RU2285537C1 - Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors - Google Patents
Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors Download PDFInfo
- Publication number
- RU2285537C1 RU2285537C1 RU2005109541/15A RU2005109541A RU2285537C1 RU 2285537 C1 RU2285537 C1 RU 2285537C1 RU 2005109541/15 A RU2005109541/15 A RU 2005109541/15A RU 2005109541 A RU2005109541 A RU 2005109541A RU 2285537 C1 RU2285537 C1 RU 2285537C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- afp
- conjugate
- antitumor
- preparation
- hormone
- Prior art date
Links
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims abstract description 14
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims abstract description 18
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims abstract description 11
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims abstract description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 5
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 13
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 4
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 claims description 3
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 3
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 229930188550 carminomycin Natural products 0.000 claims description 3
- XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N carminomycin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N 0.000 claims description 3
- XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N carminomycin I Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229950001725 carubicin Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 claims description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 3
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 3
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 claims description 3
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 claims description 3
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 3
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 abstract 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N vinblastine Chemical compound C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100012844 Homo sapiens AFP gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGGMYCMLYOUNGM-UHFFFAOYSA-N (-)-fumagillin Natural products O1C(CC=C(C)C)C1(C)C1C(OC)C(OC(=O)C=CC=CC=CC=CC(O)=O)CCC21CO2 NGGMYCMLYOUNGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LGZKGOGODCLQHG-CYBMUJFWSA-N 5-[(2r)-2-hydroxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethyl]-2-methoxyphenol Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1C[C@@H](O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 LGZKGOGODCLQHG-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150055123 afp gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- LGZKGOGODCLQHG-UHFFFAOYSA-N combretastatin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1CC(O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 LGZKGOGODCLQHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N fumagillin Chemical compound C([C@H]([C@H]([C@@H]1[C@]2(C)[C@H](O2)CC=C(C)C)OC)OC(=O)\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O)C[C@@]21CO2 NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N 0.000 description 1
- 229960000936 fumagillin Drugs 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229950008959 marimastat Drugs 0.000 description 1
- OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N marimastat Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)[C@H](O)C(=O)NO OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 nickel cations Chemical class 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005617 polyoxidonium Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 229950003608 prinomastat Drugs 0.000 description 1
- YKPYIPVDTNNYCN-INIZCTEOSA-N prinomastat Chemical compound ONC(=O)[C@H]1C(C)(C)SCCN1S(=O)(=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=NC=C1 YKPYIPVDTNNYCN-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000031539 regulation of cell division Effects 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области биофармакологии и медицины и может быть использовано для приготовления противоопухолевых препаратов и терапии злокачественных новообразований.The present invention relates to the field of biopharmacology and medicine and can be used for the preparation of antitumor drugs and the treatment of malignant neoplasms.
Изучение строения, функции и путей использования альфа-фетопротеина (АФП) имеет свою предысторию и подробно описано в статье Г.И.Абелева ("25 лет изучения α-фетопротеина", Онтогенез, 1989, т.20, №6, стр.607-615). В последние годы получено много новых данных, свидетельствующих о перспективности дальнейшего исследования этого белка.The study of the structure, function and ways of using alpha-fetoprotein (AFP) has its own history and is described in detail in the article by G.I. Abelev ("25 years of the study of α-fetoprotein", Ontogenesis, 1989, v.20, No. 6, p. 607 -615). In recent years, a lot of new data has been obtained that testify to the prospect of further research on this protein.
Альфа-фетопротеин представляет собой крупный гликопротеин (70 кДа), состоящий из одной полипептидной цепи, и является одним из основных циркулирующих белков, обнаруживаемых у млекопитающих и других позвоночных в процессе развития эмбриона и плода. Ген АФП вместе с другими генами семейства альбумина расположен в регионе 4q11-q22 4-й хромосомы [1]. Он считается онкофетальным маркером, поскольку секретируется различными опухолями, включая гепатоклеточную карциному и тератому. Установлено также, что изменения уровня АФП во время беременности могут вызывать нарушения развития плода, включая синдром Дауна и расщепление позвоночника [2]. Обнаружено, что АФП выполняет многие важные биологические функции, главная из которых - транспортная. Известно, что АФП обладает высоким сродством к жирным кислотам, содержит сайт высокоаффинного связывания билирубина и эффективно связывает катионы меди и никеля [3]. Установлено также, что этот белок принимает участие в регуляции метаболизма и деления клеток, а также взаимодействия макрофагов с Т-лимфоцитами. В пользу последнего утверждения говорят данные о роли АФП в подавлении иммунного ответа организма матери на развивающийся эмбрион [4].Alpha-fetoprotein is a large glycoprotein (70 kDa), consisting of one polypeptide chain, and is one of the main circulating proteins found in mammals and other vertebrates during the development of the embryo and fetus. The AFP gene, together with other genes of the albumin family, is located in the region 4q11-q22 of the 4th chromosome [1]. It is considered an oncofetal marker because it is secreted by various tumors, including hepatocellular carcinoma and teratoma. It was also established that changes in the AFP level during pregnancy can cause fetal development disorders, including Down syndrome and spinal cleavage [2]. It was found that AFP performs many important biological functions, the main of which is transport. AFP is known to have a high affinity for fatty acids, contains a high affinity bilirubin binding site, and effectively binds copper and nickel cations [3]. It was also established that this protein takes part in the regulation of metabolism and cell division, as well as the interaction of macrophages with T-lymphocytes. The last statement is supported by data on the role of AFP in suppressing the maternal immune response to a developing embryo [4].
Считается, что АФП состоит из одной полипептидной цепи размером в 590 аминокислотных остатков, подразделенной на три домена, именуемых домен 1, домен 2 и домен 3. Каждый домен состоит примерно из 195 аминокислот, и в них располагаются 4, 5 и 6 дисульфидных связей соответственно [5].It is believed that AFP consists of one polypeptide chain of 590 amino acid residues in size, subdivided into three domains, referred to as
Патентные исследования показали, что на основе АФП разработаны препараты и способы их получения из природных источников путем выделения и очистки (патент РФ 2121350, 1998 г., патент РФ 2123009, 1998 г., патент РФ 2154468, 2000 г.), способы лечения с помощью таких препаратов (патент РФ 2105567,1998 г.).Patent studies have shown that on the basis of AFP, drugs and methods for their preparation from natural sources by isolation and purification have been developed (RF patent 2121350, 1998, RF patent 2123009, 1998, RF patent 2154468, 2000), methods of treatment with using such drugs (RF patent 2105567.1998).
Для использования в терапевтических целях необходимы большие количества белка, которые весьма трудно обеспечить его выделением из природных источников. Актуальной задачей для обеспечения необходимых количеств АФП является привлечение методов генной инженерии и биотехнологии. Однако получение рекомбинантного АФП осложнено рядом его особенностей. Во-первых, это крупный, гликозилированный белок, обеспечение нативной конформации которого в клетках штаммов-продуцентов является подчас неразрешимой задачей. Кроме того, образующийся в ходе трансляции в клетках штамма-продуцента денатурированный АФП содержит большое количество свободных тиольных групп. Поэтому в процессе ренатурации белка возможно образование как межмолекулярных, так и внутримолекулярных дисульфидных связей. Образование межмолеклярных связей приводит к большим потерям белка в результате образования его крупных конгломератов и выпадения в осадок. Положение внутримолекулярных связей, образующихся в ходе ренатурации рекомбинантного белка, часто отличается от такового в природном АФП. Поскольку корректное образование дисульфидных связей является необходимым фактором для формирования нативной третичной структуры белка, нарушения порядка формирования этих связей в рекомбинантном белке обусловливают конформационную гетерогенность препарата и приводят к потере его активности.For therapeutic use, large quantities of protein are necessary, which are very difficult to ensure its isolation from natural sources. An urgent task to ensure the necessary amounts of AFP is the use of genetic engineering and biotechnology methods. However, obtaining recombinant AFP is complicated by a number of its features. Firstly, it is a large, glycosylated protein, the provision of the native conformation of which in the cells of producer strains is sometimes an insoluble task. In addition, the denatured AFP formed during the translation in the cells of the producer strain contains a large number of free thiol groups. Therefore, in the process of protein renaturation, the formation of both intermolecular and intramolecular disulfide bonds is possible. The formation of intermolecular bonds leads to large losses of protein as a result of the formation of its large conglomerates and precipitation. The position of the intramolecular bonds formed during the renaturation of the recombinant protein often differs from that in natural AFP. Since the correct formation of disulfide bonds is a necessary factor for the formation of the native tertiary structure of the protein, violations of the order of formation of these bonds in the recombinant protein determine the conformational heterogeneity of the drug and lead to the loss of its activity.
В значительной мере избежать этих затруднений при получении рекомбинантного АФП позволяет использование генно-инженерных конструкций, обеспечивающих продукцию не целого белка, а его биологически активных пептидных фрагментов. Это позволяет значительно удешевить, упростить процедуру получения препарата и увеличить выход биологически активного белка. Современные разработки, связанные с получением рекомбинантных молекул АФП и его фрагментов, изложенные в публикациях США, заявке 2002031520, 2002 г. и патенте 6627440, 2003 г. являются наиболее близкими аналогами нашего изобретения. Полученные с помощью этих работ генно-инженерным методом фрагменты АФП предназначены для усиления клеточного иммунитета при некоторых онкологических заболеваниях.To a large extent, to avoid these difficulties in obtaining recombinant AFP allows the use of genetic engineering constructs that ensure the production of not a whole protein, but its biologically active peptide fragments. This allows you to significantly reduce the cost, simplify the procedure for obtaining the drug and increase the yield of biologically active protein. Modern developments related to the preparation of recombinant AFP molecules and its fragments described in US publications, application 2002031520, 2002 and patent 6627440, 2003 are the closest analogues of our invention. The AFP fragments obtained using these studies by the genetic engineering method are intended to enhance cellular immunity in some oncological diseases.
Однако известные короткоцепочечные фрагменты АФП не всегда достаточно эффективны и не применялись при гормонзависимых опухолях.However, the known short-chain AFP fragments are not always effective enough and have not been used for hormone-dependent tumors.
Техническим результатом настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, а также расширение арсенала противоопухолевых средств и методов лечения злокачественных заболеваний.The technical result of the present invention is to eliminate these drawbacks, as well as expanding the arsenal of antitumor agents and methods for treating malignant diseases.
Технический результат достигается тем, что разработан противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина человека, представляющий собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.1, имеющий в первичной структуре 237 аминокислотных остатка и молекулярную массу около 27 кДа, способный связываться с рецептором альфа-фетопротеина и ингибировать эстрадиол-индуцированный рост клеток гормонзависимых опухолей, а также выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки цитотоксического препарата в опухолевые клетки. Препарат может быть получен рекомбинантным методом при культивировании клеток Е. coli, трансформированных плазмидным вектором, содержащим кДНК гена третьего домена альфа-фетопротеина человека; полученный пептидный продукт модифицирован добавочным метиониновьм остатком (Met) на N-конце и двумя аминокислотными остатками (Leu-Glu) на С-конце.The technical result is achieved by the development of an antitumor peptide preparation based on a fragment of human alpha-fetoprotein, which is a peptide with the amino acid sequence shown in Fig. 1, having in the primary structure 237 amino acid residues and a molecular weight of about 27 kDa, capable of binding to the alpha receptor β-fetoprotein and inhibit estradiol-induced cell growth of hormone-dependent tumors, and also act as a vector molecule for targeted cytotoxic delivery Skog of the drug into the tumor cells. The preparation can be obtained by the recombinant method by culturing E. coli cells transformed with a plasmid vector containing the cDNA of the gene of the third domain of human alpha-fetoprotein; the resulting peptide product is modified with an additional methionine residue (Met) at the N-terminus and two amino acid residues (Leu-Glu) at the C-terminus.
Другим объектом изобретения является конъюгат пептидного препарата и цитотоксического агента, способный целенаправленно проникать в опухолевую клетку, представляющий собой препарат, охарактеризованный выше, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом в молярном соотношении от 1:1 до 1:10. Конъюгат в качестве цитотоксического агента может содержать вещество, выбранное из группы: паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, дауномицин, карминомицин, винкристин, винбластин, мелфалан, метотрексат, цитарабин. Все названные препараты являются противоопухолевыми или цитотоксическими веществами, не имеющими достаточного избирательного действия в отношении опухолевых клеток. В виде конъюгата с нашим пептидным препаратом эти вещества приобретают исключительную избирательность в отношении злокачественных клеток.Another object of the invention is a conjugate of a peptide preparation and a cytotoxic agent capable of targeted penetration into a tumor cell, which is a preparation described above, covalently linked to a cytotoxic agent in a molar ratio of from 1: 1 to 1:10. The conjugate as a cytotoxic agent may contain a substance selected from the group: paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, daunomycin, carminomycin, vincristine, vinblastine, melphalan, methotrexate, cytarabine. All of these drugs are antitumor or cytotoxic substances that do not have sufficient selective action against tumor cells. In the form of a conjugate with our peptide preparation, these substances acquire exceptional selectivity for malignant cells.
На основе пептидного препарата и конъюгата разработана фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, содержащая противоопухолевый компонент и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, при этом в качестве противоопухолевого компонента композиция содержит разработанный нами пептидный препарат или конъюгат в количестве, достаточном для получения терапевтического эффекта. В качестве носителя для внутривенного введения может быть использован физиологический раствор или фосфатно-солевой раствор, рН 7.4, приготовленный на воде для инъекций.Based on the peptide preparation and the conjugate, a pharmaceutical composition has been developed that has an antitumor effect, containing an antitumor component and a pharmaceutical carrier suitable for intravenous administration, while the composition contains the peptide preparation or conjugate developed by us as an antitumor component in an amount sufficient to obtain a therapeutic effect. As a carrier for intravenous administration, physiological saline or phosphate-saline solution, pH 7.4, prepared in water for injection can be used.
В основе изобретения лежат два новых вещества - разработанный и полученный нами пептидный препарат на основе фрагмента АФП и его конъюгат с цитотоксическим агентом, которые отличаются высокой избирательностью и эффективностью противоопухолевого действия и могут быть получены с помощью технологичных методов генной инженерии и химического синтеза.The invention is based on two new substances - a peptide preparation developed and obtained by us based on an AFP fragment and its conjugate with a cytotoxic agent, which are highly selective and have an antitumor effect and can be obtained using technological methods of genetic engineering and chemical synthesis.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:The invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Конструирование плазмидного вектора и экспрессия рекомбинантного пептидного препарата (фрагмента АФП) в клетках Е. coli.Example 1. Construction of a plasmid vector and expression of a recombinant peptide preparation (AFP fragment) in E. coli cells.
1) Получение кДНК гена АФП человека1) Obtaining human AFP gene cDNA
Тотальную РНК выделяли из клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека линии HepG2, продуцирующей АФП. кДНК гена АФП человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (RTAMV). В качестве затравки использовали праймер на 3'- нетранслируемую область mPHK: 5'-CTTCCCCTGAAGTAAT-3'. Реакцию проводили в 2 этапа: 1) отжиг праймера, 2) синтез кДНК. На первом этапе смесь, составленную из 18 μlH2O, 10 μl 5-кратного буфера (50 mM Трис-HCl, рН 8.3, 50 mM MgCl2, 700 mM KCl), 8 μl смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов dNTP (1.25 mM каждого dNTP), 10 μl раствора мРНК (2 мкг/мл) и 25 μМ праймера, нагревали до 70°С в течение 10 мин, затем постепенно охлаждали до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляли 1 μl ингибитора РНКаз RNазина (40 ед/μl) и 2.5 μl RTAMV (12.5 ед/μd). Конечный объем смеси составил 50 μl. Реакцию проводили при 40°С в течение 2 часов, а затем инактивировали реакционную смесь выдерживанием при 95°С в течение 5 мин. Качество кДНК проверяли методом PCR, используя праймеры на 5'-и 3'-концевые области молекулы ДНК АФП. Полосы амплификации соответствовали ожидаемому размеру 1773 пар оснований (bp).Total RNA was isolated from human hepatocellular carcinoma cells of the HepG2 line producing AFP. The human AFP gene cDNA was synthesized on mRNA using reverse transcriptase of avian myeloblastosis virus (RTAMV). As a seed, a primer was used on the 3'-untranslated region of mPHK: 5'-CTTCCCCTGAAGTAAT-3 '. The reaction was carried out in 2 stages: 1) primer annealing, 2) cDNA synthesis. At the first stage, a mixture composed of 18 μlH 2 O, 10 μl 5-fold buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM MgCl 2 , 700 mM KCl), 8 μl mixture of four dNTP deoxynucleotide triphosphates (1.25 mM of each dNTP) 10 μl of mRNA solution (2 μg / ml) and 25 μM primer were heated to 70 ° C for 10 min, then gradually cooled to room temperature. To the reaction mixture were added 1 μl RNase inhibitor RNazine (40 units / μl) and 2.5 μl RTAMV (12.5 units / μd). The final volume of the mixture was 50 μl. The reaction was carried out at 40 ° C for 2 hours, and then the reaction mixture was inactivated by keeping it at 95 ° C for 5 minutes. The quality of the cDNA was checked by PCR using primers at the 5'- and 3'-terminal regions of the AFP DNA molecule. The amplification bands corresponded to the expected size of 1773 base pairs (bp).
2) Конструирование экспрессионного вектора.2) Construction of an expression vector.
Предварительно на основе последовательности мРНК АФП человека с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности АФП для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции. По результатам анализа этих данных были подобраны и синтезированы праймеры для амплификации фрагмента ДНК АФП, соответствующего третьему домену белковой молекулы (с 357 по 590 аминокислоту). Прямой праймер 5'ttttCCATGGGATACCAGGAGTTATTG 3' содержит сайт для Ncol рестриктазы. Обратный праймер 5' ttttCTCGAGAACTCCCAAAGCAGCAC 3' содержит сайт для Xhol рестриктазы. Очищенный методом электрофореза в 1.2% агарозном геле с последующей экстракцией фрагмент ДНК встроили в вектор рЕТ28а(+) (Novagene) по сайтам рестрикции Ncol и Xhol. Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить пептид AFP28D3, который по аминокислотной последовательности соответствует третьему домену молекулы АФП с добавочным метионином (Met) на N-конце и несколькими аминокислотами на С-конце (Leu-Glu-His-His-His-His-His-His). Шесть концевых гистидинов необходимы для выделения белка методом хелатной хроматографии. Размер нового пептида составляет 237 аминокислотных остатков или примерно 27 кДа. Клонирование проводили методом кальциевой трансформации компетентных клеток DH5a штамма E.coli с селекцией на чашках Петри с агаризованной питательной средой LB, содержащей канамицин. Отбор колоний с генной конструкцией проводили методом полимеразной цепной реакции с помощью стандартных векторных праймеров T7prom и T7ter по длине продуктов амплификации. Отобранные колонии наращивали в LB с канамицином, и из клеточной массы выделяли экспрессионные плазмиды для секвенирования. По результатам секвенирования (отсутствие ошибок амплификации) для дальнейшей работы была выбрана плазмида pAFP28D3.Preliminarily, based on the human AFP mRNA sequence, using the DNA-SUN computer program, a restriction map of the AFP DNA sequence was obtained to determine the missing and unique restriction sites. Based on the analysis of these data, primers were selected and synthesized for amplification of the AFP DNA fragment corresponding to the third domain of the protein molecule (from 357 to 590 amino acids). Direct primer 5'ttttCCATGGGATACCAGGAGTTATTG 3 'contains a site for Ncol restriction enzyme. Reverse primer 5 'ttttCTCGAGAACTCCCAAAGCAGCAC 3' contains a site for Xhol restrictase. The DNA fragment purified by electrophoresis in 1.2% agarose gel followed by extraction was inserted into the pET28a (+) vector (Novagene) at the Ncol and Xhol restriction sites. This gene construction allows translation to produce the AFP28D3 peptide, which according to the amino acid sequence corresponds to the third domain of the AFP molecule with additional methionine (Met) at the N-terminus and several amino acids at the C-terminus (Leu-Glu-His-His-His-His-His-His-His -His). Six terminal histidines are required for protein isolation by chelating chromatography. The size of the new peptide is 237 amino acid residues or approximately 27 kDa. Cloning was carried out by the method of calcium transformation of competent cells of DH5a strain E. coli with selection on Petri dishes with agarized nutrient medium LB containing kanamycin. Colonies with a gene construct were selected by polymerase chain reaction using standard vector primers T7prom and T7ter along the length of amplification products. Selected colonies were grown in LB with kanamycin, and expression plasmids were isolated from the cell mass for sequencing. Based on the results of sequencing (no amplification errors), plasmid pAFP28D3 was selected for further work.
3) Экспрессия рекомбинантного пептидного фрагмента АФП в E.coli.3) Expression of a recombinant peptide fragment of AFP in E. coli.
Экспрессирующий штамм E.coli BL21(DE3) трансфецировали плазмидой pAFP28D3. Ночную культуру бактериальных клеток разводили в 50 раз в среде LB, содержащей канамицин (30 мкг/мл), и наращивали клетки при 37°С до уровня мутности культуральной среды 0.6-0.8. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации 0.4 мМ и инкубировали клеточную суспензию 3 часа при интенсивном перемешивании. Клеточные осадки собирали центрифугированием и хранили при -30°С.The expression strain of E. coli BL21 (DE3) was transfected with plasmid pAFP28D3. The overnight culture of bacterial cells was diluted 50 times in LB medium containing kanamycin (30 μg / ml), and cells were grown at 37 ° C to a turbidity level of the culture medium of 0.6-0.8. Then IPTG was added to a final concentration of 0.4 mM and the cell suspension was incubated for 3 hours with vigorous stirring. Cell pellets were collected by centrifugation and stored at -30 ° C.
Пример 2. Выделение конечного продукта (пептидного препарата) из штамма-продуцента Е.coli.Example 2. Isolation of the final product (peptide preparation) from the producer strain E. coli.
1) Приготовление буферных растворов1) Preparation of buffer solutions
Готовили растворы A, B, C, D, E. F:Prepared solutions A, B, C, D, E. F:
А: 0.1 М трис-HCl буфер, 6 М гуанидинхлорид, рН 8,0.A: 0.1 M Tris-HCl buffer, 6 M guanidine chloride, pH 8.0.
В: 0.02 М Трис-HCl. 0.3 М NaCl, рН 8.0.B: 0.02 M Tris-HCl. 0.3 M NaCl, pH 8.0.
С: 0.05 М трис-HCl буфер, 6 М мочевины, 0.4 М NaCl и 0.02 М имидазола, рН 8.0.C: 0.05 M Tris-HCl buffer, 6 M urea, 0.4 M NaCl and 0.02 M imidazole, pH 8.0.
D: 0.05 М трис-HCl буфер, 6 М мочевины, 0.4 М NaCl и 0.3 М имидазола, рН 8.0.D: 0.05 M Tris-HCl buffer, 6 M urea, 0.4 M NaCl and 0.3 M imidazole, pH 8.0.
E: 0.1 М трис-HCl буфер, 0.5 М NaCl и 2 мМ ЭДТА, рН 8.0.E: 0.1 M Tris-HCl buffer, 0.5 M NaCl and 2 mM EDTA, pH 8.0.
F: 0.01 М трис-HCl буфер, 0.15 М NaCl, рН 8.0.F: 0.01 M Tris-HCl buffer, 0.15 M NaCl, pH 8.0.
2) Выделение пептидного препарата АФП (рер-АФП) из биомассы.2) Isolation of the peptide preparation AFP (re-AFP) from biomass.
К биомассе из 600 мл культуральной среды добавляли 3 мл буфера В с 2 мМ PMSF. Суспензию обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе High Intensity Ultrasonic Processor 750 Watt Series при 0°С. Суспензию центрифугировали 10 мин (12000 g, 4°C). Супернатант отбрасывали, осадки суспендировали в 5 мл буфера В и центрифугировали при указанных выше условиях. Промывку осадка повторяли 5 раз. К отмытому осадку телец включения добавляли 4 мл буфера А, обрабатывали ультразвуком для растворения белка и центрифугировали 30 мин (12000 g, 4°С). Супернатант наносили на колонку (диаметр 0,5 см) с 1 мл иминодиацетат-сефарозы Chelating Sepharose CL-6B, насыщенной ионами никеля (2+) и промытой 2 мл буфера А. Сорбент последовательно промывали 10 мл буфера А и 10 мл буфера С. Белок элюировали 6 мл буфера D. К элюату добавляли 42 мкл β-меркаптоэтанола (до конечной концентрации 0,1 М) и раствор перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Раствор восстановленного белка выливали при перемешивании в 60 мл холодного (4°С) буфера Е. Через 48 ч белок диализировали сначала против 3 л буфера Е (48 ч, 4°С), затем против 3 л буфера F (24 ч, 4°С). Диализат концентрировали на ячейке Amicon (мембрана РМ-10) до 400 мкл, концентрат фракционировали на колонке Superdex™ 200 10/30, элюируя буфером F со скоростью протока 0,5 мл/мин и детекцией при 280 нм. Выделяют две фракции - димер (фракция I) и мономер (фракция II). Профиль элюции суммарного белка приведен на фиг.2 (I - димер, II - мономер). Как видно на фигуре, эффективность получения мономера II достигает 40% от суммарного белка. Концентрацию белка определяли по методу ВСА (ВСА-набор Sigma), выход - 3 мг. Проводили электрофорез выделенных фракций белка в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях в 13%-ном полиакриламидном геле по Лэммли. Целевую фракцию II концентрировали на ячейке Amicon (мембрана РМ-10) до 1,5 мл.To a biomass of 600 ml of culture medium, 3 ml of buffer B with 2 mM PMSF was added. The suspension was sonicated on a High Intensity Ultrasonic Processor 750 Watt Series disintegrator at 0 ° C. The suspension was centrifuged for 10 min (12000 g, 4 ° C). The supernatant was discarded, the pellets were suspended in 5 ml of buffer B and centrifuged under the above conditions. The washing of the precipitate was repeated 5 times. To the washed precipitate of inclusion bodies, 4 ml of buffer A was added, sonicated to dissolve the protein, and centrifuged for 30 min (12000 g, 4 ° C). The supernatant was applied to a column (0.5 cm diameter) with 1 ml of Chelating Sepharose CL-6B iminodiacetate-sepharose saturated with nickel ions (2 + ) and washed with 2 ml of buffer A. The sorbent was washed successively with 10 ml of buffer A and 10 ml of buffer C. Protein was suirable 6 ml of buffer D. To the eluate was added 42 μl of β-mercaptoethanol (to a final concentration of 0.1 M) and the solution was stirred for 1 h at room temperature. The solution of the recovered protein was poured with stirring into 60 ml of cold (4 ° C) buffer E. After 48 hours, the protein was dialyzed first against 3 L of buffer E (48 h, 4 ° C), then against 3 L of buffer F (24 h, 4 ° FROM). The dialysate was concentrated on an Amicon cell (PM-10 membrane) to 400 μl, the concentrate was fractionated on a Superdex ™ 200 10/30 column, eluting with buffer F at a flow rate of 0.5 ml / min and detection at 280 nm. Two fractions are distinguished - a dimer (fraction I) and a monomer (fraction II). The elution profile of the total protein is shown in figure 2 (I - dimer, II - monomer). As can be seen in the figure, the efficiency of obtaining monomer II reaches 40% of total protein. Protein concentration was determined by the BCA method (BCA Sigma kit), yield 3 mg. Electrophoresis of the isolated protein fractions was performed under reducing and non-reducing conditions in a 13% Laemmli polyacrylamide gel. Target fraction II was concentrated on an Amicon cell (PM-10 membrane) to 1.5 ml.
На фиг.3 представлен электрофорез в 13%-ном ПААГ фракций, соответствующих димеру и мономеру рер-АФП, в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (полосы 1,2- без восстановления; полосы 3-5 с восстановлением β-меркаптоэтанолом; 1,4 - фракция I (димер); 2,5 - фракция II (мономер); 3 - маркеры молекулярной массы).Figure 3 presents the electrophoresis in 13% PAAG fractions corresponding to the dimer and monomer of re-AFP, in reducing and non-reducing conditions (
Пример 3. Анализ связывания и захвата FITC-меченого пептидного препарата (рер-АФП) в опухолевых клетках и лимфоцитах с помощью проточной цитофлуориметрии.Example 3. The analysis of the binding and capture of FITC-labeled peptide preparation (re-AFP) in tumor cells and lymphocytes using flow cytofluorimetry.
1) Получение FITC-меченого производного рер-АФП.1) Obtaining FITC-labeled derivative of re-AFP.
К раствору 1 мг рер-АФП в 1 мл 0,1 М бикарбоната натрия, рН 8,5, добавляли 6,5 мкл (4-кратный молярный избыток) раствора FITC (флуоресцеин-изотиоцианат) в ДМСО (10 мг/мл). Реакцию проводили в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре, затем 18 ч при +4°С, после чего наносили на колонку (1х30 см) с сефадексом G-25, уравновешенную PBS, рН 7,4, и элюировали указанным буфером при скорости протока 1 мл/мин и детекции при 280 нм. Собирали белковую фракцию в свободном объеме, концентрировали до 1 мл. Концентрацию белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты, концентрацию FITC - по поглощению в области 498 нм. Молярное соотношение FITC- пептид составило 1,4:1.To a solution of 1 mg of re-AFP in 1 ml of 0.1 M sodium bicarbonate, pH 8.5, 6.5 μl (4-fold molar excess) of a solution of FITC (fluorescein-isothiocyanate) in DMSO (10 mg / ml) was added. The reaction was carried out in the dark for 1 h at room temperature, then 18 h at + 4 ° С, after which it was applied to a Sephadex G-25 column (1x30 cm), equilibrated with PBS, pH 7.4, and eluted with the indicated buffer at a
2) Анализ связывания и захвата FITC-меченого рер-АФП в опухолевых клетках и лимфоцитах с помощью проточной цитофлуориметрии.2) Analysis of the binding and capture of FITC-labeled pp-AFP in tumor cells and lymphocytes using flow cytometry.
Клетки аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 и аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 культивировали в пластиковых флаконах (Coming-Costar) в среде DMEM (ICN), содержащей 10% FBS (фирма Gibco) и 50 мкг/мл гентамицина (ICN) в CO2-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Лимфоциты периферической крови здоровых добровольцев выделяли с помощью центрифугирования крови через градиент раствора фиколл-пак по методу Boyum [(Boyum A., llin. Invest. 21: 9-18, 1968]. Клетки рассевали в 6-луночные планшеты за сутки до эксперимента. Перед началом эксперимента клетки инкубировали 2 часа в среде DMEM без FBS. Для анализа связывания рер-АФП-FITC в диапазоне концентраций 30-4000 нм добавляли к суспензии клеток и инкубировали при 4°С в течение 1 часа. При исследовании эндоцитоза инкубацию проводили при 37°С. После окончания инкубации клетки трижды отмывали холодным PBS и фиксировали с помощью 2% параформальдегида. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре EPICS-XL. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер (λ488 нм, полоса пропускания 520 нм). В каждом образце (105 клеток) определяли среднее значение интенсивности флуоресценции и процент клеток, флуоресценция которых превышала аутофлуоресценцию. Специфичность связывания рер-АФП-FITC с рецептором АФП определяли путем инкубации клеток с рер-АФП-FITC в присутствии 30-кратного избытка АФП.MCF-7 mammary adenocarcinoma cells and SKOV3 human ovarian adenocarcinoma cells were cultured in plastic bottles (Coming-Costar) in DMEM medium (ICN) containing 10% FBS (Gibco) and 50 μg / ml gentamicin (ICN) in CO 2 incubator at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 . The peripheral blood lymphocytes of healthy volunteers were isolated by centrifugation of blood through a ficoll-pack solution gradient according to the Boyum method [(Boyum A., llin. Invest. 21: 9-18, 1968]. Cells were scattered into 6-well plates the day before the experiment. Before the start of the experiment, the cells were incubated for 2 hours in DMEM without FBS. For analysis of the binding of peR-AFP-FITC in the concentration range of 30-4000 nm was added to the cell suspension and incubated at 4 ° C for 1 hour. In the study of endocytosis, incubation was carried out at 37 ° C. After the end of the incubation, the cells were washed three times ali cold PBS and fixed with 2% paraformaldehyde. The fluorescence intensity was measured by a flow cytometer EPICS-XL. For the excitation of fluorescence using an argon laser (λ488 nm, bandwidth 520 nm). Each sample (10 5 cells) was determined by mean fluorescence intensity and the percentage of cells whose fluorescence exceeded autofluorescence. The specificity of the binding of re-AFP-FITC to the AFP receptor was determined by incubating cells with re-AFP-FITC in the presence of a 30-fold excess of AFP.
Было показано, что рер-АФП-FITC связывается с опухолевыми клетками (MCF-7 и SKOV3) в отличие от лимфоцитов периферической крови (фиг.4а). При этом интенсивность флуоресценции клеток, обработанных рер-АФП-FITC до концентрации 1 мкМ, была близка к флуоресценции клеток, обработанных АФП-FITC. Эти исследования показывают избирательность нашего препарата в отношении гормонзависимых опухолей.PeR-AFP-FITC has been shown to bind to tumor cells (MCF-7 and SKOV3) in contrast to peripheral blood lymphocytes (Fig. 4a). At the same time, the fluorescence intensity of cells treated with peR-AFP-FITC to a concentration of 1 μM was close to the fluorescence of cells treated with AFP-FITC. These studies show the selectivity of our drug for hormone-dependent tumors.
Исследование захвата рер-АФП-FITC опухолевыми клетками и лимфоцитами периферической крови человека показало, что опухолевые линии MCF-7 и SKOV3 активно эндоцитируют рер-АФП-FITC (фиг.4б), в отличие от лимфоцитов. В лимфоцитах эндоцитоз рер-АФП-FITC практически отсутствовал. Для исследования специфичности связывания, клетки SKOV3 инкубировали с рер-АФП-FITC с добавлением 30-кратного избытка немеченого АФП в тех же условиях. АФП в значительной степени ингибировал связывание рер-АФП-FITC с клетками (фиг.5). Эти данные подтверждают, что наш препарат (фрагмент рер-АФП) действительно связывается с рецептором АФП на опухолевых клетках и конкурирует с целым белком АФП за сайт связывания.A study of the capture of re-AFP-FITC by tumor cells and lymphocytes of human peripheral blood showed that the tumor lines MCF-7 and SKOV3 actively endocytize re-AFP-FITC (Fig. 4b), in contrast to lymphocytes. In lymphocytes, endocytosis of re-AFP-FITC was practically absent. To investigate binding specificity, SKOV3 cells were incubated with peer-AFP-FITC supplemented with a 30-fold excess of unlabeled AFP under the same conditions. AFP significantly inhibited the binding of peR-AFP-FITC to cells (Fig. 5). These data confirm that our drug (a fragment of peR-AFP) actually binds to the AFP receptor on tumor cells and competes with the whole AFP protein for the binding site.
Пример 4. Исследование гормонзависимой активности нового пептида.Example 4. The study of hormone-dependent activity of a new peptide.
Клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 4×105 клеток/лунку. На следующий день меняли среду на DMEM без фенолового красного с добавлением 5% телячьей сыворотки и инкубировали клетки в стандартных условиях до достижения плотного монослоя (4 суток). Далее к клеткам добавляли гормон 17 β-эстрадиол (E2) в концентрации 10-9 М, рер-АФП и АФП (оба в концентрациях 10-11-10-6 М). Через 3 суток в лунки вносили [3Н]-тимидин (1 мкCi/мл, удельная активность 50 Ci/ммоль) на 2 часа, после чего клетки собирали на фильтры и измеряли радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике RackBeta. Через 72 часа инкубирования для стимуляции пролиферации клеток, ее оценивали по включению [3H]-тимидина в ДНК. Пролиферация составляла в среднем 165% от контроля (контроль - 100%). При одновременном с E2 добавлении к клеткам АФП или рер-АФП в диапазоне концентраций 10-11-10-6 М включение [3H]-тимидина значительно снижалось (117±5.85% для АФП и 120±4.8% для рер-АФП), как показано на фиг.6.MCF-7 cells were seeded in 96-well plates with a density of 4 × 10 5 cells / well. The next day, the medium was changed to DMEM without phenol red with the addition of 5% calf serum and cells were incubated under standard conditions until a dense monolayer was reached (4 days). Next, the hormone 17 β-estradiol (E 2 ) was added to the cells at a concentration of 10 -9 M, pp-AFP and AFP (both at concentrations of 10 -11 -10 -6 M). After 3 days, [ 3 H] -thymidine (1 μCi / ml, specific activity 50 Ci / mmol) was added to the wells for 2 hours, after which the cells were collected on filters and the radioactivity was measured on a RackBeta liquid scintillation counter. After 72 hours of incubation to stimulate cell proliferation, it was evaluated by the incorporation of [ 3 H] -thymidine into DNA. Proliferation averaged 165% of control (control - 100%). With simultaneous addition of E 2 to the cells of AFP or peR-AFP in the concentration range of 10 -11 -10 -6 M, the incorporation of [ 3 H] -thymidine significantly decreased (117 ± 5.85% for AFP and 120 ± 4.8% for re-AFP) as shown in FIG. 6.
Таким образом, рер-АФП ингибирует 17 β-эстрадиол-индуцированный рост гормонзависимой линии клеток MCF-7.Thus, peR-AFP inhibits 17 β-estradiol-induced growth of the hormone-dependent MCF-7 cell line.
Пример 5. Получение конъюгата рер-АФП с паклитакселом.Example 5. Obtaining conjugate re-AFP with paclitaxel.
0.63 мг паклитаксела и 1.2 мг N,N-карбонилдиимидазола смешивали в 20 мкл диметилформамида. Раствор выдерживали 20 мин при 55°С, затем добавляли при перемешивании к 1 мл раствора рер-АФП (2 мг) в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7.4. Реакционную смесь выдерживали в течение ночи при комнатной температуре, затем центрифугировали в течение 5 мин при 13 400 об/мин. Супернатант отделяли и наносили на хроматографическую колонку с носителем Sephadex G-25f, уравновешенную PBS. Фракции, содержащие конъюгат, собирали и концентрировали до конечного объема 1 мл. Для определения молярного соотношения рер-АФП/паклитаксел отдельно определяли концентрацию каждого компонента конъюгата. Концентрацию рер-АФП в конъюгате определяли по методу Лоури. Для определения содержания паклитаксела в конъюгате аликвоту концентрата переносили в 0.2 М раствор ацетата натрия, рН 4.0, и выдерживали 48 ч при комнатной температуре. В данных условиях паклитаксел полностью отделялся от белка и выпадал в осадок. Выпавший паклитаксел экстрагировали хлороформом и высушивали на воздухе. Сухое вещество растворяли в ацетонитриле и проводили количественное определение паклитаксела с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Молярное соотношение рер-АФП/паклитаксел в полученном конъюгате составляло 1:1.0.63 mg of paclitaxel and 1.2 mg of N, N-carbonyldiimidazole were mixed in 20 μl of dimethylformamide. The solution was kept for 20 min at 55 ° C, then added with stirring to 1 ml of solution re-AFP (2 mg) in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4. The reaction mixture was kept overnight at room temperature, then centrifuged for 5 minutes at 13,400 rpm. The supernatant was separated and loaded onto a Sephadex G-25f chromatography column, equilibrated with PBS. Fractions containing conjugate were collected and concentrated to a final volume of 1 ml. To determine the molar ratio of re-AFP / paclitaxel, the concentration of each component of the conjugate was separately determined. The concentration of re-AFP in the conjugate was determined by the Lowry method. To determine the content of paclitaxel in the conjugate, an aliquot of the concentrate was transferred to a 0.2 M sodium acetate solution, pH 4.0, and kept for 48 h at room temperature. Under these conditions, paclitaxel completely separated from the protein and precipitated. The precipitated paclitaxel was extracted with chloroform and dried in air. The dry matter was dissolved in acetonitrile and paclitaxel was quantified using high performance liquid chromatography. The molar ratio of re-AFP / paclitaxel in the resulting conjugate was 1: 1.
Испытания противоопухолевой активности были проведены на моделях и подтверждаются следующими примерами.Tests of antitumor activity were carried out on models and are confirmed by the following examples.
Пример 6. Эффективность конъюгата рер-АФП с паклитакселом в отношении клеток карциномы молочной железы линии MCF-7.Example 6. The effectiveness of the conjugate peer-AFP with paclitaxel against breast carcinoma cells of the MCF-7 line.
Клетки культивировали в пластиковых флаконах ("Costar") в среде RPMI ("Sigma"), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки ("Sigma"), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37°С. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (Costar) по 10 тысяч клеток/лунку, добавляя исследуемые препараты в различных концентрациях, и инкубировали 72 ч. За 2-4 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора (1 мг/мл) МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, Sigma) в среде для культивирования клеток. После развития окраски среду удаляли, растворяли кристаллы формазана в 150 мкл диметилсульфоксида и спектрофотометрически измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм. Выживаемость клеток, подвергшихся воздействию паклитаксела и конъюгата, оценивали в процентах, принимая за 100% выживаемость контрольной культуры.Cells were cultured in plastic bottles (Costar) in RPMI medium (Sigma) containing 10% fetal bovine serum (Sigma), 100 u / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin, in a humidified atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C. Cells were scattered in 96-well plates (Costar) at 10 thousand cells / well, adding the studied drugs in various concentrations, and incubated for 72 hours. 2-4 hours before the end of the incubation, 50 μl of solution (1 mg / ml) was added to each well. ) MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) in cell culture medium. After color development, the medium was removed, formazan crystals were dissolved in 150 μl of dimethyl sulfoxide, and the color intensity was measured spectrophotometrically by absorption at 540 nm. The survival of cells exposed to paclitaxel and the conjugate was evaluated as a percentage, taking the survival of the control culture as 100%.
Значения IC20 составляли 21 нМ для свободного паклитаксела и 13 нМ для конъюгата. Из представленных данных следует, что предлагаемый конъюгат рер-АФП с паклитакселом оказывает значительно более высокое цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток дикого типа, чем свободный препарат паклитаксела.IC 20 values were 21 nM for free paclitaxel and 13 nM for conjugate. From the presented data it follows that the proposed conjugate re-AFP with paclitaxel has a significantly higher cytotoxic effect against wild-type tumor cells than the free preparation of paclitaxel.
Аналогичные исследования были проведены с каждым веществом из группы: доцетаксел, доксорубицин, дауномицин, карминомицин, винкристин, винбластин, мелфалан, метотрексат, цитарабин.Similar studies were carried out with each substance from the group: docetaxel, doxorubicin, daunomycin, carminomycin, vincristine, vinblastine, melphalan, methotrexate, cytarabine.
При использовании нового пептидного препарата и его конъюгата был разработан способ лечения злокачественных опухолей, при этом экспериментальным животным с гормонзависимыми опухолями вводили наш противоопухолевый пептидный препарат или его конъюгат с цитотоксическим агентом. Для лечения использовали также фармацевтическую композицию, охарактеризованную выше, в эффективном для терапевтического результата количестве. При терапии дополнительно можно вводить адъюванты, иные противоопухолевые препараты, различные иммуномодуляторы или антиангиогенные средства. В качестве иммуномодуляторов можно применять интерферон-α, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-6, интерлейкин-12, полиоксидоний, в качестве антиангиогенных средств - ангиостатин, эндостатин, талидомид, витаксин, пентозан, сурамин, фумагиллин, скволамин, комбретастатин, приномастат, маримастат, неовастат.Using a new peptide preparation and its conjugate, a method for treating malignant tumors was developed, while experimental animals with hormone-dependent tumors were injected with our antitumor peptide preparation or its conjugate with a cytotoxic agent. For the treatment, the pharmaceutical composition described above was also used in an amount effective for the therapeutic result. During therapy, adjuvants, other antitumor drugs, various immunomodulators or antiangiogenic agents can be additionally administered. As immunomodulators, interferon-α, interferon-γ, interleukin-2, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-12, polyoxidonium can be used, and angiostatin, endostatin, thalidomide, vitaxin, pentosan, suramin, fumagillin can be used as antiangiogenic agents, squolamine, combretastatin, prinomastat, marimastat, neovastat.
Пример 7. Противоопухолевая активность конъюгата рер-АФП-паклитаксел на модели перевиваемых опухолей мышей.Example 7. Antitumor activity of conjugate re-AFP-paclitaxel in a model of transplantable tumors of mice.
Для сравнительной оценки терапевтической активности конъюгата рер-АФП-паклитаксел в отношении солидных опухолей, полученных подкожным введением мышам опухолевых клеток линии В 16 использовали внутривенный способ введения нашего конъюгата. Препараты вводили в дозах 0,2 мкг/кг по паклитакселу по схеме один раз в 2 дня, всего пять инъекций, начиная с 3-го дня после прививки опухоли. Данные об ингибировании роста опухолей у мышей при введении препаратов представлены на фиг.7. Как видно из чертежа, конъюгат, в отличие от свободного паклитаксела, значительно замедлял время появления опухолей и скорость их роста. Кроме того, введение конъюгата увеличивало среднюю продолжительность жизни животных на 37%.For comparative evaluation of the therapeutic activity of the conjugate of re-AFP-paclitaxel against solid tumors obtained by subcutaneous administration of B16 tumor cells to mice, an intravenous route of administration of our conjugate was used. The drugs were administered in doses of 0.2 μg / kg according to paclitaxel according to the scheme once every 2 days, only five injections, starting from the 3rd day after tumor inoculation. Data on the inhibition of tumor growth in mice with the introduction of drugs are presented in Fig.7. As can be seen from the drawing, the conjugate, in contrast to free paclitaxel, significantly slowed the time of appearance of tumors and their growth rate. In addition, the introduction of the conjugate increased the average life expectancy of animals by 37%.
Таким образом разработана полная система, предназначенная для лечения гормонзависимых опухолей, на основе пептидного фрагмента АФП, содержащая новый пептидный препарат, его конъюгат с цитотоксическим агентом, фармацевтическую композицию и способ лечения. Разработанная система против гормонзависимых опухолей весьма избирательна и эффективна в отношении злокачественных клеток.Thus, a complete system designed for the treatment of hormone-dependent tumors based on the AFP peptide fragment containing a new peptide preparation, its conjugate with a cytotoxic agent, a pharmaceutical composition and a treatment method has been developed. The developed system against hormone-dependent tumors is very selective and effective against malignant cells.
ЛИТЕРАТУРАLITERATURE
1. Yang F. et al., Nucleic Acids Res. 13: 8007-8017, 1985.1. Yang F. et al., Nucleic Acids Res. 13: 8007-8017, 1985.
2. Deutsch H.F. et al., Adv. Cancer Res. 56: 253-312, 1991.2. Deutsch H.F. et al., Adv. Cancer Res. 56: 253-312, 1991.
3. Hisa J. et al., J. Biol. Chem. 255: 4224-4227, 1980.3. Hisa J. et al., J. Biol. Chem. 255: 4224-4227, 1980.
4. Dudich E. et al., Eur. J. Biochem. 266: 750-761, 1999.4. Dudich, E. et al., Eur. J. Biochem. 266: 750-761, 1999.
5. Mizejewski G., Proc. Soc. Exp.Biol. Med. 215: 333-362, 1997.5. Mizejewski G., Proc. Soc. Exp.Biol. Med. 215: 333-362, 1997.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005109541/15A RU2285537C1 (en) | 2005-04-05 | 2005-04-05 | Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005109541/15A RU2285537C1 (en) | 2005-04-05 | 2005-04-05 | Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2285537C1 true RU2285537C1 (en) | 2006-10-20 |
Family
ID=37437803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005109541/15A RU2285537C1 (en) | 2005-04-05 | 2005-04-05 | Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2285537C1 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2422512C1 (en) * | 2010-02-16 | 2011-06-27 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 STRAIN - PRODUCER OF 404 TO 609 AMINO ACID FRAGMENT OF HUMAN ALPHA-FETOPROTEIN |
| RU2431639C1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-10-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin |
| RU2448116C2 (en) * | 2010-02-01 | 2012-04-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Method for producing active fragment of human alpha-fetoprotein |
| RU2630974C1 (en) * | 2016-08-05 | 2017-09-15 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Conjugate of antitumour drugs with recombinant alpha-fetoprotein and its functional fragments and method of their producing |
| WO2020046163A1 (en) * | 2018-08-28 | 2020-03-05 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Нпк Альфа-Онкотехнологии" | Preparation for treating oncological diseases |
| RU2727924C1 (en) * | 2019-08-20 | 2020-07-27 | Открытое акционерное общество "Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО "ВНЦМДЛ") | Highly effective method for preparing dosage form of targeted action for therapy of malignant growths |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6524825B1 (en) * | 1997-08-05 | 2003-02-25 | Stressgen Biotechnologies, Inc. | Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins |
| US6797491B2 (en) * | 2000-06-26 | 2004-09-28 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Human papilloma virus treatment |
-
2005
- 2005-04-05 RU RU2005109541/15A patent/RU2285537C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6524825B1 (en) * | 1997-08-05 | 2003-02-25 | Stressgen Biotechnologies, Inc. | Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins |
| US6797491B2 (en) * | 2000-06-26 | 2004-09-28 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Human papilloma virus treatment |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2448116C2 (en) * | 2010-02-01 | 2012-04-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Method for producing active fragment of human alpha-fetoprotein |
| RU2431639C1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-10-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin |
| RU2422512C1 (en) * | 2010-02-16 | 2011-06-27 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 STRAIN - PRODUCER OF 404 TO 609 AMINO ACID FRAGMENT OF HUMAN ALPHA-FETOPROTEIN |
| RU2630974C1 (en) * | 2016-08-05 | 2017-09-15 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Conjugate of antitumour drugs with recombinant alpha-fetoprotein and its functional fragments and method of their producing |
| WO2020046163A1 (en) * | 2018-08-28 | 2020-03-05 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Нпк Альфа-Онкотехнологии" | Preparation for treating oncological diseases |
| RU2727924C1 (en) * | 2019-08-20 | 2020-07-27 | Открытое акционерное общество "Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО "ВНЦМДЛ") | Highly effective method for preparing dosage form of targeted action for therapy of malignant growths |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5891704A (en) | Method to produce high levels of methioninase | |
| WO2020103777A1 (en) | Interleukin 21 protein (il21) mutant and use thereof | |
| CN101524527B (en) | TAT-HOXB4H recombinant protein and its medical composition as a hematopoietic stimulator in vivo | |
| JPS60115528A (en) | Human interleukin-2 protein, its production and pharmacological composition containing the same | |
| JPH07508714A (en) | Low-toxicity interleukin-2 analogs for use in immunotherapy | |
| US9757473B2 (en) | Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same | |
| WO2008089645A1 (en) | Fusion polypeptide inhibiting cell growth and use thereof | |
| Xu et al. | Expression of soluble, biologically active recombinant human endostatin in Escherichia coli | |
| RU2285537C1 (en) | Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors | |
| CN105884876B (en) | Earthworm polypeptide, its coding sequence and application | |
| CN111777667B (en) | Small peptides and their application in the preparation of immunomodulatory drugs | |
| CN112851791B (en) | Novel FGF analogue for resisting metabolic disorder and application thereof | |
| CN114796525A (en) | Application of cell cycle regulatory protein inhibitor in tumor treatment | |
| CN110790841A (en) | Protein nucleic acid compound and preparation method and application thereof | |
| JPWO1996010089A1 (en) | Peptide and protein modifications | |
| CN102260352B (en) | Targeted interleukin fusion protein as well as preparation method thereof and application thereof | |
| WO2020098717A1 (en) | High-affinity tcr for afp recognition | |
| Gulevskyy et al. | CURRENT CONCEPT OF THE STRUCTURAL AND FUNCTIONAL PROPERTIES OF ALFA-FETOPROTEIN AND THE POSSIBILITIES OF ITS CLINICAL APPLICATION | |
| CN106674353B (en) | A new fusion protein of Trichosanthes kirilowii and its application | |
| CN103865899B (en) | There is VEGFR 2the fusion toxin of/KDR receptor-specific and encoding gene thereof and application | |
| CN111808186B (en) | A kind of human-derived secretory FNDC5 protein and its preparation method and use | |
| TWI419901B (en) | Composition and method for treating cancer by using brain failure protein reaction media protein-1 (CRMP-1) and fragment thereof | |
| CN100398557C (en) | Angiogenesis inhibitory polypeptide and its preparation method and application | |
| CN1824775A (en) | Preparation process of recombinant human angiostatin K1-3 and application of its products in tumor therapeutic drugs | |
| AU2020256316B2 (en) | Molecular design of recombinant protein drug |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20070926 |
|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20071225 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210406 |