RU2265219C2 - Способ диагностики helicobacter pylori-инфекции - Google Patents
Способ диагностики helicobacter pylori-инфекции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2265219C2 RU2265219C2 RU2003118723/15A RU2003118723A RU2265219C2 RU 2265219 C2 RU2265219 C2 RU 2265219C2 RU 2003118723/15 A RU2003118723/15 A RU 2003118723/15A RU 2003118723 A RU2003118723 A RU 2003118723A RU 2265219 C2 RU2265219 C2 RU 2265219C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- helicobacter pylori
- mononuclear cells
- peripheral blood
- infection
- sample
- Prior art date
Links
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims abstract description 50
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims abstract description 50
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 5
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 18
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 13
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 238000002181 esophagogastroduodenoscopy Methods 0.000 description 8
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 8
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 7
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 5
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 4
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 4
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 208000024798 heartburn Diseases 0.000 description 4
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M sodium;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoate;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoic acid;(2r,3r,4r,5s)-6-(methylamino)hexane-1,2,3,4,5-pentol Chemical compound [Na+].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 3
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 210000002318 cardia Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 3
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 238000003316 immunomagnetic separation method Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008855 peristalsis Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010015137 Eructation Diseases 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 206010057969 Reflux gastritis Diseases 0.000 description 2
- 208000027687 belching Diseases 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012895 Gastric disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 210000005022 abdominal esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000015864 chronic erosive gastritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 206010060865 duodenogastric reflux Diseases 0.000 description 1
- 230000002497 edematous effect Effects 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001861 endoscopic biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000000689 peptic esophagitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 208000018556 stomach disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для диагностики хронической персистирующей Helicobacter pylori-инфекции. Сущность изобретения состоит в том, что проводят выделение мононуклеарных клеток периферической крови, в которых регистрируют участки генома Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Техническим результатом является разработка малоинвазивного и специфичного способа диагностики хронической персистирующей Helicobacter pylori-инфекции, позволяющего оценить системность заболевания и вовремя назначить адекватную терапию. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к диагностике хронических персистирующих заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности к диагностике заболеваний, вызванных Helicobacter pylori-инфекцией.
Уже известно, что при заболеваниях желудочно-кишечного тракта обнаруживается Helicobacter pylori в биопсийном материале слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки (Hoshina S., Kahn S.M., Jiang W., Green P.H., Neu H.C., Chin N., Morotomi M., Logerfo P., Weinstein I.B. "Direct detection and amplification of Helicobacter pylori ribosomal 16S gene segments from gastric endoscopic biopsies" Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1990 Nov-Dec; 13 (6): 473-479).
Также известно об обнаружении Helicobacter pylori в слюне (Song M. "Detection of Helicobacter pylori in human saliva by using nested polymerase chain reaction" Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 1993 Aug; 14 (4): 237-40).
Известно и обнаружение Helicobacter pylori в фекалиях (Mapstone N.P., Lynch D.A., Lewis F.A., Axon A.T., Tompkins D.S., Dixon M.F., Quirke P. "PCR identification of Helicobacter pylori in faeces from gastritis patients" Lancet. 1993 February 13; 341 (8842): 447).
Целью настоящего изобретения является способ диагностики хронической персистирующей инфекции, обусловленной Helicobacter pylori.
Эта цель достигается тем, что исследуют мононуклеарные клетки периферической крови, регистрируя методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) специфические участки генома (ure С, vac A, cag А), характерные для Helicobacter pylori, кодирующие факторы патогенности данного микроорганизма - С-субъединицу уреазы, А-субъединицы вакуолизирующего цитотоксина и цитотоксин ассоциированного белка. Диагностическая чувствительность способа обуславливается чувствительностью применяемых ПЦР-тест-систем и находится в пределах 102-103 микробных тел.
В отличие от известных способов диагностики данной инфекции, в частности, обнаружения Helicobacter pylori в биоптатах слизистой оболочки гастро-дуоденальной зоны ЖКТ, слюне и фекалиях методом ПЦР предлагаемый способ позволяет определить факт персистенции возбудителя в периферической крови, т.е. вовлечение в инфекционный процесс всего организма, что характерно для хронических инфекций.
Детекция Helicobacter pylori в биопсийном материале слизистой оболочки ЖКТ отражает инфицированность данным микробом только in situ, как и неинвазивные способы определения возбудителя в слюне и фекалиях.
Известен факт наличия Helicobacter pylori на слизистых оболочках ЖКТ без возникновения воспалительных изменений в организме и развития заболевания (Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз - М.: Медпрактика-М, 2003, 412 с.). Поэтому указанные аналоги не дают возможности в полной мере оценить степень развития и системность процесса, обусловленного Н. pylori-инфекцией.
Наиболее близким прототипом предлагаемого способа диагностики Helicobacter pylori - инфекции является определение микроорганизма в биопсийном материале, полученном при эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС). Этот способ позволяет оценить степень повреждения слизистых оболочек и наличие указанного микроба.
Однако проведение ЭГДС является инвазивной манипуляцией, требующей специальной дорогостоящей аппаратуры и, тем не менее, также не позволяющей оценить степень развития и системность инфекционного процесса, поскольку полученные при этом данные могут свидетельствовать только о местных проявлениях инфекции. Кроме того, не все пациенты одинаково хорошо переносят проведение ЭГДС, что существенно влияет на частоту исследований в процессе лечения.
Предлагаемый способ диагностики Helicobacter pylori-инфекции является малоинвазивным способом в отличие от получения биопсийного материала при (ЭГДС). Позволяет оценить инфицированность клеток периферической крови, степень вовлечения в инфекционный процесс организма в целом, отражает системность заболевания, чего не удается достигнуть определением возбудителя на слизистых оболочках ЖКТ, в слюне и фекалиях. Предлагаемый способ легко применим при мониторинге проводимых терапевтических мероприятий.
Из локтевой вены пациента берут 5-10 мл крови с использованием динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в качестве антикоагулянта в стандартной концентрации, выделяют фракцию мононуклеарных клеток по общепринятой методике на градиенте плотности, выдерживая при комнатной температуре 15-20 минут, наслаивая надэритроцитарную фазу в объеме 2 -2,5 мл на 3-4 мл смеси 9% водного раствора фиколла 400 и верографина (р=1.077), центрифугируя при 1500-2000 об/мин в течение 15-20 минут, отбирая интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, отмывая их в забуференном изотоническом растворе NaCl (pH - 7,2) или растворе Хэнкса по общепринятой методике, клеточный осадок ресуспендируют в 400-600 мкл используемого для отмывки раствора, готовят необходимое количество аликвот клеточной суспензии объемом 60-90 мкл, из которых известным методом иммуномагнитной сепарации, используя суспензию ферромагнитных частиц с соответствующими антителами к поверхностным мембранным структурам, разделяют субпопуляции клеток, выделяют из них ДНК известными методами, в частности лизированием биопробы раствором гуанидина с последующей сорбцией ДНК на сорбенте, многократной отмывке и ресорбции ДНК, проводят амплификацию с использованием праймеров к специфическим участкам генома Helicobacter pylori (ure С, vac A, cag А), осуществляют детекцию продуктов амплификации, после чего делают вывод о наличии участков генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови.
На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов амплификации биологических проб, полученных от пациента в примере 1; на фиг.2 электрофореграмма продуктов амплификации биологических проб, полученных от пациента в примере 2; на фиг.3 - электрофореграмма продуктов амплификации биологических проб, полученных от пациента в примере 3. Заявленный способ поясняется на следующих конкретных примерах его осуществления.
Пример 1.
Больной К., 26 лет, поступил с жалобами на периодические боли умеренной интенсивности в области эпигастрия, изжогу, отрыжку.
Анамнез: Болен в течение 2 лет. Весной 2001 года впервые обратился в поликлинику по месту жительства с жалобами: на боли в области желудка умеренной интенсивности, изжогу, чувство переполнения желудка после приема пищи, даже в небольших количествах. Установлен диагноз: хронический гастрит в стадии обострения. Лечился амбулаторно. Какие препараты принимал, не помнит. После лечения некоторое время чувствовал себя удовлетворительно. Осенью этого же года и весной 2002 года симптомы заболевания повторялись, но были значительно менее выражены. За медицинской помощью не обращался. Осенью 2002 года произошло обострение заболевания. С указанными выше жалобами пациент обратился в консультативно-диагностический центр ЦБ №6 МПС России.
При поступлении проведена эзофагогастродуоденоскопия желудка и двенадцатиперстной кишки с взятием биопсийного материала слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Биологический материал направлен на гистологическое, цитологическое исследования и определение Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции. Кроме того, этим же методом Helicobacter pylori определяли в слюне. При эзофагогастродуоденоскопическом обследовании пациента получено: Пищевод свободно проходим. Слизистая без патологии. Кардия смыкается. В желудке большое количество желчи. Складки среднего калибра расправляются при инсуфляции воздухом. Перистальтика симметричная. Слизистая бугристая в виде "булыжной мостовой", застойная. Привратник округлый, зияет. Луковица двенадцатиперстной кишки не деформирована. Слизистая рыхлая, белесовато-розовая. Заключение: Рефлюкс-гастрит. Гастропатия с гиперплазией.
Гистологический диагноз: Гиперпластический гастрит.
При цитологическом исследовании мазка-отпечатка измененной слизистой оболочки желудка обнаружена умеренная гиперплазия клеток покровно-ямочного эпителия. Helicobacter pylori найден в значительном количестве.
При исследовании методом полимеразной цепной реакции участки генома Helicobacter pylori обнаружены в биопсийном материале слизистой оболочки желудка и слюне.
В сыворотке крови определены высокие уровни специфических к Helicobacter pylori антител классов A, M, G (IgA - 44 МЕ/мл; IgM - 40 МЕ/мл; IgG - 28 МЕ/мл).
Больной обследован по предложенному способу.
Из локтевой вены пациента взяли 7,0 мл крови с использованием динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в качестве антикоагулянта. Выдержав при комнатной температуре 15 минут, выделили фракцию мононуклеарных клеток по общепринятой методике на градиенте плотности, наслоив надэритроцитарную фазу в объеме 2 мл на 3,5 мл смеси 9% водного раствора фиколла 400 и верографина (р=1.077), отцентрифугировав при 1500 об/мин в течение 15 минут. Отобрав интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, отмыли их в забуференном изотоническом растворе NaCl (pH - 7,2), клеточный осадок ресуспендировали в 400 мкл используемого для отмывки раствора. Приготовили три аликвоты клеточной суспензии объемом 60 мкл, из которых стандартным методом иммуномагнитной сепарации выделили субпопуляции клеток, выделили из них ДНК методом, основанным на лизисе биопробы раствором гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, отмывке и ресорбции ДНК, провели амплификацию с использованием праймеров к специфическим участкам генома Helicobacter pylori, осуществили детекцию продуктов амплификации методом электрофоретического разделения этих продуктов в агарозном геле с последующей их визуализацией в ультрафиолетовом свете, где в исследуемой пробе общей фракции мононуклеарных клеток была выявлена светящаяся полоса на уровне положительного контроля, в пробе Т-лимфоцитов периферической крови таковая отсутствовала.
На фиг.1: проба 1 - положительный контрольный образец; проба 2 - отрицательный контрольный образец; проба 3 - биопсийный материал слизистой оболочки желудка; проба 4 - слюна; проба 5 - Т-лимфоциты периферической крови; проба 6 - общая фракция мононуклеарных клеток периферической крови.
В этом примере обследование указанным способом и обнаружение Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови позволило сделать вывод о длительном течении болезни, что косвенно подтверждалось высоким уровнем антител классов A, M, G к Helicobacter pylori, а также о неблагоприятном прогнозе развития заболевания, приобретающем характер системного. На основании полученных данных была назначена адекватная терапия.
Пример 2.
Больной Д., 53 года, поступил с жалобами на боли в эпигастральной области, ослабевающие после приема пищи, чувство тяжести в желудке, изжогу.
Анамнез: Болен в течение 7 лет. Обострения заболевания происходят регулярно в весенне-осенний период. Лечение проходил амбулаторно. Эрозивный характер процесса и наличие Helicobacter pylori-инфекции выявлено впервые при настоящем обращении.
При эзофагогастродуоденоскопическом обследовании пациента получено: Пищевод свободно проходим, слизистая розовая. Определяется грыжевое расширение в абдоминальном отделе пищевода. Кардия смыкается не полностью. В желудке большое количество пенистого содержимого. Складки среднего калибра, расправляются при инсуфляции воздухом. Перистальтика симметрична. Слизистая розовая, отечная, в препилорическом отделе три приподнятые над поверхностью дефекта слизистой с фибрином на верхушках. Привратник округлый, проходим. Луковица двенадцатиперстной кишки не деформирована. Слизистая розовая. Дистальные отделы двенадцатиперстной кишки не изменены.
Заключение: Эрозии антрального отдела желудка.
Гистологический диагноз: Хронический эррозивный гастрит.
При цитологическом исследовании мазка-отпечатка измененной слизистой оболочки желудка обнаружены клетки покровно-ямочного эпителия в состоянии гиперплазии, ряд из них деформирован, встречаются клетки с признаками кариорексиса. Helicobacter pylori выявлен в большом количестве.
При исследовании методом полимеразной цепной реакции участки генома Helicobacter pylori обнаружены в биопсийном материале слизистой оболочки желудка, в слюне - не обнаружен.
В сыворотке крови определены высокие уровни специфических к Helicobacter pylori антител классов A, M, G (IgA - 33 МЕ/мл; IgM - 57 МЕ/мл; IgG - 31 МЕ/мл).
Больной обследован по предложенному способу.
Из локтевой вены пациента взяли 8,0 мл крови с использованием динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в качестве антикоагулянта. Выдержав при комнатной температуре 15 минут, выделили фракцию мононуклеарных клеток по общепринятой методике на градиенте плотности, наслоив надэритроцитарную фазу в объеме 2 мл на 3 мл смеси 9% водного раствора фиколла 400 и верографина (р=1.077), отцентрифугировав при 1500 об/мин в течение 20 минут. Отобрав интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, отмыли их в растворе Хэнкса, клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл используемого для отмывки раствора. Приготовили три аликвоты клеточной суспензии объемом 70 мкл, из которых стандартным методом иммуномагнитной сепарации выделили субпопуляции клеток, выделили из них ДНК методом, основанным на лизисе биопробы раствором гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, отмывке и ресорбции ДНК, провели амплификацию с использованием праймеров к специфическим участкам генома Helicobacter pylori, осуществили детекцию продуктов амплификации методом электрофоретического разделения этих продуктов в агарозном геле с последующей их визуализацией в ультрафиолетовом свете, где в исследуемых пробах Т-лимфоцитов и мононуклеарных клетках периферической крови были выявлены светящиеся полосы на уровне положительного контроля.
На фиг.2: проба 1 - положительный контрольный образец; проба 2 - отрицательный контрольный образец; проба 3 - биопсийный материал слизистой оболочки желудка; проба 4 - слюна; проба 5 - Т-лимфоциты периферической крови; проба 6 - общая фракция мононуклеарных клеток периферической крови.
В данном примере обследование указанным способом и сопоставление его результатов с результатом инструментального метода и клинической симптоматики позволило сделать предположение о системности процесса, глубоком характере повреждения слизистой оболочки желудка и еще до получения гистологического подтверждения начать адекватную терапию.
Пример 3.
Больная Г., 29 лет, поступила с жалобами на чувство тяжести в области желудка, отрыжку, изжогу.
Анамнез: Впервые описанные симптомы заболевания почувствовала около 2 месяцев назад. Их появление связывает с повышением физической и эмоциональной нагрузок. До настоящего времени за медицинской помощью не обращалась. Лечение не проходила.
При эзофагогастродуоденоскопическом обследовании пациентки получено: Пищевод свободно проходим. Слизистая бугристая, белесовато-розовая. Кардия смыкается полностью. В желудке большое количество содержимого с желчью. Складки среднего калибра, расправляются при инсуфляции воздухом. Перистальтика симметричная. Привратник округлый, проходим. Луковица двенадцатиперстной кишки не деформирована. Слизистая белесовато-розовая. Заключение: Дуодено-гастральный рефлюкс. Рефлюкс-эзофагит. Рефлюкс-гастрит.
Гистологический диагноз: Слизистая желудка с картиной хронического гастрита.
При цитологическом исследовании мазка-отпечатка измененной слизистой оболочки желудка обнаружена умеренная гиперплазия клеток покровно-ямочного эпителия. Helicobacter pylori найден в небольшом количестве.
При исследовании методом полимеразной цепной реакции геном Helicobacter pylori обнаружен только в биопсийном материале слизистой оболочки желудка, в слюне - не обнаружен.
В сыворотке крови обнаружены: высокий (29 МЕ/мл) уровень специфических антител класса А, умеренные значения (42 МЕ/мл) уровня специфических антител класса М, антитела класса G находились на уровне ниже диагностического порога (<15 МЕ/мл).
Больная обследована по предложенному способу.
Из локтевой вены пациентки взяли 10,0 мл крови с использованием динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в качестве антикоагулянта. Выдержав при комнатной температуре 20 минут, выделили фракцию мононуклеарных клеток по общепринятой методике на градиенте плотности, наслоив надэритроцитарную фазу в объеме 2,5 мл на 4 мл смеси 9% водного раствора фиколла 400 и верографина (р=1.077), отцентрифугировав при 1500 об/мин в течение 20 минут. Отобрав интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, отмыли их в забуференном изотоническом растворе NaCl (pH - 7,2), клеточный осадок ресуспендировали в 600 мкл используемого для отмывки раствора. Приготовили три аликвоты клеточной суспензии объемом 90 мкл, из которых стандартным методом иммуномагнитной сепарации выделили субпопуляции клеток, выделили из них ДНК методом, основанным на лизисе биопробы раствором гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, отмывке и ресорбции ДНК, провели амплификацию с использованием праймеров к специфическим участкам генома Helicobacter pylori, осуществили детекцию продуктов амплификации методом электрофоретического разделения этих продуктов в агарозном геле с последующей их визуализацией в ультрафиолетовом свете, где в исследуемых пробах Т-лимфоцитов и мононуклеарных клетках периферической крови не было выявлено светящихся полос на уровне положительного контроля.
На фиг.3: проба 1 - положительный контрольный образец; проба 2 - отрицательный контрольный образец; проба 3 - биопсийный материал слизистой оболочки желудка; проба 4 - слюна; проба 5 - Т-лимфоциты периферической крови; проба 6 - общая фракция мононуклеарных клеток периферической крови.
В этом примере проведение диагностики указанным способом показало отсутствие генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках, что позволило подтвердить прямую коррелляционную связь между незначительным характером повреждения слизистой оболочки желудка, отсутствием Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови, а также сделать вывод о начальной фазе развития заболевания и отсутствии его системного характера. Назначена адекватная терапия.
Всего обследовано 73 пациента с различной по выраженности патологии слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки (табл.1)
| Таблица 1. Результаты обследования пациентов в зависимости от выраженности поражения слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки |
||||||
| Диагноз по данным эзофагогастродуоденоскопии, подтвержденный гистологическими исследованиями | Число пациентов | Процент положительных результатов определения Helicobacter pylori в мононуклеарах крови методом полимеразной цепной реакции | Процент положительных результатов определения Helicobacter pylori в биопсийном материале методом полимеразной цепной реакции | Процент положительных результатов определения специфических иммуноглобулинов классов A, M, G к Helicobacter pylori |
||
| IgM | IgA | IgG | ||||
| Группа сравнения* | 20 | 15,0 | 5,0 | 5,0 | 25,0 | |
| Поверхностное воспаление | 14 | 21,4 | 50,0 | 21,4 | 57,1 | 50,0 |
| Деструктивное воспаление | 39 | 41,0 | 84,6 | 17,9 | 69,2 | 51,3 |
| *Критерием для отбора пациентов в группу сравнения служили отсутствие признаков воспаления и бактериального обсеменения Helicobacter pylori по данным эзофагогастродуоденоскопии, гистологии и цитологии. | ||||||
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют, что факт обнаружения персистенции генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови, в частности в Т-лимфоцитах, является отражением инфекционного процесса, обусловленного указанным микроорганизмом.
Причем информативность его находится на достаточно высоком уровне и коррелирует с другими методами определения наличия Helicobacter pylori-инфекции, интенсивностью процесса поражения слизистой оболочки гастро-дуоденальной области и может отражать системный характер процесса.
Таким образом, достигается важный для клинической практики результат. Определение в мононуклеарах периферической крови генома Helicobacter pylori отражает степень и глубину (системность) развития заболевания, обусловленного Helicobacter pylori-инфекцией и позволяет назначать адекватную терапию.
Настоящее изобретение не очевидно для специалистов, работающих в данной области.
Несмотря на кажущуюся простоту до настоящего времени никто не мог даже предположить, что Helicobacter pylori может персистировать в мононуклеарных клетках периферической крови. Нами это выявлено и доказано впервые.
Потребовались длительные научные исследования (начиная с февраля 2000 года) по изучению биологических субстратов персистенции данного микроорганизма в организме человека при хронических заболеваниях, обусловленных Helicobacter pylori: ротовая полость (слюна, зубо-десневая борозда, лимфоидное глоточное кольцо); полость желудка и двенадцатиперстной кишки (желудочный сок, поверхность и собственно слизистая оболочка); периферическая кровь (сыворотка, плазма, форменные элементы).
Полученные данные позволили впервые выявить факт персистенции генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови при хронической инфекции, обусловленной Helicobacter pylori, для доказательства которого потребовалось сопоставление результатов эзофагогастродуоденоскопии, гистологии, цитологии, серологических исследований по определению специфических иммуноглобулинов классов A, M, G, полимеразной цепной реакции в биопсийном материале и форменных элементов крови.
Метод иммуномагнитной сепарации позволил определить субпопуляции клеток, наиболее подверженных персистенции генома Helicobacter pylori.
Всего нами в течение 3,5 лет был выполнено комплексное обследование 1504 пациентов по выявлению Helicobacter pylori в различных биологических субстратах, из них у 73 проведено исследование периферической крови. Факт персистенции генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови при хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта обнаружен нами впервые.
Впервые выявленный нами факт персистенции генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови при хронической Helicobacter pylori-инфекции имеет важное научно-практическое значение и позволяет сделать важные для науки и практики выводы о том, что:
Во-первых, детекция участков генома Helicobacter pylori в мононуклеарах периферической крови, в частности лимфоцитах, при заболеваниях желудочно-кишечного тракта свидетельствует о вовлечении в инфекционный процесс защитных механизмов всей системы иммунитета, а не только его местной составляющей. По-видимому, при инфицировании микроорганизмом, обладающим тропностью к эпителию слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, процесс не ограничивается местными реакциями, а приобретает системный характер.
Во-вторых, если при заболевании желудочно-кишечного тракта, обусловленном Helicobacter pylori, считающимся тропным к поверхности эпителиальных клеток слизистой оболочки, его фрагменты могут обнаруживаться в кровяном русле, то, вероятно, и при других инфекциях барьерных тканей подобный феномен может иметь место. При этом определенную важность имеет чувствительность метода детекции возбудителя и правильно выбранный тканевой или клеточный субстрат его обнаружения.
Обнаружение Helicobacter pylori, тропного к поверхности эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта, в клетках периферической крови позволяет по-новому рассматривать систему патогенеза заболеваний, обусловленных Helicobacter pylori, принципы диагностики и используемые для этого методы. Применение предлагаемого способа диагностики Helicobacter pylori-инфекции в протоколах обследования пациентов позволяет упростить диагностические манипуляции, оценить системность заболевания и вовремя назначить адекватную терапию.
Предлагаемый способ является малоинвазивным, специфичным, может использоваться как скрининговый метод без проведения эзофагогастродуоденоскопии и взятия биопсийного материала для дальнейших исследований различными методами.
Настоящее изобретение стало результатом длительных научно-практических исследований. Факт персистенции генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови явился неожиданным для самих авторов, но не случайным, доказанным нами путем тщательной перепроверки полученных результатов.
Заявленное изобретение позволяет в короткие сроки без проведения эзофагогастродуоденоскопии и взятия биопсийного материала делать предварительные заключения о наличии в организме пресистирующей Helicobacter pylori-инфекции, причем впервые определять ее как системное поражение организма.
Настоящее изобретение может быть осуществлено непосредственно по данному описанию.
Claims (2)
1. Способ диагностики Helicobacter pylori-инфекции методом полимеразной цепной реакции (ПНР), отличающийся тем, что проводят выделение мононуклеарных клеток периферической крови, в которых регистрируют участки генома Helicobacter pylori.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выделении мононуклеарных клеток в качестве антикоагулянта используют динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, фракцию мононуклеарных клеток выделяют на градиенте плотности, а субпопуляции клеток разделяют методом иммуномагнитной сепарации.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003118723/15A RU2265219C2 (ru) | 2003-06-25 | 2003-06-25 | Способ диагностики helicobacter pylori-инфекции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003118723/15A RU2265219C2 (ru) | 2003-06-25 | 2003-06-25 | Способ диагностики helicobacter pylori-инфекции |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003118723A RU2003118723A (ru) | 2004-12-27 |
| RU2265219C2 true RU2265219C2 (ru) | 2005-11-27 |
Family
ID=35867824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003118723/15A RU2265219C2 (ru) | 2003-06-25 | 2003-06-25 | Способ диагностики helicobacter pylori-инфекции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2265219C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2394499C1 (ru) * | 2009-06-09 | 2010-07-20 | Эльвира Ивановна Белобородова | Способ диагностики степени активности антрального хеликобактер-ассоциированного гастрита у больных бронхиальной астмой |
| RU2440583C2 (ru) * | 2009-05-25 | 2012-01-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО ОрГМА Росздрава) | Способ диагностики инфекции helicobacter pylori у больных с хирургической патологией органов брюшной полости |
-
2003
- 2003-06-25 RU RU2003118723/15A patent/RU2265219C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HAN S.R. et al. One-step polymerase chain reaction-based typing of Helicobacter pylori vac A gene: association with gastric histopathology. Med. Microbiol. Immunol. 1999, 188 (3), p.131-138. VOLAND P. et al. Antigenic properties of Hpa A and Omp 18, two outer membrane proteins of Helicobacter pylori. Infect Immun. 2003, 71, p.3837-3843. HOSHINA S et al. Direct detection and amplification of Helicobacter pylori ribosomal 16S gene segments from gastric endoscopic biopsies. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1990, 13 (6), p.473-479. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2440583C2 (ru) * | 2009-05-25 | 2012-01-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО ОрГМА Росздрава) | Способ диагностики инфекции helicobacter pylori у больных с хирургической патологией органов брюшной полости |
| RU2394499C1 (ru) * | 2009-06-09 | 2010-07-20 | Эльвира Ивановна Белобородова | Способ диагностики степени активности антрального хеликобактер-ассоциированного гастрита у больных бронхиальной астмой |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Levine et al. | An endoscopic biopsy protocol can differentiate high-grade dysplasia from early adenocarcinoma in Barrett's esophagus | |
| Vaira et al. | Diagnosis of Helicobacter pylori infection | |
| Apostolov et al. | Helicobacter pylori and other Helicobacter species in gallbladder and liver of patients with chronic cholecystitis detected by immunological and molecular methods | |
| Kiesslich et al. | Value of chromoendoscopy and magnification endoscopy in the evaluation of duodenal abnormalities: a prospective, randomized comparison | |
| Tseng et al. | Comparison of the clinical feasibility of three rapid urease tests in the diagnosis of Helicobacter pylori infection | |
| Calvet et al. | Diagnosis of Helicobacter pylori infection | |
| Jekarl et al. | Evaluation of a newly developed rapid stool antigen test using an immunochromatographic assay to detect Helicobacter pylori | |
| Nakamura | Laboratory tests for the evaluation of Helicobacter pylori infections | |
| RU2265219C2 (ru) | Способ диагностики helicobacter pylori-инфекции | |
| Russo et al. | Detection of Helicobacter pylori cagA gene by polymerase chain reaction in faecal samples | |
| Yamamura et al. | Relationship between Helicobacter pylori infection and histologic features of gastritis in biopsy specimens in gastroduodenal diseases, including evaluation of diagnosis by polymerase chain reaction assay | |
| Kroser et al. | Comparison of rapid office-based serology with formal laboratory-based ELISA testing for diagnosis of Helicobacter pylori gastritis | |
| Sütö et al. | 13C-Urea breath test is superior in sensitivity to detect Helicobacter pylori infection than either antral histology or rapid urease test | |
| Özgür et al. | The diagnostic value of endoscopic narrow band imaging in helicobacter pylori gastritis in children | |
| Arikan et al. | Helicobacter pylori stool antigen test: results of a prospective study | |
| US20110002943A1 (en) | Use of enterovirus for diagnostics, treatment and prevention of disease | |
| Budiman et al. | Clinical and Endoscopic Features in Helicobacter Pylori Infection: Literature Review | |
| Al-Jumaili et al. | Evaluation of Two Housekeeping Gene in Diagnosis of Helicobacter Pylori and Compare It to another Routine Test | |
| Iwamoto et al. | The comparison of the intensity of human intestinal spirochetes between Brachyspira pilosicoli and Brachyspira aalborgi infections | |
| TWI624668B (zh) | 評估個體之登革熱病毒感染嚴重程度的方法 | |
| RU2659134C1 (ru) | Способ оценки степени тяжести течения хронического эрозивного гастрита, ассоциированного с helicobacter pylori и вирусом эпшейн-барр | |
| RU2331364C1 (ru) | Способ диагностики гастрита у детей | |
| Omar | Evaluating the Performance of Stool Antigen Tests to Detect Helicobacter pylori Infection in Tobruk, Libya | |
| Ramezani et al. | Frequency of Helicobacter pylori infection in patients with peptic ulcer referred to the Endoscopy Departments of Khorramabad city hospitals, Iran, during 2013-2016 | |
| RU2193203C2 (ru) | Неинвазивный способ выявления helicobacter pylori при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050626 |