-область, и ДНК, кодирующей L- или Н-цепь, содержащего полипептида, содержащего V-область. Еще одним объектом настоящего изобретения является создание рекомбинантного вектора, содержащего указанную ДНК, и хозяина, трансформированного указанным вектором. Еще одним объектом настоящего изобретения являются способы получения химерных и очеловеченных антител против PTPrH. Еще одним объектом настоящего изобретения является получение антитела против PTPrH, обладающего сильной нейтрализующей активностью. Еще одним объектом настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции и средства для подавления гиперкальциемии, или улучшения при гипофосфатемии и алкалозе содержащего антитело или очеловеченное антитело против PTPrH в качестве активного ингредиента.Another object of the present invention is to provide DNA containing a base sequence encoding the above antibody, in particular its V region, and DNA encoding an L or H chain containing a polypeptide containing the V region. Another object of the present invention is the creation of a recombinant vector containing the specified DNA, and the host transformed with the specified vector. Another object of the present invention are methods for producing chimeric and humanized antibodies against PTPrH. Another object of the present invention is to provide an antibody against PTPrH having strong neutralizing activity. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and agent for suppressing hypercalcemia, or improving hypophosphatemia and alkalosis containing an antibody or humanized anti-PTPrH antibody as an active ingredient.

В результате всестороннего исследования, направленного на достижение вышеуказанных целей, авторами настоящего изобретения было получено антитело с низкой иммуногенностью моноклональных антител мыши против PTPrH в организме человека; так было завершено данное изобретение.As a result of a comprehensive study aimed at achieving the above goals, the authors of the present invention obtained an antibody with low immunogenicity of mouse monoclonal antibodies against PTPrH in the human body; thus completed the invention.

Объектом настоящего изобретения является химерная L-цепь, содержащая С-область L-цепи антитела человека и V-область L-цепи моноклонального антитела мыши против PTPrH. V-область L-цепи содержит одну аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №45, и С-область L-цепи включает Сλ-область.The object of the present invention is a chimeric L chain containing the C region of the L chain of a human antibody and the V region of the L chain of a monoclonal mouse antibody against PTPrH. The V region of the L chain contains one amino acid sequence expressed by the sequence with identification No. 45, and the C region of the L chain includes the Cλ region.

Объектом настоящего изобретения является также химерная Н-цепь, содержащая С-область Н-цепи антитела человека и V-область Н-цепи моноклонального антитела мыши против PTPrH. V-область Н-цепи содержит аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №46, и С-область включает Сγ 1-область.The object of the present invention is also a chimeric H chain containing the C region of the H chain of a human antibody and the V region of the H chain of a monoclonal mouse antibody against PTPrH. The V region of the H chain contains the amino acid sequence expressed by the sequence with identification no. 46, and the C region includes the Cγ 1 region.

Кроме того, объектом настоящего изобретения является химерное моноклональное антитело против PTPrH, содержащее указанную химерную L-цепь и указанную химерную Н-цепь.In addition, an object of the present invention is a chimeric monoclonal anti-PTPrH antibody comprising said chimeric L chain and said chimeric H chain.

Объектом настоящего изобретения далее является полипептид, имеющий V-область L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит каркасные области 1-4 V-области L-цепи антитела человека и гипервариабельные участки 1-3 V-области L-цепи моноклонального антитела мыши против PTPrH. Гипервариабельные участки 1-3 содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№59-61; каркасные области 1-3 получены из каркасных областей 1-3 антитела человека HSU03868 и каркасная область 4 получена из каркасной области 4 антитела человека S25755; или каркасные области 1-3 по существу идентичны каркасным областям 1-3 антитела человека HSU03868, и каркасная область 4 по существу идентична каркасной области 4 антитела человека S25755.The object of the present invention is further a polypeptide having the V region of the L chain of a humanized antibody, which contains frame regions 1-4 of the V region of the L chain of a human antibody and hypervariable regions 1-3 of the V region of the L chain of the monoclonal mouse anti-PTPrH antibody. Hypervariable sites 1-3 contain amino acid sequences expressed respectively by sequences with identification No. 59-61; frame regions 1–3 were obtained from frame regions 1–3 of the human antibody HSU03868 and frame region 4 was obtained from the frame region 4 of human antibody S25755; or framework regions 1-3 are substantially identical to framework regions 1-3 of human antibody HSU03868, and framework region 4 is substantially identical to framework region 4 of human antibody S25755.

Термин "по существу идентичный" означает, что каркасные области антитела человека, используемые в очеловеченном антителе, могут иметь делеции, замены и/или добавления аминокислот, необходимые для образования гипервариабельных участков моноклонального антитела мыши, в результате чего очеловеченное антитело должно обладать активностью, которая эквивалентна активности моноклонального антитела мыши.The term “substantially identical” means that the framework regions of a human antibody used in a humanized antibody may have deletions, substitutions and / or additions of amino acids necessary for the formation of hypervariable regions of a monoclonal mouse antibody, whereby the humanized antibody must have an activity that is equivalent to mouse monoclonal antibody activity.

Таким образом, настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, в которой 36-я и 49-я аминокислоты в каркасных областях в соответствии с рекомендациями Кабата (Kabat, E.A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) являются соответственно тирозиновой и аспарагиновой кислотой.Thus, the present invention relates to a polypeptide having a V region of the L chain of a humanized antibody, in which the 36th and 49th amino acids in the frame regions according to the recommendations of Kabat (Kabat, EA et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) are tyrosine and aspartic acid, respectively.

Настоящее изобретение относится также к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит аминокислотную последовательность, выраженную любой последовательностью с идентификационными №№48-51.The present invention also relates to a polypeptide having the V region of the L chain of a humanized antibody, which contains an amino acid sequence expressed by any sequence with identification No. 48-51.

Настоящее изобретение далее относится к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, где 45-я и 87-я аминокислоты в каркасных областях в соответствии с рекомендациями Кабата являются соответственно лизином и изолейцином.The present invention further relates to a polypeptide having a V region of the L chain of a humanized antibody, wherein the 45th and 87th amino acids in the framework regions according to the recommendations of Kabat are lysine and isoleucine, respectively.

Настоящее изобретение далее относится к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит аминокислотную последовательность, выраженную любой последовательностью с идентификационными №№52-55.The present invention further relates to a polypeptide having the V region of the L chain of a humanized antibody, which contains an amino acid sequence expressed by any sequence with identification No. 52-55.

Настоящее изобретение далее относится к полипептиду, имеющему V-область Н-цепи очеловеченного антитела, которая содержит каркасные области 1-4 V-области Н-цепи V-области антитела человека и гипервариабельные участки 1-3 V-области Н-цепи V-области моноклонального антитела мыши против PTPrH человека. Гипервариабельные участки 1-3 содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№62-64, каркасные области 1-4 выделены из каркасных областей 1-4 антитела человека, относящегося к человеческой подгруппе III (HSG III, Kabat, E.A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991), в частности, из каркасных областей 1-4 антитела человека S31679 соответственно, или они по существу идентичны каркасным областям 1-4 антитела человека S31679, соответственно.The present invention further relates to a polypeptide having a humanized antibody H chain V region, which comprises frame regions 1-4 of the human antibody V region H chain V region and 1-3 hypervariable regions of the V chain H chain V region mouse monoclonal antibody against human PTPrH. Hypervariable regions 1-3 contain amino acid sequences expressed respectively by sequences with identification Nos. 62-64; framework regions 1-4 are isolated from framework regions 1-4 of a human antibody belonging to human subgroup III (HSG III, Kabat, EA et al. , US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991), in particular, from the framework regions 1-4 of the human antibody S31679, respectively, or they are essentially identical to the framework regions 1-4 of the human antibody S31679, respectively.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему V-область Н-цепи очеловеченного антитела, которая содержит аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №56.In addition, the present invention relates to a polypeptide having the V region of the H chain of a humanized antibody, which contains the amino acid sequence expressed by the sequence with identification No. 56.

Настоящее изобретение относится также к L-цепи очеловеченного антитела против PTHrP человека, которая содержит полипептид, имеющий V-область L-цепи указанного очеловеченного антитела, и полипептид, имеющий С-область L-цепи антитела человека. С-область включает Сλ-область, каркасные области 1-3 по существу идентичны каркасным областям 1-3 антитела человека HSU03868, каркасная область 4 по существу идентична каркасной области 4 антитела человека S25755, и аминокислотные последовательности гипервариабельных участков 1-3 выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№59-61.The present invention also relates to the L chain of a humanized anti-human PTHrP antibody, which comprises a polypeptide having an L chain V region of said humanized antibody and a polypeptide having a human antibody L chain C region. The C region includes a Cλ region, framework regions 1-3 are substantially identical to framework regions 1-3 of the human antibody HSU03868, framework region 4 is substantially identical to framework region 4 of the human antibody S25755, and the amino acid sequences of the hypervariable regions 1-3 are expressed respectively by sequences with Identification No. 59-61.

Настоящее изобретение далее относится к Н-цепи очеловеченного антитела против PTHrP человека, которая содержит полипептиды, имеющие С-область Н-цепи и V-область Н-цепи указанного антитела человека. С-область включает Сγ 1-область, каркасные области 1-4 выделены из каркасных области 1-4 антитела человека, относящегося к HSGIII, и гипервариабельные области 1-3 содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№62-64.The present invention further relates to the H chain of a humanized anti-human PTHrP antibody, which comprises polypeptides having an H chain C region and an H chain V region of said human antibody. The C region includes the Cγ 1 region, framework regions 1-4 are isolated from the framework regions 1-4 of a human HSGIII antibody, and the hypervariable regions 1-3 contain amino acid sequences expressed respectively by sequences with identification Nos. 62-64.

Настоящее изобретение далее относится к антителу против PTHrP со слабой антигенностью и высокой нейтрализующей активностью. Антитело против PTHrP включает антитело человека, очеловеченное антитело, химерное антитело и приматированное антитело, которые можно использовать для лечения заболеваний человека. Указанное антитело характеризуется низкой константой диссоциации. Кроме того, антитело по настоящему изобретению обладает высокой нейтрализующей активностью благодаря низкой константе диссоциации, поэтому его можно использовать для лечения заболеваний человека.The present invention further relates to an anti-PTHrP antibody with low antigenicity and high neutralizing activity. An anti-PTHrP antibody includes a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, and a primal antibody that can be used to treat human diseases. The specified antibody is characterized by a low dissociation constant. In addition, the antibody of the present invention has a high neutralizing activity due to the low dissociation constant, so it can be used to treat human diseases.

Антитело по настоящему изобретению имеет константу диссоциации, равную 1,86×10-7 [М] или меньше, константу скорости диссоциации, равную 1,22×10-1 [1/сек] или меньше, и константу скорости ассоциации, равную 6,55×104 [1/М.сек] или больше. Эти константы можно измерить с помощью анализа Скатчарда, используя меченные радиоактивным изотопом лиганды или резонансный сенсор поверхностного плазмона.The antibody of the present invention has a dissociation constant of 1.86 × 10 -7 [M] or less, a dissociation rate constant of 1.22 × 10 -1 [1 / s] or less, and an association rate constant of 6, 55 × 10 4 [1 / M.sec] or more. These constants can be measured using Scatchard analysis using ligands labeled with a radioactive isotope or a resonant surface plasmon sensor.

Настоящее изобретение далее относится к ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи или V-область Н-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека. V-область L-цепи и V-область Н-цепи содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№45-46;The present invention further relates to DNA containing a base sequence encoding the V region of an L chain or the V region of an H chain of a mouse anti-human PTHrP monoclonal antibody. The V region of the L chain and the V region of the H chain contain amino acid sequences expressed respectively by sequences with identification Nos. 45-46;

ДНК, кодирующая V-область L-цепи, содержит, например, последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №65, и ДНК, кодирующая V-область Н-цепи, содержит последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №57.DNA encoding the V region of the L chain contains, for example, a base sequence expressed by a sequence with identification No. 65, and DNA encoding a V region of an H chain contains a base sequence expressed by a sequence with identification No. 57.

Настоящее изобретение далее относится к ДНК, кодирующей указанную химерную L- или Н-цепь. ДНК, кодирующая L-цепь, содержит, например, последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №65, и ДНК, кодирующая Н-цепь, содержит последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №57.The present invention further relates to DNA encoding said chimeric L or H chain. DNA encoding an L chain contains, for example, a base sequence expressed by an identification sequence of No. 65, and DNA encoding an H chain contains a base sequence expressed by an identification sequence of No. 57.

Настоящее изобретение относится также к ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи или V-область Н-цепи указанного очеловеченного антитела. ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи, выражена любой последовательностью с идентификационными №№66-74, и ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую V-область Н-цепи, выражена последовательностью с идентификационным №58.The present invention also relates to DNA containing a base sequence encoding the V region of an L chain or the V region of an H chain of said humanized antibody. DNA containing a base sequence encoding the V region of the L chain is expressed by any sequence with identification Nos. 66-74, and DNA containing a base sequence encoding the V region of the L chain is expressed by a sequence with identification No. 58.

Настоящее изобретение относится также к ДНК для V-области L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, выраженную любой последовательностью с идентификационными №№47-55. Указанная ДНК содержит последовательность оснований, выраженную одной из последовательностей с идентификационными №№66-74.The present invention also relates to DNA for the V region of the L chain of a humanized antibody, which contains a base sequence encoding the amino acid sequence expressed by any sequence with identification No. 47-55. The specified DNA contains a sequence of bases expressed in one of the sequences with identification No. 66-74.

Настоящее изобретение далее относится к ДНК для V-области Н-цепи очеловеченного антитела, которая кодирует аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №56. Указанная ДНК содержит последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №58.The present invention further relates to DNA for the V region of the H chain of a humanized antibody, which encodes the amino acid sequence expressed by the sequence with identification No. 56. The specified DNA contains a sequence of bases, expressed by a sequence with identification No. 58.

Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантному вектору, содержащему любые указанные ДНК.The present invention further relates to a recombinant vector containing any of these DNAs.

Настоящее изобретение относится также к трансформанту, преобразованному с помощью указанного рекомбинантного вектора.The present invention also relates to a transformant converted using the indicated recombinant vector.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения химерного или очеловеченного антитела против белка, родственного паращитовидному гормону человека, который включает: культивирование указанного трансформанта и выделение из полученной культуры химерного или очеловеченного антитела против белка, родственного паращитовидному гормону человека.In addition, the present invention relates to a method for producing a chimeric or humanized anti-protein related to human parathyroid hormone, which comprises: culturing said transformant and isolating from the resulting culture a chimeric or humanized anti-protein related to human parathyroid hormone.

Настоящее изобретение далее относится к фармацевтической композиции или средству, предназначенному для подавления гиперкальциемии или улучшения при гипофосфатемии, которые содержат указанное антитело в качестве активного ингредиента. Кальциемия возникает вследствие злокачественного заболевания и гипофосфатемия часто наблюдается у субъектов, страдающих гиперкальциемией, обусловленной злокачественной опухолью. Таким образом, антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения злокачественной опухоли или ослабления симптомов гиперкальциемии или гипофосфатемии. Злокачественная ткань может включать, но не ограничиваться, по крайней мере одной, выбранной из группы рака поджелудочной железы, легкого, глотки, гортани, языка, десны, пищевода, желудка, желчных протоков, молочной железы, почек, мочевого пузыря, матки и предстательной железы, а также злокачественной лимфомы. Средство по настоящему изобретению, предназначенное для подавления гиперкальциемии, можно использовать в случае любого злокачественного заболевания, вызывающего гиперкальциемию.The present invention further relates to a pharmaceutical composition or agent for the suppression of hypercalcemia or improvement in hypophosphatemia, which contain the specified antibody as an active ingredient. Calcemia occurs due to a malignant disease, and hypophosphatemia is often observed in subjects suffering from malignant hypercalcemia. Thus, the antibody of the present invention can be used to treat a malignant tumor or relieve symptoms of hypercalcemia or hypophosphatemia. Malignant tissue may include, but is not limited to, at least one selected from the group of cancer of the pancreas, lung, pharynx, larynx, tongue, gum, esophagus, stomach, bile ducts, breast, kidney, bladder, uterus, and prostate as well as malignant lymphoma. The agent of the present invention for suppressing hypercalcemia can be used in the case of any malignant disease that causes hypercalcemia.

Подробно настоящее изобретение будет описано ниже.The present invention will be described in detail below.

1. Получение моноклональных антител мыши против PTHrP человека1. Obtaining monoclonal mouse antibodies against human PTHrP

Моноклональные антитела мыши против PTHrP человека можно получить путем создания гибридом в результате слияния миеломных клеток и антителообразующих клеток, выделенных у животных, иммунизированных антигеном, и выбора из полученных гибридом клонов, продуцирующих антитела, которые специфически ингибируют активность PTHrP.Mouse monoclonal antibodies against human PTHrP can be obtained by creating hybridomas by fusion of myeloma cells and antibody-forming cells isolated from animals immunized with an antigen and selecting from the resulting hybridomas clones producing antibodies that specifically inhibit PTHrP activity.

(1) Получение антигенов(1) Obtaining antigens

PTHrP, используемый для иммунизации животных, включает пептиды, содержащие всю или часть аминокислотной последовательности PTHrP, полученного с помощью технологии получения рекомбинантных ДНК или химического синтеза, и PTHrP, выделенного из супернатантов раковых клеток, вызывающих гиперкальциемию. Например, в качестве антигена можно использовать пептид [PTHrP(1-34)], содержащий аминокислоты 1-34 известного PTHrP (Kemp, B.E. et al., Science (1987) 238, 1568-1570). PTHrP (1-34) человека имеет аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №75.PTHrP used to immunize animals includes peptides containing all or part of the amino acid sequence of PTHrP obtained using recombinant DNA technology or chemical synthesis, and PTHrP isolated from supernatants of cancer cells causing hypercalcemia. For example, a peptide [PTHrP (1-34)] containing amino acids 1-34 of the known PTHrP (Kemp, B.E. et al., Science (1987) 238, 1568-1570) can be used as an antigen. Human PTHrP (1-34) has an amino acid sequence expressed by a sequence with identification No. 75.

Полученный PTHrP присоединяют к белку-носителю, такому как тироглобулин, с последующим добавлением адъюванта. Можно смешивать любой адъювант, включая полные и неполные адъюванты Фрейнда.The resulting PTHrP is coupled to a carrier protein such as thyroglobulin, followed by the addition of an adjuvant. You can mix any adjuvant, including complete and incomplete Freund's adjuvants.

(2) Иммунизация и выделение антителообразующих клеток(2) Immunization and isolation of antibody-forming cells

Полученный выше антиген вводят млекопитающему, такому как мышь, крыса, лошадь, обезьяна, кролик, коза или овца. Иммунизацию можно осуществлять любыми известными методами, включая внутривенные, подкожные и внутрибрюшинные инъекции. Временные интервалы между инъекциями с целью иммунизации не имеют каких-либо конкретных ограничений и могут составлять от нескольких дней до нескольких недель, предпочтительно от 4 дней до 21 дня.The antigen obtained above is administered to a mammal, such as a mouse, rat, horse, monkey, rabbit, goat or sheep. Immunization can be carried out by any known method, including intravenous, subcutaneous and intraperitoneal injections. The time intervals between injections for the purpose of immunization are not particularly limited and may range from several days to several weeks, preferably from 4 days to 21 days.

Через два или три дня после последней иммунизации выделяют антителообразующие клетки. Антителообразующими клетками являются клетки селезенки, лимфатического узла и периферической крови; причем обычно используют клетки селезенки. Однократная доза антигена, предназначенного для иммунизации, составляет 100 мкг/мышь.Two or three days after the last immunization, antibody-forming cells are secreted. Antibody-forming cells are cells of the spleen, lymph node and peripheral blood; usually using spleen cells. A single dose of antigen intended for immunization is 100 μg / mouse.

(3) Определение титров антител(3) Determination of antibody titers

Чтобы определить уровни иммунной реакции иммунизированных животных и выбрать представляющие интерес гибридомы из клеток, подвергнутых слиянию, измеряют титр антител в крови иммунизированного животного или титр антител в супернатанте антителообразующих клеток.In order to determine the immune response levels of immunized animals and to select hybridomas of interest from the cells fused, the antibody titer in the blood of the immunized animal or the antibody titer in the supernatant of the antibody-forming cells is measured.

Методы детектирования антител хорошо известны и включают иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммунный анализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).Antibody detection methods are well known and include enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

(4) Слияние клеток(4) Cell fusion

Миеломные клетки, используемые для слияния с антителообразующими клетками, включают линии клеток, которые получают у разных животных, таких как мыши, крысы и человек, и, как правило, могут быть легко получены специалистами в этой области. Приемлемые линии клеток характеризуются лекарственной устойчивостью, неспособностью выживать в избирательной среде, такой как НАТ-среда, в несвязанном состоянии, и способностью выживать в указанной среде только в связанном состоянии. Обычно используют линии клеток, устойчивые к 8-азагуанину, у которых отсутствует гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза и которые не могут расти в гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой (HAT) среде.Myeloma cells used to fuse with antibody-forming cells include cell lines that are obtained from various animals, such as mice, rats and humans, and, as a rule, can be easily obtained by specialists in this field. Acceptable cell lines are characterized by drug resistance, the inability to survive in a selective medium, such as a NAT medium, in an unbound state, and the ability to survive in this medium only in a bound state. Usually, cell lines resistant to 8-azaguanine are used, which lack hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase and cannot grow in hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium.

Пригодными для использования миеломными клетками являются разные известные линии клеток, такие как Р3 (P3x63Ag8.653) (J.Immunl. (1979) 123:1548-1550); P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7); NS-1 (Kohler, G and Milstein, C., Eur. J.Immunol. (1976) 6:511-519); MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8:405-415); SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276:269-170); FO (de St. Groth, S.F. et al., J.Iinmunol. Methods (1980) 35:1-21); S194 (Trowbridge, I.S, J.Exp.Med. (1978) 148:313-323) и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277:131-133).Suitable myeloma cells are various known cell lines, such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immmunl. (1979) 123: 1548-1550); P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7); NS-1 (Kohler, G and Milstein, C., Eur. J. Immmunol. (1976) 6: 511-519); MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8: 405-415); SP2 / 0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-170); FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21); S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323) and R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133).

Антителообразующие клетки можно получить из клеток селезенки, лимфатического узла или подобных клеток. С этой целью у любого из вышеуказанных животных удаляют селезенку, лимфатический узел или другой орган и ткань измельчают. Полученный измельченный материал суспендируют в среде или буфере, таком как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) или RPMI1640, фильтруют через фильтр из нержавеющий стали или тому подобный и центрифугируют с получением требуемых антителообразующих клеток.Antibody-forming cells can be obtained from spleen cells, lymph nodes, or similar cells. For this purpose, the spleen, lymph node or other organ is removed from any of the above animals and the tissue is ground. The resulting ground material is suspended in a medium or buffer, such as phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's Modified Eagle’s medium (DMEM) or RPMI1640, filtered through a stainless steel filter or the like, and centrifuged to obtain the desired antibody-forming cells.

Затем указанные миеломные клетки и антителообразующие клетки подвергают слиянию.Then these myeloma cells and antibody-forming cells are subjected to fusion.

Слияние клеток можно осуществлять путем соединения миеломных и антителообразующих клеток в отношении от 1:1 до 1:10 в среде для культивирования животных клеток, такой как минимальная поддерживающая среда (MEM), DMEM или RPME-1640, в присутствии акселератора слияния при температуре 30-37°С в течение 1-15 минут. Для ускорения слияния клеток можно использовать любой акселератор слияния или вирус, такой как полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 1000-6000, поливиниловый спирт или вирус Сендай. Слияние антителообразующих и миеломных клеток можно также осуществлять в промышленно доступном аппарате для слияния клеток с использованием электрической стимуляции, такой как электропорация.Cell fusion can be accomplished by combining myeloma and antibody-forming cells in a ratio of 1: 1 to 1:10 in an animal cell culture medium, such as minimal support medium (MEM), DMEM or RPME-1640, in the presence of a fusion accelerator at a temperature of 30- 37 ° C for 1-15 minutes. To accelerate cell fusion, you can use any fusion accelerator or virus, such as polyethylene glycol with an average molecular weight of 1000-6000, polyvinyl alcohol or Sendai virus. The fusion of antibody-forming and myeloma cells can also be carried out in a commercially available apparatus for cell fusion using electrical stimulation, such as electroporation.

(5) Отбор и клонирование гибридом(5) Selection and cloning of hybridomas

Представляющие интерес гибридомы отбирают из клеток после слияния клеток, например, по методу селективного выращивание клеток в селективных средах.Hybridomas of interest are selected from cells after cell fusion, for example, by the selective growth of cells in selective media.

С этой целью суспензию клеток разводят в приемлемой среде и инокулируют на титрационном микропланшете. В каждую лунку добавляют селективную среду, такую как НАТ-среда, и инкубируют, периодически заменяя указанную селективную среду свежей средой.To this end, the cell suspension is diluted in an acceptable medium and inoculated on a microtiter plate. A selective medium, such as NAT medium, is added to each well and incubated, periodically replacing said selective medium with fresh medium.

Выращенные клетки собирают и используют в качестве гибридом.The grown cells are harvested and used as hybridomas.

Эти гибридомы затем исследуют посредством ограниченного разведения, клеточного сортера, активируемого флуоресценцией, или другим способом. И, наконец, получают гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело.These hybridomas are then examined by means of limited dilution, fluorescence activated cell sorter, or other method. And finally, hybridomas producing a monoclonal antibody are obtained.

(6) Выделение моноклональных антител(6) Isolation of monoclonal antibodies

Для получения моноклональных антител из полученных гибридом обычно используют способы культивирования клеток и образования асцита.To obtain monoclonal antibodies from the obtained hybridomas, cell culturing and ascites formation methods are usually used.

В соответствии со способом культивирования клеток, гибридомы культивируют в среде для выращивания животных клеток, такой как RPMI-1640, содержащая 10-20% сыворотки плода коровы, минимальная поддерживающая среда или бессывороточная среда, в приемлемых условиях (например, 37°С, 5% СО2) в течение 2-14 дней, после чего антитела выделяют из супернатанта.According to a cell cultivation method, hybridomas are cultured in an animal cell growth medium such as RPMI-1640 containing 10-20% of fetal bovine serum, minimal maintenance medium or serum-free medium, under acceptable conditions (e.g. 37 ° C, 5% CO 2 ) for 2-14 days, after which the antibodies are isolated from the supernatant.

В соответствии со способом образования асцита, гибридомы внутрибрюшинно инокулируют млекопитающему того же вида, который используют в качестве источника миеломных клеток, для достижения обильного роста гибридом. Через 1-4 недели получают асцит или сыворотку.According to the ascites formation method, hybridomas are intraperitoneally inoculated to a mammal of the same species that is used as a source of myeloma cells to achieve abundant hybridoma growth. After 1-4 weeks, ascites or serum is obtained.

Для получения очищенных антител используют отдельно или в сочетании такие известные способы, как осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию.Known methods such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography are used separately or in combination to obtain purified antibodies.

2. Конструирование химерных антител2. Construction of chimeric antibodies

(1) Клонирование ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую V-область моноклоналъного антитела мыши против PTHrP человека.(1) Cloning of DNA containing a base sequence encoding the V region of a monoclonal mouse antibody against human PTHrP.

(i) Получение мРНК(i) Obtaining mRNA

Чтобы клонировать ДНК, содержащую последовательность оснований, кодирующую V-область моноклонального антитела мыши против PTHrP человека, полученные гибридомы обрабатывают известным способом, например, гуанидин-ультрацентрифугированием (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) или методом AGPC (Chomczynski, P. et al., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156-159), с получением полной РНК, из которой выделяют мРНК, например, в разделительной колонке с олиго(тимидин)целлюлозным наполнителем, которая входят в набор для очистки мРНК (Pharmacia). Для получения мРНК можно также использовать набор для очистки мРНК Quick Prep (Pharmacia AB), при этом не нужно выделять полную РНК.To clone a DNA containing a base sequence encoding the V region of a mouse monoclonal antibody against human PTHrP, the resulting hybridomas are processed in a known manner, for example, by guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) or by AGPC (Chomczynski, P. et al., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156-159), to obtain complete RNA from which mRNA is isolated, for example, in a separation column with oligo (thymidine) cellulose excipient, which is included in the kit for purification of mRNA (Pharmacia). To prepare mRNA, you can also use the Quick Prep mRNA purification kit (Pharmacia AB), without the need to isolate complete RNA.

(ii) Получение и амплификация кДНК(ii) Obtaining and amplification of cDNA

Из полученной выше (i) мРНК синтезируют кДНК в V-областях L- и Н-цепей с использованием обратной транскриптазы. В процессе синтеза кДНК можно использовать затравку, такую как олиготимидин, или любую другую приемлемую затравку, которая гибридизирует с С-областью L- или Н-цепи, например, затравку МНС2, имеющую последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №1.From the above (i) mRNA, cDNAs are synthesized in the V regions of the L and H chains using reverse transcriptase. In the process of cDNA synthesis, a seed, such as oligothymidine, or any other suitable seed, which hybridizes to the C-region of the L or H chain, for example, a MHC2 seed, having a base sequence expressed as identity No. 1, can be used.

Для синтеза кДНК указанную мРНК и затравку смешивают и подвергают взаимодействию в присутствии обратной транскриптазы, например, при температуре 52°С в течение 30 минут.For cDNA synthesis, the indicated mRNA and seed are mixed and reacted in the presence of reverse transcriptase, for example, at a temperature of 52 ° C for 30 minutes.

Амплификацию кДНК как L-цепи, так и Н-цепи можно осуществлять путем полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) по методу 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nu-cleic Acids Res., 17, 2919-2932, 1989) с использованием набора 5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH Inc.). Таким образом, связывающий фрагмент Ampli FINDER (последовательность с идентификационным №42) присоединяют к 5' концу синтезированной выше кДНК и осуществляют полимеразную реакцию синтеза цепи в отношении ДНК, содержащей последовательности оснований, кодирующие V-области L- и Н-цепей. (ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи, далее иногда определяется как "ДНК для V-области L-цепи" или "ДНК, кодирующая V-область L-цепи". То же самое относится к V-области Н-цепи, С-области и т.д.).Amplification of cDNA of both the L chain and the H chain can be carried out by polymerase chain synthesis (PCR) according to the 5'-RACE method (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998- 9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nu-cleic Acids Res., 17, 2919-2932, 1989) using the 5'-Ampli FINDER RACE kit (CLONTECH Inc.). Thus, the Ampli FINDER binding fragment (sequence no. 42) is attached to the 5 ′ end of the cDNA synthesized above and a polymerase chain synthesis reaction is performed on DNA containing base sequences encoding the V regions of the L and H chains. (DNA containing the base sequence encoding the V region of the L chain is hereinafter sometimes referred to as “DNA for the V region of the L chain” or “DNA encoding the V region of the L chain.” The same applies to the V region H-chains, C-regions, etc.).

Приемлемой затравкой для амплификации ДНК, кодирующей V-область L-цепи, может быть, например, связывающая затравка (последовательность с идентификационным №2) и затравки, полученные из консервативных последовательностей в константной области Lλ-цепи (Сλ-область) антител мыши, такие как затравка MLC, имеющая последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №4. Приемлемой затравкой для амплификации ДНК, кодирующей V-область Н-цепи, может быть, например, связывающая затравка (последовательность с идентификационным №2) и затравка MHC-G1 (последовательность с идентификационным №3) (S.Т.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991).A suitable seed for amplification of DNA encoding the V region of the L chain can be, for example, a binding seed (sequence with identification No. 2) and seeds obtained from conserved sequences in the constant region of the Lλ chain (Cλ region) of mouse antibodies, such as a seed MLC having a base sequence, expressed as a sequence with identification No. 4. A suitable seed for amplification of DNA encoding the V region of the H chain may be, for example, a binding seed (sequence with identification No. 2) and seed MHC-G1 (sequence with identification No. 3) (S.T. Jones, et al. Biotechnology, 9, 88, 1991).

(iii) Очистка ДНК и определение последовательности оснований(iii) DNA purification and base sequence determination

Продукты полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) подвергают электрофорезу в агарозном геле известными способами с целью вырезания представляющих интерес фрагментов ДНК, которые затем выделяют, очищают и лигируют с векторной ДНК.The products of the polymerase chain synthesis reaction (PCR) are subjected to agarose gel electrophoresis by known methods to excise DNA fragments of interest, which are then isolated, purified and ligated with vector DNA.

Очистку ДНК можно осуществлять с помощью промышленно доступных наборов, таких как GENECLEAN II; BIО101. Векторная ДНК, несущая фрагменты ДНК, известна; с этой целью можно, например, использовать pUC19 или Bluescript.DNA purification can be performed using commercially available kits, such as GENECLEAN II; BIO101. Vector DNA carrying DNA fragments is known; for this purpose, for example, pUC19 or Bluescript can be used.

Указанную ДНК и векторную ДНК лигируют с помощью известного набора для лигирования (Takara Shuzo) с получением рекомбинантного вектора.The specified DNA and vector DNA are ligated using a known ligation kit (Takara Shuzo) to obtain a recombinant vector.

Полученный рекомбинантный вектор вводят в Escherichia coli JM109 и в устойчивые к ампициллину колонии; таким образом, векторную ДНК получают известным способом (J.Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). После расщепления векторной ДНК одним или несколькими рестрикционными ферментами, последовательность оснований требуемой ДНК определяют известным способом, таким как дидезокси способ (J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). При осуществлении настоящего изобретения можно использовать автоматическое устройство для определения последовательности оснований (секвенатор ДНК 373А; ABI Inc.).The resulting recombinant vector is introduced into Escherichia coli JM109 and into ampicillin-resistant colonies; thus, vector DNA is obtained in a known manner (J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). After digesting the vector DNA with one or more restriction enzymes, the base sequence of the desired DNA is determined in a known manner, such as the dideoxy method (J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). In the implementation of the present invention, you can use an automatic device for determining the sequence of bases (DNA sequencer 373A; ABI Inc.).

(iv) Гипервариабельный участок(iv) Hypervariable area

V-области Н- и L-цепи образуют антигенсвязывающий сайт, и их полные структуры обладают некоторым сходством. То есть, четыре участка каркасной области (FR) связаны тремя гипервариабельными участками (CDR). Аминокислотная последовательность в каркасной области является достаточно консервативной, в то время как аминокислотная последовательность гипервариабельного участка отличается высокой вариабельностью (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).The V regions of the H and L chains form an antigen binding site, and their complete structures have some similarities. That is, four regions of the framework region (FR) are linked by three hypervariable regions (CDR). The amino acid sequence in the framework region is quite conservative, while the amino acid sequence of the hypervariable region is highly variable (Kabat, E. A. et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Многие участки указанных четырех каркасных областей имеют β-складчатую структуру, вследствие чего три гипервариабельных участка образуют петлю. Гипервариабельный участок может иногда составлять часть β-складчатой структуры. Поэтому три гиперварибельных участка в пространственном отношении расположены очень близко друг к другу из-за указанной структуры каркасных областей, которые образуют антигенсвязывающий сайт вместе с тремя гипервариабельными участками в спаренных областях.Many sites of these four frame regions have a β-folded structure, as a result of which three hypervariable sites form a loop. The hypervariable region can sometimes form part of a β-folded structure. Therefore, three hypervariable sites are spatially located very close to each other due to the indicated structure of the frame regions that form the antigen-binding site together with three hypervariable sites in paired regions.

С учетом этих факторов гипервариабельные участки можно обнаружить путем сравнения аминокислотной последовательности в вариабельной области моноклонального антитела мыши против PTHrP человека с базой данных по структуре аминокислотных последовательностей для антител, полученных по методу Кабата и др. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983), с целью исследования их гомологии.Given these factors, hypervariable regions can be detected by comparing the amino acid sequence in the variable region of a mouse anti-human PTHrP monoclonal antibody with a database of the amino acid sequence structure for antibodies obtained by the method of Kabat et al. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept Health and Human Services, 1983), with the aim of studying their homology.

(2) Конструирование экспрессирующего вектора химерного антитела(2) Construction of an expression vector of a chimeric antibody

После клонирования фрагментов ДНК, кодирующей V-области L- и Н-цепи моноклонального антитела мыши (далее L- или Н-цепь антитела иногда определяется как "L-цепь мыши" и т.д. для антител мыши и "Н-цепь человека" и т.д. для антител человека), ДНК, кодирующие V-области мыши, и ДНК, кодирующие константные области антитела человека, лигируют и экспрессируют с получением химерных антител против PTHrP человека.After cloning fragments of DNA encoding the V regions of the L and H chains of a monoclonal mouse antibody (hereinafter, the L or H chain of an antibody is sometimes defined as the “mouse L chain”, etc. for mouse antibodies and the human H chain "etc. for human antibodies), DNA coding for mouse V regions and DNA coding for constant regions of a human antibody are ligated and expressed to produce chimeric anti-human PTHrP antibodies.

Стандартным способом получения химерных антител является лигирование лидерной последовательности мыши и последовательности V-области, присутствующей в клонированной кДНК, с последовательностью, кодирующей С-область антитела человека, которая уже имеется в экспрессирующем векторе клетки млекопитающего. Альтернативно, лидерную последовательность мыши и последовательность V-области, присутствующую в клонированной кДНК, лигируют с последовательностью, кодирующей С-область антитела человека, и затем лигируют с экспрессирующим вектором клетки млекопитающего.A standard method for producing chimeric antibodies is to ligate the mouse leader sequence and the V region sequence present in the cloned cDNA with a sequence encoding the C region of a human antibody that is already present in the mammalian cell expression vector. Alternatively, the mouse leader sequence and the V region sequence present in the cloned cDNA are ligated to the sequence encoding the C region of the human antibody, and then ligated to the mammalian cell expression vector.

Полипептид, содержащий С-область антитела человека, может представлять собой любые С-области Н- или L-цепи, включая, например, Сγ1, Сγ2, Сγ3 или Сγ4 для Н-цепей человека или Cλ или Сk для L-цепей.A polypeptide containing the C region of a human antibody can be any C region of an H or L chain, including, for example, Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 for human H chains or C λ or C k for L chains.

Чтобы получить химерное антитело, сначала конструируют два экспрессирующих вектора; то есть, экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующие V-область L-цепи мыши и С-область L-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система энхансер/промотор, и экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующие V-область Н-цепи мыши и С-область Н-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система энхансер/промотор. Затем клетки-хозяева, такие как клетки млекопитающих, котрансформируют с помощью этих экспрессирующих векторов, после чего трансформированные клетки культивируют in vitro или in vivo с целью получения химерного антитела (см., например, WO 91/16928).To obtain a chimeric antibody, two expression vectors are first constructed; that is, an expression vector containing DNA encoding a mouse L chain V region and a human L chain C region controlling expression of a region such as an enhancer / promoter system and an expression vector containing DNA encoding a V region The mouse H chains and the C region of the human H chain, under the control of an expression-regulating region, such as an enhancer / promoter system. Host cells, such as mammalian cells, are then co-transformed with these expression vectors, after which the transformed cells are cultured in vitro or in vivo to produce a chimeric antibody (see, for example, WO 91/16928).

Альтернативно лидерную последовательность мыши, имеющуюся в клонированной кДНК и ДНК, кодирующих V-область L-цепи мыши и С-область L-цепи человека, а также лидерную последовательность мыши и ДНК, кодирующие V-область Н-цепи мыши и С-область Н-цепи человека, вводят в один экспрессирующий вектор (см., например, WO 94/11523) и используют указанный вектор для трансформации клетки-хозяина; после чего трансформированную клетку-хозяина культивируют in vivo или in vitro с целью получения требуемого химерного антитела.Alternative mouse leader sequence present in the cloned cDNA and DNA encoding the mouse L chain V region and human L chain C region, as well as mouse leader sequence and DNA encoding the mouse H chain V region and C region H human chains are introduced into one expression vector (see, for example, WO 94/11523) and use the specified vector to transform the host cell; after which the transformed host cell is cultured in vivo or in vitro to obtain the desired chimeric antibody.

(i) Получение Н-цепи химерного антитела(i) Obtaining the H chain of a chimeric antibody

Вектор экспрессии Н-цепи химерного антитела можно получить путем введения кДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую V-область Н-цепи мыши (далее определяется так же как "кДНК для V-области Н-цепи"), в приемлемый экспрессирующий вектор, содержащий геномную ДНК с последовательностью оснований, кодирующей С-область Н-цепи антитела человека (далее определяется так же как "геномная ДНК для С-области Н-цепи"), или кДНК, кодирующую указанную область (далее определяется так же как "кДНК для С-области Н-цепи"). С-область Н-цепи включает, например, Сγ1, Сγ2, Сγ3 или Сγ4 области.The chimeric antibody H chain expression vector can be obtained by introducing a cDNA containing a base sequence encoding the mouse H chain V region (hereinafter, also referred to as “cDNA for the H chain V region”) into an acceptable expression vector containing genomic DNA with a base sequence encoding the C region of the H chain of a human antibody (hereinafter referred to as "genomic DNA for the C region of the H chain"), or cDNA encoding the specified region (hereinafter also defined as "cDNA for C H chain region "). The C region of the H chain includes, for example, Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 regions.

(i-a) Конструирование экспрессирующего вектора химерной Н-цепи, содержащего геномную ДНК, кодирующую С-область Н-цепи(i-a) Construction of an expression vector of a chimeric H chain containing genomic DNA encoding the C region of the H chain

Экспрессирующие векторы, содержащие геномную ДНК, кодирующую С-область Н-цепи, в частности, кодирующие Сγ1-область, включают, например, HEF-PMh-gγ1 (WO 91/19759) и DHFR-ΔE-RVh-PMl-f (WO 92/19759).Expression vectors containing genomic DNA encoding the C region of the H chain, in particular encoding the Cγ1 region, include, for example, HEF-PMh-gγ1 (WO 91/19759) and DHFR-ΔE-RVh-PMl-f (WO 92/19759).

После введения в эти экспрессирующие векторы кДНК, кодирующей V-область Н-цепи мыши, в указанную кДНК можно ввести соответствующую последовательность оснований способом полимеразной реакции синтеза цепи (PCR). Например, чтобы ввести в экспрессирующий вектор соответствующие последовательности оснований, полимеразную реакцию синтеза цепи можно осуществлять с помощью затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 5'-конца и согласованную последовательность Козака, расположенную непосредственно перед инициирующим кодоном, с целью повышения эффективности транскрипции, и затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 3'-конца и донорскую область, что необходимо для правильного сплайсинга первичных продуктов транскрипции геномной ДНК с целью получения мРНК, для введения указанных последовательностей оснований в экпрессирующий вектор.After the cDNA encoding the mouse H chain V region V region is introduced into these expression vectors, an appropriate base sequence can be introduced into the cDNA by the polymerase chain synthesis reaction (PCR). For example, in order to introduce the corresponding base sequences into the expression vector, the polymerase chain synthesis reaction can be carried out using PCR seed, which is designed to obtain cDNA containing the recognition sequence for an acceptable restriction enzyme at the 5'-end and a coordinated Kozak sequence located immediately before the initiating codon, in order to increase the efficiency of transcription, and seed for PCR, which is designed to obtain cDNA containing recognizing sequence for a suitable restriction enzyme at the 3'-end of the donor region and that is necessary for correct splicing the primary transcription products of the genomic DNA to produce mRNA for introducing said bases ekpressiruyuschy sequences in the vector.

После обработки сконструированной таким образом кДНК, кодирующей V-область Н-цепи мыши, одним или несколькими приемлемыми рестрикционными ферментами ее вставляют в указанный экспрессирующий вектор с целью создания экспрессирующего вектора химерной Н-цепи, содержащего геномную ДНК, кодирующую С-область Н-цепи (Cγ1-область).After processing the cDNA thus constructed encoding the mouse H chain V region with one or more suitable restriction enzymes, it is inserted into said expression vector to create an expression vector for the chimeric H chain containing genomic DNA encoding the C region of the H chain ( Cγ1 region).

(i-b) Конструирование экспрессирующего вектора химерной Н-цепи, содержащего кДНК с последовательностью оснований, кодирующей Н-цепь(i-b) Construction of an expression vector of a chimeric H chain containing cDNA with a base sequence encoding an H chain

Экспрессирующие векторы, содержащие кДНК, кодирующую С-область Н-цепи, такую как Cγ1-область, можно сконструировать следующим образом: мРНК получают из клеток яичника китайского хомячка, в которые вводят экспрессирующий вектор DHFR-ΔE-RVh-PMI-f (см. WO 91/19759), содержащий ДНК, кодирующую V-область Н-цепи очеловеченного антитела РМ1, и геномную ДНК С-области Н-цепи (Сγ1) антитела человека (N. Takahashi, et al., Cell, 29, 671-679 (1982)), и экспрессирующий вектор RVl-PM1a (см. WO91/19759), содержащий геномную ДНК, кодирующую V-область L-цепи очеловеченного антитела РМ1, и геномную ДНК С-области Lκ-цепи антитела человека; по методу RT-PCR клонируют кДНК, кодирующую V-область Н-цепи очеловеченного антитела РМ1, и кДНК, кодирующую С-область Н-цепи (Сγ1) антитела человека, и лигируют с экспрессирующим вектором животной клетки, который обрабатывают приемлемым рестрикционным ферментом, для конструирования желаемого экспрессирующего вектора.Expression vectors containing cDNA encoding an H chain C region, such as a Cγ1 region, can be constructed as follows: mRNA is obtained from Chinese hamster ovary cells into which the expression vector DHFR-ΔE-RVh-PMI-f is introduced (see WO 91/19759) containing DNA encoding the V region of the H chain of the humanized PM1 antibody and the genomic DNA of the C region of the H chain (Cγ1) of a human antibody (N. Takahashi, et al., Cell, 29, 671-679 (1982)), and the expression vector RVl-PM1a (see WO91 / 19759) containing genomic DNA encoding the V region of the L chain of the humanized antibody PM1, and the genomic DNA of the C region the Lκ chain of a human antibody; by RT-PCR, a cDNA encoding the V region of the H chain of the humanized PM1 antibody and a cDNA encoding the C region of the H chain (Cγ1) of a human antibody is cloned and ligated to an animal cell expression vector that is treated with an acceptable restriction enzyme to constructing the desired expression vector.

Когда кДНК, кодирующая V-область Н-цепи мыши, лигирована непосредственно с кДНК, кодирующей С-область Н-цепи (Сγ1) антитела человека, во фрагмент, содержащий кДНК, кодирующую V-область Н-цепи, можно ввести соответствующие последовательности оснований по методу PCR. Например, полимеразную реакцию синтеза цепи можно осуществить с помощью специальной затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 5'-конца и согласованную последовательность Козака, расположенную непосредственно перед инициирующим кодоном, с целью повышения эффективности транскрипции, и затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 3'-конца, что необходимо для прямого лигирования с С-областью Н-цепи (Сγ1) с целью введения указанных последовательностей оснований в указанную кДНК.When a cDNA encoding a mouse H chain V region V is ligated directly from a cDNA encoding a human antibody H chain C region (Cγ1), corresponding base sequences can be introduced into a fragment containing cDNA encoding a H chain V region PCR method. For example, the polymerase reaction of chain synthesis can be carried out using a special PCR primer, which is designed to obtain cDNA containing the recognition sequence for an acceptable restriction enzyme at the 5'-end and a coordinated Kozak sequence located immediately before the initiating codon, in order to increase transcription efficiency, and primers for PCR, which is designed to obtain cDNA containing the recognition sequence for an acceptable restriction enzyme at the 3'-end that Parts Required for direct ligation of the C region of an H chain (Sγ1) to introduce said base sequences into said cDNA.

Сконструированную таким образом кДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, обрабатывают одним или несколькими приемлемыми рестрикцинными ферментами, лигируют с кДНК, кодирующей С-область Н-цепи (Сγ1), и вставляют в экспрессирующий вектор, такой как pCOS1 или pCHO1, с целью создания экспрессирующего вектора, содержащего кДНК, кодирующую химерную Н-цепь.The cDNA thus constructed encoding the mouse H chain V region is treated with one or more suitable restriction enzymes, ligated to the cDNA encoding the H chain C region (Cγ1), and inserted into an expression vector such as pCOS1 or pCHO1, c the goal of creating an expression vector containing cDNA encoding a chimeric H chain.

(ii) Получение L-цепи химерного антитела(ii) Obtaining the L chain of the chimeric antibody

Вектор экспрессии L-цепи химерного антитела можно получить путем лигирования кДНК, кодирующей V-область L-цепи мыши, с геномной ДНК или кДНК, кодирующей С-область L-цепи антитела человека, и введения в приемлемый экспрессирующий вектор. С-область L-цепи включает, например, κ-цепь и λ-цепь.The chimeric antibody L chain expression vector can be obtained by ligating a cDNA encoding the mouse L chain V region with genomic DNA or cDNA encoding the human antibody L chain C region and introducing into an acceptable expression vector. The C region of an L chain includes, for example, a κ chain and a λ chain.

(ii-a) Конструирование экспрессирующего вектора, содержащего кДНК, кодирующую химерную Lλ-цепь(ii-a) Construction of an Expression Vector Containing cDNA Encoding a Chimeric Lλ Chain

Сконструировав экспрессирующий вектор, содержащий кДНК, кодирующую V-область L-цепи мыши, в указанный экспрессирующий вектор можно ввести соответствующие последовательности оснований по методу PCR. Например, полимеразную реакцию синтеза цепи можно осуществить с помощью специальной затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 5'-конца и согласованную последовательность Козака, с целью повышения эффективности транскрипции, и затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 3'-конца, что необходимо для введения указанных последовательностей оснований в указанную кДНК.By constructing an expression vector containing cDNA encoding the V region of the mouse L chain, appropriate base sequences can be introduced into the expression vector by PCR. For example, the polymerase chain synthesis reaction can be carried out using a special PCR primer, which is designed to obtain cDNA containing the recognition sequence for an acceptable restriction enzyme at the 5'-end and a coordinated Kozak sequence, in order to increase transcription efficiency, and the PCR primer, which is intended to obtain cDNA containing the recognition sequence for an acceptable restriction enzyme at the 3'-end, which is necessary for the introduction of these sequences basically cations in the specified cDNA.

Всю последовательность оснований кДНК, кодирующей С-область Lλ-цепи человека, можно синтезировать с помощью синтезатора ДНК и сконструировать по способу PCR. Известно, что С-область Lλ-цепи человека, имеет по крайней мере 4 разных изотипа, и каждый изотип можно использовать для создания экспрессирующего вектора. Например, на основании данных о гомологии с С-областями Lλ-цепи клонированных моноклональных антител мыши можно выбрать изотип Mcg+Ke+Oz-фрагмента С-области Lλ-цепи человека (№ Х57819) (P.Dariavach et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987) и использовать его для создания экспрессирующего вектора. Чтобы сконструировать кДНК для известной С-области Lλ-цепи человека, такой как Mcg+Ke+Oz-, можно использовать четыре нижеследующие затравки, выраженные последовательностями с идентификационными №№11-14: затравки MBC1HGP1 (последовательность с идентификационным №11) и MBC1HGP3 (последовательность с идентификационным №13) содержат смысловые последовательности ДНК, а затравки MBC1HGP2 (последовательность с идентификационным №12) и MBC1HGP4 (последовательность с идентификационным №14) содержат антисмысловые последовательности ДНК, причем каждая затравка имеет комплементарную последовательность длиной от 20 до 23 пар оснований у каждого конца.The entire cDNA base sequence encoding the C region of the human Lλ chain can be synthesized using a DNA synthesizer and constructed using the PCR method. It is known that the C region of a human Lλ chain has at least 4 different isotypes, and each isotype can be used to create an expression vector. For example, based on homology data with the C regions of the Lλ chain of the cloned monoclonal antibodies of the mouse, one can select the isotype of the Mcg + Ke + Oz fragment of the C region of the human Lλ chain (No. X57819) (P. Dariavach et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987) and use it to create an expression vector. In order to construct cDNA for a known human Lλ C region of a chain, such as Mcg + Ke + Oz-, the following four primers can be used, expressed by sequences with identification Nos. 11-14: MBC1HGP1 (sequence with ID 11) and MBC1HGP3 ( the sequence with identification No. 13) contains semantic DNA sequences, and the seeds MBC1HGP2 (sequence with identification No. 12) and MBC1HGP4 (sequence with identification No. 14) contain antisense DNA sequences, and each seed has a complementary sequence of 20 to 23 base pairs at each end.

MBC1HGPS (последовательность с идентификационным №15) и MBC1HGPR (последовательность с идентификационным №16) являются внешними затравками, имеют последовательности, гомологичные соответственно MBC1HGP1 и MBC1HGP4, и узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента. Произведя сборку четырех затравкок по методу PCR, синтезируют полную цепь кДНК и добавляют внешние затравки для амплификации кДНК.MBC1HGPS (sequence with identification No. 15) and MBC1HGPR (sequence with identification No. 16) are external seeds, have sequences homologous to MBC1HGP1 and MBC1HGP4, respectively, and a recognition sequence for an acceptable restriction enzyme. Having assembled four seeds using the PCR method, a complete cDNA strand is synthesized and external seeds are added to amplify the cDNA.

Сборку по способу PCR производят следующим образом: у MBC1HGP1 и MBC1HGP2 или MBC1HGP3 и MBC1HGP4 гибридизируют комплементарные последовательности, синтезируя фрагмент MBC1HGP1-MBC1HGP2 и фрагмент MBC1HGP3-MBC1HGP4, после чего у каждого фрагмента снова гибридизируют комплементарные последовательности, синтезируя кДНК, кодирующую непроцессированную С-область Lλ-цепи человека.PCR assembly is performed as follows: in MBC1HGP1 and MBC1HGP2 or MBC1HGP3 and MBC1HGP4, the complementary sequences are hybridized by synthesizing the MBC1HGP1-MBC1HGP2 fragment and the MBC1HGP3-MBC1HGP4 fragment, after which the L-coding sequence is synthesized, -chains of man.

Сконструированную таким образом кДНК, кодирующую С-область Lλ-цепи человека, и сконструированную выше кДНК, кодирующую V-область L-цепи мыши, можно лигировать между приемлемыми сайтами рестрикционных ферментов и вставить в экспрессирующий вектор, такой как pCOS1 или pCHO1, с целью создания экспрессирующего вектора, содержащего кДНК, кодирующую Lλ-цепь химерного антитела.Thus constructed cDNA encoding the C region of the human Lλ chain and constructed above cDNA encoding the V region of the mouse L chain can be ligated between acceptable restriction enzyme sites and inserted into an expression vector, such as pCOS1 or pCHO1, to create an expression vector containing cDNA encoding the Lλ chain of the chimeric antibody.

(ii-b) Конструирование экспрессирующего вектора, содержащего кДНК, кодирующую химерную Lκ-цепь(ii-b) Construction of an expression vector containing cDNA encoding a chimeric Lκ chain

Сконструировав экспрессирующий вектор, содержащий кДНК, кодирующую V-область L-цепи, в указанную кДНК можно ввести соответствующие последовательности оснований по способу PCR. Например, полимеразную реакцию синтеза цепи можно осуществить с помощью специальной затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 5'-конца и согласованную последовательность Козака, с целью повышения эффективности транскрипции, и затравки для PCR, которая предназначена для получения кДНК, содержащей узнающую последовательность для приемлемого рестрикционного фермента у 3'-конца, что необходимо для введения указанных последовательностей оснований в указанную кДНК.By constructing an expression vector containing cDNA encoding the V region of the L chain, corresponding base sequences can be introduced into said cDNA by the PCR method. For example, the polymerase chain synthesis reaction can be carried out using a special PCR primer, which is designed to obtain cDNA containing the recognition sequence for an acceptable restriction enzyme at the 5'-end and a coordinated Kozak sequence, in order to increase transcription efficiency, and the PCR primer, which is intended to obtain cDNA containing the recognition sequence for an acceptable restriction enzyme at the 3'-end, which is necessary for the introduction of these sequences basically cations in the specified cDNA.

ДНК, кодирующую С-область Lκ-цепи человека, которая предназначена для лигирования с ДНК, кодирующей V-область L-цепи мыши, можно сконструировать, например, из HEF-PM1k-gk, содержащей геномную ДНК (см. WO 92/19759).DNA encoding the C region of a human Lκ chain that is intended to be ligated with DNA encoding a mouse L chain V region V can be constructed, for example, from HEF-PM1k-gk containing genomic DNA (see WO 92/19759) .

Узнающие последовательности для приемлемых рестрикционных ферментов можно ввести по способу PCR в 5'- и 3'-концы ДНК, кодирующей С-область Lκ-цепи, и ДНК, кодирующую V-область L-цепи мыши, и ДНК, кодирующую С-область Lκ-цепи, можно лигировать друг с другом и вставить в экспрессирующий вектор, такой как pCOS1 или pCHO1, с целью создания экспрессирующего вектора, содержащего кДНК, кодирующую Lκ-цепь химерного антитела.Recognizing sequences for acceptable restriction enzymes can be introduced by PCR at the 5'- and 3'-ends of the DNA encoding the C region of the Lκ chain, and the DNA encoding the V region of the mouse L chain, and the DNA encoding the C region of Lκ -chains can be ligated with each other and inserted into an expression vector, such as pCOS1 or pCHO1, in order to create an expression vector containing cDNA encoding the Lκ chain of a chimeric antibody.

3. Получение очеловеченных антител3. Obtaining humanized antibodies

(1) Выявление гомологии с антителами человека(1) Identification of homology with human antibodies

Чтобы получить очеловеченное антитело, в котором гипервариабельный участок моноклонального антитела мыши трансплантирован в антитело человека, желательно, чтобы между каркасными областями многоклонального антитела мыши и антитела человека существовала значительная гомология. Поэтому необходимо произвести сравнение V-областей Н- и L-цепей моноклонального антитела мыши против PTHrP человека с V-областями всех известных антител, структуру которых определяют на основании банка данных по структуре белка. Кроме того, одновременно производят сравнение с подгруппами антител человека (HSG: человеческая подгруппа), классифицированными Кабатом и др., с учетом длины каркасной области антитела, гомологии аминокислот и тому подобного (Kabat, E.A. et al., US Dep.Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991).In order to obtain a humanized antibody in which the hypervariable region of a mouse monoclonal antibody is transplanted into a human antibody, it is desirable that significant homology exists between the framework regions of the mouse multiclonal antibody and the human antibody. Therefore, it is necessary to compare the V regions of the H and L chains of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP with the V regions of all known antibodies, the structure of which is determined on the basis of a database of protein structure. In addition, at the same time, comparisons are made with human antibody subgroups (HSG: human subgroup) classified by Kabat et al., Taking into account the length of the antibody framework region, amino acid homology, and the like (Kabat, EA et al., US Dep.Health and Human Services , US Government Printing Offices, 1991).

V-области Н-цепи человека можно отнести к одной из подгрупп HSG I-III на основании классификации Кабата и др., при этом V-области Н-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека характеризуются 82,7% гомологией с согласованной последовательностью подгруппы HSG III. С другой стороны, V-области Lλ-цепи человека можно отнести к одной из подгрупп HSG I-VI на основании классификации Кабата и др., при этом V-области Lλ-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека не обладают достаточно высокой гомологией с согласованными последовательностями V-областей Lλ-цепи человека, входящими в эти подгруппы.The V regions of the human H chain can be assigned to one of the HSG subgroups I-III based on the classification of Kabat et al., While the V regions of the H chain of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP are 82.7% homologous with a consistent sequence of the HSG subgroup III. On the other hand, the V regions of the human Lλ chain can be attributed to one of the HSG I-VI subgroups based on the classification of Kabat et al., While the V regions of the Lλ chain of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP do not have a sufficiently high homology with consistent sequences of V-regions of the human Lλ-chain, included in these subgroups.

Если необходимо очеловечить моноклональное антитело мыши против PTHrP человека, то желательно использовать V-область Н-цепи человека, которая относится к подгруппе HSG III и обладает самой высокой гомологией, или V-область Н-цепи человека, в которой каркасная область имеет соответствующую стандартную структуру (Chothia С, et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987). Кроме того, поскольку не существует согласованной последовательности с высокой гомологией в подгруппах V-областей Lλ-цепи человека, для конструирования очеловеченного антитела желательно использовать V-область Lλ-цепи антитела человека с самой высокой гомологией, зарегистрированной в банке данных по структуре белка.If it is necessary to humanize a mouse monoclonal antibody against human PTHrP, it is desirable to use the V region of the human H chain, which belongs to the subgroup HSG III and has the highest homology, or the V region of the human H chain, in which the frame region has an appropriate standard structure (Chothia C, et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987). In addition, since there is no consistent sequence with high homology in the subgroups of the V regions of the human Lλ chain, it is desirable to use the highest homology of the human Lλ chain V region of the Lλ chain of the human antibody registered in the protein structure database to construct a humanized antibody.

(2) Конструирование ДНК, кодирующей V-область очеловеченного антитела(2) Construction of DNA encoding the V region of a humanized antibody

На первой стадии конструирования ДНК, кодирующей V-область очеловеченного антитела, необходимо выбрать V-область антитела человека в качестве основы для указанной конструкции.In the first step of constructing the DNA encoding the V region of the humanized antibody, it is necessary to select the V region of the human antibody as the basis for this construction.

При осуществлении настоящего изобретения в очеловеченном антителе можно использовать каркасную область V-области антитела человека, которая гомологична каркасной области V-области антитела мыши более чем на 80%. Каркасная область V-области Н-цепи, используемая в качестве фрагмента по существу идентичной каркасной области, может включать каркасную область, относящуюся к подгруппе III, такую как S31679 (NBRF-PDB, Cuisinier A.M. et al., Eur.J. Immunol, 23, 110-118, 1993). Кроме того, каркасная область V-области L-цепи, используемая в качестве фрагмента по существу идентичной каркасной области, может включать, например, FR1, FR2 и FR3, выделенные из антитела человека HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. et al., Scand. J. Immunol, 39, 95-103, 1994), и FR4, выделенную из антитела человека S25755 (NBRF-PDB).When carrying out the present invention in a humanized antibody, the framework region of the V region of a human antibody can be used that is more than 80% homologous to the framework region of the V region of the mouse antibody. The framework region of the H chain V region, used as a fragment of a substantially identical framework region, may include a framework region belonging to subgroup III, such as S31679 (NBRF-PDB, Cuisinier AM et al., Eur. J. Immunol, 23 110-118, 1993). In addition, the framework region of the V region of the L chain, used as a fragment of a substantially identical framework region, may include, for example, FR1, FR2 and FR3 isolated from human antibodies HSU03868 (GEN-BANK, M. Deftos et al., Scand. J. Immunol, 39, 95-103, 1994), and FR4 isolated from S25755 human antibody (NBRF-PDB).

Антитело человека S311679 клонировано из библиотеки кДНК печени плода человека, и антитело человека HSU03868 клонировано в качестве нового гена для V-области Lλ-цепи человека.The human antibody S311679 was cloned from the human fetal liver cDNA library, and the human antibody HSU03868 was cloned as a new gene for the V region of the human Lλ chain.

(3) Получение полипептидов, содержащих V-область очеловеченного антитела(3) Obtaining polypeptides containing the V region of a humanized antibody

В очеловеченном антителе по настоящему изобретению С-область и каркасные области (FR) V-области указанного антитела взяты у человека, и гипервариабельные участки V-области взяты у мыши. Полипептид, содержащий V-область очеловеченного антитела по настоящему изобретению, можно получить путем трансплантации гипервариабельных участков по методу PCR с использованием в качестве матрицы фрагмента ДНК антитела человека. Способ трансплантации гипервариабельных участков заключается в том, что получают фрагмент ДНК, кодирующей гипервариабельный участок мыши, и заменяют его антителом человека, используемым в качестве матрицы.In the humanized antibody of the present invention, the C region and framework regions (FR) of the V region of said antibody are from a human, and the hypervariable portions of the V region are from a mouse. A polypeptide containing the V region of the humanized antibody of the present invention can be obtained by transplantation of the hypervariable regions using the PCR method using a human antibody fragment as a template. A method for transplanting hypervariable regions is to obtain a DNA fragment encoding a hypervariable region of the mouse and replace it with a human antibody used as a template.

Если фрагмент ДНК антитела человека, предназначенного для использования в качестве матрицы, недоступен, последовательность оснований, зарегистрированную в базе данных, можно синтезировать в синтезаторе ДНК, и ДНК для V-области очеловеченного антитела можно получить по способу полимеразной реакции синтеза цепи (PCR). Кроме того, если в базе данных зарегистрирована только аминокислотная последовательность, всю последовательность оснований можно вывести из указанной аминокислотной последовательности с учетом данных об использовании кодонов в антителах по способу Кабата и др. (Kabat, E.A. et al., in US Dep.Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991). Эту последовательность оснований синтезируют в синтезаторе ДНК, затем по методу PCR получают ДНК V-области очеловеченного антитела и вводят в приемлемого хозяина с последующей экспрессией, необходимой для получения требуемого полипептида.If the DNA fragment of a human antibody to be used as a template is not available, the base sequence recorded in the database can be synthesized in a DNA synthesizer, and DNA for the V region of a humanized antibody can be obtained by the method of polymerase chain synthesis (PCR). In addition, if only the amino acid sequence is registered in the database, the entire base sequence can be deduced from the specified amino acid sequence, taking into account data on the use of codons in antibodies according to the method of Kabat et al. (Kabat, EA et al., In US Dep.Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991). This base sequence is synthesized in a DNA synthesizer, then DNA of the V region of the humanized antibody is obtained by PCR and introduced into an acceptable host, followed by expression necessary to obtain the desired polypeptide.

Ниже описываются общие процедуры трансплантации гипервариабельных участков по методу PCR, выполняемые при наличии фрагмента ДНК антитела человека, используемого в качестве матрицы.The following describes the general procedures for transplantation of hypervariable sites by PCR, performed in the presence of a DNA fragment of a human antibody used as a matrix.

(i) Трансплантация гипервариабельных участков(i) Transplantation of hypervariable sites

Предположим, что ДНК, кодирующая V-область, представляет собой ДНК, кодирующие FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4, которые связаны друг с другом в указанном порядке.Assume that the DNA encoding the V region is DNA encoding FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4, which are linked to each other in this order.

Сначала синтезируют фрагменты ДНК мыши, соответствующие требуемым гипервариабельным участкам. Гипервариабельные участки 1-3 синтезируют на основе последовательностей оснований ранее клонированных V-областей Н- и L-цепи мыши. Трансплантирующие затравки В и Е синтезируют с таким расчетом, чтобы затравка В имела последовательность, гибридизирующую с CDR1 мыши и FR2 антитела человека в направлении смысловой последовательности, и затравка Е имела последовательность, гибридизирующую с CDR1 и FR1 антитела человека в направлении антисмысловой последовательности. Аналогичным образом синтезируют трансплантирующие затравки С и F и затравки D и G. Помимо этого, синтезируют так называемые "внешние затравки", которые могут соответственно гибридизировать с верхними областями от FR1 и нижними областями от FR4. Трансплантирующие затравки можно выделить и экстрагировать известными методами (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).First, mouse DNA fragments are synthesized corresponding to the desired hypervariable regions. Hypervariable sites 1-3 are synthesized based on the base sequences of previously cloned mouse H and L chain V regions. The transplanting seeds B and E are synthesized so that the seed B has a sequence hybridizing to mouse CDR1 and human FR2 antibodies in the sense direction, and the seed E has a sequence hybridizing to human CDR1 and FR1 antibodies in the direction of the antisense sequence. In a similar manner, transplanting seeds C and F and seeds D and G. are synthesized. In addition, so-called “external seeds” are synthesized which can accordingly hybridize with the upper regions from FR1 and the lower regions from FR4. Transplant seeds can be isolated and extracted by known methods (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Затем выполняют первую полимеразную реакцию синтеза цепи, используя трансплантирующую затравку Е и внешнюю затравку А, трансплантирующие затравки В и F, трансплантирующие затравки С и G, а также трансплантирующую затравку D и внешнюю затравку Н, в результате чего соответственно образуются фрагменты А-Е, B-F, C-G и D-H.Then, the first polymerase chain synthesis reaction is performed using transplanting seed E and external seed A, transplanting seeds B and F, transplanting seeds C and G, as well as transplanting seed D and external seed H, resulting in fragments A-E, BF, respectively. CG and DH.

Поскольку верхняя область трансплантирующей затравки В и часть нижней области трансплантирующей затравки Е были сконструированы, чтобы перекрывать друг друга (то же самое верно для трансплантирующих затравок С и F, а также D и С), эти фрагменты могут быть гибридизированы с соответствующими комплементарными последовательностями при осуществлении реакции в приемлемых температурных условиях и собраны в результате выполнения полимеразной реакции синтеза цепи с образованием ДНК длиной от А до Н. Получив фрагмент ДНК, кодирующей V-область, можно добавить внешние затравки А и Н и выполнить вторую полимеразную реакцию синтеза цепи, что дает ДНК, кодирующую V-область очеловеченного антитела, в котором каркасные области 1-4 выделены у человека и гипервариабельные участки 1-3 выделены у мыши. Затем эту ДНК можно ввести в приемлемый хозяин для экспрессии с получением требуемого полипептида.Since the upper region of transplanting seed B and part of the lower region of transplanting seed E were designed to overlap each other (the same is true for transplanting seeds C and F, as well as D and C), these fragments can be hybridized with the corresponding complementary sequences when implemented reactions under acceptable temperature conditions and are assembled as a result of a polymerase chain synthesis reaction with the formation of DNA from A to N. In length, having received a DNA fragment encoding the V region, it is necessary to add external seeds A and H and perform a second polymerase chain synthesis reaction, which gives DNA encoding the V region of a humanized antibody in which framework regions 1-4 are isolated in humans and hypervariable regions 1-3 are isolated in mice. This DNA can then be introduced into an acceptable host for expression to produce the desired polypeptide.

(ii) Конструирование ДНК и экспрессирующего вектора, кодирующего очеловеченную V-область Н-цепи(ii) Construction of DNA and expression vector encoding the humanized V region of the H chain

При осуществлении настоящего изобретения всю последовательность оснований ДНК, кодирующей V-область Н-цепи антитела человека, которая предназначена для использования в качестве матрицы очеловеченного антитела, можно синтезировать в синтезаторе ДНК и сконструировать по способу PCR, хотя указанную ДНК нельзя получить из естественных источников.In the practice of the present invention, the entire DNA base sequence encoding the V region of the H chain of a human antibody, which is intended to be used as a matrix of a humanized antibody, can be synthesized in a DNA synthesizer and constructed using the PCR method, although this DNA cannot be obtained from natural sources.

V-область Н-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека характеризуется высокой гомологичностью с S31679, входящим в человеческую подгруппу III. Для использования этого антитела человека в качестве матрицы для конструирования ДНК, кодирующей очеловеченную V-область Н-цепи, необходимы четыре затравки, выраженные, например, последовательностями с идентификационными №№23-26. Затравки MBC1HGP1 (последовательность с идентификационным №23) и MBC1HGP3 (последовательность с идентификационным №24) содержат смысловые последовательности ДНК, а затравки MBC1HGP2 (последовательность с идентификационным №25) и MBC1HGP4 (последовательность с идентификационным №26) содержат антисмысловые последовательности ДНК. Каждая из них должна иметь с любого конца комплементарную последовательность длиной от 15 до 21 пары оснований.The V region of the H chain of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP is characterized by high homology with S31679, which is part of human subgroup III. To use this human antibody as a template for constructing DNA encoding the humanized V region of the H chain, four seeds are required, expressed, for example, by sequences with identification Nos. 23-26. The seeds MBC1HGP1 (sequence with identification No. 23) and MBC1HGP3 (sequence with identification No. 24) contain sense DNA sequences, and the seeds MBC1HGP2 (sequence with identification No. 25) and MBC1HGP4 (sequence with identification No. 26) contain antisense DNA sequences. Each of them should have a complementary sequence from 15 to 21 base pairs at either end.

Внешние затравки MBC1HVS1 (последовательность с идентификационным №27) и MBC1HVR1 (последовательность с идентификационным №28) имеют последовательность, гомологичную соответственно с MBC1HGP1 и MBC1HGP4, и каждая из них содержит узнающую последовательность для соответствующего приемлемого рестрикционного фермента. Четыре затравки собирают по способу PCR и синтезируют непроцессированную кДНК, после чего добавляют внешние затравки для амплификации ДНК. "Сборка по методу PCR" означает гибридизацию MBC1HGP1 и MBC1HGP2 или MBC1HGP3 и MBC1HGP4 по их комплементарным последовательностям с получением фрагмента MBC1HGP1-MBC1HGP3 и фрагмента MBC1HGP2-MBC1HGP4 с последующей гибридизацией этих фрагментов по их комплементарным последовательностям с получением непроцессированной ДНК для очеловеченной V-области Н-цепи.External seeds MBC1HVS1 (sequence with identification No. 27) and MBC1HVR1 (sequence with identification No. 28) have a sequence homologous to MBC1HGP1 and MBC1HGP4, respectively, and each of them contains a recognition sequence for the corresponding acceptable restriction enzyme. Four seeds were collected by PCR and the unprocessed cDNA was synthesized, after which external seeds were added to amplify the DNA. “PCR assembly” means the hybridization of MBC1HGP1 and MBC1HGP2 or MBC1HGP3 and MBC1HGP4 according to their complementary sequences to obtain the MBC1HGP1-MBC1HGP3 fragment and the MBC1HGP2-MBC1HGP4 fragment with subsequent subsequent sequencing of these sequences for subsequent hybridization chains.

С-область Н-цепи антитела человека может быть любой С-областью Н-цепи человека, например, Cγ1, Cγ2, Сγ3 или Сγ4 областью Н-цепи человека.The C region of the H chain of a human antibody can be any C region of the H chain of a person, for example, the Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 region of the human H chain.

ДНК для V-области Н-цепи очеловеченного антитела, которая получена в соответствии с приведенным выше описанием, можно лигировать с ДНК для любой С-области Н-цепи антитела человека, например. Cγ1-области Н-цепи человека. Как указывалось в разделе "Получение Н-цепи химерного антитела", ДНК для V-области Н-цепи можно обработать приемлемым рестрикционным ферментом и лигировать с ДНК, кодирующей С-область Н-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система энхансер/промотор, с получением экспрессирующего вектора, содержащего ДНК для очеловеченной V-области Н-цепи и С-области Н-цепи человека.DNA for the humanized antibody H chain V region, which is prepared as described above, can be ligated with DNA for any human antibody H chain C region, for example. Cγ1 regions of the human H chain. As indicated in the section "Obtaining the H chain of the chimeric antibody", DNA for the V region of the H chain can be processed with an acceptable restriction enzyme and ligated with DNA encoding the C region of the human H chain, controlling the expression of the region, such as an enhancer system / promoter, to obtain an expression vector containing DNA for the humanized V region of the H chain and C region of the human H chain.

(iii) Конструирование ДНК и экспрессирующего вектора, кодирующего очеловеченную V-область L-цепи(iii) Construction of DNA and expression vector encoding the humanized V region of the L chain

При осуществлении настоящего изобретения всю последовательность оснований ДНК, кодирующей V-область L-цепи антитела человека, используемого в качестве матрицы, можно синтезировать в синтезаторе ДНК и сконструировать по способу PCR, хотя ДНК для V-области L-цепи не доступна так же, как ДНК, кодирующую V-область H-цепи.In the practice of the present invention, the entire base sequence of the DNA encoding the V region of the L chain of a human antibody used as a template can be synthesized in a DNA synthesizer and constructed using the PCR method, although DNA for the V region of the L chain is not available in the same way as DNA encoding the V region of the H chain.

Чтобы сконструировать ДНК для очеловеченной V-области L-цепи, используя в качестве матрицы антитело человека SU03868, характеризующееся наибольшей гомологией с V-областью L-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека, необходимы четыре затравки, выраженные, например, последовательностями с идентификационными №№29-32. Затравки MBC1LGP1 (последовательность с идентификационным №29) и MBC1LGP3 (последовательность с идентификационным №30) содержат смысловые последовательности ДНК, а затравки MBC1LGP2 (последовательность с идентификационным №31) и MBC1LGP4 (последовательность с идентификационным №32) содержат антисмысловые последовательности ДНК. Все они были сконструированы для того, чтобы иметь комплементарную последовательность длиной от 15 до 21 пары оснований у любого конца.In order to construct DNA for the humanized V region of the L chain, using the human antibody SU03868 as the template, which is characterized by the highest homology with the V region of the L chain of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP, four seeds are required, expressed, for example, by sequences with identification Nos. 29-32. The seeds MBC1LGP1 (sequence with identification No. 29) and MBC1LGP3 (sequence with identification No. 30) contain sense DNA sequences, and the seeds MBC1LGP2 (sequence with identification No. 31) and MBC1LGP4 (sequence with identification No. 32) contain antisense DNA sequences. All were designed to have a complementary sequence of 15 to 21 base pairs at either end.

Внешние затравки MBC1LVS1 (последовательность с идентификационным №33) и MBC1LVR1 (последовательность с идентификационным №34) имеют последовательность, гомологичную соответственно с MBC1LGP1 и MBC1LGP4, и содержат узнающую последовательность для соответствующего приемлемого рестрикционного фермента. Четыре затравки собирают по методу PCR с получением непроцессированной ДНК и добавляют внешние затравки для амплификации ДНК. "Сборка по методу PCR" означает гибридизацию затравок MBC1LGP1 и MBC1LGP3 или затравок MBC1LGP2 и MBC1LGP4 по их комплементарным последовательностям с получением фрагмента MBC1LGP1-MBC1LGP3 и фрагмента MBC1LGP2-MBC1LGP4 с последующей гибридизацией этих фрагментов по их комплементарным последовательностям с получением непроцессированной ДНК, кодирующей очеловеченную V-область Н-цепи.External seeds MBC1LVS1 (sequence with identification No. 33) and MBC1LVR1 (sequence with identification No. 34) have a sequence homologous to MBC1LGP1 and MBC1LGP4, respectively, and contain the recognition sequence for the corresponding acceptable restriction enzyme. Four seeds were collected by PCR to obtain unprocessed DNA and external seeds were added to amplify the DNA. “PCR assembly” means the hybridization of the seeds MBC1LGP1 and MBC1LGP3 or the seeds MBC1LGP2 and MBC1LGP4 by their complementary sequences to obtain the fragment MBC1LGP1-MBC1LGP3 and the fragment MBC1LGP2-MBC1 incomplete DNA fragment with 4 H chain region.

С-область L-цепи антитела человека может быть любой С-областью L-цепи человека, например, Сλ- или Сκ-областью L-цепи человека.The C region of the L chain of a human antibody can be any C region of the L chain of a person, for example, the Cλ or Cκ region of a human L chain.

ДНК для V-области L-цепи очеловеченного антитела, которая получена в соответствии с приведенным выше описанием, можно лигировать с ДНК для любой С-области L-цепи антитела человека, например, Сλ-области L-цепи человека. ДНК для V-области L-цепи можно обработать приемлемым рестрикционным ферментом и лигировать с ДНК, кодирующей С-область Lλ-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система энхансер/промотор, с получением экспрессирующего вектора, содержащего ДНК, кодирующие очеловеченную V-область L-цепи и С-область Lλ-цепи человека.DNA for the humanized antibody L chain V region, which is prepared as described above, can be ligated with DNA for any human antibody L chain C region, for example, the human L chain C region. DNA for the V region of the L chain can be treated with a suitable restriction enzyme and ligated with DNA encoding the C region of the human Lλ chain to control expression of a region, such as an enhancer / promoter system, to obtain an expression vector containing human encoding DNA The V region of the L chain and the C region of the human Lλ chain.

Факт получения полипептида способом, описанным выше, содержащего V-область очеловеченного антитела, вовсе не означает, что указанный полипептид будет обладать активностью в качестве антитела, например, обладать связывающей или нейтрализующей активностью против своего антигена. Это, в частности, относится к L-цепи, так как V-область L-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека выделена из очень редкого Vλx-гена, поэтому необходимо исследовать указанный полипептид в отношении наличия или отсутствия у него данной активности путем соединения его с очеловеченной Н-цепыо и экспрессии в животной клетке, такой как COS-7.The fact of obtaining a polypeptide by the method described above containing the V region of a humanized antibody does not mean at all that said polypeptide will have activity as an antibody, for example, have binding or neutralizing activity against its antigen. This, in particular, applies to the L chain, since the V region of the L chain of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP is isolated from a very rare Vλx gene; therefore, it is necessary to study the indicated polypeptide with respect to the presence or absence of this activity by combining it with humanized H-chain and expression in an animal cell, such as COS-7.

Эффективным способом выявления каркасной области в V-области очеловеченного антитела, обладающей связывающей и нейтрализующей активностью очеловеченного антитела, может быть конструирование гибридной V-области (Ohtomo, T.et al., Molecular Immunology, 32, 407-416, 1995) и подтверждение полученных результатов. Чтобы выявить аминокислоту в V-области L-цепи очеловеченного антитела по настоящему изобретению, которую необходимо мутировать с получением аминокислоты, обладающей требуемой активностью, конструируют ДНК, в которой фрагмент каркасной области очеловеченного антитела рекомбинирован фрагментом каркасной области, выделенным у мыши, после чего каждую область анализируют в отношении очеловечивания.An effective way to identify the frame region in the V region of a humanized antibody with binding and neutralizing activity of a humanized antibody can be to construct a hybrid V region (Ohtomo, T.et al., Molecular Immunology, 32, 407-416, 1995) and confirm the results results. In order to identify an amino acid in the V region of the L chain of a humanized antibody of the present invention, which must be mutated to produce an amino acid having the desired activity, a DNA is constructed in which a fragment of the frame region of the humanized antibody is recombined with a fragment of the frame region isolated from the mouse, after which each region analyzed in relation to humanization.

Получают антитело с полипептидом, содержащим рекомбинантную V-область, в которой FR1 и FR2 выделены из антитела человека и FR3 и FR4 выделены из антитела мыши (такое антитело, имеющее рекомбинантный фрагмент, определяется как "гибридное антитело"), гибридное антитело, в котором только FR1 выделена у человека, и гибридное антитело, в котором только FR2 выделена у человека. Каждую ДНК, кодирующую эти гибридные антитела, вводят в экспрессирующий вектор и временно экспрессируют очеловеченные антитела для исследования на наличие требуемой активности.An antibody is obtained with a polypeptide containing a recombinant V region in which FR1 and FR2 are isolated from a human antibody and FR3 and FR4 are isolated from a mouse antibody (such an antibody having a recombinant fragment is defined as a “hybrid antibody”), a hybrid antibody in which only FR1 is isolated in humans, and a hybrid antibody in which only FR2 is isolated in humans. Each DNA encoding these hybrid antibodies is introduced into an expression vector and humanized antibodies are temporarily expressed to examine for the presence of the desired activity.

С помощью этого способа автор настоящего изобретения исследовал полипептиды, содержащие V-области L-цепи, в отношении антигенсвязывающей и нейтрализующей активности и обнаружил, что определенные заменяемые аминокислоты находятся в каркасных областях FR2 и FR3.Using this method, the present inventor examined polypeptides containing L chain V regions for antigen binding and neutralizing activity and found that certain substitutable amino acids are located in the framework regions of FR2 and FR3.

Обнаружив, что аминокислоты, определяющие данную активность, находятся в областях FR2 и FR3, автор настоящего изобретения установил, что указанной активностью обладают 36-я, 45-я и 49-я аминокислоты в области FR2 и 87-я аминокислота в области FR3 (нумерация аминокислот в антителах определена Кабатом (Kabat, E.A. et al., US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991).Having discovered that the amino acids that determine this activity are in the FR2 and FR3 regions, the author of the present invention found that the 36th, 45th, and 49th amino acids in the FR2 region and the 87th amino acid in the FR3 region have the indicated activity (numbering amino acids in antibodies are determined by Kabat (Kabat, EA et al., US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991).

Таким образом, при осуществлении настоящего изобретения получают полипептид, содержащий V-область, в которой мутирована одна или несколько таких аминокислот (например, заменена).Thus, in the practice of the present invention, a polypeptide is obtained comprising a V region in which one or more of these amino acids has been mutated (e.g., replaced).

В соответствии с рассмотренным выше способом трансплантации гипервариабельных участков сначала получают полипептид, содержащий V-область с аминокислотной последовательностью в качестве основы для мутации аминокислоты. Этот исходный полипептид содержит аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №47, и определяется как "вариант а" ("а" в таблице 1).In accordance with the above method for transplantation of hypervariable regions, a polypeptide is first obtained containing a V region with an amino acid sequence as the basis for an amino acid mutation. This parent polypeptide contains the amino acid sequence expressed by the sequence with identification No. 47, and is defined as "option a" ("a" in table 1).

Затем, используя в качестве основы "вариант а", получают разные вариантные фрагменты, в которых мутирована одна или несколько аминокислот каркасной области.Then, using “variant a” as the basis, various variant fragments are obtained in which one or several amino acids of the framework region are mutated.

Мутацию можно осуществить путем конструирования олигонуклеотидной затравки (мутагенная затравка), кодирующей аминокислоту, вводимую в качестве требуемой мутации, которую используют для выполнения полимеразной реакции синтеза цепи с использованием указанной затравки.The mutation can be accomplished by constructing an oligonucleotide seed (mutagenic seed) encoding the amino acid introduced as the desired mutation, which is used to perform the polymerase chain synthesis reaction using this seed.

Так получают полипептиды, содержащие V-области (варианты b-t), в которых мутированы конкретные аминокислоты в областях FR2 и FR3 (b-t в таблице 1).Thus, polypeptides containing V regions (b-t variants) are obtained in which specific amino acids in the FR2 and FR3 regions are mutated (b-t in Table 1).

Полученную выше ДНК, кодирующую каждый вариант V-области L-цепи очеловеченного антитела, можно лигировать с ДНК любой С-области L-цепи антитела человека, такой как Сλ-область L-цепи человека. С этой целью ее обрабатывают приемлемым рестрикционным ферментом и лигируют с ДНК, кодирующей С-область Lλ-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система энхансер/промотор с получением экспрессирующего вектора, содержащего ДНК, кодирующую каждый вариант очеловеченной V-области L-цепи, и ДНК, кодирующую очеловеченную С-область Lλ-цепи.The DNA obtained above, encoding each variant of the V region of the L chain of a humanized antibody, can be ligated with the DNA of any C region of the L chain of a human antibody, such as the Cλ region of a human L chain. For this purpose, it is treated with an acceptable restriction enzyme and ligated with DNA encoding the C region of the human Lλ chain, controlling the expression of the region, such as an enhancer / promoter system, to obtain an expression vector containing DNA encoding each variant of the humanized V region L -chain, and DNA encoding the humanized C region of the Lλ chain.

Сконструированную выше ДНК, кодирующую V-область Н-цепи очеловеченного антитела и С-область Н-цепи человека, и ДНК, кодирующую очеловеченную V-область L-цепи и С-область L-цепи человека, можно также ввести в один экспрессирующий вектор, описанный в патенте WO 94/11523, причем указанный вектор можно использовать для трансформации клетки-хозяина и трансформированный хозяин можно культивировать in vivo или in vitro с получением требуемого очеловеченного антитела.The DNA constructed above encoding the humanized antibody H chain V region and the human H chain C region, and the DNA encoding the humanized human L chain V region and the human L chain C region can also be introduced into a single expression vector, described in patent WO 94/11523, wherein said vector can be used to transform a host cell, and the transformed host can be cultured in vivo or in vitro to obtain the desired humanized antibody.

4. Получение химерного антитела и очеловеченного антитела4. Obtaining chimeric antibodies and humanized antibodies

Чтобы получить химерное или очеловеченное антитело, необходимо приготовить два вышеуказанных экспрессирующих вектора. Так, в случае химерного антитела конструируют экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши и С-область Н-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система энхансер/промотор, и экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую V-область L-цепи мыши и С-область L-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система энхансер/промотор. В случае очеловеченного антитела конструируют экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую очеловеченную V-область Н-цепи и С-область Н-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система знхансер/промотор и экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую очеловеченную V-область L-цепи и С-область L-цепи человека, под контролем регулирующей экспрессию области, такой как система усилителя энхансер/промотор.To obtain a chimeric or humanized antibody, it is necessary to prepare the two above expression vectors. So, in the case of a chimeric antibody, an expression vector is constructed containing DNA encoding the mouse H chain V region and the human H chain C region, to control the expression region, such as an enhancer / promoter system, and an expression vector containing DNA, the coding region of the V region of the mouse L chain and the C region of the human L chain, under the control of expression control regions, such as an enhancer / promoter system. In the case of a humanized antibody, an expression vector is constructed containing DNA encoding the humanized V region of the H chain and the C region of the human H chain, controlling the expression region, such as the knowhancer / promoter system and the expression vector containing DNA encoding the humanized V the L chain region and the C region of a human L chain, under the control of an expression region, such as an enhancer / promoter system.

Затем клетку-хозяина, такую как клетка млекопитающего, котрансформируют этими экспрессирующими векторами и полученную трансформированную клетку культивируют in vitro или in vivo с получением химерного или очеловеченного антитела (см., например, WO91/16928).A host cell, such as a mammalian cell, is then co-transformed with these expression vectors and the resulting transformed cell is cultured in vitro or in vivo to produce a chimeric or humanized antibody (see, for example, WO91 / 16928).

Альтернативно ДНК, кодирующую V- и С-области Н-цепи, и ДНК, кодирующую V- и С-области L-цепи, можно лигировать с единичным вектором и трансформировать в приемлемую клетку-хозяин с получением антитела. Так, для экспрессии химерного антитела ДНК, кодирующую лидерную последовательность мыши, имеющуюся в клонированной кДНК, V-область Н-цепи мыши и С-область Н-цепи человека, а также ДНК, кодирующую лидерную последовательность мыши, V-область L-цепи мыши и С-область L-цепи человека, вводят в один экспрессирующий вектор, описанный, например, в WO 94/11523. Для экспрессии очеловеченного антитела, ДНК, кодирующую очеловеченную V-область Н-цепи и С-область Н-цепи человека, и ДНК, кодирующую очеловеченную V-область L-цепи и С-область L-цепи человека, вводят в единичный экспрессирующий вектор, описанный, например, в WO 94/11523. Такой вектор используют для трансформации клетки-хозяина, после чего трансформированного хозяина культивируют in vivo или in vitro с получением представляющего интерес химерного или очеловеченного антитела.Alternatively, DNA encoding the V and C regions of the H chain and DNA encoding the V and C regions of the L chain can be ligated with a single vector and transformed into an acceptable host cell to produce an antibody. So, for expression of a chimeric antibody, DNA encoding a mouse leader sequence present in a cloned cDNA, a mouse H chain V region and a human H chain C region, as well as DNA encoding a mouse leader sequence, a mouse L chain V region and the C region of a human L chain is introduced into one expression vector described, for example, in WO 94/11523. For expression of a humanized antibody, DNA encoding the humanized V region of the H chain and C region of the human H chain and DNA encoding the humanized V region of the L chain and C region of the human L chain are introduced into a single expression vector, described, for example, in WO 94/11523. Such a vector is used to transform the host cell, after which the transformed host is cultured in vivo or in vitro to obtain the chimeric or humanized antibody of interest.

Представляющее интерес химерное или очеловеченное антитело, полученное путем культивирования трансформанта, преобразованного посредством ДНК, кодирующей указанное химерное или очеловеченное антитело, можно выделить из внутренней или наружной части клетки и очистить до однородного состояния.Of interest is a chimeric or humanized antibody obtained by culturing a transformant transformed with DNA encoding said chimeric or humanized antibody can be isolated from the inside or outside of the cell and purified to a uniform state.

Представляющее интерес химерное или очеловеченное антитело по настоящему изобретению можно выделить и очистить в колонке, заполненной белком А и агарозой. Для этой цели можно также использовать любые другие способы, применяемые для выделения и очистки обычных белков, причем их выбор ничем не ограничен. Например, для выделения и очистки химерного или очеловеченного антитела можно использовать по отдельности или в сочетании разные виды хроматографии, ультрафильтрации, высаливания и диализа.The chimeric or humanized antibody of the present invention of interest can be isolated and purified in a column filled with protein A and agarose. For this purpose, you can also use any other methods used for the isolation and purification of conventional proteins, and their choice is not limited. For example, to isolate and purify a chimeric or humanized antibody, different types of chromatography, ultrafiltration, salting out, and dialysis can be used individually or in combination.

Для получения химерного или очеловеченного антитела против PTHrP человека по настоящему изобретению можно использовать любую экспрессирующую систему. Например, эукариютические клетки включают животные клетки, в частности, выделенные линии клеток млекопитающих, клетки плесени, грибов и дрожжей; прокариотические клетки включают бактериальные клетки, такие как клетки Escherichia coli. Химерное или очеловеченное антитело по настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют в клетке млекопитающего, такой как клетки COS или СНО.Any expression system can be used to produce a chimeric or humanized anti-human PTHrP antibody of the present invention. For example, eukarytic cells include animal cells, in particular, selected mammalian cell lines, mold, fungus, and yeast cells; prokaryotic cells include bacterial cells such as Escherichia coli cells. The chimeric or humanized antibody of the present invention is preferably expressed in a mammalian cell, such as COS or CHO cells.

Можно использовать любые известные промоторы, предназначенные для экспрессии в клетках млекопитающих. Например, предпочтительно используют быстродействующий протомор цитомегаловируса человека (HCMV). Примерами экспрессирующих векторов, содержащих промотор HCMV, являются HCMV-VH-HCγ1 и HCMV-VL-HCK, выделенные из pSV2neo (WO92/19759).You can use any known promoters designed for expression in mammalian cells. For example, a fast-acting human cytomegalovirus protomor (HCMV) is preferably used. Examples of expression vectors containing the HCMV promoter are HCMV-VH-HCγ1 and HCMV-VL-HCK isolated from pSV2neo (WO92 / 19759).

Кроме того, при осуществлении настоящего изобретения в качестве промоторов для экспрессии гена в клетках млекопитающих можно использовать вирусные промоторы, такие как ретровирус, вирус полиомы, аденовирус и вирус обезьяны (SV) 40, и промоторы, выделенные из клеток млекопитающих, например, из фактора-1α элонгации цепи полипептида человека (HEF-lα). Например, промотор SV40 можно легко использовать по способу Муллигана и др. (Mulligan et al., Nature, 277, 108, 1979) и промотор HEF-lα можно эффективно использовать по способу Мизушима и др. (Mizushima, S. et al., Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990).In addition, in the practice of the present invention, viral promoters such as retrovirus, polyoma virus, adenovirus and monkey virus (SV) 40, and promoters isolated from mammalian cells, for example, from factor-, can be used as promoters for gene expression in mammalian cells. 1α human polypeptide chain elongation (HEF-lα). For example, the SV40 promoter can be easily used according to the method of Mulligan et al. (Mulligan et al., Nature, 277, 108, 1979) and the HEF-lα promoter can be effectively used according to the method of Mizushima et al. (Mizushima, S. et al., Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990).

Исходным материалом для репликации, используемым при осуществлении настоящего изобретения, получают из вируса SV40, вируса полиомы, аденовируса или вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV). Кроме того, экспрессирующий вектор может содержать ген для фосфотрансферазы АРН(3') II или I (neo), тимидин-киназы (ТК), ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазы (Ecogpt) E.coli или дигидрофолат-редуктазы (DHFR) в качестве селективного маркера для увеличения количества копий гена в системе клетки-хозяина.The starting material for replication used in the practice of the present invention is obtained from SV40 virus, polyoma virus, adenovirus or cattle papilloma virus (BPV). In addition, the expression vector may contain a gene for APH (3 ') II or I (neo) phosphotransferase, thymidine kinase (TK), E. coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt), or dihydrofolate reductase (DHFR) b as a selective marker for increasing the number of copies of a gene in a host cell system.

5. Оценка антигенсвязывающей и нейтрализующей активности химерного и очеловеченного антитела.5. Assessment of antigen-binding and neutralizing activity of chimeric and humanized antibodies.

(1) Определение концентрации антитела(1) Determination of antibody concentration

Концентрацию полученного очищенного антитела можно определить по способу твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).The concentration of the obtained purified antibodies can be determined by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Планшеты для определения концентрации антител по способу ELISA получают следующим образом: в каждой лунке 96-луночного планшета для анализа ELISA (например, Maxisorp, NUNC) иммобилизируют 100 мкл антитела козы против иммуноглобулина G (IgG) человека с концентрацией, равной, например, 1 мкг/мл. Содержимое лунок блокируют 200 мкл разбавляющего буфера (например, 50 мМ трис-HCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 0,05% твина-20, 0,02% NaN3, 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), рН 7,2), в каждую лунку добавляют постепенно разбавленный супернатант клеток COS-7 или СНО, в котором экспрессировано химерное, гибридное или очеловеченное антитело либо очищенное химерное, гибридное или очеловеченное антитело; 100 мкл конъюгированного со щелочной фосфатазой антитела козы против IgG человека и 1 мг/мл раствора субстрата (Sigma 104, паранитрофенилфосфорная кислота, SIGMA), после чего с помощью аппарата для прочтения микропланшетов (Bio Rad) измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм. В качестве эталона для определения концентраций можно использовать очищенный IgGl λ человека (сайт связывания).ELISA plates for antibody concentration were prepared as follows: in each well of a 96-well ELISA assay plate (e.g., Maxisorp, NUNC), 100 μl of human goat anti-human immunoglobulin G (IgG) antibody was immobilized at a concentration of, for example, 1 μg / ml The contents of the wells are blocked with 200 μl of dilution buffer (for example, 50 mm Tris-HCl, 1 mm MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween-20, 0.02% NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA) , pH 7.2), a gradually diluted supernatant of COS-7 or CHO cells in which a chimeric, hybrid or humanized antibody or purified chimeric, hybrid or humanized antibody is expressed is added to each well; 100 μl alkaline phosphatase conjugated goat anti-human IgG antibodies and 1 mg / ml substrate solution (Sigma 104, paranitrophenylphosphoric acid, SIGMA), after which the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured using a microplate reader (Bio Rad). Purified human IgGl λ (binding site) can be used as a reference for determining concentrations.

(2) Определение антигенсвязывающей способности(2) Determination of antigen binding ability

Планшеты для определения антигенсвязывающей способности по способу ELISA получают следующим образом: в каждой лунке 96-луночного планшета для анализа ELISA (например, Maxisorp, NUNC) иммобилизируют 100 мкл PRHrP человека (1-34) с концентрацией 1 мкг/мл. Содержимое лунок блокируют 200 мкл разбавляющего буфера, в каждую лунку добавляют постепенно разбавленный супернатант клеток COS-7 или СНО, в котором экспрессировано химерное, гибридное или очеловеченное антитело либо очищенное химерное, гибридное или очеловеченное антитело, 100 мкл конъюгированного со щелочной фосфатазой антитела козы против IgG человека и 1 мг/мл раствора субстрата (Sigma 104, паранитрофенилфосфорная кислота, SIGMA), после чего с помощью аппарата для прочтения микропланшетов (Bio Rad) измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм.ELISA antigen binding capacity plates were prepared as follows: in each well of a 96-well ELISA assay plate (e.g., Maxisorp, NUNC), 100 μl of human PRHrP (1-34) was immobilized at a concentration of 1 μg / ml. The contents of the wells are blocked with 200 μl of dilution buffer, gradually diluted COS-7 or CHO cell supernatant is added to each well, in which a chimeric, hybrid or humanized antibody or purified chimeric, hybrid or humanized antibody, 100 μl alkaline phosphatase conjugated goat anti-IgG antibodies are expressed human and 1 mg / ml substrate solution (Sigma 104, paranitrophenylphosphoric acid, SIGMA), after which the optical density at a wavelength of 405 n is measured using a microplate reader (Bio Rad) .

(3) Определение нейтрализующей.активности(3) Determination of neutralizing activity

Нейтрализующую активность антитела мыши, химерного антитела и очеловеченного антитела можно определить, используя, например, линию клеток остеосаркомы крыс ROS17/2,8-5 (Sato, K.et al., Acta Endocrinology, 116, 113-120, 1987). Клетки ROS 17/2,8-5 стимулируют, используя 4 мМ гидрокортизона, чтобы индуцировать рецептор РТН/PTHrP. Вырожденный фермент для циклического аденозинмонофосфата (сАМР) ингибируют 1 мМ изобутил-1-метилксантина (IBMX, SIGMA). Антитело мыши, или химерное или очеловеченное антитело, предназначенное для определения нейтрализирующей активности, смешивают с равным количеством PTHrP (1-34) и в каждую лунку добавляют полученную смесь антитела и PTHrP (1-34). Нейтрализующую активность антитела мыши, химерного или очеловеченного антитела можно определить путем измерения количества сАМР, продуцированного линиями клеток остеосаркомы крыс ROS17/2,8-5 в результате стимуляции PTHrP.The neutralizing activity of a mouse antibody, a chimeric antibody, and a humanized antibody can be determined using, for example, rat osteosarcoma cell line ROS17 / 2.8-5 (Sato, K. et al., Acta Endocrinology, 116, 113-120, 1987). ROS 17 / 2.8-5 cells were stimulated using 4 mM hydrocortisone to induce the PTH / PTHrP receptor. The degenerate enzyme for cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is inhibited by 1 mM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, SIGMA). A mouse antibody, or a chimeric or humanized antibody for determining neutralizing activity, is mixed with an equal amount of PTHrP (1-34) and the resulting mixture of antibody and PTHrP (1-34) is added to each well. The neutralizing activity of a mouse antibody, chimeric or humanized antibody can be determined by measuring the amount of cAMP produced by ROS17 / 2.8-5 rat osteosarcoma cell lines as a result of PTHrP stimulation.

(4) Кинетический анализ взаимодействия между PTHrP и антителом против PTHrP(4) Kinetic analysis of the interaction between PTHrP and anti-PTHrP antibody

При осуществлении настоящего изобретения, кинетику взаимодействия между PTHrP и анти-PTHrP можно определить разными средствами и способами. В частности, константы диссоциации, константы скорости диссоциации и константы скорости ассоциации можно измерить по методу Скатчарда (Scatchard) и с помощью резонансного сенсора поверхностного плазмона BIACORE (разработан и продается фирмой Pharmacia Biotech). Анализ с помощью резонансного сенсора поверхностного плазмона BIOCORE будет описан ниже в одном из примеров.In carrying out the present invention, the kinetics of the interaction between PTHrP and anti-PTHrP can be determined by various means and methods. In particular, dissociation constants, dissociation rate constants, and association rate constants can be measured using the Scatchard method and the BIACORE surface plasmon resonance sensor (developed and sold by Pharmacia Biotech). Analysis using a BIOCORE surface plasmon resonance sensor will be described below in one example.

BIACORE состоит из оптического источника, призмы, детектора и микроканала. В процессе практического применения лиганд иммобилизируют на конце сенсора кассетного типа и инъецируют в него анализируемое вещество. При наличии между ними сродства оптически определяют степень связывания.BIACORE consists of an optical source, a prism, a detector, and a microchannel. In the process of practical application, the ligand is immobilized at the end of the cassette type sensor and the analyte is injected into it. If there is an affinity between them, the degree of binding is optically determined.

Принцип детектирования этого метода определяется как резонанс поверхностного плазмона. Падающий свет направляют на поверхность раздела между стеклом и металлической пленкой так, чтобы происходило полное отражение, при этом свет, падающий под определенным углом, вызывает возбуждение поверхностного плазмона. Угол падения света изменяется в зависимости от изменения концентрации растворителя, соприкасающегося с металлической пленкой (сенсор). BIACORE определяет это изменение.The detection principle of this method is defined as the resonance of a surface plasmon. Incident light is directed to the interface between the glass and the metal film so that complete reflection occurs, while the light incident at a certain angle causes excitation of the surface plasmon. The angle of incidence of light varies depending on changes in the concentration of the solvent in contact with the metal film (sensor). BIACORE defines this change.

В BIACORE это изменение называется резонансным сигналом (SPR-сигнал), и изменение на 0,1 градус составляет 1000 резонансных единиц (RU). 1000 резонансных единиц соответствует изменению связывания, равному примерно 1 нг белка на тонком золотом сенсоре с площадью поверхности 1 мм2. Для белка можно полностью определить изменение, равное примерно 50 резонансным единицам (50 пг).In BIACORE, this change is called a resonant signal (SPR signal), and a change of 0.1 degrees is 1000 resonance units (RU). 1000 resonance units corresponds to a binding change of approximately 1 ng of protein on a thin gold sensor with a surface area of 1 mm 2 . For a protein, a change of approximately 50 resonance units (50 pg) can be fully determined.

Обнаруженные сигналы преобразуются в присоединенном к BIACORE компьютере в кривую связывания, именуемую сенсограммой, которая строится на мониторе компьютера в реальном времени (Natsume, T, et al., (1995) Experimental Medicine, 13, 563-569; Karlsson, R., et al.(1991) J.Inimunol. Methods 145, 229-240).The detected signals are converted in a computer connected to BIACORE into a binding curve called a sensogram, which is built on a computer monitor in real time (Natsume, T, et al., (1995) Experimental Medicine, 13, 563-569; Karlsson, R., et al. (1991) J. Inimunol. Methods 145, 229-240).

С помощью вышеописанного прибора BIACORE можно измерить кинетические параметры, то есть константу диссоциации (KD), константу скорости диссоциации (Kdiss) и константу скорости ассоциации (Kass) антител против PTHrP по настоящему изобретению.Using the BIACORE instrument described above, kinetic parameters, i.e., dissociation constant (KD), dissociation rate constant (Kdiss), and association rate constant (Kass) of anti-PTHrP antibodies of the present invention, can be measured.

Антитела против PTHrP по настоящему изобретению предпочтительно имеют как можно меньшую константу диссоциации (значение KD) с точки зрения нейтрализующей активности. Против PTHrP антитела по настоящему изобретению предпочтительно имеют значение KD, равное 1,86×10-7 или меньше, более предпочтительно 1,86×10-8 или меньше и наиболее предпочтительно 3,58×10-10 или меньше.Antibodies against PTHrP of the present invention preferably have the lowest dissociation constant (KD value) in terms of neutralizing activity. Against PTHrP, the antibodies of the present invention preferably have a KD value of 1.86 x 10 -7 or less, more preferably 1.86 x 10 -8 or less, and most preferably 3.58 x 10 -10 or less.

Значения KD определяют на основании двух параметров:KD values are determined based on two parameters:

констант скорости диссоциации (Kdiss) и констант скорости ассоциации (Kass) (KD=Kdiss/Kass). Поэтому совершенно очевидно, что значения KD должны быть меньше при меньших значениях Kdiss и больших значениях Kass.dissociation rate constants (Kdiss) and association rate constants (Kass) (KD = Kdiss / Kass). Therefore, it is obvious that the KD values should be smaller with lower Kdiss values and large Kass values.

В частности, значения Kdiss антител против PTHrP по настоящему изобретения могут быть равны 1,22×10-1 [1/сек] или меньше. Значения Kdiss предпочтительно равны 1,22×10-2 или меньше, более предпочтительно 3,16×10-4 или меньше и наиболее предпочтительно 2,32×10-4 [1/сек] или меньше.In particular, the Kdiss values of the anti-PTHrP antibodies of the present invention may be 1.22 × 10 −1 [1 / s] or less. The Kdiss values are preferably 1.22 x 10 -2 or less, more preferably 3.16 x 10 -4 or less, and most preferably 2.32 x 10 -4 [1 / s] or less.

С другой стороны, значения Kass могут быть равны 6,55×104 [1/М.сек] или больше. Значения Kass предпочтительно равны 6,55×105 или больше, более предпочтительно 0,883×106 или больше и наиболее предпочтительно 1,03×106 [1/М.сек] или больше.On the other hand, Kass values may be 6.55 × 10 4 [1 / M.sec] or more. The Kass values are preferably 6.55 × 10 5 or more, more preferably 0.883 × 10 6 or more, and most preferably 1.03 × 10 6 [1 / M.sec] or more.

Кроме того, предпочтительны антитела против PTHrP, имеющие значение Kdiss, равное 1,22×10-1 [1/сек], и значение Kass, равное 6,55×104 [1/М.сек] или больше.In addition, anti-PTHrP antibodies having a Kdiss value of 1.22 × 10 −1 [1 / s] and a Kass value of 6.55 × 10 4 [1 / M.sec] or more are preferred.

В частности, антитела против PTHrP по настоящему изобретению имеют значение KD в диапазоне от 1,02×10-11 до 1,86×10-7 [М], предпочтительно от 1,01×10-10 до 1,86×10-8 [М], более предпочтительно от 1,34×10-10 до 3,58×10-10 [М], наиболее предпочтительно от 2,25×10-10 до 3,58×10-10 [М].In particular, the anti-PTHrP antibodies of the present invention have a KD value in the range of 1.02 × 10 −11 to 1.86 × 10 -7 [M], preferably from 1.01 × 10 -10 to 1.86 × 10 - 8 [M], more preferably from 1.34 × 10 -10 to 3.58 × 10 -10 [M], most preferably from 2.25 × 10 -10 to 3.58 × 10 -10 [M].

Значения Kdiss находятся в диапазоне от 7,38×10-6 до 1,22×10-1 [1/сек], предпочтительно от 7,38×10-5 до 1,22×10-2 [1/сек], более предпочтительно от 1,66×10-4 до 3,16×10-4 [1/сек], наиболее предпочтительно от 1,66×10-4 до 2,32×10-4 [1/сек].Kdiss values range from 7.38 × 10 −6 to 1.22 × 10 −1 [1 / s], preferably from 7.38 × 10 −5 to 1.22 × 10 −2 [1 / s], more preferably 1.66 x 10 -4 to 3.16 x 10 -4 [1 / s], most preferably 1.66 x 10 -4 to 2.32 x 10 -4 [1 / s].

Значения Kass находятся в диапазоне от 6,55×104 до 1,24×107 [1/М.сек], предпочтительно от 6,55×105 до 1,24×106 [1/М.сек], более предпочтительно от 7,23×105 до 1,03×106 [1/М.сек], наиболее предпочтительноот 0,883×106 до 1,03×106 [1/М.сек].Kass values range from 6.55 × 10 4 to 1.24 × 10 7 [1 / M.sec], preferably from 6.55 × 10 5 to 1.24 × 10 6 [1 / M.sec], more preferably from 7.23 × 10 5 to 1.03 × 10 6 [1 / M.sec], most preferably from 0.883 × 10 6 to 1.03 × 10 6 [1 / M.sec].

Эти значения KD, Kdiss и Kass можно получить с помощью анализа Скэтчарда или резонансного сенсора поверхностного плазмона, такого как BIACORE, и предпочтительно BIACORE. ом.These KD, Kdiss, and Kass values can be obtained using Scatchard analysis or a surface plasmon resonance sensor such as BIACORE, and preferably BIACORE. ohm

6. Фармацевтическая композиция и лекарственное средство для подавления гиперкальциемии, содержащие антитело против PTHrP или очеловеченное антитело в качестве активного ингредиента.6. A pharmaceutical composition and a medicament for suppressing hypercalcemia, comprising an anti-PTHrP antibody or a humanized antibody as an active ingredient.

Терапевтический эффект очеловеченного антитела на PTHrP можно проверить путем введения антитела против PTHrP или очеловеченного антитела животному, страдающему гиперкальциемией, и измерения индекса гиперкальциемии. У животных с гиперкальциемией и у субъектов, страдающих гиперкальциемией, часто наблюдается гипофосфатемия; антитела по настоящему изобретению можно также использовать для улучшения гипофосфатемии.The therapeutic effect of a humanized antibody on PTHrP can be verified by administering an anti-PTHrP antibody or humanized antibody to an animal suffering from hypercalcemia and measuring the hypercalcemia index. In animals with hypercalcemia and in subjects suffering from hypercalcemia, hypophosphatemia is often observed; the antibodies of the present invention can also be used to improve hypophosphatemia.

При осуществлении настоящего изобретения используют антитело против PTHrP, включая антитело человека, химерное антитело, приматированное антитело или очеловеченное антитело против PTHrP, которые имеют значения константы диссоциации, константы скорости диссоциации и константы скорости ассоциации. Антитело, которое будет нейтрализовать активность PTHrP, связываясь с ним, предпочтительно включает очеловеченное антитело №23-57-137-1. Способ получения очеловеченного антитела №23-57-137-1 описывается в примерах 1-3.In the practice of the present invention, an anti-PTHrP antibody is used, including a human antibody, a chimeric antibody, a primate antibody, or a humanized anti-PTHrP antibody, which have dissociation constants, dissociation rate constants, and association rate constants. An antibody that will neutralize the binding of PTHrP by binding to it preferably includes humanized antibody No. 23-57-137-1. The method of obtaining humanized antibodies No. 23-57-137-1 is described in examples 1-3.

Антитело по настоящему изобретению можно очистить с достижением высокой степени очистки с помощью любой комбинации известных способов очистки, таких как высаливание, гель-фильтрация с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения и т.д., а также аффинной хроматографии с использованием колонки, заполненной белком А, и т.д. Точность узнавания PTHrP очищенным антителом можно проверить известными иммунологическими средствами, такими как радиоиммунный анализ (RIA), иммуноферментный анализ (EIA, ELISA) и иммунофлуоресцентный анализ.The antibody of the present invention can be purified to achieve a high degree of purification using any combination of known purification methods, such as salting out, gel filtration using high resolution liquid chromatography, etc., as well as affinity chromatography using a column filled with protein A, etc. The accuracy of PTHrP recognition by purified antibody can be verified by known immunological agents such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA) and immunofluorescence analysis.

В качестве испытуемого животного с симптомами гиперкальциемии можно использовать животную модель, полученную путем трансплантации PTHrP-продуцирующих раковых клеток экспериментальному животному с пониженной или отсутствующей иммунологической функцией. Трансплантированные раковые клетки, которые предпочтительно берут у человека, включают, например, раковые клетки поджелудочной железы человека PAN-7. Животное с пониженной или отсутствующей иммунологической функцией, которому трансплантируют раковые клетки, является "голой" мышью и мышью линии SCID.An animal model obtained by transplanting PTHrP-producing cancer cells to an experimental animal with reduced or absent immunological function can be used as a test animal with symptoms of hypercalcemia. Transplanted cancer cells, which are preferably taken from humans, include, for example, human pancreatic cancer cells PAN-7. An animal with reduced or absent immunological function to which cancer cells are transplanted is a naked mouse and a mouse of the SCID line.

Степень подавления гиперкальциемии можно определить путем измерения концентрации кальция в крови, массы тела или восстановления двигательной активности по истечении определенного периода времени с последующей оценкой изменения состояния субъекта на основании полученных данных.The degree of suppression of hypercalcemia can be determined by measuring the concentration of calcium in the blood, body weight or restoration of motor activity after a certain period of time, followed by an assessment of the change in the condition of the subject based on the data.

Фармацевтическую композицию и средство для подавления гиперкальциемии, содержащие антитело или очеловеченное антитело против PTHrP по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, можно вводить парентеральным способом системно или местно. Например, можно производить внутривенные инъекции, включая капельные, внутримышечные инъекции, внутрибрюшинные инъекции или подкожные инъекции. Способ введения выбирают в зависимости от возраста субъекта и тяжести заболевания. Эффективная однократная доза может составлять от 0,01 до 1000 мг/кг массы тела. Альтернативно, указанная доза может составлять от 5 до 10000 мг/массу тела, предпочтительно от 50 до 1000 мг/массу тела.The pharmaceutical composition and agent for suppressing hypercalcemia containing the antibody or humanized anti-PTHrP antibody of the present invention as an active ingredient can be administered parenterally or systemically. For example, you can make intravenous injections, including drip, intramuscular injection, intraperitoneal injection or subcutaneous injection. The route of administration is selected depending on the age of the subject and the severity of the disease. An effective single dose may be from 0.01 to 1000 mg / kg body weight. Alternatively, the dose may be from 5 to 10,000 mg / body weight, preferably from 50 to 1000 mg / body weight.

Фармацевтическая композиция и средство для подавления гиперкальциемии, содержащие антитело или очеловеченное антитело против PTHrP по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, могут далее включать фармацевтически приемлемый носитель и/или добавку или добавки в зависимости от способа введения. Примерами таких носителей и добавок являются вода, фармацевтически приемлемые органические растворители, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивинил полимер, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, поли(акрилат натрия), аргинат натрия, водорастворимый декстран, натрий-карбоксиметиловый крахмал, пектин, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, ксантановая смола, аравийская камедь, казеин, желатин, агар, диглицерин, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновая кислота, сывороточный альбумин человека (HSA), маннитол, сорбитол, лактоза и сурорантанты, пригодные для использования в качестве фармацевтических добавок. Добавки можно использовать по отдельности или в сочетании, не ограничиваясь вышеуказанными веществами.The pharmaceutical composition and agent for suppressing hypercalcemia containing the antibody or humanized anti-PTHrP antibody of the present invention as an active ingredient may further include a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive or additives, depending on the route of administration. Examples of such carriers and additives are water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, poly (sodium acrylate), sodium arginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethylose starch, methyl starch, methyl starch, methyl starch, starch xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, diglycerin, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, serum a human lbumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose and antioxidants suitable for use as pharmaceutical additives. Additives can be used individually or in combination, not limited to the above substances.

Антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения гиперкальциемии, возникающей вследствие различных видов рака (злокачественных опухолей). Эти виды рака не имеют каких-либо конкретных ограничений и включают не только какой-либо один вид рака, но и комбинацию разных видов рака. Виды рака могут, например, включать рак поджелудочной железы, легкого, глотки, гортани, языка, десны, пищевода, желудка, желчных протоков, молочной железы, почек, мочевого пузыря, матки и предстательной железы, а также злокачественную лимфому.The antibody of the present invention can be used to treat hypercalcemia resulting from various types of cancer (malignant tumors). These types of cancer do not have any specific limitations and include not only any one type of cancer, but also a combination of different types of cancer. Types of cancer may, for example, include cancer of the pancreas, lung, pharynx, larynx, tongue, gum, esophagus, stomach, bile ducts, breast, kidney, bladder, uterus, and prostate, as well as malignant lymphoma.

ПримерыExamples

Далее приведено более подробное описание настоящего изобретения со ссылкой на нижеследующие примеры, которые не должны ограничивать объем настоящего изобретения.The following is a more detailed description of the present invention with reference to the following examples, which should not limit the scope of the present invention.

Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело мыши против PTHrP (1-34)A method of obtaining a hybridoma producing a monoclonal mouse antibody against PTHrP (1-34)

Гибридомы, способные продуцировать моноклональное антитело против PTHrP человека (1-34), №23-57-154 и №23-57-137-1, получают в соответствии со способом, описанным Каньи Сато и др. (Sato, К. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993).Hybridomas capable of producing a monoclonal antibody against human PTHrP (1-34), No. 23-57-154 and No. 23-57-137-1, obtained in accordance with the method described by Kanyi Sato et al. (Sato, K. et al ., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993).

В качестве иммуногена используют PTHrP (1-34) (Peninsula, с которым конъюгируют белок-носитель и тироглобулин, используя карбодиимид (Dojinn). Конъюгированный с тироглобулином PTHrP (1-34) диализируют, для получения раствора с концентрацией белка 2 мкг/мл. Полученный раствор смешивают с адъювантом Фрейнда (Difco) в отношении 1:1 с получением эмульсии. Эту эмульсию вводят в виде дорсально-подкожной или внутрибрюшинной инъекции 16 самкам мышей BALB/C в дозе 100 мкг/мышь с целью иммунизации указанных мышей. Эту инъекцию выполняют 11 раз. Для первой иммунизаций используют полный адъювант Фрейнда и для последующих иммунизаций используют неполный адъювант Фрейнда.As an immunogen, PTHrP (1-34) (Peninsula, with which the carrier protein and thyroglobulin are conjugated using carbodiimide (Dojinn) are conjugated. Tyroglobulin-conjugated PTHrP (1-34) is dialyzed to obtain a solution with a protein concentration of 2 μg / ml. The resulting solution was mixed with Freund's adjuvant (Difco) in a 1: 1 ratio to give an emulsion, This emulsion was administered as a dorsal-subcutaneous or intraperitoneal injection to 16 female BALB / C mice at a dose of 100 μg / mouse to immunize these mice. 11. For the first immunization use Freund's complete adjuvant, and Freund's incomplete adjuvant is used for subsequent immunizations.

У иммунизированных мышей определяют титры антител в сыворотках следующим образом:In immunized mice, serum antibody titers were determined as follows:

У всех мышей берут кровь из хвостовой вены и центрифугируют ее с получением сыворотки. Эту сыворотку разбавляют буфером для радиоиммунного анализа (RIA), смешивают с 125-I меченым PTHrP (1-34) и определяют ее связывающую активность. Мышам, обладающим достаточно высоким титром антител, внутрибрюшинно вводят PTHrP (1-34) без белка-носителя в количестве 50 мкг/мышь для окончательной иммунизации.All mice were bled from the tail vein and centrifuged to obtain serum. This serum is diluted with radioimmunoassay buffer (RIA), mixed with 125 -I-labeled PTHrP (1-34) and its binding activity is determined. Mice with a sufficiently high antibody titer were injected intraperitoneally with PTHrP (1-34) without carrier protein in an amount of 50 μg / mouse for final immunization.

Через три дня после окончательной иммунизации мышей умерщвляют и удаляют у них селезенку. Затем производят слияние клеток селезенки с линией миеломных клеток мыши P3x63Ag8U. 1 в соответствии с известным методом на основе использования 50% полиэтиленгликоля 4000. Полученные связанные клетки инокулируют в лунки 96-луночных планшетов (всего 85 планшетов) в количестве 2×104/лунку. Скрининг представляющих интерес гибридом производят с использованием гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой (HAT) среды следующим образом.Three days after the final immunization, the mice are sacrificed and their spleen removed. Then the spleen cells are fused to the P3x63Ag8U mouse myeloma cell line. 1 in accordance with a known method based on the use of 50% polyethylene glycol 4000. The resulting bound cells were inoculated into the wells of 96-well plates (total 85 tablets) in an amount of 2 × 10 4 / well. Hybridomas of interest are screened using a hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium as follows.

Гибридомы исследуют на наличие PTHrP-узнающих антител в культуральном супернатанте, тех лунок, где наблюдался рост клеток в НАТ-среде, с помощью твердофазного радиоиммунного анализа. Гибридомы собирают из лунок, в которых достоверно установлена способность культуры связываться с PTHrP-узнающим антителом. Полученные таким образом гибридомы суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 15% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и OPI-добавку (Sigma), унифицируют по методу ограниченного разбавления, что дает два типа гибридомных клонов, №23-57-154 и №23-57-137-1, каждый из которых обладает сильной способностью связывания с PTHrP (1-34).Hybridomas are examined for the presence of PTHrP-recognizing antibodies in the culture supernatant of the wells where cell growth was observed in the NAT medium using solid-phase radioimmunoassay. Hybridomas are harvested from wells in which the ability of the culture to bind to the PTHrP-recognizing antibody is reliably established. The hybridomas thus obtained are suspended in RPMI-1640 medium containing 15% fetal calf serum (FCS) and OPI supplement (Sigma), unified by the method of limited dilution, which gives two types of hybridoma clones, No. 23-57-154 and No. 23 -57-137-1, each of which has a strong ability to bind to PTHrP (1-34).

Гибридомный клон №23-57-137-1, получивший название "гибридома типа мышь-мышь №23-57-137-1", был включен в коллекцию Национального института Бионауки Человеческих технологий, агентство промышленной науки и технологии, Япония (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Япония) под номером FERM ВР-5631 на основании Будапештского договора от 15 августа 1996 г.The hybridoma clone No. 23-57-137-1, dubbed "mouse-mouse hybridoma No. 23-57-137-1," was included in the collection of the National Institute of Bioscience of Human Technologies, Agency for Industrial Science and Technology, Japan (1-3 , Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) under the number FERM BP-5631 on the basis of the Budapest Treaty of August 15, 1996

Пример 1Example 1

Клонирование ДНК, кодирующей V-область моноклонального антитела мыши против PTHrP человека (1-34)Cloning of DNA encoding the V region of a monoclonal mouse antibody against human PTHrP (1-34)

Клонирование ДНК, кодирующей V-область полученного выше моноклонального антителя мыши против PTHrP человека (1-34) №23-57-137-1, выполняют следующим образом.Cloning of the DNA encoding the V region of the above obtained monoclonal mouse antibody against human PTHrP (1-34) No. 23-57-137-1 is performed as follows.

(1) Получение мРНК(1) Obtaining mRNA

мРНК получают из гибридомы №23-57-137-1 с использованием набора ддя очистки мРНК Quick Prep (Pharmacia Biotech) аналогично описанной ниже процедуре.mRNA is obtained from hybridoma No. 23-57-137-1 using the Quick Prep mRNA purification kit (Pharmacia Biotech) similarly to the procedure described below.

Клетки полученной выше гибридомы №23-57-137-1 полностью гомогенизируют экстракционным буфером, после чего мРНК экстрагируют из этого буфера в колонке с олиго(тимидин)целлюлозным наполнителем в соответствии с инструкцией производителя этого набора. мРНК осаждают этанолом из экстракционного раствора и растворяют полученный осадок мРНК в буфере для элюирования.Cells of the hybridoma obtained above No. 23-57-137-1 are completely homogenized with extraction buffer, after which the mRNA is extracted from this buffer in a column with oligo (thymidine) cellulose filler in accordance with the instructions of the manufacturer of this kit. mRNA is precipitated with ethanol from the extraction solution and the resulting mRNA precipitate is dissolved in the elution buffer.

(2) Получение и амплификация кДНК гена, кодирующего V-область Н-цепи антигена мыши(2) Obtaining and amplification of cDNA of a gene encoding the V region of the H chain of the antigen of the mouse

(i) Клонирование кДНК для V-области Н-цепи антитела №23-57-137-1 ДНК, кодирующую V-область Н-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека, клонируют по методу 5'-RACE (Frohman, M.A. et al.,Prov. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucieic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). Этот метод выполняют с использованием набора 5'-Ampli FINDER RACE (CLONETECH) в соответствии с инструкциями производителя. При осуществлении этого метода используют затравку для синтеза кДНК, например, затравку МНС2 (последовательность с идентификационным №1), которая гибридизирует с С-областью Н-цепи антитела мыши. Примерно 2 мкг полученной выше мРНК, которая является матрицей для синтеза кДНК, смешивают с 10 пмолями затравки МНС2. Полученную смесь подвергают взаимодействию с обратной транскриптазой при температуре 52°С в течение 30 минут, для приготовления кДНК, комплементарной мРНК.(i) Cloning of cDNA for the V region of the H chain of antibody No. 23-57-137-1 DNA encoding the V region of the H chain of the anti-human PTHrP mouse monoclonal antibody is cloned by the 5'-RACE method (Frohman, MA et al ., Prov. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucieic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). This method is performed using the 5'-Ampli FINDER RACE (CLONETECH) kit in accordance with the manufacturer's instructions. When implementing this method, a seed for cDNA synthesis is used, for example, a seed of MHC2 (sequence with identification No. 1), which hybridizes with the C region of the mouse antibody H chain. Approximately 2 μg of the mRNA obtained above, which is the template for cDNA synthesis, is mixed with 10 pmoles of MHC2 seed. The resulting mixture was reacted with reverse transcriptase at a temperature of 52 ° C for 30 minutes to prepare cDNA complementary to mRNA.

Полученное вещество смешивают с 6 н NaOH для гидролиза мРНК (при температуре 65°С в течение 30 минут) и осаждают кДНК этанолом. Выделенную таким образом кДНК лигируют с Ampli FINDER (последовательность с идентификационным №42) у 5'-конца в результате взаимодействия с РНК-лигазой Т4 при температуре 37°С в течение 6 часов и затем при комнатной температуре в течение 16 часов. В качестве затравок для амплификации кДНК по методу PCR используют затравку Anchor (последовательность с идентификационным №2) и затравку MHC-G1 (последовательность с идентификационным №3) (S.T.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991).The resulting material was mixed with 6 N NaOH to hydrolyze mRNA (at a temperature of 65 ° C for 30 minutes) and cDNA was precipitated with ethanol. The cDNA thus isolated was ligated to Ampli FINDER (sequence no. 42) at the 5 ′ end by reaction with T4 RNA ligase at 37 ° C. for 6 hours and then at room temperature for 16 hours. As seeds for PCR amplification of cDNA, Anchor seed (sequence with identification No. 2) and MHC-G1 seed (sequence with identification No. 3) are used (S.T. Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991).

Раствор для полимеразной реакции синтеза цепи (50 мкл), используемый при осуществлении этого метода, состоит из 10 мМ трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 0,25 мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 мМ MgCl2, 2,5 единицы TaKaRa Taq (Takara Shuzo), 10 пмолей затравки Anchor и 1 мкл реакционной смеси кДНК, с которой лигируют затравку MHC-G1 и затравку Ampli FINDER Anchor, помещая сверху 50 мкл минерального масла. В термоциклизаторе модели 480J (Perkin Elmer) выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 45 секунд; 60°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 2 минут.The solution for the polymerase chain synthesis reaction (50 μl) used in this method consists of 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mM MgCl 2 , 2.5 units of TaKaRa Taq (Takara Shuzo), 10 pmol of Anchor seed and 1 μl of cDNA reaction mixture with which the MHC-G1 seed and Ampli FINDER Anchor seed are ligated, placing 50 μl of mineral oil on top. In the model 480J thermal cycler (Perkin Elmer), thirty cycles of the polymerase chain synthesis reaction are performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 45 seconds; 60 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 2 minutes.

(ii) Клонирование кДНК для V-области L-цепи антитела №23-57-137-1 ДНК, кодирующую V-область L-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека, клонируют по методу 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). Этот метод выполняют с использованием набора 5'-Ampli Finder RACE (CloneTech) в соответствии с инструкциями производителя. При осуществлении этого метода, в качестве затравки для синтеза кДНК используют олиго(тимидиновую) затравку. Примерно 2 мкг полученной выше мРНК, которая является матрицей для синтеза кДНК, смешивают с олиготимидиновой затравкой. Полученную смесь подвергают взаимодействию с обратной транскриптазой при температуре 52°С в течение 30 минут с получением кДНК. Полученное вещество смешивают с 6 н NaOH для гидролиза РНК (при температуре 65°С в течение 30 минут). Полученную смесь осаждают этанолом для выделения кДНК в виде осадка. Выделенную таким образом кДНК лигируют со связывающим фрагментом Ampli FINDER Anchor у 5'-конца в результате взаимодействия с РНК-лигазой Т4 при температуре 37°С в течение 6 часов и затем при комнатной температуре в течение 16 часов.(ii) Cloning of cDNA for the V region of the L chain of antibody No. 23-57-137-1 DNA encoding the V region of the L chain of the mouse anti-human PTHrP monoclonal antibody is cloned by the 5'-RACE method (Frohman, MA et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). This method is performed using the 5'-Ampli Finder RACE kit (CloneTech) in accordance with the manufacturer's instructions. When implementing this method, oligo (thymidine) seeds are used as seed for cDNA synthesis. Approximately 2 μg of the mRNA obtained above, which is the template for the synthesis of cDNA, is mixed with oligothymidine seed. The resulting mixture was reacted with reverse transcriptase at a temperature of 52 ° C for 30 minutes to obtain cDNA. The resulting material was mixed with 6 N NaOH to hydrolyze RNA (at a temperature of 65 ° C for 30 minutes). The resulting mixture was precipitated with ethanol to isolate cDNA as a precipitate. The cDNA thus isolated was ligated with the Ampli FINDER Anchor binding fragment at the 5'-end as a result of interaction with T4 RNA ligase at a temperature of 37 ° C for 6 hours and then at room temperature for 16 hours.

Затравку MLC (последовательность с идентификационным №4) для полимеразной реакции синтеза цепи конструируют на основе консервативной последовательности С-области λ-цепи L-цепи мыши и синтезируют в синтезаторе 394 ДНК/РНК (ABI). Раствор для полимеразной реакции синтеза цепи (100 мкл), используемый в процессе получения затравки, состоит из 10 мМ трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 0,25 мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 мМ MgCl2, 2,5 единицы AmpliTaq (PERKIN ELMER), 50 пмолей затравки Anchor (последовательность с идентификационным №2) и 1 мкл реакционной смеси кДНК, с которой лигируют затравку MLC (последовательность с идентификационным №4) и затравку Ampli FINDER Anchor лигировали, помещая сверху 50 мкл минерального масла. В термоциклизаторной модели 480J (Perkin Elmer) выполняют тридцать пять циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 45 секунд, 60°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 2 минут.The MLC seed (identification sequence No. 4) for the polymerase chain synthesis reaction was constructed based on the conserved sequence of the C region of the λ chain of the mouse L chain and synthesized in a 394 DNA / RNA synthesizer (ABI). The solution for the polymerase chain synthesis reaction (100 μl) used in the seed preparation process consists of 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mM MgCl 2 , 2.5 AmpliTaq units (PERKIN ELMER), 50 pmol of Anchor seed (sequence with identification No. 2) and 1 μl of cDNA reaction mixture with which the MLC seed (sequence with identification No. 4) and Ampli seed are ligated FINDER Anchor was ligated by placing 50 μl of mineral oil on top. In the 480J thermal cycler model (Perkin Elmer), thirty-five cycles of the chain synthesis polymerase reaction are performed in accordance with a temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C. for 45 seconds, 60 ° C. for 45 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes .

(3) Очистка и фрагментация продукта полимеразной реакции синтеза цепи(3) Purification and fragmentation of the product of the polymerase chain synthesis reaction

Все фрагменты ДНК, амплифицированные описанными выше методами PCR, разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием 3% агарозы Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products). Для каждой V-области Н-цепи и V-области L-цепи из геля вырезают соответственно фракцию агарозного геля, содержащую фрагмент ДНК длиной около 550 пар оснований. Изо всех полученных гель-фракций выделяют ДНК, используя набор GENECLEAN II (BIO 101) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенную ДНК осаждают из раствора этанолом и растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA. Один мкл полученного таким образом раствора ДНК расщепляют рестрикционным ферментом XmaI (New England Biolabs) при температуре 37°С в течение 1 часа и рестрикционным ферментом EcoRI (Takara Shuzo) при температуре 37°С в течение еще 1 часа. Гидролизованную смесь экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК этанолом.All DNA fragments amplified by the PCR methods described above were separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products). For each V region of the H chain and V region of the L chain, a fraction of an agarose gel containing a DNA fragment of about 550 base pairs in length is cut out from the gel, respectively. DNA is isolated from all gel fractions obtained using the GENECLEAN II kit (BIO 101) in accordance with the manufacturer's instructions. Purified DNA was precipitated from the solution with ethanol and dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA. One μl of the thus obtained DNA solution was digested with the restriction enzyme XmaI (New England Biolabs) at 37 ° C for 1 hour and the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) at 37 ° C for another 1 hour. The hydrolyzed mixture is extracted with phenol and chloroform and the DNA is precipitated with ethanol.

Аналогичным образом получают ДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, и ДНК, кодирующую V-область L-цепи мыши, которые имеют EcoRI-узнающую последовательность у 5'-конца и XmaI-узнающую последовательность у 3'-конца.Similarly, DNA encoding the mouse H chain V region and DNA encoding a mouse L chain V region that have an EcoRI recognition sequence at the 5 ′ end and an XmaI recognition sequence at the 3 ′ end are similarly prepared.

Все фрагменты ДНК EcoRI-XmaI, содержащие соответственно ДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, и ДНК, кодирующую V-область L-цепи мыши, подвергают взаимодействию с вектором pUC19, который предварительно расщепляют EcoRI и Xmal, при температуре 16°С в течение 1 часа с использованием набора для лигирования ДНК, вариант 2 (Takara Shuzo) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную таким образом лигированнную смесь (10 мкл) добавляют к 100 мкл раствора, содержащего компетентные клетки Е. coli, JM 109 (Nippon Gene). Смесь клеток оставляют выстаиваться на льду в течение 15 минут, затем при температуре 42°С в течение 1 минуты и снова на льду в течение еще 1 минуты. Полученный продукт смешивают с 300 мкл культуральной среды SOC (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) и инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут. Полученный раствор клеток помещают на агаровую среду LB или 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащую 100 или 50 мкг/мл ампициллина, 0,1 мМ IPTG и 20 мкг/мл X-gal, и инкубируют при температуре 37°С в течение ночи. Аналогичным образом получают трансформанты Е. coli.All EcoRI-XmaI DNA fragments containing respectively DNA encoding the mouse H chain V region and DNA encoding the mouse L chain V region are reacted with pUC19, which is pre-digested with EcoRI and Xmal, at a temperature of 16 ° C within 1 hour using the DNA ligation kit, option 2 (Takara Shuzo) in accordance with the manufacturer's instructions. The ligation mixture thus obtained (10 μl) was added to 100 μl of a solution containing competent E. coli cells, JM 109 (Nippon Gene). The mixture of cells is left to stand on ice for 15 minutes, then at 42 ° C for 1 minute and again on ice for another 1 minute. The resulting product was mixed with 300 μl of SOC culture medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and incubated at 37 ° C for 30 minutes. The resulting cell solution was placed on LB or 2xYT agar medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) containing 100 or 50 μg / ml ampicillin, 0.1 mM IPTG and 20 μg / ml X-gal, and incubated at 37 ° C overnight. Similarly, E. coli transformants are obtained.

Трансформанты культивируют в течение ночи в 2 мл среды LB или 2xYT, содержащей 100 или 50 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С, после чего из клеточной фракции получают плазмидную ДНК с помощью плазмидного экстрактора PI-100Σ (Kurabou) или набора для выделения плазмид QIAprep (QIAGEN). У полученных таким образом плазмидных ДНК определяют последовательности ДНК.Transformants were cultured overnight in 2 ml of LB or 2xYT medium containing 100 or 50 μg / ml ampicillin at 37 ° C, after which plasmid DNA was obtained from the cell fraction using a PI-100Σ plasmid extractor (Kurabou) or an isolation kit QIAprep plasmids (QIAGEN). In the plasmid DNA thus obtained, DNA sequences are determined.

(4) Секвенирование кДНК, кодирующей V-область антитела мыши(4) Sequencing of cDNA encoding the mouse antibody V region

Последовательность кДНК, кодирующей область плазмиды, определяют с помощью секвенатора ДНК 373А (ABI; Perkin-Elmer), используя набор для циклического секвенирования с окрашиванием терминатора (Perkin-Elmer). Для определения этой последовательности ДНК исследуют последовательности оснований в обеих ориентациях с помощью таких затравок, как затравка М13 Primer M4 (Takara Shuzo) (последовательность с идентификационным №5) и затравка М13 Primer RV (Takara Shuzo) (последовательность с идентификационным №6).The cDNA sequence encoding the plasmid region was determined using a 373A DNA sequencer (ABI; Perkin-Elmer) using a terminator staining cyclic sequencing kit (Perkin-Elmer). To determine this DNA sequence, base sequences are examined in both orientations using primers such as primer M13 primer M4 (Takara Shuzo) (sequence no. 5) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) primer (sequence no. 6).

Полученные таким образом плазмиды, содержащие кДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, и кДНК, кодирующую V-область L-цепи мыши, выделенные из гибридомы №23-57-137-1, названы соответственно "МВС1Н04" и "MBC1L24". Последовательности (включая соответствующие аминокислотные последовательности) ДНК, кодирующей V-область Н-цепи, и ДНК, кодирующей V-область L-цепи антитела мыши №23-57-137-1 (относящиеся соответственно к плазмидам МВС1Н04 и МВС1Н24), представлены соответственно последовательностями с идентификационными №№57 и 65. Оба полипептида для фрагмента V-области Н-цепи и фрагмента V-области L-цепи транслированы, начиная с 58-го основания (которое кодирует глутамин) в последовательностях ДНК, выраженных последовательностями с идентификационными №№57 и 65. Аминокислотные последовательности для V-области Н-цепи и V-области L-цепи выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№46 и 45.Thus obtained plasmids containing cDNA encoding the V region of the mouse H chain and cDNA encoding the V region of the mouse L chain isolated from hybridoma No. 23-57-137-1 are named respectively "MBC1H04" and "MBC1L24" . The sequences (including the corresponding amino acid sequences) of DNA encoding the V region of the H chain and DNA encoding the V region of the L chain of mouse antibody No. 23-57-137-1 (corresponding to plasmids MBC1H04 and MBC1H24, respectively) are represented by sequences with identification Nos. 57 and 65. Both polypeptides for the fragment of the V region of the H chain and the fragment of the V region of the L chain are translated starting from the 58th base (which encodes glutamine) in the DNA sequences expressed by sequences with identification No. 57 and 65. Ami okislotnye sequence for the V-region of H-chain V-region and L-chain sequences are expressed respectively with the identification №№46 and 45.

Штамм Е. coli, имеющий плазмиду МВС1Н04, и штамм Е. coli, имеющий плазмиду MBC1L24, соответственно названы "Escherichia coli JM109 (МВС1Н04)" и "Escherichia coli JM109 (MBC1L24)". Эти штаммы Е. coli включены в коллекцию Национального института бионауки человеческой технологии, агентство промышленной науки и технологии, Япония (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Япония), под номерами FERM ВР-5628 для Escherichia coli JM109 (МВС1Н04) и FERM ВР-5627 для Escherichia coli JM109 (MBC1L24) на основании Будапештского договора от 15 августа 1996 г.The E. coli strain having plasmid MBC1H04 and the E. coli strain having plasmid MBC1L24 are respectively named "Escherichia coli JM109 (MBC1H04)" and "Escherichia coli JM109 (MBC1L24). These E. coli strains are included in the collection of the National Institute of Bioscience of Human Technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan), under the numbers FERM BP-5628 for Escherichia coli JM109 (MBC1H04) and FERM BP-5627 for Escherichia coli JM109 (MBC1L24) based on the Budapest Treaty of August 15, 1996

(5) Определение гипервариабельного участка моноклонального антитела мыши №23-57-137-1 против PTHrP человека(5) Determination of the hypervariable region of mouse monoclonal antibody No. 23-57-137-1 against human PTHrP

Общие структуры V-области Н-цепи и V-области L-цепи обладают значительным сходством. То есть обе структуры имеют четыре каркасные области, дотированные с помощью трех гипервариабельных участков [то есть, CDR]. Аминокислотные последовательности каркасных областей являются достаточно консервативными, в то время как аминокислотные последовательности гипервариабельных участков характеризуются сильной мутагенностью (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).The general structures of the V region of the H chain and the V region of the L chain have significant similarities. That is, both structures have four frame regions, subsidized by three hypervariable regions [ie, CDR]. The amino acid sequences of the framework regions are quite conserved, while the amino acid sequences of the hypervariable regions are highly mutagenic (Kabat, E. A. et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

На основании вышеуказанных факторов, гипервариабельные участки (CDR) определяют путем поиска гомологии аминокислотных последовательностей V-области моноклонального антитела мыши в результате обращения к базе данных по структуре аминокислотных последовательностей для антител, созданной Кабатом и др.Based on the above factors, hypervariable regions (CDRs) are determined by searching for the homology of the amino acid sequences of the V region of the mouse monoclonal antibody as a result of accessing the database on the structure of amino acid sequences for antibodies created by Kabat and others.

Аминокислотные последовательности гипервариабельных участков 1-3 V-области L-цепи выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№59-61, и аминокислотные последовательности гипервариабельных участков 1-3 V-области Н-цепи выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№62-64. (см.табл.2).Amino acid sequences of the hypervariable regions 1-3 of the V region of the L chain are expressed respectively by sequences with identification Nos. 59-61, and the amino acid sequences of the hypervariable regions 1-3 of the V region of the L chain are expressed by sequences with identification Nos. 62-64, respectively. (see table 2).

Таблица 2table 2 V-областьV region Последовательность с идентификационным №Sequence with ID No. CDR1CDR1 CDR2Cdr2 CDR3CDR3 V-область H-цепиH chain V region 5757 31-3531-35 50-6650-66 99-10799-107 V-область L-цепиL chain V region 6565 23-3423-34 50-6050-60 93-10593-105

Пример 2Example 2

Конструирование химерного антителаConstruction of a chimeric antibody

(1) Конструирование Н-цепи химерного антитела(1) Construction of the H chain of a chimeric antibody

(i) Конструирование V-области Н-цепи(i) Construction of the V region of the H chain

Клонированную кДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, модифицируют по методу PCR и лигируют с экспрессирующим вектором, содержащим геномную ДНК для Сγ1 С-области Н-цепи человека. Нижнюю затравку MBC1-S1 (последовательность с идентификационным №7) конструируют таким образом, чтобы она гибридизировала с ДНК, кодирующей 5'-концевую область лидерной последовательности V-области, и имела согласованную последовательность Козака (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol, 196, 947-950, 1987) и HindIII-узнающую последовательность. Верхнюю затравку МВС1-а (последовательность с идентификационным №8) конструируют таким образом, чтобы она гибридизировала с ДНК, кодирующей 3'-концевую область J-области и имела донорскую последовательность сплайсированного фрагмента и BamHI-узнающую последовательность. Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) и соответствующего буфера. Раствор для полимеразной реакции синтеза цепи (50 мкл) содержит 0,07 мкг плазмиды MBC1Н04 в качестве матричной ДНК, 50 пмолей МВС1-а и 50 пмолей MBC1-S1 в качестве затравок, 2,5 единицы TaKaRa Ex Taq и 0,25 мМ dNTP в буфере, поверх которого помещают 50 мкл минерального масла. Выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты/ 55°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут. Фрагменты ДНК, амплифицированные в результате выполнения полимеразной реакции синтеза цепи, разделяют посредством электрофореза в агарозном геле с использованием 3% агароэы Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products).The cloned cDNA encoding the mouse H chain V region is PCR modified and ligated to an expression vector containing genomic DNA for the Cγ1 C region of the human H chain. The lower seed MBC1-S1 (sequence with identification No. 7) is designed so that it hybridizes with DNA encoding the 5'-terminal region of the leader sequence of the V region, and has a consistent Kozak sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol, 196, 947-950, 1987) and a HindIII recognition sequence. The upper seed MBC1-a (sequence with identification No. 8) is designed so that it hybridizes with DNA encoding the 3'-terminal region of the J region and has a donor sequence of a spliced fragment and a BamHI-recognizing sequence. The chain synthesis polymerase reaction is carried out using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) and an appropriate buffer. The solution for the polymerase chain synthesis reaction (50 μl) contains 0.07 μg of plasmid MBC1H04 as template DNA, 50 pmoles MBC1-a and 50 pmoles MBC1-S1 as seeds, 2.5 units of TaKaRa Ex Taq and 0.25 mm dNTP in a buffer over which 50 μl of mineral oil is placed. Thirty cycles of the chain synthesis polymerase reaction were performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute / 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes. DNA fragments amplified by performing a polymerase chain synthesis reaction were separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agaroea (FMC Bio. Products).

Затем вырезают участок агарозного геля, содержащий фрагмент ДНК длиной 437 пар оснований, и очищают указанный фрагмент ДНК с помощью набора GENECLEAN II (BIO 101) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями. Очищенную ДНК осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Один мкл полученного раствора ДНК расщепляют рестрикционными ферментами BamHI и HindIII (Takara Shuzo) при температуре 37°С в течение 1 часа. Гидролизованную смесь экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК этанолом.A section of the agarose gel containing a 437 bp DNA fragment is then cut out and the indicated DNA fragment is purified using the GENECLEAN II kit (BIO 101) in accordance with the instructions attached thereto. The purified DNA was precipitated with ethanol and dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). One μl of the obtained DNA solution was digested with restriction enzymes BamHI and HindIII (Takara Shuzo) at a temperature of 37 ° C for 1 hour. The hydrolyzed mixture is extracted with phenol and chloroform and the DNA is precipitated with ethanol.

Полученный фрагмент ДНК HindIII-BamHI, который содержит ДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, субклонируют в векторе pUC19, который предварительно расщепляют ферментами HindIII и BamHI. Полученную плазмиду секвенируют секвенатором ДНК 373А (Perkin-Elmer), используя затравки М13 Primer М4 и М13 Primer RV и набор для циклического секвенирования с окрашиванием терминатора (Perkin-Elmer). Указанная плазмида, которая содержит ДНК с требуемой последовательностью оснований, кодирующей V-область Н-цепи мыши, выделенную из гибридомы №23-57-137-1, и имеет HindIII-узнающую последовательность, последовательность Козака в 5'-концевой области и BamHI-узнающую последовательность в 3'-концевой области, названа "MBC1H/pUC19".The resulting HindIII-BamHI DNA fragment, which contains DNA encoding the mouse H chain V region, is subcloned into the pUC19 vector, which is pre-digested with the HindIII and BamHI enzymes. The resulting plasmid was sequenced with a 373A DNA sequencer (Perkin-Elmer) using primers M13 Primer M4 and Primer RV M13 and a terminator staining cyclic sequencing kit (Perkin-Elmer). The specified plasmid, which contains DNA with the desired base sequence encoding the V region of the mouse H-chain isolated from hybridoma No. 23-57-137-1, and has a HindIII-recognizing sequence, the Kozak sequence in the 5'-terminal region and BamHI- the recognition sequence in the 3'-terminal region is called "MBC1H / pUC19".

(ii) Конструирование V-области Н-цепи, используемой для получения кДНК химерной Н-цепи типа "мышь - человек"(ii) Construction of the V region of the H chain used to obtain cDNA of the chimeric mouse-human H chain

Полученную на предыдущей стадии ДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, модифицируют по методу PCR и лигируют с кДНК для Сγ1 С-области Н-цепи человека. Обратную затравку MBC1PVS2 (последовательность с идентификационным №9), используемую для модификации V-области Н-цепи, конструируют таким образом, чтобы заменить глицином вторую аминокислоту (то есть аспарагин) последовательности, кодирующей переднюю часть лидерной последовательности V-области, и получить согласованную последовательность Козака (Kozak, N. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987} и HindIII- и EcoRI-узнающие последовательности. Прямую затравку MBC1PVR2 (последовательность с идентификационным №10), используемую для модификации V-области Н-цепи, конструируют таким образом, чтобы она гибридизировала с последовательностью ДНК, кодирующей 3'-концевую область J-области, и с последовательностью ДНК, кодирующей 5'-концевую область С-области, и имела Apal- и Smal-узнающие последовательности.Obtained at the previous stage, the DNA encoding the V region of the mouse H chain is modified by PCR and ligated with cDNA for the Cγ1 C region of the human H chain. The seed primer MBC1PVS2 (sequence no. 9) used to modify the V region of the H chain is designed to replace glycine with a second amino acid (i.e., asparagine) of the sequence encoding the front of the leader sequence of the V region and obtain a consistent sequence Kozak (Kozak, N. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987} and HindIII and EcoRI-recognizing sequences. Direct seed MBC1PVR2 (sequence with identification number 10) used to modify V- H-chain areas, design so that it hybridizes with the DNA sequence encoding the 3'-terminal region of the J region and with the DNA sequence encoding the 5'-terminal region of the C region and has Apal and Smal recognition sequences.

Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) и соответствующего буфера. Раствор для полимеразной реакции синтеза цепи (50 мкл) содержит 0,6 мкг плазмиды MBClH/pUC19 в качестве матричной ДНК, 50 пмолей MBC1HVS2 и 50 пмолей MBC1HVR2 в качестве затравок, 2,5 единицы TaKaRa Ex Taq и 0,25 мМ dNTP в буфере, поверх которого помещают 50 мкл минерального масла. Выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты; 55°С в течение 1 минуты; 72°С в течение 1 минуты. Фрагменты ДНК, амплифицированные в результате выполнения полимеразной реакции синтеза, разделяют посредством электрофореза в агарозном геле с использованием 1% агарозы Sea Kem GTG (FMC Bio. Products). Затем вырезают участок агарозного геля, содержащий фрагмент ДНК длиной 456 пар оснований, и очищают указанный фрагмент ДНК с помощью набора GENECLEAN II (BIO 101) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные фрагменты ДНК осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.The chain synthesis polymerase reaction is carried out using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) and an appropriate buffer. The solution for the polymerase chain synthesis reaction (50 μl) contains 0.6 μg of plasmid MBClH / pUC19 as template DNA, 50 pmol of MBC1HVS2 and 50 pmol of MBC1HVR2 as seeds, 2.5 units of TaKaRa Ex Taq and 0.25 mm dNTP in buffer on top of which 50 μl of mineral oil is placed. Thirty cycles of the polymerase reaction of chain synthesis are performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute; 55 ° C for 1 minute; 72 ° C for 1 minute. DNA fragments amplified by performing a polymerase synthesis reaction were separated by agarose gel electrophoresis using 1% Sea Kem GTG agarose (FMC Bio. Products). A section of an agarose gel containing a DNA fragment of 456 base pairs in length is then excised and the indicated DNA fragment is purified using the GENECLEAN II kit (BIO 101) in accordance with the manufacturer's instructions. The purified DNA fragments are precipitated with ethanol and dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA.

Один мкл полученного раствора ДНК расщепляют рестрикционными ферментами EcoRI и SmaI (Takara Shuzo) при температуре 37°С в течение 1 часа. Гидролизованную смесь экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом ДНК. Полученные фрагменты ДНК EcoRI-SmaI, которые содержат ДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, субклонируют в векторе pUC19, плазмиду предварительно расщепляют ферментами EcoRI и SmaI. Полученную плазмиду секвенируют секвенатором ДНК 373А (Perkin-Elmer), используя затравки М13 Primer M4 и М13 Primer RV и набор для циклического секвенирования с окрашиванием терминатора (Perkin-Elmer). Указанная плазмида, которая содержит ДНК с требуемой последовательностью оснований, кодирующей V-область Н-цепи мыши, выделенную из гибридомы №23-57-137-1, и имеет HindIII-узнающую последовательность, последовательность Козака в 5'-концевой области и ApaI- и Smal-узнающие последовательности в 3'-концевой области, названа "MBC1Hv/pUC19".One μl of the obtained DNA solution was digested with restriction enzymes EcoRI and SmaI (Takara Shuzo) at a temperature of 37 ° C for 1 hour. The hydrolyzed mixture is extracted with phenol and chloroform and ethanol precipitated with DNA. The obtained EcoRI-SmaI DNA fragments that contain DNA encoding the mouse H chain V region V are subcloned in pUC19 vector, the plasmid is pre-digested with EcoRI and SmaI enzymes. The resulting plasmid was sequenced with a 373A DNA sequencer (Perkin-Elmer) using primers M13 Primer M4 and M13 Primer RV and terminator staining cyclic sequencing kit (Perkin-Elmer). The specified plasmid, which contains DNA with the desired base sequence encoding the V region of the mouse H-chain isolated from hybridoma No. 23-57-137-1, and has a HindIII-recognizing sequence, the Kozak sequence in the 5'-terminal region and ApaI- and Smal-recognizing sequences in the 3'-terminal region, called "MBC1Hv / pUC19".

(iii) Конструирование экспрессирующего вектора для Н-цепи химерного антитела(iii) Construction of an expression vector for the H chain of a chimeric antibody

кДНК, содержащую Сγ1 С-области Н-цепи антитела человека, получают следующим образом.A cDNA containing the Cγ1 C region of the H chain of a human antibody is prepared as follows.

Из клетки яичника китайского хомячка, в которую предварительно вводят экспрессирующий вектор DHFR-ΔE-RVh-PM-lf (см. WO 92/19759), кодирующий геномные ДНК V-области Н-цепи очеловеченного антитела РМ1 и IgGl С-области Н-цепи антитела человека, и экспрессирующий вектор RVl-PMla (см. WO 92/19759), кодирующий геномные ДНК V-области L-цепи очеловеченного антитела РМ1 и С-области κ-цепи L-цепи антитела человека, получают мРНК. Полученную мРНК используют для клонирования по методу RT-PCR кДНК, содержащую V-область Н-цепи очеловеченного антитела РМ1 и Сγ1 С-области антитела человека, которую затем субклонируют в сайте HindIII-BamHI плазмиды pUC19. У субклонированной плазмиды определяют последовательность ДНК. Плазмида с требуемой последовательностью оснований названа "pRVh-PM1f-кДНК".From a Chinese hamster ovary cell into which the expression vector DHFR-ΔE-RVh-PM-lf (see WO 92/19759), which encodes the genomic DNA of the V region of the H chain of the humanized antibody PM1 and IgGl of the C region of the H chain, is previously introduced human antibodies, and the RVl-PMla expression vector (see WO 92/19759) encoding the genomic DNA of the V region of the L chain of humanized PM1 antibody and the C region of the κ chain of the human antibody L chain κ chain, obtain mRNA. The resulting mRNA is used for cloning using the RT-PCR method of cDNA containing the V region of the H chain of the humanized antibody PM1 and Cγ1 of the C region of a human antibody, which is then subcloned into the HindIII-BamHI site of pUC19 plasmid. In a subcloned plasmid, the DNA sequence is determined. The plasmid with the desired base sequence is named "pRVh-PM1f-cDNA".

Чтобы сконструировать экспрессирующий вектор для кДНК, содержащей V-область Н-цепи очеловеченного антитела РМ1 и Сγ1 С-области антитела человека, получают экспрессирующий вектор DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f с делециями в сайте HindIII между промотором SV40 и геном DHFR и в сайте EcoRI между промотором EF-1α и V-областью Н-цепи очеловеченного антитела РМ1.In order to construct an expression vector for cDNA containing the H region V chain of the humanized PM1 antibody and Cγ1 C region of a human antibody, an expression vector DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f is obtained with deletions in the HindIII site between the SV40 promoter and the DHFR gene and in the EcoRI site between the EF-1α promoter and the H chain V region of the humanized PM1 antibody.

Полученную плазмиду pRVh-PMlf-кДНК расщепляют BamHI, дефосфолируют фрагментом Кленова и еще раз расщепляют HindIII с получением дефосфолированного фрагмента HindIII-BamHI. Этот дефосфолированный фрагмент HindIII-BamHI лигируют с экспрессирующим вектором DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f, имеющим делеции в сайтах HindIII и EcoRI, который предварительно расщепляют HindIII и BamHI, с целью конструирования экспрессирующего вектора RVh-PM1f-кДНК, содержащего кДНК, кодирующие соответственно V-область Н-цепи очеловеченного антитела РМ1 и Сγ1 С-области антитела человека.The resulting plasmid pRVh-PMlf cDNA was digested with BamHI, dephospholated with a Klenov fragment, and again digested with HindIII to obtain a dephospholated HindIII-BamHI fragment. This dephosphorylated HindIII-BamHI fragment is ligated with the DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f expression vector having deletions at the HindIII and EcoRI sites, which are pre-digested with HindIII and BamHI, to construct an RVh-PM1f cDNA expression vector containing cDNA encoding, respectively, the V region of the H chain of the humanized antibody PM1 and Cγ1 of the C region of a human antibody.

Экспрессирующий вектор RVh-PM1f-кДНК, содержащий кДНК, кодирующие V-область Н-цепи очеловеченного антитела РМ1 и Cγ1 С-области антитела человека, расщепляют ApaI и BamHI, после чего получают фрагмент ДНК, содержащий С-область Н-цепи. Полученный фрагмент ДНК вводят в вышеуказанную плазмиду MBC1Hv/pUC19, которую предварительно расщепляют Aral и BamHI. Полученная таким образом плазмида названа "МВС1НкДНК/рUС19". Эта плазмида содержит кДНК, которые кодируют соответственно V-область Н-цепи антитела мыши и Cγ1 С-области антитела человека и имеют EcoRI- и HindIII-узнающие последовательности у 5'-конца и BamHI-узнающую последовательность у 3'-конца.The expression vector RVh-PM1f cDNA containing cDNAs encoding the H region V region of the humanized PM1 antibody and Cγ1 region of the human antibody cleaves ApaI and BamHI, after which a DNA fragment containing the H region C region is obtained. The resulting DNA fragment was introduced into the above plasmid MBC1Hv / pUC19, which was pre-digested with Aral and BamHI. The plasmid thus obtained is called "MBC1NcDNA / pUC19". This plasmid contains cDNAs that encode respectively the V region of the H chain of the mouse antibody and the Cγ1 C region of the human antibody and have EcoRI and HindIII recognition sequences at the 5 ′ end and a BamHI recognition sequence at the 3 ′ end.

Плазмида МВС1НсДНК/рUС19 была расщеплена EcoRI и BamHI для получения ДНК, кодирующей Н-цепь химерного антитела. Полученный фрагмент ДНК вводят в экспрессирующий вектор pCOSI, который предварительно расщепляют EcoRI и BamHI. Полученный таким образом экспрессирующий вектор для химерного антитела назван "МВС1НкДНК/рСOS1". Экспрессирующий вектор pCOSI конструируют с использованием HEF-PMh-gγ1 (см. WO92/19759), удаляя ген антитела путем расщепления с помощью EcoRI и SmaI и лигируя его с адаптером EcoRI-NotI-BamHI (Takara Shuzo).The plasmid MBC1HcDNA / pUC19 was digested with EcoRI and BamHI to obtain DNA encoding the H chain of the chimeric antibody. The resulting DNA fragment is introduced into the pCOSI expression vector, which is pre-digested with EcoRI and BamHI. The expression vector for the chimeric antibody thus obtained is called "MBC1HcDNA / pCOS1". The pCOSI expression vector was constructed using HEF-PMh-gγ1 (see WO92 / 19759), removing the antibody gene by digestion with EcoRI and SmaI and ligating it with an EcoRI-NotI-BamHI adapter (Takara Shuzo).

Чтобы получить плазмиду для экспрессии в клетке яичника китайского хомячка, плазмиду МВС1НкДНК/рUС19 расщепляют EcoRI и BamHI с получением ДНК, кодирующей Н-цепь химерного антитела, которую затем вводят в экспрессирующую плазмиду pCHO1, которую предварительно расщепляют EcoRI и BamHI. Полученная таким образом экспрессирующая плазмида для химерного антитела названа "MBClНкДНК/рСНО1". Экспрессирующий вектор рСНО1 конструируют с использованием DHFR-ΔE-rvH-PM1-f (см. WO92/19759), удаляя ген антитела путем расщепления с помощью EcoRI и SmaI и лигируя его с адаптером EcoRI-NotI-BamHI (Takara Shuzo).To obtain a plasmid for expression in a Chinese hamster ovary cell, the plasmid MBC1HcDNA / pUC19 was digested with EcoRI and BamHI to obtain DNA encoding the H chain of the chimeric antibody, which was then introduced into the expression plasmid pCHO1, which was previously digested with EcoRI and BamHI. The expression plasmid thus obtained for the chimeric antibody is named "MBClHcDNA / pCHO1". The pCHO1 expression vector was constructed using DHFR-ΔE-rvH-PM1-f (see WO92 / 19759), removing the antibody gene by digestion with EcoRI and SmaI and ligation with the EcoRI-NotI-BamHI adapter (Takara Shuzo).

(2) Конструирование С-области L-цепи человека(2) Construction of the C region of the human L chain

(i) Получение клонирующего вектора(i) Obtaining a cloning vector

Чтобы сконструировать вектор pUC19, содержащий С-область L-цепи человека, получают вектор pUC19 с делецией сайта HindIII. Два мкг вектора pUC19 расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ MgCl2,1 мМ дитиотреитола (DTT), 100 мМ KCl, 8 единиц HindIII (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа. Полученную гидролизованную смесь экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают требуемую ДНК этанолом.To construct a pUC19 vector containing the C region of a human L chain, a pUC19 vector with a HindIII site deletion is obtained. Two μg of the pUC19 vector is digested in 20 μl of a reaction solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol (DTT), 100 mM KCl, 8 units of HindIII (Takara Shuzo), at a temperature 37 ° C for 1 hour. The resulting hydrolyzed mixture was extracted with phenol and chloroform and the desired DNA was precipitated with ethanol.

Полученную ДНК подвергают взаимодействию в 50 мкл реакционного раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола (DTT), 100 мМ NaCl, 0,5 мМ dNTP и 6 единиц фрагмента Кленова (GIBCO BRL), при комнатной температуре в течение 20 минут, в результате чего происходит дефосфолирование ДНК. Полученную реакционную смесь экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом векторной ДНК.The resulting DNA was reacted in 50 μl of a reaction solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol (DTT), 100 mM NaCl, 0.5 mM dNTP, and 6 units of a Clenov fragment ( GIBCO BRL), at room temperature for 20 minutes, resulting in DNA dephospholation. The resulting reaction mixture was extracted with phenol and chloroform and ethanol precipitated with vector DNA.

Полученную векторную ДНК подвергают взаимодействию в 10 мкл реакционного раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 1 мМ аденозин-5'-трифосфата (АТР), 1 мМ дитиотреитола (DTT), 5% (в объемном отношении) полиэтиленгликоля-8000 и 0,5 единицы ДНК-лигазы Т4 (GIBCO BRL), при температуре 16°С в течение 2 часов, в результате чего происходит аутолигирование векторной ДНК. Реакционную смесь (5 мкл) добавляют к 100 мкл раствора, содержащего компетентные клетки штамма JM109 Е.coli (Nippon Gene), и полученный раствор оставляют выстаиваться на льду в течение 30 минут, затем при температуре 42°С в течение 1 минуты и снова на льду в течение 1 минуты. К реакционному раствору добавляют 500 мл культуральной среды SOC и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Полученный раствор помещают на агаровую среду 2xYT (содержащую 50 мкг/мл ампициллина), на поверхность которой предварительно нанесены Х-gal и IPTG (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), и культивируют при температуре 37°С в течение ночи, получая таким образом трансформант.The resulting vector DNA is reacted in 10 μl of a reaction solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 , 1 mM adenosine 5'-triphosphate (ATP), 1 mM dithiothreitol (DTT), 5% (in volume ratio) polyethylene glycol-8000 and 0.5 units of T4 DNA ligase (GIBCO BRL), at a temperature of 16 ° C for 2 hours, resulting in autoligation of vector DNA. The reaction mixture (5 μl) was added to 100 μl of a solution containing competent cells of E. coli strain JM109 (Nippon Gene), and the resulting solution was allowed to stand on ice for 30 minutes, then at 42 ° C for 1 minute and again on ice for 1 minute. 500 ml of SOC culture medium was added to the reaction solution and incubated at 37 ° C for 1 hour. The resulting solution was placed on 2xYT agar medium (containing 50 μg / ml ampicillin), on the surface of which X-gal and IPTG were pre-coated (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), and cultured at a temperature of 37 ° C during the night, thus obtaining a transformant.

Этот трансформант культивируют на среде 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С в течение ночи. Из клеточной фракции культуральной среды выделяют плазмидную ДНК, используя для этой цепи мининабор для очистки плазмид (QIAGEN) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями. Очищенную плазмиду расщепляют HindIII. Эта плазмида с делецией сайта HindIII названа "pUC19 ΔHindIII".This transformant was cultured on 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin at 37 ° C. overnight. Plasmid DNA was isolated from the cell fraction of the culture medium using a plasmid purification kit (QIAGEN) for this chain in accordance with the instructions attached thereto. The purified plasmid was digested with HindIII. This HindIII deletion plasmid is named "pUC19 ΔHindIII".

(ii) Конструирование ДНК, кодирующей С-область λ-цепи L-цепи человека(ii) Construction of DNA encoding the C region of the λ chain of the human L chain

Известно, что С-область λ-цепи L-цепи антитела человека имеет по крайней мере четыре изотипа, включающие Mcg+Ke+Oz-, Mcg-Ke-Oz-, Mcg-Ke-Oz+и Mcg-Ke+Oz- (P.Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987). На основании базы данных EMBL произведен поиск С-области λ-цепи L-цепи антитела человека, которая гомологична С-области λ-цепи L-цепи мыши №23-57-137-1. В результате этого установлено, что изотип Mcg+Ke+Oz- (№ доступа 1Х57819) P.Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987) λ-цепи L-цепи антитела человека в наибольшей степени гомологичен С-области λ-цепи L-цепи мыши №23-57-137-1, характеризуясь 64,4% гомологией в отношении аминокислотной последовательности и 73,4% гомологией в отношении последовательности ДНК.It is known that the C region of the λ chain of the L chain of a human antibody has at least four isotypes, including Mcg + Ke + Oz - , Mcg - Ke - Oz - , Mcg - Ke - Oz + and Mcg - Ke + Oz - ( P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987). Based on the EMBL database, a search was made for the C region of the λ chain of the L chain of the human antibody, which is homologous to the C region of the λ chain of the L chain of the mouse No. 23-57-137-1. As a result of this, it was found that the isotype Mcg + Ke + Oz - (access no. 1X57819) P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987) the human antibody L chain of the L chain of the human antibody is most homologous to the C region of the mouse L chain of the λ chain of No. 23-57-137-1, characterized by 64.4% amino acid homology sequence and 73.4% homology with respect to DNA sequence.

Затем по методу PCR конструируют ДНК, кодирующую С-область λ-цепи L-цепи антитела человека. Все нижеследующие затравки синтезируют с помощью синтезатора ДНК/РНК 394 (ABI). Синтезируют затравки HLAMB1 (последовательность с идентификационным №11) и HLAMB3 (последовательность с идентификационным №13), которые содержат смысловую последовательность ДНК, и затравки HLAMB2 (последовательность с идентификационным №12) и HLAMB4 (последовательность с идентификационным №14), которые содержат антисмысловую последовательность ДНК, при этом все затравки имеют с обоих концов комплементарную последовательность длиной 20-23 пары оснований.Then, the DNA encoding the C region of the λ chain of the L chain of a human antibody is constructed by PCR. All of the following seeds are synthesized using a DNA / RNA 394 (ABI) synthesizer. Synthesize seeds HLAMB1 (sequence with identification No. 11) and HLAMB3 (sequence with identification No. 13), which contain the sense DNA sequence, and seeds HLAMB2 (sequence with identification No. 12) and HLAMB4 (sequence with identification No. 14), which contain the antisense sequence DNA, while all seeds have a complementary sequence at both ends with a length of 20-23 base pairs.

Внешние затравки HLAMBS (последовательность с идентификационным №15) и HLAMBR (последовательность с идентификационным №16) имеют последовательность, комплементарную затравкам HLAMB1 и HLAMB4, соответственно, а также содержат соответственно EcoRI-, HindIII- и Blnl-узнающие последовательности и EcoRI-узнающую последовательность. Во время первой полимеразной реакции синтеза цепи происходит взаимодействие HLAMB1-HLAMB2 и HLAMB3-HLAMB4. После завершения указанных реакций оба полученных продукта смешивают друг с другом в эквивалентных количествах и производят их сборку во время второй полимеразной реакции синтеза цепи. К полученному продукту добавляют внешние затравки HLAMBS и HLAMBR. Эту реакционную смесь подвергают третьей полимеразной реакции синтеза цепи с целью амплификации непроцессированной ДНК.External seeds HLAMBS (sequence with identification No. 15) and HLAMBR (sequence with identification No. 16) have a sequence complementary to the seeds HLAMB1 and HLAMB4, respectively, and also contain EcoRI-, HindIII- and Blnl-recognizing sequences, and EcoRI-recognizing sequence, respectively. During the first polymerase chain synthesis reaction, HLAMB1-HLAMB2 and HLAMB3-HLAMB4 react. After completion of these reactions, both obtained products are mixed with each other in equivalent amounts and assembled during the second polymerase chain synthesis reaction. External seeds HLAMBS and HLAMBR are added to the resulting product. This reaction mixture is subjected to a third polymerase chain synthesis reaction to amplify unprocessed DNA.

Полимеразные реакции синтеза цепи выполняют с помощью TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) в соответствии с инструкциями производителя. Во время осуществления первой полимеразной реакции синтеза цепи используют 100 мкл реакционного раствора, содержащего 5 пмолей HLAMB1, 0,5 пмолей HLAMB2 и 5 единиц TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), или реакционный раствор, содержащий 0,5 пмолей HLAMB3, 5 пмолей HLAMB4 и 5 единиц TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), поверх которого помещают 50 мкл минерального масла, и выполняют пять циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты. Во время осуществления второй полимеразной реакции синтеза цепи используют смесь, содержащую по 50 мкл каждого реакционного раствора, поверх которой помещают 50 мкл минерального масла, и выполняют три цикла полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты. Во время осуществления третьей полимеразной реакции синтеза цепи используют реакционный раствор, к которому добавляют по 50 пмолей внешних затравок HLAMBS и HLAMBR, и выполняют тридцать циклов полимеразной реакции' синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты.Polymerase chain synthesis reactions are performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) in accordance with the manufacturer's instructions. During the first polymerase chain synthesis reaction, 100 μl of a reaction solution containing 5 pmol of HLAMB1, 0.5 pmol of HLAMB2 and 5 units of TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), or a reaction solution containing 0.5 pmol of HLAMB3, 5 pmol of HLAMB4 and 5 units of TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), on top of which 50 μl of mineral oil is placed, and five cycles of polymerase chain synthesis are performed in accordance with the cyclic temperature change program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute. During the second polymerase chain synthesis reaction, a mixture containing 50 μl of each reaction solution, on top of which 50 μl of mineral oil is placed, is used and three cycles of the polymerase chain synthesis reaction are performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute. During the third polymerase chain synthesis reaction, a reaction solution is added to which 50 pmoles of HLAMBS and HLAMBR external seeds are added, and thirty cycles of the chain synthesis polymerase reaction are carried out in accordance with the temperature cycling program in the following sequence: 94 ° C. for 1 minutes, 60 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute.

Фрагмент ДНК, полученный в результате третьей полимеразной реакции синтеза цепи, подвергают электрофорезу в 3% низкоплавком агарозном геле (NuSieve GTG Agarose, FMC), после чего его выделяют и очищают от геля с помощью набора GENECLEAN II (BIO 101) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями.The DNA fragment obtained from the third polymerase chain synthesis reaction is subjected to electrophoresis on a 3% low melting agarose gel (NuSieve GTG Agarose, FMC), after which it is isolated and gel purified using the GENECLEAN II kit (BIO 101) in accordance with him instructions.

Полученный таким образом фрагмент ДНК расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола (DTT), 100 мМ NaCl и 8 единиц EcoRI (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа. Гидролизованный раствор экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК этанолом. Полученную ДНК собирают и растворяют в 8 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).The DNA fragment thus obtained was digested in 20 μl of a reaction solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol (DTT), 100 mM NaCl and 8 units of EcoRI (Takara Shuzo), temperature of 37 ° C for 1 hour. The hydrolyzed solution is extracted with phenol and chloroform and DNA is precipitated with ethanol. The resulting DNA was collected and dissolved in 8 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).

Плазмиду pUC19 ΔHindIII (0,8 мкг) расщепляют EcoRI аналогично вышеописанной процедуре. Гидролизованный раствор экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом, что дает расщепленную плазмиду pUC19 ΔHindIII. Расщепленную плазмиду подвергают взаимодействию в реакционном растворе (50 мкл), содержащем 50 мМ трис-HCl (рН 9,0), 1 мМ MgCl2 и щелочную фосфатазу (E.coli C75; Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 30 минут, в результате чего происходит дефосфолирование указанной плазмиды (то есть обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий). Реакционный раствор экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК этанолом. Полученную таким образом ДНК растворяют в 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.Plasmid pUC19 ΔHindIII (0.8 μg) was digested with EcoRI in the same manner as described above. The hydrolyzed solution is extracted with phenol and chloroform and precipitated with ethanol, which gives a cleaved plasmid pUC19 ΔHindIII. The digested plasmid was reacted in a reaction solution (50 μl) containing 50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 mM MgCl 2 and alkaline phosphatase (E. coli C75; Takara Shuzo), at a temperature of 37 ° C for 30 minutes, resulting in dephospholation of the indicated plasmid (that is, treated with alkaline phosphatase bacteria). The reaction solution was extracted with phenol and chloroform and DNA was precipitated with ethanol. Thus obtained DNA was dissolved in 10 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA.

Один мкл обработанной фосфатазой бактерий плазмиды pUC19 ΔHindIII смешивают с 4 мкл ДНК, полученной в результате вышеуказанной полимеразной реакции синтеза цепи, чтобы лигировать их друг с другом при помощи набора для лигирования ДНК, вариант 2 (Takara Shuzo). Полученную плазмиду вводят в компетентную клетку E.coli, JM109, для образования трансформанта. Трансформант культивируют в течение ночи в 2 мл среды 2xYT, содержащей 5 мкг/мл ампициллина. Полученную из этой клетки плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN).One μl of the bacterial phosphatase-treated plasmid pUC19 ΔHindIII is mixed with 4 μl of the DNA obtained from the above polymerase chain synthesis reaction to ligate them with each other using the DNA ligation kit, option 2 (Takara Shuzo). The resulting plasmid was introduced into a competent E. coli cell, JM109, to form a transformant. The transformant was cultured overnight in 2 ml of 2xYT medium containing 5 μg / ml ampicillin. The plasmid obtained from this cell is purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN).

В вышеописанной плазмиде подтверждают последовательность клонированной ДНК. Для определения последовательности ДНК используют секвенатор ДНК 373А (ABI) и затравки "М13 Primer M4" и "М13 Primer RV" (Takara Shuzo). Это позволяет установить, что клонированная ДНК имеет делецию длиной 12 пар оснований. Указанная плазмида, содержащая эту ДНК, названа "сλΔ/рUС19". Затем для получения рекомбинантной части вновь синтезируют затравки HCLMS (последовательность с идентификационным №17) и HCLMR (последовательность с идентификационным №18) и по методу полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) реконструируют требуемую ДНК.In the above plasmid, the sequence of the cloned DNA is confirmed. To determine the DNA sequence using a DNA sequencer 373A (ABI) and the seed "M13 Primer M4" and "M13 Primer RV" (Takara Shuzo). This suggests that the cloned DNA has a 12 base pair deletion. The indicated plasmid containing this DNA is named "cλΔ / pUC19". Then, in order to obtain a recombinant part, the seeds of HCLMS (sequence with identification No. 17) and HCLMR (sequence with identification No. 18) are again synthesized and the desired DNA is reconstructed by the method of polymerase chain synthesis (PCR).

Первую полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют, используя плазмиду сλΔ/рUС19, содержащую удаленную ДНК в качестве матрицы, и затравки HLAMBS и HCLMS или затравки HCLMS и HLAMB4. Все продукты полимеразной реакции синтеза цепи последовательно очищают. При осуществлении второй полимеразной реакции синтеза цепи производят сборку продуктов PCR. К полученному продукту добавляют внешние затравки HLAMBS и HLAMB4, после чего выполняют третью полимеразную реакцию синтеза цепи для амплификации непроцессированной ДНК.The first polymerase chain synthesis reaction is carried out using a λΔ / pUC19 plasmid containing the removed DNA as a template and HLAMBS and HCLMS seed or HCLMS and HLAMB4 seed. All products of the polymerase chain synthesis reaction are subsequently purified. In a second polymerase chain synthesis reaction, PCR products are assembled. External seeds HLAMBS and HLAMB4 were added to the resulting product, after which a third polymerase chain synthesis reaction was performed to amplify unprocessed DNA.

Во время осуществления первой полимеразной реакции синтеза цепи используют 100 мкл реакционного раствора, содержащего 0,1 мкг cλΔ/pUC19 в качестве матрицы, по 50 пмолей затравок HLAMBS и HCLMR или по 50 пмолей затравок HCLMS и HLAMB4 и 5 единиц TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), поверх которого помещают 50 мкл минерального масла, и выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты.During the first polymerase chain synthesis reaction, 100 μl of a reaction solution containing 0.1 μg cλΔ / pUC19 as a matrix, 50 pmoles of HLAMBS and HCLMR seeds or 50 pmoles of HCLMS and HLAMB4 seeds and 5 units of TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo ), on top of which 50 μl of mineral oil is placed, and thirty cycles of the polymerase reaction of chain synthesis are performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minutes

Продукты полимеразной реакции синтеза цепи, HLAMBS-HCLMR (236 пар оснований) и HCLMS-HLAMB4 (147 пар оснований) подвергают электрофорезу в 3% низкоплавком агарозном геле, чтобы выделить фрагмент ДНК. Фрагмент ДНК собирают и очищают от геля с помощью набора GENECLEAN II (BIO 101). Во время осуществления второй полимеразной реакции синтеза цепи используют 20 мкл реакционного раствора, содержащего 40 нг очищенных фрагментов ДНК и 1 единицу TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), поверх которого помещают 25 мкл минерального масла, и выполняют пять циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты.The products of the polymerase chain synthesis reaction, HLAMBS-HCLMR (236 base pairs) and HCLMS-HLAMB4 (147 base pairs) were subjected to electrophoresis on a 3% low melting agarose gel to isolate a DNA fragment. The DNA fragment is collected and purified from the gel using a GENECLEAN II kit (BIO 101). During the second polymerase chain synthesis reaction, 20 μl of a reaction solution containing 40 ng of purified DNA fragments and 1 TaKaRa Ex Taq unit (Takara Shuzo) is used, over which 25 μl of mineral oil is placed, and five cycles of the polymerase chain synthesis reaction are performed in accordance with the temperature cycling program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute.

Во время осуществления третьей полимеразной реакции синтеза цепи используют 100 мкл реакционного раствора, содержащего 2 мкл реакционного раствора, полученного при выполнении второй полимеразной реакции синтеза цепи, по 50 пмолей затравок HLAMBS и HLAMB4 и 5 единиц TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), поверх которого помещают 50 мкл минерального масла, и выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты, что дает фрагмент ДНК длиной 357 пар оснований (продукт третьей полимеразной реакции синтеза цепи). Фрагмент ДНК подвергают электрофорезу в 3% низкоплавком агарозном геле. Полученный фрагмент ДНК удаляют и очищают с помощью набора GENECLEAN (BIO 101).During the third polymerase chain synthesis reaction, 100 μl of the reaction solution containing 2 μl of the reaction solution obtained by performing the second polymerase chain synthesis reaction is used, 50 pmol of HLAMBS and HLAMB4 seeds and 5 units of TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), on top of which 50 μl of mineral oil, and thirty cycles of the polymerase reaction of chain synthesis are performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute, to give DNA fragment of 357 bp (product of the third PCR). The DNA fragment is subjected to electrophoresis on a 3% low melting agarose gel. The resulting DNA fragment was removed and purified using the GENECLEAN kit (BIO 101).

Полученный таким образом фрагмент ДНК (0,1 мкг) расщепляют EcoRI и субклонируют в плазмиде pUC19 ΔHindIII, которую предварительно обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий (ВАР). Полученную плазмиду вводят в компетентную клетку Е. coli, JM109, для образования трансформанта. Полученный таким образом трансформант культивируют в течение ночи в 2 мл среды 2хYТ, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN).The thus obtained DNA fragment (0.1 μg) was digested with EcoRI and subcloned into the plasmid pUC19 ΔHindIII, which was pretreated with bacterial alkaline phosphatase (BAP). The resulting plasmid is introduced into a competent E. coli cell, JM109, to form a transformant. The transformant thus obtained was cultured overnight in 2 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin. The plasmid isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN).

Последовательность ДНК полученной плазмиды подтверждают с помощью затравок М13 Primer M4 и М13 Primer RV (Takara Shuzo) и определяют на секвенаторе ДНК 373А (ABI). Плазмида, с подтвержденной правильной последовательностью ДНК без какой-либо делеции, названа "Cλ/pUC19".The DNA sequence of the obtained plasmid was confirmed using primers M13 Primer M4 and M13 Primer RV (Takara Shuzo) and determined on a 373A DNA sequencer (ABI). The plasmid, with the correct DNA sequence confirmed without any deletion, is named "Cλ / pUC19".

(iii) Конструирование ДНК, кодирующей С-область κ-цепи L-цепи человека(iii) Construction of DNA encoding the C region of the κ chain of the human L chain

Фрагмент ДНК, кодирующий С-область κ-цепи L-цепи, клонируют из плазмиды HEF-PMIk-gk (WO 92/19759) по методу PCR. Прямую затравку HKAPS (последовательность с идентификационным №19) конструируют таким образом, чтобы она содержала EcoRI-, HindIII- и Blnl-узнающие последовательности, и обратную затравку НКАРА (последовательность с идентификационным №20) конструируют таким образом, чтобы она содержала EcoRI-узнающую последовательность, используя для их синтеза синтезатор ДНК/РНК 394 (ABI).A DNA fragment encoding the C region of the κ chain of the L chain is cloned from the plasmid HEF-PMIk-gk (WO 92/19759) by PCR. HKAPS direct seed (sequence with identification No. 19) is designed so that it contains EcoRI-, HindIII- and Blnl-recognizing sequences, and NKARA reverse seed (sequence with identification No. 20) is designed so that it contains an EcoRI-recognizing sequence using a DNA / RNA 394 (ABI) synthesizer for their synthesis.

Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют, используя 100 мкл реакционного раствора, содержащего 0,1 мкг плазмиды HEF-PMIk-gk в качестве матрицы, по 50 пмолей затравок HKAPS и НКАРА и 5 единиц TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), поверх которого помещают 50 мкл минерального масла. Выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты, в результате чего получают фрагмент ДНК длиной 360 пар оснований. Полученный фрагмент ДНК выделяют электрофорезом в 3% низкоплавком агарозном геле, удаляют и очищают с помощью набора GENECLEAN II (BIO 101).The polymerase chain synthesis reaction is carried out using 100 μl of a reaction solution containing 0.1 μg of HEF-PMIk-gk plasmid as a template, 50 pmol of HKAPS and NKAPA seeds and 5 units of TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), on top of which 50 μl mineral oil. Thirty cycles of the chain synthesis polymerase reaction were performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute, resulting in a 360 DNA fragment of length base pairs. The resulting DNA fragment was isolated by electrophoresis on a 3% low melting agarose gel, removed and purified using the GENECLEAN II kit (BIO 101).

Полученный таким образом фрагмент ДНК расщепляют EcoRI и клонируют в плазмиде pUC19 ΔHindIII, которую предварительно обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий (ВАР). Полученную плазмиду вводят в компетентную клетку E.coli, JM109, для образования трансформанта. Полученный таким образом трансформант культивируют в течение ночи в 2 мл среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN).The DNA fragment thus obtained was digested with EcoRI and cloned into plasmid pUC19 ΔHindIII, which was pretreated with bacterial alkaline phosphatase (BAP). The resulting plasmid was introduced into a competent E. coli cell, JM109, to form a transformant. The transformant thus obtained was cultured overnight in 2 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin. The plasmid isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN).

Очищенную плазмидную ДНК секвенируют, используя затравки М13 Primer М4 и М13 Primer RV (Takara Shuzo), с помощью секвенатора ДНК 373А (ABI). Плазмида, с подтвержденной правильной последовательностью оснований, названа "Сκ/pUC 19".The purified plasmid DNA was sequenced using the primers M13 Primer M4 and M13 Primer RV (Takara Shuzo) using a 373A DNA sequencer (ABI). The plasmid, with the correct sequence of bases confirmed, is named "Cκ / pUC 19".

(3) Конструирование экспрессирующего вектор L-цепи химерного антитела(3) Construction of a Chimeric Antibody L-Vector Expressing Vector

Конструируют экспрессирующий вектор L-цепи химерного антитела №23-57-137-1. ДНК, кодирующую V-область L-цепи №23-57-137-1, лигируют с сайтами HindIII и Binl, расположенными непосредственно перед С-областью антитела человека, обеих плазмид Cλ/pUC19 и Cκ/pUC19, в результате чего получают векторы pUC19, содержащие ДНК, кодирующую V-область L-цепи химерного антитела № 23-57-137-1 и С-область λ- или κ-цепи L-цепи. Оба вектора затем расщепляют EcoRI, чтобы вырезать ДНК, кодирующую L-цепь химерного антитела, которую затем субклонируют в экспрессирующем векторе HEF.The expression vector of the L chain of the chimeric antibody No. 23-57-137-1 is constructed. DNA encoding the V region of the L chain No. 23-57-137-1 is ligated to the HindIII and Binl sites located immediately in front of the C region of the human antibody of both plasmids Cλ / pUC19 and Cκ / pUC19, resulting in pUC19 vectors containing DNA encoding the V region of the L chain of the chimeric antibody No. 23-57-137-1 and the C region of the λ or κ chain of the L chain. Both vectors are then digested with EcoRI to excise DNA encoding the L chain of the chimeric antibody, which is then subcloned into the HEF expression vector.

ДНК, кодирующую V-область L-цепи антитела №23-57-137-1, клонируют из плазмиды MBC1L24 по методу PCR. Отдельные затравки синтезируют с помощью синтезатора ДНК/РНК 394 (ABI). Обратную затравку MBCCHL1 (последовательность с идентификационным №21) конструируют таким образом, чтобы она содержала HindIII-узнающую последовательность и последовательность Козака (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987), и прямую затравку MBCCHL3 (последовательность с идентификационным №22) конструируют таким образом, чтобы она содержала BgII- и RcoRI-узнающие последовательности.DNA encoding the V region of the L chain of antibody No. 23-57-137-1 was cloned from the plasmid MBC1L24 by PCR. Individual seeds are synthesized using a DNA / RNA 394 synthesizer (ABI). The seed MBCCHL1 (sequence with identification No. 21) is designed so that it contains the HindIII-recognizing sequence and the Kozak sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987), and direct the seed MBCCHL3 (sequence with identification No. 22) is designed so that it contains BgII and RcoRI-recognizing sequences.

Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют, используя 100 мкл реакционного раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 0,1 мкг MBC1L24, по 50 пмолей затравок MBCCHL1 и MBCCHL3 и 1 мкл AmpliTaq (Perkin Elmer), поверх которого помещают 50 мкл минерального масла. Выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 45 секунд, 60°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 2 минут.The polymerase chain synthesis reaction is carried out using 100 μl of a reaction solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 0.1 μg MBC1L24, 50 each pmole seeds MBCCHL1 and MBCCHL3 and 1 μl AmpliTaq (Perkin Elmer), on top of which 50 μl of mineral oil is placed. Thirty cycles of the polymerase chain synthesis reaction were performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 2 minutes.

Фрагмент ДНК длиной 444 пары оснований подвергают электрофорезу в 3% низкоплавком агарозном геле, собирают и очищают с помощью набора GENECLEAN (BIO 101). Очищенный фрагмент ДНК растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA. Один мкл продукта полимеразной реакции синтеза цепи расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 50 мМ NaCl, 8 единиц HindIII (Takara Shuzo) и 8 единиц EcoRI (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа. Гидролизованный раствор экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК этанолом. Полученную таким образом ДНК растворяют в 8 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.A 444 bp DNA fragment was subjected to electrophoresis on a 3% low melting agarose gel, collected and purified using the GENECLEAN kit (BIO 101). The purified DNA fragment was dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA. One μl of the product of the polymerase chain reaction is digested in 20 μl of a reaction solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 50 mM NaCl, 8 units of HindIII (Takara Shuzo) and 8 units EcoRI (Takara Shuzo), at a temperature of 37 ° C for 1 hour. The hydrolyzed solution is extracted with phenol and chloroform and DNA is precipitated with ethanol. The DNA thus obtained was dissolved in 8 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA.

Один мкг плазмиды pUC19 расщепляют HindIII и EcoRI аналогично вышеописанной процедуре, экстрагируют фенолом и хлороформом, после чего расщепленную плазмиду осаждают этанолом. Полученный продукт обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий [то есть щелочной фосфатазой (E.coli C75; Takara Shuzo)], экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК этанолом. Полученную ДНК растворяют в 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС! (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.One μg of plasmid pUC19 was digested with HindIII and EcoRI in the same manner as described above, extracted with phenol and chloroform, after which the digested plasmid was precipitated with ethanol. The resulting product is treated with bacterial alkaline phosphatase [i.e., alkaline phosphatase (E. coli C75; Takara Shuzo)], extracted with phenol and chloroform, and DNA is precipitated with ethanol. The resulting DNA is dissolved in 10 μl of a solution containing 10 mm Tris-NS! (pH 7.4) and 1 mM EDTA.

Один мкл обработанной щелочной фосфатазой плазмиды pUC19 смешивают с 4 мкл вышеуказанного продукта полимеразной реакции синтеза цепи, чтобы лигировать их друг с другом при помощи набора для лигирования ДНК, вариант 2 (Takara Shuzo). Полученную плазмиду вводят в компетентную клетку Е. coli, JM109 (Nippon Gene) аналогично процедуре, описанной выше для образования трансформанта. Полученный трансформант инокулируют в течение ночи на агаровой среде 2хYТ, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С. Затем полученный трансформант культивируют в течение ночи в 2 мл среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С. Выделенную из клеточной фракции плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN). После определения последовательности ДНК, плазмида, с подтвержденной правительной последовательностью ДНК, названа "CHL/pUC19".One μl of alkaline phosphatase-treated plasmid pUC19 was mixed with 4 μl of the above product of the polymerase chain synthesis polymerase reaction to ligate them with each other using the DNA ligation kit, option 2 (Takara Shuzo). The resulting plasmid was introduced into a competent cell of E. coli, JM109 (Nippon Gene) similarly to the procedure described above for the formation of a transformant. The obtained transformant was inoculated overnight on 2xYT agar medium containing 50 μg / ml ampicillin at a temperature of 37 ° C. Then, the obtained transformant was cultured overnight in 2 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin at a temperature of 37 ° C. The plasmid isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN). After determining the DNA sequence, the plasmid, with the confirmed correct DNA sequence, is named "CHL / pUC19".

По одному мкг плазмид Cλ/pUC19 и Cκ/pUC19 расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 100 мМ KCl, 8 единиц HindIII (Takara Shuzo) и 2 единицы BInI (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа. Гидролизованный раствор экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК этанолом. Полученную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий при температуре 37°С в течение 30 минут, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. Полученный продукт растворяют в 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.One μg of plasmids Cλ / pUC19 and Cκ / pUC19 was digested in 20 μl of a reaction solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 100 mM KCl, 8 units of HindIII (Takara Shuzo ) and 2 units of BInI (Takara Shuzo), at a temperature of 37 ° C for 1 hour. The hydrolyzed solution is extracted with phenol and chloroform and DNA is precipitated with ethanol. The resulting DNA is treated with bacterial alkaline phosphatase at a temperature of 37 ° C for 30 minutes, extracted with phenol and chloroform and precipitated with ethanol. The resulting product was dissolved in 10 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA.

Восемь мкг плазмиды CHL/pUC19, которая содержит ДНК, кодирующую V-область L-цепи №23-57-137-1, расщепляют HindIII и В1nI так, как это описано выше. Полученный таким образом фрагмент ДНК длиной 409 пар оснований подвергают электрофорезу в 3% низкоплавком агарозном геле, собирают и очищают от геля с помощью набора GENECLEAN (BIO 101). Этот фрагмент ДНК растворяют в 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.Eight μg of the plasmid CHL / pUC19, which contains DNA encoding the V region of the L chain No. 23-57-137-1, cleave HindIII and B1nI as described above. The 409 bp DNA fragment thus obtained was subjected to electrophoresis on a 3% low melting agarose gel, and the gel was collected and purified using the GENECLEAN kit (BIO 101). This DNA fragment was dissolved in 10 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA.

Четыре мкл ДНК V-области L-цепи субклонируют в 1 мкл обработанных щелочной фосфатазой плазмид Cλ/pUC19 или Cκ/pUC19 и вводят в компетентную клетку E.coli, JM109, с целью получения трансформанта. Полученный трансформант культивируют в течение ночи в 3 мл среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN). Полученные таким образом плазмиды соответственно названы "MBC1L(λ)/pUC19" и "MBC1L(κ)/pUC19".Four μl of DNA of the V region of the L chain are subcloned into 1 μl of alkali phosphatase-treated plasmids Cλ / pUC19 or Cκ / pUC19 and introduced into a competent E. coli cell, JM109, to obtain a transformant. The resulting transformant was cultured overnight in 3 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin. The plasmid isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN). The plasmids thus obtained are respectively named "MBC1L (λ) / pUC19" and "MBC1L (κ) / pUC19".

Плазмиды MBC1L(λ)/pUC19 и MBC1L(κ)/pUC19 расщепляют EcoRI и подвергают электрофорезу в 3% низкоплавком агарозном геле. Выделяют фрагмент ДНК длиной 743 пары оснований, очищают его от геля с помощью набора GENECLEANII (BIO 101) и растворяют в 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.Plasmids MBC1L (λ) / pUC19 and MBC1L (κ) / pUC19 cleave EcoRI and electrophoresis on a 3% low melting agarose gel. A 743 base pair DNA fragment was isolated, gel was purified using the GENECLEANII kit (BIO 101) and dissolved in 10 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA.

Экспрессирующий вектор плазмиды HEF-PMlk-gk (2,7 мкг) расщепляют EcoRI, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают фрагмент ДНК этанолом. Полученный фрагмент ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий и подвергают электрофорезу в 1% низкоплавком агарозном геле. Фрагмент ДНК длиной 6561 пар оснований выделяют и очищают от геля с помощью набора GENECLEANII (BIO 101). Фрагмент ДНК растворяют в 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.HEF-PMlk-gk plasmid expression vector (2.7 μg) was digested with EcoRI, extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragment was precipitated with ethanol. The resulting DNA fragment is treated with bacterial alkaline phosphatase and subjected to electrophoresis in 1% low melting agarose gel. A 6561 bp DNA fragment was isolated and gel purified using the GENECLEANII kit (BIO 101). The DNA fragment was dissolved in 10 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA.

Полученный таким образом вектор HEF обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий и 2 мкл обработанного щелочной фосфатазой вектора HEF смешивают с 3 мкл EcoRI-фрагментов плазмид MBC1L(λ)/pUC19 или MBC1L(κ)/pUC19, чтобы лигировать их друг с другом. Продукт лигирования вводят в компетентную клетку Е. coli, JM109, для образования трансформанта. Полученный трансформант культивируют в 2 мл среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIPprep (QIAGEN).The HEF vector thus obtained is treated with bacterial alkaline phosphatase and 2 μl of alkaline phosphatase-treated HEF vector is mixed with 3 μl of EcoRI fragments of plasmids MBC1L (λ) / pUC19 or MBC1L (κ) / pUC19 to ligate with each other. The ligation product is introduced into a competent E. coli cell, JM109, to form a transformant. The resulting transformant was cultured in 2 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin. The plasmid isolated from the cell fraction was purified using the QIPprep plasmid purification kit (QIAGEN).

Очищенную таким образом плазмидную ДНК расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 100 мМ КС1, 8 единиц HindIII (Takara Shuzo) и 2 единицы Pvul (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа. Предполагается, что, если вышеуказанный фрагмент ДНК введен в вектор с правильной ориентацией, то в результате гидролиза будет получен расщепленный фрагмент длиной 5104/2195 пар оснований, и если вышеуказанный фрагмент ДНК введен в вектор с обратной ориентацией, то будет получен расщепленный фрагмент длиной 4387/2926 пар оснований. Исходя из этого предположения плазмиды, в которых данный фрагмент ориентирован правильно, названы соответственно "MBC1L(λ)/neo" и "МВС1L(κ)/neo".The plasmid DNA thus purified is digested in 20 μl of the reaction solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 100 mM KCl, 8 units of HindIII (Takara Shuzo) and 2 units of Pvul ( Takara Shuzo), at a temperature of 37 ° C for 1 hour. It is assumed that if the above DNA fragment is inserted into the vector with the correct orientation, then a digested fragment of 5104/2195 base pairs will be obtained by hydrolysis, and if the above DNA fragment is introduced into the vector with a reverse orientation, then a split fragment of 4387 / 2926 base pairs. Based on this assumption, plasmids in which this fragment is oriented correctly are named MBC1L (λ) / neo and MBC1L (κ) / neo, respectively.

(4) Трансфекция клеток COS-7(4) Transfection of COS-7 cells

Полученные выше экспрессирующие плазмиды временно экспрессируют в клетках COS-7, чтобы определить связывающую и нейтрализующую активность химерного антитела против антигена.The expression plasmids obtained above are temporarily expressed in COS-7 cells to determine the binding and neutralizing activity of the chimeric antibody against antigen.

Временную экспрессию химерного антитела осуществляют, используя комбинацию плазмид МВС1НкДНК/рСOS1 и MBClL(λ)/neo или плазмид МВС1НкДНК/рСOS1 и MBC1L(κ)/neo, по методу электропорации с помощью электроимпульсного устройства Gene Pulser (Bio Rad) для котрансфекции этих комбинаций плазмидных ДНК в клетки COS-7. То есть к 0,8 мл суспензии клеток COS-7 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS(-)) с концентрацией 1×107 клеток/мл добавляют 10 мкг каждой плазмидной ДНК. Полученный раствор подвергают воздействию импульсов при электростатической емкости 1500 В и силе тока 2 мкФ, чтобы вызвать электропорацию. Раствор выдерживают в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего клетки суспендируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 2% фетальной телячьей сыворотки с ультранизким содержанием IgG (GIBCO), и культивируют в 10 см чашке в инкубаторе с CO2. Клетки культивируют в течение 72 часов, после чего культуральный супернатант собирают, центрифугируют для удаления клеточного дебриса и используют в качестве образца для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).Temporary expression of the chimeric antibody is performed using a combination of MVC1NcDNA / pCOS1 and MBClL (λ) / neo plasmids or MBC1NcDNA / pCOS1 and MBC1L (κ) / neo plasmids according to the electroporation method using an electropulse device Gene Pulser (Bio Rad) for cotransfection of these combinations DNA into COS-7 cells. That is, to 0.8 ml of a suspension of COS-7 cells in phosphate buffered saline (PBS (-)) with a concentration of 1 × 10 7 cells / ml, 10 μg of each plasmid DNA is added. The resulting solution is subjected to pulses at an electrostatic capacity of 1500 V and a current strength of 2 μF to cause electroporation. The solution was incubated for 10 minutes at room temperature, after which the cells were suspended in the Dulbecco modified Eagle medium containing 2% fetal calf serum with ultra low IgG content (GIBCO), and cultured in a 10 cm dish in a CO 2 incubator. Cells were cultured for 72 hours, after which the culture supernatant was harvested, centrifuged to remove cell debris, and used as a sample for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

При выполнении этой процедуры очистку химерных антител от культурального супернатанта клеток COS-7 производят с помощью набора AffiGel Protein A MAPSII (Bio Rad) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями.When this procedure is performed, the chimeric antibodies are purified from the culture supernatant of COS-7 cells using the AffiGel Protein A MAPSII kit (Bio Rad) in accordance with the instructions attached to it.

(5) Твердофаэный иммуноферментный анализ (ELISA)(5) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

(i) Определение концентрации антител(i) Determination of antibody concentration

Планшет для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), предназначенный для определения концентрации антител, готовят следующим образом. Во все лунки 96-луночного планшета для ELISA (Maxisorp, NUNC) вводят 100 мкл раствора, содержащего антитело козы против IgG человека (TAGO), в буфере для сенсибилизации поверхностей (0,1М раствор NaHCO3, 0,02% NaN3), с концентрацией 1 мкг/мл и блокируют 200 мкл буфера для разведения [50 мМ трис-HCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 0,05% твина-20, 0,02% NaN3, 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA); рН 7,2]. Во все лунки добавляют культуральный супернатант клеток COS-7, в которых были экспрессированы химерные антитела или очищенные химерные антитела, полученные в результате последовательного разведения. Содержимое лунок инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа и промывают смесью забуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20, после чего в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора конъюгированных со щелочной фосфатазой антител козы против IgG человека (TAGO). Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа, промывают смесью забуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20 и добавляют в каждую лунку 1 мг/мл раствора субстрата ("Sigma 104", паранитрофенилфосфорная кислота, SIGMA). У полученного раствора измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм, используя аппарат для прочтения микропланшетов (Bio Rad). В качестве эталона при выполнении этого измерения используют очищенный иммуноглобулин IgG1λ человека (сайт связывания).A plate for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), designed to determine the concentration of antibodies, is prepared as follows. 100 μl of a solution containing goat anti-human IgG antibody (TAGO) was added to all wells of a 96-well ELISA plate (Maxisorp, NUNC) in a surface sensitization buffer (0.1 M NaHCO 3 solution, 0.02% NaN 3 ), with a concentration of 1 μg / ml and block 200 μl of dilution buffer [50 mm Tris-HCl, 1 mm MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween-20, 0.02% NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA); pH 7.2]. The culture supernatant of COS-7 cells in which chimeric antibodies or purified chimeric antibodies obtained by serial dilution were expressed was added to all wells. The contents of the wells were incubated at room temperature for 1 hour and washed with a mixture of phosphate buffered saline and Tween-20, after which 100 μl of a solution of goat anti-human IgG antibodies conjugated with alkaline phosphatase (TAGO) was added. The resulting mixture was incubated at room temperature for 1 hour, washed with a mixture of phosphate buffered saline and Tween-20, and 1 mg / ml of substrate solution (Sigma 104, paranitrophenylphosphoric acid, SIGMA) was added to each well. The optical density of the resulting solution was measured at a wavelength of 405 nm using a microplate reader (Bio Rad). Purified human IgG1λ immunoglobulin (binding site) is used as a reference for this measurement.

(ii) Определение антигенсвязывающей способности(ii) Determination of antigen binding ability

Планшет для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), предназначенный для определения антигенсвязывающей способности, готовят следующим образом. Во все лунки 96-луночного планшета вводят 100 мкл раствора, содержащего PTHrP человека (1-34) (Peptide Research Institute), в буфере для сенсибилизации поверхностей с концентрацией 1 мкг/мл, и блокируют 200 мкл буфера для разведения. Во все лунки добавляют культуральный супернатант клеток COS-7, в которых были экспрессированы химерные антитела или очищенные химерные антитела, полученные в результате последовательного разведения. Содержимое лунок инкубируют при комнатной температуре и промывают смесью забуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20, после чего в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора конъюгированных со щелочной фосфатазой антител козы против IgG человека (TAGO). Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре, промывают смесью забуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20 и добавляют в каждую лунку 1 мг/мл раствор субстрата ("Sigma 104", паранитрофенилфосфорная кислота, SIGMA). У полученного раствора измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм, используя аппарат для прочтения микропланшетов (Bio Rad).A plate for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), designed to determine the antigen binding capacity, is prepared as follows. 100 μl of a solution containing human PTHrP (1-34) (Peptide Research Institute) was added to all wells of a 96-well plate in a surface sensitization buffer at a concentration of 1 μg / ml, and 200 μl of dilution buffer was blocked. The culture supernatant of COS-7 cells in which chimeric antibodies or purified chimeric antibodies obtained by serial dilution were expressed was added to all wells. The contents of the wells are incubated at room temperature and washed with a mixture of phosphate buffered saline and Tween-20, after which 100 μl of a solution of goat anti-human IgG antibodies (TAGO) conjugated with alkaline phosphatase are added to each well. The resulting mixture was incubated at room temperature, washed with a mixture of phosphate buffered saline and Tween-20, and a 1 mg / ml substrate solution (Sigma 104, paranitrophenylphosphoric acid, SIGMA) was added to each well. The optical density of the resulting solution was measured at a wavelength of 405 nm using a microplate reader (Bio Rad).

Результаты этого анализа показывают, что химерное антитело обладает связывающей способностью против PTHrP человека (1-34) и имеет правильную структуру V-области клонированного антитела мыши. Кроме того, установлено, что не существует различия между связывающей способностью против PTHrP (1-34) химерного антитела, в котором С-область L-цепи имеет λ-цепь, и химерного антитела, в котором С-область L-цепи имеет κ-цепь. Поэтому С-область L-цепи очеловеченного антитела конструируют с использованием λ-цепи L-цепи очеловеченного антитела.The results of this analysis show that the chimeric antibody has binding ability against human PTHrP (1-34) and has the correct structure of the V region of the cloned mouse antibody. In addition, it was found that there is no difference between the binding ability against PTHrP (1-34) of a chimeric antibody in which the C region of the L chain has a λ chain and a chimeric antibody in which the C region of the L chain has κ- chain. Therefore, the C region of the L chain of the humanized antibody is constructed using the λ chain of the L chain of the humanized antibody.

(6) Создание стабильно трансформированной линии клеток яичника китайского хомячка (СНО)(6) Creation of a stably transformed Chinese hamster ovary cell line (CHO)

Чтобы создать стабильный трансформант для химерного антитела, вышеуказанную экспрессирующую плазмиду вводят в клетку СНО (DXB11).To create a stable transformant for the chimeric antibody, the above expression plasmid is introduced into the CHO cell (DXB11).

Стабильный трансформант для химерного антитела создают, используя комбинации экспрессирующих плазмид для клетки СНО, МВС1НкДНК/рСНO1 и MBC1L(λ)/neo, или экспрессирующих плазмид для клетки СНО, МВС1НкДНК/рСНO1 и MBC1L(κ)/neo. Эти комбинации плазмид по отдельности котрансфецируют в клетки СНО по методу электропорации с помощью устройства Gene Pulser (Bio Rad). Все экспрессирующие векторы расщепляют рестрикционным ферментом Pvul с получением линейной ДНК. Полученную ДНК экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. Полученные таким образом плазмидные ДНК подвергают электропорации. К 0,8 мл суспензии клеток СНО в PBS(-) с концентрацией 1×107 клеток/мл добавляют 10 мкг каждой плазмидной ДНК. Полученную смесь подвергают воздействию импульсов при электростатической емкости 1500 В и силе тока 2 мкФ. Электропорированные клетки выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут и суспендируют в среде МЕМ-α(GIBCO), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (GIBCO). Полученную суспензию культивируют на трех 96-луночных планшетах (Falcon) в инкубаторе с CO2. На следующий день после начала культивирования эту среду заменяют селективной средой [среда МЕМ-α, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (GIBCO) и 500 мг/мл GENETICIN (G418Sulfate; GIBCO) без рибонуклеозида или дезоксирибонуклеозида]. Из культуральной среды отбирают клетки, в которые введен ген антитела. Селективную среду заменяют свежей средой до культивирования и через две недели культивирования, после чего клетки исследуют под микроскопом. В клетках, характеризующихся удовлетворительным ростом, определяют количество антител, полученных в результате выполнения вышеуказанного твердофазного иммуноферментного анализа. Избирательно собирают клетки, которые продуцировали наибольшее количество антител.A stable transformant for a chimeric antibody is created using combinations of expression plasmids for CHO, MBC1HcDNA / pCHO1 and MBC1L (λ) / neo cells, or expressing plasmids for CHO, MBC1HcDNA / pCHO1 and MBC1L (κ) / neo cells. These combinations of plasmids are individually cotransfected into CHO cells by electroporation using a Gene Pulser (Bio Rad) device. All expression vectors are digested with the restriction enzyme Pvul to give linear DNA. The resulting DNA was extracted with phenol and chloroform and precipitated with ethanol. Thus obtained plasmid DNA is subjected to electroporation. To 0.8 ml of a suspension of CHO cells in PBS (-) with a concentration of 1 × 10 7 cells / ml add 10 μg of each plasmid DNA. The resulting mixture is subjected to pulses at an electrostatic capacity of 1500 V and a current strength of 2 μF. The electroporated cells were kept at room temperature for 10 minutes and suspended in MEM-α (GIBCO) containing 10% fetal calf serum (GIBCO). The resulting suspension was cultured in three 96-well plates (Falcon) in a CO 2 incubator. The day after the start of cultivation, this medium is replaced with selective medium [MEM-α medium containing 10% fetal calf serum (GIBCO) and 500 mg / ml GENETICIN (G418Sulfate; GIBCO) without ribonucleoside or deoxyribonucleoside]. Cells into which the antibody gene is introduced are selected from the culture medium. The selective medium is replaced with fresh medium before cultivation and after two weeks of cultivation, after which the cells are examined under a microscope. In cells characterized by satisfactory growth, the number of antibodies obtained by performing the above enzyme-linked immunosorbent assay is determined. Selectively collect the cells that produced the highest number of antibodies.

Повышение уровня культуры стабильного трансформанта для полученных антител производят во вращающемся флаконе с использованием минимальной поддерживающей среды (MEM), дополненной 2% фетальной телячьей сыворотки с ультранизким содержанием IgG без рибонуклеозида или дезоксирибонуклеозида. На 3-й и 4-й день культивирования культуральный супернатант собирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм (Millipore), чтобы удалить клеточный дебрис.An increase in the level of stable transformant culture for the obtained antibodies is carried out in a rotating vial using a minimum support medium (MEM) supplemented with 2% fetal calf serum with ultra-low IgG content without ribonucleoside or deoxyribonucleoside. On the 3rd and 4th day of cultivation, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.2 μm filter (Millipore) to remove cell debris.

Затем химерные антитела очищают от культурального супернатанта клеток СНО в колонке POROS, заполненной белком А (PerSeptive Biosystems), на ConSep LC100 (Millipore) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Очищенные химерные антитела используют в качестве образцов для определения нейтрализующей активности и для исследования эффективности на животных моделях гиперкальциемии. Концентрацию и связывающую активность очищенных химерных антител против антигена определяют с помощью аналогичной системы для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA.Chimeric antibodies are then purified from the CHO cell culture supernatant in a POROS column filled with protein A (PerSeptive Biosystems) on a ConSep LC100 (Millipore) in accordance with the attached instructions. Purified chimeric antibodies are used as samples to determine neutralizing activity and to study efficacy in animal models of hypercalcemia. The concentration and binding activity of purified chimeric antibodies against antigen is determined using a similar system for enzyme-linked immunosorbent assay ELISA.

Пример 3Example 3

Конструирование очеловеченного антителаConstruction of humanized antibodies

(1) Конструирование Н-цепи очеловеченного антитела(1) Construction of the H chain of humanized antibodies

(i) Конструирование очеловеченной V-области Н-цепи(i) Construction of the humanized V region of the H chain

Н-цепь очеловеченного антитела №23-57-137-1 получают путем трансплантации гипервариабельного участка по методу PCR. Чтобы получить Н-цепь очеловеченного антитела №23-57-137-1 (вариант "а"), имеющую каркасную область, выделенную из антитела человека S31679 (NMRF-PDB; Cuisinier, A.M. et al., Eur. J.Iinmunol., 23, 110-118, 1993), используют следующие шесть типов затравок для полимеразной реакции синтеза цепи: затравки для трансплантации гипервариабельных участков MBC1PGP1 (последовательность с идентификационным №23) и MBC1HGP3 (последовательность с идентификационным №24) (обе содержат смысловую последовательность ДНК) и MBC1HGP2 (последовательность с идентификационным №25) и MBC1HGP4 (последовательность с идентификационным №26) (обе содержат антисмысловую последовательность ДНК), которые с обоих концов имеют комплементарную последовательность длиной 15-21 пар оснований; внешние затравки MBC1HVS1 (последовательность с идентификационным №27) и MBC1HVR1 (последовательность с идентификационным №28), которые соответственно гомологичны затравкам для трансплантации гипервариабельных участков MBC1HGP1 и MBC1HGP4.The humanized antibody H chain No. 23-57-137-1 is obtained by transplantation of a hypervariable region by PCR. To obtain the H chain of a humanized antibody No. 23-57-137-1 (option "a") having a frame region isolated from human antibody S31679 (NMRF-PDB; Cuisinier, AM et al., Eur. J. Iinmunol., 23, 110-118, 1993), the following six types of seeds for the polymerase chain synthesis reaction are used: seeds for transplantation of the hypervariable regions of MBC1PGP1 (sequence with identification number 23) and MBC1HGP3 (sequence with identification number 24) (both contain a sense DNA sequence) and MBC1HGP2 (sequence with identification number 25) and MBC1HGP4 (sequence with ide ification No. 26) (both contain an antisense DNA sequence), which on both ends have a complementary sequence of 15-21 base pairs long; external seeds MBC1HVS1 (sequence with identification No. 27) and MBC1HVR1 (sequence with identification No. 28), which are respectively homologous to seeds for transplantation of the hypervariable regions MBC1HGP1 and MBC1HGP4.

Затравки для трансплантации гипервариабельных участков MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 и MBC1HGP4 выделяют с помощью денатурированного мочевиной полиакриламидного геля (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) и экстрагируют из гель-фракции методом измельчения и вымачивания (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), выполняя эту процедуру следующим образом.Seeds for transplantation of the hypervariable regions MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4 were isolated using urea-denatured polyacrylamide gel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and extracted from the gel by gel soaking (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), performing this procedure as follows.

С помощью 6% денатурированного полиакриламидного геля выделяют по одному нмолю всех затравок для трансплантации гипервариабельного участка с получением фрагментов ДНК. Полученные фрагменты ДНК требуемой длины идентифицируют на тонкой пластинке силикагеля, облучаемой ультрафиолетом, и удаляют их методом измельчения и вымачивания. Полученный продукт растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA. Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo). Реакционный раствор (100 мкл), используемый для осуществления полимеразной реакции синтеза цепи, содержит по 1 мкл вышеуказанных затравок для трансплантации гипервариабельных участков MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 и MBC1HGP4, 0,25 мМ dNTP и 2,5 единицы TaKaRa Ex Taq в буфере. Выполняют пять циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 55°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты. К полученной реакционной смеси добавляют обе внешние затравки MBC1HVS1 и MBC1HVR1 в количестве 50 пмолей. Используя эту реакционную смесь, выполняют еще 30 циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с той же программой циклического изменения температуры. Амплифицированный таким образом фрагмент ДНК выделяют путем электрофореза в агарозном геле с использованием 4% агарозы Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products).Using a 6% denatured polyacrylamide gel, one nmole of all seeds is isolated for transplantation of the hypervariable region to produce DNA fragments. The obtained DNA fragments of the required length are identified on a thin silica gel plate irradiated with ultraviolet light and removed by grinding and soaking. The resulting product was dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA. The polymerase chain synthesis reaction is carried out using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo). The reaction solution (100 μl) used to carry out the polymerase chain synthesis reaction contains 1 μl of the above seeds for transplantation of the hypervariable regions MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4, 0.25 mM dNTP and 2.5 TaKaRa Ex Taq units in buffer. Perform five cycles of the polymerase reaction of chain synthesis in accordance with the program of cyclic temperature changes in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute. To the resulting reaction mixture were added both external seeds MBC1HVS1 and MBC1HVR1 in an amount of 50 pmoles. Using this reaction mixture, another 30 cycles of the polymerase chain synthesis reaction are performed in accordance with the same cyclic temperature change program. The DNA fragment thus amplified was isolated by agarose gel electrophoresis using 4% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Затем вырезают участок агарозы, содержащий фрагмент ДНК длиной 421 пар оснований, и очищают указанный фрагмент ДНК при помощи набора GENECLEANII (BIO 101) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями. Очищенный фрагмент ДНК осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA. Реакционную смесь для полимеразной реакции синтеза цепи используют для субклонирования этого фрагмента ДНК в плазмиде pUC19, которую предварительно расщепляют BamHI и HindIII, после чего определяют последовательность оснований полученной плазмиды. Плазмида, имеющая правильную последовательность, названа "hMBCHv/pUC19".Then cut out a plot of agarose containing a DNA fragment with a length of 421 base pairs, and clean the indicated DNA fragment using the GENECLEANII kit (BIO 101) in accordance with the instructions attached thereto. The purified DNA fragment is precipitated with ethanol and dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA. The reaction mixture for the polymerase chain synthesis reaction is used to subclone this DNA fragment in plasmid pUC19, which was previously digested with BamHI and HindIII, after which the base sequence of the obtained plasmid was determined. The plasmid having the correct sequence is named "hMBCHv / pUC19".

(ii) Конструирование V-области Н-цепи для кДНК очеловеченной Н-цепи(ii) Construction of the V region of the H chain for cDNA humanized H chain

ДНК очеловеченной V-области Н-цепи, полученную на предыдущей стадии, модифицируют по методу PCR, чтобы лигировать ее с кДНК очеловеченной Сγ1 С-области Н-цепи. Для этого конструируют обратную затравку MVC1HVS1 так, чтобы она гибридизировала с последовательностью, кодирующей 5'-концевую область лидерной последовательности V-области, имела согласованную последовательность Козака (Kozak et al., J. Mol.Biol. 196, 947-950, 1987) и HindIII- и EcoRI-узнающие последовательности. Прямую затравку MBC1HVR2, используемую для модификации ДНК для V-области Н-цепи, конструируют таким образом, чтобы она гибридизировала с последовательностью ДНК, кодирующей 3'-концевую область J-области, и с последовательностью ДНК, кодирующей 5'-концевую область С-области, и имела AlaI- и SamI-узнающие последовательности.The DNA of the humanized V region of the H chain obtained in the previous step is modified by PCR to ligate it with the cDNA of the humanized Cγ1 C region of the H chain. For this purpose, the MVC1HVS1 seed primer is designed so that it hybridizes with the sequence encoding the 5'-terminal region of the V region leader sequence and has a consistent Kozak sequence (Kozak et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987) and HindIII and EcoRI recognition sequences. The direct seed MBC1HVR2 used to modify DNA for the V region of the H chain is designed to hybridize with the DNA sequence encoding the 3'-terminal region of the J region and the DNA sequence encoding the 5'-terminal region of C regions, and had AlaI and SamI recognition sequences.

Полимеразную реакцию синтеза цепи выполняют с использованием TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) и соответствующего буфера. Реакционный раствор, используемый для полимеразной реакции синтеза цепи, содержит 0,4 мкг hMBCH/pUC19 в качестве матрицы ДНК, по 50 пмолей затравок MBC1HVS2 и MBC1HVR2, 2,5 единицы TaKaRaExTaq и 0,25 мМ dNTP в буфере. Выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 55°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты. Амплифицированный таким образом фрагмент ДНК выделяют посредством электрофореза в агарозном геле с использованием 3% агарозы Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products).The polymerase chain synthesis reaction is performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) and the appropriate buffer. The reaction solution used for the polymerase chain synthesis reaction contains 0.4 μg hMBCH / pUC19 as a DNA template, 50 pmoles of MBC1HVS2 and MBC1HVR2 seeds, 2.5 TaKaRaExTaq units and 0.25 mM dNTP in buffer. Thirty cycles of the polymerase chain synthesis reaction are performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute. The DNA fragment thus amplified was isolated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Фрагмент ДНК длиной 456 пар оснований вырезают и очищают с помощью набора GENECLEANII (BIO 101) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями. Очищенный фрагмент ДНК осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA. Полученную таким образом реакционную смесь используют для субклонирования этого фрагмента ДНК в плазмиде pUC19, которую предварительно расщепляли EcoRI и SmaI, после чего определяют последовательность ДНК полученной плазмиды. Плазмидная ДНК, которая содержит ДНК, кодирующую V-область Н-цепи мыши, выделенную из гибридомы №23-57-137-1, и имеет EcoRI- и HindIII-узнающие последовательности, последовательность Козака у 5'-конца и ApaI- и SmaI-узнающие последовательности у 3'-конца, названа "hMBClHv/pUC19".A DNA fragment with a length of 456 base pairs was excised and purified using the GENECLEANII kit (BIO 101) in accordance with the instructions attached thereto. The purified DNA fragment is precipitated with ethanol and dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA. The reaction mixture thus obtained was used to subclone this DNA fragment in plasmid pUC19, which was previously digested with EcoRI and SmaI, after which the DNA sequence of the resulting plasmid was determined. Plasmid DNA, which contains DNA encoding the V region of the mouse H chain, isolated from hybridoma No. 23-57-137-1, and has EcoRI and HindIII recognition sequences, the Kozak sequence at the 5'end and ApaI and SmaI -recognizing sequences at the 3'-end, called "hMBClHv / pUC19".

(2) Конструирование экспрессирующего вектора для Н-цепи очеловеченного антитела(2) Construction of an expression vector for the H chain of a humanized antibody

Плазмиду RVh-PM1f-кДНК, содержащую последовательность кДНК Н-цепи антитела hPM1, расщепляют ApaI и BamHI с получением фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований С-области Н-цепи. Полученный фрагмент ДНК вводят в плазмиду hMBClHv/pUC19, которую предварительно расщепляют ApaI и BamHI. Полученная таким образом плазмида названа "hМВС1НкДНК/рUС19". Эта плазмида содержит ДНК, кодирующую V-область Н-цепи очеловеченного антитела №23-57-137-1, и ДНК, кодирующую Сγ1 С-области Н-цепи человека, имеет EcoRI- и Hindi II-узнающие последовательности в 5'-концевой области и BamHI-узнающую последовательность в 3'-концевой области. Эта последовательность оснований и соответствующая аминокислотная последовательность очеловеченной Н-цепи варианта "а", имеющиеся в плазмиде hМВС1НкДНК/рUС19, выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№58 и 56.Plasmid RVh-PM1f cDNA containing the hPM1 antibody H chain cDNA sequence was digested with ApaI and BamHI to obtain a DNA fragment containing the base sequence of the C region of the H chain. The resulting DNA fragment was introduced into the hMBClHv / pUC19 plasmid, which was first digested with ApaI and BamHI. The plasmid thus obtained is called "hMBC1HcDNA / pUC19". This plasmid contains DNA encoding the V region of the H chain of the humanized antibody No. 23-57-137-1, and DNA encoding the Cγ1 region of the C region of the human H chain has EcoRI and Hindi II recognition sequences at the 5'-terminal region and BamHI-recognizing sequence in the 3'-terminal region. This base sequence and the corresponding amino acid sequence of the humanized H-chain of variant "a", which are found in the hMBC1NcDNA / pUC19 plasmid, are expressed respectively by sequences with identification Nos. 58 and 56.

Плазмиду hМВС1НкДНК/рUС19 расщепляют EcoRI и BamHI с получением фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований, кодирующую Н-цепь. Полученный фрагмент ДНК вводят в экспрессирующую плазмиду pCOS1, которую предварительно расщепляют EcoRI и BamHI. Полученная таким образом экспрессирующая плазмида для очеловеченного антитела названа "hМВС1НкДНК/рCOS1".Plasmid hMBC1NcDNA / pUC19 was digested with EcoRI and BamHI to obtain a DNA fragment containing the base sequence encoding the H chain. The resulting DNA fragment was introduced into the expression plasmid pCOS1, which was pre-digested with EcoRI and BamHI. The expression plasmid thus obtained for the humanized antibody is called "hMBC1HcDNA / pCOS1".

Чтобы получить плазмиду для экспрессии в клетке СНО, плазмиду hМВС1НкДНК/рUС19 расщепляют EcoRI и BamHI с получением фрагмента ДНК, кодирующего Н-цепь. Полученный фрагмент ДНК вводят в экспрессирующий вектор pCHO1, который получают путем расщепления плазмиды EcoRI и BamHI. Полученная таким образом экспрессирующая плазмида для очеловеченного антитела названа "hВС1НкДНК/рСНО1".To obtain a plasmid for expression in a CHO cell, the hMBC1HcDNA / pUC19 plasmid was digested with EcoRI and BamHI to obtain a DNA fragment encoding the H chain. The resulting DNA fragment is introduced into the expression vector pCHO1, which is obtained by digestion of the plasmid EcoRI and BamHI. The expression plasmid thus obtained for the humanized antibody is called "hBC1HcDNA / pCHO1".

(3) Конструирование L-цепи для вариабельной области гибридного антитела(3) Construction of the L chain for the variable region of a hybrid antibody

(i) Получение гибридного антитела FR1,2/FR3,4(i) Obtaining a hybrid antibody FR1,2 / FR3,4

Конструируют ДНК, кодирующую L-цепь, в которой каркасные области рекомбинированы областями очеловеченного антитела и (химерного) антитела мыши, и оценивают указанные области в отношении их пригодности для очеловечивания. На этом этапе, используя сайт рестрикции AflII, имеющийся в CDR2, получают гибридное антитело, содержащее FR1 и FR2, выделенные из антитела человека, и FR3 и FR4, выделенные из антитела мыши.A DNA coding for the L chain is constructed in which framework regions are recombined with regions of a humanized antibody and a (chimeric) mouse antibody, and these regions are evaluated for their suitability for humanization. At this stage, using the AflII restriction site found in CDR2, a hybrid antibody is obtained containing FR1 and FR2 isolated from a human antibody and FR3 and FR4 isolated from a mouse antibody.

В 100 мкл реакционного раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 50 мМ NaCl, 0,01% (в отношении веса к объему) бычьего сывороточного альбумина и 10 единиц AflII (Takara Shuzo), расщепляют по десять мкг плазмид MBClL(λ)/neo и hMBCIL(λ)/neo при температуре 37°С в течение 1 часа. Реакционный раствор подвергают электрофорезу в 2% низкоплавком агарозном геле, удаляют фрагменты ДНК длиной 6282 пары оснований (определяются как "cl") и длиной 1022 пары оснований (определяются как "h1") и очищают их от геля с помощью набора GENECLEANII (BIO 101).In 100 μl of a reaction solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) bovine serum albumin and 10 units of AflII (Takara Shuzo), ten μg of plasmids MBClL (λ) / neo and hMBCIL (λ) / neo were cleaved at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was subjected to electrophoresis on a 2% low melting agarose gel, 6282 base pairs of DNA (defined as “cl”) and 1022 base pairs of length (defined as “h1”) were removed and the gel was purified using the GENECLEANII kit (BIO 101) .

Один мкг полученных фрагментов с1 и h1 обрабатывают щелочной фосфатазой бактерий (ВАР). Полученный фрагмент ДНК экстрагируют фенолом и этанолом, осаждают этанолом и растворяют в 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.One μg of the resulting fragments c1 and h1 is treated with bacterial alkaline phosphatase (BAP). The resulting DNA fragment was extracted with phenol and ethanol, precipitated with ethanol and dissolved in 10 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA.

Один мкл фрагментов с1 и h1, обработанных щелочной фосфатазой, смешивают соответственно с 4 мкл фрагментов ДНК h2 и с2, чтобы лигировать их друг с другом (при температуре 4°С в течение ночи). Продукт лигирования вводят в компетентную клетку E.coli, JM109, с целью получения трансформанта. Полученный трансформант культивируют в 2 мл среды 2хYТ, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN).One μl of fragments c1 and h1 treated with alkaline phosphatase are mixed with 4 μl of DNA fragments h2 and c2, respectively, to ligate with each other (at 4 ° C overnight). The ligation product is introduced into a competent E. coli cell, JM109, in order to obtain a transformant. The obtained transformant was cultured in 2 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin. The plasmid isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN).

Очищенную плазмидную ДНК расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 10 мМ трис-НС! (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 2 единицы ApaLI (Takara Shuzo) и 8 единиц BamHI (Takara Shuzo) или HindIII (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа. На этой стадии производят идентификацию плазмиды, полагая, что, если фрагмент c1-h2 правильно лигирован в плазмиде, это лигирование должно давать ApaLI-расщепленный фрагмент, содержащий 5560/1246/498 пар оснований, или BamHI/HindIII-расщепленный фрагмент, содержащий 7134/269 пар оснований.The purified plasmid DNA is digested in 20 μl of a reaction solution containing 10 mM Tris-HC! (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 2 units of ApaLI (Takara Shuzo) and 8 units of BamHI (Takara Shuzo) or HindIII (Takara Shuzo), at a temperature of 37 ° C for 1 hour. At this stage, the plasmid is identified, assuming that if the c1-h2 fragment is correctly ligated in the plasmid, this ligation should produce an ApaLI-cleaved fragment containing 5560/1246/498 base pairs, or a BamHI / HindIII-cleaved fragment containing 7134 / 269 base pairs.

Экспрессирующий вектор, кодирующий L-цепь гибридного антитела мыши, содержащего FR1,2 человека и FR3,4 мыши, назван "h/mMBC1L(λ)/neo". С другой стороны, нельзя получить клон для h1-c1. Поэтому производят рекомбинацию на векторе pUC с последующим клонированием в векторе HEF. В качестве матриц используют плазмиду hMBC1Laλ/pUC19, которая содержит ДНК, кодирующую V-область L-цепи очеловеченного антитела без аминокислотных замен, и плазмиду hMBClLdλ/pUC19, которая содержит ДНК, кодирующую V-область L-цепи очеловеченного антитела с заменой аминокислоты в 91-положении каркасной области FR3 (аминокислота №87 в соответствии с определением Кабата), то есть тирозина, изолейцином.The expression vector encoding the L chain of a mouse hybrid antibody containing human FR1.2 and mouse FR3.4 is named "h / mMBC1L (λ) / neo". On the other hand, you cannot get a clone for h1-c1. Therefore, recombination is performed on the pUC vector, followed by cloning in the HEF vector. As matrices, the plasmid hMBC1Laλ / pUC19, which contains DNA encoding the V region of the humanized L chain of the human antibody without amino acid substitutions, and the plasmid hMBClLdλ / pUC19, which contains DNA encoding the human body of the L chain V region of humanized antibody with 91 amino acid substitution the position of the FR3 framework region (amino acid No. 87 according to the definition of Kabat), that is, tyrosine, isoleucine.

В 30 мкл реакционного раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 50 мМ NaCl, 0,01% (в отношении веса к объему) бычьего сывороточного альбумина, 16 единиц HindIII и 4 единицы AfIII, расщепляют по десять мкл плазмид MBC1L(λ)/pUC19, hMBC1Laλ/pUC19 и hMBC1Ldλ/pUC19 при температуре 37°С в течение 1 часа. Реакционный раствор обрабатывают электрофорезом в 2% низкоплавком агарозном геле, после чего собирают и очищают с помощью набора GENECLEANII (BIO 101) следующие фрагменты ДНК: фрагмент ДНК длиной 215 пар оснований из плазмиды MBC1L(λ)/pUC19 (определяется как "с2'") или фрагмент ДНК длиной 3218 пар оснований из плазмид hMBC1Laλ/pUC19 и hMBClLdλ/pUC19 (определяются соответственно как "hal'" и "hdl'").In 30 μl of a reaction solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) bovine serum albumin, 16 units of HindIII and 4 AfIII units, cleave ten μl of plasmids MBC1L (λ) / pUC19, hMBC1Laλ / pUC19 and hMBC1Ldλ / pUC19 at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was electrophoresed on a 2% low melting agarose gel, after which the following DNA fragments were collected and purified using the GENECLEANII kit (BIO 101): DNA fragment 215 base pairs long from the plasmid MBC1L (λ) / pUC19 (defined as “c2 ')) or a 3218 base pair DNA fragment from the hMBC1Laλ / pUC19 and hMBClLdλ / pUC19 plasmids (defined as “hal '” and “hdl”, respectively).

Фрагменты hal' и hdl' по отдельности лигируют с фрагментом с2' и вводят в компетентную клетку E.coli с целью получения трансформанта. Полученный трансформант культивируют в 2 мл среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмиду очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN). Полученные плазмидные ДНК, содержащие фрагмент hal' и фрагмент hdl', названы соответственно "m/hMBClLaλ/pUC19" и "m/hMBClLdλ/pUC19".The hal 'and hdl' fragments are individually ligated with the c2 'fragment and introduced into a competent E. coli cell in order to obtain a transformant. The resulting transformant was cultured in 2 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin. The plasmid isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN). The resulting plasmid DNAs containing the hal 'fragment and the hdl' fragment are named m / hMBClLaλ / pUC19 and m / hMBClLdλ / pUC19, respectively.

Плазмиды m/hMBClLaλ/pUC19 и m/hMBClLdλ/pUC19 расщепляют EcoRI. Фрагмент ДНК длиной 743 пары оснований обрабатывают электрофорезом в 2% низкоплавком агарозном геле, удаляют и очищают от геля с помощью набора GENECLEANII (BIО101). Полученный продукт растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.Plasmids m / hMBClLaλ / pUC19 and m / hMBClLdλ / pUC19 cleave EcoRI. A DNA fragment of 743 base pairs in length was treated by electrophoresis in a 2% low melting agarose gel, removed and purified from the gel using the GENECLEANII kit (BIO101). The resulting product was dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA.

Четыре мкл полученного фрагмента ДНК смешивают с 1 мкл вышеуказанного вектора HEF, обработанного щелочной фосфатазой бактерий, чтобы лигировать их друг с другом. Продукт лигирования вводят в компетентную клетку E.coli, JM109, с целью получения трансформанта. Полученный трансформант культивируют в 2 мл среды 2xYT, дополненной 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмидную ДНК очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN).Four μl of the obtained DNA fragment was mixed with 1 μl of the above HEF vector treated with alkaline bacteria phosphatase to ligate them with each other. The ligation product is introduced into a competent E. coli cell, JM109, in order to obtain a transformant. The resulting transformant was cultured in 2 ml of 2xYT medium supplemented with 50 μg / ml ampicillin. The plasmid DNA isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN).

Очищенную плазмидную ДНК расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 100 мМ KCl, 8 единиц HindIII (Takara Shuzo) и 2 единицы Pvul (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа. На этой стадии плазмидную ДНК идентифицируют, исходя из предположения о том, что, если фрагмент ДНК введен в плазмиду с правильной ориентацией, то в результате гидролиза будет получен расщепленный фрагмент длиной 5104/2195 пар оснований, и если указанный фрагмент ДНК введен в плазмиду с обратной ориентацией, то будет получен расщепленный фрагмент длиной 4387/2926 пар оснований. Полученные таким образом плазмиды являются экспрепрессирующими векторами, кодирующими L-цепь гибридного антитела, содержащего FR1,2 мыши и FR3,4 человека, которые названы соответственно "m/hMBClLaλ/neo" и "m/hMBClLdλ/neo".The purified plasmid DNA was digested in 20 μl of a reaction solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 100 mM KCl, 8 HindIII units (Takara Shuzo) and 2 Pvul units (Takara Shuzo ), at a temperature of 37 ° C for 1 hour. At this stage, plasmid DNA is identified based on the assumption that if the DNA fragment is inserted into the plasmid with the correct orientation, then a digested fragment of 5104/2195 base pairs will be obtained by hydrolysis, and if this DNA fragment is introduced into the plasmid from the reverse orientation, then a cleaved fragment with a length of 4387/2926 base pairs will be obtained. The plasmids thus obtained are expression vectors encoding the L chain of a hybrid antibody containing mouse FR1.2 and human FR3.4, which are named respectively "m / hMBClLaλ / neo" and "m / hMBClLdλ / neo".

(ii) Получение гибридного антитела FR1/FR2(ii) Obtaining a hybrid antibody FR1 / FR2

Гибридное антитело FR1/FR2 получают так же, как описано выше, используя сайт рестрикции SnaBI, имеющийся в гипервариабельном участке CDR1.The FR1 / FR2 hybrid antibody is prepared in the same manner as described above using the SnaBI restriction site located in the hypervariable region of CDR1.

В 20 мкл реакционного раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,9), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 50 мМ NaCl, 0,01% (в отношении веса к объему) бычьего сывороточного альбумина и 6 единиц SnaBI (Takara Shuzo), расщепляют по десять мкг плазмид MBC1Lλ/neo и mMBC1Lλ/neo при температуре 37°С в течение 1 часа. Полученный реакционный раствор далее гидролизуют в 50 мкл реакционного раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 100 мМ KCl, 0,01% (в отношении веса к объему) бычьего сывороточного альбумина и 6 единиц Pvul, при температуре 37°С в течение 1 часа.In 20 μl of a reaction solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) bovine serum albumin and 6 units of SnaBI (Takara Shuzo), cleave ten μg of plasmids MBC1Lλ / neo and mMBC1Lλ / neo at 37 ° C for 1 hour. The resulting reaction solution is then hydrolysed in 50 μl of a reaction solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 100 mM KCl, 0.01% (w / v) bovine serum albumin and 6 units of Pvul, at 37 ° C for 1 hour.

Полученный реакционный раствор обрабатывают электрофорезом в 1,5% низкоплавком агарозном геле, после чего фрагменты ДНК длиной 4955 и 2349 пар оснований удаляют и очищают от геля с помощью набора GENECLEANII (ВIO101). Фрагменты ДНК, полученные из плазмиды MBC1L(λ)/neo, названы "m1" (4955 пар оснований) и "m2" (2349 пар оснований), и фрагменты ДНК, полученные из плазмиды h/mMBClL(λ) /пео, названы "hm1" (4955 пар оснований) и "hm2" (2349 пар оснований). Все полученные фрагменты ДНК растворяют в 40 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.The resulting reaction solution was treated by electrophoresis in a 1.5% low melting agarose gel, after which the DNA fragments of 4955 and 2349 base pairs in length were removed and purified from the gel using the GENECLEANII kit (BIO101). DNA fragments obtained from plasmid MBC1L (λ) / neo are named "m1" (4955 base pairs) and "m2" (2349 base pairs), and DNA fragments obtained from plasmid h / mMBClL (λ) / peo are named " hm1 "(4955 base pairs) and" hm2 "(2349 base pairs). All DNA fragments obtained were dissolved in 40 μl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA.

По одному мкл фрагментов m1 и hm1 лигируют соответственно с 4 мкл фрагментов hm2 и m2, а затем вводят в компетентную клетку E.coli, JM109, с целью получения трансформанта. Полученный трансформант культивируют в 2 мл среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выделенную из клеточной фракции плазмидную ДНК очищают с помощью набора для очистки плазмид QIAprep (QIAGEN).One μl of fragments m1 and hm1 are ligated with 4 μl of fragments hm2 and m2, respectively, and then introduced into a competent cell of E. coli, JM109, in order to obtain a transformant. The resulting transformant was cultured in 2 ml of 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin. The plasmid DNA isolated from the cell fraction was purified using the QIAprep plasmid purification kit (QIAGEN).

Очищенную плазмидную ДНК расщепляют в 20 мкл реакционного раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола и 8 единиц Apal (Takara Shuzo) или 2 единицы AlaII (Takara Shuzo), при температуре 37°С в течение 1 часа.The purified plasmid DNA was digested in 20 μl of a reaction solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol and 8 Apal units (Takara Shuzo) or 2 AlaII units (Takara Shuzo), at a temperature 37 ° C for 1 hour.

Полученные таким образом плазмиды (m1-hm2 и hm1-m2) идентифицируют, исходя из предположения о том, что, если фрагменты ДНК лигированы в плазмиде с правильной ориентацией, то в результате гидролиза плазмиды (ml-hm2) Apal и AlaLI будут соответственно получены расщепленный фрагмент длиной 7304 пары оснований и фрагменты длиной 5560/1246/498 пар оснований, и в результате гидролиза плазмиды (hml-m2) Apal и ApLI будут соответственно получены фрагменты длиной 6538/766 пар оснований и фрагмент длиной 3535/2025/1246/498 пар оснований.The plasmids thus obtained (m1-hm2 and hm1-m2) are identified based on the assumption that if the DNA fragments are ligated in the plasmid with the correct orientation, then digested plasmids (ml-hm2) Apal and AlaLI will correspondingly produce a cleaved fragment length 7304 base pairs and fragments 5560/1246/498 base pairs long, and as a result of hydrolysis of the Apal and ApLI plasmids (hml-m2), fragments 6538/766 base pairs and fragment 3535/2025/1246/498 pairs long will be obtained, respectively grounds.

Экспрессирующий вектор, кодирующий L-цепь гибридного антитела, содержащего FR1 человека и FR2,3,4 мыши, назван "hmmMBCIL(λ)/neo", и экспрессирующий вектор, кодирующий L-цепь гибридного антитела FR1 мыши, FR2 человека и FR3,4 мыши, назван "mhmMBC1L(λ)/neo".The expression vector encoding the L chain of the hybrid antibody containing human FR1 and mouse FR2,3,4 is named "hmmMBCIL (λ) / neo", and the expression vector encoding the L chain of the hybrid antibody FR1 mouse, human FR2 and FR3,4 a mouse named "mhmMBC1L (λ) / neo".

(4) Конструирование L-цепи очеловеченного антитела(4) Construction of the L chain of humanized antibodies

L-цепь очеловеченного антитела №23-57-137-1 получают путем трансплантации гипервариабельного участка по методу PCR. То есть получают L-цепь очеловеченного антитела №23-57-137-1 (вариант "а"), которая содержит области FR1, FR2 и FR3, выделенные из антитела человека HSU03868 (GEN-BANK, Deftos, M. et al., Scand. J.Immunol, 39, 95-103, 1994), и область FR4, выделенную из антитела человека S25755 (NBRF-PDB), используя шесть типов затравок для полимеразной реакции синтеза цепи: затравки для трансплантации гипервариабельных участков MBC1LGP1 (последовательность с идентификационным №29) и MBC1LGP3 (последовательность с идентификационным №30), которые содержат смысловую последовательность ДНК, затравки для трансплантации гипервариабельных участков, MBC1LGP2 (последовательность с идентификационным №31) и MBC1LGP4 (последовательность с идентификационным №32), которые содержат антисмысловую последовательность ДНК, при этом все указанные затравки для трансплантации гипервариабельных участков имеют с обоих концов комплементарную последовательность длиной 15-21 пар оснований; и внешние затравки MBC1LVS1 (последовательность с идентификационным №33) и MBC1LVR1 (последовательность с идентификационным №34), которые гомологичны соответственно затравкам для трансплантации гипервариабельных участков MBC1LGP1 и MBC1LGP4.The humanized L chain of antibody 23-57-137-1 is obtained by transplantation of the hypervariable region by PCR. That is, an L-chain of humanized antibody No. 23-57-137-1 (variant "a") is obtained which contains the FR1, FR2 and FR3 regions isolated from the human antibody HSU03868 (GEN-BANK, Deftos, M. et al., Scand. J. Immunol, 39, 95-103, 1994), and the FR4 region isolated from S25755 human antibody (NBRF-PDB) using six types of seeds for the polymerase chain synthesis reaction: seeds for transplantation of the hypervariable regions of MBC1LGP1 (sequence with identification No. 29) and MBC1LGP3 (sequence with identification No. 30), which contain a sense DNA sequence, seed for transplantation hypervariable regions, MBC1LGP2 (sequence with identification No. 31) and MBC1LGP4 (sequence with identification No. 32), which contain an antisense DNA sequence, while all of the indicated seeds for transplantation of hypervariable regions have a complementary sequence at both ends of 15-21 base pairs; and external seeds MBC1LVS1 (sequence with identification No. 33) and MBC1LVR1 (sequence with identification No. 34), which are homologous respectively to the seeds for transplantation of hypervariable regions MBC1LGP1 and MBC1LGP4.

Затравки для трансплантации гипервариабельных участков MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 и MBC1LGP4 выделяют с помощью денатурированного мочевиной полиакриламидного геля (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) и экстрагируют из гель-фракции методом измельчения и вымачивания (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).Seeds for transplantation of the hypervariable regions MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3, and MBC1LGP4 were isolated using urea-denatured polyacrylamide gel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and extracted by grinding by gel Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

С помощью 6% денатурированного полиакриламидного геля выделяют по одному нмолю всех затравок для трансплантации гипервариабельных участков. Фрагменты полученной ДНК требуемой длины идентифицируют на тонкой пластинке силикагеля, облучаемой ультрафиолетом, и удаляют методом измельчения и вымачивания. Полученный продукт растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 1 мМ EDTA.Using a 6% denatured polyacrylamide gel, one nmole of all seeds for the transplantation of hypervariable sites is isolated. Fragments of the obtained DNA of the desired length are identified on a thin silica gel plate irradiated with ultraviolet light and removed by grinding and soaking. The resulting product was dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mm EDTA.

Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют, используя TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) с буфером. Реакционный раствор (100 мкл), предназначенный для полимеразной реакции синтеза цепи, содержит по 1 мкл затравок для трансплантации гипервариабельных участков MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 и MBC1LGP4, 0,25 мМ dNTP и 2,5 единицы TaKaRa Ex Taq в буфере. Выполняют пять циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 55°С в течение 1 минут и 72°С в течение 1 минуты. В полученную реакционную смесь добавляют по 50 пмолей внешних затравок MBC1LVS1 и MBC1LVR1. Используя эту реакционную смесь, выполняют еще 30 циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с той же программой циклического изменения температуры. Амплифицированный фрагмент ДНК выделяют путем электрофореза в агарозном геле с использованием 3% агарозы Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products).The chain synthesis polymerase reaction is carried out using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) with a buffer. The reaction solution (100 μl) intended for the polymerase chain synthesis reaction contains 1 μl of seeds for transplantation of the hypervariable regions MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 and MBC1LGP4, 0.25 mM dNTP and 2.5 TaKaRa Ex Taq units in buffer. Perform five cycles of the polymerase reaction of chain synthesis in accordance with the program of cyclic temperature changes in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute. To the resulting reaction mixture were added 50 pmoles of external seeds MBC1LVS1 and MBC1LVR1. Using this reaction mixture, another 30 cycles of the polymerase chain synthesis reaction are performed in accordance with the same cyclic temperature change program. The amplified DNA fragment was isolated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Вырезают участок агарозы, содержащий фрагмент ДНК длиной 421 пара оснований, и очищают от геля указанный фрагмент ДНК при помощи набора GENECLEANII (ВIО101) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями. Полученную таким образом реакционную смесь для полимеразной реакции синтеза цепи используют для субклонирования этого фрагмента ДНК в плазмиде pUC19, которую предварительно расщепляют BamHI и HindIII. Затем определяют последовательность ДНК полученной плазмиды. Указанная плазмида названа "hMBCL/pUC19". Однако установлено, что в этой плазмиде аминокислота в 104-положении (аминокислота №96 в соответствии с определением Кабата) гипервариабельного участка CDR4 этой плазмиды заменена аргинином. Чтобы заменить эту аминокислоту тирозином, конструируют и синтезируют затравку MBC1LGP10R (последовательность с идентификационным №35). Затем осуществляют полимеразную реакцию синтеза цепи, используя TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) с буфером. Реакционный раствор (100 мкл), используемый для выполнения полимеразной реакции синтеза цепи, содержит 0,6 мкг плазмиды hMBCL/pUC19 в качестве матричной ДНК, 50 пмолей затравок MBC1LVS1 и MBC1LGP10R, 2,5 единицы TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) и 0,25 мМ dNTP в буфере, поверх которого помещают слой минерального масла. Выполняют тридцать циклов полимеразной реакции синтеза цепи в соответствии с программой циклического изменения температуры в следующей последовательности: 94°С в течение 1 минуты, 55°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты. Амплифицированный фрагмент ДНК выделяют посредством электрофореза в агарозном геле, используя 3% агарозу Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products).An agarose section containing a 421 base pair DNA fragment was excised and the indicated DNA fragment was purified from the gel using a GENECLEANII kit (BIO101) in accordance with the instructions attached thereto. The reaction mixture thus obtained for the polymerase chain synthesis reaction is used to subclone this DNA fragment in plasmid pUC19, which was previously digested with BamHI and HindIII. Then determine the DNA sequence of the obtained plasmid. The specified plasmid is named "hMBCL / pUC19". However, it was found that in this plasmid, the amino acid at the 104 position (amino acid No. 96 according to the definition of Kabat) in the hypervariable region of the CDR4 of this plasmid is replaced by arginine. To replace this amino acid with tyrosine, MBC1LGP10R seed is designed and synthesized (sequence with identification number 35). The polymerase chain synthesis reaction is then carried out using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) with a buffer. The reaction solution (100 μl) used to carry out the polymerase chain synthesis reaction contains 0.6 μg of hMBCL / pUC19 plasmid as template DNA, 50 pmole seeds MBC1LVS1 and MBC1LGP10R, 2.5 units TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) and 0, 25 mM dNTP in a buffer over which a layer of mineral oil is placed. Thirty cycles of the polymerase chain synthesis reaction are performed in accordance with the temperature cyclic program in the following sequence: 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute. The amplified DNA fragment was isolated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Фрагмент ДНК длиной 421 пара оснований вырезают и очищают от геля с помощью набора GENECLEANII (BIO 101) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями. Полученную реакционную смесь для полимеразной реакции синтеза цепи используют для субклонирования фрагмента ДНК в плазмиду pUC19, которая была приготовлена путем расщепления плазмиды BamHI и HindIII.A 421 base pair DNA fragment was excised and gel purified using the GENECLEANII kit (BIO 101) in accordance with its instructions. The resulting reaction mixture for the polymerase chain synthesis reaction is used to subclone a DNA fragment into plasmid pUC19, which was prepared by digesting the plasmids BamHI and HindIII.

В полученной плазмиде определяют последовательность ДНК, используя затравки М 13 Primer M4 и М13 Primer RV. Полученные результаты подтверждают, что плазмида имеет правильную последовательность. Эту плазмиду расщепляют HindIII и B1nI и посредством электрофореза в 1% агарозном геле выделяют из нее фрагмент ДНК длиной 416 пар оснований. Полученный фрагмент ДНК очищают с помощью набора GENECLEANII (BIO 101) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями и вводят в плазмиду Cλ/pUC, которая была приготовлена путем расщепления плазмиды HindIII и B1nI. Полученная плазмида названа "hMBClLaλ/pUC19". Эту плазмиду расщепляют EcoRI с получением фрагмента ДНК, кодирующего очеловеченную L-цепь. Полученный фрагмент ДНК вводят в плазмиду pCOS1 так, чтобы инициирующий кодон очеловеченной L-цепи располагался внизу от промотора EF1α. Полученная таким образом плазмида названа "hMBC1Laλ/pCOS1". Последовательность ДНК (включая соответствующую аминокислотную последовательность) очеловеченной L-цепи (вариант "а") выражена последовательностью с идентификационным №66. Аминокислотная последовательность варианта "а" выражена последовательностью с идентификационным №47.In the resulting plasmid, the DNA sequence was determined using the primers M 13 Primer M4 and M13 Primer RV. The results confirm that the plasmid has the correct sequence. This plasmid was digested with HindIII and B1nI and a 416 bp DNA fragment was isolated from it by electrophoresis on a 1% agarose gel. The resulting DNA fragment was purified using the GENECLEANII kit (BIO 101) in accordance with the instructions attached thereto and introduced into the plasmid Cλ / pUC, which was prepared by cleavage of the plasmid HindIII and B1nI. The resulting plasmid is named "hMBClLaλ / pUC19". This plasmid is digested with EcoRI to give a DNA fragment encoding a humanized L chain. The resulting DNA fragment is introduced into the plasmid pCOS1 so that the initiating codon of the humanized L chain is located downstream of the EF1α promoter. The plasmid thus obtained is named "hMBC1Laλ / pCOS1". The DNA sequence (including the corresponding amino acid sequence) of the humanized L chain (variant "a") is expressed by the sequence with identification No. 66. The amino acid sequence of variant "a" is expressed by the sequence with identification number 47.

Вариант "b" получают путем введения мутагена по методу PCR. Вариант "b" конструируют таким образом, чтобы заменить аминокислоту в 43-положении, то есть глицин (аминокислота №43 в соответствии с определением Кабата), пролином и аминокислоту в 49-положении, то есть лизин (аминокислота №49 в соответствии с определением Кабата), аспарагиновой кислотой. Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием плазмиды hMBC1Laλ/pUC19 в качестве матрицы, мутагенной затравки MBV1LGP5R (последовательность с идентификационным №36) и затравки MBC1LVS1. Полученный фрагмент ДНК расщепляют BamHI и HindIII и расщепленный фрагмент субклонируют в сайте BamHI-HindIII плазмиды рUC19. Полученную плазмидную ДНК секвенируют и расщепляют HindIII и AfIII, поеле чего полученный расщепленный фрагмент лигируют с плазмидой hMBC1Laλ/pUC19, которую предварительно расщепляют HindIII и AflII.Option "b" is obtained by introducing a mutagen according to the PCR method. Option "b" is designed to replace the amino acid at the 43-position, that is, glycine (amino acid No. 43 according to the definition of Kabat), proline and the amino acid at the 49-position, that is, lysine (amino acid No. 49 according to the definition of Kabat ), aspartic acid. The chain synthesis polymerase reaction is carried out using the plasmid hMBC1Laλ / pUC19 as a template, the mutagenic seed MBV1LGP5R (sequence with identification No. 36) and the seed MBC1LVS1. The resulting DNA fragment was digested with BamHI and HindIII, and the digested fragment was subcloned into the BamHI-HindIII site of pUC19 plasmid. The resulting plasmid DNA was sequenced and digested with HindIII and AfIII, after which the resulting digested fragment was ligated with the plasmid hMBC1Laλ / pUC19, which HindIII and AflII were previously digested.

Полученная плазмида названа "hMBC1Lbλ/pUC19". Эту плазмидную ДНК расщепляют EcoRI с получением фрагмента ДНК, содержащего ДНК, кодирующую очеловеченную L-цепь. Указанный фрагмент ДНК вводят в плазмиду pCOSi так, чтобы инициирующий кодон очеловеченной L-цепи находился внизу от промотора EF1α. Полученная таким образом плазмида названа "hMBClLbλ/pCOSi".The resulting plasmid is named "hMBC1Lbλ / pUC19". This plasmid DNA was digested with EcoRI to give a DNA fragment containing DNA encoding a humanized L chain. The indicated DNA fragment was introduced into the pCOSi plasmid so that the initiating codon of the humanized L chain was downstream of the EF1α promoter. The plasmid thus obtained is named "hMBClLbλ / pCOSi".

Вариант "с" получают путем введения мутагена по методу PCR. Вариант "с" конструируют таким образом, чтобы заменить аминокислоту в 84-положении, то есть серии (аминокислота №80 в соответствии с определением Кабата), пролином. Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием плазмиды hMBClLaλ/pUC19 в качестве матрицы, мутагенной затравки MBC1LGP6S (последовательность с идентификационным №37) и затравки М13 Primer RV. Полученный фрагмент ДНК расщепляют BamHI и HindIII и субклонируют в плазмиде pUC19, которую предварительно расщепляют BamHI и HindIII. Плазмидную ДНК секвенируют и расщепляют BstPI и Аоr51НI, после чего полученный фрагмент ДНК лигируют с плазмидой hMBClLaλ/pUC19, которую предварительно расщепляют BstPI и Aor51HI. Полученная плазмида названа "hMBC1Lcλ/pUC19". Эту плазмидную ДНК расщепляют EcoRI с получением последовательности, кодирующей очеловеченную L-цепь. Эту последовательность вводят в сайт EcoRI плазмиды pCOS1 так, чтобы инициирующий кодон очеловеченной L-цепи находился в прямом направлении от промотора EF1α. Полученная таким образом плазмида названа "hMBC1Lcλ/pCOS1".Option "C" is obtained by introducing a mutagen using the PCR method. Option "c" is designed in such a way as to replace the amino acid in the 84-position, that is, the series (amino acid No. 80 according to the definition of Kabat), proline. The polymerase chain synthesis reaction is carried out using the plasmid hMBClLaλ / pUC19 as the template, the mutagenic seed MBC1LGP6S (sequence with identification No. 37) and the seed M13 Primer RV. The resulting DNA fragment was digested with BamHI and HindIII and subcloned into the plasmid pUC19, which was previously digested with BamHI and HindIII. Plasmid DNA is sequenced and BstPI and Ao51HI are digested, after which the resulting DNA fragment is ligated with the plasmid hMBClLaλ / pUC19, which BstPI and Aor51HI have previously been digested. The resulting plasmid is named "hMBC1Lcλ / pUC19". This plasmid DNA was digested with EcoRI to give a sequence encoding a humanized L chain. This sequence is introduced into the EcoRI site of pCOS1 plasmid so that the initiating codon of the humanized L chain is in the forward direction from the EF1α promoter. The plasmid thus obtained is named "hMBC1Lcλ / pCOS1".

Варианты "d", "e" и "f" также получают путем введения мутагена по методу PCR. Варианты "d", "e" и "f" конструируют с заменой в вариантах "а", "b" и "с" аминокислоты в 91-положении, то есть тирозина (аминокислота №87 в соответствии с определением Кабата), изолейцином. Для получения вариантов "d", "e" и "f" полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием плазмид hMBC1Laλ/pCOS1 (для варианта "d"), hMBClLbλ/pCOS1 (для варианта "e") и hMBC1Lcλ/pCOS1 (для варианта "f") в качестве матрицы, мутагенной затравки MBC1LGP11R (последовательность с идентификационным №38) и затравки M-S1 (последовательность с идентификационным №44). Полученный фрагмент ДНК расщепляют BamHI и HindIII и субклонируют в pUC19, которую приготавливают путем расщепления pUC19 BamHI и HindIII. После проведения секвенирования, плазмиду расщепляют HindIII и BinI и полученный расщепленный фрагмент лигируют с плазмидой Cλ/pUC19, которую приготавливают путем расщепления плазмиды HindIII и BlnI.Options "d", "e" and "f" are also obtained by introducing a mutagen using the PCR method. Variants "d", "e" and "f" are constructed with substitution in variants "a", "b" and "c" of the amino acid at the 91-position, that is, tyrosine (amino acid No. 87 according to the definition of Kabat), isoleucine. To obtain variants "d", "e" and "f", the polymerase chain reaction is carried out using plasmids hMBC1Laλ / pCOS1 (for variant "d"), hMBClLbλ / pCOS1 (for variant "e") and hMBC1Lcλ / pCOS1 (for variant "f") as a matrix, a mutagenic seed MBC1LGP11R (sequence with identification No. 38) and seed M-S1 (sequence with identification No. 44). The resulting DNA fragment was digested with BamHI and HindIII and subcloned into pUC19, which was prepared by digesting pUC19 with BamHI and HindIII. After sequencing, the plasmid was digested with HindIII and BinI, and the resulting cleaved fragment was ligated with plasmid Cλ / pUC19, which was prepared by digesting the plasmids HindIII and BlnI.

Полученные плазмиды соответственно названы 'hMBC1Ldλ/pUC1", "hMBC1Leλ/pUC19" и "hMBC1Lfλ/pUC19". Все эти плазмиды расщепляют EcoRI с получением фрагмента ДНК, содержащего ДНК, кодирующую очеловеченную L-цепь. Этот фрагмент ДНК вводят в сайт EcoRI плазмиды pCOS1 так, чтобы инициирующий кодон очеловеченной L-цепи находился внизу от протомора EF1α данной плазмиды. Полученные таким образом плазмиды названы "hMBClLdλ/pCOS1", "hMBC1Leλ/pCOS1" и "hMBC1Lfλ/pCOS1".The resulting plasmids are respectively named 'hMBC1Ldλ / pUC1 "," hMBC1Leλ / pUC19 "and" hMBC1Lfλ / pUC19. All these plasmids cleave EcoRI to obtain a DNA fragment containing DNA encoding a humanized L chain. This DNA fragment is introduced into the EcoRI site of pCOS1 plasmid so that the initiating codon of the humanized L chain is located downstream of the EF1α protomore of this plasmid. The plasmids thus obtained are named "hMBClLdλ / pCOS1", "hMBC1Leλ / pCOS1" and "hMBC1Lfλ / pCOS1".

Варианты "g" и "h" также получают путем введения мутагена по методу PCR. Варианты "g" и "h" конструируют с заменой в вариантах "а" и "d" аминокислоты в 36-положении, то есть гистидина (аминокислота №36 в соответствии с определением Кабата), тирозином. Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием мутагенной затравки MBC1LGP9R (последовательность с идентификационным №39), затравки М13 Primer PV с использованием плазмиды hMBC1Laλ/pUC19 в качестве матрицы. Продукт полимеразной реакции синтеза цепи еще раз подвергают полимеразной реакции синтеза цепи с использованием затравки М 13 Primer M4 и плазмиды hMBC1Laλ/pUC19 в качестве матрицы. Полученный фрагмент ДНК расщепляют HindIII и BinI и субклонируют в плазмиде Cλ/pUC19, которую приготавливают путем расщепления плазмиды HindIII и B1nI. Используя эту плазмиду в качестве матрицы, осуществляют полимеразную реакцию синтеза цепи с затравками MBC1LGP13R (последовательность с идентификационным №40) и MBC1LVS1. Полученный продукт PCR расщепляют AlaI и HindIII и вводят в плазмиды hMBC1Laλ/pUC19 и hMBC1Ldλ/pUC19, которые приготавливают путем расщепления обоих плазмид AlaI и HindIII. В полученных плазмидах определяют последовательности ДНК. Плазмиды, в которых было подтверждено наличие правильных последовательностей, названы соответственно "hMBC1Lgλ/pUC19" и "hMBC1Lhλ/pUC19". Эти плазмиды расщепляют EcoRI с получением последовательности, кодирующей очеловеченную L-цепь. Эту последовательность вводят в сайт EcoRI плазмиды pCOS1 так, чтобы инициирующий кодон очеловеченной L-цепи находился внизу от промотора EF1α. Полученные плазмиды названы соответственно "hMBClLgλ/pCOS1" и "hMBC1Lhλ/pCOS1".Options "g" and "h" are also obtained by introducing a mutagen using the PCR method. Variants "g" and "h" are constructed with substitution in variants "a" and "d" of the amino acid at the 36 position, that is, histidine (amino acid No. 36 as defined by Kabat), tyrosine. The polymerase chain synthesis reaction is carried out using a mutagenic seed MBC1LGP9R (sequence with identification No. 39), seed M13 Primer PV using plasmid hMBC1Laλ / pUC19 as a matrix. The product of the chain synthesis polymerase reaction is again subjected to the chain synthesis polymerase reaction using the primer M4 seed M 13 and the plasmid hMBC1Laλ / pUC19 as a template. The resulting DNA fragment was digested with HindIII and BinI and subcloned into the plasmid Cλ / pUC19, which was prepared by digesting the plasmids HindIII and B1nI. Using this plasmid as a matrix, a polymerase chain synthesis reaction is carried out with seeds MBC1LGP13R (sequence with identification number 40) and MBC1LVS1. The resulting PCR product was digested with AlaI and HindIII and introduced into the plasmids hMBC1Laλ / pUC19 and hMBC1Ldλ / pUC19, which were prepared by cleaving both plasmids AlaI and HindIII. The resulting plasmids determine the DNA sequence. Plasmids in which the correct sequences were confirmed are named hMBC1Lgλ / pUC19 and hMBC1Lhλ / pUC19, respectively. These plasmids cleave EcoRI to give a sequence encoding a humanized L chain. This sequence is introduced into the EcoRI site of pCOS1 plasmid so that the initiation codon of the humanized L chain is downstream of the EF1α promoter. The resulting plasmids are named respectively "hMBClLgλ / pCOS1" and "hMBC1Lhλ / pCOS1".

Варианты "i", "j", "k", "l", "m", "n" и "о" также получают путем введения мутагена по методу PCR. Полимеразную реакцию синтеза цепи осуществляют с использованием мутагенной затравки MBC1LGP14S (последовательность с идентификационным №41), затравки V1RV (λ) (последовательность с идентификационным №43) и плазмиды hMBC1Laλ/pUC19 в качестве матрицы. Полученный фрагмент ДНК расщепляют ApaI и BlnI и субклонируют в плазмиде hMBC1Lgλ/pUC19, которую приготавливают путем расщепления плазмиды ApaI и BInI. В полученной плазмиде определяют последовательность оснований и выбирают клон с мутацией, соответствующей каждому из указанных вариантов. Полученная таким образом плазмида названа "hMBC1Lxλ/pUC19 (х=i, j, k, l, m, n или о)". Эту плазмиду расщепляют EcoRI с получением последовательности, кодирующей очеловеченную L-цепь. Полученную последовательность вводят в сайт EcoRI плазмиды pCOS1 так, чтобы инициирующий кодон очеловеченной L-цепи находился внизу от промотора EF1α. Полученная плазмида названа "hMBClLxλ/pCOS1" (x=i, j, k, l, m, n или о). Последовательности ДНК (включая соответствующие аминокислотные последовательности) вариантов "j", "l", "m" и "о" выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№67, 68, 69 и 70. Аминокислотные последовательности этих вариантов выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№48, 49, 50 и 51.Options "i", "j", "k", "l", "m", "n" and "o" are also obtained by introducing a mutagen using the PCR method. The polymerase chain synthesis reaction is carried out using the mutagenic seed MBC1LGP14S (sequence with identification No. 41), seed V1RV (λ) (sequence with identification No. 43) and plasmid hMBC1Laλ / pUC19 as a matrix. The resulting DNA fragment was digested with ApaI and BlnI and subcloned into the hMBC1Lgλ / pUC19 plasmid, which was prepared by digesting the plasmids ApaI and BInI. In the resulting plasmid, the sequence of the bases is determined and a clone with a mutation corresponding to each of these options is selected. The plasmid thus obtained is named "hMBC1Lxλ / pUC19 (x = i, j, k, l, m, n or o)". This plasmid is digested with EcoRI to give a sequence encoding a humanized L chain. The resulting sequence is introduced into the EcoRI site of pCOS1 plasmid so that the initiation codon of the humanized L chain is downstream of the EF1α promoter. The resulting plasmid is named "hMBClLxλ / pCOS1" (x = i, j, k, l, m, n or o). DNA sequences (including the corresponding amino acid sequences) of variants "j", "l", "m" and "o" are expressed respectively by sequences with identification Nos. 67, 68, 69 and 70. The amino acid sequences of these variants are expressed respectively by sequences with identification Nos. 48, 49, 50, and 51.

Варианты "р", "q", "r", "s" и "t" являются модифицированными формами вариантов "i", "j", "m", "l" и "о", в которых аминокислота в 87-положении, то есть тирозин, заменена изолейцином. Эти варианты получают, используя сайт рестрикции Аоr51МI области FR3 для замены варианта "h" вариантом "i", "j", "m", "l" или "о" следующим образом. Из экспрессирующей плазмиды hMBC1Lxλ/pCOS1 (x=i, j, m, l или о) удаляют рестрикционный фрагмент Аоr51НI (514 пар оснований), содержащий гипервариабельный участок CDR3, часть области FR3 и всю область FR4. Рестрикционный фрагмент Аоr51НI (514 пар оснований), содержащий гипервариабельный участок CDR3, часть области FR3 и всю область FR4, лигируют с удаленной частью экспрессирующей плазмиды, заменяя аминокислоту в 91-положении, то есть тирозин (аминокислота №87 в соответствии с определением Кабата), изолейцином. В полученных плазмидах определяют последовательность ДНК и выбирают клон вариантов "i", "j", "m", "l" и "о", в котором аминокислота в 91-положении, то есть тирозин (аминокислота №87 в соответствии с определением Кабата), заменена изолейцином. Варианты, соответствующие вариантам "i", "j", "m", "l" и "о", названы соответственно вариантами "р", "q", "s", "r" и "t", и плазмиды для этих вариантов названы "hMBC1Lxλ/pCOS1" (x=р, q, s, r или t). Последовательности ДНК (включая соответствующие аминокислоты) вариантов "q", "r", "s" и "t" выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№71, 72, 73 и 74. Аминокислотные последовательности этих вариантов выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№52, 53, 54 и 55.The variants "p", "q", "r", "s" and "t" are modified forms of the variants "i", "j", "m", "l" and "o", in which the amino acid is 87- position, that is, tyrosine, is replaced by isoleucine. These variants are obtained using the Ao51MI restriction site of the FR3 region to replace variant "h" with variant "i", "j", "m", "l" or "o" as follows. From the expression plasmid hMBC1Lxλ / pCOS1 (x = i, j, m, l or o), the restriction fragment Ao51HI (514 base pairs) containing the hypervariable region of CDR3, part of the FR3 region and the entire FR4 region was removed. The restriction fragment Ao51HI (514 base pairs), containing the hypervariable region of CDR3, part of the FR3 region and the entire FR4 region, is ligated to the deleted part of the expression plasmid, replacing the amino acid at the 91-position, i.e. tyrosine (amino acid No. 87 according to the definition of Kabat), isoleucine. The DNA sequence is determined in the obtained plasmids and a clone of variants “i”, “j”, “m”, “l” and “o” is selected, in which the amino acid is in the 91-position, that is, tyrosine (amino acid No. 87 according to the definition of Kabat ), replaced by isoleucine. The variants corresponding to the variants "i", "j", "m", "l" and "o" are called, respectively, variants "p", "q", "s", "r" and "t", and plasmids for these options are called "hMBC1Lxλ / pCOS1" (x = p, q, s, r or t). DNA sequences (including the corresponding amino acids) of variants "q", "r", "s" and "t" are expressed respectively by sequences with identification Nos. 71, 72, 73 and 74. Amino acid sequences of these variants are expressed by sequences with identification Nos. 52 , 53, 54, and 55.

Плазмиду hMBC1Lqλ/pCOS1 расщепляют HindIII и EcoRI и субклонируют в плазмиде pUC19, которую приготавливают путем расщепления плаэмиды HindIII и EcoRI. Полученная таким образом плазмида названа "hMBC1Lqλ/pUC19".Plasmid hMBC1Lqλ / pCOS1 was digested with HindIII and EcoRI and subcloned into plasmid pUC19, which was prepared by cleaving the HindIII and EcoRI plasmids. The plasmid thus obtained is named "hMBC1Lqλ / pUC19".

Положение замененных аминокислот в каждом варианте очеловеченной L-цепи показано в таблице 3.The position of the substituted amino acids in each variant of the humanized L chain is shown in Table 3.

Таблица 3Table 3 Положение замененной аминокислоты в списках последовательностей (номер аминокислоты в соответствии с определением Кабата)The position of the substituted amino acid in the sequence lists (amino acid number as defined by Kabat) ВариантOption 3636 4343 4545 4747 4949 8080 8787 аbut               bb   РR     DD     cc           PP   dd             II ee   PP     DD   II ff           РR II gg YY             hh YY         II   ii YY   КTO         jj YY   КTO   DD     kk YY   КTO VV       ll YY   КTO VV DD     mm YY       DD     nn YY   VV         оabout YY   VV DD       pp YY   KK       II qq YY   KK   DD   II rr YY       DD   II ss YY   KK VV DD   II tt YY     VV DD   II

В таблице 3 заглавными буквами обозначены следующие аминокислоты:In table 3, the following amino acids are capitalized:

Y - тирозин; Р - пролин; К - лизин; V - валин; D - аспарагиновая кислота и I - изолейцин.Y is tyrosine; P is proline; K is lysine; V is valine; D is aspartic acid and I is isoleucine.

Штамм E.coli, содержащий плазмиду hМВС1НкДНК/рUС19, и штамм E.coli, содержащий плазмиду hMBC1Lqλ/pUC19, названы соответственно "Escherichia coli JM109 (hМВС1НкДНК/рUС19" и "Escherichia coli JM109 (hMBC1Lqλ/pUC19)" и включены на основании Будапештского договора от 15 августа 1996 г.в коллекцию Национального института бионауки человеческой технологии, агентство промышленной науки и технологии, Япония (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Япония) под номером FERM ВР-5629 для Escherichia coli JM109 (hМВС1НкДНК/рUС19) и под номером FERM BP-5630 для Escherichia coli JM109 (hMBClLqλ/pUC19.The E. coli strain containing the hMBC1NcDNA / pUC19 plasmid and the E. coli strain containing the hMBC1Lqλ / pUC19 plasmid are respectively named "Escherichia coli JM109 (hMBC1HcDNA / pUC19" and "Escherichia coli JM109 and bMUC1b agreement of August 15, 1996 to the collection of the National Institute of Bioscience of Human Technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) under the number FERM BP-5629 for Escherichia coli JM109 (hMBC1NcDNA / pUC19) and under the number FERM BP-5630 for Escherichia coli JM109 (hMBClLqλ / pUC19.

(5) Трансфекция в клетке COS-7(5) COS-7 Cell Transfection

Вышеуказанные экспрессирующие плазмиды временно экспрессируют в клетках COS-7, чтобы определить антигенсвязывающую и нейтрализующую активность гибридного антитела и очеловеченного антитела №23-57-137-1. Для временной экспрессии L-цепи гибридного антитела нижеследующие комбинации плазмид котрансфецируют клетки COS-7 по методу электропорации с помощью электроимпульсного устройства Gene Pulser (Bio Rad): hМВС1НкДНК/рСOS1 и h/mMBC1L(λ)/neo; hМВС1НкДНК/рСOS1 и m/hMBC1Laλ/neo; hВС1НкДНК/рСOS1 и m/hMBC1Ldλ/neo; hМВС1НкДНК/рСOS1 и hmmMBClL(λ)/neo; и hМВС1НкДНК/рСOS1 и mhmMBCIL(λ)/пео. К 0,8 мл суспензии клеток COS-7 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS(-)) с концентрацией 1×107 клеток/мл добавляют по 10 мкг всех плазмидных ДНК. Полученный раствор подвергают воздействию импульсов при электростатической емкости 1500 В и силе тока 25 мкФ.The above expression plasmids are temporarily expressed in COS-7 cells to determine the antigen binding and neutralizing activity of the hybrid antibody and humanized antibody No. 23-57-137-1. For temporary expression of the hybrid antibody L-chain, the following plasmid combinations co-transfect COS-7 cells by electroporation using the Gene Pulser (Bio Rad) electro-pulse device: hMBC1NcDNA / pCOS1 and h / mMBC1L (λ) / neo; hMBC1NcDNA / pCOS1 and m / hMBC1Laλ / neo; hBC1HcDNA / pCOS1 and m / hMBC1Ldλ / neo; hMBC1NcDNA / pCOS1 and hmmMBClL (λ) / neo; and hMBC1NcDNA / pCOS1 and mhmMBCIL (λ) / peo. To 0.8 ml of a suspension of COS-7 cells in phosphate buffered saline (PBS (-)) with a concentration of 1 × 10 7 cells / ml, 10 μg of all plasmid DNAs are added. The resulting solution is subjected to pulses at an electrostatic capacity of 1500 V and a current strength of 25 μF.

Раствор выдерживают в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего электропорированные клетки суспендируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 2% фетальную телячью сыворотку с ультранизким содержанием IgG (GIBCO), и культивируют в 10 см чашке в инкубаторе с атмосферой СО2. Клетки культивируют в течение 72 часов, после чего культуральный супернатант собирают и центрифугируют для удаления плеточного дебриса. Полученный продукт используют в качестве образца для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).The solution was incubated for 10 minutes at room temperature, after which the electroporated cells were suspended in the Dulbecco modified Eagle medium containing 2% fetal calf serum with ultra low IgG content (GIBCO) and cultured in a 10 cm dish in an incubator with a CO 2 atmosphere. Cells were cultured for 72 hours, after which the culture supernatant was harvested and centrifuged to remove the dendritic debris. The resulting product is used as a sample for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Для временной экспрессии очеловеченного антитела. №23-57-137-1 плазмидную комбинацию hМВС1кДНК/рСOS1 или hMBC1Lxλ/pCOS1 (х=а-t) трансфецируют в клетки COS-7 с помощью электроимульсного устройства Gene Pulse (Bio Rad) аналогично процедуре, описанной выше для гибридного анитела. Культуральный супернатант используют в качестве образца для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).For the temporary expression of a humanized antibody. No. 23-57-137-1, the plasmid combination hMBC1cDNA / pCOS1 or hMBC1Lxλ / pCOS1 (x = a-t) is transfected into COS-7 cells using the Gene Pulse (Bio Rad) electroimpulse device similarly to the procedure described above for the hybrid antibody. The culture supernatant is used as a sample for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Гибридное антитело или очеловеченное антитело очищают от культурального супернатанта клеток COS-7 с помощью набора AffiGal Protein A MAPSII (Bio Rad) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями.The hybrid antibody or humanized antibody is purified from the COS-7 cell culture supernatant using the AffiGal Protein A MAPSII kit (Bio Rad) in accordance with the instructions attached thereto.

(6) Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)(6) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

(i) Определение концентрации антител(i) Determination of antibody concentration

Планшет для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), предназначенный для определения концентрации антител, готовят следующим образом. Во все лунки 96-луночного планшета для ELISA (Maxisorp, NUNC) вводят 100 мкл буфера для сенсибилизации поверхностей (0,1 М раствор NaHCO3, 0,02% NaN3), дополненного 1 мкг/мл антитела козы против IgG человека (TAGO), и блокируют 200 мкл буфера для разведения [50 мМ трис-HCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 0,05% твина-20, 0,02% NaN3, 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA); рН 7,2]. Во все лунки добавляют культуральный супернатант клеток COS, в которых было экспрессировано гибридное антитело или очеловеченное антитело, полученное в результате последовательного разведения. Содержимое лунок инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа и промывают смесью забуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20, после чего в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора конъюгированного со щелочной фосфатазой антитела козы против IgG человека (TAGO). Полученную' смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа промывают смесью забуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20 и добавляют в каждую лунку 1 мг/мл раствора субстрата ("Sigma104", паранитрофенилфосфорная кислота, SIGMA). У полученного раствора измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм, используя аппарат для прочтения микропланшетов (Bio Rad). В качестве эталона при определении концентрации антител используют очищенный иммуноглобулин IgGlλ человека (сайт связывания).A plate for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), designed to determine the concentration of antibodies, is prepared as follows. 100 μl of surface sensitization buffer (0.1 M NaHCO 3 solution, 0.02% NaN 3 ) supplemented with 1 μg / ml goat anti-human IgG antibody (TAGO) is injected into all wells of a 96-well ELISA plate (Maxisorp, NUNC) ), and 200 μl of dilution buffer [50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween-20, 0.02% NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA) is blocked ; pH 7.2]. The culture supernatant of COS cells in which a hybrid antibody or a humanized antibody obtained by serial dilution was expressed was added to all wells. The contents of the wells were incubated at room temperature for 1 hour and washed with a mixture of phosphate buffered saline and Tween-20, after which 100 μl of a solution of goat anti-human IgG antibody conjugated with alkaline phosphatase (TAGO) was added. The resulting mixture was incubated at room temperature for 1 hour, washed with a mixture of phosphate buffered saline and Tween-20, and 1 mg / ml substrate solution (Sigma104, paranitrophenylphosphoric acid, SIGMA) was added to each well. The optical density of the resulting solution was measured at a wavelength of 405 nm using a microplate reader (Bio Rad). Purified human IgGlλ immunoglobulin (binding site) is used as a reference in determining the concentration of antibodies.

(ii) Определение антигенсвязывающей способности(ii) Determination of antigen binding ability

Планшет для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), предназначенный для определения антигеневязывающей способности, готовят следующим образом. Во все лунки 96-луночного планшета для ELISA (Maxisorp, NUNC) вводят 100 мкл буфера для сенсибилизации поверхностей, дополненного 1 мкг/мл PTHrP человека (1-34), и блокируют 200 мкл буфера для разведения. Во все лунки добавляют культуральный супернатант клеток COS-7, в которых было экспрессировано гибридное антитело или очеловеченное антитело, либо растворы очищенного гибридного антитела или очищенного очеловеченного антитела, полученные в результате последовательного разведения. Содержимое лунок инкубируют при комнатной температуре и промывают смесью эабуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20, после чего в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора конъюгированного со щелочной фосфатазой антитела козы против IgG человека (TAGO). Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре, промывают смесью забуференного фосфатом физиологического раствора и твина-20 и добавляют в каждую лунку 1 мг/мл раствора субстрата ("Sigma104", паранитрофенилфосфорная кислота, SIGMA). У полученного раствора измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм, используя аппарат для прочтения микропланшетов (Bio Rad).A plate for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), designed to determine antigennegative ability, is prepared as follows. 100 μl of surface sensitization buffer supplemented with 1 μg / ml human PTHrP (1-34) was added to all wells of a 96-well ELISA plate (Maxisorp, NUNC) and 200 μl of dilution buffer was blocked. The culture supernatant of COS-7 cells in which a hybrid antibody or a humanized antibody, or solutions of a purified hybrid antibody or a purified humanized antibody obtained by serial dilution was added to all wells. The contents of the wells are incubated at room temperature and washed with a mixture of phosphate-buffered saline and Tween-20, after which 100 μl of a solution of goat anti-human IgG antibody conjugated with alkaline phosphatase (TAGO) is added to each well. The resulting mixture was incubated at room temperature, washed with a mixture of phosphate buffered saline and Tween-20, and 1 mg / ml substrate solution (Sigma104, paranitrophenylphosphoric acid, SIGMA) was added to each well. The optical density of the resulting solution was measured at a wavelength of 405 nm using a microplate reader (Bio Rad).

(7) Подтверждение активностей(7) Confirmation of activities

(i) Оценка очеловеченной Н-цепи(i) Assessment of humanized H-chain

Установлено, что антитело, содержащее очеловеченную Н-цепь варианта "а" и химерную L-цепь, характеризуются таким же уровнем PTHrP-связывающей активности, что и химерное антитело. Этот результат позволяет предположить, что в варианте "а" достигнуто удовлетворительное очеловечивание V-области Н-цепи. Поэтому очеловеченная Н-цепь варианта "а" использована в качестве Н-цепи очеловеченного антитела в следующих экспериментах.It was found that an antibody containing the humanized H chain of variant “a” and a chimeric L chain are characterized by the same level of PTHrP binding activity as the chimeric antibody. This result suggests that in option "a" satisfactory humanization of the V region of the H chain was achieved. Therefore, the humanized H chain of variant "a" was used as the H chain of the humanized antibody in the following experiments.

(ii) Активность гибридного антитела(ii) The activity of a hybrid antibody

(ii-a) Гибридное антитело FR1,2/FR3,4(ii-a) Hybrid antibody FR1,2 / FR3,4

Когда L-цепь имеет структуру h/mMBC1Ld(λ), антитело не обладает антигенсвязывающей активностью. Однако, когда L-цепь гибридного антитела имеет структуру m/hMBC1Laλ или m/hMBClLdλ, данное антитело характеризуется таким же уровнем антигенсвязывающей активности, что и химерное антитело №23-57-137-1. Эти результаты позволяют предположить, что области FR3 и FR4 пригодны для очеловеченного антитела, а в областях FR1 и FR2 имеется один или несколько аминокислотных остатков, которые необходимо заменить.When the L chain has an h / mMBC1Ld (λ) structure, the antibody does not have antigen binding activity. However, when the L chain of a hybrid antibody has the structure m / hMBC1Laλ or m / hMBClLdλ, this antibody is characterized by the same level of antigen binding activity as chimeric antibody No. 23-57-137-1. These results suggest that the FR3 and FR4 regions are suitable for humanized antibodies, and in the FR1 and FR2 regions there is one or more amino acid residues that need to be replaced.

(ii-b) Гибридное антитело FR1/FR2(ii-b) Hybrid antibody FR1 / FR2

Когда L-цепь гибридного антитела имеет структуру mhmMBC1L(λ), антитело не обладает антигенсвязывающей активностью. Однако, когда L-цепь гибридного антитела имеет структуру hmmMBC1L(λ), данное антитело характеризуется таким же уровнем антигенсвязывающей активности, что и химерное антитело №23-57-137-1. Эти результаты позволяют предположить, что область FR1 пригодна для очеловеченного антитела, а в области FR2 имеется один или несколько аминокислотных остатков, которые необходимо заменить.When the L chain of a hybrid antibody has the structure mhmMBC1L (λ), the antibody does not have antigen binding activity. However, when the L chain of a hybrid antibody has the structure hmmMBC1L (λ), the antibody is characterized by the same level of antigen binding activity as chimeric antibody No. 23-57-137-1. These results suggest that the FR1 region is suitable for humanized antibodies, and in the FR2 region there is one or more amino acid residues that need to be replaced.

(iii) Активность очеловеченного антитела(iii) Humanized antibody activity

Определяют антигенсвязывающую активность очеловеченного антитела, в котором в качестве L-цепи использованы все варианты от "а" до "t". Полученные результаты показывают, что очеловеченные антитела, имеющие L-цепь в соответствии с вариантами "j", "l", "m", "о", "q", "r", "s" и "t", характеризуются таким же уровнем PTHrP-связывающей активности, что и химерное антитело.The antigen binding activity of a humanized antibody is determined in which all variants from "a" to "t" are used as the L chain. The results show that humanized antibodies having an L chain in accordance with variants "j", "l", "m", "o", "q", "r", "s" and "t" are characterized by such the same level of PTHrP binding activity as the chimeric antibody.

(8) Создание стабильно продуцируемой линии клеток яичника китайского хомячка(8) Creating a Stably Produced Chinese Hamster Ovary Cell Line

Чтобы создать стабильный трансформант для очеловеченного антитела, вышеуказанные экспрессирующие плазмиды вводят в клетку СНО (DXB11).To create a stable transformant for a humanized antibody, the above expression plasmids are introduced into the CHO cell (DXB11).

Стабильный трансформант очеловеченного антитела создают с использованием нижеследующих комбинаций плазмид в качестве экспрессирующего вектора для клеток СНО, а именно hМВС1НкДНК/рСНO1 и hМВС1Lmλ/рСOS1; hМВС1НкДНК/рСНO1 и hMBC1Lqλ/pCOS1; hМВС1НкДНК/рСНO1 и hMBC1Lrλ/pCOS1. Эти плазмиды котрансфецируют в клетки СНО по методу электропорации с помощью электроимпульсного устройства Gene Pulser (Bio Rad). Все экспрессирующие векторы расщепляют рестрикционным ферментом Pvul с получением линейной ДНК. Указанную ДНК экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом.A stable transformant of a humanized antibody is created using the following combinations of plasmids as an expression vector for CHO cells, namely hMBC1HcDNA / pCHO1 and hMBC1Lmλ / pCOS1; hMBC1NcDNA / pCHO1 and hMBC1Lqλ / pCOS1; hMBC1NcDNA / pCHO1 and hMBC1Lrλ / pCOS1. These plasmids are cotransfected into CHO cells by electroporation using an Electropulse Gene Pulser (Bio Rad). All expression vectors are digested with the restriction enzyme Pvul to give linear DNA. The DNA was extracted with phenol and chloroform and precipitated with ethanol.

Полученные таким образом ДНК подвергают электропорации. К 0,8 мл суспензии клеток СНО в PBS(-) с концентрацией 1×107 клеток/мл добавляют по десять мкг всех плазмидных ДНК. Полученную смесь подвергают воздействию импульсов при электростатической емкости 1500 В и силе тока 2 мкФ. Электропорированные клетки выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут и суспендируют в среде МЕМ-α (GIBCO), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (GIBCO), и культивируют на 96-луночных планшетах (Falcon) в инкубаторе с CO2. На следующий день после начала культивирования среду заменяют селективной средой МЕМ-α, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (GIBCO) и 500 мг/мл GENETICIN (G418Sulfate; GIBCO) без рибонуклеозида или дезоксирибонуклеозида. Из культуральной среды отбирают клетки, в которые введен ген антитела. Селективную среду заменяют свежей средой до культивирования и через две недели культивирования, после чего клетки исследуют под микроскопом. В клетках, характеризующихся удовлетворительным ростом, определяют количество антител, полученных в результате выполнения твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), который обычно используют для измерения концентрации антител в соответствии с описанной выше процедурой. Избирательно собирают клетки, продуцирующие наибольшее количество антител.Thus obtained DNA is subjected to electroporation. To 0.8 ml of a suspension of CHO cells in PBS (-) with a concentration of 1 × 10 7 cells / ml add ten μg of all plasmid DNA. The resulting mixture is subjected to pulses at an electrostatic capacity of 1500 V and a current strength of 2 μF. The electroporated cells were kept at room temperature for 10 minutes and suspended in MEM-α medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal calf serum (GIBCO), and cultured on 96-well plates (Falcon) in a CO 2 incubator. The day after the start of cultivation, the medium is replaced with selective MEM-α medium supplemented with 10% fetal calf serum (GIBCO) and 500 mg / ml GENETICIN (G418Sulfate; GIBCO) without ribonucleoside or deoxyribonucleoside. Cells into which the antibody gene is introduced are selected from the culture medium. The selective medium is replaced with fresh medium before cultivation and after two weeks of cultivation, after which the cells are examined under a microscope. In cells characterized by satisfactory growth, the number of antibodies obtained by performing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which is usually used to measure the concentration of antibodies in accordance with the above procedure, is determined. Cells producing the highest number of antibodies are selectively harvested.

Повышение уровня культуры стабильного трансформанта для полученных антител производят во вращающемся флаконе с использованием минимальной поддерживающей среды МЕМ-α, дополненной 2% фетальной телячьей сыворотки с ультранизким содержанием IgG без рибонуклеозида или дезоксирибонуклеозида. На 3-й и 4-й день культивирования культуральный супернатант собирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм (Millipore) для удаления клеточного дебриса. Затем очеловеченные антитела очищают от культурального супернатанта клеток СНО в колонке POROS, заполненной белком А (PerSeptive Biosystems), на ConSep LC100 (Millipore) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Очищенные очеловеченные антитела используют в качестве образцов для определения нейтрализующей активности и для исследования фармакологической эффективности на животных моделях гиперкальциемии. Концентрацию и антигенсвязывающую активность очищенных очеловеченных антител определяют с помощью аналогичной системы для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA.An increase in the level of stable transformant culture for the obtained antibodies is carried out in a rotating vial using the minimum MEM-α support medium supplemented with 2% fetal calf serum with ultra-low IgG content without ribonucleoside or deoxyribonucleoside. On the 3rd and 4th day of cultivation, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.2 μm filter (Millipore) to remove cell debris. The humanized antibodies are then purified from the culture supernatant of CHO cells in a POROS column filled with protein A (PerSeptive Biosystems) on a ConSep LC100 (Millipore) in accordance with the attached instructions. Purified humanized antibodies are used as samples for determining neutralizing activity and for studying pharmacological efficacy in animal models of hypercalcemia. The concentration and antigen-binding activity of purified humanized antibodies is determined using a similar system for enzyme-linked immunosorbent assay ELISA.

Пример 4Example 4

Определение нейтрализующей активностиDetermination of neutralizing activity

Нейтрализующую активность антитела мыши, химерного антитела и очеловеченного антитела определяют с использованием линии миеломных клеток крыс ROS17/2,8-5. Клетки ROS17/2,8-5 культивируют в среде F-12 Хэма (GIBCO), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (GIBCO), в инкубаторе с CO2. Клетки ROS 17/2,8-5 инокулируют во все лунки 96-луночного планшета с концентрацией 104 клеток/100 мкл/лунку и культивируют в течение 1 дня. Культуральную среду заменяют средой F-12 Хэма (GIBCO), дополненной 4 мМ гидрокортизона и 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки культивируют в течение трех-четырех дней, промывают 260 мкл среды F-12 Хэма (GIBCO) и добавляют 80 мкл среды F-12 Хэма, дополненной 1 мМ изобутил-1-метилксантина (IBMX, SIGMA), 10% фетальной телячьей сыворотки и 10 мМ HEPES. Полученную смесь инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут.The neutralizing activity of the mouse antibody, chimeric antibody, and humanized antibody was determined using the ROS17 / 2.8-5 rat myeloma cell line. ROS17 / 2.8-5 cells were cultured in Ham F-12 medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal calf serum (GIBCO) in a CO 2 incubator. ROS 17 / 2.8-5 cells were inoculated into all wells of a 96-well plate at a concentration of 10 4 cells / 100 μl / well and cultured for 1 day. The culture medium is replaced with Ham F-12 medium (GIBCO) supplemented with 4 mM hydrocortisone and 10% fetal calf serum. The cells were cultured for three to four days, washed with 260 μl of Ham F-12 medium (GIBCO) and 80 μl of Ham F-12 medium supplemented with 1 mM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, SIGMA), 10% fetal calf serum and 10 mM HEPES. The resulting mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes.

Антитело мыши, химерное антитело и очеловеченное антитело, предназначенные для испытания нейтрализующей активности, предварительно поэтапно разводят следующим образом: [10 мкг/мл, 3,3 мкг/мл, 1,1 мкг/мл и 0,37 мкг/мл], [10 мкг/мл, 2 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 0,01 мкг/мл] и [10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 0,63 мкг/мл и 0,31 мкг/мл]. Каждый раствор образца разведенного антитела смешивают с эквивалентным количеством 4 нг/мл PTHrP (1-34). В каждую лунку вводят 80 мкл раствора полученной смеси. Конечная концентрация каждого антитела равна четвертой части исходной концентрации вышеуказанного антитела, поэтому концентрация PTHrP (1-34) составляет 1 нг/мл. Культуру выдерживают в течение десяти минут при комнатной температуре, после чего культуральный супернатант удаляют и остаток трижды промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером. Из полученного продукта экстрагируют циклический аденозинмонофосфат (сАМР) в клетках, используя 10 мкл смеси 0,3% HCl и 95% этанола, и упаривают с помощью впрыскивающего аспиратора для удаления HCl этанола. Остаток растворяют в 120 мкл буфера для иммуноферментного анализа (EIA), прилагаемого к набору для анализа сАМР методом EIA (CAYMAN CHEMICAL'S). Уровень сАМР определяют с помощью набора (CAYMAN CHEMICAL'S) в соответствии с прилагаемыми к нему инструкциями. Полученные результаты показывают, что очеловеченные антитела, содержащие разные варианты L-цепи, характеризуются таким же уровнем антигенсвязывающей активности, что и химерное антитело, при этом очеловеченные антитела с L-цепью вариантов "q", "r", "s" и "t", в которых тирозин в 91-положении заменен изолейцином, обладают нейтрализующей активностью, которая ближе всего соответствует аналогичной активности химерного антитела, особенно те, которые имеют L-цепь варианта "q", обладают наиболее сильной нейтрализующей активностью.A mouse antibody, a chimeric antibody, and a humanized antibody to be tested for neutralizing activity are pre-diluted in the following manner: [10 μg / ml, 3.3 μg / ml, 1.1 μg / ml and 0.37 μg / ml], [ 10 μg / ml, 2 μg / ml, 0.5 μg / ml and 0.01 μg / ml] and [10 μg / ml, 5 μg / ml, 1.25 μg / ml, 0.63 μg / ml and 0.31 μg / ml]. Each diluted antibody sample solution was mixed with an equivalent amount of 4 ng / ml PTHrP (1-34). 80 μl of a solution of the resulting mixture is injected into each well. The final concentration of each antibody is equal to a quarter of the initial concentration of the above antibodies, so the concentration of PTHrP (1-34) is 1 ng / ml. The culture was maintained for ten minutes at room temperature, after which the culture supernatant was removed and the residue was washed three times with physiological saline with phosphate buffer. Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) was extracted from the resulting product in cells using 10 μl of a mixture of 0.3% HCl and 95% ethanol and evaporated using an injection aspirator to remove ethanol HCl. The residue was dissolved in 120 μl Enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) buffer attached to the EIA cAMP assay kit (CAYMAN CHEMICAL'S). The cAMP level is determined using the kit (CAYMAN CHEMICAL'S) in accordance with the instructions attached to it. The results show that humanized antibodies containing different variants of the L chain are characterized by the same level of antigen binding activity as the chimeric antibody, while humanized antibodies with the L chain of variants q, r, s and t ", in which tyrosine at the 91-position is replaced by isoleucine, have a neutralizing activity that is closest to that of a chimeric antibody, especially those that have the" q "variant L chain have the most powerful neutralizing activity.

Пример 5Example 5

Исследование фармакологического действия на животной модели гиперкалыциемии (1)A study of the pharmacological action in an animal model of hypercalcemia (1)

Терапевтическое действие химерного очеловеченного антитела против PTHrP, имеющих L-цепь вариантов "m", "r" и "q", исследовали на животной модели гиперкальциемии (опухоль человека, трансплантированная "голым" мышам).The therapeutic effect of the chimeric humanized anti-PTHrP antibody having the L chain of variants “m”, “r” and “q” was investigated in an animal model of hypercalcemia (human tumor transplanted to “naked” mice).

В качестве животной модели гиперкальциемии использовали "голых" мышей, которым трансплантировали злокачественную опухоль поджелудочной железы человека PAN-7 [мыши были приобретены в Центральном институте экспериментальных животных]. Известно, что у "голых" мышей, которым трансплантирована злокачественная опухоль поджелудочной железы человека PAN-7, повышается концентрация кальция в крови по мере увеличения объема опухоли и развивается гиперкальциемия, вызывающая уменьшение массы тела и сокращение двигательной активности. В соответствии с этим примером терапевтическое действие химерного антитела и очеловеченного антитела по настоящему изобретению на гиперкальциемию, обусловленную злокачественной опухолью поджелудочной железы человека PAN-7, исследовали путем измерения массы тела и концентрации кальция в крови испытуемого животного.As an animal model of hypercalcemia, “naked” mice were used, which transplanted a human pancreatic tumor PAN-7 [mice were purchased at the Central Institute of Experimental Animals]. It is known that in "naked" mice, which transplanted a human pancreatic cancer, PAN-7, the concentration of calcium in the blood increases as the tumor volume increases and hypercalcemia develops, causing a decrease in body weight and a decrease in motor activity. According to this example, the therapeutic effect of the chimeric antibody and the humanized antibody of the present invention on hypercalcemia due to a PAN-7 human pancreatic cancer was investigated by measuring body weight and calcium concentration in the blood of a test animal.

Злокачественную опухоль поджелудочной железы человека PAN-7 прививали "голым" мышам BALB/c-nu/nu (Nippon Charles River) in vivo. Для оценки фармакологического действия антител по настоящему изобретению были приобретены самцы "голых" мышей BALB/c-nu-nu (Nippon Charles River) в возрасте 5 недель, которых акклиматизировали в течение 1 недели и использовали для выполнения указанного эксперимента в 6-недельном возрасте. Испытуемых мышей с симптомами гиперкальциемии готовили и распределяли по группам следующим образом. Пассированную злокачественную опухоль поджелудочной железы человека PAN-7 иссекали и вырезали из нее 3 мм кубик срезов. Каждой мыши трансплантировали подкожно по одному срезу опухоли. Через две или три недели после трансплантации, когда раковая опухоль у мышей достигала достаточно большого объема, мышей распределяли по группам с учетом среднего объема опухоли, концентрации кальция в крови и массы тела, после чего их использовали в качестве животных моделей гиперкальциемии.A human pancreatic tumor, PAN-7, was inoculated into nude BALB / c-nu / nu mice (Nippon Charles River) in vivo. To evaluate the pharmacological effect of the antibodies of the present invention, 5-week-old male BALB / c-nu-nu (Nippon Charles River) nude mice were purchased, which were acclimatized for 1 week and used to perform this experiment at 6 weeks of age. Test mice with symptoms of hypercalcemia were prepared and divided into groups as follows. A passivated human pancreatic tumor, PAN-7, was excised and a 3 mm section cube was excised from it. Each mouse was transplanted subcutaneously with one section of the tumor. Two or three weeks after transplantation, when the cancer tumor in the mice reached a sufficiently large volume, the mice were divided into groups based on the average tumor volume, blood calcium concentration and body weight, after which they were used as animal models of hypercalcemia.

Терапевтическое действие на гиперкальциемию исследовали следующим образом. Однократную дозу химерного или очеловеченного антител против PTHrP, имеющих L-цепь варианта "m" или "r", вводили в хвостовую вену испытуемым мышам в количестве 10 или 30 мкг/мышь. Однократную дозу очеловеченного антитела, имеющего L-цепь варианта "q", вводили в хвостовую вену испытуемым мышам с симптомами гиперакальциемии, в количестве 20 или 60 мкг/мышь. Для оценки фармакологического действия антител у всех мышей измеряли концентрацию кальция в крови и массу тела на 1-й, 4-й, 7-й и 11-й день после введения. Объем опухоли определяли путем измерения наибольшего диаметра (а мм) и наименьшего диаметр (b мм) опухоли и выполнения вычислений с использованием обоих полученных значений по уравнению Галанта [ab2/2]. Концентрацию кальция в крови определяли на основании концентрации ионизированного кальция в цельной крови, которую брали у всех мышей через глазницу с помощью гематокритной трубки и анализировали в автоматическом анализаторе 643Ca++/pH (CIBA-CORNING).The therapeutic effect on hypercalcemia was investigated as follows. A single dose of chimeric or humanized anti-PTHrP antibodies having the L chain of the “m” or “r” variant was injected into the tail vein of the test mice in an amount of 10 or 30 μg / mouse. A single dose of a humanized antibody having an “q” variant L chain was injected into the tail vein of test mice with hyperacalcemia symptoms in an amount of 20 or 60 μg / mouse. To assess the pharmacological effect of antibodies in all mice, the concentration of calcium in the blood and body weight were measured on the 1st, 4th, 7th and 11th day after administration. Tumor volume was determined by measuring the largest diameter (a mm) and the smallest diameter (b mm) of the tumor and performing calculations using both of the obtained values Galant's equation [ab 2/2]. Blood calcium concentration was determined based on the concentration of ionized calcium in whole blood, which was taken from all mice through the orbit using a hematocrit tube and analyzed in a 643Ca ++ / pH automated analyzer (CIBA-CORNING).

Было установлено, что введение химерного антитела и очеловеченных антител, имеющих L-цепь вариантов "m", "r" и "q", вызывает быстрое улучшение по отношению к изменению массы тела и концентрации кальция в крови и улучшение сохраняется в течение длительного периода времени. Полученные результаты показывают, что химерное антитело и очеловеченные антитела по настоящему изобретению являются полезными для лечения гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью.It was found that the introduction of a chimeric antibody and humanized antibodies having the L chain of variants "m", "r" and "q" causes a rapid improvement with respect to changes in body weight and calcium concentration in the blood and the improvement persists for a long period of time . The results show that the chimeric antibody and humanized antibodies of the present invention are useful for the treatment of hypercalcemia caused by a malignant tumor.

Пример 6Example 6

Исследование фармакологического действия на животной модели гиперкалыциемии (2)A study of the pharmacological action in an animal model of hypercalcemia (2)

Терапевтическое действие химерного очеловеченного антитела против PTHrP, имеющего L-цепь варианта "q", исследовали на животной модели гиперкальциемии (опухоль человека, трансплантированная "голым" мышам).The therapeutic effect of the chimeric humanized anti-PTHrP antibody having the “q” variant L chain was investigated in an animal model of hypercalcemia (human tumor transplanted to nude mice).

Терапевтическое действие на гиперкальциемию исследовали следующим образом. Однократную дозу химерного или очеловеченного антитела против PTHrP, имеющего L-цепь варианта "q", вводили в хвостовую вену испытуемым мышам с симптомами гиперкальциемии в количестве 10 или 30 мкг/мышь. Для оценки фармакологического действия антител у всех мышей измеряли концентрацию кальция в крови и массу тела на 1-й, 3-й, 7-й и 11-й день после введения. Концентрацию кальция в крови определяли на основании концентрации ионизированного кальция в цельной крови, которую брали у всех мышей через глазницу с помощью гематокритной трубки и анализировали в автоматическом анализаторе 643Ca++/pH (CIBA-CORNING).The therapeutic effect on hypercalcemia was investigated as follows. A single dose of a chimeric or humanized anti-PTHrP antibody having an “q” L chain was injected into the tail vein of test mice with symptoms of hypercalcemia in an amount of 10 or 30 μg / mouse. To assess the pharmacological effect of antibodies in all mice, the concentration of calcium in the blood and body weight were measured on the 1st, 3rd, 7th and 11th day after administration. Blood calcium concentration was determined based on the concentration of ionized calcium in whole blood, which was taken from all mice through the orbit using a hematocrit tube and analyzed in a 643Ca ++ / pH automated analyzer (CIBA-CORNING).

Было установлено, что введение химерного и очеловеченного антитела, имеющего L-цепь варианта "q", вызывает быстрое улучшение по отношению к изменению массы тела и концентрации кальция в крови, улучшение сохраняется в течение длительного периода времени. Полученные результаты показывают, что химерное антитело и очеловеченное антитело по настоящему изобретению являются полезными средствами для лечения гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью.It was found that the introduction of a chimeric and humanized antibody having the L chain of variant "q" causes a rapid improvement with respect to changes in body weight and calcium concentration in the blood, the improvement persists for a long period of time. The results show that the chimeric antibody and humanized antibody of the present invention are useful in the treatment of malignant hypercalcemia.

Пример 7Example 7

Исследование фармакологического действия животной модели гиперкальциемии (3)Study of the pharmacological action of an animal model of hypercalcemia (3)

Терапевтическое действие химерного и очеловеченного антитела против PTHrP, имеющего L-цепь варианта "q", исследовали на животной модели гиперкальциемии (злокачественная опухоль легкого человека LC-6, трансплантированная "голым" мышам).The therapeutic effect of the chimeric and humanized anti-PTHrP antibody having the “q” variant L chain was investigated in an animal model of hypercalcemia (human lung tumor LC-6 transplanted into nude mice).

В качестве животной модели гиперкальциемии использовали "голых" мышей, которым трансплантировали злокачественную опухоль легкого человека LC-6 [мыши были приобретены в Центральном институте экспериментальных животных]. Известно, что у "голых" мышей, которым трансплантирована злокачественная опухоль легкого человека LC-6, повышается концентрация кальция в крови по мере увеличения объема опухоли и развивается гиперкальциемия, вызывающая уменьшение массы тела и сокращение двигательной активности.As an animal model of hypercalcemia, “naked” mice were used, which transplanted a human lung cancer tumor LC-6 [mice were purchased at the Central Institute of Experimental Animals]. It is known that in “naked” mice, which transplanted a lung cancer tumor of a human lung LC-6, the concentration of calcium in the blood increases as the tumor volume increases and hypercalcemia develops, causing a decrease in body weight and a decrease in motor activity.

В соответствии с этим примером терапевтическое действие химерного антитела и очеловеченного антитела по настоящему изобретению на гиперкальциемию, обусловленную злокачественной опухолью легкого человека LC-6, исследовали путем измерения массы тела и концентрации кальция в крови испытуемых животных.In accordance with this example, the therapeutic effect of the chimeric antibody and the humanized antibody of the present invention on hypercalcemia due to malignant human lung cancer LC-6 was investigated by measuring body weight and calcium concentration in the blood of test animals.

Злокачественную опухоль легкого человека LC-6 прививали "голым" мышам BALB/c-nu/nu (Nippon Charles River) in vivo. Для оценки фармакологического действия антител по настоящему изобретению были приобретены самцы "голых" мышей BALB/c-nu-nu (Nippon Charles River) в возрасте 5 недель, которых акклиматизировали в течение 1 недели и использовали для выполнения указанного эксперимента в 6-недельном возрасте.LC-6 human lung cancer was inoculated into nude BALB / c-nu / nu mice (Nippon Charles River) in vivo. To evaluate the pharmacological effect of the antibodies of the present invention, 5-week-old male BALB / c-nu-nu (Nippon Charles River) nude mice were purchased, which were acclimatized for 1 week and used to perform this experiment at 6 weeks of age.

Испытуемых мышей с симптомами гиперкальциемии готовили и распределяли по группам следующим образом. Пассированную злокачественную опухоль легкого человека LC-6 иссекали и вырезали из нее 3 мм кубик срезов. Каждой мыши трансплантировали подкожно по одному срезу опухоли. Через две или три недели после трансплантации, когда раковая опухоль у мышей достигала достаточно большого объема, мышей распределяли по группам с учетом среднего объема опухоли, концентрации кальция в крови и массы тела, после чего их использовали в качестве животных моделей гиперкальциемии.Test mice with symptoms of hypercalcemia were prepared and divided into groups as follows. Passaged malignant tumor of a human lung LC-6 was excised and a 3 mm cube of sections was cut from it. Each mouse was transplanted subcutaneously with one section of the tumor. Two or three weeks after transplantation, when the cancer tumor in the mice reached a sufficiently large volume, the mice were divided into groups based on the average tumor volume, blood calcium concentration and body weight, after which they were used as animal models of hypercalcemia.

Терапевтическое действие на гиперкальциемию исследовали следующим образом. Однократную дозу химерного или очеловеченного антитела против PTHrP, имеющего L-цепь варианта "q", вводили в хвостовую вену испытуемым мышам с симптомами гиперкальциемии в количестве 10 или 30 мкг/мышь. Для оценки фармакологического действия антител у всех мышей измеряли концентрацию кальция в крови и массу тела на 1-й, 3-й, 6-й и 10-й день после введения. Концентрацию кальция в крови определяли на основании концентрации ионизированного кальция в цельной крови, которую брали у всех мышей через глазницу с помощью гематокритной трубки и анализировали в автоматическом анализаторе 643Ca++/pH (CIBA-CORNING).The therapeutic effect on hypercalcemia was investigated as follows. A single dose of a chimeric or humanized anti-PTHrP antibody having an “q” L chain was injected into the tail vein of test mice with symptoms of hypercalcemia in an amount of 10 or 30 μg / mouse. To assess the pharmacological effect of antibodies in all mice, the concentration of calcium in the blood and body weight were measured on the 1st, 3rd, 6th and 10th day after administration. Blood calcium concentration was determined based on the concentration of ionized calcium in whole blood, which was taken from all mice through the orbit using a hematocrit tube and analyzed in a 643Ca ++ / pH automated analyzer (CIBA-CORNING).

Было установлено, что введение химерного антитела и очеловеченного антитела, имеющего L-цепь варианта "q", вызывает быстрое улучшение по отношению к изменению массы тела и концентрации кальция в крови у испытуемых мышей, имеющих злокачественную опухоль легкого человека LC-6, и улучшение сохраняется в течение длительного периода времени. Полученные результаты показывают, что химерное антитело и очеловеченное антитело по настоящему изобретению являются полезными средствами для лечения гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью.It was found that the introduction of a chimeric antibody and a humanized antibody having an “q” variant L chain causes a rapid improvement with respect to changes in body weight and blood calcium concentration in test mice having LC-6 human lung cancer, and the improvement is maintained for a long period of time. The results show that the chimeric antibody and humanized antibody of the present invention are useful in the treatment of malignant hypercalcemia.

Пример 8Example 8

Кинетический анализ взаимодействия между PTHrP и антителом против PTHrP с использованием BIACOREKinetic analysis of the interaction between PTHrP and anti-PTHrP antibody using BIACORE

В этом эксперименте выполняли кинетический анализ взаимодействия антиген-антитело с использованием BIACORE. В качестве антитела использовали PTHrP (1-34+Cys), который адсорбировали на конце сенсора, особенно на С-конце. В качестве аналита использовали очищенные антитела с разными концентрациями. На основании полученной сенсорграммы высчитывали кинетические параметры (константа скорости связывания "kass" и константа скорости диссоциации "kdiss"). Кинетический анализ выполняли по методике, описанной в статье "Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system", Karlsson, R. et al., (1991), J.Immunol. Methods 145, p.229-240.In this experiment, a kinetic analysis of antigen-antibody interaction was performed using BIACORE. As the antibody, PTHrP (1-34 + Cys) was used, which was adsorbed at the end of the sensor, especially at the C-end. As the analyte used purified antibodies with different concentrations. Based on the sensorgram obtained, kinetic parameters were calculated (binding rate constant "kass" and dissociation rate constant "kdiss"). Kinetic analysis was performed according to the method described in the article "Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system", Karlsson, R. et al., (1991), J. Immmunol. Methods 145, p. 229-240.

(1) Иммобилизация PTHrP (1-34+С) на конце сенсора(1) Immobilization of PTHrP (1-34 + C) at the end of the sensor

PTHrP (1-34+С) адсорбировали на конце сенсора СМ5 (Pharmacia). В качестве испытательного буфера использовали HBS (10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3,4 мМ EDTA, 0,005% сурфантанта Р20) со скоростью потока 5 мкл/мин. Карбоксильные группы карбоксиметилдекстрана на конце сенсора СМ5 активировали путем введения 100 мкл 0,05 М гидроксисукцинимида (NHS)/0,2M гидроксихлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 100 мкл 80 мМ 2-(2-пиридинилдитио)-этанамина (PDEA)/0,1 М боратного буфера (рН 8,5) и дополнительного введения 10 мкл 5 мкг/мл PTHrP (1-34+С)/10 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), в результате чего на С-концах PTHrP (1-34+С) происходила адсорбция, особенно Cys-остатков. Затем вводили 100 мкл 50 мМ (L)-цистеина/1M NaCl/0,1 М натрий-формиатного буфера (рН 4,3), чтобы блокировать чрезмерно активированные группы. Вслед за этим вводили 10 мкл 0,1 М глицин-HCl буфера (рН 2,5) и 10 мкл 10 мМ HCl для промывки веществ с нековалентным связыванием.PTHrP (1-34 + C) was adsorbed at the end of the CM5 sensor (Pharmacia). HBS (10 mM HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% P20 surfactant) was used as test buffer at a flow rate of 5 μl / min. The carboxy groups of carboxymethyldextran at the end of the CM5 sensor were activated by injecting 100 μl of 0.05 M hydroxysuccinimide (NHS) / 0.2 M hydroxychloride N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 100 μl 80 mM 2- (2 -pyridinyldithio) ethanamine (PDEA) / 0.1 M borate buffer (pH 8.5) and an additional injection of 10 μl 5 μg / ml PTHrP (1-34 + C) / 10 mm sodium acetate buffer (pH 5.0 ), resulting in adsorption at the C-ends of PTHrP (1-34 + C), especially of Cys residues. Then, 100 μl of 50 mM (L) -cysteine / 1M NaCl / 0.1 M sodium formate buffer (pH 4.3) was added to block excessively activated groups. Subsequently, 10 μl of 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 2.5) and 10 μl of 10 mM HCl were added to wash non-covalent binding substances.

Количество иммунизированного PTHrP (1-34+C) составило 226,4 резонансной единицы (RU).The amount of immunized PTHrP (1-34 + C) was 226.4 resonance units (RU).

(2) Взаимодействие между иммунизированным PTHrP (1-34+C) и очищенным антителом мыши против PTHrP(2) Interaction between Immunized PTHrP (1-34 + C) and Purified Mouse Antibody Against PTHrP

В качестве буфера для перегонки использовали HBS со скоростью потока 20 мкл/мин. Антителообразующие гибридомы инъецировали в брюшную полость мышам Balb/c. Через несколько недель собирали асцит и вводили его в колонку, заполненную белком А, для очистки антител. Очищенное антитело № 23-57-137-1 было названо "МВС" и очищенное антитело 3F5 было названо "3F5". Эти антитела разбавляли HBS с получением нескольких растворов с концентрациями 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мкг/мл.HBS was used as a distillation buffer at a flow rate of 20 μl / min. Antibody-forming hybridomas were injected into the abdominal cavity of Balb / c mice. After a few weeks, ascites was collected and introduced into a column filled with protein A to purify the antibodies. The purified antibody No. 23-57-137-1 was named "MBC" and the purified 3F5 antibody was named "3F5". These antibodies were diluted with HBS to give several solutions with concentrations of 1.25, 2.5, 5, 10 and 20 μg / ml.

При выполнении этого анализа в течение 2 минут вводили 40 мкл раствора антитела для достижения фазы связывания, затем в течение 2 минут вводили НВ5 для достижения фазы диссоциации. После окончания диссоциации вводили 10 мкл 10 мм HCl для восстановления конца сенсора. Анализ выполняли в соответствии с процедурой связывания - диссоциации - восстановления в виде одного цикла и введения разных растворов антител с целью получения сенсорграммы.When performing this analysis, 40 μl of antibody solution was injected for 2 minutes to achieve the binding phase, then HB5 was injected for 2 minutes to achieve the dissociation phase. After dissociation, 10 μl of 10 mm HCl was injected to restore the end of the sensor. The analysis was carried out in accordance with the procedure of binding — dissociation — reduction in the form of a single cycle and the introduction of different solutions of antibodies in order to obtain a sensogram.

(3) Взаимодействие между иммобилизированным PTHrP (1-34+С) и очищенным очеловеченным антителом против PTHrP(3) Interaction between immobilized PTHrP (1-34 + C) and purified humanized anti-PTHrP antibody

В качестве буфера для перегонки использовали HBS со скоростью потока 20 мкл/мин. Антитело получали из клеток яичника китайского хомячка и очищали в колонке, заполненной белком А. Очищенное химерное антитело было названо "chMBC" и очищенные очеловеченные антитела вариантов m и q были названы "hMBCm" и "hMBCq". Эти антитела разбавляли HBS с получением нескольких растворов с концентрациями 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мкг/мл.HBS was used as a distillation buffer at a flow rate of 20 μl / min. The antibody was obtained from Chinese hamster ovary cells and purified in a column filled with protein A. The purified chimeric antibody was named "chMBC" and the purified humanized antibodies of variants m and q were named "hMBCm" and "hMBCq". These antibodies were diluted with HBS to give several solutions with concentrations of 1.25, 2.5, 5, 10 and 20 μg / ml.

При выполнении этого анализа в течение 2 минут вводили 40 мкл раствора антитела для достижений фазы связывания, затем в течение 2 минут вводили HBS для достижения фазы диссоциации. После окончания диссоциации вводили 10 мкл 10 мМ HCl для восстановления конца сенсора. Анализ выполняли в соответствии с процедурой связывания - диссоциации - восстановления в виде одного цикла и введения разных растворов антител с целью получения сенсорграммы.When performing this analysis, 40 μl of antibody solution was injected for 2 minutes to achieve the binding phase, then HBS was injected for 2 minutes to reach the dissociation phase. After dissociation was completed, 10 μl of 10 mM HCl was injected to restore the end of the sensor. The analysis was carried out in accordance with the procedure of binding — dissociation — reduction in the form of a single cycle and the introduction of different solutions of antibodies in order to obtain a sensogram.

(4) Кинетический анализ взаимодействия(4) Kinetic interaction analysis

Считывали файл с интересующими данными и сравнивали реакционные модели путем наложения друг на друга представляющих интерес областей реакции. Затем выполняли кинетический анализ взаимодействия с использованием программы анализа, специально предназначенной для сенсора BIACORE "BIAevaluation 2/1" (Pharmacia), которая позволяет высчитывать кинетические параметры (константу скорости связывания "kass" и константу скорости диссоциации "kdiss") путем обработки полученных графиков (таблицы 4 и 5).The file with the data of interest was read and reaction models were compared by superimposing on each other areas of interest of interest. Then, a kinetic analysis of the interaction was performed using an analysis program specially designed for the BIACORE "BIAevaluation 2/1" sensor (Pharmacia), which allows you to calculate kinetic parameters (the binding rate constant "kass" and the dissociation constant constant "kdiss") by processing the obtained graphs tables 4 and 5).

Таблица 4Table 4 Кинетические параметры МВС и 3F5Kinetic parameters MVS and 3F5   МВСMVS 3F53F5 Kdiss [1/сек]Kdiss [1 / sec] 7,38×10-5 7.38 × 10 -5 1,22×102 1.22 × 10 2 Kass [1/сек]Kass [1 / sec] 7,23×105 7.23 × 10 5 6,55×105 6.55 × 10 5 KD [М]KD [M] 1,02×10-10 1.02 × 10 -10 1,86×10-8 1.86 × 10 -8 Таблица 5Table 5 Кинетические параметры химерного и очеловеченного антителаKinetic parameters of chimeric and humanized antibodies   chH-chλchH-chλ HMBCmHmbcm hMBCqhMBCq Kdiss [1/сек]Kdiss [1 / sec] (×10-4)(× 10 -4 ) 1,661,66 3,163.16 2,322,32 Kass [1/сек]Kass [1 / sec] (×106)(× 10 6 ) 1,241.24 0,8830.883 1,031,03 KD [М]KD [M] (×10-10)(× 10 -10 ) 1,341.34 3,583,58 2,252.25

В этом эксперименте для определения константы скорости связывания использовали модель анализа типа 4 (BIAevaluation 2/1 Software Handbook, A1-A5).In this experiment, a type 4 analysis model (BIAevaluation 2/1 Software Handbook, A1-A5) was used to determine the binding rate constant.

Пример 9Example 9

Подавление экскреции фосфора в модели гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухольюSuppression of phosphorus excretion in a model of hypercalcemia due to malignant tumor

Гиперкальциемия, обусловленная злокачественной опухолью (ННМ), является болезнью, вызываемой PTHrP, известно, что PTHrP ускоряет резорбцию костной ткани и резорбцию кальция в почках и почечных канальцах, что ведет к развитию гиперкальциемии. С другой стороны, если рассматривать фосфор, то PTHrP подавляет резорбцию фосфора в почках и почечных канальцах, что ведет к выведению фосфора, поэтому у субъектов, страдающих гиперкальциемией, часто наблюдается гипофосфатемия. Влияние очеловеченного антитела против PTHrP на экскрецию фосфора в почках исследовали на крысах, которые служили животной моделью гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью.Malignant tumor hypercalcemia (HNM) is a disease caused by PTHrP, it is known that PTHrP accelerates bone resorption and calcium resorption in the kidneys and renal tubules, which leads to the development of hypercalcemia. On the other hand, if phosphorus is considered, then PTHrP suppresses phosphorus resorption in the kidneys and renal tubules, which leads to phosphorus excretion, therefore hypophosphatemia is often observed in subjects suffering from hypercalcemia. The effect of humanized anti-PTHrP antibody on kidney phosphorus excretion was studied in rats, which served as an animal model of hypercalcemia caused by a malignant tumor.

В качестве животной модели использовали "голых" крыс, которым трансплантировали злокачественную опухоль легкого человека LC-6 (крысы были приобретены в Центральном институте экспериментальных животных). Известно, что у "голых" крыс, которым подкожно трансплантирована злокачественная опухоль легкого человека LC-6, повышается концентрация кальция в крови по мере увеличения объема опухоли и развивается гиперкальциемия, вызывающая уменьшение массы тела и сокращение двигательной активности. Используя эту животную модель, исследовали воздействие очеловеченного антитела против PTHrP по настоящему изобретению на экскрецию фосфата в почках по методу почечного клиренса на основании описанной ниже фракциональной экскреции фосфата.As an animal model, “naked” rats were used, which transplanted a human lung cancer tumor LC-6 (rats were purchased at the Central Institute of Experimental Animals). It is known that in "naked" rats, which were transplanted subcutaneously with a malignant tumor of a human lung LC-6, the concentration of calcium in the blood increases with increasing tumor volume and hypercalcemia develops, causing a decrease in body weight and a decrease in motor activity. Using this animal model, the effect of the humanized anti-PTHrP antibody of the present invention on kidney phosphate excretion was studied by renal clearance based on the fractional phosphate excretion described below.

Злокачественную опухоль легкого человека LC-6 прививали "голым" крысам BALB/c-nu/nu (Nippon Kurea) in vivo. Для оценки фармакологического действия антител по настоящему изобретению были приобретены самцы "голых" крыс F344N/Jcl-rnu (Nippon Kurea) в возрасте 5 недель, которых акклиматизировали в течение 1 недели и использовали для выполнения указанного эксперимента в 6-недельном возрасте.An LC-6 human lung cancer was inoculated into BALB / c-nu / nu (Nippon Kurea) rats in vivo. To evaluate the pharmacological effect of the antibodies of the present invention, male F344N / Jcl-rnu (Nippon Kurea) male rats were purchased at 5 weeks of age, which were acclimatized for 1 week and used to perform this experiment at 6 weeks of age.

Испытуемых крыс с симптомами гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью, готовили следующим образом. Пассированную злокачественную опухоль легкого человека LC-6 иссекали и вырезали из нее 3 мм кубик срезов. Крысам подкожно трансплантировали по одному срезу опухоли. Через тридцать дней после трансплантации, когда раковая опухоль у крыс достигала достаточно большого объема (3000 мм3), крыс распределяли по группам с учетом концентрации кальция в крови и массы тела, после чего их использовали в качестве животных моделей гиперкальциемии.Test rats with symptoms of hypercalcemia due to a malignant tumor were prepared as follows. Passaged malignant tumor of a human lung LC-6 was excised and a 3 mm cube of sections was cut from it. Rats were transplanted subcutaneously with one section of the tumor. Thirty days after transplantation, when the cancerous tumor in rats reached a sufficiently large volume (3000 mm 3 ), the rats were divided into groups taking into account the concentration of calcium in the blood and body weight, after which they were used as animal models of hypercalcemia.

Экскрецию фосфата по методу почечного клиренса исследовали следующим образом.The excretion of phosphate by the method of renal clearance was investigated as follows.

(1) Метод почечного клиренса(1) Renal clearance method

Испытуемого животного с симптомами гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью, анестезировали пентобарбиталом (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), неподвижно фиксировали на спине на инкубационном мате при температуре 37°С и вводили в мочевой пузырь канюлю (полиэтиленовая трубка, РЕ50, Nippon Beckton Dickenson) для сбора мочи. Затем этому животному вводили канюлю (полиэтиленовая трубка, РЕ50, Nippon Beckton Dickinson) в бедренную вену и через эту канюлю с помощью инфузионного насоса вводили раствор для вливания (0,7% инулина, 5% маннита, 0,2% пентобарбитала и 0,9% хлорида натрия) со скоростью потока 2 мл/час. После достижения физиологического баланса, то есть спустя 50 минут, через канюлю в течение 5 минут через 20-минутные интервалы собирали мочу (начиная с периода 1 и кончая периодом 5), в результате чего были получены пробы мочи. В середине процедуры по сбору мочи у подопытного животного брали примерно 0,25 мл крови из правой шейной вены с помощью обработанного гепарином шприца для инъекций.A test animal with symptoms of hypercalcemia due to a malignant tumor was anesthetized with pentobarbital (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), immovably fixed on the back on an incubation mat at a temperature of 37 ° C and a cannula was inserted into the bladder (polyethylene tube, PE50, Nippon Beckton Dickenson) for collecting urine. This cannula (polyethylene tube, PE50, Nippon Beckton Dickinson) was then injected into the femoral vein and an infusion solution (0.7% inulin, 5% mannitol, 0.2% pentobarbital and 0.9%) was injected through this cannula % sodium chloride) with a flow rate of 2 ml / hour. After reaching physiological balance, that is, after 50 minutes, urine was collected through a cannula for 5 minutes at 20-minute intervals (starting from period 1 and ending with period 5), as a result of which urine samples were obtained. In the middle of the urine collection procedure, approximately 0.25 ml of blood was taken from the right cervical vein from a test animal using a heparin-treated injection syringe.

(2) Введение антитела(2) Introduction of antibodies

Во время описанного выше клиренс-теста в момент начала сбора мочи периода 2, животному внутривенно вводили очеловеченное антитело против PTHrP в количестве 1 мг/мл/кг.During the clearance test described above, at the time the urine collection period 2 started, the animal was injected intravenously with a humanized anti-PTHrP antibody in an amount of 1 mg / ml / kg.

(3) Определение концентрации инулина и фосфора в моче и крови(3) Determination of the concentration of inulin and phosphorus in urine and blood

Измеряли объем проб мочи, полученных с периода 1 по период 5, и определяли содержание в них инулина и фосфора. Полученные выше пробы крови центрифугировали в условиях охлаждения с получением образца плазмы, который использовали для определения концентрации инулина и фосфора. Содержание инулина определяли по антронсульфатному методу (Roe, L. et al., J. Biol. Chem. 178, 839-845, 1949) и содержание фосфора определяли при помощи автоматического анализатора модели 7170 фирмы Hitachi с использованием реагента для определения неорганического фосфора, Autosera IP (Daiichi Pure Chemicals) в соответствии с прилагаемым руководством (метод Physke-Sabaroh).The volume of urine samples obtained from period 1 to period 5 was measured, and the contents of inulin and phosphorus were determined. The blood samples obtained above were centrifuged under cooling conditions to obtain a plasma sample, which was used to determine the concentration of inulin and phosphorus. The inulin content was determined by the antronsulfate method (Roe, L. et al., J. Biol. Chem. 178, 839-845, 1949) and the phosphorus content was determined using a Hitachi model 7170 automatic analyzer using an inorganic phosphorus reagent, Autosera IP (Daiichi Pure Chemicals) in accordance with the attached manual (Physke-Sabaroh method).

(4) Вычисление клиренса инулина, клиренса фосфора и фракциональной экскреции фосфора(4) Calculation of inulin clearance, phosphorus clearance and fractional phosphorus excretion

Клиренс инулина (Cin), клиренс фосфора (Ср) и фракциональную экскрецию фосфора (FEp) высчитывали по следующим уравнениям.Inulin clearance (Cin), phosphorus clearance (Cp), and fractional phosphorus excretion (FEp) were calculated using the following equations.

Вычисление клиренса инулина (Cin):Calculation of inulin clearance (Cin):

Cin=Uin V/Pin,Cin = Uin V / Pin,

где Cin означает клиренс инулина (мл/кг/мин); Uin означает концентрацию инулина в моче (мг/мл); V означает количество мочи в единицу времени (мл/кг/мин) и Pin означает концентрацию инулина в крови (мг/мл).where Cin means inulin clearance (ml / kg / min); Uin means the concentration of inulin in the urine (mg / ml); V means the amount of urine per unit time (ml / kg / min) and Pin means the concentration of inulin in the blood (mg / ml).

Вычисление клиренса фосфора (Ср):Calculation of phosphorus clearance (Cf):

Ср=Up V/Pp,Cp = Up V / Pp,

где Ср означает клиренс фосфора (мл/кг/мин); Up означает концентрацию фосфора в моче (мг/мл); V означает количество мочи в единицу времени (мл/кг/мин) и Рр означает концентрацию фосфора в крови (мг/мл).where Cp means phosphorus clearance (ml / kg / min); Up means the concentration of phosphorus in the urine (mg / ml); V means the amount of urine per unit time (ml / kg / min) and Pp means the concentration of phosphorus in the blood (mg / ml).

Вычисление фракциональной экскреции фосфора (FEp):Calculation of fractional phosphorus excretion (FEp):

FEp=Cp/Cin,FEp = Cp / Cin,

где FEp означает фракциональную экскрецию фосфора; Cin означает клиренс инулина и Ср означает клиренс фосфора. Для этого исследования использовали четырех животных. Результаты определяли в виде среднего значения ± стандартная ошибка.where FEp means fractional excretion of phosphorus; Cin means inulin clearance and Cp means phosphorus clearance. Four animals were used for this study. The results were determined as mean ± standard error.

Очеловеченное антитело против PTHrP (1 мг/кг) вводили (внутривенно) в начале периода 2.The humanized anti-PTHrP antibody (1 mg / kg) was administered (intravenously) at the beginning of period 2.

Результаты показывают, что фракциональная экскреция фосфора после введения антитела (то есть с периода 2 по период 5) существенно ниже по сравнению с показателем, полученным до введения антитела (то есть период 1). Другими словами, установлено, что введение нейтрализующего антитела субъекту, страдающему гипофосфатемией вследствие повышенной экскреции фосфора (FEp>0,2), восстанавливает резорбцию фосфора у субъекта почти до нормального уровня (фракциональная резорбция фосфата=1-FEp>0,8%), при этом наблюдается тенденции нормализации концентрации фосфора в крови обследуемого субъекта. Эти результаты свидетельствуют об эффективности антител по настоящему изобретению в качестве средств для лечения повышенной экскреции фосфора и гипофосфатемии, вызываемой наличием PTHrP.The results show that the fractional excretion of phosphorus after administration of the antibody (i.e., from period 2 to period 5) is significantly lower compared to the value obtained before administration of the antibody (i.e., period 1). In other words, it has been found that administration of a neutralizing antibody to a subject suffering from hypophosphatemia due to increased phosphorus excretion (FEp> 0.2) restores the phosphorus resorption in the subject to almost normal levels (fractional phosphate resorption = 1-FEp> 0.8%), with This is a tendency to normalize the concentration of phosphorus in the blood of the subject. These results indicate the effectiveness of the antibodies of the present invention as agents for treating increased excretion of phosphorus and hypophosphatemia caused by the presence of PTHrP.

Поскольку PTHrP является субстратом, вызывающим гиперкальциемию, обусловленную злокачественной опухолью, с высокой степенью вероятности можно прогнозировать увеличение экскреции фосфора и сокращение высокоэнергетического органического фосфора в тканях под воздействием PTHrP. Считается, что многие болезни, обусловленные гипофосфатемией, такие как гипофосфатемический рахит и гипофосфатемический рахит, устойчивый к витамину D, возникают вследствие увеличения экскреции фосфора в моче, поэтому антитела по настоящему изобретению должны быть также полезны для лечения указанных болезней.Since PTHrP is a substrate that causes hypercalcemia due to a malignant tumor, it is highly likely that an increase in phosphorus excretion and a decrease in high-energy organic phosphorus in tissues under the influence of PTHrP can be predicted. It is believed that many diseases caused by hypophosphatemia, such as hypophosphatemic rickets and vitamin D resistant hypophosphatemic rickets, arise from increased excretion of phosphorus in the urine, therefore, the antibodies of the present invention should also be useful for the treatment of these diseases.

Пример 10Example 10

Положительная динамика различных клинических симптомов гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухольюPositive dynamics of various clinical symptoms of hypercalcemia due to malignant tumor

Известно, что гиперкальциемия, обусловленная злокачественной опухолью, возникает под воздействией PTHrP, вырабатываемого опухолью, и что PTHrP ускоряет резорбцию костной ткани и резорбцию кальция в почках и почечных канальцах, что ведет к гиперкальциемии. Кроме того, у субъекта, страдающего гиперкальциемией, наблюдается ухудшение клинических симптомов, а именно плохое физическое состояние, потеря сознания, постоянное недомогание, гидродипсия, тошнота и рвота (анорексия). Воздействие антитела против PTHrP на такие клинические симптомы исследовали с помощью системы трансплантации злокачественной опухоли человека "голым" мышам и "голым" крысам, испольуемым в качестве животных моделей гиперкальциемии.It is known that hypercalcemia due to a malignant tumor occurs under the influence of PTHrP produced by the tumor, and that PTHrP accelerates bone resorption and calcium resorption in the kidneys and renal tubules, which leads to hypercalcemia. In addition, a subject suffering from hypercalcemia has a worsening of clinical symptoms, namely, poor physical condition, loss of consciousness, constant malaise, hydrodipsia, nausea and vomiting (anorexia). The effect of the anti-PTHrP antibody on such clinical symptoms was investigated using a human malignant tumor transplantation system for nude mice and nude rats used as animal models of hypercalcemia.

В качестве животной модели гиперкальциемии использовали "голых" мышей и "голых" крыс (мыши и крысы были приобретены в Центральном институте экспериментальных животных), которым трансплантировали злокачественную опухоль легкого человека LC-6. Известно, что у "голых" мышей и "голых" крыс, которым трансплантирована злокачественная опухоль легкого человека LC-6, повышается концентрация кальция в крови по мере увеличения объема опухоли и развивается гиперкальциемия, вызывающая понижение температуры тела и уменьшение массы тела.As an animal model of hypercalcemia, “nude” mice and “nude” rats (mice and rats were purchased at the Central Institute of Experimental Animals) were used, which transplanted a human lung tumor LC-6. It is known that in "naked" mice and "naked" rats, which transplanted a malignant tumor of a human lung LC-6, the concentration of calcium in the blood increases with increasing tumor volume and hypercalcemia develops, causing a decrease in body temperature and a decrease in body weight.

Положительное воздействие антитела мыши против PTHrP на общие клинические симптомы гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью, исследовали с использованием системы трансплантации "голым" мышам злокачественной опухоли легкого человека LC-6. Полученные результаты представлены на фотографиях. Воздействие указанного антитела на улучшение по отношению к сниженной двигательной активности, температуры тела и анорексии исследовали с использованием системы трансплантации "голым" мышам злокачественной опухоли легкого человека LC-6.The beneficial effects of mouse antibodies against PTHrP on the general clinical symptoms of malignant hypercalcemia were investigated using the LC-6 human lung cancer tumor transplantation system. The results are presented in the photographs. The effect of this antibody on the improvement with respect to reduced locomotor activity, body temperature, and anorexia was investigated using the LC-6 human lung cancer tumor transplantation system.

1. Положительная динамика выраженных клинических симптомов, обусловленных гиперкальциемией1. Positive dynamics of severe clinical symptoms due to hypercalcemia

Злокачественную опухоль легкого человека LC-6 прививали "голым" мышам BALB/c-nu/nu (Nippon Kurea) in vivo. Для оценки фармакологического действия антител были приобретены самцы "голых" мышей BALB/c-nu-nu (Nippon Kurea) в возрасте 5 недель, которых акклиматизировали в течение 1 недели и использовали для выполнения указанного эксперимента в 6-недельном возрасте.LC-6 human lung cancer was inoculated into nude BALB / c-nu / nu (Nippon Kurea) mice in vivo. To assess the pharmacological effect of antibodies, male BALB / c-nu-nu (Nippon Kurea) nude mice were purchased at the age of 5 weeks, which were acclimatized for 1 week and used to perform this experiment at 6 weeks of age.

Испытуемых мышей с симптомами гиперкальциемии готовили и распределяли по группам следующим образом. Пассированную злокачественную опухоль легкого человека LC-6 иссекали и вырезали из нее 3 мм кубик срезов. Каждой мыши трансплантировали подкожно по одному срезу опухоли. Через двадцать семь дней после трансплантации, когда раковая опухоль у мышей достигала достаточно большого объема, мышей распределяли по группам с учетом среднего объема опухоли, концентрации кальция в крови и массы тела, после чего их использовали в качестве животных моделей гиперкальциемии.Test mice with symptoms of hypercalcemia were prepared and divided into groups as follows. Passaged malignant tumor of a human lung LC-6 was excised and a 3 mm cube of sections was cut from it. Each mouse was transplanted subcutaneously with one section of the tumor. Twenty-seven days after transplantation, when the cancer tumor in the mice reached a sufficiently large volume, the mice were divided into groups based on the average tumor volume, blood calcium concentration and body weight, after which they were used as animal models of hypercalcemia.

Объем опухоли определяли путем измерения наибольшего диаметра (а мм) и наименьшего диаметр (b мм) опухоли и выполнения вычислений по уравнению Галанта [ab2/2].Tumor volume was determined by measuring the largest diameter (a mm) and the smallest diameter (b mm) of the tumor, and perform calculations on Galant's equation [ab 2/2].

Концентрацию кальция в крови определяли на основании концентрации ионизированного кальция в цельной крови, которую брали у всех мышей через глазницу с помощью гематокритной трубки и анализировали в автоматическом анализаторе 643 Са++/рН (CIBA-CORNING).Blood calcium concentration was determined based on the concentration of ionized calcium in whole blood, which was taken from all mice through the orbit using a hematocrit tube and analyzed in a 643 Ca ++ / pH automated analyzer (CIBA-CORNING).

Терапевтическое действие данного антитела на гиперкальциемию исследовали следующим образом. Антитело мыши против PTHrP вводили в количестве 100 мкг/мышь в хвостовую вену всем испытуемым животным с симптомами гиперкальциемии на 27-й, 30-й, 34-й и 37-й день после трансплантации злокачественной опухоли. Контрольным животным вместо антитела аналогичным образом вводили забуференный фосфатом физиологический раствор. На 41-й день после трансплантации опухоли, из каждой группы животных, которым вводили указанное антитело, и из контрольной группы выбирали по одной типичной мыши и фотографировали их рядом с нормальной мышью.The therapeutic effect of this antibody on hypercalcemia was investigated as follows. The anti-PTHrP mouse antibody was injected in an amount of 100 μg / mouse into the tail vein of all test animals with symptoms of hypercalcemia on the 27th, 30th, 34th and 37th day after the transplantation of the malignant tumor. Instead of antibodies, the control animals were similarly injected with phosphate buffered saline. On the 41st day after tumor transplantation, one typical mouse was selected from each group of animals to which the indicated antibody and from the control group were photographed next to a normal mouse.

В результате была получена модель с трансплантированной злокачественной опухолью легкого человека LC-6, хотя масса опухоли у мышей, которым вводили антитело, соответствовала массе контрольных мышей, лишь мыши, которым вводили антитело, выглядели так же, как нормальные мыши. Полученные результаты позволяют предположить, что введение антитела против PTHrP вызывает положительную динамику выраженных клинических симптомов.The result was an LC-6 human lung transplanted tumor model, although the tumor mass in the mice that were injected with the antibody corresponded to the weight of the control mice, only the mice that were injected with the antibody looked like normal mice. The obtained results suggest that the introduction of antibodies against PTHrP causes a positive dynamics of pronounced clinical symptoms.

2. Восстановление двигательной активности, пониженной вследствие гиперкальциемии2. Restoration of motor activity reduced due to hypercalcemia

Злокачественную опухоль легкого человека LC-6 прививали "голым" мышам BALB/c-nu/nu (Nippon Kurea) in vivo. Для оценки фармакологического действия антител по настоящему изобретению были приобретены самцы "голых" крыс F344/N Jclrun (Nippon Kurea) в возрасте 5 недель, которых акклиматизировали в течение 1 недели и использовали для выполнения указанного эксперимента в 6-недельном возрасте.LC-6 human lung cancer was inoculated into nude BALB / c-nu / nu (Nippon Kurea) mice in vivo. To evaluate the pharmacological effect of the antibodies of the present invention, 5-week-old male F344 / N Jclrun rats (Nippon Kurea) were acclimated and acclimatized for 1 week and used to perform this experiment at 6 weeks of age.

Испытуемых животных с симптомами гиперкальциемии готовили следующим образом. Пассированную злокачественную опухоль легкого человека LC-6 иссекали и вырезали из нее 3 мм кубик срезов. Каждой мыши трансплантировали подкожно по одному срезу опухоли. Через тридцать дней после трансплантации, когда раковая опухоль у мышей достигала достаточно большого объема, мышей распределяли по группам с учетом среднего объема опухоли, концентрации кальция в крови и массы тела, после чего их использовали в качестве животных моделей гиперкальциемии.Test animals with symptoms of hypercalcemia were prepared as follows. Passaged malignant tumor of a human lung LC-6 was excised and a 3 mm cube of sections was cut from it. Each mouse was transplanted subcutaneously with one section of the tumor. Thirty days after transplantation, when the cancer tumor in the mice reached a sufficiently large volume, the mice were divided into groups taking into account the average tumor volume, blood calcium concentration and body weight, after which they were used as animal models of hypercalcemia.

Концентрацию кальция в крови определяли на основании концентрации ионизированного кальция в цельной крови, которую брали у всех мышей через глазницу с помощью гематокритной трубки и анализировали в автоматическом анализаторе 643Ca++/pH (CIBA-CORNING).Blood calcium concentration was determined based on the concentration of ionized calcium in whole blood, which was taken from all mice through the orbit using a hematocrit tube and analyzed in a 643Ca ++ / pH automated analyzer (CIBA-CORNING).

(1) Метод определения двигательной активности(1) Method for determining motor activity

Двигательную активность определяли с помощью измерителя активности ANIMEX типа SE (FARAD, Electronics, Швеция), который помещали в определенном положении в полиэтиленовую клетку с испытуемым животным, получавшим воду и пищу. Это устройство предназначено для измерения подвижности крысы. С помощью этого устройства подвижность регистрируется в виде количества движений, совершаемых за определенный период времени. Измерение производили в течение 13 часов (с 19.00 часов вечера одного дня до 8.00 часов утра следующего дня). Результаты приведены в виде количества движений за один час.Motor activity was determined using an ANIMEX type SE activity meter (FARAD, Electronics, Sweden), which was placed in a specific position in a polyethylene cage with a test animal that received water and food. This device is designed to measure rat motility. With this device, mobility is recorded as the number of movements made over a given period of time. The measurement was carried out within 13 hours (from 19.00 o'clock in the evening of one day to 8.00 in the morning of the next day). The results are shown as the number of movements in one hour.

(2) Введение антитела(2) Introduction of antibodies

Очеловеченное антитело против PTHrP вводили в количестве 5 мг/0,5 мл/кг в хвостовую вену всем вышеуказанным крысам, страдающим гиперкальциемией. Контрольной группе крыс аналогичным образом вводили физиологический раствор. Измерение производили поочередно у испытуемых крыс, которым вводили антитело, и у контрольных крыс.The humanized anti-PTHrP antibody was administered in an amount of 5 mg / 0.5 ml / kg into the tail vein of all the above rats suffering from hypercalcemia. The control group of rats was similarly injected with saline. The measurement was performed alternately in the test rats that were injected with the antibody, and in control rats.

Крыс, которым вводили антитело, обследовали на 0-й день (то есть день, предшествующий введению), 2-й, 4-й, 7-й и 14-й день и контрольных крыс обследовали на 1-й, 3-й, 5-й, 8-й и 15-й день.Rats that were injected with the antibody were examined on day 0 (i.e., the day preceding administration), 2nd, 4th, 7th and 14th day, and control rats were examined on 1st, 3rd, 5th, 8th and 15th day.

Полученные результаты показывают, что у контрольных крыс не наблюдалось изменения или снижения двигательной активности во время испытательного периода, в то время как у крыс, которым вводили антитело, двигательная активность повысилась на 4-й день введения антитела и в последующие дни.The results show that in the control rats there was no change or decrease in motor activity during the test period, while in rats that were injected with the antibody, motor activity increased on the 4th day of administration of the antibody and on the following days.

3. Повышение температуры тела, пониженной вследствие гиперкальциемии3. An increase in body temperature decreased due to hypercalcemia

Испытуемым животным прививали злокачественную опухоль легкого человека LC-6, вызывали у них гиперкальциемию, обусловленную злокачественной опухолью, и готовили к эксперименту в соответствии с процедурой, описанной на стадии 2.The test animals were inoculated with a malignant tumor of the human lung LC-6, hypercalcemia caused by a malignant tumor was induced in them, and prepared for the experiment in accordance with the procedure described in stage 2.

(1) Метод измерения температуры тела(1) Method for measuring body temperature

Температуру тела испытуемых животных измеряли с помощью цифрового термометра. Для этого животных анестезировали пентобарбиталом (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) и вводили в прямую кишку датчик температуры.The body temperature of the test animals was measured using a digital thermometer. For this, animals were anesthetized with pentobarbital (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and a temperature sensor was inserted into the rectum.

(2) Введение антитела(2) Introduction of antibodies

Очеловеченное антитело против PTHrP вводили в количестве 1 мг/мл/кг в хвостовую вену всем испытуемым крысам, страдающим гиперкальциемией. Контрольной крысе аналогичным образом вводили физиологический раствор. Кроме того, температуру тела измеряли также у нормальной крысы, которой не вводили указанное антитело. Температуру тела у всех крыс, которым вводили антитело, у контрольной крысы и нормальной крысы измеряли на 0-й день (то есть день, предшествующий введению), 1-й, 2-й и 3-й день после введения.The humanized anti-PTHrP antibody was administered in an amount of 1 mg / ml / kg into the tail vein of all test rats suffering from hypercalcemia. The control rat was similarly injected with saline. In addition, body temperature was also measured in a normal rat, to which the indicated antibody was not administered. The body temperature in all rats that were injected with the antibody in the control rat and normal rat was measured on the 0th day (i.e. the day preceding administration), the 1st, 2nd and 3rd day after administration.

В результате этого эксперимента у нормальной крысы не было обнаружено изменения температуры тела (34,2-34,4°С) на протяжении всего периода испытания, в то время как у крыс, страдающих гиперкальциемией, обусловленной злокачественной опухолью, наблюдалось снижение температуры тела примерно на 2°С по сравнению с нормальными крысами. Через три дня после начала введения испытуемым крысам очеловеченного антитела против PTHrP температура тела у них повышалась до уровня, характерного для нормальных крыс. Эти результаты позволяют предположить, что очеловеченное антитело против PTHrP по настоящему изобретению эффективно для повышения сниженной температуры тела у животных, страдающих гиперкальциемией, обусловленной злокачественной опухолью.As a result of this experiment, no change in body temperature (34.2-34.4 ° C) was observed in a normal rat throughout the entire test period, while in rats suffering from malignant hypercalcemia, a decrease in body temperature of approximately 2 ° C compared with normal rats. Three days after the start of administering to the test rats a humanized anti-PTHrP antibody, their body temperature increased to the level typical of normal rats. These results suggest that the humanized anti-PTHrP antibody of the present invention is effective in increasing the decreased body temperature in animals suffering from malignant hypercalcemia.

4. Улучшение аппетита у испытуемых животных, сниженного вследствие гиперкальциемии4. Improved appetite in test animals, reduced due to hypercalcemia

Испытуемым животным прививали злокачественную опухоль легкого человека LC-6, вызывали у них гиперкальциемию и готовили к эксперименту в соответствии с процедурой, описанной в разделе 2. Крыс распределяли по группам с учетом средней концентрации кальция в крови и массы тела, после чего их использовали в описываемых ниже экспериментах.The test animals were inoculated with a malignant tumor of the human lung LC-6, hypercalcemia was caused in them and prepared for the experiment in accordance with the procedure described in Section 2. The rats were divided into groups based on the average concentration of calcium in the blood and body weight, after which they were used in the described below experiments.

(1) Измерение количества потребляемой пищи(1) Measuring the amount of food consumed

Во время испытания каждую крысу помещали в отдельную метаболическую клетку, где она получала воду и пищу. Количество корма, съеденного каждой крысой, определяли в виде количества (г), съеденного за 24 часа (с 9.00 часов утра одного дня до 9.00 часов утра следующего дня). Для этого измеряли общую массу кормушки с кормом в 9.00 часов утра одного дня (то есть вместе с массой тары) и в 9.00 часов утра следующего дня, после чего высчитывали разность между ними.During the test, each rat was placed in a separate metabolic cage, where it received water and food. The amount of food eaten by each rat was determined as the amount (g) eaten in 24 hours (from 9:00 in the morning of one day to 9:00 in the morning of the next day). For this, the total weight of the feeder with the feed was measured at 9:00 a.m. on one day (that is, together with the tare weight) and at 9:00 a.m. on the next day, after which the difference between them was calculated.

(2) Введение антитела(2) Introduction of antibodies

Очеловеченное антитело против PTHrP вводили в количестве 5 мг/0,5 мл/кг в хвостовую вену всем испытуемым крысам, страдающим гиперкальциемией (крысы ННМ). Контрольной группе крыс аналогичным образом вводили физиологический раствор. Кроме того, физиологический раствор вводили в хвостовую вену нормальным крысам. Количество корма, съеденного крысами, которым вводили антитело, контрольными крысами и нормальными крысами, определяли на 0-й день (то есть день, предшествующий введению антитела), 1-й день (то есть в период со дня введения до следующего дня), 3-й день (то есть в период через три дня после введения до следующего дня) и 5-й день (то есть в период через пять дней после введения до следующего дня).The humanized anti-PTHrP antibody was administered in an amount of 5 mg / 0.5 ml / kg into the tail vein of all test rats suffering from hypercalcemia (HHM rats). The control group of rats was similarly injected with saline. In addition, saline was injected into the tail vein of normal rats. The amount of food eaten by the rats that were injected with the antibody, control rats and normal rats was determined on the 0th day (i.e., the day preceding the administration of the antibody), 1st day (i.e., from the day of administration to the next day), 3 day (that is, in the period three days after administration until the next day) and 5th day (that is, in the period five days after administration until the next day).

В результате этого эксперимента было установлено, что до введения антитела количество корма, съеденного крысами с симптомами гиперкальциемии (5-9 крыс), составляло в среднем 8,11 г, в то время как нормальные крысы съедали в среднем 12,06 г, что свидетельствует о явном сокращении количества потребляемого корма испытуемыми крысами, страдающими гиперкальциемией. Когда испытуемым крысам вводили очеловеченное антитело против PTHrP, то в день введения антитела и в последующие дни у них повышалось потребление корма до уровня, характерного для нормальных крыс, в то время как у контрольных крыс практически не наблюдалось изменения в потреблении количества корма. Эти результаты позволяют предположить, что очеловеченное антитело против PTHrP по настоящему изобретению эффективно для улучшения сниженного аппетита у животных с симптомами гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью (таблица 6).As a result of this experiment, it was found that before administration of the antibody, the amount of food eaten by rats with symptoms of hypercalcemia (5-9 rats) averaged 8.11 g, while normal rats ate 12.06 g on average, which indicates a clear reduction in the amount of food consumed by test rats suffering from hypercalcemia. When a humanized anti-PTHrP antibody was administered to test rats, on the day of administration of the antibody and on the following days, their food intake increased to the level typical of normal rats, while the control rats showed practically no change in the amount of food consumed. These results suggest that the humanized anti-PTHrP antibody of the present invention is effective in improving decreased appetite in animals with symptoms of hypercalcemia due to a malignant tumor (Table 6).

Таблица 6Table 6 Воздействие на потребление кормаImpact on feed intake ЖивотноеAnimal № крысыRat number Введение *Introduction * Количество корма, съеденного одной крысой (г)The amount of food eaten by one rat (g) 0-й деньDay 0 1-й день1st day 3-й день3rd day 5-й день5th day Нормальная крысаNormal rat 1one Физиологический растворSaline 13,713.7 16,716.7 18,6318.63 18,7118.71   22 Физиологический растворSaline 14,2714.27 15,315.3 19,5519.55 19,3919.39 33 Физиологический растворSaline 9,839.83 15,515,5 20,7220.72 19,8819.88 4four Физиологический растворSaline 10,4210.42 15,0415.04 20,2820.28 22,0322.03 Крыса ННМRat nnm 55 Физиологический растворSaline 10,7710.77 14,2414.24 12,6612.66 11,8211.82 66 Физиологический растворSaline 6,996.99 8,928.92 2,592.59 14,814.8 Крыса ННМRat nnm 77 Антитело против PTHrPAntibody against PTHrP 7,467.46 17,6517.65 22,5222.52 17,9917,99 88 Антитело против PTHrPAntibody against PTHrP 12,0012.00 12,3812.38 20,9420.94 32,132.1 99 Антитело против PTHrPAntibody against PTHrP 3,353.35 16,6516.65 20,3620.36 21,8921.89 * Введение физиологического раствора: 0,5 мл/г в хвостовую вену. Введение антитела против PTHrP: 5 мг/0,5 мл/г в хвостовую вену.* The introduction of saline: 0.5 ml / g in the tail vein. Introduction of anti-PTHrP antibody: 5 mg / 0.5 ml / g into the tail vein.

Приведенные выше результаты показывают, что химерные антитела и очеловеченные антитела по настоящему изобретению являются полезными средствами воздействия на положительную динамику различных клинических симптомов гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью.The above results show that the chimeric antibodies and humanized antibodies of the present invention are useful agents for influencing the positive dynamics of various clinical symptoms of hypercalcemia due to a malignant tumor.

5. Улучшение показателя рН крови, сниженного вследствие гиперкальциемии5. Improvement in blood pH decreased due to hypercalcemia

Испытуемым животным прививали злокачественную опухоль легкого человека LC-6, вызывали у них гиперкальциемию, обусловленную злокачественной опухолью, и готовили к эксперименту в соответствии с процедурой, описанной на стадии 2. Крыс распределяли по группам с учетом средней концентрации кальция в крови и массы тела.The test animals were inoculated with a malignant tumor of the human lung LC-6, they caused hypercalcemia caused by a malignant tumor, and were prepared for the experiment in accordance with the procedure described in stage 2. Rats were divided into groups taking into account the average concentration of calcium in the blood and body weight.

(1) Определение показателя рН крови(1) Determination of blood pH

У всех испытуемых животных брали кровь с помощью обработанного гепарином шприца для инъекций по методу взятия проб крови из сердца и анализировали полученные пробы крови в автоматическом анализаторе 643 Са++/рН (CIBA-CORNING) с целью определения показателя рН.Blood was drawn from all test animals using a heparin-injected syringe according to the method of taking blood samples from the heart and the obtained blood samples were analyzed in a 643 Ca ++ / pH automated analyzer (CIBA-CORNING) to determine the pH value.

(2) Введение антитела(2) Introduction of antibodies

Очеловеченное антитело против PTHrP вводили в количестве 5 мг/0,5 мл/кг в хвостовую вену всем испытуемым крысам, страдающим гиперкальциемией (крысы ННМ) (n=3). Контрольным крысам в хвостовую вену аналогичным образом вводили физиологический раствор (n=2). Показатель рН крови у крыс, которым вводили антитело, и у контрольных крыс определяли на 0-й день (то есть день введения), 1-й и 7-й день. Результаты приведены в виде среднего значения показателей рН.The humanized anti-PTHrP antibody was administered in an amount of 5 mg / 0.5 ml / kg into the tail vein of all test rats suffering from hypercalcemia (HMN rats) (n = 3). Control rats were similarly injected with saline (n = 2) in the tail vein. The pH of the blood in rats that were injected with the antibody, and in control rats was determined on the 0th day (that is, the day of administration), the 1st and 7th day. The results are shown as average pH values.

Полученные результаты показывают, что до введения антитела показатель рН крови у испытуемых крыс с симптомами гиперкальциемии был равен примерно 7,49 (в то время как у нормальных крыс указанный показатель был равен 7,40±0,02); это, по-видимому, свидетельствует о том, что у испытуемых крыс имел место метаболический алкалоз. Когда испытуемым крысам вводили очеловеченное антитело против PTHrP по настоящему изобретению, у них происходило восстановление рН почти до значения, характерного для нормальных крыс, через семь дней после введения антитела, в то время как у контрольных крыс практически не наблюдалось какого-либо изменения рН крови. Известно, что алкалоз является одним из клинических симптомов гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью, и возникает в результате ингибирования экскреции бикарбонат-иона (НСО3 -) в почках. Поскольку введение очеловеченного антитела против PTHrP по настоящему изобретению нормализуют рН крови у испытуемых животных с симптомами гиперкальциемии, можно предположить, что данное антитело способно восстанавливать метаболический алкалоз, возникающий вследствие гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью.The results show that prior to administration of the antibody, the blood pH in the test rats with symptoms of hypercalcemia was approximately 7.49 (while in normal rats, the indicated value was 7.40 ± 0.02); this, apparently, indicates that the tested rats had metabolic alkalosis. When the humanized anti-PTHrP antibody of the present invention was administered to the test rats, the pH was restored to almost the value typical of normal rats seven days after the administration of the antibody, while the control rats showed almost no change in blood pH. It is known that alkalosis is one of the clinical symptoms of hypercalcemia due to a malignant tumor, and arises as a result of inhibition of the excretion of bicarbonate ion (HCO 3 - ) in the kidneys. Since the administration of the humanized anti-PTHrP antibody of the present invention normalizes the blood pH in test animals with symptoms of hypercalcemia, it can be assumed that this antibody is able to restore metabolic alkalosis resulting from hypercalcemia due to malignant tumor.

Приведенные выше результаты показывают, что химерные антитела и очеловеченные антитела по настоящему изобретению являются полезными средствами воздействия на положительную динамику различных клинических симптомов гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью.The above results show that the chimeric antibodies and humanized antibodies of the present invention are useful agents for influencing the positive dynamics of various clinical symptoms of hypercalcemia due to a malignant tumor.

Промышленная применимостьIndustrial applicability

Настоящее изобретение относится к получению химерного антитела и очеловеченного антитела против PTHrP. Эти антитела характеризуются низкой антигенностью в отношении человека и поэтому являются полезными средствами для лечения гиперкальциемии, гипофосфатемии и подобных заболеваний.The present invention relates to the production of a chimeric antibody and a humanized anti-PTHrP antibody. These antibodies are characterized by low antigenicity against humans and therefore are useful in the treatment of hypercalcemia, hypophosphatemia and similar diseases.

Claims (6)

1. Средство для профилактики или улучшения, по меньшей мере, одного из симптомов или состояний, включающих потерю веса, снижение приема пищи, анорексию, обусловленные злокачественной опухолью, содержащее в качестве активного ингредиента антитело против белка, родственного паратиреоидному гормону человека (PTHrP).1. An agent for the prevention or improvement of at least one of the symptoms or conditions, including weight loss, reduced food intake, anorexia due to a malignant tumor, containing as an active ingredient an antibody against a protein related to human parathyroid hormone (PTHrP). 2. Средство по п.1, содержащее антитело против PTHrP человека.2. The tool according to claim 1, containing an antibody against human PTHrP. 3. Средство по п.2, где антитело является человеческим, гуманизированным или химерным антителом.3. The tool according to claim 2, where the antibody is a human, humanized or chimeric antibody. 4. Средство по любому из пп.1-3, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из злокачественных опухолей поджелудочной железы, легкого, глотки, гортани, языка, десны, пищевода, желудка, желчных протоков, молочной железы, почки, мочевого пузыря, матки и предстательной железы и злокачественной лимфомы.4. The tool according to any one of claims 1 to 3, where the malignant tumor is selected from the group consisting of malignant tumors of the pancreas, lung, pharynx, larynx, tongue, gum, esophagus, stomach, bile ducts, breast, kidney, bladder , uterus and prostate and malignant lymphoma. 5. Средство по любому из пп.1-4, содержащее химерное антитело против белка, родственного паратиреоидному гормону человека (PTHrP), которое включает химерную L-цепь, содержащую С-область L-цепи антитела человека и V-область L-цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:45, и химерную Н-цепь, содержащую С-область Н-цепи антитела человека и V-область Н-цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:46.5. The tool according to any one of claims 1 to 4, containing a chimeric antibody against a protein related to human parathyroid hormone (PTHrP), which includes a chimeric L chain containing the C region of the L chain of a human antibody and the V region of the L chain, containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45, and a chimeric H chain containing the C region of the H chain of a human antibody and the V region of the H chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46. 6. Средство по любому из пп.1-4, содержащее гуманизированное антитело №323-57-137-1.6. The tool according to any one of claims 1 to 4, containing a humanized antibody No. 323-57-137-1.
RU2002124875/13A 1996-09-26 2002-09-18 Antibodies raised against protein related to human parathyroid hormone RU2322453C2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8/255196 1996-09-26
JP25519696 1996-09-26
JP9/214168 1997-07-24

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU99108713/13A Division RU2198220C2 (en) 1996-09-26 1997-09-24 Antibody raised against protein relative to human parathyroid hormone, dna-vector, method of preparing and antibody using

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2002124875A RU2002124875A (en) 2004-04-20
RU2322453C2 true RU2322453C2 (en) 2008-04-20

Family

ID=17275369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2002124875/13A RU2322453C2 (en) 1996-09-26 2002-09-18 Antibodies raised against protein related to human parathyroid hormone

Country Status (5)

Country Link
KR (1) KR100571060B1 (en)
CN (1) CN1817906B (en)
RU (1) RU2322453C2 (en)
UA (1) UA75318C2 (en)
ZA (1) ZA978590B (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012092374A2 (en) * 2010-12-31 2012-07-05 Short Jay M Express humanization of antibodies

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04228089A (en) * 1990-05-15 1992-08-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Agent for treatment and prevention of hypercalcemia
DK0813423T3 (en) * 1995-01-23 2002-07-22 Xenotech Inc Preparation for the prevention of osteolysis and metastasis

Also Published As

Publication number Publication date
CN1817906A (en) 2006-08-16
UA75318C2 (en) 2006-04-17
CN1817906B (en) 2011-08-10
KR20000048691A (en) 2000-07-25
ZA978590B (en) 1998-03-26
KR100571060B1 (en) 2006-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7358355B2 (en) Antibodies against human parathyroid hormone related protein
JP4516711B2 (en) Stable antibody composition and injection preparation
EP1004313A1 (en) Cachexia remedy
US20100297008A1 (en) Ganglioside associated recombinant antibodies and the use thereof in the diagnosis and treatment of tumors
EP1090643A1 (en) Remedies for hypercalcemic crisis
JP4372240B2 (en) Cachexia treatment
KR20110005887A (en) Humanized antibodies specific for amino acid sequence rgd of an extracellular matrix protein and the uses thereof
JPH1192500A (en) Antibody to human parathyroid hormone-related peptide
RU2322453C2 (en) Antibodies raised against protein related to human parathyroid hormone
JP4078164B2 (en) Antibodies against human parathyroid hormone related peptides
US7655227B1 (en) Agents for ameliorating low vasopressin level
EP1197225A1 (en) REMEDIES FOR DISEASES CAUSED BY PTH OR PTHrP
EP1312378A1 (en) Agents for ameliorating symptoms caused by joint diseases
AU3824702A (en) Antibody against human parathormone related peptides
AU2003203622B2 (en) Cachexia remedy
PL190351B1 (en) Antibodies against human protein being affiliated to parathyroid hormone
JP2006306895A (en) Therapeutic agent for cachexia
EP1195164A1 (en) Remedies for drug-resistant hypercalcemia
JP2005320353A (en) Therapeutic agent for hypercalcemia crisis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20080925