RU2234942C2 - Tumor polypeptide isolated from prostate and polynucleotide encoding thereof - Google Patents

Tumor polypeptide isolated from prostate and polynucleotide encoding thereof

Info

Publication number
RU2234942C2
RU2234942C2 RU2001104349A RU2001104349A RU2234942C2 RU 2234942 C2 RU2234942 C2 RU 2234942C2 RU 2001104349 A RU2001104349 A RU 2001104349A RU 2001104349 A RU2001104349 A RU 2001104349A RU 2234942 C2 RU2234942 C2 RU 2234942C2
Authority
RU
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
seq id
cdna sequence
prostate
determined
sequence
Prior art date
Application number
RU2001104349A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2001104349A (en )
Inventor
Дэвин Клиффорд ДИЛЛОН (US)
Дэвин Клиффорд ДИЛЛОН
Сюзан Луиз ХАРЛОКЕР (US)
Сюзан Луиз ХАРЛОКЕР
Дзианг ЮКВИУ (US)
Дзианг ЮКВИУ
Дзиангчун КСУ (US)
Дзиангчун КСУ
Дженнифер Линн МИТЧАМ (US)
Дженнифер Линн МИТЧАМ
Original Assignee
Корикса Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Images

Abstract

FIELD: molecular biology, genetic therapy, medicine, oncology.
SUBSTANCE: invention relates to isolation of polypeptide from prostate that comprises the sequence SEQ ID NO: 327, and polynucleotide isolated from prostate tumor tissue encoding prostate tumor polypeptides and comprising the sequence SEQ ID NO: 225 or SEQ ID NO: 326. These polypeptides and polynucleotides expand the assortment of genetic agents used in vaccines and pharmaceutical compositions for prophylaxis and treatment of prostate cancer and for diagnosis and monitoring of such tumors.
EFFECT: valuable biological and medicinal properties of polypeptide and polynucleotide.
2 cl, 4 tbl, 8 dwg, 16 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ TECHNICAL FIELD

Данное изобретение относится в основном к терапии и диагностике такой злокачественной опухоли, как рак предстательной железы. The present invention relates generally to therapy and diagnosis of cancer such as prostate cancer. Изобретение более конкретно относится к полипептидам, содержащим, по меньшей мере, часть опухолевого белка предстательной железы, и к полинуклеотидам, кодирующим такие полипептиды. The invention more particularly relates to polypeptides comprising at least part of the prostate tumor protein, and to polynucleotides encoding such polypeptides. Такие полипептиды и полинуклеотиды могут быть использованы в вакцинах и фармацевтических композициях для профилактики и лечения рака предстательной железы и для диагностики и мониторинга таких раковых опухолей. Such polypeptides and polynucleotides may be used in vaccines and pharmaceutical compositions for preventing and treating prostate cancer and for the diagnosis and monitoring of such cancers.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ BACKGROUND OF THE INVENTION

Рак предстательной железы является наиболее распространенной формой рака среди мужчин с оцениваемой встречаемостью 30% у мужчин в возрасте свыше 50 лет. Prostate cancer is the most common form of cancer among men with the estimated frequency of occurrence of 30% in men aged over 50 years. Многочисленные клинические доказательства показывают, что рак предстательной железы человека обладает тенденцией метастазировать в кость, и это заболевание, по-видимому, неуклонно прогрессирует из андроген-зависимого статуса в андроген-резистентный статус, приводя к повышенной смертности пациентов. Numerous clinical evidence shows that human prostate cancer has a tendency to metastasize to the bone, and this disease seems to be steadily progresses from androgen-dependent to androgen status-resistant status, leading to increased patient mortality. Это преобладающее заболевание является в настоящее время второй по частоте причиной смерти от рака среди мужчин в Соединенных Штатах. This is the prevailing disease is currently the second leading cause of cancer death among men in the United States.

Несмотря на значительные исследования в терапии указанного заболевания, лечение рака предстательной железы остается трудным. Despite significant research in the treatment of said disease, the treatment of prostate cancer remains difficult. Обычно лечение основывается на хирургии и/или лучевой терапии, но эти способы являются неэффективными в значительном проценте случаев. Generally, treatment is based on surgery and / or radiation therapy, but these methods are ineffective in a significant percentage of cases. Два идентифицированных ранее специфических белка предстательной железы - специфический антиген предстательной железы (PSA) и кислая фосфатаза предстательной железы (PAP) - имеют ограниченный терапевтический и диагностический потенциал. Two previously identified specific prostate proteins - prostate specific antigen (PSA) and prostatic acid phosphatase (PAP) - have limited therapeutic and diagnostic potential. Например, содержание PSA не всегда хорошо коррелирует с наличием рака предстательной железы, являясь положительным в некотором проценте случаев, не являющихся раком предстательной железы, в том числе в случае доброкачественной гиперплазии рака предстательной железы (ВРН). For example, the PSA content does not always correlate well with the presence of prostate cancer, being positive in a percentage of cases, non-prostate cancer, including in the case of benign prostatic hyperplasia (BPH), cancer. Кроме того, содержание PSA коррелирует с объемом предстательной железы и не указывает уровень метастазирования. Furthermore, the content of PSA correlates with prostate volume, and do not indicate the level of metastasis.

Несмотря на значительные исследования в области терапии этих и других раковых опухолей, рак предстательной железы по-прежнему трудно диагностировать и лечить. Despite significant research in the field of treatment of these and other cancers, prostate cancer remains difficult to diagnose and treat. Соответственно в данной области имеется потребность в усовершенствованных способах обнаружения и лечения подобных раковых опухолей. Accordingly, in the art there is a need for improved methods of detecting and treating such cancers. Данное изобретение удовлетворяет эти потребности и дополнительно обеспечивает другие связанные с ними преимущества. The present invention fulfills these needs and further provides other related advantages.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ SUMMARY

Вкратце, данное изобретение обеспечивает композиции и способы для диагностики и терапии рака, такого как рак предстательной железы. Briefly, the present invention provides compositions and methods for the diagnosis and therapy of cancer, such as prostate cancer. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает полипептиды, содержащие, по меньшей мере, часть опухолевого белка предстательной железы или его вариант. In one aspect, this invention provides polypeptides comprising at least a portion of a tumor protein of the prostate or a variant thereof. Определенные части и другие варианты являются иммуногенными, так что способность варианта реагировать с антиген-специфическими антисыворотками по существу не является уменьшенной. Certain portions and other variants are immunogenic, such that the ability to react with antigen variant-specific antisera is not substantially diminished. В некоторых вариантах указанный полипептид содержит, по меньшей мере, иммуногенную часть опухолевого белка предстательной железы или его вариант, причем опухолевый белок содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: (а) последовательностей, представленных в любой из последовательностей SEQ ID NO:1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 или 384-472; In some embodiments, said polypeptide comprises at least an immunogenic portion of a tumor protein of the prostate or a variant thereof, wherein the tumor protein comprises an amino acid sequence which is encoded by a polynucleotide sequence selected from the group consisting of: (a) sequences shown in any of the sequences SEQ ID NO: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 or 384-472; (b) последовательностей, которые гибридизуются с любой из указанных выше последовательностей при умеренно жестких условиях; (B) sequences that hybridize to any of the foregoing sequences under moderately stringent conditions; и (с) комплементов любой из последовательностей (а) или (b). and (c) complements of any of the sequences (a) or (b). В некоторых характерных вариантах такой полипептид содержит, по меньшей мере, часть или вариант опухолевого белка, которые включают в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, представленных в любой из последовательностей SEQ ID NO:112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380 и 383. In some exemplary embodiments, such a polypeptide comprises at least a portion or variant of a tumor protein that includes an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequences represented in any of the sequences SEQ ID NO: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380 and 383.

Далее, данное изобретение обеспечивает полинуклеотиды, которые кодируют описанный выше полипептид, или его часть (такую как часть, кодирующую, по меньшей мере, 15 аминокислотных остатков опухолевого белка предстательной железы), экспрессирующие векторы, содержащие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные такими экспрессирующими векторами. Further, the present invention provides polynucleotides which encode the above-described polypeptide, or a portion thereof (such as a portion encoding at least 15 amino acid residues tumor protein of the prostate), expression vectors comprising such polynucleotides and host cells transformed or transfected with such expression vectors.

В других аспектах данное изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие полипептид или полинуклеотид, описанные выше, и физиологически приемлемый носитель. In other aspects, the invention provides pharmaceutical compositions comprising a polypeptide or polynucleotide as described above and a physiologically acceptable carrier.

В родственном аспекте данного изобретения обеспечены вакцины. In a related aspect, the present invention vaccines are provided. Такие вакцины содержат полипептид или полинуклеотид, описанные выше, и неспецифический усилитель иммунного ответа. Such vaccines comprise a polypeptide or polynucleotide as described above and a non-specific immune response enhancer.

Данное изобретение обеспечивает дополнительно фармацевтические композиции, которые содержат: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с опухолевым белком предстательной железы; The present invention further provides pharmaceutical compositions which comprise: (a) an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds with prostate tumor protein; и (b) физиологически приемлемый носитель. and (b) a physiologically acceptable carrier.

В следующих аспектах данное изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие: (а) антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует полипептид, описанный выше; In further aspects, the invention provides pharmaceutical compositions comprising: (a) an antigen-presenting cell that expresses a polypeptide as described above; и (b) фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. and (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Антиген-презентирующие клетки включают в себя дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-клетки. Antigen-presenting cells include dendritic cells, macrophages, monocytes, fibroblasts and B cells.

В родственных аспектах обеспечены вакцины, которые содержат: (а) антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует полипептид, описанный выше, и (b) неспецифический усилитель иммунного ответа. In related aspects, vaccines are provided that comprise: (a) an antigen-presenting cell that expresses a polypeptide as described above and (b) non-specific immune response enhancer.

Данное изобретение обеспечивает далее, в других аспектах, слитые (гибридные) белки, которые содержат, по меньшей мере, один полипептид, описанный выше, а также полинуклеотиды, кодирующие такие слитые белки. The present invention further provides, in other aspects, fusion (hybrid) proteins which comprise at least one polypeptide described above as well as polynucleotides encoding such fusion proteins.

В родственных аспектах обеспечены фармацевтические композиции, содержащие слитый белок или полинуклеотид, кодирующий слитый белок, в комбинации с физиологически приемлемым носителем. In related aspects, pharmaceutical compositions are provided comprising a fusion protein or polynucleotide encoding a fusion protein, in combination with a physiologically acceptable carrier.

Далее, обеспечены вакцины в других аспектах, которые содержат слитый белок или полинуклеотид, кодирующий слитый белок, в комбинации с неспецифическим усилителем иммунного ответа. Furthermore, vaccines are provided in other aspects, that comprise a fusion protein or polynucleotide encoding a fusion protein, in combination with a non-specific immune response enhancer.

В следующих аспектах данное изобретение обеспечивает способы подавления развития раковой опухоли у пациента, предусматривающие введение пациенту фармацевтической композиции или вакцины, описанных выше. In further aspects, the invention provides methods for inhibiting the development of a cancer in a patient, comprising administering to a patient a pharmaceutical composition or vaccine as described above.

Далее, данное изобретение обеспечивает, в других аспектах, способы удаления опухолевых клеток из биологического образца, предусматривающие взаимодействие биологического образца с Т-клетками, которые специфически реагируют с опухолевым белком предстательной железы, причем стадию взаимодействия выполняют в условиях и в течение времени, достаточных для возможности удаления клеток, экспрессирующих указанный белок, из образца. Further, the present invention provides, in other aspects, methods for removing tumor cells from a biological sample comprising contacting a biological sample with T cells that specifically react with a tumor protein of the prostate, wherein the step of reacting is performed under conditions and for a time sufficient to allow removal of cells expressing said protein from a sample.

В родственных вариантах обеспечены способы подавления развития раковой опухоли у пациента, предусматривающие введение пациенту биологического образца, обработанного, как описано выше. In related embodiments, methods are provided for suppressing the development of cancer in a patient, comprising administering to a patient a biological sample treated as described above.

Дополнительно обеспечены способы, в других аспектах, для стимуляции и/или размножения Т-клеток, специфических для опухолевого белка предстательной железы, предусматривающие взаимодействие Т-клеток с одним или более из таких компонентов, как: (i) полипептид, описанный выше; Additionally, methods are provided, in other aspects, for stimulating and / or propagation of the T-cells specific for neoplastic prostate protein comprising contacting T cells with one or more of such ingredients as: (i) a polypeptide as described above; (ii) полинуклеотид, кодирующий такой полипептид; (Ii) a polynucleotide encoding such a polypeptide; и/или (iii) антиген-презентирующая клетка, которая экспрессирует такой полипептид; and / or (iii) an antigen-presenting cell that expresses such a polypeptide; в условиях и в течение времени, достаточных для возможности стимуляции и/или размножения Т-клеток. under conditions and for a time sufficient to allow stimulation and / or expansion of T cells. Также обеспечены выделенные популяции Т-клеток, содержащие Т-клетки, полученные, как описано выше. Also provided are isolated T cell population, comprising T cells prepared as described above.

В следующих аспектах данное изобретение обеспечивает способы подавления развития раковой опухоли у пациента, предусматривающие введение пациенту эффективного количества популяции Т-клеток, описанной выше. In further aspects, the invention provides methods for inhibiting the development of a cancer in a patient, comprising administering to a patient an effective amount of T cell population as described above.

Далее, данное изобретение обеспечивает способы подавления развития раковой опухоли у пациента, предусматривающие стадии; Further, the present invention provides methods in a patient, comprising the steps of suppressing cancer development; (а) инкубирования CD4 + и/или CD8 + Т-клеток, выделенных из пациента, с одним или более из таких компонентов, как: (i) полипептид, содержащий, по меньшей мере, иммуногенную часть опухолевого белка предстательной железы; (a) incubating CD4 + and / or CD8 + T cells isolated from a patient with one or more of such ingredients as: (i) a polypeptide comprising at least an immunogenic portion of a prostate tumor protein; (ii) полинуклеотид, кодирующий такой полипептид; (Ii) a polynucleotide encoding such a polypeptide; и (iii) антиген-презентирующая клетка, которая экспрессирует такой полипептид; and (iii) an antigen-presenting cell that expresses such a polypeptide; и (b) введения пациенту эффективного количества пролиферированных Т-клеток и тем самым подавления развития раковой опухоли у пациента. and (b) administering to the patient an effective amount of proliferated T-cells and thereby suppress development of a cancer in the patient. Пролиферированные клетки могут, но необязательно, быть клонированы перед введением пациенту. Proliferating cells may, but need not, be cloned prior to administration to a patient.

В следующих аспектах данное изобретение обеспечивает способы определения наличия или отсутствия раковой опухоли у пациента, предусматривающие: (а) взаимодействие биологического образца, полученного из пациента, со связывающим агентом, который связывается с полипептидом, описанным выше; In further aspects, the invention provides methods for determining the presence or absence of a cancer in a patient involving: (a) contacting a biological sample obtained from a patient with a binding agent that binds to a polypeptide described above; (b) определение в указанном образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; (B) determining in said sample amount of a polypeptide that binds to the binding agent; и (с) сравнение указанного количества полипептида с заранее определенной предельной величиной и определение из указанного сравнения наличия или отсутствия раковой опухоли у пациента. and (c) comparing said amount of polypeptide with a predetermined limit value and determining from said comparison the presence or absence of cancer in the patient. В предпочтительных вариантах связывающим агентом является антитело, более предпочтительно моноклональное антитело. In preferred embodiments, the binding agent is an antibody, more preferably monoclonal antibody. Рак может быть раком предстательной железы. The cancer can be prostate cancer.

Данное изобретение обеспечивает также, в других аспектах, способы мониторинга прогрессирования раковой опухоли у пациента. The present invention also provides, in other aspects, methods for monitoring the progression of cancer in a patient. Такие способы включают в себя стадии: (а) взаимодействия биологического образца, полученного из пациента, в первой временной точке со связывающим агентом, который связывается с полипептидом, описанным выше; Such methods include the steps of: (a) interaction of the biological sample obtained from a patient, the first time point with a binding agent that binds to a polypeptide described above; (b) определения в указанном образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; (B) determining in said sample amount of a polypeptide that binds to the binding agent; (с) повторения стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, полученного из пациента, в следующей временной точке; (C) repeating steps (a) and (b) using a biological sample obtained from the patient in the next time-point; и (d) сравнения количества полипептида, определяемого в стадии (с), с количеством, определяемым в стадии (b), и мониторинга на основании указанного сравнения прогрессирования раковой опухоли у пациента. and (d) comparing the amount of polypeptide is determined in step (c) with the amount determined in step (b), and monitoring on the basis of said comparison, progression of cancer in a patient.

Данное изобретение обеспечивает, далее, в других аспектах, способы определения наличия или отсутствия раковой опухоли у пациента, предусматривающие стадии: (а) взаимодействия биологического образца, полученного из пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим опухолевой белок предстательной железы; The present invention provides, further, in other aspects, methods for determining the presence or absence of a cancer in a patient, comprising the steps of: (a) contacting a biological sample obtained from a patient with an oligonucleotide that hybridizes to a polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate; (b) определения в указанном образце уровня полинуклеотида, предпочтительно мРНК, который гибридизуется с указанным олигонуклеотидом; (B) determining in said sample the level of a polynucleotide, preferably mRNA, that hybridizes to said oligonucleotide; и (с) сравнения уровня полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, с заранее определенной предельной величиной и определения из указанного сравнения наличия или отсутствия раковой опухоли у пациента. and (c) comparing the level of polynucleotide that hybridizes to the oligonucleotide with a predetermined limit value and determining from said comparison the presence or absence of cancer in the patient. В некоторых вариантах количество мРНК определяют через полимеразную цепную реакцию с использованием, например, по меньшей мере, одного олигонуклеотидного праймера, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, описанный выше, или комплементом такого полинуклеотида. In some embodiments, the amount of mRNA is determined by polymerase chain reaction using, for example, at least one oligonucleotide primer that hybridizes to a polynucleotide encoding a polypeptide described above, or the complement of such a polynucleotide. В других вариантах количество мРНК определяют с использованием гибридизационного способа, применяющего олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, описанный выше, или комплементом такого полинуклеотида. In other embodiments, the amount of mRNA is determined using a hybridization method, applying an oligonucleotide probe which hybridizes with a polynucleotide encoding a polypeptide described above, or the complement of such a polynucleotide.

В родственных аспектах обеспечены способы мониторинга прогрессирования раковой опухоли у пациента, предусматривающие стадии; In related aspects, methods are provided for monitoring the progression of cancer in a patient, comprising the steps of; (а) взаимодействия биологического образца, полученного из пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим опухолевой белок предстательной железы; (A) contacting a biological sample obtained from a patient with an oligonucleotide that hybridizes to a polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate; (b) определения в указанном образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с указанным олигонуклеотидом; (B) determining in said sample amount of polynucleotide that hybridizes to said oligonucleotide; (с) повторения стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, полученного из пациента, в следующий момент времени; (C) repeating steps (a) and (b) using a biological sample obtained from the patient at a next time; и (d) сравнения количества полинуклеотида, определяемого в стадии (с), с количеством, определяемым в стадии (b), и на основании указанного мониторинга прогрессирования раковой опухоли у пациента. and (d) comparing the amount of polynucleotide as defined in step (c) with the amount determined in step (b), and on the basis of said monitoring progression of a cancer in the patient.

В следующих аспектах данное изобретение обеспечивает антитела, такие как моноклональные антитела, которые связываются с описанным выше полипептидом, а также диагностические наборы, содержащие такие антитела. In further aspects, the invention provides antibodies, such as monoclonal antibodies that bind to the polypeptide described above as well as diagnostic kits comprising such antibodies. Обеспечены также диагностические наборы, содержащие один или несколько олигонуклеотидных зондов или праймеров, описанных выше. Also provided are diagnostic kits comprising one or more oligonucleotide probes or primers described above.

Эти и другие аспекты данного изобретения станут очевидными в связи со следующим подробным описанием и прилагаемыми чертежами. These and other aspects of the invention will become apparent in connection with the following detailed description and accompanying drawings. Все приведенные здесь ссылки включены в качестве ссылки во всей их полноте, как если бы каждая из них была включена отдельно. All references cited herein are incorporated by reference in their entirety as if each was incorporated individually.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ И ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЕ НОМЕРА (ИДЕНТИФИКАТОРЫ) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS and the identification number (ID) SEQUENCE

Фигура 1 иллюстрирует способность Т-клеток узнавать клетки, экспрессирующие показательный опухолевый полипептид предстательной железы P502S в сравнении с контрольными фибробластами. Figure 1 illustrates the ability of T cells to recognize cells expressing the tumor polypeptide P502S indicative of prostate as compared to control fibroblasts. Лизис в процентах показан в виде ряда соотношений эффектор : мишень, как указано. Percentage lysis is shown as a series of effector: target ratio, as indicated.

Фигуры 2А и 2В иллюстрируют способность Т-клеток узнавать клетки, экспрессирующие показательный опухолевый полипептид предстательной железы P502S. Figures 2A and 2B illustrate the ability of T cells to recognize cells expressing the polypeptide is indicative of prostate tumor P502S. В каждом случае количество пятен γ-интерферона показано для разных количеств иммунокомпетентных клеток (клеток-респондеров). In each case, the amount of γ-interferon spots is shown for different numbers of immune cells (responder cells). На фигуре 2А представлены данные для фибробластов, кратковременно обработанных пептидом PDS-12, в сравнении с фибробластами, кратковременно обработанными контрольным пептидом Е75. Figure 2A shows the data for fibroblasts treated briefly PDS-12 peptide, as compared to fibroblasts, briefly treated with the control peptide E75. На фигуре 2В представлены данные для фибробластов, экспрессирующих P502S, в сравнении с фибробластами, экспрессирующими HER-2/neu. Figure 2B shows the data for fibroblasts expressing P502S, as compared to fibroblasts expressing HER-2 / neu.

Фигура 3 представляет тест конкурентного связывания пептидов, показывающий, что пептид P1S#10, произведенный из P501S, связывает HLA-A2. Figure 3 is a competitive binding test peptides showing that the P1S # 10 peptide produced from P501S, binds HLA-A2. Пептид P1S#10 подавляет рестриктированную (ограниченную) HLA-A2 презентацию пептида fluM58 CTL-клону D150M58 в биоанализе высвобождения TNF. P1S # 10 peptide inhibits restricted (limited) HLA-A2 peptide presentation fluM58 CTL-clone bioassay D150M58 release of TNF. CTL D150M58 является специфическим для НLА-А2-связывающего матричного пептида fluM58 вируса гриппа. CTL D150M58 is specific for HLA-A2-binding peptide matrix fluM58 influenza virus.

Фигура 4 иллюстрирует способность Т-клеточных линий, получаемых из иммунизированных P1S#10 мышей, специфически лизировать клетки-мишени Jurkat А2Кb, кратковременно обработанные P1S#10, и трансдуцированные P501S клетки-мишени Jurkat А2Кb, в сравнении с трансдуцированными EGFP клетками Jurkat A2Kb. Figure 4 illustrates the ability of T cell lines derived from the immunized mice P1S # 10, specifically lyse Jurkat A2Kb target cells transiently treated P1S # 10 and P501S-transduced Jurkat A2Kb target cell, in comparison with the transduced cells EGFP Jurkat A2Kb. Лизис в процентах показан в виде ряда соотношений эффектор : мишень, как указано. Percentage lysis is shown as a series of effector: target ratio, as indicated.

Фигура 5 иллюстрирует способность клона Т-клеток узнавать и специфически лизировать клетки Jurkat A2Kb, экспрессирующие показательный опухолевый полипептид P501S предстательной железы, показывая, что пептид P1S#10 может быть природно процессируемым эпитопом полипептида P501S. Figure 5 illustrates the ability of T cell clones specifically recognize and lyse cells Jurkat A2Kb, expressing tumor polypeptide P501S indicative of the prostate, indicating that the P1S # 10 peptide can be natural epitope of the processed polypeptide P501S.

Фигуры 6А и 6В (7) являются графиками, иллюстрирующими специфичность CD8 + клеточной линии (3А-1) в отношении показательного антигена опухоли предстательной железы (P501S). Figures 6A and 6B (7) are graphs illustrating the specificity of the CD8 + cell line (3A-1) against an antigen indicative of the prostate tumor (P501S). Фигура 6А показывает результаты анализа высвобождения 51 Сr. Figure 6A shows the results of 51 Cr release assay. Специфический лизис в процентах показан в виде ряда соотношений эффектор : мишень, как указано. Percentage specific lysis is shown as a series of effector: target ratio, as indicated. Фигура 6В (7) показывает продуцирование интерферона-гамма клетками 3А-1, стимулированными аутологичными B-LCL, трансдуцированными P501S, при различных соотношениях эффектор : мишень, как указано. Figure 6B (7) shows production of interferon-gamma 3A-1 cells stimulated with autologous B-LCL, transduced with P501S, at various ratios of effector: target, as indicated.

SEQ ID NO:1 является определенной последовательностью-кДНК для F1-13 SEQ ID NO: 1 is the determined cDNA sequence for F1-13

SEQ ID NO:2 является определенной последовательностью-кДНК для F1-12 SEQ ID NO: 2 is the determined cDNA sequence for F1-12

SEQ ID NO:3 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для F1-12 SEQ ID NO: 3 is the determined 5 'cDNA sequence for F1-12

SEQ ID NO:4 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для F1-16 SEQ ID NO: 4 is the determined 3 'cDNA sequence for F1-16

SEQ ID NO:5 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для Н1-1 SEQ ID NO: 5 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1

SEQ ID NO:6 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для H1-9 SEQ ID NO: 6 is the determined 3 'cDNA sequence for H1-9

SEQ ID NO:7 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для H1-4 SEQ ID NO: 7 is the determined 3 'cDNA sequence for H1-4

SEQ ID NO:8 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для J1-17 SEQ ID NO: 8 is the determined 3 'cDNA sequences for J1-17

SEQ ID NO:9 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для J1-17 SEQ ID NO: 9 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-17

SEQ ID NO:10 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для L1-12 SEQ ID NO: 10 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-12

SEQ ID NO:11 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для L1-12 SEQ ID NO: 11 is the determined 5 'cDNA sequence for L1-12

SEQ ID NO:12 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для N1-1862 SEQ ID NO: 12 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1862

SEQ ID NO:13 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для N1-1862 SEQ ID NO: 13 is the determined 5 'cDNA sequence for N1-1862

SEQ ID NO:14 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для J1-13 SEQ ID NO: 14 is the determined 3 'cDNA sequences for J1-13

SEQ ID NO:15 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для J1-13 SEQ ID NO: 15 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-13

SEQ ID NO:16 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для J1-19 SEQ ID NO: 16 is the determined 3 'cDNA sequences for J1-19

SEQ ID NO:17 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для J1-19 SEQ ID NO: 17 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-19

SEQ ID NO:18 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для J1-25 SEQ ID NO: 18 is the determined 3 'cDNA sequences for J1-25

SEQ ID NO:19 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для J1-25 SEQ ID NO: 19 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-25

SEQ ID NO:20 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для J1-24 SEQ ID NO: 20 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-24

SEQ ID NO:21 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для J1-24 SEQ ID NO: 21 is the determined 3 'cDNA sequences for J1-24

SEQ ID NO:22 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для К1-58 SEQ ID NO: 22 is the determined 5 'cDNA sequence for K1-58

SEQ ID NO:23 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для К1-58 SEQ ID NO: 23 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-58

SEQ ID NO:24 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для К1-63 SEQ ID NO: 24 is the determined 5 'cDNA sequence for K1-63

SEQ ID NO:25 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для К1-63 SEQ ID NO: 25 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-63

SEQ ID NO:26 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для L1-4 SEQ ID NO: 26 is the determined 5 'cDNA sequence for L1-4

SEQ ID NO:27 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для L1-4 SEQ ID NO: 27 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-4

SEQ ID NO:28 является определенной 5'-последовательностью-кДНК для L1-14 SEQ ID NO: 28 is the determined 5 'cDNA sequence for L1-14

SEQ ID NO:29 является определенной 3'-последовательностыо-кДНК для L1-14 SEQ ID NO: 29 is the determined 3 'cDNA posledovatelnostyo for L1-14

SEQ ID NO:30 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для J1-12 SEQ ID NO: 30 is the determined 3 'cDNA sequences for J1-12

SEQ ID NO:31 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для J1-16 SEQ ID NO: 31 is the determined 3 'cDNA sequences for J1-16

SEQ ID NO:32 является определенной 3' -последовательностью-кДНК для J1-21 SEQ ID NO: 32 is the determined 3 'cDNA -sequence for J1-21

SEQ ID NO:33 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для К1-48 SEQ ID NO: 33 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-48

SEQ ID NO:34 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для для К1-55 SEQ ID NO: 34 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-55 for

SEQ ID NO:35 является определенной 3'-последовательностыо-кДНК для L1-2 SEQ ID NO: 35 is the determined 3 'cDNA for posledovatelnostyo L1-2

SEQ ID NO:36 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для L1-6 SEQ ID NO: 36 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-6

SEQ ID NO:37 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для N1-1858 SEQ ID NO: 37 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1858

SEQ ID NO:38 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для N1-1860 SEQ ID NO: 38 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1860

SEQ ID NO:39 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для N1-1861 SEQ ID NO: 39 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1861

SEQ ID NO:40 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для N1-1864 SEQ ID NO: 40 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1864

SEQ ID NO:41 является определенной последовательностью-кДНК для Р5 SEQ ID NO: 41 is the determined cDNA sequence for P5

SEQ ID NO:42 является определенной последовательностью-кДНК для Р8 SEQ ID NO: 42 is the determined cDNA sequence for P8

SEQ ID NO:43 является определенной последовательностью-кДНК для Р9 SEQ ID NO: 43 is the determined cDNA sequence for P9

SEQ ID NO:44 является определенной последовательностью-кДНК для Р18 SEQ ID NO: 44 is the determined cDNA sequence for P18

SEQ ID NO:45 является определенной последовательностью-кДНК для Р20 SEQ ID NO: 45 is the determined cDNA sequence for P20

SEQ ID NO:46 является определенной последовательностью-кДНК для Р29 SEQ ID NO: 46 is the determined cDNA sequence for P29

SEQ ID NO:47 является определенной последовательностью-кДНК для Р30 SEQ ID NO: 47 is the determined cDNA sequence for P30

SEQ ID NO:48 является определенной последовательностью-кДНК для Р34 SEQ ID NO: 48 is the determined cDNA sequence for P34

SEQ ID NO:49 является определенной последовательностью-кДНК для Р36 SEQ ID NO: 49 is the determined cDNA sequence for P36

SEQ ID NO:50 является определенной последовательностью-кДНК для Р38 SEQ ID NO: 50 is the determined cDNA sequence for P38

SEQ ID NO:51 является определенной последовательностью-кДНК для Р39 SEQ ID NO: 51 is the determined cDNA sequence for P39

SEQ ID NO:52 является определенной последовательностью-кДНК для Р42 SEQ ID NO: 52 is the determined cDNA sequence for P42

SEQ ID NO:53 является определенной последовательностью-кДНК для Р47 SEQ ID NO: 53 is the determined cDNA sequence for P47

SEQ ID NO:54 является определенной последовательностью-кДНК для Р49 SEQ ID NO: 54 is the determined cDNA sequence for P49

SEQ ID NO:55 является определенной последовательностью-кДНК для Р50 SEQ ID NO: 55 is the determined cDNA sequence for P50

SEQ ID NO:56 является определенной последовательностыо-кДНК для Р53 SEQ ID NO: 56 is the determined cDNA posledovatelnostyo for P53

SEQ ID NO:57 является определенной последовательностью-кДНК для Р55 SEQ ID NO: 57 is the determined cDNA sequence for P55

SEQ ID NO:58 является определенной последовательностью-кДНК для Р60 SEQ ID NO: 58 is the determined cDNA sequence for P60

SEQ ID NO:59 является определенной последовательностью-кДНК для Р64 SEQ ID NO: 59 is the determined cDNA sequence for P64

SEQ ID NO:60 является определенной последовательностью-кДНК для Р65 SEQ ID NO: 60 is the determined cDNA sequence for P65

SEQ ID NO:61 является определенной последовательностью-кДНК для Р73 SEQ ID NO: 61 is the determined cDNA sequence for P73

SEQ ID NO:62 является определенной последовательностью-кДНК для Р75 SEQ ID NO: 62 is the determined cDNA sequence for P75

SEQ ID NO:63 является определенной последовательностью-кДНК для Р76 SEQ ID NO: 63 is the determined cDNA sequence for P76

SEQ ID NO:64 является определенной последовательностью-кДНК для Р79 SEQ ID NO: 64 is the determined cDNA sequence for P79

SEQ ID NO:65 является определенной последовательностью-кДНК для Р84 SEQ ID NO: 65 is the determined cDNA sequence for P84

SEQ ID NO:66 является определенной последовательностью-кДНК для Р68 SEQ ID NO: 66 is the determined cDNA sequence for P68

SEQ ID NO:67 является определенной последовательностью-кДНК для Р80 SEQ ID NO: 67 is the determined cDNA sequence for P80

SEQ ID NO:68 является определенной последовательностью-кДНК для Р82 SEQ ID NO: 68 is the determined cDNA sequence for P82

SEQ ID NO:69 является определенной последовательностью-кДНК для U1-3064 SEQ ID NO: 69 is the determined cDNA sequence for U1-3064

SEQ ID NO:70 является определенной последовательностью-кДНК для U1-3065 SEQ ID NO: 70 is the determined cDNA sequence for U1-3065

SEQ ID NO:71 является определенной последовательностью-кДНК для V1-3692 SEQ ID NO: 71 is the determined cDNA sequence for V1-3692

SEQ ID NO:72 является определенной последовательностью-кДНК для 1А-3905 SEQ ID NO: 72 is the determined cDNA sequence for 1A-3905

SEQ ID NO:73 является определенной последовательностью-кДНК для V1-3686 SEQ ID NO: 73 is the determined cDNA sequence for V1-3686

SEQ ID NO:74 является определенной последовательностью-кДНК для R1-2330 SEQ ID NO: 74 is the determined cDNA sequence for R1-2330

SEQ ID NO:75 является определенной последовательностью-кДНК для 1В-3976 SEQ ID NO: 75 is the determined cDNA sequence for 1B-3976

SEQ ID NO:76 является определенной последовательностью-кДНК для V1-3679 SEQ ID NO: 76 is the determined cDNA sequence for V1-3679

SEQ ID NO:77 является определенной последовательностью-кДНК для 1G-4736 SEQ ID NO: 77 is the determined cDNA sequence for 1G-4736

SEQ ID NO:78 является определенной последовательностью-кДНК для 1G-4738 SEQ ID NO: 78 is the determined cDNA sequence for 1G-4738

SEQ ID NO:79 является определенной последовательностью-кДНК для 1G-4741 SEQ ID NO: 79 is the determined cDNA sequence for 1G-4741

SEQ ID NO:80 является определенной последовательностью-кДНК для 1G-4744 SEQ ID NO: 80 is the determined cDNA sequence for 1G-4744

SEQ ID NO:81 является определенной последовательностью-кДНК для 1G-4734 SEQ ID NO: 81 is the determined cDNA sequence for 1G-4734

SEQ ID NO:82 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4774 SEQ ID NO: 82 is the determined cDNA sequence for 1H-4774

SEQ ID NO:83 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4781 SEQ ID NO: 83 is the determined cDNA sequence for 1H-4781

SEQ ID NO:84 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4785 SEQ ID NO: 84 is the determined cDNA sequence for 1H-4785

SEQ ID NO:85 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4787 SEQ ID NO: 85 is the determined cDNA sequence for 1H-4787

SEQ ID NO:86 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4796 SEQ ID NO: 86 is the determined cDNA sequence for 1H-4796

SEQ ID NO:87 является определенной последовательностью-кДНК для 1I-4807 SEQ ID NO: 87 is the determined cDNA sequences for 1I-4807

SEQ ID NO:88 является определенной последовательностью-кДНК для 1I-4810 SEQ ID NO: 88 is the determined cDNA sequences for 1I-4810

SEQ ID NO:89 является определенной последовательностью-кДНК для 1I-4811 SEQ ID NO: 89 is the determined cDNA sequences for 1I-4811

SEQ ID NO:90 является определенной последовательностью-кДНК для 1J-4876 SEQ ID NO: 90 is the determined cDNA sequence for 1J-4876

SEQ ID NO:91 является определенной последовательностью-кДНК для 1К-4884 SEQ ID NO: 91 is the determined cDNA sequence for 1K-4884

SEQ ID NO:92 является определенной последовательностью-кДНК для 1К-4896 SEQ ID NO: 92 is the determined cDNA sequence for 1K-4896

SEQ ID NO:93 является определенной последовательностью-кДНК для 1G-4761 SEQ ID NO: 93 is the determined cDNA sequence for 1G-4761

SEQ ID NO:94 является определенной последовательностью-кДНК для 1G-4762 SEQ ID NO: 94 is the determined cDNA sequence for 1G-4762

SEQ ID NO:95 является определенной последовательностыо-кДНК для 1Н-4766 SEQ ID NO: 95 is the determined cDNA posledovatelnostyo for 1H-4766

SEQ ID NO:96 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4770 SEQ ID NO: 96 is the determined cDNA sequence for 1H-4770

SEQ ID NO:97 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4771 SEQ ID NO: 97 is the determined cDNA sequence for 1H-4771

SEQ ID NO:98 является определенной последовательностью-кДНК для 1Н-4772 SEQ ID NO: 98 is the determined cDNA sequence for 1H-4772

SEQ ID NO:99 является определенной последовательностью-кДНК для ID-4297 SEQ ID NO: 99 is the determined cDNA sequence for ID-4297

SEQ ID NO:100 является определенной последовательностью-кДНК для ID-4309 SEQ ID NO: 100 is the determined cDNA sequence for ID-4309

SEQ ID NO:101 является определенной последовательностью-кДНК для ID.1-4278 SEQ ID NO: 101 is the determined cDNA sequence for ID.1-4278

SEQ ID NO:102 является определенной последовательностью-кДНК для ID-4288 SEQ ID NO: 102 is the determined cDNA sequence for ID-4288

SEQ ID NO:103 является определенной последовательностью-кДНК для ID-4283 SEQ ID NO: 103 is the determined cDNA sequence for ID-4283

SEQ ID NO:104 является определенной последовательностью-кДНК для ID-4304 SEQ ID NO: 104 is the determined cDNA sequence for ID-4304

SEQ ID NO:105 является определенной последовательностью-кДНК для ID-4296 SEQ ID NO: 105 is the determined cDNA sequence for ID-4296

SEQ ID NO:106 является определенной последовательностью-кДНК для ID-4280 SEQ ID NO: 106 is the determined cDNA sequence for ID-4280

SEQ ID NO:107 является определенной полноразмерной последовательностью-кДНК для F1-12 (также называемой p504S) SEQ ID NO: 107 is the determined full length cDNA sequence for F1-12 (also called p504S)

SEQ ID NO:108 является предсказанной аминокислотной последовательностью для F1-12 SEQ ID NO: 108 is the predicted amino acid sequence for F1-12

SEQ ID NO:109 является полноразмерной последовательностью-кДНК для J1-17 SEQ ID NO: 109 is a full-length cDNA sequences for J1-17

SEQ ID NO:110 является определенной полноразмерной последовательностью-кДНК для L1-12 SEQ ID NO: 110 is the determined full length cDNA sequence for L1-12

SEQ ID NO:111 является определенной полноразмерной последовательностью-кДНК для N1-1862 SEQ ID NO: 111 is the determined full length cDNA sequence for N1-1862

SEQ ID NO:112 является предсказанной аминокислотной последовательностью для J1-17 SEQ ID NO: 112 is the predicted amino acid sequence for J1-17

SEQ ID NO:113 является предсказанной аминокислотной последовательностью для L1-12 SEQ ID NO: 113 is the predicted amino acid sequence for L1-12

SEQ ID NO:114 является предсказанной аминокислотной последовательностью для N1-1862 SEQ ID NO: 114 is the predicted amino acid sequence for N1-1862

SEQ ID NO:115 является определенной последовательностью-кДНК для Р89 SEQ ID NO: 115 is the determined cDNA sequence for P89

SEQ ID NO:116 является определенной последовательностью-кДНК для Р90 SEQ ID NO: 116 is the determined cDNA sequence for P90

SEQ ID NO:117 является определенной последовательностью-кДНК для Р92 SEQ ID NO: 117 is the determined cDNA sequence for P92

SEQ ID NO:118 является определенной последовательностью-кДНК для Р95 SEQ ID NO: 118 is the determined cDNA sequence for P95

SEQ ID NO:119 является определенной последовательностью-кДНК для Р98 SEQ ID NO: 119 is the determined cDNA sequence for P98

SEQ ID NO:120 является определенной последовательностью-кДНК для Р102 SEQ ID NO: 120 is the determined cDNA sequence for P102

SEQ ID NO:121 является определенной последовательностью-кДНК для Р110 SEQ ID NO: 121 is the determined cDNA sequence for P110

SEQ ID NO:122 является определенной последовательностью-кДНК для Р111 SEQ ID NO: 122 is the determined cDNA sequence for P111

SEQ ID NO:123 является определенной последовательностью-кДНК для Р114 SEQ ID NO: 123 is the determined cDNA sequence for P114

SEQ ID NO:124 является определенной последовательностью-кДНК для Р115 SEQ ID NO: 124 is the determined cDNA sequence for P115

SEQ ID NO:125 является определенной последовательностью-кДНК для Р116 SEQ ID NO: 125 is the determined cDNA sequence for P116

SEQ ID NO:126 является определенной последовательностью-кДНК для Р124 SEQ ID NO: 126 is the determined cDNA sequence for P124

SEQ ID NO:127 является определенной последовательностью-кДНК для Р126 SEQ ID NO: 127 is the determined cDNA sequence for P126

SEQ ID NO:128 является определенной последовательностью-кДНК для Р130 SEQ ID NO: 128 is the determined cDNA sequence for P130

SEQ ID NO:129 является определенной последовательностью-кДНК для Р133 SEQ ID NO: 129 is the determined cDNA sequence for P133

SEQ ID NO:130 является определенной последовательностью-кДНК для Р138 SEQ ID NO: 130 is the determined cDNA sequence for P138

SEQ ID NO:131 является определенной последовательностью-кДНК для Р143 SEQ ID NO: 131 is the determined cDNA sequence for P143

SEQ ID NO:132 является определенной последовательностыо-кДНК для Р151 SEQ ID NO: 132 is the determined cDNA for posledovatelnostyo R151

SEQ ID NO:133 является определенной последовательностью-кДНК для Р156 SEQ ID NO: 133 is the determined cDNA sequence for R156

SEQ ID NO:134 является определенной последовательностью-кДНК для Р157 SEQ ID NO: 134 is the determined cDNA sequence for R157

SEQ ID NO:135 является определенной последовательностью-кДНК для Р166 SEQ ID NO: 135 is the determined cDNA sequence for R166

SEQ ID NO:136 является определенной последовательностью-кДНК для Р176 SEQ ID NO: 136 is the determined cDNA sequence for R176

SEQ ID NO:137 является определенной последовательностью-кДНК для Р178 SEQ ID NO: 137 is the determined cDNA sequence for R178

SEQ ID NO:138 является определенной последовательностью-кДНК для Р179 SEQ ID NO: 138 is the determined cDNA sequence for R179

SEQ ID NO:139 является определенной последовательностью-кДНК для Р185 SEQ ID NO: 139 is the determined cDNA sequence for p185

SEQ ID NO:140 является определенной последовательностью-кДНК для Р192 SEQ ID NO: 140 is the determined cDNA sequence for R192

SEQ ID NO:141 является определенной последовательностью-кДНК для Р201 SEQ ID NO: 141 is the determined cDNA sequence for P201

SEQ ID NO:142 является определенной последовательностью-кДНК для Р204 SEQ ID NO: 142 is the determined cDNA sequence for P204

SEQ ID NO:143 является определенной последовательностью-кДНК для Р208 SEQ ID NO: 143 is the determined cDNA sequence for P208

SEQ ID NO:144 является определенной последовательностью-кДНК для Р211 SEQ ID NO: 144 is the determined cDNA sequence for P211

SEQ ID NO:145 является определенной последовательностыо-кДНК для Р213 SEQ ID NO: 145 is the determined cDNA for posledovatelnostyo R213

SEQ ID NO:146 является определенной последовательностью-кДНК для Р219 SEQ ID NO: 146 is the determined cDNA sequence for R219

SEQ ID NO:147 является определенной последовательностью-кДНК для Р237 SEQ ID NO: 147 is the determined cDNA sequence for R237

SEQ ID NO:148 является определенной последовательностыо-кДНК для Р239 SEQ ID NO: 148 is the determined cDNA for posledovatelnostyo R239

SEQ ID NO:149 является определенной последовательностью-кДНК для Р248 SEQ ID NO: 149 is the determined cDNA sequence for R248

SEQ ID NO:150 является определенной последовательностью-кДНК для Р251 SEQ ID NO: 150 is the determined cDNA sequence for P251

SEQ ID NO:151 является определенной последовательностью-кДНК для Р255 SEQ ID NO: 151 is the determined cDNA sequence for R255

SEQ ID NO:152 является определенной последовательностью-кДНК для Р256 SEQ ID NO: 152 is the determined cDNA sequence for R256

SEQ ID NO:153 является определенной последовательностью-кДНК для Р259 SEQ ID NO: 153 is the determined cDNA sequence for R259

SEQ ID NO:154 является определенной последовательностью-кДНК для Р260 SEQ ID NO: 154 is the determined cDNA sequence for P260

SEQ ID NO:155 является определенной последовательностью-кДНК для Р263 SEQ ID NO: 155 is the determined cDNA sequence for P263

SEQ ID NO:156 является определенной последовательностью-кДНК для Р264 SEQ ID NO: 156 is the determined cDNA sequence for P264

SEQ ID NO:157 является определенной последовательностью-кДНК для Р266 SEQ ID NO: 157 is the determined cDNA sequence for R266

SEQ ID NO:158 является определенной последовательностью-кДНК для Р270 SEQ ID NO: 158 is the determined cDNA sequence for P270

SEQ ID NO:159 является определенной последовательностью-кДНК для Р272 SEQ ID NO: 159 is the determined cDNA sequence for R272

SEQ ID NO:160 является определенной последовательностью-кДНК для Р278 SEQ ID NO: 160 is the determined cDNA sequence for R278

SEQ ID NO:161 является определенной последовательностью-кДНК для Р105 SEQ ID NO: 161 is the determined cDNA sequence for P105

SEQ ID NO:162 является определенной последовательностью-кДНК для Р107 SEQ ID NO: 162 is the determined cDNA sequence for P107

SEQ ID NO:163 является определенной последовательностью-кДНК для Р137 SEQ ID NO: 163 is the determined cDNA sequence for P137

SEQ ID NO:164 является определенной последовательностью-кДНК для Р194 SEQ ID NO: 164 is the determined cDNA sequence for P194

SEQ ID NO:165 является определенной последовательностью-кДНК для Р195 SEQ ID NO: 165 is the determined cDNA sequence for R195

SEQ ID NO:166 является определенной последовательностью-кДНК для Р196 SEQ ID NO: 166 is the determined cDNA sequence for R196

SEQ ID NO:167 является определенной последовательностью-кДНК для Р220 SEQ ID NO: 167 is the determined cDNA sequence for P220

SEQ ID NO:168 является определенной последовательностью-кДНК для Р234 SEQ ID NO: 168 is the determined cDNA sequence for R234

SEQ ID NO:169 является определенной последовательностью-кДНК для Р235 SEQ ID NO: 169 is the determined cDNA sequence for P235

SEQ ID NO:170 является определенной последовательностью-кДНК для Р243 SEQ ID NO: 170 is the determined cDNA sequence for R243

SEQ ID NO:171 является определенной последовательностью-кДНК для P703P-DE1 SEQ ID NO: 171 is the determined cDNA sequence for P703P-DE1

SEQ ID NO:172 является предсказанной аминокислотной последовательностью для P703P-DE1 SEQ ID NO: 172 is the predicted amino acid sequence for P703P-DE1

SEQ ID NO:173 является определенной последовательностью-кДНК для P703P-DE2 SEQ ID NO: 173 is the determined cDNA sequence for P703P-DE2

SEQ ID NO:174 является определенной последовательностью-кДНК для P703P-DE6 SEQ ID NO: 174 is the determined cDNA sequence for P703P-DE6

SEQ ID NO:175 является определенной последовательностью-кДНК для P703P-DE13 SEQ ID NO: 175 is the determined cDNA sequence for P703P-DE13

SEQ ID NO:176 является предсказанной аминокислотной последовательностью для P703P-DE13 SEQ ID NO: 176 is the predicted amino acid sequence for P703P-DE13

SEQ ID NO:177 является определенной последовательностью-кДНК для P703P-DE14 SEQ ID NO: 177 is the determined cDNA sequence for P703P-DE14

SEQ ID NO:178 является предсказанной аминокислотной последовательностью для P703P-DE14 SEQ ID NO: 178 is the predicted amino acid sequence for P703P-DE14

SEQ ID NO:179 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4736 SEQ ID NO: 179 is the definition of long-cDNA sequences for 1G-4736

SEQ ID NO:180 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4738 SEQ ID NO: 180 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4738

SEQ ID NO:181 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4741 SEQ ID NO: 181 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4741

SEQ ID NO:182 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4744 SEQ ID NO: 182 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4744

SEQ ID NO:183 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4774 SEQ ID NO: 183 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4774

SEQ ID NO:184 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4781 SEQ ID NO: 184 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4781

SEQ ID NO:185 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4785 SEQ ID NO: 185 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4785

SEQ ID NO:186 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4787 SEQ ID NO: 186 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4787

SEQ ID NO:187 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1Н-4796 SEQ ID NO: 187 is the determined extended cDNA sequence for 1H-4796

SEQ ID NO:188 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 11-4807 SEQ ID NO: 188 is the determined extended cDNA sequence for 11-4807

SEQ ID NO:189 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для 11-4810 SEQ ID NO: 189 is the determined 3 'cDNA sequences for 11-4810

SEQ ID NO:190 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для 11-4811 SEQ ID NO: 190 is the determined 3 'cDNA sequences for 11-4811

SEQ ID NO:191 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1J-4876 SEQ ID NO: 191 is the determined extended cDNA sequence for 1J-4876

SEQ ID NO:192 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1К-4884 SEQ ID NO: 192 is the determined extended cDNA sequence for 1K-4884

SEQ ID NO:193 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1К-4896 SEQ ID NO: 193 is the definition of long-cDNA sequence for 1K-4896

SEQ ID NO:194 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4761 SEQ ID NO: 194 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4761

SEQ ID NO:195 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1G-4762 SEQ ID NO: 195 is the definition of long-cDNA sequences for 1G-4762

SEQ ID NO:196 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1Н-4766 SEQ ID NO: 196 is the determined extended cDNA sequence for 1H-4766

SEQ ID NO:197 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для 1Н-4770 SEQ ID NO: 197 is the determined 3 'cDNA sequence for 1H-4770

SEQ ID NO:198 является определенной 3'-последовательностью-кДНК для 1Н-4771 SEQ ID NO: 198 is the determined 3 'cDNA sequence for 1H-4771

SEQ ID NO:199 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1Н-4772 SEQ ID NO: 199 is the determined extended cDNA sequence for 1H-4772

SEQ ID NO:200 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для ID-4309 SEQ ID NO: 200 is the determined extended cDNA sequence for ID-4309

SEQ ID NO:201 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1D.1-4278 SEQ ID NO: 201 is the determined extended cDNA sequence for 1D.1-4278

SEQ ID NO:202 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1D-4288 SEQ ID NO: 202 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4288

SEQ ID NO:203 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1D-4283 SEQ ID NO: 203 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4283

SEQ ID NO:204 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1D-4304 SEQ ID NO: 204 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4304

SEQ ID NO:205 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1D-4296 SEQ ID NO: 205 is the definition of long-cDNA sequences for 1D-4296

SEQ ID NO:206 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для 1D-4280 SEQ ID NO: 206 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4280

SEQ ID NO:207 является определенной последовательностью-кДНК для 10-d8fwd SEQ ID NO: 207 is the determined cDNA sequence for 10-d8fwd

SEQ ID NO:208 является определенной последовательностыо-кДНК для 10-Н10cоn SEQ ID NO: 208 is the determined cDNA posledovatelnostyo for 10 N10con

SEQ ID NO:209 является определенной последовательностью-кДНК для 11-C8rev SEQ ID NO: 209 is the determined cDNA sequence for 11-C8rev

SEQ ID NO:210 является определенной последовательностью-кДНК для 7.g6fwd SEQ ID NO: 210 is the determined cDNA sequence for 7.g6fwd

SEQ ID NO:211 является определенной последовательностью-кДНК для 7.g6rev SEQ ID NO: 211 is the determined cDNA sequence for 7.g6rev

SEQ ID NO:212 является определенной последовательностью-кДНК для 8-b5fwd SEQ ID NO: 212 is the determined cDNA sequence for 8-b5fwd

SEQ ID NO:213 является определенной последовательностью-кДНК для 8-b5rev SEQ ID NO: 213 is the determined cDNA sequence for 8-b5rev

SEQ ID NO:214 является определенной последовательностью-кДНК для 8-b6fwd SEQ ID NO: 214 is the determined cDNA sequence for 8-b6fwd

SEQ ID NO:215 является определенной последовательностью-кДНК для 8-b6rev SEQ ID NO: 215 is the determined cDNA sequence for 8-b6rev

SEQ ID NO:216 является определенной последовательностью-кДНК для 8-d4fwd SEQ ID NO: 216 is the determined cDNA sequence for 8-d4fwd

SEQ ID NO:217 является определенной последовательностью-кДНК для 8-d9rev SEQ ID NO: 217 is the determined cDNA sequence for 8-d9rev

SEQ ID NO:218 является определенной последовательностью-кДНК для 8-g3fwd SEQ ID NO: 218 is the determined cDNA sequence for 8-g3fwd

SEQ ID NO:219 является определенной последовательностью-кДНК для 8-g3rev SEQ ID NO: 219 is the determined cDNA sequence for 8-g3rev

SEQ ID NO:220 является определенной последовательностью-кДНК для 8-h11rev SEQ ID NO: 220 is the determined cDNA sequence for 8-h11rev

SEQ ID NO:221 является определенной последовательностью-кДНК для g-f12fwd SEQ ID NO: 221 is the determined cDNA sequence for g-f12fwd

SEQ ID NO:222 является определенной последовательностью-кДНК для g-f3rev SEQ ID NO: 222 is the determined cDNA sequence for g-f3rev

SEQ ID NO:223 является определенной последовательностью-кДНК для P509S SEQ ID NO: 223 is the determined cDNA sequence for P509S

SEQ ID NO:224 является определенной последовательностью-кДНК для P510S SEQ ID NO: 224 is the determined cDNA sequence for P510S

SEQ ID NO:225 является определенной последовательностью-кДНК для P703DE5 SEQ ID NO: 225 is the determined cDNA sequence for P703DE5

SEQ ID NO:226 является определенной последовательностью-кДНК для 9-А11 SEQ ID NO: 226 is the determined cDNA sequence for the 9-A11

SEQ ID NO:227 является определенной последовательностью-кДНК для 8-С6 SEQ ID NO: 227 is the determined cDNA sequence for 8-C6

SEQ ID NO:228 является определенной последовательностью-кДНК для 8-Р7 SEQ ID NO: 228 is the determined cDNA sequence for 8-P7

SEQ ID NO:229 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN13 SEQ ID NO: 229 is the determined cDNA sequence for JPTPN13

SEQ ID NO:230 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN14 SEQ ID NO: 230 is the determined cDNA sequence for JPTPN14

SEQ ID NO:231 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN23 SEQ ID NO: 231 is the determined cDNA sequence for JPTPN23

SEQ ID NO:232 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN24 SEQ ID NO: 232 is the determined cDNA sequence for JPTPN24

SEQ ID NO:233 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN25 SEQ ID NO: 233 is the determined cDNA sequence for JPTPN25

SEQ ID NO:234 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN30 SEQ ID NO: 234 is the determined cDNA sequence for JPTPN30

SEQ ID NO:235 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN34 SEQ ID NO: 235 is the determined cDNA sequence for JPTPN34

SEQ ID NO:236 является определенной последовательностью-кДНК для PTPN35 SEQ ID NO: 236 is the determined cDNA sequence for PTPN35

SEQ ID NO:237 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN36 SEQ ID NO: 237 is the determined cDNA sequence for JPTPN36

SEQ ID NO:238 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN38 SEQ ID NO: 238 is the determined cDNA sequence for JPTPN38

SEQ ID NO:239 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN39 SEQ ID NO: 239 is the determined cDNA sequence for JPTPN39

SEQ ID NO:240 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN40 SEQ ID NO: 240 is the determined cDNA sequence for JPTPN40

SEQ ID NO:241 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN41 SEQ ID NO: 241 is the determined cDNA sequence for JPTPN41

SEQ ID NO:242 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN42 SEQ ID NO: 242 is the determined cDNA sequence for JPTPN42

SEQ ID NO:243 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN45 SEQ ID NO: 243 is the determined cDNA sequence for JPTPN45

SEQ ID NO:244 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN46 SEQ ID NO: 244 is the determined cDNA sequence for JPTPN46

SEQ ID NO:245 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN51 SEQ ID NO: 245 is the determined cDNA sequence for JPTPN51

SEQ ID NO:246 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN56 SEQ ID NO: 246 is the determined cDNA sequence for JPTPN56

SEQ ID NO:247 является определенной последовательностью-кДНК для PTPN64 SEQ ID NO: 247 is the determined cDNA sequence for PTPN64

SEQ ID NO:248 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN65 SEQ ID NO: 248 is the determined cDNA sequence for JPTPN65

SEQ ID NO:249 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN67 SEQ ID NO: 249 is the determined cDNA sequence for JPTPN67

SEQ ID NO:250 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN76 SEQ ID NO: 250 is the determined cDNA sequence for JPTPN76

SEQ ID NO:251 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN84 SEQ ID NO: 251 is the determined cDNA sequence for JPTPN84

SEQ ID NO:252 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN85 SEQ ID NO: 252 is the determined cDNA sequence for JPTPN85

SEQ ID NO:253 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN86 SEQ ID NO: 253 is the determined cDNA sequence for JPTPN86

SEQ ID NO:254 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN87 SEQ ID NO: 254 is the determined cDNA sequence for JPTPN87

SEQ ID NO:255 является определенной последовательностью-кДНК для JPTPN88 SEQ ID NO: 255 is the determined cDNA sequence for JPTPN88

SEQ ID NO:256 является определенной последовательностью-кДНК для JP1F1 SEQ ID NO: 256 is the determined cDNA sequence for JP1F1

SEQ ID NO:257 является определенной последовательностью-кДНК для JP1F2 SEQ ID NO: 257 is the determined cDNA sequence for JP1F2

SEQ ID NO:258 является определенной последовательностью-кДНК для JP1C2 SEQ ID NO: 258 is the determined cDNA sequence for JP1C2

SEQ ID NO:259 является определенной последовательностью-кДНК для JP1B1 SEQ ID NO: 259 is the determined cDNA sequence for JP1B1

SEQ ID NO:260 является определенной последовательностью-кДНК для JP1B2 SEQ ID NO: 260 is the determined cDNA sequence for JP1B2

SEQ ID NO:261 является определенной последовательностью-кДНК для JP1D3 SEQ ID NO: 261 is the determined cDNA sequence for JP1D3

SEQ ID NO:262 является определенной последовательностью-кДНК для JP1A4 SEQ ID NO: 262 is the determined cDNA sequence for JP1A4

SEQ ID NO:263 является определенной последовательностью-кДНК для JP1F5 SEQ ID NO: 263 is the determined cDNA sequence for JP1F5

SEQ ID NO:264 является определенной последовательностыо-кДНК для JP1E6 SEQ ID NO: 264 is the determined cDNA for posledovatelnostyo JP1E6

SEQ ID NO:265 является определенной последовательностью-кДНК для JP1D6 SEQ ID NO: 265 is the determined cDNA sequence for JP1D6

SEQ ID NO:266 является определенной последовательностью-кДНК для JP1B5 SEQ ID NO: 266 is the determined cDNA sequence for JP1B5

SEQ ID NO:267 является определенной последовательностью-кДНК для JP1A6 SEQ ID NO: 267 is the determined cDNA sequence for JP1A6

SEQ ID NO:268 является определенной последовательностью-кДНК для JP1E8 SEQ ID NO: 268 is the determined cDNA sequence for JP1E8

SEQ ID NO:269 является определенной последовательностью-кДНК для JP1D7 SEQ ID NO: 269 is the determined cDNA sequence for JP1D7

SEQ ID NO:270 является определенной последовательностью-кДНК для JP1D9 SEQ ID NO: 270 is the determined cDNA sequence for JP1D9

SEQ ID NO:271 является определенной последовательностью-кДНК для JP1C10 SEQ ID NO: 271 is the determined cDNA sequence for JP1C10

SEQ ID NO:272 является определенной последовательностью-кДНК для JP1A9 SEQ ID NO: 272 is the determined cDNA sequence for JP1A9

SEQ ID NO:273 является определенной последовательностыо-кДНК для JP1F12 SEQ ID NO: 273 is the determined cDNA for posledovatelnostyo JP1F12

SEQ ID NO:274 является определенной последовательностью-кДНК для JP1E12 SEQ ID NO: 274 is the determined cDNA sequence for JP1E12

SEQ ID NO:275 является определенной последовательностью-кДНК для JP1D11 SEQ ID NO: 275 is the determined cDNA sequence for JP1D11

SEQ ID NO:276 является определенной последовательностью-кДНК для JP1C11 SEQ ID NO: 276 is the determined cDNA sequence for JP1C11

SEQ ID NO:277 является определенной последовательностью-кДНК для JP1C12 SEQ ID NO: 277 is the determined cDNA sequence for JP1C12

SEQ ID NO:278 является определенной последовательностью-кДНК для JP1B12 SEQ ID NO: 278 is the determined cDNA sequence for JP1B12

SEQ ID NO:279 является определенной последовательностью-кДНК для JP1A12 SEQ ID NO: 279 is the determined cDNA sequence for JP1A12

SEQ ID NO:280 является определенной последовательностью-кДНК для JP8G2 SEQ ID NO: 280 is the determined cDNA sequence for JP8G2

SEQ ID NO:281 является определенной последовательностью-кДНК для JP8H1 SEQ ID NO: 281 is the determined cDNA sequence for JP8H1

SEQ ID NO:282 является определенной последовательностью-кДНК для JP8H2 SEQ ID NO: 282 is the determined cDNA sequence for JP8H2

SEQ ID NO:283 является определенной последовательностью-кДНК для JP8A3 SEQ ID NO: 283 is the determined cDNA sequence for JP8A3

SEQ ID NO:284 является определенной последовательностью-кДНК для JP8A4 SEQ ID NO: 284 is the determined cDNA sequence for JP8A4

SEQ ID NO:285 является определенной последовательностью-кДНК для JP8C3 SEQ ID NO: 285 is the determined cDNA sequence for JP8C3

SEQ ID NO:286 является определенной последовательностью-кДНК для JP8G4 SEQ ID NO: 286 is the determined cDNA sequence for JP8G4

SEQ ID NO:287 является определенной последовательностью-кДНК для JP8B6 SEQ ID NO: 287 is the determined cDNA sequence for JP8B6

SEQ ID NO:288 является определенной последовательностью-кДНК для JP8D6 SEQ ID NO: 288 is the determined cDNA sequence for JP8D6

SEQ ID NO:289 является определенной последовательностью-кДНК для JP8F5 SEQ ID NO: 289 is the determined cDNA sequence for JP8F5

SEQ ID NO:290 является определенной последовательностью-кДНК для JP8A8 SEQ ID NO: 290 is the determined cDNA sequence for JP8A8

SEQ ID NO:291 является определенной последовательностью-кДНК для JP8C7 SEQ ID NO: 291 is the determined cDNA sequence for JP8C7

SEQ ID NO:292 является определенной последовательностью-кДНК для JP8D7 SEQ ID NO: 292 is the determined cDNA sequence for JP8D7

SEQ ID NO:293 является определенной последовательностью-кДНК для P8D8 SEQ ID NO: 293 is the determined cDNA sequence for P8D8

SEQ ID NO:294 является определенной последовательностью-кДНК для JP8E7 SEQ ID NO: 294 is the determined cDNA sequence for JP8E7

SEQ ID NO:295 является определенной последовательностью-кДНК для JP8F8 SEQ ID NO: 295 is the determined cDNA sequence for JP8F8

SEQ ID NO:296 является определенной последовательностью-кДНК для JP8G8 SEQ ID NO: 296 is the determined cDNA sequence for JP8G8

SEQ ID NO:297 является определенной последовательностью-кДНК для JP8B10 SEQ ID NO: 297 is the determined cDNA sequence for JP8B10

SEQ ID NO:298 является определенной последовательностью-кДНК для JP8C10 SEQ ID NO: 298 is the determined cDNA sequence for JP8C10

SEQ ID NO:299 является определенной последовательностью-кдНК для JP8E9 SEQ ID NO: 299 is the determined cDNA sequence for JP8E9

SEQ ID NO:300 является определенной последовательностью-кДНК для JP8E10 SEQ ID NO: 300 is the determined cDNA sequence for JP8E10

SEQ ID NO:301 является определенной последовательностью-кДНК для JP8F9 SEQ ID NO: 301 is the determined cDNA sequence for JP8F9

SEQ ID NO:302 является определенной последовательностью-кДНК для JP8H9 SEQ ID NO: 302 is the determined cDNA sequence for JP8H9

SEQ ID NO:303 является определенной последовательностью-кДНК для JP8C12 SEQ ID NO: 303 is the determined cDNA sequence for JP8C12

SEQ ID NO:304 является определенной последовательностью-кДНК для JP8E11 SEQ ID NO: 304 is the determined cDNA sequence for JP8E11

SEQ ID NO:305 является определенной последовательностью-кДНК для JP8E12 SEQ ID NO: 305 is the determined cDNA sequence for JP8E12

SEQ ID NO:306 является аминокислотной последовательностью для пептида PS2#12 SEQ ID NO: 306 is the amino acid sequence for the peptide PS2 # 12

SEQ ID NO:307 является определенной последовательностью-кДНК для Р711Р SEQ ID NO: 307 is the determined cDNA sequence for R711R

SEQ ID NO:308 является определенной последовательностью-кДНК для Р712Р SEQ ID NO: 308 is the determined cDNA sequence for R712R

SEQ ID NO:309 является определенной последовательностью-кДНК для СLONE 23 SEQ ID NO: 309 is the determined cDNA sequence for 23 SLONE

SEQ ID NO:310 является определенной последовательностью-кДНК для Р774Р SEQ ID NO: 310 is the determined cDNA sequence for R774R

SEQ ID NO:311 является определенной последовательностью-кДНК для Р775Р SEQ ID NO: 311 is the determined cDNA sequence for R775R

SEQ ID NO:312 является определенной последовательностью-кДНК для Р715Р SEQ ID NO: 312 is the determined cDNA sequence for R715R

SEQ ID NO:313 является определенной последовательностью-кДНК для Р710Р SEQ ID NO: 313 is the determined cDNA sequence for R710R

SEQ ID NO:314 является определенной последовательностью-кДНК для Р767Р SEQ ID NO: 314 is the determined cDNA sequence for R767R

SEQ ID NO:315 является определенной последовательностью-кДНК для Р768Р SEQ ID NO: 315 is the determined cDNA sequence for R768R

SEQ ID NO:316-325 являются определенными последовательностями-кДНК ранее выделенных генов SEQ ID NO: 316-325 are the determined cDNA sequences of previously-selected genes

SEQ ID NO:326 является определенной последовательностью-кДНК для P703PDE5 SEQ ID NO: 326 is the determined cDNA sequence for P703PDE5

SEQ ID NO:327 является предсказанной аминокислотной последовательностью для P703PDE5 SEQ ID NO: 327 is the predicted amino acid sequence for P703PDE5

SEQ ID NO:328 является определенной последовательностью-кДНК для Р703Р6.26 SEQ ID NO: 328 is the determined cDNA sequence for R703R6.26

SEQ ID NO:329 является предсказанной аминокислотной последовательностью для Р703Р6.26 SEQ ID NO: 329 is the predicted amino acid sequence for R703R6.26

SEQ ID NO:330 является определенной последовательностью-кДНК для Р703РХ-23 SEQ ID NO: 330 is the determined cDNA sequence for 23-R703RH

SEQ ID NO:331 является предсказанной аминокислотной последовательностью для Р703РХ-23 SEQ ID NO: 331 is the predicted amino acid sequence for R703RH-23

SEQ ID NO:332 является определенной полноразмерной последовательностью-кДНК для P509S SEQ ID NO: 332 is the determined full length cDNA sequence for P509S

SEQ ID NO:333 является определенной удлиненной последовательностью-кДНК для Р707Р (также называемой 11-С9) SEQ ID NO: 333 is the determined extended cDNA sequence for R707R (also called 11-C9)

SEQ ID NO:334 является определенной последовательностью-кДНК для Р714Р SEQ ID NO: 334 is the determined cDNA sequence for R714R

SEQ ID NO:335 является определенной последовательностью-кДНК для Р705Р (также называемой 9-F3) SEQ ID NO: 335 is the determined cDNA sequence for R705R (also referred to as 9-F3)

SEQ ID NO:336 является предсказанной аминокислотной последовательностью для Р705Р SEQ ID NO: 336 is the predicted amino acid sequence for the R705R

SEQ ID NO:337 является аминокислотной последовательностью пептида Р1S#10 SEQ ID NO: 337 is the amino acid sequence of peptide # 10 R1S

SEQ ID NO:338 является аминокислотной последовательностью пептида р5 SEQ ID NO: 338 is the amino acid sequence of the peptide p5

SEQ ID NO:339 является аминокислотной последовательностью P509S SEQ ID NO: 339 is the amino acid sequence of P509S

SEQ ID NO:340 является определенной последовательностью-кДНК для Р778Р SEQ ID NO: 340 is the determined cDNA sequence for R778R

SEQ ID NO:341 является определенной последовательностью-кДНК для Р787Р SEQ ID NO: 341 is the determined cDNA sequence for R787R

SEQ ID NO:342 является определенной последовательностью-кДНК для Р789Р SEQ ID NO: 342 is the determined cDNA sequence for R789R

SEQ ID NO:343 является определенной последовательностью-кДНК для клона, обнаруживающего гомологию с мРНК ММ46 Homo sapiens SEQ ID NO: 343 is the determined cDNA sequence for clone detecting homology to Homo sapiens mRNA MM46

SEQ ID NO:344 является определенной последовательностью-кДНК для клона, обнаруживающего гомологию с мРНК белка АВС (АВС50), стимулируемой TNF-альфа Homo sapiens SEQ ID NO: 344 is the determined cDNA sequence for clone detecting mRNA of protein homology with ABC (AVS50) stimulated TNF-alpha Homo sapiens

SEQ ID NO:345 является определенной последовательностью-кДНК для клона, обнаруживающего гомологию с мРНК Е-кадхерина Homo sapiens SEQ ID NO: 345 is the determined cDNA sequence for clone detecting homology to E-cadherin mRNA Homo sapiens

SEQ ID NO:346 является определенной последовательностью-кДНК для клона, обнаруживающего гомологию с ядерно-кодируемой митохондриальной серингидроксиметилтрансферазой (SHMT) человека SEQ ID NO: 346 is the specific-cDNA sequence for clone detecting homology with nuclear encoded mitochondrial seringidroksimetiltransferazoy (SHMT) Human

SEQ ID NO:347 является определенной последовательностью-кДНК для клона, обнаруживающего гомологию с природным связанным с устойчивостью белком 2 макрофагов (NRAMP2) Homo sapiens SEQ ID NO: 347 is the determined cDNA sequence for clone detecting homology with the natural resistance associated with macrophage protein 2 (NRAMP2) Homo sapiens

SEQ ID NO:348 является определенной последовательностью-кДНК для клона, обнаруживающего гомологию с фосфоглюкомутаза-родственным белком (PGMRP) Homo sapiens SEQ ID NO: 348 is the determined cDNA sequence for clone detecting homology with phosphoglucomutase-related protein (PGMRP) Homo sapiens

SEQ ID NO:349 является определенной последовательностью-кДНК для клона, обнаруживающего гомологию с мРНК для субъединицы протеосомы р40 человека SEQ ID NO: 349 is the determined cDNA sequence for clone homology with the detection of mRNA for proteasome subunit p40 of human

SEQ ID NO:350 является определенной последовательностью-кДНК для Р777Р SEQ ID NO: 350 is the determined cDNA sequence for R777R

SEQ ID NO:351 является определенной последовательностью-кДНК для Р779Р SEQ ID NO: 351 is the determined cDNA sequence for R779R

SEQ ID NO:352 является определенной последовательностью-кДНК для Р790Р SEQ ID NO: 352 is the determined cDNA sequence for R790R

SEQ ID NO:353 является определенной последовательностью-кДНК для Р784Р SEQ ID NO: 353 is the determined cDNA sequence for R784R

SEQ ID NO:354 является определенной последовательностью-кДНК для Р776Р SEQ ID NO: 354 is the determined cDNA sequence for R776R

SEQ ID NO:355 является определенной последовательностью-кДНК для Р780Р SEQ ID NO: 355 is the determined cDNA sequence for R780R

SEQ ID NO:356 является определенной последовательностью-кДНК для P544S SEQ ID NO: 356 is the determined cDNA sequence for P544S

SEQ ID NO:357 является определенной последовательностью-кДНК для P745S SEQ ID NO: 357 is the determined cDNA sequence for P745S

SEQ ID NO:358 является определенной последовательностью-кДНК для Р782Р SEQ ID NO: 358 is the determined cDNA sequence for R782R

SEQ ID NO:359 является определенной последовательностью-кДНК для Р783Р SEQ ID NO: 359 is the determined cDNA sequence for R783R

SEQ ID NO:360 является определенной последовательностью-кДНК для неизвестного 17984 SEQ ID NO: 360 is the determined cDNA sequence for unknown 17984

SEQ ID NO:361 является определенной последовательностью-кДНК для Р787Р SEQ ID NO: 361 is the determined cDNA sequence for R787R

SEQ ID NO:362 является определенной последовательностью-кДНК для Р788Р SEQ ID NO: 362 is the determined cDNA sequence for R788R

SEQ ID NO:363 является определенной последовательностью-кДНК для неизвестного 17994 SEQ ID NO: 363 is the determined cDNA sequence for unknown 17994

SEQ ID NO:364 является определенной последовательностью-кДНК для Р781Р SEQ ID NO: 364 is the determined cDNA sequence for R781R

SEQ ID NO:365 является определенной последовательностью-кДНК для Р785Р SEQ ID NO: 365 is the determined cDNA sequence for R785R

SEQ ID NO:366-375 являются определенными последовательностями-кДНК для сплайсинговых вариантов B305D SEQ ID NO: 366-375 are the determined cDNA sequences for splice variants of B305D

SEQ ID NO:376 является предсказанной аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:366 SEQ ID NO: 376 is the predicted amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 366

SEQ ID NO:377 является предсказанной аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:372 SEQ ID NO: 377 is the predicted amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 372

SEQ ID NO:378 является предсказанной аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:373 SEQ ID NO: 378 is the predicted amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 373

SEQ ID NO:379 является предсказанной аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:374 SEQ ID NO: 379 is the predicted amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 374

SEQ ID NO:380 является предсказанной аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:375 SEQ ID NO: 380 is the predicted amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 375

SEQ ID NO:381 является определенной последовательностью-кДНК для В716Р SEQ ID NO: 381 is the determined cDNA sequence for V716R

SEQ ID NO:382 является определенной полноразмерной последовательностью-кДНК для Р711Р SEQ ID NO: 382 is the determined full length cDNA sequence for R711R

SEQ ID NO:383 является предсказанной аминокислотной последовательностью для Р711Р SEQ ID NO: 383 is the predicted amino acid sequence for the R711R

SEQ ID NO:384 является последовательностью-кДНК для Р1000С SEQ ID NO: 384 is the cDNA sequence for R1000S

SEQ ID NO:385 является последовательностью-кДНК для CGI-82 SEQ ID NO: 385 is the cDNA sequence for CGI-82

SEQ ID NO:386 является последовательностью-кДНК для 23320 SEQ ID NO: 386 is the cDNA sequence for 23320

SEQ ID NO:387 является последовательностью-кДНК для CGI-69 SEQ ID NO: 387 is the cDNA sequence for the CGI-69

SEQ ID NO:388 является последовательностью-кДНК для 1-идитол-2-дегидрогеназы SEQ ID NO: 388 is the cDNA sequence for 1-iditol-2-dehydrogenase

SEQ ID NO:389 является последовательностью-кДНК для 23379 SEQ ID NO: 389 is the cDNA sequence for 23379

SEQ ID NO:390 является последовательность-кДНК для 23381 SEQ ID NO: 390 is the cDNA sequence for 23381

SEQ ID NO:391 является последовательностью-кДНК для KIAA0122 SEQ ID NO: 391 is the cDNA sequence for KIAA0122

SEQ ID NO:392 является последовательность-кДНК для 23399 SEQ ID NO: 392 is the cDNA sequence for 23399

SEQ ID NO:393 является последовательностью-кДНК для ранее идентифицированного гена SEQ ID NO: 393 is the cDNA sequence for a previously identified gene

SEQ ID NO:394 является последовательностью-кДНК для HCLBP SEQ ID NO: 394 is the cDNA sequence for HCLBP

SEQ ID NO:395 является последовательностью-кДНК для транс-глутаминазы SEQ ID NO: 395 is the cDNA sequence for trans-glutaminase

SEQ ID NO:396 является последовательностью-кДНК для ранее идентифицированного гена SEQ ID NO: 396 is the cDNA sequence for a previously identified gene

SEQ ID NO:397 является последовательностью-кДНК для РАР SEQ ID NO: 397 is the cDNA sequence for PAP

SEQ ID NO:398 является последовательностью-кДНК для Ets фактора транскрипции PDEF SEQ ID NO: 398 is the cDNA sequence for Ets transcription factor PDEF

SEQ ID NO:399 является последовательностью-кДНК для hTGR SEQ ID NO: 399 is the cDNA sequence for hTGR

SEQ ID NO:400 является последовательностью-кДНК для KIAA0295 SEQ ID NO: 400 is the cDNA sequence for KIAA0295

SEQ ID NO:401 является последовательностью-кДНК для 22545 SEQ ID NO: 401 is the cDNA sequence for 22545

SEQ ID NO:402 является последовательностью-кДНК для 22547 SEQ ID NO: 402 is the cDNA sequence for 22547

SEQ ID NO:403 является последовательностью-кДНК для 22548 SEQ ID NO: 403 is the cDNA sequence for 22548

SEQ ID NO:404 является последовательностью-кДНК для 22550 SEQ ID NO: 404 is the cDNA sequence for 22550

SEQ ID NO:405 является последовательностью-кДНК для 22551 SEQ ID NO: 405 is the cDNA sequence for 22551

SEQ ID NO:406 является последовательностью-кДНК для 22552 SEQ ID NO: 406 is the cDNA sequence for 22552

SEQ ID NO:407 является последовательностью-кДНК для 22553 SEQ ID NO: 407 is the cDNA sequence for 22553

SEQ ID NO:408 является последовательностью-кДНК для 22558 SEQ ID NO: 408 is the cDNA sequence for 22558

SEQ ID NO:409 является последовательностью-кДНК для 22562 SEQ ID NO: 409 is the cDNA sequence for 22562

SEQ ID NO:410 является последовательностью-кДНК для 22565 SEQ ID NO: 410 is the cDNA sequence for 22565

SEQ ID NO:411 является последовательностью-кДНК для 22567 SEQ ID NO: 411 is the cDNA sequence for 22567

SEQ ID NO:412 является последовательностью-кДНК для 22568 SEQ ID NO: 412 is the cDNA sequence for 22568

SEQ ID NO:413 является последовательностью-кДНК для 22570 SEQ ID NO: 413 is the cDNA sequence for 22570

SEQ ID NO:414 является последовательностью-кДНК для 22571 SEQ ID NO: 414 is the cDNA sequence for 22571

SEQ ID NO:415 является последовательностью-кДНК для 22572 SEQ ID NO: 415 is the cDNA sequence for 22572

SEQ ID NO:416 является последовательностью-кДНК для 22573 SEQ ID NO: 416 is the cDNA sequence for 22573

SEQ ID NO:417 является последовательностью-кДНК для 22574 SEQ ID NO: 417 is the cDNA sequence for 22574

SEQ ID NO:418 является последовательностью-кДНК для 22575 SEQ ID NO: 418 is the cDNA sequence for 22575

SEQ ID NO:419 является последовательностью-кДНК для 22580 SEQ ID NO: 419 is the cDNA sequence for 22580

SEQ ID NO:420 является последовательностью-кДНК для 22581 SEQ ID NO: 420 is the cDNA sequence for 22581

SEQ ID NO:421 является последовательностью-кДНК для 22582 SEQ ID NO: 421 is the cDNA sequence for 22582

SEQ ID NO:422 является последовательностью-кДНК для 22583 SEQ ID NO: 422 is the cDNA sequence for 22583

SEQ ID NO:423 является последовательностью-кДНК для 22584 SEQ ID NO: 423 is the cDNA sequence for 22584

SEQ ID NO:424 является последовательностью-кДНК для 22585 SEQ ID NO: 424 is the cDNA sequence for 22585

SEQ ID NO:425 является последовательностью-кДНК для 22586 SEQ ID NO: 425 is the cDNA sequence for 22586

SEQ ID NO:426 является последовательностью-кДНК для 22587 SEQ ID NO: 426 is the cDNA sequence for 22587

SEQ ID NO:427 является последовательностью-кДНК для 22588 SEQ ID NO: 427 is the cDNA sequence for 22588

SEQ ID NO:428 является последовательностью-кДНК для 22589 SEQ ID NO: 428 is the cDNA sequence for 22589

SEQ ID NO:429 является последовательностью-кДНК для 22590 SEQ ID NO: 429 is the cDNA sequence for 22590

SEQ ID NO:430 является последовательностью-кДНК для 22591 SEQ ID NO: 430 is the cDNA sequence for 22591

SEQ ID NO:431 является последовательностью-кДНК для 22592 SEQ ID NO: 431 is the cDNA sequence for 22592

SEQ ID NO:432 является последовательностью-кДНК для 22593 SEQ ID NO: 432 is the cDNA sequence for 22593

SEQ ID NO:433 является последовательностью-кДНК для 22594 SEQ ID NO: 433 is the cDNA sequence for 22594

SEQ ID NO:434 является последовательностью-кДНК для 22595 SEQ ID NO: 434 is the cDNA sequence for 22595

SEQ ID NO:435 является последовательностью-кДНК для 22596 SEQ ID NO: 435 is the cDNA sequence for 22596

SEQ ID NO:436 является последовательностью-кДНК для 22847 SEQ ID NO: 436 is the cDNA sequence for 22847

SEQ ID NO:437 является последовательностью-кДНК для 22848 SEQ ID NO: 437 is the cDNA sequence for 22848

SEQ ID NO:438 является последовательностью-кДНК для 22849 SEQ ID NO: 438 is the cDNA sequence for 22849

SEQ ID NO:439 является последовательностью-кДНК для 22851 SEQ ID NO: 439 is the cDNA sequence for 22851

SEQ ID NO:440 является последовательностью-кДНК для 22852 SEQ ID NO: 440 is the cDNA sequence for 22852

SEQ ID NO:441 является последовательностью-кДНК для 22853 SEQ ID NO: 441 is the cDNA sequence for 22853

SEQ ID NO:442 является последовательностью-кДНК для 22854 SEQ ID NO: 442 is the cDNA sequence for 22854

SEQ ID NO:443 является последовательностью-кДНК для 22855 SEQ ID NO: 443 is the cDNA sequence for 22855

SEQ ID NO:444 является последовательностью-кДНК для 22856 SEQ ID NO: 444 is the cDNA sequence for 22856

SEQ ID NO:445 является последовательностью-кДНК для 22857 SEQ ID NO: 445 is the cDNA sequence for 22857

SEQ ID NO:446 является последовательностью-кДНК для 23601 SEQ ID NO: 446 is the cDNA sequence for 23601

SEQ ID NO:447 является последовательностью-кДНК для 23602 SEQ ID NO: 447 is the cDNA sequence for 23602

SEQ ID NO:448 является последовательностью-кДНК для 23605 SEQ ID NO: 448 is the cDNA sequence for 23605

SEQ ID NO:449 является последовательностью-кДНК для 23606 SEQ ID NO: 449 is the cDNA sequence for 23606

SEQ ID NO:450 является последовательностью-кДНК для 23612 SEQ ID NO: 450 is the cDNA sequence for 23612

SEQ ID NO:451 является последовательностью-кДНК для 23614 SEQ ID NO: 451 is the cDNA sequence for 23614

SEQ ID NO:452 является последовательностью-кДНК для 23618 SEQ ID NO: 452 is the cDNA sequence for 23618

SEQ ID NO:453 является последовательностью-кДНК для 23622 SEQ ID NO: 453 is the cDNA sequence for 23622

SEQ ID NO:454 является последовательностью-кДНК для фолатгидролазы SEQ ID NO: 454 is the cDNA sequence for folatgidrolazy

SEQ ID NO:455 является последовательностью-кДНК для белка LIM SEQ ID NO: 455 is the cDNA sequence for LIM protein

SEQ ID NO:456 является последовательностью-кДНК для известного гена SEQ ID NO: 456 is the cDNA sequence for a known gene

SEQ ID NO:457 является последовательностью-кДНК для известного гена SEQ ID NO: 457 is the cDNA sequence for a known gene

SEQ ID NO:458 является последовательностью-кДНК для ранее идентифицированного гена SEQ ID NO: 458 is the cDNA sequence for a previously identified gene

SEQ ID NO:459 является последовательностью-кДНК для 23045 SEQ ID NO: 459 is the cDNA sequence for 23045

SEQ ID NO:460 является последовательностыо-кДНК для 23032 SEQ ID NO: 460 is the cDNA for posledovatelnostyo 23032

SEQ ID NO:461 является последовательностыо-кДНК для 23054 SEQ ID NO: 461 is the cDNA for posledovatelnostyo 23054

SEQ ID NO:462-467 являются последовательностями-кДНК для известных генов SEQ ID NO: 462-467 are cDNA sequences for known genes

SEQ ID NO:468-471 являются последовательностями-кДНК для Р710Р SEQ ID NO: 468-471 are cDNA sequences for R710R

SEQ ID NO:472 является последовательностью-кДНК для Р1001С. SEQ ID NO: 472 is the cDNA sequence for R1001S.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Как отмечалось выше, данное изобретение относится, в общем, к композициям и способам для терапии и диагностики рака, такого как рак предстательной железы. As noted above, the present invention relates generally to compositions and methods for therapy and diagnosis of cancer, such as prostate cancer. Описанные здесь композиции могут включать в себя опухолевые полипептиды предстательной железы, полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, связывающие агенты, такие как антитела, антиген-презентирующие клетки (АРС) и/или клетки иммунной системы (например, Т-клетки). The compositions described herein may include polypeptides tumor prostate, polynucleotides encoding such polypeptides, binding agents such as antibodies, antigen presenting cells (APC), and / or immune system cells (e.g., T cells). Полипептиды данного изобретения обычно содержат, по меньшей мере, часть (такую как иммуногенная часть) опухолевого белка предстательной железы или его вариант. Polypeptides of the invention typically comprise at least a portion (such as an immunogenic portion) of the prostate tumor protein or a variant thereof. “Опухолевый белок предстательной железы” представляет собой белок, который экспрессируется в клетках опухоли предстательной железы на уровне, который является, по меньшей мере, в 2 раза более высоким и предпочтительно, по меньшей мере, в пять раз более высоким, чем уровень экспрессии в нормальной ткани, как определено с использованием репрезентативного анализа, обеспеченного здесь. "Tumor protein of the prostate" is a protein that is expressed in prostatic tumor cells at a level that is at least 2 times higher, more preferably at least five times higher than the expression level in normal tissue, as determined using a representative assay provided herein. Некоторые опухолевые белки предстательной железы являются опухолевыми белками, которые определяемо реагируют (в иммуноанализе, таком как ELISA или Вестерн-блот) с антисыворотками пациента, имеющего рак предстательной железы. Some prostate tumor proteins are tumor proteins that react detectably (in an immunoassay, such as ELISA or Western blot) with antisera of a patient having prostate cancer. Полинуклеотиды данного изобретения обычно содержат последовательность ДНК или РНК, которая кодирует весь такой полипептид или часть такого полипептида или которая является комплементарной такой последовательности. Polynucleotides of the present invention generally comprise a DNA or RNA sequence that encodes the entire polypeptide or a portion of such a polypeptide or which is complementary to such a sequence. Антитела обычно являются белками иммунной системы или их антигенсвязывающими фрагментами, которые способны связываться с полипептидом, описанным выше. Antibodies are generally immune system proteins, or antigen-binding fragments that are capable of binding to the polypeptide described above. Антиген-презентирующие клетки включают в себя дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-клетки, экспрессирующие полипептид, описанный выше. Antigen-presenting cells include dendritic cells, macrophages, monocytes, fibroblasts and B cells expressing the polypeptide described above. Т-клетки, которые могут использоваться в таких композициях, обычно являются Т-клетками, которые являются специфическими в отношении полипептида, описанного выше. T cells that may be used in such compositions are generally T cells which are specific for the polypeptide described above.

Данное изобретение основано на открытии опухолевых белков предстательной железы. The present invention is based on the discovery of prostate tumor protein. Последовательности полинуклеотидов, кодирующих некоторые опухолевые белки, или их части, обеспечены в последовательностях SEQ ID NO:1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 382 или 384-472. Sequences of polynucleotides encoding some tumor proteins, or portions thereof, are provided in the sequences SEQ ID NO: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335 , 340-375, 382 and 384-472. Последовательности полипептидов, содержащих, по меньшей мере, часть опухолевого белка, обеспечены в последовательностях SEQ ID NO:112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380 и 383. The sequences of polypeptides comprising at least a portion of a tumor protein sequences are provided in SEQ ID NO: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 383 and 376-380.

ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ ОПУХОЛЕВОГО БЕЛКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Polynucleotides TUMOR PROTEIN PROSTATE

Любой полинуклеотид, кодирующий опухолевый белок предстательной железы или его часть или вариант, описанный здесь, включен в данное изобретение. Any polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate or a portion or variant described herein, is incorporated herein. Предпочтительные полинуклеотиды содержат, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, 30 последовательных нуклеотидов и более предпочтительно, по меньшей мере, 45 последовательных нуклеотидов, которые кодируют часть опухолевого белка предстательной железы. Preferred polynucleotides comprise at least 15 consecutive nucleotides, preferably at least 30 consecutive nucleotides and more preferably at least 45 consecutive nucleotides, that encode a portion of a prostate tumor protein. Более предпочтительно, полинуклеотид кодирует иммуногенную часть опухолевого белка предстательной железы. More preferably, a polynucleotide encodes an immunogenic portion of a prostate tumor protein. Полинуклеотиды, комплементарные любой такой последовательности, также включены в данное изобретение. Polynucleotides complementary to any such sequences are also included in this invention. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут быть ДНК- (геномными, кДНК- или синтетическими) или РНК-молекулами. Polynucleotides may be single-stranded (coding or antisense) or double-stranded and may be DNA (genomic, cDNA or synthetic) or RNA molecules. РНК-молекулы включают в себя молекулы гяRNА, которые содержат интроны и соответствуют ДНК-молекуле, как один к одному, и мРНК-молекулами, которые не содержат интронов. RNA molecules include gyaRNA molecules which contain introns and correspond to a DNA molecule as one to one, and mRNA molecules, which do not contain introns. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но необязательно, присутствовать в полинуклеотиде данного изобретения, и полинуклеотид может быть, но необязательно, связан с другими молекулами и/или веществами-носителями. Additional coding or non-coding sequences may, but need not, be present in a polynucleotide of the present invention, and a polynucleotide may, but not necessarily, linked to other molecules and / or carrier substances.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует опухолевый белок предстательной железы или его часть), или могут содержать вариант такой последовательности. Polynucleotides may comprise a native sequence (i.e. an endogenous sequence that encodes a tumor protein of the prostate or a portion thereof) or may comprise a variant of such a sequence. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или несколько замен, добавлений, делений и/или инсерций (вставок), так чтобы иммногенность кодируемого полипептида не уменьшалась относительно нативного опухолевого белка. Polynucleotide variants may contain one or more substitutions, additions, divisions and / or insertions (inserts), so that immnogennost encoded polypeptide is not diminished relative to a native tumor protein. Действие на иммуногенность кодируемого полипептида может обычно оцениваться, как описано здесь. Effect on the immunogenicity of the encoded polypeptide may generally be assessed as described herein. Варианты предпочтительно обнаруживают приблизительно 70% идентичность, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичность и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90% идентичность полинуклеотидной последовательности, кодирующей нативный опухолевый белок предстательной железы или его часть. Variants preferably exhibit about 70% identity, more preferably at least about 80% identity and most preferably at least about 90% identity to a polynucleotide sequence encoding a native tumor protein of the prostate or a portion thereof.

Говорят, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются “идентичными”, если последовательность нуклеотидов или аминокислот в этих двух последовательностях является одинаковой при сопоставлении для максимального соответствия, как описано ниже. We say that two polynucleotide or polypeptide sequences are "identical" if the sequence of nucleotides or amino acids in the two sequences is the same when compared for maximum correspondence as described below. Сравнения между двумя последовательностями обычно выполняют путем сравнения этих последовательностей на протяжении окна сравнения для идентификации и сравнения локальных районов сходства последовательностей. Comparisons between two sequences are typically performed by comparing the sequences over a comparison window to identify and compare local regions of sequence similarity. “Окно сравнения” в применении здесь относится к сегменту из, по меньшей мере, 20 смежных (непрерывных) положений, обычно от 30 до приблизительно 75, от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность может сравниваться со сравниваемой последовательностью из такого же числа смежных (непрерывных) положений после оптимального выравнивания этих двух последовательностей. "Comparison window" as used herein refers to a segment of at least 20 contiguous (continuous) positions, usually 30 to about 75, from 40 to about 50, wherein the sequence can be compared with the comparison sequence of the same number of adjacent ( continuous) positions after optimal alignment of the two sequences.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть выполнено с использованием программы Megalign в комплекте Lasergene программного обеспечения биоинформатики (DNASTAR, Inc. Madison, WI) с использованием параметров по умолчанию. Optimal alignment of sequences for comparison can be performed using the Megalign program in the Lasergene software bundled bioinformatics (DNASTAR, Inc. Madison, WI) using the default parameters. Эта программа включает в себя несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: Dayhoff, М.О. The program includes several alignment schemes described in the following references: Dayhoff, MO (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. В Dayhoff, MO (ed.) Atlas of Protein Sequences and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; In Dayhoff, MO (ed.) Atlas of Protein Sequences and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, DG and Sharp, PM (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins, DG and Sharp, PM (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, EW and Muller W. (1988) CABIOC 4:11-17; Myers, EW and Muller W. (1988) CABIOC 4: 11-17; Robinson, ED (1971) Comb. Robinson, ED (1971) Comb. Theor 11:105; Theor 11: 105; Santou, N, Nes, M. (1987) Mol. Santou, N, Nes, M. (1987) Mol. Biol. Biol. Evol. Evol. 4:406-425; 4: 406-425; Sneath, PHA and Sokal, RR (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy. Sneath, PHA and Sokal, RR (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy. Freeman Press, San Francisco, CA; Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, WJ and Lipman, DJ (1983) Proc. Wilbur, WJ and Lipman, DJ (1983) Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 80:726-730. USA 80: 726-730.

Предпочтительно “процент идентичности последовательности” определяют путем сравнения двух оптимально выравненных последовательностей над окном сравнения из, по меньшей мере, 20 положений, причем доля полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы (промежутки)), составляющие 20% или менее, обычно 5-15% или 10-12%, в сравнении со ссылочной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Preferably, the "percentage of sequence identity" is determined by comparing two optimally aligned sequences over a comparison window of at least 20 positions, wherein the proportion of the polynucleotide or polypeptide sequence in the comparison window may comprise additions or deletions (i.e., gaps (spaces)), is 20% or less, typically 5-15% or 10-12% compared to the reference sequence (which does not comprise additions or deletions) for optimal alignment of the two sequences. Указанный процент рассчитывают путем определения числа положений, при которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в ссылочной последовательности (например, с размером окна) и умножения этих результатов на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Said percentage is calculated by determining the number of positions at which the identical nucleic acid bases or amino acid residues occur in both sequences to yield the number of matched positions, dividing the number of matched positions by the total number of positions in the reference sequence (e.g., the window size), and multiplying these results by 100 to yield the percentage of sequence identity.

Варианты могут быть также или альтернативно по существу гомологичными нативному гену или его части или комплементу. Variants may also, or alternatively, be substantially homologous to a native gene, or a portion or complement. Такие полинуклеотидные варианты способны гибридизоваться при умеренно жестких условиях с природно встречающейся последовательностью ДНК, кодирующей нативный опухолевый белок предстательной железы (или комплементарной последовательностью). Such polynucleotide variants are capable of hybridizing under moderately stringent conditions to a naturally occurring DNA sequence encoding a native tumor protein of the prostate (or complementary sequence). Подходящие умеренно жесткие условия включают в себя предварительное промывание в растворе 5×SSC, 0,5% ДСН, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0); Suitable moderately stringent conditions include pre-washing in a solution of 5 × SSC, 0,5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0); гибридизацию при 50-65°С, 5×SSC, в течение ночи; hybridizing at 50-65 ° C, 5 × SSC, overnight; с последующим промыванием дважды при 65°С в течение 20 минут каждым из 2х, 0,5х и 0,2х SSC, содержащим 0,1% ДСН. followed by washing twice at 65 ° C for 20 minutes each of 2x, 0.5x and 0.2 × SSC, containing 0.1% SDS.

Средним специалистам в данной области должно быть понятно, что вследствие вырожденности генетического кода имеется много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют описанный здесь полипептид. Ordinary skill in the art will appreciate that due to the degeneracy of the genetic code, there are many nucleotide sequences that encode a polypeptide as described herein. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию относительно любого нативного гена. Some of these polynucleotides have minimal homology to any native gene. Тем не менее полинуклеотиды, которые отличаются вследствие различий в использовании кодонов, особо рассматриваются данным изобретением. Nonetheless, polynucleotides that vary due to differences in codon usage, particularly contemplated by the invention. Далее, аллели генов, содержащие обеспеченные здесь полинуклеотидные последовательности, находятся в объеме данного изобретения. Further, alleles of the genes comprising the polynucleotide sequences provided herein are within the scope of this invention. Аллели являются эндогенными генами, которые изменены в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Alleles are endogenous genes that are altered as a result of one or more mutations, such as deletions, additions and / or substitutions of nucleotides. Полученные мРНК и белок могут, но необязательно, иметь измененные структуру или функцию. The resulting mRNA and protein may, but need not, have an altered structure or function. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных способов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей баз данных). Alleles may be identified using standard techniques (such as hybridization, amplification and / or database sequence comparison).

Полинуклеотиды могут быть получены любым из различных способов. Polynucleotides may be prepared by any of various methods. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован, как описано более подробно ниже, посредством скрининга микроматрицы кДНК на связанную с опухолями экспрессию (т.е. экспрессию, которая является, по меньшей мере, в пять раз более высокой в опухоли предстательной железы, чем в нормальной ткани, как определено с помощью показательного анализа, описанного здесь). For example, a polynucleotide may be identified, as described in more detail below, by screening a cDNA microarray expression associated with tumors (i.e., expression that is at least five times higher in prostate tumor than in normal tissue as determined via an exponential analysis described herein). Такие скрининги могут быть выполнены с использованием микроматрицы Synteni (Palo Alto, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя (и по существу, как описано Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 и Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997). Such screenings can be performed using a microarray Synteni (Palo Alto, CA) according to manufacturer's instructions (and essentially as described by Schena et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:..... 10614-10619, 1996 and Heller et al, Proc Natl Acad Sci USA 94:..... 2150-2155, 1997). Альтернативно, полипептиды могут быть амплифицированы из кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих описанные здесь белки, таких как опухолевые клетки предстательной железы. Alternatively, polypeptides may be amplified from cDNA prepared from cells expressing the proteins described herein, such as prostate tumor cells. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Such polynucleotides may be amplified via polymerase chain reaction (PCR). Для указанного подхода могут быть сконструированы последовательность-специфические праймеры на основе обеспеченных здесь последовательностей или они могут быть куплены или синтезированы. For this approach can be designed sequence-specific primers based on the sequences provided herein, or they may be purchased or synthesized.

Амплифицированный белок может быть использован для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК опухоли предстательной железы) с использованием хорошо известных способов. The amplified protein can be used to isolate a full length gene from a suitable library (e.g., a tumor cDNA library prostate) using well known techniques. В таких способах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов или праймеров, пригодных для амплификации. In such methods, a library (cDNA or genomic) is screened using one or more polynucleotide probes or primers suitable for amplification. Предпочтительно библиотека является выбранной по размеру таким образом, чтобы она включала в себя более крупные молекулы. Preferably the library is selected in size so as to include a larger molecule. Случайно праймированные библиотеки могут быть предпочтительными для идентификации 5'-районов гена и районов гена, лежащих выше по ходу транскрипции. Randomly primed library may be preferred for identifying 5 'regions of the gene and the gene regions lying upstream of the transcription. Геномные библиотеки являются предпочтительными для получения интронов и удлинения 5'-последовательностей. Genomic libraries are preferred for obtaining introns and 5 'extension sequences.

Для способов гибридизации частичная последовательность может быть меченной (например, ник-трансляцией или концевым мечением 32 Р) с использованием хорошо известных способов. For hybridization methods partial sequence may be labeled (e.g., nick translation or end-labeling with 32 P) using well known techniques. Затем бактериальную или бактериофаговую библиотеку подвергают скринингу при помощи фильтров для гибридизации, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или “газоны”, содержащие фаговые бляшки), с меченым зондом (Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Then, bacterial or bacteriophage library was screened using the filter hybridization containing denatured bacterial colonies (or "lawns" containing phage plaques) with the labeled probe (Sambrook et al, Molecular Cloning;. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Гибридизующиеся колонии или бляшки отбирают и размножают и ДНК выделяют для последующего анализа. Hybridizing colonies or plaques are selected and expanded, and the DNA is isolated for further analysis.

Клоны кДНК могут быть анализированы для определения количества дополнительной последовательности, например, при помощи ПЦР с использованием праймера из частичной последовательности и праймера из вектора. cDNA clones may be analyzed to determine the amount of additional sequence, e.g., by PCR using a primer from the partial sequence and a primer from the vector. Рестрикционные карты и частичные последовательности могут быть генерированы для идентификации одного или нескольких перекрывающихся клонов. Restriction maps and partial sequences may be generated to identify one or more overlapping clones. Затем может быть определена полная последовательность с использованием стандартных способов, которые могут включать в себя генерирование ряда делеционных клонов. The complete sequence may then be determined using standard techniques, which may involve generating a series of deletion clones. Затем полученные перекрывающиеся последовательности собирают в единую непрерывную последовательность. Then, the resulting overlapping sequences are collected into a single contiguous sequence. Полноразмерная кДНК-молекула может быть генерирована лигированием подходящих фрагментов с использованием хорошо известных способов. The full-length cDNA molecule can be generated by ligating suitable fragments, using well known techniques.

Альтернативно, существуют многочисленные способы амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. Alternatively, there are numerous amplification techniques for obtaining a full length coding sequence from a partial cDNA sequence. В таких способах амплификацию обычно выполняют посредством ПЦР. In such processes typically operate amplification by PCR. Любой из многочисленных коммерчески доступных наборов может быть использован для выполнения стадии амплификации. Any of numerous commercially available kits can be used to perform the amplification step. Праймеры могут быть сконструированы с использованием, например, программного обеспечения, хорошо известного в данной области. Primers may be designed using, for example, software well known in the art. Праймеры предпочтительно имеют 22-30 нуклеотидов в длину, имеют содержание GC, по меньшей мере, 50% и отжигаются с последовательностью-мишенью при температурах приблизительно 68-72°С. Primers are preferably 22-30 nucleotides in length, have a GC content of at least 50% and anneal to the target sequence at temperatures about 68-72 ° C. Амплифицированный район может быть секвенирован, как описано выше, и перекрывающиеся последовательности могут быть собраны в непрерывную последовательность. The amplified region may be sequenced as described above, and overlapping sequences can be assembled into a contiguous sequence.

Одним из таких способов амплификации является обратная полимеразная цепная реакция (Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), в которой используют рестрикционные ферменты (рестриктазы) для генерирования фрагмента в известном районе гена. One such amplification methods is the inverse polymerase chain reaction (Triglia et al, Nucl Acids Res 16:... 8186, 1988), which uses restriction enzymes (restriction enzyme) to generate a fragment in the known region of the gene. Затем указанный фрагмент замыкают в кольцо внутримолекулярным лигированием и используют в качестве матрицы для ПЦР с дивергентными праймерами, произведенными из указанного известного района. Then, this fragment was circularized by intramolecular ligation ring and used as template for PCR with divergent primers derived from said known area. В альтернативном подходе последовательности, смежные с частичной последовательностью, могут быть исправлены амплификацией с праймером для линкерной последовательности и праймером, специфическим для известного района. In an alternative approach, sequences adjacent to a partial sequence may be corrected by amplification with a primer to a linker sequence and a primer specific to the known region. Эти амплифицированные последовательности обычно подвергают второму циклу амплификации с тем же самым линкерным праймером и вторым праймером, специфическим для известного района. These amplified sequences are typically subjected to a second round of amplification with the same linker primer and a second primer specific to the known region. Вариация этой процедуры, которая использует два праймера, которые инициируют удлинение в противоположных направлениях от известной последовательности, описана в WO 96/38591. A variation of this procedure, which employs two primers that initiate extension in opposite directions from the known sequence, is described in WO 96/38591. Другой подобный способ известен как “быстрая амплификация концов кДНК” или RACE. Another similar method is known as "rapid amplification of cDNA ends" or RACE. Указанный способ предусматривает использование внутреннего праймера и наружного праймера, который гибридизуется с полиА-районом или векторной последовательностью, для идентификации последовательностей, которые находятся 5' и 3' от известной последовательности. Said method involves the use of an internal primer and an external primer, which hybridizes to a polyA region or vector sequence, to identify sequences that are 5 'and 3' of a known sequence. Дополнительные способы включают в себя “улавливающую” ПЦР (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) и “прогулочную” ПЦК (Parker et al., Nucl. Acids Res. 19:3055-60, 1991). Additional methods include "plume" PCR (Lagerstrom et al, PCR Methods Applic 1:.. 111-19, 1991) and "stroller" CRC (Parker et al, Nucl Acids Res 19:... 3055-60, 1991 ). Другие способы с использованием амплификации также могут применяться для получения полноразмерной последовательности кДНК. Other methods using amplification may also be employed to obtain full-length cDNA sequence.

В некоторых случаях можно получить полноразмерную последовательность-кДНК анализом последовательностей, обеспечиваемых в базе данных меток экспрессируемых последовательностей (EST), такой как база данных, доступная из GenBank. In some cases it is possible to obtain a full length cDNA sequence analysis of sequences provided in an expressed sequence tag database data (EST), such as a database accessible from GenBank. Поиски на перекрывающиеся EST могут обычно проводиться с использованием хорошо известных программ (например, программы NCBI BLAST searches), и такие EST могут быть использованы для генерирования непрерывной полноразмерной последовательности. Searches for overlapping EST may generally be performed using well known programs (e.g., NCBI BLAST searches of the program) and these EST can be used for generating a continuous full-length sequence.

Некоторые последовательности нуклеиновых кислот молекул кДНК, кодирующие, по меньшей мере, часть опухолевого белка предстательной железы, обеспечены в последовательностях SEQ ID NО:1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 или 384-472. Certain nucleic acid sequences of cDNA molecules encoding at least a portion of a prostate tumor protein sequences are provided in SEQ ID NO: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, ​​or 384-472. Выделение этих полинуклеотидов описано ниже. Isolation of these polynucleotides described below. Каждый из этих опухолевых белков предстательной железы сверхэкспрессируется в опухолевой ткани предстательной железы. Each of these prostate tumor protein is overexpressed in prostate tumor tissue.

Варианты полинуклеотидов могут быть обычно получены при помощи любого способа, известного в данной области, в том числе химического синтеза, например твердофазного фосфорамидитного химического синтеза. polynucleotide variants may generally be prepared by any method known in the art, including chemical synthesis, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Модификации в полинуклеотидной последовательности могут быть также введены с использованием стандартных способов мутагенеза, таких как олигонуклеотид-направляемый сайт-специфический мутагенез (Adelman et al., DNA 2:183, (1983). Альтернативно, молекулы РНК могут быть получены in vitro- или in vivo-транскрипцией последовательностей ДНК, кодирующих опухолевый белок предстательной железы, или их части, при условии, что эта ДНК включена в вектор с подходящим промотором РНК-полимеразы (таким как Т7 или SP6). Некоторые части могут быть использованы для получения код Modifications in a polynucleotide sequence may also be introduced using standard mutagenesis techniques, such as oligonucleotide-directed site-specific mutagenesis (Adelman et al, DNA 2:.. 183, (1983) Alternatively, RNA molecules may be prepared in vitro- or in vivo-transcription of DNA sequences encoding prostate tumor protein, or parts thereof, provided that the DNA is incorporated into a vector with a suitable RNA polymerase promoter (such as T7 or SP6). Certain portions may be used to obtain the code ируемого полипептида, как описано здесь. Кроме того, или альтернативно, такая часть может быть введена пациенту таким образом, что кодируемый ею полипептид генерируется in vivo (например, трансфекцией антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки, конструкцией-кДНК, кодирующей опухолевый полипептид предстательной железы, и введением этих трансфицированных клеток пациенту). iruemogo polypeptide as described herein. In addition, or alternatively, such a portion may be administered to a patient so that the polypeptide encoded by it is generated in vivo (e.g., by transfecting antigen-presenting cells such as dendritic cells, construct cDNA coding for a tumor polypeptide prostate cancer, and the introduction of these transfected cells to the patient).

Часть последовательности, комплементарной кодирующей последовательности (т.е. антисмысловой полинуклеотид), может быть также использована в качестве зонда или для модуляции экспрессии генов. Part of the sequence complementary to the coding sequence (i.e., an antisense polynucleotide) may also be used as a probe or to modulate gene expression. Конструкции-кДНК, которые могут быть транскрибированы в антисмысловую РНК, также могут быть введены в клетки тканей для облегчения продуцирования антисмысловой РНК. Constructs cDNA that can be transcribed into antisense RNA may also be introduced into cells of tissues to facilitate the production of antisense RNA. Антисмысловой полинуклеотид может быть использован, как описано здесь, для подавления экспрессии опухолевого белка. An antisense polynucleotide may be used as described herein, to inhibit tumor protein expression. Антисмысловая технология может быть использована для регуляции экспрессии генов через образование тройной спирали, которая нарушает способность двойной спирали достаточно открываться для связывания полимераз, транскрипционных факторов или регуляторных молекул (Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Iinmuno logic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1993)). Antisense technology can be used to regulate gene expression through triple helix, which impairs the ability of the double helix sufficiently open for the binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules (Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Iinmuno logic Approaches, Futura Publishing Co . (Mt. Kisco, NY; 1993)). Альтернативно, может быть сконструирована антисмысловая молекула для гибридизации с регуляторным районом гена (например, промотором, энхансером или сайтом инициации транскрипции) и блокирования транскрипции данного гена; Alternatively, it may be designed antisense molecule to hybridize to gene regulatory regions (e.g., promoter, enhancer or transcription initiation site), and block transcription of the gene; или блокирования трансляции путем подавления связывания транскрипта с рибосомами. or block translation by inhibiting binding of a transcript to ribosomes.

Часть кодирующей последовательности или комплементарной последовательности может быть также сконструирована в виде зонда или праймера для определения экспрессии гена. Portion of the coding sequence or complementary sequence may also be designed as a probe or primer to determine gene expression. Зонды могут быть помечены различными репортерными группами, такими как радионуклиды и ферменты, и предпочтительно имеют длину, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 нуклеотидов и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 30 нуклеотидов. Probes may be labeled with different reporter groups, such as radionuclides and enzymes, and preferably have a length of at least 10 nucleotides, more preferably at least 20 nucleotides and still more preferably at least 30 nucleotides. Праймеры, как отмечалось выше, имеют длину 22-30 нуклеотидов. Primers, as noted above, have a length of 22-30 nucleotides.

Любой полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован для увеличения стабильности in vivo. Any polynucleotide may be further modified to increase stability in vivo. Возможные модификации включают в себя, но не ограничиваются ими, добавление фланкирующих последовательностей при 5'- и/или 3'-концах; Possible modifications include, but are not limited to, the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' ends; предпочтительное использование фосфоротиоатных или 2'-О-метильных, а не фосфодиэстеразных связей в молекулярном скелете и/или включение нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и вибутазин, а также ацетил-, метил-, тио- и других модифицированных форм аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина. preferred use of phosphorothioate or 2'-O-methyl rather than phosphodiesterase linkages in the molecular skeleton and / or the inclusion of nontraditional bases such as inosine, queosine and vibutazin, as well as acetyl-, methyl-, thio- and other modified forms of adenine, cytidine , guanine, thymine and uridine.

Нуклеотидные последовательности, описанные здесь, могут быть соединены с различными другими нуклеотидными последовательностями при помощи стандартных способов рекомбинантных ДНК. The nucleotide sequences described herein may be coupled with a variety of other nucleotide sequences using standard recombinant DNA techniques. Например, полинуклеотид может быть клонирован в любой из многочисленных клонирующих векторов, в том числе в плазмиды, фагмиды, производные фага лямбда и космиды. For example, a polynucleotide may be cloned into any of a variety of cloning vectors, including plasmids, phagemids, lambda phage derivatives and cosmids. Представляющие особый интерес векторы включают в себя экспрессирующие векторы, репликационные векторы, генерирующие зонд векторы и секвенирующие векторы. Vectors of particular interest include expression vectors, replication vectors, probe generation vectors and sequencing vectors. В общем, вектор будет содержать точку начала репликации, функциональное в, по меньшей мере, одном организме, подходящие сайты рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) и один или более селектируемых маркеров. In general, a vector will contain an origin of replication functional in at least one organism, suitable restriction sites endonucleases (restriction enzymes) and one or more selectable markers. Другие элементы будут зависеть от желательного применения и будут очевидными средним специалистам в данной области. Other elements will depend upon the desired use, and will be apparent to those of ordinary skill in the art.

В некоторых вариантах полинуклеотиды могут быть приготовлены таким образом, чтобы сделать возможными вхождение в клетку млекопитающего и экспрессию в ней. In some embodiments, polynucleotides may be formulated so as to make possible entry into mammalian cells and expression therein. Такие композиции применимы, в частности, для терапевтических целей, как описано ниже. Such compositions are particularly useful for therapeutic purposes, as described below. Специалистам в данной области будет понятно, что существует много способов достижения экспрессии полинуклеотида в клетке-мишени и может быть использован любой подходящий способ. It will be appreciated in the art that there are many ways to achieve expression of a polynucleotide in a target cell and may be used by any suitable method. Например, полинуклеотид может быть включен в вирусный вектор, такой как, но не только, аденоассоциированный вирус, ретровирус или вирус коровьей оспы или других поксвирусов (вирусов оспы) (например, птичьего поксвируса). For example, a polynucleotide may be incorporated into a viral vector such as, but not limited to, adeno-associated virus, a retrovirus, or vaccinia or other pox viruses (smallpox virus) (eg, avian pox virus). Способы включения ДНК в такие векторы хорошо известны средним специалистам в данной области. Methods for incorporating DNA into such vectors are well known to those of ordinary skill in the art. Ретровирусный вектор может дополнительно переносить или включать ген для селектируемого маркера (для помощи в идентификации или селекции трансдуцированных клеток) и/или нацеливающую часть молекулы, такую как ген, кодирующий лиганд для рецептора на специфической клетке-мишени, для придания специфичности в отношении мишени указанному вектору. The retroviral vector may additionally transfer or incorporate a gene for a selectable marker (to aid in the identification or selection of transduced cells) and / or a targeting moiety, such as a gene encoding a ligand for a receptor on a specific target cell, to impart specificity with regard to target said vector . Нацеливание может выполняться с использованием антител способами, известными средним специалистам в данной области. Targeting can be accomplished using antibody methods known to those of ordinary skill in the art.

Другие композиции для терапевтических целей включают в себя коллоидальные диспергированные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, в том числе эмульсии типа масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Other formulations for therapeutic purposes include colloidal dispersed systems, such as macromolecule complexes, nanocapsules, microspheres, beads and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. Предпочтительной коллоидальной системой для применения в качестве вектора доставки in vitro и in vivo является липосома (т.е. искусственный мембранный пузырек). A preferred colloidal system for use as a delivery vector in vitro and in vivo is a liposome (i.e., an artificial membrane vesicle). Получение и применение таких систем хорошо известны в данной области. Preparation and use of such systems is well known in the art.

ОПУХОЛЕВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ TUMOR polypeptides PROSTATE

В контексте данного изобретения полипептиды могут содержать, по меньшей мере, иммуногенную часть опухолевого белка предстательной железы или его вариант, как описано здесь. In the context of this invention, polypeptides may comprise at least an immunogenic portion of a prostate tumor protein or a variant thereof as described herein. Как отмечалось выше, "опухолевый белок предстательной железы" является белком, который экспрессируется опухолевыми клетками предстательной железы. As noted above, the "prostate tumor protein" is a protein that is expressed by tumor cells of the prostate. Белки, которые являются опухолевыми белками предстательной железы, также взаимодействуют определяемо в иммуноанализе (таком как ELISA) с антисыворотками из пациента с раком предстательной железы. Proteins that are breast tumor proteins of the prostate, also react detectably in an immunoassay (such as an ELISA) with antisera from a patient with prostate cancer. Описанные здесь полипептиды могут быть любой длины. The polypeptides described herein may be of any length. Могут присутствовать дополнительные последовательности, произведенные из последовательностей нативного белка и/или гетерологичных последовательностей, и такие последовательности могут (но необязательно) обладать дополнительными иммуногенными или антигенными свойствами. There may be additional sequences derived from the sequences of the native protein and / or heterologous sequences, and such sequences may (but need not) possess further immunogenic or antigenic properties.

"Иммуногенная часть" в применении здесь является частью белка, которая распознается (т.е. специфически связывается) рецептором антигена поверхности В-клеток и/или Т-клеток. "Immunogenic portion" as used herein is part of a protein that is recognized (i.e., specifically binds to) the receptor surface antigen of B cells and / or T cells.

Такие иммуногенные части обычно содержат, по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере, 10, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков опухолевого белка предстательной железы или его варианта. Such immunogenic portions generally comprise at least 5 amino acid residues, more preferably at least 10, still more preferably at least 20 amino acid residues of the prostate tumor protein or a variant thereof. Некоторые предпочтительные иммуногенные части включают в себя пептиды, в которых были делегированы N-концевая лидерная последовательность и/или трансмембранный домен. Certain preferred immunogenic portions include peptides in which were delegated to N-terminal leader sequence and / or transmembrane domain. Другие предпочтительные иммуногенные части могут содержать небольшую N- или С-концевую делецию (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно 5-15 аминокислот) относительно зрелого белка. Other preferred immunogenic portions may contain a small N- or C-terminal deletion (e.g., 1-30 amino acids, preferably 5-15 amino acids) relative to the mature protein.

Иммуногенные части могут быть обычно идентифицированы с использованием хорошо известных способов, таких как суммированные в Paul, Fundamental Immunology, 3 rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) и цитированных в этой работе ссылках. Immunogenic portions may generally be identified using well known techniques such as summarized in Paul, Fundamental Immunology, 3 rd ed., 243-247 (Raven Press , 1993) and cited references in this work. Такие способы включают в себя скрининг полипептидов на способность реагировать с антиген-специфическими антителами, антисыворотками и/или Т-клеточными линиями или клонами. Such techniques include screening polypeptides for the ability to react with antigen-specific antibodies, antisera and / or T-cell lines or clones. В применении здесь антисыворотки и антитела являются “антиген-специфическими”, если они специфически связываются с антигеном (т.е. реагируют с белком в ELISA или другом иммуноанализе и не реагируют определяемо с посторонними белками). As used herein, antisera and antibodies are "antigen-specific" if they specifically bind to an antigen (i.e., react with the protein in an ELISA or other immunoassay, and do not react detectably with extraneous proteins). Такие антисыворотки и антитела могут быть получены, как описано здесь, и с использованием хорошо известных способов. Such antisera and antibodies may be prepared as described herein, and using well known techniques. Иммуногенная часть нативного опухолевого белка предстательной железы является частью, которая реагирует с такими антисыворотками и/или Т-клетками на уровне, который по существу не меньше, чем реактивность полноразмерного полипептида (например, в ELISA и/или анализе Т-клеточной реактивности). An immunogenic portion of a native tumor protein of the prostate is a portion that reacts with such antisera and / or T-cells at a level that is substantially less than the reactivity of the full length polypeptide (e.g., ELISA and / or analysis of T cell reactivity). Такие иммуногенные части могут реагировать в таких анализах на уровне, который является одинаковым или более высоким, чем реактивность полноразмерного полипептида. Such immunogenic portions may react in such assays at a level that is the same or higher than the reactivity of the full length polypeptide. Такие скрининги могут обычно проводиться с использованием способов, хорошо известных средним специалистам в данной области, таких как описанные в Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Например, полипептид может быть иммобилизован на твердом носителе и приведен в контакт с сыворотками пациентов для возможности связывания антител в сыворотках с иммобилизованном полипептидом. Such screenings can usually be carried out using methods well known to those of ordinary skill in the art, such as those described in Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. For example, a polypeptide may be immobilized on a solid support and brought into contact with patient sera to allow binding of antibodies in the sera to the immobilized polypeptide. Несвязанные сыворотки могут быть затем удалены, а связанные антитела могут быть определены с использованием, например, 125 I-меченного белка А. Unbound sera may then be removed, and related antibody may be determined using, for example, 125 I-labeled protein A.

Как отмечалось выше, композиция может содержать вариант нативного опухолевого белка предстательной железы. As noted above, the composition may comprise a variant of a native tumor protein of the prostate. “Вариант” полипептида в применении здесь является полипептидом, который отличается от нативного опухолевого белка предстательной железы одной или несколькими заменами, делениями, добавлениями и/или инсерциями (вставками), так что иммуногенность указанного полипептида по существу не уменьшается. A "variant" polypeptide as used herein is a polypeptide that differs from a native tumor protein prostate one or more substitutions, deletions, additions and / or insertions (inserts), so that the immunogenicity of the polypeptide is not substantially diminished. Другими словами, способность варианта реагировать с антиген-специфическими антисыворотками может быть повышенной или неизмененной относительно нативного белка или может быть сниженной на менее чем 50%, и предпочтительно на менее чем 20% относительно нативного белка. In other words, the variant to react with antigen-specific antisera may be enhanced or unchanged relative to the native protein or may be reduced to less than 50%, and preferably less than 20% relative to the native protein. Такие варианты могут быть идентифицированы модификацией одной из вышеуказанных полипептидных последовательностей и определением реактивности модифицированного полипептида с антиген-специфическими антителами или антисыворотками, как описано здесь. Such variants may be identified by modifying one of the above polypeptide sequences and determination of the modified polypeptide with antigen-reactivity with specific antibodies or antisera as described herein. Предпочтительные варианты включают в себя варианты, в которых одна или несколько частей, таких как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Preferred variants include variants in which one or more portions, such as the N-terminal leader sequence or transmembrane domain, have been removed. Другие предпочтительные варианты включают варианты, в которых небольшая часть (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно 5-15 аминокислот) были удалены из N- и/или С-конца зрелого белка. Other preferred variants include variants in which a small portion (e.g., 1-30 amino acids, preferably 5-15 amino acids) has been removed from the N- and / or C-terminus of the mature protein. Варианты полипептида предпочтительно обнаруживают, по меньшей мере, приблизительно 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95% идентичность (определяемую, как описано выше) относительно идентифицированных полипептидов. The polypeptide variants preferably exhibit at least about 70%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95% identity (determined as described above) with respect to the identified polypeptides.

Предпочтительно вариант содержит консервативные замены. Preferably, a variant contains conservative substitutions. “Консервативной заменой” является замена, при которой аминокислота заменена другой аминокислотой, которая имеет сходные свойства, так чтобы специалист с квалификацией в данной области мог ожидать, что вторичная структура и гидропатический характер данного полипептида по существу не будут измененными. "Conservative substitution" is a substitution in which the amino acid is substituted for another amino acid that has similar properties, so that those skilled in the art could expect the secondary structure and hydropathic nature of the polypeptide to be substantially unchanged. Аминокислотные замены обычно могут производиться на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Amino acid substitutions may generally be made on the basis of similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and / or amphipathic nature of the residues. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; положительно заряженные аминокислоты включают в себя лизин и аргинин; positively charged amino acids include lysine and arginine; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющие одинаковые величины гидрофильности, включают в себя лейцин, изолейцин и валин, глицин и аланин, аспарагин и глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин. and amino acids with uncharged polar head groups having similar hydrophilicity values ​​include leucine, isoleucine and valine, glycine and alanine, asparagine and glutamine, serine, threonine, phenylalanine and tyrosine. Другие группы аминокислот, которые могут представлять консервативные замены, включают в себя: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; Other groups of amino acids that may represent conservative changes include: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; (4) lys, arg, his; (5) phe, tyr, thr, his. (5) phe, tyr, thr, his. Вариант может также, или альтернативно содержать неконсервативные замены. A variant may also, or alternatively, contain nonconservative substitution. В предпочтительном варианте полипептиды варианта отличаются от нативной последовательности заменой, делецией или добавлением пяти или меньшего количества аминокислот. In a preferred embodiment, variant polypeptides differ from a native sequence by substitution, deletion or addition of five amino acids or fewer. Варианты могут также (или альтернативно) быть модифицированы, например, делецией или добавлением аминокислот, которые имеют минимальное влияние на иммуногенность, вторичную структуру и гидропатический характер полипептида. Variants may also (or alternatively) be modified by, e.g., deletion or addition of amino acids that have minimal influence on the immunogenicity, secondary structure and hydropathic nature of the polypeptide.

Как отмечалось выше, полипептиды могут содержать сигнальную (или лидерную) последовательность на N-концевой стороне белка, которая котрансляционно или посттрансляционно направляет перенос указанного белка. As noted above, polypeptides may comprise a signal (or leader) sequence at the N-terminal side of the protein which cotranslationally or post-translationally directs transfer of the protein. Полипептид может быть также конъюгирован с линкерной или другой последовательностью для облегчения синтеза, очистки или идентификации указанного полипептида (например, поли-His) или для усиления связывания указанного полипептида с твердым носителем. The polypeptide may also be conjugated to a linker or other sequence for ease of synthesis, purification or identification of the polypeptide (e.g., poly-His), or to enhance binding of the polypeptide to a solid support. Например, полипептид может быть конъюгирован с Fc-районом иммуноглобулина. For example, a polypeptide may be conjugated to an immunoglobulin Fc-region.

Полипептиды могут быть получены с использованием любого из разнообразных хорошо известных способов. Polypeptides may be prepared using any of a variety of well known methods. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые описанными выше последовательностями ДНК, могут быть легко получены из этих последовательностей ДНК с использованием различных экспрессирующих векторов, известных средним специалистам в данной области. Recombinant polypeptides encoded by DNA sequences as described above may be readily prepared from these DNA sequences using various expression vectors known to those of ordinary skill in the art. Экспрессия может быть достигнута в любой подходящей клетке-хозяине, которая была трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, кодирующую рекомбинантный полипептид. Expression may be achieved in any appropriate host cell that has been transformed or transfected with an expression vector comprising a DNA molecule encoding the recombinant polypeptide. Подходящие клетки-хозяева включают в себя прокариоты, дрожжи и высшие эукариотические клетки. Suitable host cells include prokaryotes, yeast and higher eukaryotic cells. Предпочтительно используемыми клетками-хозяевами являются Е.coli, дрожжи или линия клеток млекопитающих, такая как COS или СНО. Preferably, the host cells employed are E. coli, yeast or a mammalian cell line such as COS or CHO. Супернатанты из подходящих систем хозяин-вектор, которые секретируют рекомбинантный белок или полипептид в культуральные среды, могут быть сначала сконцентрированы при помощи коммерчески доступного фильтра. Supernatants from suitable host-vector systems which secrete recombinant protein or polypeptide into culture media may be first concentrated using a commercially available filter. После концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящий очищающий матрикс, такой как аффинный матрикс или ионообменная смола. After concentration, the concentrate may be applied to suitable purifying matrix, such as an affinity matrix or an ion exchange resin. Наконец, для дополнительной очистки рекомбинантного полипептида могут быть использованы одна или несколько стадий обращеннофазовой ВЭЖХ. Finally, one or more reverse phase HPLC steps can be employed to further purify a recombinant polypeptide.

Части или другие варианты, имеющие менее приблизительно 100 аминокислот и обычно менее приблизительно 50 аминокислот, могут быть получены синтетическими способами с использованием способов, хорошо известных средним специалистам в данной области. Parts or other variants having fewer than about 100 amino acids and usually less than about 50 amino acids, may be prepared by synthetic means using techniques well known to those of ordinary skill in the art. Например, такие полипептида могут быть синтезированы при помощи любого из коммерчески доступных твердофазных способов, таких как способ твердофазного синтеза Меррифилда, в котором аминокислоты последовательно добавляют к растущей аминокислотной цепи. For example, such polypeptides may be synthesized using any of the commercially available solid-phase techniques, such as the Merrifield solid phase synthesis method, where amino acids are sequentially added to a growing amino acid chain. См. Merrifield, J. Am. See. Merrifield, J. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 85:2149-2146, 1963. Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов является коммерчески доступным от поставщиков, таких как Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), и оно может эксплуатироваться в соответствии с инструкциями изготовителя. 85: 2149-2146, 1963. Equipment for automated synthesis of polypeptides is commercially available from suppliers such as Perkin Elmer / Applied BioSystems Division (Foster City, CA), and may be operated according to the manufacturer's instructions.

В некоторых характерных вариантах полипептид может быть слитым белком, который содержит множественные полипептиды, описанные здесь, или который содержит, по меньшей мере, один полипептид, описанный здесь, и постороннюю последовательность, такую как известный опухолевый белок. In some specific embodiments, a polypeptide may be a fusion protein that comprises multiple polypeptides as described herein, or that comprises at least one polypeptide described herein and an extraneous sequence, such as a known tumor protein. Слитый партнер может, например, способствовать обеспечению эпитопов Т-клеток-хелперов (иммунологический партнер слияния), предпочтительно эпитопов Т-клеток-хелперов, узнаваемых человеком, или может способствовать экспрессии белка (усилитель экспрессии) с более высокими выходами, чем нативный рекомбинантный белок. A fusion partner may, for example, contribute to the epitope of T-helper cells (immunological fusion partner), preferably epitopes of T helper cells, recognizable person, or can promote the expression of the protein (expression enhancer) at higher yields than the native recombinant protein. Некоторые предпочтительные партнеры слияния являются как иммунологическими, так и усиливающими экспрессию партнерами слияния. Some preferred the merger partners are both immunological and expression enhancing fusion partners. Другие партнеры слияния могут быть выбраны таким образом, чтобы они увеличивали растворимость белка или позволяли белку быть нацеленным на желательные внутриклеточные компартменты. Other fusion partners may be selected so that they have increased solubility of the protein or allow the protein to be aimed at the desired intracellular compartments. Следующие партнеры слияния включают в себя аффинные метки, которые облегчают очистку данного белка. Following fusion partners include affinity tags, which facilitate purification of the protein.

Слитые белки могут быть обычно получены при помощи стандартных способов, в том числе при помощи химической конъюгации. Fusion proteins may generally be prepared using standard techniques, including by chemical conjugation. Предпочтительно слитый белок экспрессируется в виде рекомбинантного белка, позволяя получать увеличенные уровни относительно неслитого белка в системе экспрессии. Preferably, the fusion protein is expressed as a recombinant protein, allowing to obtain enhanced levels relative to the unfused protein in the expression system. Вкратце, последовательности-ДНК, кодирующие эти полипептидные компоненты, могут быть собраны отдельно и лигированы в подходящий экспрессирующий вектор. Briefly, DNA sequences encoding the polypeptide components may be assembled separately, and ligated into an appropriate expression vector. 3'-конец последовательности-ДНК, кодирующей один полипептидный компонент, лигируют с пептидным линкером или без него с 5'-концом последовательности-ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, так что рамки считывания этих последовательностей находятся в фазе. 3'-end of the DNA sequence encoding one polypeptide component is ligated to a peptide linker with or without a 5'-end of the DNA sequence encoding the second polypeptide component so that the reading frames of the sequences are in phase. Это делает возможной трансляцию в единый слитый белок, который сохраняет биологическую активность обоих полипептидов-компонентов. This makes it possible to broadcast in a single fusion protein that retains the biological activity of both component polypeptides.

Пептидная линкерная последовательность может быть использована для разделения первого и второго полипептидного компонентов расстоянием, достаточным для гарантии того, что каждый полипептид укладывается в его вторичную и третичную структуры. A peptide linker sequence may be employed to separate the first and second polypeptide components distance sufficient to ensure that each polypeptide fit into its secondary and tertiary structures. Такую пептидную линкерную последовательность включают в слитый белок с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области. Such a peptide linker sequence included in the fusion protein using standard techniques well known in the art. Подходящие пептидные линкерные последовательности могут быть выбраны на основании следующих факторов: (1) их способности принимать гибкую распрямляющуюся конформацию; Suitable peptide linker sequences may be chosen based on the following factors: (1) their ability to adopt a flexible straightens conformation; (2) их неспособности принимать вторичную структуру, которая могла бы взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; (2) their inability to adopt a secondary structure that could interact with functional epitopes on the first and second polypeptides; и (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могут взаимодействовать с функциональными эпитопами полипептида. and (3) the lack of hydrophobic or charged residues that might react with the polypeptide functional epitopes. Предпочтительные пептидные линкерные последовательности содержат остатки Gly, Asn и Ser. Preferred peptide linker sequences contain residues Gly, Asn and Ser. Другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Thr и А1а, могут быть также использованы в линкерной последовательности. Other near neutral amino acids, such as Thr and A1a, may also be used in the linker sequence. Аминокислотные последовательности, которые могут обычно использоваться в качестве линкеров, включают в себя последовательности, описанные в Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Amino acid sequences which may typically be used as linkers include sequences disclosed in Maratea et al, Gene 40: 39-46, 1985;. Murphy et al., Proc. Murphy et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; USA 83: 8258-8262, 1986; патент Соединенных Штатов № 4935233 и патент Соединенных Штатов № 4751180. Линкерная последовательность обычно может иметь длину от 1 до приблизительно 50 аминокислот. United States Patent № 4935233 and United States Patent 4751180. № The linker sequence may generally have a length of from 1 to about 50 amino acids. Линкерные последовательности не требуются, когда первый и второй полипептиды имеют районы заменимых N-концевых аминокислот, которые могут быть использованы для отделения функциональных доменов и предотвращения стерических затруднений. Linker sequences are not required when the first and second polypeptides have non-essential regions of N-terminal amino acids that can be used to separate the functional domains and prevent steric hindrance.

Лигированные последовательности-ДНК оперативно связаны с подходящими регуляторными элементами транскрипции или трансляции. The ligated DNA sequences are operably linked to suitable regulatory elements of transcription or translation. Регуляторные элементы, ответственные за экспрессию ДНК, расположены только 5' (слева) относительно последовательности-ДНК, кодирующей первый полипептид. The regulatory elements responsible for expression of DNA are located only 5 '(left) with respect to the DNA sequence encoding the first polypeptide. Подобным образом стоп-кодоны, требующиеся для конечных сигналов терминации трансляции и транскрипции, присутствуют только 3' (справа) относительно последовательности-ДНК, кодирующей второй полипептид. Similarly, stop codons required to end translation termination signals and transcription only present 3 '(right) with respect to the DNA sequence encoding the second polypeptide.

Обеспечены также слитые белки, содержащие полипептид данного изобретения вместе с неродственным иммуногенным белком. Also provided are fusion proteins comprising a polypeptide of the invention together with an unrelated immunogenic protein. Предпочтительно указанный иммуногенный белок способен вызывать вторичный иммунный ответ. Preferably said immunogenic protein is capable of eliciting an anamnestic response. Примеры таких белков включают в себя белки столбняка, туберкулеза и гепатита (например, Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997). Examples of such proteins include tetanus, proteins, tuberculosis and hepatitis (e.g., Stoute et al, New Engl J. Med, 336:... 86-91, 1997).

В предпочтительных вариантах иммунологический партнер слияния получают из белка D, поверхностного белка грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza В (WO 91/18926). In preferred embodiments, an immunological fusion partner is protein D prepared from, surface protein of the gram-negative bacterium Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Предпочтительно производное белка D содержит приблизительно первую треть белка (например, первые 100-110 N-концевых аминокислот) и производное белка D может быть липидировано. Preferably the protein D derivative comprises approximately the first third of the protein (e.g., the first 100-110 N-terminal amino acids) and a protein D derivative may be lipidated. В некоторых предпочтительных вариантах первые 109 остатков партнера слияния Липопротеина D включены на N-конце для обеспечения указанного полипептида дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и для увеличения уровня экспрессии в Е.coli (для функционирования, следовательно, в качестве усилителя экспрессии). In certain preferred embodiments, the first 109 residues of Lipoprotein D fusion partner includes at N-end to provide the polypeptide with additional exogenous T-cell epitopes and increase expression level in E. coli (for operation, therefore, as the expression of the amplifier). Липидный хвост обеспечивает оптимальную презентацию (представление) антигена антиген-презентирующим клеткам. The lipid tail ensures optimal presentation (presentation) antigen of antigen presenting cells. Другие партнеры слияния включают в себя неструктурный белок из вируса гриппа, NS1 (гемагглютинин). Other fusion partners include the non-structural protein from influenza virus, NS1 (hemagglutinin). Обычно используют 81 N-концевую аминокислоту, хотя могут быть использованы различные фрагменты, включающие в себя эпитопы Т-клеток-хелперов. Typically use 81 N-terminal amino acid, although different fragments that include epitopes T helper cells may be used.

В другом варианте иммунологическим партнером слияния является белок, известный как LYTA, или его часть (предпочтительно С-концевая часть). In another embodiment the immunological fusion partner is the protein known as LYTA, or a portion thereof (preferably a C-terminal portion). LYTA произведен из Streptococcus pneumoniae, который синтезирует N-ацетил-L-аланинамидазу, известную как амидаза LYTA (кодируемую геном LytA; Gene 43:265-292, 1980). LYTA is derived from Streptococcus pneumoniae, which synthesizes N-acetyl-L-alaninamidazu known as amidase LYTA (encoded by the gene LytA; Gene 43: 265-292, 1980). LYTA является аутолизином, который специфически разрушает определенные связи в структуре пептидогликана. LYTA is an autolysin that specifically degrades certain bonds in the peptidoglycan structure. С-концевой домен белка LYTA является ответственным за аффинность в отношении холина или некоторых аналогов холина, таких как ДЭАЭ. C-terminal domain of the protein LYTA is responsible for the affinity to choline or choline analogues of some, such as DEAE. Это свойство было использовано для разработки экспрессирующих C-LYTA Е.coli плазмид, применимых для экспрессии слитых белков. This property was used to develop expressing E. coli C-LYTA plasmids useful for expression of fusion proteins. Очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LYTA на амино-конце, была описана (Biotechnology 10:795-798, 1992). Purification of hybrid proteins containing the C-LYTA fragment at the amino terminus has been described (Biotechnology 10: 795-798, 1992). В предпочтительном варианте повторная часть LYTA может быть включена в слитый белок. In a preferred embodiment, repeated part LYTA may be incorporated into a fusion protein. Повторная часть обнаружена в С-концевом районе, и она начинается при остатке 178. Особенно предпочтительная повторная часть включает в себя остатки 188-305. Re-discovered in the part of the C-terminal region, and it begins at residue 178. A particularly preferred repeat portion includes residues 188-305.

Обычно полипептиды (в том числе слитые белки) и полинуклеотиды, описанные здесь, выделяют. Typically, polypeptides (including fusion proteins) and polynucleotides as described herein are isolated. “Выделенным” полипептидом или полинуклетидом является полипептид или полинуклеотид, который удален из его исходного окружения. "Isolated" polypeptide or polinukletidom is a polypeptide or polynucleotide that is removed from its original environment. Например, природно встречающийся белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех веществ, сосуществующих с ним в природной системе. For example, a naturally-occurring protein is isolated if it is separated from some or all substances coexisting in the natural system. Предпочтительно такие полипептиды являются чистыми, по меньшей мере, приблизительно на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 99%. Preferably, such polypeptides are pure, at least about 90%, more preferably at least about 95%, and most preferably at least about 99%. Полипептид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, который не является частью природного окружения. A polypeptide is considered to be isolated if, for example, it is cloned into a vector that is not part of the natural environment.

СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ binding agents

Данное изобретение обеспечивает, далее, агенты, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с опухолевым белком предстательной железы. The present invention provides, further, agents such as antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to the protein of the prostate tumor. В применении здесь антитело или его антигенсвязывающий фрагмент считают "специфически связанным" с опухолевым белком предстательной железы, если они реагируют при определяемом уровне (например, в анализе ELISA) с опухолевым белком предстательной железы и не реагируют определяемо с неродственными белками при тех же самых условиях. As used herein, an antibody or antigen binding fragment thereof are considered "specifically bound" by a tumor protein of the prostate, if they react with the determined level (e.g., ELISA assay) from tumor protein prostate and do not react detectably with unrelated proteins under the same conditions. В применении здесь "связыванием" называют нековалентную связь между двумя отдельными молекулами с образованием комплекса. As used herein, "binding" refers to non-covalent association between two separate molecules to form a complex. Способность связывания может быть оценена, например, путем определения константы связывания для образования указанного комплекса. The ability to bind may be evaluated, e.g., by determining the binding constant for the formation of said complex. Константа связывания является величиной, получаемой при делении концентрации комплекса на произведение концентраций компонентов. The binding constant is the value obtained by dividing the concentration of the complex in the product of the component concentrations. Обычно говорят, что два соединения "связываются", в контексте данного изобретения, когда константа связывания для образования комплекса превышает приблизительно 10 3 л/моль. It is usually said that the two compounds "bind" in the context of the present invention when the binding constant for complex formation exceeds about 10 3 L / mol. Константа связывания может быть определена с использованием способов, хорошо известных в данной области. The binding constant maybe determined using methods well known in the art.

Связывающие агенты могут быть дополнительно способными к разделению между пациентами, страдающими или не страдающими раковыми опухолями, такими как рак предстательной железы, при помощи показательных анализов, описанных здесь. Binding agents may be further capable of separation between patients suffering or suffering from cancers such as prostate cancer, using the illustrative assays described herein. Другими словами, антитела или другие связывающие агенты, которые связываются с опухолевым белком предстательной железы, будут генерировать сигнал, указывающий на наличие раковой опухоли, по меньшей мере, приблизительно у 20% пациентов с указанным заболеванием и будут генерировать отрицательный сигнал, указывающий на отсутствие указанного заболевания, по меньшей мере, приблизительно у 90% индивидуумов, не страдающих раковой опухолью. In other words, antibodies or other binding agents that bind to a tumor protein of the prostate, will generate a signal indicating the presence of a cancer in at least about 20% of patients with this disease, and will generate a negative signal indicating the absence of said disease at least about 90% of individuals not suffering from cancer. Для определения, удовлетворяет ли связывающий агент указанному требованию, биологические образцы (например, кровь, сыворотки, моча и/или опухолевые биоптаты) пациентов, страдающих и не страдающих раковой опухолью (что определяют с использованием стандартных клинических тестов), могут быть подвергнуты анализу, как описано здесь, на присутствие полипептидов, которые связываются с указанным связывающим агентом. To determine satisfies whether binding agent this requirement, biological samples (e.g., blood, sera, urine and / or tumor biopsies) patients not suffering from a cancer (as determined using standard clinical tests) may be assayed as described herein, for the presence of polypeptides that bind to said binding agent. Должно быть понятно, что должно быть подвергнуто анализу статистически значимое число образцов с заболеванием и без заболевания. It will be appreciated that should be analyzed statistically significant number of samples with and without the disease condition. Каждый связывающий агент должен удовлетворять вышеуказанным критериям, однако среднему специалисту в данной области будет понятно, что связывающие агенты могут быть использованы в комбинации для улучшения чувствительности. Each binding agent should satisfy the above criteria, but one of ordinary skill in the art will recognize that binding agents may be used in combination to improve sensitivity.

Любой агент, который удовлетворяет вышеуказанным требованиям, может быть связывающим агентом. Any agent that satisfies the above requirements may be a binding agent. Например, связывающим агентом может быть рибосома с пептидным компонентом или без пептидного компонента, молекула РНК или полипептид. For example, the binding agent may be a ribosome with or without a peptide component of the peptide component, an RNA molecule or a polypeptide. В предпочтительном варианте связывающий агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. In a preferred embodiment the binding agent is an antibody or antigen binding fragment thereof. Антитела могут быть получены любым из различных способов, известных средним специалистам в данной области, например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Обычно антитела могут быть получены способами культуры клеток, в том числе генерированием моноклональных антител, как описано здесь, или через трансфекцию генов антител в подходящие клетки-хозяева бактерий или млекопитающих для продуцирования рекомбинантных антител. Antibodies can be prepared by any of various methods known to those of ordinary skill in the art, e.g., Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Typically, the antibodies may be prepared by methods of the cell culture, including the generation of monoclonal antibodies as described herein, or via transfection of antibody genes into suitable host cells are bacteria or mammalian cells for production of recombinant antibodies. В одном способе иммуноген, содержащий данный полипептид, сначала инъецируют в любое млекопитающее из большого ряда (например, мышь, крыса, кролик, овца или коза). In one method, an immunogen comprising the polypeptide is initially injected into any of a large number of mammal (e.g., mouse, rat, rabbit, sheep or goat). В этой стадии полипептиды данного изобретения могут служить в качестве иммуногена без модификации. In this step, the polypeptides of this invention may serve as the immunogen without modification. Альтернативно, в частности, для относительно коротких полипептидов, превосходный иммунный ответ может быть вызван, если полипептид соединен с белком-носителем, таким как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин фиссуреллы. Alternatively, particularly for relatively short polypeptides, superior immune response may be invoked, if the polypeptide is coupled to a carrier protein, such as bovine serum albumin or keyhole limpet hemocyanin. Иммуноген инъецируют в животное-хозяин, предпочтительно в соответствии с заданным режимом, включающим в себя одну или несколько бустер-иммунизаций, и периодически из животных берут кровь. The immunogen is injected into the animal host, preferably according to a predetermined regime, comprising one or more booster immunizations, and the animals are periodically bled out. Поликлональные антитела, специфические для указанного полипептида, могут быть затем очищены из таких антисывороток, например, аффинной хроматографией с использованием полипептида, связанного с подходящим твердым носителем. Polyclonal antibodies specific for the polypeptide may then be purified from such antisera, for example, affinity chromatography using the polypeptide associated with a suitable solid carrier.

Моноклональные антитела, специфические для представляющего интерес антигенного полипептида, могут быть получены, например, с использованием способа Kohler and Milstein, Eur. Monoclonal antibodies specific for an antigenic polypeptide of interest may be prepared, for example, using the method of Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. J. Immunol. 6:511-519, 1976, и его усовершенствованных вариантов. 6: 511-519, 1976, and advanced options. Вкратце, эти способы предусматривают получение иммортализованных клеточных линий, способных продуцировать антитела, имеющие желаемую специфичность (т.е. реактивность с представляющим интерес полипептидом). Briefly, these methods involve the preparation of immortalized cell lines capable of producing antibodies having the desired specificity (i.e., reactivity with the polypeptide of interest). Такие клеточные линии могут быть получены, например, из клеток селезенки, полученных из животного, иммунизированного, как описано выше. Such cell lines may be produced, for example, from spleen cells obtained from an animal immunized as described above. Затем клетки селезенки иммортализуют, например, слиянием с миеломной клеткой в качестве партнера слияния, предпочтительно клеткой, которая является сингенной с иммунизированным животным. spleen cells are then immortalized, for example, fusion with a myeloma cell, as a fusion partner, preferably a cell that is syngeneic with the immunized animal. Могут использоваться различные способы слияния. They may use various methods for merging. Например, клетки селезенки и миеломные клетки могут быть объединены с неионогенным детергентом на несколько минут, и затем производят посев при низкой плотности на селективную среду, которая поддерживает рост гибридных клеток, но не миеломных клеток. For example, spleen cells and myeloma cells may be combined with a nonionic detergent for a few minutes, and then seeded at low density on a selective medium that supports the growth of hybrid cells, but not myeloma cells. В предпочтительном способе отбора используют отбор с HAT (гипоксантином, аминоптерином, тимидином). The preferred selection method using selection with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). После достаточного периода времени, обычно приблизительно 1-2 недель, наблюдают колонии гибридов. After a sufficient time, usually about 1-2 weeks, colonies of hybrids is observed. Отбирают одиночные колонии и их культуральные супернатанты испытывают на связывающую активность в отношении полипептида. Single colonies are selected and their culture supernatants tested for binding activity against the polypeptide. Предпочтительными являются гибридомы, имеющие высокую реактивность и высокую специфичность. Preferred are the hybridoma having high reactivity and high specificity.

Моноклональные антитела могут быть выделены из супернатантов растущих гибридомных колоний. Monoclonal antibodies can be isolated from the supernatants of growing hybridoma colonies. Кроме того, различные способы могут быть использованы для повышения выхода, такие как инъекция гибридомной клеточной линии в перитонеальную полость подходящего позвоночного хозяина, такого как мышь. Furthermore, various methods can be used to increase the yield, such as injection of the hybridoma cell line into the peritoneal cavity of a suitable vertebrate host, such as a mouse. Затем моноклональные антитела могут быть собраны из асцитной жидкости или крови. Next, the monoclonal antibody can be harvested from the ascites fluid or the blood. Примеси могут быть удалены из антител общепринятыми способами, такими как хроматография, гель-фильтрация, осаждение и экстракция. Impurities can be removed from the antibodies by conventional techniques such as chromatography, gel filtration, precipitation, and extraction. Полипептиды данного изобретения могут быть использованы в процессе очистки, например, в стадии аффинной хроматографии. Polypeptides of the invention may be used in the purification process, e.g., in affinity chromatography step.

В некоторых вариантах может быть предпочтительным использование антигенсвязывающих фрагментов антител. In some embodiments, it may be preferred to use antigen-binding antibody fragments. Такие фрагменты включают в себя Fab-фрагменты, которые могут быть получены с использованием стандартных способов. Such fragments include Fab-fragments, which may be prepared using standard techniques. Вкратце, иммуноглобулины могут быть очищены из кроличьей сыворотки аффинной хроматографией на колонках с гранулами белка А (Наrlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) и гидролизованы папаином с образованием Fab- и Fс-фрагментов. Briefly, immunoglobulins may be purified from rabbit serum by affinity chromatography on a column of protein A beads (Narlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) and digested with papain to produce Fab- and Fc fragments. Fab- и Fc-фрагменты могут быть разделены аффинной хроматографией на колонках с гранулами белка А. Fab- and Fc-fragments may be separated by affinity chromatography on a column of protein A beads

Моноклональные антитела данного изобретения могут быть связаны с одним или несколькими терапевтическими агентами. Monoclonal antibodies of the invention may be associated with one or more therapeutic agents. Подходящие для указанного агенты включают в себя радионуклиды, индукторы дифференцировки, лекарственные средства, токсины и их производные. Suitable for the specified agents include radionuclides, differentiation inducers, drugs, toxins, and derivatives thereof. Предпочтительные радионуклиды включают в себя 90 Y, 123 I, 125 I, 131 I, 188 Re, 211 At и 212 Bi. Preferred radionuclides include 90 Y, 123 I, 125 I, 131 I, 188 Re, 211 At and 212 Bi. Предпочтительные лекарственные средства включают в себя метотрексат и аналоги пиримидина и пурина. Preferred drugs include methotrexate, and pyrimidine and purine analogs. Предпочтительные индукторы дифференцировки включают в себя форболовые эфиры и масляную кислоту. Preferred differentiation inducers include phorbol esters and butyric acid. Предпочтительные токсины включают в себя рицин, абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин, гелонин, экзотоксин Pseudomonas, токсин Shigella и антивирусный белок фитолакки американской. Preferred toxins include ricin, abrin, diptheria toxin, cholera toxin, gelonin, exotoxin Pseudomonas, Shigella toxin, and pokeweed antiviral protein.

Терапевтический агент может быть связан (например, ковалентно связан) с подходящим моноклональным антителом либо непосредственно, либо опосредованно (например, через линкерную группу). The therapeutic agent may be coupled (e.g., covalently bonded) to a suitable monoclonal antibody either directly or indirectly (e.g., via a linker group). Прямая реакция между агентом и антителом возможна, когда агент и антитело обладают заместителями, способными реагировать друг с другом. The direct reaction between an agent and an antibody is possible when an agent and an antibody have substituents capable of reacting with each other. Например, нуклеофильная группа, такая как амино или сульфгидрильная группа, на одном из них может быть способна реагировать с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или галогенангидрид карбоновой кислоты, или с алкильной группой, содержащей подходящую уходящую группу (например, галогенид) на другом. For example, a nucleophilic group such as an amino or sulfhydryl group, on one of them may be capable of reacting with a carbonyl group such as an anhydride or carboxylic acid halide, or with an alkyl group containing a suitable leaving group (e.g., halide) on the other.

Альтернативно, может быть желательным связывать терапевтический агент и антитело посредством линкерной группы. Alternatively, it may be desirable to associate the therapeutic agent and an antibody via a linker group. Линкерная группа может функционировать в качестве спейсера для помещения антитела на расстоянии от агента во избежание помех в отношении связывающих способностей. The linker group can function as a spacer to distance an antibody from the room to avoid interference agent against binding abilities. Линкерная группа может служить также для увеличения химической активности заместителя на агенте или антителе и, следовательно, увеличения эффективности связывания. The linker group can also serve to increase the chemical reactivity of a substituent on an agent or an antibody, and thus increase the coupling efficiency. Увеличение химической активности может также облегчать использование агентов или функциональных групп на агентах, которое в противном случае не было бы возможным. Increased reactivity may also facilitate the use of agents, or functional groups on agents, which otherwise would not be possible.

Специалистам в данной области будет понятно, что различные бифункциональные или полифункциональные реагенты, как гомо-, так и гетерофункциональные (такие как описанные в каталоге Pierce Chemical Co., Rockford, IL), могут быть использованы в качестве линкерной группы. Those skilled in the art will appreciate that a variety of bifunctional or polyfunctional reagents, both homo- and heterofunctional (such as those described in the catalog Pierce Chemical Co., Rockford, IL), may be employed as the linker group. Связывание может выполняться, например, через аминогруппы, карбоксильные группы, сульгидрильные группы или окисленные углеводные остатки. The binding may be performed, for example, through amino groups, carboxyl groups, sulgidrilnye groups or oxidized carbohydrate residues. Имеются многочисленные ссылки, описывающие такую методологию, например патент Соединенных Штатов № 4671958, выданный Rodwell et al. There are numerous references describing such methodology, e.g. № United States Patent 4671958, issued to Rodwell et al.

Если терапевтический агент является более сильнодействующим, когда он не содержит являющейся антителом части иммуноконъюгата данного изобретения, может быть желательным использование линкерной группы, расщепляемой во время или после интернализации в клетку. If a therapeutic agent is more potent when it contains an antibody portion of the immunoconjugate of the invention may be desirable to use a linker group cleavable during or upon internalization into a cell. Был описан ряд различных расщепляемых линкерных групп. number of different cleavable linker groups have been described. Механизмы внутриклеточного высвобождения агента от этих линкерных групп включают в себя расщепление восстановлением дисульфидной связи (например, патент Соединенных Штатов № 4489710, выданный Spitler), облучением фотолабильной связи (например, патент Соединенных Штатов, выданный Senter et al.), гидролизом дериватизованных аминокислотных боковых цепей (например, патент Соединенных Штатов № 4638045, выданный Kohn et al.), опосредованным сывороточным комплементом гидролизом (например, патент Соединенных Штатов № 4671958, выданный Rodwell et al.) и катализируемым кисл Mechanisms intracellular release of an agent from these linker groups include cleavage of the disulfide bond by reduction (e.g., United States Patent № 4,489,710 issued to Spitler), by irradiation photolabile bond (e.g., United States Patent, issued Senter et al.), By hydrolysis of derivatized amino acid side chains (e.g., United States patent № 4,638,045 issued to Kohn et al.), serum complement-mediated hydrolysis (e.g., United States patent № 4,671,958 issued to Rodwell et al.) and catalyzed sour той гидролизом (например, патент Соединенных Штатов № 4569789, выданный Blattler et al.). of the hydrolysis (e.g., United States Patent № 4,569,789 issued to Blattler et al.).

Может быть желательным связывание более чем одного агента с антителом. It may be desirable binding more than one agent to an antibody. В одном варианте множественные молекулы терапевтического агента связывают с одной молекулой антитела. In one embodiment, multiple molecules of a therapeutic agent linked to one antibody molecule. В другом варианте более чем один тип агента может быть связан с одним антителом. In another embodiment, more than one type of agent may be coupled to one antibody. Независимо от конкретного варианта иммуноконъюгаты с более чем одним агентом могут быть приготовлены различными способами. Regardless of the particular embodiment in various ways can be prepared immunoconjugates with more than one agent. Например, более чем один агент может быть связан непосредственно с молекулой антитела или могут быть использованы линкеры, которые обеспечивают множественные сайты для присоединения. For example, more than one agent may be coupled directly to an antibody molecule, or linkers can be used that provide multiple sites for attachment. Альтернативно, может быть использован носитель. Alternatively, a carrier can be used. Носитель может нести эти агенты различными способами, в том числе посредством ковалентного связывания либо непосредственно, либо через линкер. A carrier may bear the agents in various ways, including by covalent bonding either directly or via a linker. Подходящие носители включают в себя белки, такие как альбумины (например, патент Соединенных Штатов № 4507234, выданный Kato et al.), пептиды и полисахариды, такие как аминодекстран (например, патент Соединенных Штатов № 4699784, выданный Shih et al.). Suitable carriers include proteins such as albumins (e.g., United States Patent № 4,507,234 issued to Kato et al.), Peptides and polysaccharides such as aminodextran (e.g., United States Patent № 4,699,784 issued to Shih et al.). Носитель может также нести агент посредством нековалентного связывания или посредством инкапсулирования, такого как в пузырьке липосомы (например, патенты Соединенных Штатов № 4429088 и 4873088). The carrier may also bear an agent by noncovalent bonding or by encapsulation, such as a liposome vesicle (e.g., United States patents 4,429,088 and 4,873,088 №). Носители, специфические для радионуклидных агентов, включают в себя радиогалогенированные небольшие молекулы и хелатирующие соединения. Carriers specific for radionuclide agents include radiogalogenirovannye small molecules and chelating compounds. Например, патент Соединенных Штатов № 4735792 описывает показательные радиогалогенированные небольшие молекулы и их синтез. For example, United States patent number 4735792 describes a demonstration radiogalogenirovannye small molecules and their synthesis. Содержащий радионуклид хелат может быть образован из хелатирующих соединений, которые включают в себя соединения, содержащие атомы азота и серы в качестве донорных атомов для связывания металла или оксида металла, радионуклида. Containing radionuclide chelate may be formed from chelating compounds that include those containing nitrogen and sulfur atoms as the donor atoms for binding the metal, or metal oxide, radionuclide. Например, патент Соединенных Штатов № 4673562, выданный Davison et al., описывает показательные хелатирующие соединения и их синтез. For example, United States Patent № 4673562 issued to Davison et al., Describes illustrative chelating compounds and their synthesis.

Могут быть использованы разнообразные способы введения для антител и иммуноконъюгатов. variety of modes of administration for the antibodies and immunoconjugates may be used. Обычно введение является внутривенным, внутримышечным, подкожным или в место, где находилась иссеченная опухоль. Usually administration is by intravenous, intramuscular, subcutaneous or in a place where there was tumor excision. Понятно, что точная доза антитела/иммуноконъюгата будет зависеть от используемого антитела, антигенной плотности на опухоли и скорости клиренса данного антитела. It is understood that the precise dose of the antibody / immunoconjugate will depend upon the antibody used, the antigen density on the tumor, and the clearance rate of the antibody.

Т-клетки T cells

Иммунотерапевтические композиции могут также или альтернативно содержать Т-клетки, специфические для опухолевого белка предстательной железы. Immunotherapeutic compositions may also, or alternatively, comprise T cells specific for prostate tumor protein. Такие клетки могут быть обычно получены in vitro или ex vivo с использованием стандартных процедур. Such cells may generally be prepared in vitro or ex vivo, using standard procedures. Например, Т-клетки могут быть выделены из костного мозга, периферической крови или фракции костного мозга или периферической крови пациента с использованием коммерчески доступной системы разделения клеток, такой как система CEPRATE™, доступная из CellPro Inc., Bothell WA (патент Соединенных Штатов № 5240856; патент Соединенных Штатов № 5215926; WO 89/06280; WO 91/16116 и WO 92/07243). For example, T cells may be isolated from bone marrow, peripheral blood or a fraction of bone marrow or peripheral blood of a patient using a commercially available cell separation system, such as system CEPRATE ™, available from CellPro Inc., Bothell WA (United States Patent 5,240,856 № ; United States patent № 5215926; WO 89/06280; WO 91/16116 and WO 92/07243). Альтернативно, Т-клетки могут быть получены из родственников пациента или не являющихся родственниками людей, других млекопитающих, клеточных линий или культур. Alternatively, T cells may be derived from the patient's relatives and family members are not human, other mammals, cell lines or cultures.

Т-клетки могут быть стимулированы опухолевым полипептидом предстательной железы, полинуклеотидом, кодирующим опухолевый полипептид предстательной железы, и/или антиген-презентирующей клеткой (АРС), экспрессирующей такой полипептид. T cells may be stimulated with a polypeptide of prostate tumor, a polynucleotide encoding a polypeptide tumor of the prostate and / or antigen-presenting cell (APC) that expresses such a polypeptide. Такую стимуляцию выполняют в условиях и в течение времени, достаточных для возможности генерирования Т-клеток, специфических для указанного полипептида. Such stimulation is performed under conditions and for a time sufficient to allow the generation of T-cells specific for said polypeptide. Предпочтительно опухолевый полипептид или полинуклеотид предстательной железы присутствует в доставляющем носителе, таком как микросфера, для облегчения генерирования специфических Т-клеток. Preferably, a tumor polypeptide or polynucleotide is present in prostatic a delivery medium, such as a microsphere, to facilitate the generation of specific T cells.

Т-клетки считаются специфическими для опухолевого полипептида предстательной железы, если эти Т-клетки убивают клетки-мишени, содержащие на своей поверхности полипептид или экспрессирующие ген, кодирующий указанный полипептид. T cells are considered to be specific for a tumor polypeptide prostate if the T cells kill target cells having on their surface a polypeptide or expressing a gene encoding said polypeptide. Специфичность Т-клеток может оцениваться с использованием любого из разнообразных стандартных способов. The specificity of T cells can be assessed using any of a variety of standard methods. Например, в анализе высвобождения хрома или в анализе пролиферации индекс стимуляции более чем двукратного увеличения лизиса и/или пролиферации в сравнении с отрицательными контролями свидетельствует о специфичности Т-клеток. For example, in a chromium release assay or proliferation assay stimulation index of more than two-fold increase in lysis and / or proliferation, compared to negative controls indicates T-cell specificity. Такие анализы могут проводиться, например, как описано в Chen et al., Cancer Res. Such assays can be conducted, e.g., as described in Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994. Альтернативно, определение пролиферации Т-клеток может выполняться различными известными способами. 54: 1065-1070, 1994. Alternatively, identification of T-cell proliferation may be performed by various known methods. Например, пролиферацию Т-клеток можно определять путем измерения увеличенной скорости синтеза ДНК (например, путем кратковременного (импульсного) мечения культур Т-клеток тритированным тимидином и измерения количества тритированного тимидина, включенного в ДНК). For example, T cell proliferation can be determined by measuring an increased rate of DNA synthesis (e.g., by short-term (pulse) labeling cultures of T cells with tritiated thymidine and measuring the amount of tritiated thymidine incorporated into DNA). Контакт с опухолевым полипептидом предстательной железы (100 нг/мл - 100 мкг/мл, предпочтительно 200 нг/мл - 25 мкг/мл) в течение 3-7 дней должен приводить к по меньшей мере двукратному увеличению пролиферации Т-клеток. Contact with a tumor polypeptide prostate (100 ng / ml - 100 ug / ml, preferably 200 ng / ml - 25 ug / ml) for 3-7 days should result in at least a two-fold increase of T cell proliferation. Описанный выше контакт в течение 2-3 часов должен приводить к активации Т-клеток, измеряемой с использованием стандартных анализов на цитокины, в которых двукратное увеличение уровня высвобождения цитокина (например, TNF или IFN-γ) является указанием на активацию Т-клеток (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol.1, Wiley Interscience (Greent 1998). Т-клетки, которые активировались в ответ на опухолевый полипептид, полинуклеотид предстательной железы или экспрессирующие полипептид АРС, могут быть CD4 + и/или CD8 + . Т-клетки, специфические для опухолевого белка предстательно The above-described contact for 2-3 hours should result in activation of the T cells, as measured using standard cytokine assays in which a two-fold increase in the level of cytokine release (e.g., TNF or IFN-γ) is indicative of T cell activation (Coligan et al., Current Protocols in Immunology , vol.1, Wiley Interscience (Greent 1998). T cells that are activated in response to a tumor polypeptide, polynucleotide or prostate polypeptide expressing APC may be CD4 + and / or CD8 +. T cells specific for a prostate tumor protein железы, могут быть размножены с использованием стандартных способов. В предпочтительных вариантах Т-клетки получают либо из пациента, либо из родственного или неродственного донора и вводят пациенту после стимуляции и размножения. gland may be propagated using standard techniques. In preferred embodiments, the T cells are obtained either from the patient or from a related or unrelated donor and are administered to the patient following stimulation and propagation.

Для терапевтических целей CD4 + и/или CD8 + Т-клетки, которые пролиферируют в ответ на опухолевый полипептид, полинуклеотид предстательной железы или экспрессирующие указанный полипептид АРС, могут быть размножены до большего числа клеток in vitro или in vivo. For therapeutic purposes, CD4 + and / or CD8 + T cells that proliferate in response to a tumor polypeptide, polynucleotide prostate expressing said polypeptide or APC can be expanded to a larger number of cells in vitro or in vivo. Пролиферацию таких Т-клеток in vitro можно проводить различными путями. In vitro proliferation of T cells may be carried out in various ways. Например, эти Т-клетки могут быть повторно экспонированы опухолевому полипептиду предстательной железы или короткому пептиду, соответствующему иммуногенной части такого полипептида, с добавлением или без добавления факторов роста Т-клеток, таких как интерлейкин-2, и/или стимулирующих клеток, которые синтезируют опухолевый полипептид предстательной железы. For example, the T cells can be re-exposed tumor polypeptide of the prostate or a short peptide corresponding to an immunogenic portion of such a polypeptide, with or without addition of growth factors, T-cells, such as interleukin-2, and / or stimulating cells that synthesize a tumor prostate polypeptide. Альтернативно, одна или несколько Т-клеток, которые пролиферируют в присутствии опухолевого белка предстательной железы, могут быть увеличены в числе клеток посредством клонирования. Alternatively, one or more T cells that proliferate in the presence of a prostate tumor protein may be increased in cell number by cloning. Способы клонирования клеток хорошо известны в данной области и включают в себя лимитирующее разбавление. Methods for cloning cells are well known in the art, and include limiting dilution.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ВАКЦИНЫ Pharmaceutical compositions and vaccines

В некоторых аспектах описанные здесь полипептиды, полинуклеотиды, Т-клетки и/или связывающие агенты могут быть включены в фармацевтические композиции или иммуногенные композиции (т.е. вакцины). In certain aspects, polypeptides, polynucleotides, T cells and / or binding agents described herein can be incorporated into pharmaceutical compositions or immunogenic compositions (i.e., vaccines). Фармацевтические композиции содержат одно или несколько таких соединений и физиологически приемлемый носитель. Pharmaceutical compositions comprise one or more such compounds and a physiologically acceptable carrier. Вакцины могут содержать одно или несколько таких соединений и неспецифический усилитель иммунного ответа. Vaccines may comprise one or more such compounds and a non-specific immune response enhancer. Неспецифические усилители иммунного ответа включают в себя адъюванты, биодеградируемые микросферы (например, галактид полимолочной кислоты) и липосомы (в которые включено данное соединение; например, Fullerton, патент Соединенных Штатов № 4235877). Non-specific immune response enhancers include adjuvants, biodegradable microspheres (e.g., polylactic acid Galactics) and liposomes (into which the compound is incorporated; e.g., Fullerton, US Patent 4,235,877 №). Получение вакцин описано в общем, например, в MFPowell and MJNewman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Preparation of vaccines is generally described, for example, in MFPowell and MJNewman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Фармацевтические композиции и вакцины, находящиеся в объеме данного изобретения, могут также содержать другие соединения, которые могут быть биологически активными или неактивными. Pharmaceutical compositions and vaccines, are within the scope of the present invention may also contain other compounds that may be biologically active or inactive. Например, одна или несколько иммуногенных частей других опухолевых антигенов могут присутствовать либо включенными в слитый полипептид, либо в виде отдельного соединения в этой композиции или вакцине. For example, one or more immunogenic portions of other tumor antigens may be present either incorporated into a fusion polypeptide or as a separate compound in the composition or vaccine.

Фармацевтическая композиция или вакцина может содержать ДНК, кодирующую один или несколько вышеописанных полипептидов, так что указанный полипептид генерируется in situ. A pharmaceutical composition or vaccine may contain DNA encoding one or more of the above polypeptides, such that the polypeptide is generated in situ. Как отмечалось выше, эта ДНК может присутствовать в любой из различных систем доставки, известных средним специалистам в данной области, в том числе системах экспрессии нуклеиновых кислот, бактериальных и вирусных системах экспрессии. As noted above, the DNA may be present in any of a variety of delivery systems known to those of ordinary skill in the art, including nucleic acid expression systems, bacterial and viral expression systems. Многочисленные способы доставки генов хорошо известны в данной области, такие как описанные Rolland, Crit. Numerous gene delivery techniques are well known in the art such as those described Rolland, Crit. Rev. Rev. Therap. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998 и цитированные в этой работе в ссылках. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998 and references cited in this work references. Подходящие системы экспрессии нуклеиновых кислот содержат необходимые последовательности-ДНК для экспрессии в пациенте (такие как подходящие промотор и сигнал терминации). Appropriate nucleic acid expression systems contain the necessary DNA sequences for expression in the patient (such as a suitable promoter and terminating signal). Бактериальные системы доставки предусматривают введение бактерии (такой как Bacillus-Calmette-Guerrin), которая экспрессирует иммуногенную часть данного полипептида на ее клеточной поверхности или секретирует такой эпитоп. Bacterial delivery systems involve the administration of bacteria (such as Bacillus-Calmette-Guerrin), that expresses an immunogenic portion of the polypeptide on its cell surface or secretes such an epitope. В предпочтительном варианте ДНК может быть введена с использованием вирусной экспрессионной системы (например, вируса коровьей оспы или другого поксвируса, ретровируса или аденовируса), которая может предусматривать применение непатогенного (дефектного) репликационно-компетентного вируса. In a preferred embodiment, the DNA may be introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus), which may involve the use of a non-pathogenic (defective), replication competent virus. Подходящие системы описаны, например, в Fisher-Hoch et al., Proc. Suitable systems are described, for example, in Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 86:317-321; USA 86: 317-321; Flexner et al., Ann. Flexner et al., Ann. NYAcad. NYAcad. Sci. Sci. 569:86-103, 1989; 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; Flexner et al, Vaccine 8: 17-21, 1990. патент Соединенных Штатов № 4603112 и патент Соединенных Штатов № 5017487; United States patent number 4603112 and United States patent number 5017487; WO 89/01973; WO 89/01973; патент Соединенных Штатов № 4777127; United States patent number 4777127; GB 2200651; GB 2200651; ЕР 0345242; EP 0345242; WO 91/02805; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:627, 1988; Berkner, Biotechniques 6: 627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252;431-434, 1991; Rosenfeld et al, Science 252;. 431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Kolls et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 91:215-219, 1994; USA 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; USA 90: 11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993 и Guzman et al., Cir. Guzman et al, Circulation 88:. 2838-2848, 1993 and Guzman et al, Cir.. Res. Res. 73:1202-1207, 1993. Способы включения ДНК в такие экспрессионные системы хорошо известны средним специалистам в данной области. 73: 1202-1207, 1993. Methods for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. ДНК может быть также “оголенной” (депротеинизированной), как описано, например, в Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 и в обзоре Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Поглощение депротеинизированной ДНК может быть увеличено нанесением этой ДНК в виде покрытия на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки. DNA may also be "naked" (deproteinized) as described, for example, in Ulmer et al, Science 259:. 1745-1749, 1993 and in the review Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. The uptake of naked DNA may be increased applying the DNA coated onto biodegradable beads, which are efficiently transported into the cells.

Хотя любой подходящий носитель, известный средним специалистам в данной области, может быть использован в фармацевтических композициях данного изобретения, тип носителя будет меняться в зависимости от способа введения. While any suitable carrier known to those of ordinary skill in the art may be used in the pharmaceutical compositions of this invention, the type of carrier will vary depending on the mode of administration. Композиции данного изобретения могут быть приготовлены для любого подходящего способа введения, в том числе, например, местного, перорального, назального, внутривенного, внутричерепного, внутрибрюшинного, подкожного или внутримышечного введения. The compositions of this invention may be formulated for any appropriate manner of administration, including for example, topical, oral, nasal, intravenous, intracranial, intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular administration. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, солевой раствор, спирт, жир, воск или буфер. For parenteral administration, such as subcutaneous injection, the carrier preferably comprises water, saline, alcohol, fat, a wax or a buffer. Для перорального введения может быть использован любой из вышеуказанных носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. For oral administration, it may be used any of the above carriers or a solid carrier such as mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talcum, cellulose, glucose, sucrose and magnesium carbonate. Биодеградируемые микросферы (например, полилактат-полигликолат) могут быть также использованы в качестве носителей для фармацевтических композиций данного изобретения. Biodegradable microspheres (e.g., polylactate-poliglikolat) may also be employed as carriers for the pharmaceutical compositions of this invention. Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах Соединенных Штатов № 4897268 и 5075109. Suitable biodegradable microspheres are disclosed, for example, in United States Patents 4897268 and 5075109 №.

Такие композиции могут также содержать буферы (например, нейтрально забуференный солевой раствор или забуференный фосфатом солевой раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, хелатообразователи, такие как ЭДТА или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия) и/или консерванты. Such compositions may also comprise buffers (e.g., neutral buffered saline or phosphate buffered saline), carbohydrates (e.g., glucose, mannose, sucrose or dextrans), mannitol, proteins, polypeptides or amino acids such as glycine, antioxidants, chelating agents such as EDTA or glutathione, adjuvants (e.g., aluminum hydroxide) and / or preservatives. Альтернативно, композиции данного изобретения могут быть приготовлены в виде лиофилизата. Alternatively, the compositions of this invention may be formulated as a lyophilizate. Соединения могут быть также инкапсулированы в липосомах с использованием хорошо известной технологии. Compounds may also be encapsulated within liposomes using well known technology.

Любой из разнообразных неспецифических усилителей иммунного ответа может быть использован в вакцинах данного изобретения. Any of a variety of non-specific immune response enhancers may be employed in the vaccines of this invention. Например, может быть включен адъювант. For example, an adjuvant may be included. Большинство адъювантов содержат вещество, предназначенное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как липид А, белки, полученные из Bortadella pertussis или Mycobacterium tuberculosis. Most adjuvants contain a substance designed to protect the antigen from rapid catabolism, such as aluminum hydroxide or mineral oil, and a stimulator of immune responses, such as lipid A, proteins derived from Bortadella pertussis or Mycobacterium tuberculosis. Подходящие адъюванты является коммерчески доступными, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, MI); Suitable adjuvants are commercially available, for example, Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI); адъювант 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); Adjuvant 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; aluminum salts such as aluminum hydroxide gel (alum) or aluminum phosphate; соли кальция, железа или цинка; salts of calcium, iron or zinc; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; an insoluble suspension of acylated tyrosine; ацилированные сахара; acylated sugars; катионно или анионно дериватизованные полисахариды; cationically or anionically derivatized polysaccharides; полифосфазены; polyphosphazenes; биодеградируемые микросферы; biodegradable microspheres; монофосфориллипид А и квил А. Цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12, могут быть также использованы в качестве адъювантов. monophosphoryl lipid A and Quil A. Cytokines, such as GM-CSF or interleukin-2, -7, or -12, it may also be used as adjuvants.

В рассматриваемых здесь вакцинах адъювантная композиция предпочтительно предназначена для индукции иммунного ответа типа Th1. The vaccines contemplated herein, the adjuvant composition is preferably designed to induce an immune response of type Th1. Высокие уровни цитокинов Th1-типа (например, IFN-γ, IL-2 и IL-12) имеют тенденцию благоприятствовать индукции клеточно-опосредованных иммунных ответов на введенный антиген. High levels of Th1-type cytokines (e.g., IFN-γ, IL-2 and IL-12) tend to favor the induction of cell mediated immune responses to an administered antigen. В противоположность этому высокие уровни цитокинов Тh2-типа (например, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и TNF-β) имеют тенденцию благоприятствовать индукции гуморальных иммунных ответов. In contrast, high levels of Th2-type cytokines (e.g., IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 and TNF-β) tend to favor the induction of humoral immune responses. После применения рассматриваемой здесь вакцины в пациенте будет поддерживаться иммунная реакция, которая включает в себя ответы Th1- и Тh2-типа. Following application of a vaccine contemplated herein will be maintained in the patient's immune response that includes Th1- and Th2 responses type. В предпочтительном варианте, в котором иммунный ответ является преимущественно ответом Th1-типа, уровень цитокинов Th1-типа будет увеличиваться в большей степени, чем уровень цитокинов Тh2-типа. In a preferred embodiment, wherein the immune response is predominantly Th1-type response, the cytokines Th1-type level will increase to a greater extent than the level of Th2-type cytokines. Уровни этих цитокинов могут быть легко определены с использованием стандартных анализов. The levels of these cytokines may be readily determined using standard assays. В отношении обзора семейств цитокинов см. Mosmann and Coffman, Ann. For a review of the families of cytokines, see. Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Rev. Immunol. Immunol. 7:145-173, 1989. 7: 145-173, 1989.

Предпочтительные адъюванты для применения в индукции преимущественно ответа Th1-типа включают в себя, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-де-O-ацилированного монофосфориллипида A (3D-MPL), вместе с солью алюминия. Preferred adjuvants for use in the induction predominantly Th1-type response include, for example, a combination of monophosphoryl lipid A, preferably 3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A (3D-MPL), together with an aluminum salt. MPL-адъюванты доступны из Ribi IiniriunoChem Research Inc. -MPL adjuvants are available from Ribi IiniriunoChem Research Inc. (Hamilton, MT; патенты Соединенных Штатов № 4436727, 4877611, 4866034 и 4912024). (Hamilton, MT; United States patents № 4,436,727, 4,877,611, 4,866,034 and 4,912,024). CpG-содержащие олигонуклеотиды (в которых динуклеотид CpG является неметилированным) также индуцируют преимущественно Th1-ответ. CpG-containing oligonucleotides (in which the CpG dinucleotide is unmethylated) also induce a predominantly Th1-response. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555. Such oligonucleotides are well known and are described, e.g., in WO 96/02555. Другим предпочтительным адъювантом является сапонин, предпочтительно QS21, который может использоваться отдельно или в комбинации с другими адъювантами. Another preferred adjuvant is a saponin, preferably QS21, which may be used alone or in combination with other adjuvants. Например, усиленная система предусматривает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, например комбинацию QS21 и 3D-MPL, как описано в WO 94/00153, или менее реакционноспособную композицию, в которой QS21 погашен холестерином, как описано в WO 96/33739. For example, enhanced system involves the combination of a monophosphoryl lipid A and saponin derivative, such as a combination of QS21 and 3D-MPL, as described in WO 94/00153, or a less reactive composition, wherein the QS21 is quenched with cholesterol, as described in WO 96/33739. Другие предпочтительные композиции содержат эмульсию типа масло-в-воде и токоферол. Other preferred formulations comprise an emulsion of oil-in-water emulsion and tocopherol. Особенно сильнодействующая адъювантная композиция, содержащая QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии типа масло-в-воде, описана в WO 95/17210. A particularly potent adjuvant composition comprising QS21, 3D-MPL and tocopherol in an oil-in-water emulsion is described in WO 95/17210. Любая рассматриваемая здесь вакцина может быть приготовлена с использованием хорошо известных способов, которые могут приводить к получению комбинации антигена, усилителя иммунного ответа и подходящего носителя или наполнителя. Any considered here vaccine can be prepared using well-known methods, which may result in a combination of antigen, immune response amplifier and a suitable carrier or excipient.

Описанные здесь композиции могут вводиться в виде части формы продолжительного высвобождения (т.е. композиции, такой как капсула или пористый материал, которая осуществляет медленное высвобождение соединения после введения). The compositions described herein may be administered as part of a sustained release form (i.e., a composition such as a capsule or a porous material, which provides a slow release of compound following administration). Такие формы могут быть обычно приготовлены с использованием хорошо известных способов и могут вводиться, например, перорально, ректально или подкожной имплантацией, или имплантацией в целевом участке-мишени. Such formulations may generally be prepared using well known methods and can be administered, e.g., orally, rectally or by subcutaneous implantation, or by implantation into the target site of a target. Формы продолжительного высвобождения могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, диспергированные в матриксе-носителе и/или содержащиеся в резервуаре, окруженном регулирующей скорость мембраной; Sustained release forms can contain a polypeptide, polynucleotide or antibody dispersed in a carrier matrix and / or contained in a reservoir surrounded by a rate regulating membrane; предпочтительно эта форма обеспечивает относительно константный уровень высвобождения активного компонента. preferably, this shape provides a relatively constant level of active component release. Количество активного компонента, содержащееся в композиции продолжительного высвобождения, зависит от места имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения и характера подлежащего лечению или предупреждению состояния. The quantity of active component contained in the sustained release formulation depends upon the site of implantation, rate and expected duration of release and the nature be treated or prevented state.

Любой из разнообразных доставляющих носителей может быть использован в фармацевтических композициях и вакцинах для облегчения получения антиген-специфического иммунного ответа, который нацелен на опухолевые клетки. Any of a variety of delivery vehicles may be used in pharmaceutical compositions and vaccines to facilitate preparation of antigen-specific immune response that targets tumor cells. Носители для доставки включают в себя антиген-презентирующие клетки (АРС), такие как дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, моноциты и другие клетки, которые могут быть сконструированы таким образом, чтобы они были эффективными АРС. Delivery vehicles include antigen presenting cells (APC) such as dendritic cells, macrophages, B cells, monocytes and other cells that may be engineered so that they were efficient APC. Такие клетки могут быть, но необязательно, генетически модифицированными для увеличения способности презентации антигена, для улучшения активации и/или поддержания Т-клеточного ответа, чтобы иметь противоопухолевые эффекты per se и/или быть иммунологически совместимыми с реципиентом (т.е. иметь совместимый гаплотип HLA). Such cells may, but need not be genetically modified to increase the ability of antigen presentation, to improve activation and / or maintenance of T cell response, to have antitumor effects per se and / or to be immunologically compatible with the recipient (i.e., have a compatible haplotype HLA). АРС могут быть обычно выделены из любых различных биологических жидкостей и органов, в том числе опухолевых и околоопухолевых тканей, и могут быть аутологичными, аллогенными, сингенными или ксеногенными клетками. APCs may generally be isolated from any of a variety of biological fluids and organs, including tumor and okoloopuholevyh tissues, and may be autologous, allogeneic, syngeneic or xenogeneic cells.

Некоторые предпочтительные варианты данного изобретения используют дендритные клетки или их клетки-предшественники в качестве антиген-презентирующих клеток. Certain preferred embodiments of the present invention use dendritic cells or their precursor cells as antigen-presenting cells. Дендритные клетки являются очень сильными АРС (Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998), и было показано, что они являются эффективными в качестве физиологического адъюванта для индукции профилактического или терапевтического противоопухолевого иммунитета (Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). Dendritic cells are highly potent APCs (Banchereau and Steinman, Nature 392: 245-251, 1998), and it was shown that they are effective as a physiological adjuvant for induction of prophylactic or therapeutic antitumor immunity (Timmerman and Levy, Ann Rev. Med. . 50: 507-529, 1999). Обычно дендритные клетки могут быть идентифицированы на основании их типичной формы (звездообразной in situ, с заметными цитоплазматическими выступами (дендрита-ми), видимыми in vitro) и на основании отсутствия маркеров дифференцировки В-клеток (CD19 и CD20), Т-клеток (CD3), моноцитов (CD14) и натуральных киллеров (CD56), определяемой с использованием стандартных анализов. Typically, dendritic cells may be identified based on their typical shape (a star in situ, with marked cytoplasmic projections (dendrite mi) visible in vitro) and based on the lack of differentiation markers of B cells (CD19 and CD20), T cells (CD3 ), monocytes (CD14) and natural killer cells (CD56), determined using standard assays. Дендритные клетки могут быть, конечно, сконструированы для экспрессии специфических поверхностных рецепторов или лигандов, которые обычно не обнаруживаются на дендритных клетках in vivo или ex vivo, и такие модифицированные дендритные клетки рассматриваются данным изобретением. Dendritic cells may, of course, designed for expression of specific surface receptors or ligands that are not commonly found on dendritic cells in vivo or ex vivo, and such modified dendritic cells are contemplated by the invention. В качестве альтернативы дендритным клеткам в вакцине могут быть использованы секретируемые пузырьки нагруженных антигеном дендритных клеток (называемые экзосомами) (Zitovogel et al.. Nature Med. 4:594-600, 1998). In (.: 594-600, 1998 Zitovogel et al .. Nature Med 4) As an alternative to dendritic cells, secreted vesicles antigen-loaded dendritic cells (called exosomes) may be used in the vaccine.

Дендритные клетки и их клетки-предшественники могут быть получены из периферической крови, костного мозга, инфильтрирующих опухоль клеток, инфильтрирующих околоопухолевые ткани клеток, лимфатических узлов, селезенки, кожи, крови, пупочного канатика или любой другой подходящей ткани или жидкости. Dendritic cells and progenitors may be obtained from peripheral blood, bone marrow, tumor-infiltrating cells, infiltrating cells okoloopuholevye tissue, lymph nodes, spleen, skin, blood, umbilical cord or any other suitable tissue or fluid. Например, дендритные клетки могут быть дифференцированы ех vivo путем добавления комбинации цитокинов, таких как GM-CSF, IL-4, IL-13 и/или TNFα, к культурам моноцитов, собранных из периферической крови. For example, dendritic cells may be differentiated ex vivo by adding a combination of cytokines such as GM-CSF, IL-4, IL-13 and / or TNFα, to cultures of monocytes harvested from peripheral blood. Альтернативно, CD3 4-положительные клетки, собранные из периферической крови, крови пуповины или костного мозга, могут быть дифференцированы в дендритные клетки путем добавления к культуральной среде комбинаций GM-CSF, IL-3, TNFa, СD40-лиганда, LPS, flt3-лиганда и/или другого соединения (соединений), индуцирующих созревание и пролиферацию дендритных клеток. Alternatively, CD3 4-positive cells harvested from peripheral blood, umbilical cord blood or bone marrow may be differentiated into dendritic cells by adding to the culture medium, GM-CSF combinations, IL-3, TNFa, CD40 ligand, LPS, flt3-ligand and / or other compound (s) that induce maturation and proliferation of dendritic cells.

Дендритные клетки подразделяют для удобства на “незрелые” и “зрелые” клетки, что делает возможным простой способ различения между двумя хорошо охарактеризованными фенотипами. Dendritic cells are divided for convenience into "immature" and "mature" cells, which allows a simple way to distinguish between two well characterized phenotypes. Однако эта номенклатура не должна предназначаться для исключения всех возможных промежуточных стадий дифференцировки. However, this nomenclature should not be intended to exclude all possible intermediate stages of differentiation. Незрелые дендритные клетки характеризуются как АРС с высокой способностью поглощения и процессирования антигена, которая коррелирует с высокой экспрессией Fcγ-рецептора, рецептора маннозы и DEC-205-маркера. Immature dendritic cells are characterized as APC with a high absorption capacity and antigen processing, which correlates with the high expression of Fcγ-receptor, mannose receptor and DEC-205 marker. Зрелый фенотип обычно характеризуется более низкой экспрессией этих маркеров, но отличается высокой экспрессией молекул поверхности клетки, ответственных за активацию Т-клеток, таких как МНС класса I и класса II, молекулы адгезии (например, CD54 и CD11) и костимулирующие молекулы (например, CD40, CD80 и CD86). The mature phenotype is typically characterized by a lower expression of these markers, but differs high expression of surface molecules cells, responsible for T cell activation, such as MHC class I and class II, adhesion molecules (e.g., CD54 and CD11) and costimulatory molecules (e.g., CD40 , CD80 and CD86).

Обычно АРС могут быть трансфицированы полинуклеотидом, кодирующим опухолевый белок предстательной железы (или его часть или его другой вариант), так что на клеточной поверхности экспрессируется опухолевый полипептид предстательной железы или его иммуногенная часть. Typically APC can be transfected with a polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate (or a portion thereof or a different embodiment), so that at the cell surface expressed tumor prostate polypeptide or the immunogenic portion. Такая трансфекция может иметь место ex vivo, и затем композиция или вакцина, содержащая такие трансфицированные клетки, могут быть использованы для терапевтических целей, как описано здесь. Such transfection may take place ex vivo, and then the composition or vaccine comprising such transfected cells may be used for therapeutic purposes, as described herein. Альтернативно, носитель для доставки гена, которые нацелен на дендритную или другую антиген-презентирующуго клетку, может быть введен пациенту, что приводит к трансфекции, которая происходит in vivo. Alternatively, a gene delivery vehicle that targets a dendritic or other antigen-prezentiruyuschugo cell may be administered to a patient, resulting in transfection that occurs in vivo. Трансфекция in vivo и ex vivo дендритных клеток может обычно выполняться, например, с использованием любых способов, известных в данной области, таких как способы, описанные в WO 97/24447, или подход с использованием генной пушки, описанный Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997. Нагрузка антигеном дендритных клеток может быть достигнута инкубированием дендритных клеток или их клеток-предшественников с опухолевым полипептидом предстательной железы, ДНК (депротеинизированной или в плазмидном векторе) или РНК; Transfection of in vivo and ex vivo dendritic cells may generally be performed, for example, using any of the methods known in the art, such as those described in WO 97/24447, or approach using the gene gun described by Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456-460, 1997. load antigen of dendritic cells may be achieved by incubating dendritic cells or progenitor cells with the tumor polypeptide prostate DNA (deproteinized or in a plasmid vector) or RNA; или с экспрессирующими антиген рекомбинантными бактерией или вирусами (например, векторами, являющимся вирусом коровьей оспы, птичьей оспы, аденовирусом или лентивирусом). or with antigen-expressing recombinant bacterium or viruses (e.g., the vectors being vaccinia virus, fowlpox, adenovirus or lentivirus). Перед нагрузкой полипептид может быть ковалентно конъюгирован с иммунологическим партнером, который обеспечивает помощь Т-клеткам (например, молекулой-носителем). Before loading the polypeptide may be covalently conjugated to an immunological partner that provides T cell help (e.g., a carrier molecule). Альтернативно, дендритная клетка может быть кратковременно обработана неконъюгированным иммунологическим партнером, отдельно или в присутствии полипептида. Alternatively, a dendritic cell may be briefly treated nonconjugated immunological partner, separately or in the presence of the polypeptide.

ТЕРАПИЯ РАКА CANCER THERAPY

В дополнительных аспектах данного изобретения описанные здесь композиции могут быть использованы для иммунотерапии рака, такого как рак предстательной железы. In further aspects of this invention, the compositions described herein can be used for immunotherapy of cancer, such as prostate cancer. В таких способах фармацевтические композиции и вакцины обычно вводят пациентам. In such methods, pharmaceutical compositions and vaccines are typically administered to patients. В применении здесь термин "пациент" относится к любому теплокровному животному, предпочтительно человеку. As used herein the term "patient" refers to any warm-blooded animal, preferably a human.

Пациент может быть или может не быть поражен раком. The patient may or may not be struck by cancer. Вышеописанные композиции и вакцины могут быть использованы для предупреждения развития рака или для лечения пациента, пораженного раком. The above-described compositions and vaccines may be used to prevent the development of cancer or to treat a patient afflicted with cancer. Рак может быть диагностирован с использованием критериев, обычно принятых в данной области, в том числе по наличию злокачественной опухоли. The cancer may be diagnosed using criteria generally accepted in the art, including the presence of a malignant tumor. Фармацевтические композиции и вакцины могут вводиться либо до, либо после хирургического удаления первичных опухолей и/или лечения, такого как проведение лучевой терапии или введение общепринятых химиотерапевтических лекарственных средств. Pharmaceutical compositions and vaccines may be administered either prior to or following surgical removal of primary tumors and / or treatment, such as radiation therapy or the administration of conventional chemotherapeutic drugs.

В некоторых вариантах иммунотерапия может быть активной иммунотерапией, в которой лечение основано на стимуляции in vivo эндогенной иммунной системы человека для реакции против опухолей путем введения модифицирующих иммунный ответ агентов (таких как описанные здесь полипептиды и полинуклеотиды). In some embodiments, immunotherapy may be active immunotherapy, in which (such as polypeptides and polynucleotides disclosed herein) treatment is based on the in vivo stimulation of the endogenous immune system to react against tumors by administering the agents modifying the immune response.

В других вариантах иммунотерапия может быть пассивной иммунотерапией, в которой лечение предусматривает доставку агентов с установленной опухолеиммунной реактивностью (таких как эффекторные клетки или антитела), которые могут непосредственно или опосредованно медиировать противоопухолевые эффекты и необязательно зависят от интактной иммунной системы хозяина. In other embodiments, immunotherapy may be passive immunotherapy, in which treatment involves the delivery of agents with established opuholeimmunnoy reactivity (such as effector cells or antibodies) that can directly or indirectly mediate antitumor effects and, optionally, depend on an intact host immune system. Примеры эффекторных клеток включают в себя обсужденные выше Т-клетки, Т-лимфоциты (такие как CD8 + цитотоксические Т-лимфоциты и CD4 + Т-хелперные инфильтрирующие опухоль лимфоциты), клетки-киллеры (такие как природные клетки-киллеры и активируемые лимфокинами клетки-киллеры), В-клетки и антиген-презентирующие клетки (такие как дендритные клетки и макрофаги), экспрессирующие предлагаемый здесь полипептид. Examples of effector cells include those discussed above the T cells, T lymphocytes (such as CD8 + cytotoxic T lymphocytes and CD4 + T-helper tumor-infiltrating lymphocytes), killer cells (such as Natural Killer cells and lymphokine-activated kletki killer cells), B cells and antigen-presenting cells (such as dendritic cells and macrophages) expressing a polypeptide herein proposed. Рецепторы Т-клеток и рецепторы антител, специфическиие для описанных здесь полипептидов, могут быть клонированы, экспрессированы и перенесены в другие векторы или эффекторные клетки для адоптивной иммунотерапии. T-cell receptors and receptors are antibodies specific to polypeptides described herein may be cloned, expressed and transferred into other vectors or effector cells for adoptive immunotherapy. Обеспеченные здесь полипептиды могут быть также использованы для генерирования антител или антиидиотипических антител (как описано выше и в патенте Соединенных Штатов № 4918164) для пассивной иммунотерапии. polypeptides provided herein may also be used to generate antibodies or anti-idiotypic antibodies (as described above and in United States Patent № 4,918,164) for passive immunotherapy.

Эффекторные клетки могут быть обычно получены в достаточных количествах для адоптивной иммунотерапии путем выращивания in vitro, как описано здесь. Effector cells may generally be obtained in sufficient quantities for adoptive immunotherapy by cultivation in vitro, as described herein. Условия культуры для размножения одиночных антиген-специфических эффекторных клеток до нескольких биллионов клеток с сохранением узнавания in vivo хорошо известно в данной области. Culture conditions for the growth of single antigen-specific effector cells to several billion cells retaining recognition in vivo are well known in the art. Такие условия культивирования in vitro обычно предусматривают периодическую стимуляцию антигеном, часто в присутствии цитокинов (таких как IL-2) и неделящихся питающих клеток-фидеров. Such in vitro culture conditions typically provide intermittent stimulation with antigen, often in the presence of cytokines (such as IL-2) and non-dividing feeder feeder cells. Как отмечалось выше, иммунореактивные полипептиды, обеспеченные здесь, могут быть использованы для быстрого размножения культур антиген-специфических Т-клеток для генерирования достаточного числа клеток для иммунотерапии. As noted above, immunoreactive polypeptides provided herein can be used for the rapid propagation of cultures of antigen-specific T cells to generate sufficient number of cells for immunotherapy. В частности, антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты или В-клетки, могут быть кратковременно обработаны иммунореактивными полипептидами или трансфицированы одним или несколькими полинуклеогидами с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области. In particular, antigen-presenting cells such as dendritic cells, macrophages, monocytes, fibroblasts or B-cells can be briefly treated with immunoreactive polypeptides or transfected with one or more polinukleogidami using standard methods well known in the art. Например, антиген-презентирующие клетки могут быть трансфицированы полинуклеотидом, имеющим промотор, пригодный для увеличения экспрессии в рекомбинантной вирусной или другой экспрессионной системе. For example, antigen-presenting cells can be transfected with a polynucleotide having a promoter suitable for increasing expression in a recombinant virus or other expression system. Культивируемые эффекторные клетки для применения в терапии должны быть способны расти и широко распространяться и выживать в течение длительного времени in vivo. Cultured effector cells for use in therapy must be able to grow and spread widely, and to survive for long periods in vivo. Исследования показали, что культивируемые эффекторные клетки могут быть индуцированы для роста in vivo и длительного выживания в значительных количествах путем повторяемой стимуляции антигеном, дополненным IL-2 (например, Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997). Studies have shown that cultured effector cells can be induced to grow in vivo and prolonged survival in significant quantities by repeated stimulation with antigen supplemented with IL-2 (for example, Cheever et al, Immunological Reviews 157:. 177, 1997).

Альтернативно, вектор, экспрессирующий описанный здесь полипептид, может быть введен в антиген-презентирующие клетки, взятые из пациента, и клонально размножен ех vivo для трансплантации обратно в того же самого пациента. Alternatively, a vector expressing a polypeptide described herein, may be introduced into antigen presenting cells taken from a patient and clonally propagated ex vivo for transplant back into the same patient. Трансфицированные клетки могут быть повторно введены с использованием любого из известных в данной области способов, предпочтительно в стерильной форме посредством внутривенного, внутриполостного, внутрибрюшинного или внутриопухолевого введения. Transfected cells may be reintroduced using any of those known in the art, preferably in sterile form by intravenous, intracavitary, intraperitoneal or intratumor administration.

Пути и частота введения описанных здесь терапевтических композиций, а также доза, будут варьировать от индивидуума к индивидууму и могут быть легко установлены с использованием стандартных способов. Path and frequency of administration of the therapeutic compositions described herein, as well as dosage, will vary from individual to individual and may be readily established using standard techniques. Обычно эти фармацевтические композиции могут вводиться инъекцией (например, внутрикожной, внутримышечной, внутривенной или подкожной), интраназально (например, аспирацией) или перорально. Typically, the pharmaceutical compositions may be administered by injection (e.g., intracutaneous, intramuscular, intravenous or subcutaneous), intranasally (e.g., by aspiration) or orally. Предпочтительно 1-10 доз могут быть введены на протяжении периода 52 недель. Preferably 1-10 doses may be administered over a period of 52 weeks. Предпочтительно вводят 6 доз с интервалами 1 месяц, и после этого могут периодически проводиться бустер-вакцинации. Preferably, 6 doses are administered at intervals of 1 month, and then may be periodically performed booster vaccination. Для индивидуальных пациентов могут быть подходящими другие протоколы введения. For individual patients may be other suitable administration protocols. Подходящей дозой является количество соединения, которое при введении, как описано выше, способно стимулировать противоопухолевый иммунный ответ и находится, по меньшей мере, на 10-50% выше фонового уровня (т.е. без введения этого соединения). A suitable dose is an amount of compound that, when administered as described above, can stimulate anti-tumor immune response, and is at least 10-50% above the background level (i.e., without the introduction of this compound). Такой ответ может быть подвергнут мониторингу путем измерения противоопухолевых антител в пациенте или по вакцина-зависимому генерированию цитолитических эффекторных клеток, способных убивать опухолевые клетки пациента in vitro. Such response can be monitored by measuring the anti-tumor antibodies in a patient or by vaccine-dependent generation of cytolytic effector cells capable of killing the patient's tumor cells in vitro. Такие вакцины должны быть способны вызывать иммунный ответ, который приводит к улучшенному клиническому результату (например, более частым ремиссиям, полному или частичному или более продолжительному выживанию без заболевания) в случае вакцинированных пациентов в сравнении с невакцинированными пациентами. Such a vaccine should be capable of eliciting an immune response that leads to an improved clinical outcome (e.g., more frequent remissions, complete or partial or longer disease-free survival) in vaccinated patients case compared to nonvaccinated patients. Обычно для фармацевтических композиций и вакцин, содержащих один или несколько полипептидов, количество каждого полипептида находится в диапазонах доз от приблизительно 100 мкг до 5 мг/кг веса тела хозяина. Generally, for pharmaceutical compositions and vaccines comprising one or more polypeptides, the amount of each polypeptide is in a dose ranges from about 100 .mu.g to about 5 mg / kg body weight of the host. Подходящие размеры доз будут варьировать в зависимости от размера пациента, но обычно будут находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мл до приблизительно 5 мл. Suitable dose sizes will vary with the size of the patient, but will typically be in the range from about 0.1 mL to about 5 mL.

Обычно подходящая схема приема и лечения обеспечивает активное соединение (активные соединения) в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического и/или профилактического преимущества. Typically suitable reception and treatment regimen provides the active compound (the active compounds) in an amount sufficient to provide therapeutic and / or prophylactic benefits. Такой ответ может наблюдаться по установлению улучшенного клинического результата (например, более частых ремиссий, полного или частичного или более продолжительного выживания без заболевания) в случае получающих лечение пациентов в сравнении с не получающими лечение пациентами. Such a response can be observed by establishing an improved clinical outcome (e.g., more frequent remissions, complete or partial or longer disease-free survival) in the case of treated patients compared with untreated patients. Увеличения предсуществующих иммунных ответов на опухолевый белок предстательной железы обычно коррелируют с улучшенным клиническим результатом. Increase in preexisting immune responses to a tumor protein of the prostate generally correlate with an improved clinical outcome. Такие иммунные ответы обычно оценивают с использованием стандартных анализов пролиферации, цитотоксичности или анализов на цитокины, которые могут выполняться с использованием образцов, полученных из пациента до и после лечения. Such immune responses typically evaluated using standard proliferation assays, cytotoxicity or cytokine assays, which may be performed using samples obtained from a patient before and after treatment.

СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РАКА METHODS FOR CANCER DETECTION

Обычно рак может быть обнаружен у пациента на основании наличия одного или нескольких опухолевых белков предстательной железы и/или полинуклеотидов, кодирующих такие белки, в биологическом образце (например, крови, сыворотке, моче и/или биопстате опухоли), полученном из пациента. Typically, the cancer can be detected in a patient based on the presence of one or more prostate tumor proteins and / or polynucleotides encoding such proteins in a biological sample (e.g., blood, serum, urine and / or tumor biopstate) obtained from the patient. Другими словами, такие белки могут быть использованы в качестве маркеров для указания на наличие или отсутствие рака, такого как рак предстательной железы. In other words, such proteins may be used as markers to indicate the presence or absence of a cancer such as prostate cancer. Кроме того, такие белки могут быть применимы для обнаружения других раков. Furthermore, such proteins may be useful for the detection of other cancers. Связывающие агенты, обеспеченные здесь, обычно позволяют определять уровень антигена, который связывается с таким агентом, в биологическом образце. The binding agents provided herein generally possible to determine the level of antigen that binds to an agent in a biological sample. Полинуклеотидные праймеры и зонды могут быть использованы для определения уровня мРНК, кодирующей опухолевый белок, который также может указывать на присутствие или отсутствие рака. Polynucleotide primers and probes may be used to determine the level of mRNA encoding a tumor protein, which may also indicate the presence or absence of cancer. Обычно опухолевая последовательность мРНК предстательной железы должна присутствовать при уровне, который, по меньшей мере, в три раза выше в опухолевой ткани, чем в здоровой ткани. Normally mRNA sequence of tumor of the prostate should be present at a level that is at least three fold higher in tumor tissue than in normal tissue.

Имеются различные форматы анализов, известные средним специалистам в данной области, для использования связывающего агента для определения полипептидных маркеров в образце. There are various formats of assays known to those of ordinary skill in the art, to determine the binding agent to the polypeptide markers in a sample. Например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Обычно наличие или отсутствие раковой опухоли у пациента может быть определено (а) взаимодействием биологического образца, полученного из пациента, со связывающим агентом; For example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Typically, the presence or absence of a cancer in a patient can be determined by (a) reacting a biological sample obtained from a patient with a binding agent; (b) определением в указанном образце уровня полипептида, который связывается со связывающим агентом; (B) determining in said sample the level of polypeptide that binds to the binding agent; и (с) сравнением уровня полипептида с заранее определенной предельной величиной. and (c) comparing the level of polypeptide with a predetermined limit value.

В предпочтительном варианте анализ предусматривает использование связывающего агента, иммобилизованного на твердом носителе, для связывания и удаления указанного полипептида из остального образца. In a preferred embodiment, the analysis involves the use of binding agent immobilized on a solid support to bind to and remove the polypeptide from the remaining sample. Затем связанный полипептид может определяться с использованием определяющего реагента, который содержит репортерную группу и специфически связывается с комплексом связывающий агент/полипептид. Then, the bound polypeptide may be determined using the determining reagent that contains a reporter group and specifically binds to the binding agent / polypeptide. Такие определяющие агенты могут содержать, например, связывающий агент, который специфически связывается с данным полипептидом, или антитело или другой агент, который специфически связывается со связывающим агентом, такой как анти-иммуноглобулин, белок G, белок А или лектин. Such agents may comprise determining, for example, a binding agent that specifically binds to the polypeptide or an antibody or other agent that specifically binds to the binding agent, such as an anti-immunoglobulin, protein G, protein A or a lectin. Альтернативно, может быть использован конкурентный анализ, в котором полипептид метят репортерной группой и дают ему связываться с иммобилизованным связывающим агентом после инкубации связывающего агента с образцом. Alternatively, it may be used in a competitive assay in which a polypeptide is labeled with a reporter group and allowed to bind to the immobilized binding agent after incubation of the binding agent with the sample. Степень, до которой компоненты указанного образца подавляют связывание меченого полипептида со связывающим агентом, указывает на реактивность указанного образца с иммобилизованным связывающим агентом. The extent to which components of said sample inhibit the binding of the labeled polypeptide to the binding agent, indicates the reactivity of said sample with the immobilized binding agent. Подходящие полипептиды для использования в таких анализах, включают в себя полноразмерные опухолевые белки предстательной железы и их части, с которыми связывается связывающий агент, как описано выше. Suitable polypeptides for use in such assays include full length prostate tumor proteins of the prostate and parts thereof to which the binding agent binds, as described above.

Твердым носителем может быть любой материал, известный средним специалистам в данной области, к которому может быть присоединен опухолевый белок. A solid carrier can be any material known to those of ordinary skill in the art to which may be attached tumor protein. Например, твердым носителем может быть тест-лунка в планшете для микротитрования или нитроцеллюлозная или другая подходящая мембрана. For example, the solid support may be a test well in a microtiter plate or a nitrocellulose or other suitable membrane. Альтернативно, носителем может быть гранула или диск, такой как стеклянный, стекловолоконный, латексный или пластиковый материал, такой как полистирол или поливинилхлорид. Alternatively, the support may be a bead or disc, such as glass, fiberglass, latex or a plastic material such as polystyrene or polyvinylchloride. Носитель может быть также магнитной частицей или волоконно-оптическим датчиком, таким как описанный, например, в патенте Соединенных Штатов № 5359681. Связывающий агент может быть иммобилизован на твердом носителе при помощи различных способов, известных средним специалистам в данной области, которые вполне достаточно описаны в патентной и научной литературе. The carrier may also be a magnetic particle or a fiber optic sensor, such as described in the United States, for example, in patent № 5359681. The binding agent may be immobilized on a solid support using a variety of methods known to those of ordinary skill in the art that is sufficient described in patent and scientific literature. В контексте данного изобретения термин "иммобилизация" относится как к нековалентной связи, такой как адсорбция, так и к ковалентному присоединению (которое может быть прямой связью между агентом и функциональными группами на носителе или может быть связью посредством сшивающего агента). As used herein, the term "immobilization" refers to both noncovalent association, such as adsorption, and covalent attachment to a (which may be a direct bond between the agent and functional groups on the support or may be coupled via a crosslinking agent). Предпочтительной является иммобилизация посредством адсорбции с лункой в планшете для микротитрования или с мембраной. Preferred is Immobilization by adsorption to the well in a microtiter plate or a membrane. В таких случаях адсорбция может достигаться взаимодействием связывающего агента в подходящем буфере с указанным твердым носителем в течение подходящего периода времени. In such cases, adsorption may be achieved by reacting a binding agent in a suitable buffer, with the solid support for a suitable time period. Время взаимодействия варьируется в зависимости от температуры, но обычно находится в диапазоне между приблизительно 1 часом и приблизительно 1 днем. The reaction time varies depending on the temperature, but is usually in the range between about 1 hour and about 1 day. Обычно взаимодействие лунки пластикового планшета для микротитрования (такого как полистироловый или поливинилхлоридный планшет) с количеством связывающего агента от приблизительно 10 нг до приблизительно 10 мкг и предпочтительно от приблизительно 100 нг до приблизительно 1 мкг является достаточным для иммобилизации адекватного количества связывающего агента. Usually, interaction of the plastic wells of a microtiter (such as polystyrene or polyvinylchloride plate) with the amount of binding agent from about 10 ng to about 10 micrograms, and preferably about 100 ng to about 1 g is sufficient to immobilize an adequate amount of binding agent.

Ковалентное присоединение связывающего агента к твердому носителю обычно достигается сначала реакцией носителя с бифункциональным реагентом, который будет реагировать как с носителем, так и с функциональной группой, такой как гидроксил или аминогруппа, на связывающем агенте. Covalent attachment of binding agent to a solid support is usually achieved by first reacting the support with a bifunctional reagent that will react with both the support and a functional group such as hydroxyl or amino group, on the binding agent. Например, связывающий агент может быть ковалентно присоединен к носителям, имеющим подходящее полимерное покрытие, при помощи бензохинона или посредством конденсации альдегидной группы на носителе с амином и активным водородом на партнере связывания (например, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13). For example, the binding agent may be covalently attached to supports having an appropriate polymer coating using benzoquinone or by condensation of an aldehyde group on the support with an amine and an active hydrogen on the binding partner (e.g., Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13) .

В некоторых вариантах указанный анализ является сэндвич-анализом с использованием двух антител. In some embodiments said assay is a sandwich assay using two antibodies. Указанный анализ может выполняться взаимодействием сначала антитела, которое было иммобилизовано на твердом носителе, обычно лунке планшета для микротитрования, с образцом, так чтобы полипептиды в образце могли связываться с иммобилизованным антителом. Said analysis can be carried out by reacting a first antibody that is immobilized on a solid support, commonly the well of a microtiter plate, with the sample, so that the polypeptides in the sample can bind to the immobilized antibody. Затем несвязанный образец удаляют из иммобилизованных комплексов полипептид-антитело и добавляют определяющий реагент (предпочтительно второе антитело, способное связываться с отличающимся сайтом на указанном полипептиде), содержащий репортерную группу. Unbound sample is then removed from the immobilized polypeptide-antibody complexes and determining added reagent (preferably a second antibody capable of binding to a different site on the polypeptide) containing a reporter group. Затем определяют количество определяющего реагента, которое остается связанным с твердым носителем, с использованием способа, подходящего для этой специфической репортерной группы. Then, determine the number defining the reagent that remains bound to the solid support using a method suitable for this specific reporter group.

Более конкретно, после иммобилизации антитела на носителе, как описано выше, оставшиеся сайты связывания белка на носителе обычно блокируют любым подходящим блокирующим агентом, известным средним специалистам в данной области, таким как бычий сывороточный альбумин или Твин 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). More specifically, after immobilizing the antibody on a support as described above, the remaining protein binding sites on the carrier is usually blocked by any suitable blocking agent known to those of ordinary skill in the art, such as bovine serum albumin or Tween 20 ™ (Sigma Chemical Co., St. louis, MO). Затем иммобилизованное антитело инкубируют с образцом и полипептиду дают связаться с антителом. Then, the immobilized antibody is incubated with the sample, and polypeptide is allowed to bind to the antibody. Образец может быть разбавлен подходящим растворителем, таким как забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР), перед инкубированием. The sample may be diluted with a suitable solvent, such as phosphate-buffered saline (PBS) prior to incubation. Обычно подходящим временем взаимодействия (т.е. временем инкубации) является период времени, который является достаточным для определения наличия полипептида в образце, полученного из индивидуума с раком предстательной железы. Usually the best interaction time (i.e., incubation time) is a period of time which is sufficient to determine the presence of polypeptide within a sample obtained from an individual with prostate cancer. Предпочтительно это время контакта является достаточным для достижения уровня связывания, которое равно, по меньшей мере, приблизительно 95% времени, достигаемого при равновесии между связавшимся и несвязавшимся полипептидом. Preferably, the contact time is sufficient to achieve a level of binding that is at least about 95% of the time, achieved at equilibrium between bound and unbound polypeptide. Среднему специалисту в данной области будет понятно, что время, необходимое для достижения равновесия, может быть легко определено путем определения уровня связывания, которое имеет место на протяжении некоторого периода времени. One of ordinary skill in the art will recognize that the time necessary to achieve equilibrium may be readily determined by determining the level of binding that occurs over a period of time. При комнатной температуре обычно является достаточным время инкубации приблизительно 30 минут. At room temperature is generally sufficient incubation time of about 30 minutes.

Затем несвязавшийся образец может быть удален промыванием твердого носителя подходящим буфером, таким как ЗФР, содержащий 0,1% Твин 20™. Then unbound sample can be removed by washing the solid support with a suitable buffer, such as PBS containing 0.1% Tween 20 ™. Затем к твердому носителю может быть добавлено второе антитело, которое содержит репортерную группу. Then, the second antibody may be added to the solid support which contains a reporter group. Предпочтительные репортерные группы включают в себя группы, описанные выше. Preferred reporter groups include those groups described above.

Затем определяющий реагент инкубируют с комплексом иммобилизованное антитело/полипептид в течение времени, достаточного для определения связанного полипептида. Then defining the reactant is incubated with a complex of immobilized antibody / polypeptide for a time sufficient to determine the bound polypeptide. Подходящее время может быть обычно определено определением уровня связывания, происходящего на протяжении некоторого периода времени. A suitable time may be generally defined definition level of binding that occurs over a period of time. Затем несвязанный определяющий реагент удаляют, а связанный определяющий реагент определяют с использованием репортерной группы. Then determining the unbound reagent is removed, and determining a related reagent is determined using the reporter group. Способ, применяемый для определения репортерной группы, зависит от природы этой репортерной группы. The method used to determine the reporter group depends upon the nature of the reporter group. Для радиоактивных групп обычно подходят способы сцинтилляционного счета или ауторадиографии. For radioactive groups are generally suitable ways scintillation counting or autoradiography. Спектроскопические способы могут быть использованы для определения красителей, люминесцентных групп и флуоресцентных групп. Spectroscopic methods may be used to detect dyes, luminescent groups and fluorescent groups. Биотин может определяться с использованием авидина, связанного с отличающейся репортерной группой (обычно радиоактивной или флуоресцентной группой или ферментом). Biotin can be determined using avidin associated with a different reporter group (commonly a radioactive or fluorescent group or an enzyme). Ферментная репортерная группа может обычно определяться путем добавления субстрата (обычно в течение определенного периода времени) с последующим спектроскопическим или другим анализом продуктов реакции. Enzyme reporter groups may generally be determined by the addition of substrate (generally for a specific period of time), followed by spectroscopic or other analysis of the reaction products.

Для определения наличия или отсутствия рака, такого как рак предстательной железы, сигнал, определяемый из репортерной группы, которая остается связанной с твердым носителем, обычно сравнивают с сигналом, соответствующим заранее определенной предельной величине. To determine the presence or absence of a cancer such as prostate cancer, the signal is determined from the reporter group that remains bound to the solid carrier is usually compared with a signal corresponding to a predetermined limit value. В одном предпочтительном варианте предельной величиной для определения рака является среднее значение сигнала, полученного при инкубировании иммобилизованного антитела с образцами пациентов, не страдающих раковой опухолью. In one preferred embodiment, the limit value for the definition of cancer is the average signal value obtained with the incubation of the immobilized antibody with a patient sample, not affected by cancer. Обычно образцу, генерирующую сигнал, который на три стандартных отклонения выше заранее определенной предельной величины, считают положительным в отношении рака. Typically, the model generates a signal that is three standard deviations above the predetermined limit value is considered positive for the cancer. В другом предпочтительном варианте предельную величину определяют с использованием кривой Receiver Operator Curve в соответствии со способом Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p.106-7. In another preferred embodiment, the limit value is determined using a Receiver Operator Curve curve according to the method of Sackett et al, Clinical Epidemiology:. A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p.106-7. Вкратце, в указанном варианте предельная величина может быть определена из графика пар истинно положительных уровней (т.е. чувствительности) и ложноположительных уровней (100%-специфичность), которые соответствуют каждой возможной предельной величине для каждого диагностического результата. Briefly, in this embodiment, the limit value may be determined from the plot of pairs of true positive levels (i.e., sensitivity) and false positive levels (100% -specific) that correspond to each possible limit value for each diagnostic result. Предельная величина на указанном графике, т.е. Limit value at a specified schedule, i.e. наиболее близкая к верхнему левому углу (т.е. величина, включающая в себя наибольшую площадь), является наиболее точной предельной величиной, и образец, генерирующий сигнал, который является более высоким, чем предельная величина, определенная указанным способом, может считаться положительной. closest to the upper left corner (i.e., the value that includes the largest area) is the most accurate cut-off point, and a sample generating a signal that is higher than the limit value determined by this method may be considered positive. Альтернативно, предельная величина может быть сдвинута влево вдоль графика для минимизации ложноположительного уровня или вправо для минимизации ложноотрицательного уровня. Alternatively, the limit value may be shifted to the left along the plot to minimize false positive or right level in order to minimize false negative level. Обычно образец, генерирующий сигнал, который является более высоким, чем предельная величина, определенная указанным способом, считают положительным в отношении рака. Typically, a sample generating a signal that is higher than the limit value determined by this method is considered positive for the cancer.

В родственном варианте указанный анализ выполняют в формате проточного теста или теста-полоски, в котором связывающий агент иммобилизуют на мембране, такой как нитроцеллюлозная мембрана. In a related embodiment, the analysis is performed in a flow test format or test strip, wherein the binding agent is immobilized on a membrane, such as nitrocellulose membrane. В проточном тесте полипептиды в образце связываются с иммобилизованным связывающим агентом при прохождении образца через эту мембрану. In the flow test the polypeptides in the sample bind to the immobilized binding agent by passing the sample through the membrane. Затем второй меченый связывающий агент связывается с комплексом связывающий агент/полипептид при протекании раствора, содержащего второй связывающий агент, через мембрану. Then the labeled second binding agent binds to the binding agent / polypeptide when flowing a solution containing the second binding agent through the membrane. Затем может быть выполнено определение связанного второго связывающего агента, как описано выше. Then, judgment is made may be bound second binding agent as described above. В формате тест-полоски один конец мембраны, с которой связан связывающий агент, погружен в раствор, содержащий образец. The test strip format, one end of the membrane to which binding agent is bound, is immersed in a solution containing the sample. Образец мигрирует вдоль мембраны через район, содержащий второй связывающий агент, к зоне иммобилизованного связывающего агента. The sample migrates along the membrane through a region containing second binding agent to the area of ​​immobilized binding agent. Концентрация второго связывающего агента в зоне иммобилизованного антитела указывает на присутствие рака. Concentration of second binding agent at the area of ​​immobilized antibody indicates the presence of cancer. Обычно концентрация второго связывающего агента в указанном участке генерирует рисунок, такой как линия, который может регистрироваться визуально. Typically, the concentration of second binding agent in said figure generating portion such as a line, that can be detected visually. Отсутствие такого рисунка указывает на отрицательный результат. The absence of such a pattern indicates a negative result. Обычно количество связывающего агента, иммобилизованного на мембране, выбрано таким образом, чтобы генерировать визуально различимый рисунок, когда биологический образец содержит уровень полипептида, который был бы достаточным для генерирования положительного сигнала в сэндвич-анализе с двумя антителами в обсужденном выше формате. Usually the amount of binding agent immobilized on the membrane is selected so as to generate a visually discernible pattern when the biological sample contains a level of polypeptide that would be sufficient to generate a positive signal in a sandwich assay the two antibodies in the format discussed above. Предпочтительными связывающими агентами для применения в таких анализах являются антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Preferred binding agents for use in such assays are antibodies and antigen-binding fragments thereof. Предпочтительно количество антитела, иммобилизованного на мембране, находится в диапазоне от приблизительно 25 нг до приблизительно 1 мкг и более предпочтительно от приблизительно 50 нг до приблизительно 500 нг. Preferably, the amount of antibody immobilized on the membrane ranges from about 25 ng to about 1 g, and more preferably from about 50 ng to about 500 ng. Такие тесты обычно могут проводиться с очень маленьким количеством биологического образца. Such tests can typically be performed with a very small amount of biological sample.

Конечно, существуют многочисленные другие протоколы анализов, которые пригодны для использования с опухолевыми белками или связывающими агентами данного изобретения. Of course, there are numerous other protocols assays which are suitable for use with the tumor proteins or binding agents of the present invention. Приведенные выше описания должны рассматриваться только как примеры. The above descriptions should be regarded only as examples. Например, средним специалистам в данной области будет понятно, что вышеописанные протоколы могут быть легко модифицированы для применения опухолевых полипептидов предстательной железы для определения антител, которые связываются с такими полипептидами, в биологическом образце. For example, those of ordinary skill in the art will appreciate that the above protocols may be readily modified to use tumor polypeptides prostate to detect antibodies that bind to such polypeptides in a biological sample. Определение таких специфических для опухолевого белка предстательной железы антител может коррелировать с присутствием рака. The identification of such tumor protein specific for prostate antibodies may correlate with the presence of cancer.

Рак может быть также или альтенативно определяться на основании наличия Т-клеток, которые специфически реагируют с опухолевым белком предстательной железы, в биологическом образце. Cancer can also be the alternate or determined based on the presence of T cells that specifically react with a tumor protein of the prostate, in a biological sample. В некоторых способах биологический образец, содержащий CD4 + и/или CD8 + Т-клетки, выделенный из пациента, инкубируют с опухолевым полипептидом предстательной железы, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или АРС, которая экспрессирует, по меньшей мере, иммуногенную часть такого полипептида, и определяют наличие или отсутствие специфической активации этих Т-клеток. In some methods, a biological sample comprising CD4 + and / or CD8 + T cells isolated from a patient is incubated with a tumor polypeptide prostate, polynucleotide encoding such a polypeptide and / or APC that expresses at least an immunogenic portion of such polypeptide, and determining the presence or absence of specific activation of the T cells. Пригодные биологические образцы включают в себя, но не ограничиваются ими, выделенные Т-клетки. Suitable biological samples include, but are not limited to, isolated T cells. Например, Т-клетки могут быть выделены из пациента рутинными способами (такими как центрифугирование в градиенте плотности фиколла/Hypaque лимфоцитов периферической крови). For example, T cells may be isolated from a patient by routine techniques (such as centrifugation in density gradient of Ficoll / Hypaque peripheral blood lymphocytes). Т-клетки могут быть инкубированы in vitro в течение 2-9 дней (обычно 4 дней) при 37°С с опухолевым полипептидом предстательной железы (например, 5-25 мкг/мл). T cells may be incubated in vitro for 2-9 days (typically 4 days) at 37 ° C with prostate tumor polypeptide (e.g., 5-25 ug / ml). Может быть желательным инкубирование другой аликвоты образца Т-клеток в отсутствие опухолевого полипептида предстательной железы в качестве контроля. It may be desirable incubating another aliquot of the sample of T cells in the absence of tumor polypeptide prostate as control. Для CD4 + Т-клеток активацию предпочтительно определяют оценкой пролиферации Т-клеток. For CD4 + T cell activation are preferably determined by assessing T cell proliferation. Для CD8 + Т-клеток активацию предпочтительно определяют оценкой цитолитической активности. For CD8 + T cell activation is preferably determined evaluation of the cytolytic activity. Уровень пролиферации, который по меньшей мере в два раза выше, и/или уровень цитолитической активности, который по меньшей мере на 20% выше, чем в не имеющих заболевания пациентах, указывает на наличие раковой опухоли у пациента. The level of proliferation that is at least two times higher, and / or a level of cytolytic activity that is at least 20% higher than in patients without the disease indicates the presence of cancer in the patient.

Как отмечалось выше, рак может быть определен также или альтернативно на основании уровня мРНК, кодирующей опухолевый белок предстательной железы, в биологическом образце. As noted above, a cancer may also be determined or alternatively on the basis of the level of mRNA encoding a tumor protein of the prostate, in a biological sample. Например, по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера могут быть использованы в анализе на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации части кДНК опухоли предстательной железы, полученной из биологического образца, в котором по меньшей мере один из олигонуклеотидных праймеров является специфическим для (т.е. гибридизуется с ним) полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок предстательной железы. For example, at least two oligonucleotide primers may be employed in the assay based on polymerase chain reaction (PCR) to amplify a portion of a prostate tumor cDNA derived from a biological sample, wherein at least one of the oligonucleotide primers is specific for (i.e. . hybridizes with) a polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate gland. Затем амплифицированную кДНК отделяют и определяют с использованием способов, хорошо известных в данной области, таких как гель-электрофорез. Then the amplified cDNA is separated and determined using methods well known in the art, such as gel electrophoresis. Подобным образом, олигонуклеотидные зонды, которые специфически гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим опухолевый белок предстательной железы, могут быть использованы в гибридизационном анализе для определения наличия полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок, в биологическом образце. Similarly, oligonucleotide probes that specifically hybridize to a polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate, can be used in a hybridization assay to detect the presence of polynucleotide encoding the tumor protein in a biological sample.

Для возможности гибридизации в условиях анализа олигонуклеотидные праймеры и зонды должны содержать олигонуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 60%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичность относительно части полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок предстательной железы, которая имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов и предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов. To enable hybridization under assay conditions, oligonucleotide primers and probes should comprise an oligonucleotide sequence that has at least about 60%, preferably at least about 75% and more preferably at least about 90% identity to part of a polynucleotide encoding a tumor protein prostate which has a length of at least 10 nucleotides, and preferably at least 20 nucleotides. Предпочтительно олигонуклеотидные праймеры и/или зонды будут гибридизоваться с полинуклеотидом, кодирующим описанный здесь полипептид, при умеренно жестких условиях, определенных выше. Preferably, oligonucleotide primers and / or probes will hybridize to a polynucleotide encoding a polypeptide described herein under moderately stringent conditions, as defined above. Олигонуклеотидные праймеры и/или зонды, которые могут быть выгодно использованы в диагностических способах, описанных здесь, предпочтительно имеют длину по меньшей мере 10-40 нуклеотидов. Oligonucleotide primers and / or probes which may be advantageously used in the diagnostic methods described herein preferably have a length of at least 10-40 nucleotides. В предпочтительных вариантах олигонуклеотидные праймеры и зонды содержат по меньшей мере 10 непрерывных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 непрерывных нуклеотидов молекулы ДНК, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NО:1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375 и 381. Способы для анализов на основе ПЦР и гибридизационных анализов хорошо известны в данной области (например, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Eriich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989). In preferred embodiments, oligonucleotide primers and probes comprise at least 10 contiguous nucleotides, more preferably at least 15 contiguous nucleotides of a DNA molecule having a sequence recited in SEQ ID NO: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179 -305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375 and 381. methods for PCR based assays and hybridization assays are well known in the art (e.g., Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. .. quant Biol, 51: 263, 1987; Eriich ed, PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989)..

В одном предпочтительном анализе используют ОТ-ПЦР, в которой ПЦР применяют в сочетании с обратной транскрипцией. In one preferred assay employs RT-PCR, in which PCR is applied in conjunction with reverse transcription. Обычно РНК экстрагируют из биологического образца, такого как ткань биопсии, и обратно транскрибируют с получением кДНК-молекул. Typically, RNA is extracted from a biological sample, such as biopsy tissue, and reverse transcribed to produce cDNA molecules. ПЦР-амплификация с использованием, по меньшей мере, одного специфического праймера генерирует кДНК-молекулу, которая может быть отделена и визуализирована при помощи, например, гель-электрофореза. PCR amplification using at least one specific primer generates a cDNA molecule, which may be separated and visualized using, for example, gel electrophoresis. Амплификация может выполняться на биологических образцах, взятых из обследуемого пациента и из индивидуума, который не имеет рака. Amplification may be performed on biological samples taken from the patient under examination and from an individual who does not have cancer. Реакция амплификации может быть проведена на нескольких разведениях кДНК, охватывающих два порядка величин. The amplification reaction may be performed on several dilutions of cDNA spanning two orders of magnitude. Двукратное или большее увеличение экспрессии в нескольких разведениях образца обследуемого пациента в сравнении с теми же самыми разведениями неракового образца обычно рассматривается как положительное. A twofold or greater increase in expression in several dilutions of the subject patient sample as compared to the same dilutions of the sample noncancerous generally regarded as positive.

В другом варианте описанные композиции могут быть использованы в качестве маркеров прогрессирования рака. In another embodiment, the disclosed compositions can be used as markers of cancer progression. В указанном варианте описанные выше анализы для диагностики рака могут выполняться на протяжении времени и оценивается изменение в уровне реакционноспособного полипептида (полипептидов) или полинуклеотида. In this embodiment, assays as described above for the diagnosis of a cancer may be performed over time and the estimated change in the level of reactive polypeptide (s) or polynucleotide. Например, эти анализы могут выполняться каждые 24-72 часа в течение периода 6 месяцев-1 года и после указанного выполняться по необходимости. For example, these assays may be performed every 24-72 hours for a period of 6 months and 1 year after the specified performed as needed. Обычно рак является прогрессирующим в пациентах, в которых уровень определяемого полипептида или полинуклеотида увеличивается со временем. Usually the cancer is progressing in patients in whom the level of polypeptide or polynucleotide is determined increases with time. В противоположность указанному рак не является прогрессирующим, когда уровень реакционноспособного полипептида или полинуклеотида либо остается постоянным, либо снижается со временем. In contrast to said cancer is not progressing when the level of reactive polypeptide or polynucleotide either remains constant or decreases with time.

Некоторые диагностические анализы in vivo могут проводиться непосредственно на опухоли. Certain in vivo diagnostic assays may be performed directly on a tumor. Один из таких анализов предусматривает взаимодействие опухолевых клеток со связывающим агентом. One such assay comprises contacting the tumor cells with a binding agent. Затем связанный связывающий агент может быть детектирован прямо или косвенно через репортерную группу. Then, the bound binding agent may be detected directly or indirectly via a reporter group. Такие связывающие агенты могут также использоваться в гистологических приложениях. Such binding agents may also be used in histological applications. Альтернативно, полинуклеотидные зонды могут быть использованы для таких приложений. Alternatively, polynucleotide probes may be used for such applications.

Как отмечалось выше, для улучшения чувствительности многочисленные маркеры опухолевого белка предстательной железы могут анализироваться в конкретном образце. As noted above, to improve sensitivity multiple tumor protein markers of prostate may be analyzed in a given sample. Должно быть понятно, что связывающие агенты, специфические для различных обеспеченных здесь белков, могут комбинироваться в едином анализе. It will be appreciated that binding agents specific for different proteins provided herein may be combined within a single assay. Далее, многочисленные праймеры или зонды могут использоваться совместно. Further, multiple primers or probes may be used together. Выбор маркеров опухолевого белка может основываться на рутинных экспериментах для определения комбинаций, которые дают оптимальную чувствительность. Selection of tumor protein markers may be based on routine experiments to determine combinations that give optimum sensitivity. Кроме того, или альтернативно, анализы на опухолевые белки, обеспеченные здесь, могут комбинироваться с анализами на другие известные опухолевые антигены. Additionally or alternatively, assays for tumor proteins provided herein may be combined with assays for other known tumor antigens.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ НАБОРЫ DIAGNOSTIC KITS

Данное изобретение обеспечивает, далее, наборы для применения в любом из вышеописанных диагностических способов. The present invention provides further a kit for use in any of the above diagnostic methods. Такие наборы обычно содержат два или более компонентов, необходимых для проведения диагностического анализа. Such kits typically comprise two or more components necessary for carrying out the diagnostic assay. Компоненты могут быть соединениями, реагентами, контейнерами и/или оборудованием. Components may be compounds, reagents, containers and / or equipment. Например, один контейнер в наборе может содержать моноклональное антитело или его фрагмент, который специфически связывается с опухолевым белком предстательной железы. For example, one container in the kit may contain a monoclonal antibody or fragment thereof that specifically binds to a tumor protein of the prostate. Такие антитела или фрагменты могут быть обеспечены присоединенными к материалу-носителю, как описано выше. Such antibodies or fragments may be provided attached to the carrier material, as described above. Один или несколько дополнительных контейнеров могут содержать элементы, такие как реагенты или буферы для использования в анализе. One or more additional containers may contain elements, such as reagents or buffers for use in the assay. Такие наборы могут также или альтернативно содержать определяющий реагент, описанный выше, который содержит репортерную группу, пригодную для прямого или опосредованного определения связывания антител. Such kits may also, or alternatively comprise determining reagent as described above that contains a reporter group suitable for direct or indirect determination of antibody binding.

Альтернативно, набор может быть предназначен для определения уровня мРНК, кодирующей опухолевый белок предстательной железы, в биологическом образце. Alternatively, the kit may be designed to determine the level of mRNA encoding a tumor protein of the prostate, in a biological sample. Такие наборы обычно содержат по меньшей мере один олигонуклеотидный зонд или праймер, описанные выше, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим опухолевый белок предстательной железы. Such kits generally comprise at least one oligonucleotide probe or primer, described above, that hybridizes to a polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate. Такой олигонуклеотид может быть использован, например, в ПЦР-анализе или гибридизационном анализе. Such an oligonucleotide may be used, for example in PCR analysis or a hybridization assay. Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в таких наборах, включают в себя второй олигонуклеотид и/или диагностический реагент или контейнер для облегчения определения полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок предстательной железы. Additional components which may be present in such kits include a second oligonucleotide and / or a diagnostic reagent or container to facilitate the determination of a polynucleotide encoding a tumor protein of the prostate.

Нижеследующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не для ограничения изобретения. The following examples are offered by way of illustration and not to limit the invention.

ПРИМЕРЫ EXAMPLES

ПРИМЕР 1 EXAMPLE 1

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕВЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Isolation and characterization of TUMOR POLYPEPTIDES PROSTATE

Указанный пример описывает выделение некоторых опухолевых полипептидов предстательной железы из библиотеки кДНК опухоли предстательной железы. This example describes the isolation of certain prostate tumor polypeptides from a prostate prostate tumor cDNA library.

Экспрессионную библиотеку кДНК опухоли предстательной железы человека конструировали из поли А + РНК с использованием Superscript Plasmid System для синтеза кДНК и набора Plasmid Cloning Kit (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD 20897) в соответствии с протоколом изготовителя. An expression library of human prostate tumor cDNA was constructed from poly A + RNA using a Superscript Plasmid System for cDNA synthesis kit and Plasmid Cloning Kit (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD 20897) following the manufacturer's protocol. Конкретно, ткани опухоли предстательной железы гомогенизировали с политроном (Kinematica, Switzerland) и общую РНК экстрагировали с использованием реагента Тризола (Life Technologies), как описано изготовителем. Specifically, prostate tumor tissues were homogenized with polytron (Kinematica, Switzerland) and total RNA was extracted using Trizol reagent (Life Technologies), as described by the manufacturer. Затем поли А + РНК очищали с использованием набора для очистки мРНК Qiagen oligotex spin column (Qiagen, Santa Clarita, CA 91355) в соответствии с протоколом изготовителя. Next, poly A + RNA was purified using mRNA Purification Kit Qiagen oligotex spin column (Qiagen, Santa Clarita, CA 91355) according to manufacturer's protocol. кДНК первой цепи синтезировали с использованием праймера NotI/Oligo-dT18. First strand cDNA was synthesized using primer NotI / Oligo-dT18. Синтезировали двухцепочечную кДНК, лигировали с адаптерами EcoRI/BAXI (Invitrogen, San Diego, CA) и расщепляли NotI. Double-stranded cDNA was synthesized, ligated with adapters EcoRI / BAXI (Invitrogen, San Diego, CA) and digested with NotI. После фракционирования по размеру с использованием колонок Chroma Spin-1000 (Clontech, Palo Alto/ CA) кДНК лигировали в сайт EcoRI/NotI pCDNA3.1 (Invitrogen) и трансформировали в клетки ElectroMax E.coli DH10B (BRL Life Technologies) электропорацией. Following size fractionation with Chroma Spin-columns 1000 (Clontech, Palo Alto / CA) cDNA was ligated into site EcoRI / NotI pCDNA3.1 (Invitrogen) and transformed into cells ElectroMax E.coli DH10B (BRL Life Technologies) by electroporation.

С использованием той же самой процедуры экспрессионную библиотеку кДНК поджелудочной железы здорового человека получали из пула шести тканевых образцов (Clontech). Using the same procedure expression library healthy human pancreatic cDNA prepared from a pool of six tissue specimens (Clontech). Библиотеки кДНК были охарактеризованы путем определения числа независимых колоний, процента клонов, несущих вставку, среднего размера вставки и анализа последовательности. cDNA libraries were characterized by determining the number of independent colonies percent clones harboring insert average insert size and sequence analysis. Библиотека опухоли предстательной железы содержала 1,64×10 7 независимых колоний, причем 70% клонов имели вставку и средний размер вставки был 1745 п.н. Prostate tumor library contained 1,64 × of 10 7 independent colonies, with 70% of the clones had an insert and the average insert size was 1745 base pairs Библиотека кДНК здоровой поджелудочной железы содержала 3,3×10 6 независимых колоний, причем 69% клонов имели вставки и средний размер вставки был 1120 п.н. Healthy pancreas cDNA library contained 3,3 × October 6 independent colonies, with 69% of the clones had inserts and the average insert size was 1120 base pairs Для обеих библиотек анализ последовательности показал, что большинство клонов имели полноразмерную последовательность кДНК и были синтезированы из мРНК с минимальной примесью рРНК и митохондриальной ДНК. For both libraries, sequence analysis showed that the majority of clones had a full length cDNA sequence and were synthesized from mRNA with minimal impurity rRNA and mitochondrial DNA.

Вычитание библиотек кДНК (согласно "субтрактивному методу") выполняли с использованием вышеописанных библиотек кДНК опухоли предстательной железы и нормальной поджелудочной железы, как описано Нага et al. Subtraction library cDNA (according to the "subtractive method") was carried out using the above cDNA libraries prostate tumor and normal pancreas, as described by Nag et al. (Blood, 84:189-199, 1994) с некоторыми модификациями. (Blood, 84: 189-199, 1994) with some modifications. Конкретно, являющуюся результатом вычитания опухолеспецифическую библиотеку кДНК предстательной железы получали следующим образом. Specifically, resulting from subtracting a tumor prostate cDNA library was prepared as follows. Библиотеку кДНК здоровой поджелудочной железы (70 мкг) расщепляли EcoRI, NotI и SfuI с последующей реакцией застраивания концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы. CDNA library healthy pancreas (70 ug) was digested with EcoRI, NotI, and SfuI, followed by reaction zastraivaniya ends with Klenow DNA polymerase. После экстракции смесью фенол-хлороформ и осаждения этанолом ДНК растворяли в 100 мкл Н 2 О, денатурировали нагреванием и смешивали с 100 мкл (100 мкг) биотина Photoprobe (фотозонда) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). After extraction with phenol-chloroform and ethanol precipitation the DNA was dissolved in 100 ul of H 2 O, heat-denatured and mixed with 100 .mu.l (100 .mu.g), biotin Photoprobe (fotozonda) (Vector Laboratories, Burlingame, CA ). Как рекомендовано изготовителем, полученную смесь освещали кинолампой “солнце” 270 Вт на льду в течение 20 минут. As recommended by the manufacturer, the resulting mixture was covered kinolampoy "sunshine" 270 watts on ice for 20 minutes. Добавляли дополнительное количество биотина Photoprobe (50 мкл) и повторяли реакцию биотинилирования. An additional amount of biotin Photoprobe (50 .mu.l) and the biotinylation reaction was repeated. После экстракции бутанолом пять раз ДНК осаждали этанолом и растворяли в 23 мкл Н 2 О с получением драйвер-ДНК. After extraction with butanol five times DNA was precipitated with ethanol and dissolved in 23 l of H 2 O to give the driver DNA.

Для образования ДНК-метки 10 мкг библиотеки кДНК опухоли предстательной железы расщепляли BamHI и XhoI, экстрагировали смесью фенол-хороформ и пропускали через колонки Chroma Spin-1000 (Clontech). For the formation of the DNA tags 10 ug prostate tumor cDNA library was digested with BamHI and XhoI, extracted with phenol-horoform and passed through a column Chroma Spin-1000 (Clontech). После осаждения этанолом ДНК-метку растворяли в 5 мкл Н 2 О. ДНК-метку смешивали с 15 мкл драйвер-ДНК и 20 мкл 2 × гибридизационного буфера (1,5 М NaCl/10 мМ ЭДТА/50 мМ HEPES рН 7,5/0,2% додецилсульфат натрия), покрывали минеральным маслом и полностью денатурировали нагреванием. After ethanol precipitation the DNA-marker dissolved in 5 .mu.l of H2 O. DNA marker was mixed with 15 .mu.l driver DNA and 20 ul of 2 × hybridization buffer (1.5 M NaCl / 10 mM EDTA / 50 mM HEPES pH 7.5 / 0.2% sodium dodecyl sulfate), overlaid with mineral oil and heat-denatured completely. Пробу сразу же переносили в водяную баню на 68°С и инкубировали в течение 20 часов (длительная гибридизация [LH]). The sample was immediately transferred to a water bath at 68 ° C and incubated for 20 hours (long hybridization [LH]). Затем реакционную смесь подвергали обработке стрептавидином с последующей экстракцией смесью фенол/хлороформ. Then the reaction mixture was subjected to streptavidin treatment followed by extraction with phenol / chloroform. Указанный процесс повторяли еще три раза. This process was repeated three more times. Полученную вычитанием ДНК осаждали, растворяли в 12 мкл Н 2 О, смешивали с 8 мкл драйвер-ДНК и 20 мкл 2× гибридизационного буфера и подвергали гибридизации при 68°С в течение 2 часов (кратковременная гибридизация [SH]). Obtained by subtracting the DNA was precipitated, dissolved in 12 l of H 2 O, mixed with 8 .mu.l driver DNA and 20 .mu.l of 2 × hybridization buffer, and subjected to hybridization at 68 ° C for 2 hours (short hybridization [SH]). После удаления биотинилированной двухцепочечной ДНК полученную вычитанием кДНК лигировали в сайт BamHI/XhoI хлорамфеникол-резистентной pBCSK + (Stratagene, La Jolla, CA 92037) и трансформировали в клетки Е.coli DH10B ElectroMax электропорацией для генерирования полученной вычитанием библиотеки кДНК, специфической для опухоли предстательной железы (называемой “вычитание 1 предстательной железы”). After removal of biotinylated double-stranded DNA obtained by subtracting the cDNA was ligated into the site BamHI / XhoI chloramphenicol resistant pBCSK + (Stratagene, La Jolla, CA 92037) and transformed into DH10B ElectroMax E. coli cells by electroporation to generate obtained by subtracting a cDNA library specific for prostate tumors (called "prostate subtraction 1").

Для анализа полученной вычитанием библиотеки кДНК готовили плазмидную ДНК из 100 независимых клонов, случайно выбранных из полученной вычитанием специфической для опухоли предстательной железы библиотеки и сгруппированных на основе размера вставки. For analysis obtained by subtracting a cDNA library, plasmid DNA was prepared from 100 independent clones, randomly selected from the obtained subtraction specific to prostate tumor library and grouped based on insert size. Показательные кДНК-клоны дополнительно характеризовали секвенированием ДНК с использованием автоматического секвенатора модели 373А Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Exemplary cDNA clones were further characterized by DNA sequencing using an automated sequencer model 373A Perkin Elmer / Applied Biosystems (Foster City, CA). Было показано, что шесть кДНК-клонов, далее называемых F1-13, F1-12, F1-16, H1-1, H1-9 и Н1-4, являются обильно представленными в полученной вычитанием специфической для предстательной железы библиотеке кДНК. It has been shown that the six cDNA clones, hereinafter referred to as F1-13, F1-12, F1-16, H1-1, H1-9 and N1-4 are abundantly represented in particular obtained by subtracting the prostate cDNA library. Определенные 3'- и 5'-последовательности кДНК для Fl-13 представлены в SEQ ID NО:2 и 3 соответственно, а определенные 3'-последовательности кДНК для F1-13, F1-16, H1-1, H1-9 и Н1-4 представлены в SEQ ID NО:1 и 4-7 соответственно. Certain 3'- and 5'-cDNA sequence for Fl-13 shown in SEQ ID NO: 2 and 3, respectively, and 3'-specific cDNA sequences for F1-13, F1-16, H1-1, H1-9 and H1 -4 are shown in SEQ ID NO: 1 and 4-7, respectively.

Последовательности кДНК для выделенных клонов сравнивали с известными последовательностями в банке генов с использованием баз данных EMBL и GenBank (версии 96). cDNA sequences for the isolated clones were compared to known sequences in the gene bank using the EMBL and GenBank databases (release 96). Было определено, что четыре из кДНК-клонов опухоли предстательной железы, F1-13, F1-16, H1-1 и Н1-4, кодируют следующие ранее идентифицированные белки: специфический антиген предстательной железы (PSA), гландулярный калликреин человека, усиленный опухолевой экспрессией ген человека, и субъединицу II цитохром С-оксидазы митохондрий. It has been determined that four of the cDNA clones prostate tumor, F1-13, F1-16, H1-1 and N1-4, encode the following previously identified proteins: prostate specific antigen (PSA), human glandular kallikrein, tumor expression enhanced human gene and subunit II of cytochrome C oxidase. Было обнаружено, что Р1-9 идентичен ранее идентифицированной автономно реплицирующейся последовательности. It was found that R1-9 is identical to the previously identified autonomously replicating sequences. Не было найдено значимых гомологии с последовательностью-кДНК для F1-12. No significant homology was found with the cDNA sequence for F1-12.

Последующие исследования привели к выделению полноразмерной последовательности-кДНК для F1-12. Subsequent research led to the isolation of full-length cDNA sequence for F1-12. Эта последовательность изображена в SEQ ID NO:107, с соответствующей предсказанной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:108. This sequence is shown in SEQ ID NO: 107, with the corresponding shown in SEQ ID NO predicted amino acid sequence: 108.

Для клонирования менее представленных специфических для опухоли предстательной железы генов вычитание библиотеки кДНК проводили путем вычитания библиотеки кДНК опухоли предстательной железы, описанной выше, с библиотекой кДНК здоровой поджелудочной железы и с тремя наиболее представленными генами в специфической для опухоли предстательной железы библиотеке кДНК, полученной ранее вычитанием: гландулярного калликреина человека, специфического антигена предстательной железы (PSA) и субъединицы II цитохром С-оксидазы митохондрий. To clone less submitted specific to prostate tumor genes subtraction cDNA library was performed by subtracting tumor cDNA library prostatic described above, with a library of cDNA healthy pancreas and with the three most represented genes in specific to prostate tumor cDNA library, previously obtained by subtracting: human glandular kallikrein, prostate specific antigen (PSA) and subunit II of cytochrome C oxidase. Конкретно, 1 мкг каждой из кДНК гландулярного калликреина человека, специфического антигена предстательной железы (PSA) и субъединицы II цитохром С-оксидазы митохондрий в pCDNA3.1 добавляли к драйвер-ДНК и вычитание проводили, как описано выше, с получением второй полученной вычитанием библиотеки кДНК, далее называемой “полученная вычитанием специфическая для опухоли предстательной железы библиотека кДНК со “спайком”. Specifically, 1 g of each of the cDNA of human glandular kallikrein, prostate specific antigen (PSA) and subunit II of cytochrome C oxidase in pCDNA3.1 were added to the driver DNA and subtraction was performed as described above to obtain a second resulting subtraction cDNA library , hereinafter called "obtained by subtracting specific to prostate tumor cDNA library with a" spike ".

Двадцать два кДНК-клона выделили из полученной вычитанием специфической для опухоли предстательной железы библиотеки кДНК со “спайком”. Twenty-two cDNA clones were isolated from the resulting specific for subtracting the prostate tumor cDNA library with a "spike". Определенные 3'- и 5'-последовательности кДНК для клонов, названных J1-17, L1-12, N1-1862, J1-13, J1-19, J1-25, J1-24, K1-58, K1-63, L1-4 и L1-14, представлены в SEQ ID NO:8-9, 10-11, 12-13, 14-15, 16-17, 18-19, 20-21, 22-23, 24-25, 26-27 и 28-29 соответственно. Certain 3'- and 5'-cDNA sequences for the clones, called J1-17, L1-12, N1-1862, J1-13, J1-19, J1-25, J1-24, K1-58, K1-63, L1-4 and L1-14, presented in SEQ ID NO: 8-9, 10-11, 12-13, 14-15, 16-17, 18-19, 20-21, 22-23, 24-25, 26-27 and 28-29, respectively. Определенные 3'-последовательности кДНК для клонов, названных J1-12, J1-16, J1-21, K1-48, K1-55, L1-2, L1-6, N1-1858, N1-1860, N1-1861, N1-1864, представлены в SEQ ID NO:30-40 соответственно. Certain 3'-cDNA sequences for the clones, called J1-12, J1-16, J1-21, K1-48, K1-55, L1-2, L1-6, N1-1858, N1-1860, N1-1861, N1-1864, presented in SEQ ID NO: 30-40 respectively. Сравнение этих последовательностей с последовательностями банка генов, как описано выше, не выявило значимых гомологии с тремя из пяти наиболее представленных разновидностей ДНК (J1-17, L1-12 и N-1862; SEQ ID NO:8-9, 10-11 и 12-13 соответственно). Comparison of these sequences with gene bank as described above revealed no significant homologies to three of the five most represented species DNA (J1-17, L1-12 and N-1862; SEQ ID NO: 8-9, 10-11 and 12 -13 respectively). Было обнаружено, что из остальных двух наиболее представленных разновидностей, одна (J1-12; SEQ ID NO: 30) является идентичной ранее идентифицированному сурфактант-ассоциированному легочному белку человека, а другая (К1-48; SEQ ID NO:33) имеет некоторую гомологию с мРНК R. norvegicus для 2-арилпропионил-СоА-эпимеразы. It was found that of the remaining two most represented species, one (J1-12; SEQ ID NO: 30) is identical to the previously identified pulmonary surfactant-associated protein of the human and the other (K1-48; SEQ ID NO: 33) has some homology R. norvegicus mRNA for 2-aryl-propionyl-CoA epimerase. Было обнаружено, что из 17 менее представленных кДНК-клонов, выделенных из полученной вычитанием специфической для опухоли предстательной железы библиотеки кДНК со “спайком”, четыре (J1-16, K1-55, L1-6 и N1-1864; SEQ ID NO:31, 34, 36 и 40 соответственно) являются идентичными ранее идентифицированным последовательностям, две (J1-21 и N1-1860; SEQ ID NO:32 и 38 соответственно) обнаруживают некоторую гомологию с последовательностями, не относящимися к человеку, и две (L1-2 и N1-1861; SEQ ID NO:35 и 39 соответственно) обнаруживают некоторую гомологию с известными последовательностями чел It was found that 17 of less represented cDNA clones isolated from the resulting specific for subtracting the prostate tumor cDNA library with the "spike", four (J1-16, K1-55, L1-6 and N1-1864; SEQ ID NO: 31, 34, 36 and 40, respectively) are identical to previously identified sequences, two (J1-21 and N1-1860; SEQ ID nO: 32 and 38, respectively) show some homology with sequences unrelated to the person and two (L1- 2 and N1-1861; SEQ ID NO: 35 and 39, respectively) show some homology to known sequences cel овека. oveka. Не было обнаружено значимых гомологий к полипептидам J1-13, J1-19, J1-24, J1-25, K1-58, K1-63, L1-4, L1-14 (SEQ ID NO:14-15, 16-17, 20-21, 18-19, 22-23, 24-25, 26-27, 28-29 соответственно). There were no significant homology to the polypeptides J1-13, J1-19, J1-24, J1-25, K1-58, K1-63, L1-4, L1-14 (SEQ ID NO: 14-15, 16-17 20-21, 18-19, 22-23, 24-25, 26-27, 28-29, respectively).

Последующие исследования привели к выделению полноразмерных последовательностей-кДНК для J1-17, L1-12 и N1-1862 (SEQ ID NO:109-111 соответственно). Subsequent research led to the isolation of full length cDNA sequences for J1-17, L1-12 and N1-1862 (SEQ ID NO: 109-111, respectively). Соответствующие аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO:112-114. The corresponding amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 112-114. L1-12 называют также P501S. L1-12 is also known as P501S.

В следующем эксперименте были идентифицированы четыре дополнительных клона путем вычитания библиотеки кДНК опухоли предстательной железы с кДНК здоровой предстательной железы из пула трех поли А + РНК здоровой предстательной железы (называемого "вычитание 2 предстательной железы"). In a further experiment, four additional clones by subtracting tumor prostate cDNA library from healthy prostate cDNA from a pool of three poly A + RNA healthy prostate (called "prostate subtraction 2") were identified. Определенные последовательности-кДНК для этих клонов, далее называемые U1-3064, U1-3065, V1-3692 и 1А-3905, представлены в SEQ ID NO:69-72 соответственно. Certain cDNA sequences for these clones, hereinafter referred to as U1-3064, U1-3065, V1-3692 and 1A-3905, are presented in SEQ ID NO: 69-72 respectively. Сравнение этих определенных последовательностей с последовательностями в банке генов не выявило значимых гомологий к U1-3065. Comparison of these sequences with specific sequences in the gene bank revealed no significant homologies to U1-3065.

Второе вычитание со “спайком” (называемое “вычитанием со спайком 2 предстательной железы”) выполняли путем вычитания специфической для опухоли предстательной железы библиотеки кДНК со “спайком” с библиотекой кДНК здоровой поджелудочной железы и с дополнительным "спайком" в виде генов PSA, J1-17, сурфактант-ассоциированного легочного белка, субъединицы II цитохром С-оксидазы митохондрий, N1-1862, автономно реплицирующейся последовательности, L1-12 и усиленного опухолевой экспрессией гена. A second subtraction with "spike" (called "subtraction spike 2 from prostate") was performed by subtracting specific to prostate tumor cDNA library with a "spike" with a library of cDNAs healthy pancreas and further "spike" genes in the form of PSA, J1- 17, pulmonary surfactant-associated protein, subunit II of cytochrome C oxidase, N1-1862, autonomously replicating sequence, L1-12 and tumor expression enhanced gene. Были выделены четыре дополнительных гена, далее называемых V1-3686, R1-2330, 1В-3976 и V1-3679. four additional genes were identified, hereinafter referred to as V1-3686, R1-2330, 1B-3976 and V1-3679. Определенные последовательности-кДНК для этих клонов представлены в SEQ ID NO:73-76 соответственно. Certain cDNA sequences for these clones are presented in SEQ ID NO: 73-76 respectively. Сравнение этих последовательностей с последовательностями банка генов не выявили значимых гомологий к V1-3686 и R1-2330. Comparison of these sequences with gene bank revealed no significant homologies to V1-3686 and R1-2330.

Дополнительный анализ трех вычитании предстательной железы, описанных выше (вычитания 2 предстательной железы, полученной вычитанием специфической для опухоли предстательной железы библиотеки кДНК со спайком и вычитания со спайком 2 предстательной железы), привел к идентификации шестнадцати дополнительных клонов, названных 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1G-4734, 1Н-4774, 1Н-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 1I-4810, 1I-4811, 1J-4876, 1K-4884 и 1К-4896. Additional analysis of three subtracted prostate described above (subtracting 2 prostate obtained by subtracting the prostate cDNA library specific for the tumor with a spike and subtraction with spike 2 prostate), resulted in the identification of sixteen additional clones, called 1G-4736, 1G-4738 , 1G-4741, 1G-4744, 1G-4734, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 1I-4810, 1I-4811, 1J-4876, 1K-4884 and 1K -4896. Определенные последовательности-кДНК для этих клонов представлены в SEQ ID NO:77-92 соответственно. Certain cDNA sequences for these clones are presented in SEQ ID NO: 77-92 respectively. Сравнение этих последовательностей с последовательностями банка генов не выявили значимых гомологий к 1G-4741, 1G-4734, 1I-4807, 1J-4876 и 1К-4896 (SEQ ID NO:79, 81, 87, 90 и 92 соответственно). Comparison of these sequences with gene bank revealed no significant homologies to 1G-4741, 1G-4734, 1I-4807, 1J-4876 and 1K-4896 (SEQ ID NO: 79, 81, 87, 90 and 92 respectively). Дополнительный анализ этих выделенных клонов привел к определению удлиненных последовательностей-кДНК для 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1Н-4774, 1Н-4781, 1H-4785, 1Н-4787, 1Н-4796, 1I-4876, 1K-4884 и 1К-4896, представленных в SEQ ID NO:179-188 и 191-193 соответственно, и к определению дополнительных частичных последовательностей-кДНК для 1I-4810 и 1I-4811, представленных в SEQ ID NO:189 и 190 соответственно. Further analysis of the isolated clones led to the identification of elongate sequences of cDNA for 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 1I -4876, 1K-4884 and 1K-4896, provided in SEQ ID NO: 179-188 and 191-193, respectively, and to the determination of additional partial cDNA sequences for 1I-4810 and 1I-4811, provided in SEQ ID NO: 189 and 190, respectively.

Дополнительные исследования вычитания предстательной железы со спайком 2 привело к выделению еще трех клонов. Additional studies with prostate subtraction spike 2 resulted in the isolation of three more clones. Их последовательности определяли, как описано выше, и сравнивали с самым последним банком генов. Their sequences were determined as described above, and compared with the latest bank of genes. Было обнаружено, что все три клона имеют гомологию с известными генами, которые представляют обогащенный цистеином белок, KIAA0242 и KIAA0280 (SEQ ID NО:317, 319 и 320 соответственно). It was found that all three clones have homology to known genes, which are cysteine-rich protein, KIAA0242, and KIAA0280 (SEQ ID NO: 317, 319 and 320 respectively). Дальнейший анализ этих клонов с использованием микроматрицы Synteni (Synteni, Palo Alto, CA) показал, что все три клона сверхэкспрессировались в большинстве опухолей предстательной железы и ВРН предстательной железы, а также в большинстве исследованных тканей здоровой предстательной железы, но имели низкую экспрессию во всех других здоровых тканях. Further analysis of these clones using microarray Synteni (Synteni, Palo Alto, CA) demonstrated that all three clones over-expressed in most prostate tumors and BPH prostate, as well as in most tissues examined healthy prostate, but had low expression in all other healthy tissues.

Дополнительное вычитание проводили путем вычитания библиотеки кДНК здоровой предстательной железы с кДНК здоровой поджелудочной железы (называемое “вычитание 3 предстательной железы). Additional subtraction was performed by subtracting a cDNA library from healthy prostate cDNA healthy pancreas (referred to as "prostate subtraction 3). Это привело к идентификации шести дополнительных клонов, названных 1G-4761, 1G-4762, 1Н-4766, 1Н-4770, 1Н-4771 и 1Н-4772 (SEQ ID NO:93-98). This led to the identification of six additional clones, called 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766, 1H-4770, 1H-4771 and 1H-4772 (SEQ ID NO: 93-98). Сравнение этих последовательностей с последовательностями банка генов не выявили значимых гомологии с 1G-4761 и 1Н-4771 (SEQ ID NO:93 и 97 соответственно). Comparison of these sequences with gene bank revealed no significant homologies to 1G-4761 and 1H-4771 (SEQ ID NO: 93 and 97 respectively). Дальнейший анализ выделенных клонов привел к определению удлиненных последовательностей-кДНК для 1G-4761, 1G-4762, 1Н-4766 и 1Н-4772, представленных в SEQ ID NO:194-196 и 199 соответственно и к определению дополнительных частичных последовательностей-кДНК для 1Н-4770 и 1Н-4771, представленных в SEQ ID NO:197 и 198 соответственно. Further analysis of the isolated clones led to the identification of elongate cDNA sequences for 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766 and 1H-4772 provided in SEQ ID NO: 194-196 and 199, respectively, and to the determination of additional partial cDNA sequences for 1H -4770 and 1H-4771 provided in SEQ ID NO: 197 and 198, respectively.

Вычитание библиотеки кДНК опухоли предстательной железы, полученной из пула поли A + РНК из трех пациентов с раком предстательной железы, с библиотекой кДНК здоровой поджелудочной железы (вычитание 4 предстательной железы) привело к идентификации восьми клонов, названных ID-4297, ID-4309, ID.1-4278, ID-4288, ID-4283, ID-4304, ID-4296 и ID-4280 (SEQ ID NO:99-107). Subtraction library cDNA prostate tumor obtained from a pool of poly A + RNA from three patients with prostate cancer, with a library of cDNAs healthy pancreas (subtraction 4 prostate) led to the identification of eight clones, called ID-4297, ID-4309, ID .1-4278, ID-4288, ID-4283, ID-4304, ID-4296 and ID-4280 (SEQ ID NO: 99-107). Эти последовательности сравнивали с последовательностями банка генов, как описано выше. These sequences were compared with sequences of a gene bank, as described above. Не было обнаружено значимых гомологий к ID-4283 и ID-4304 (SEQ ID NO:103 и 104 соответственно). There were no significant homology to the ID-ID-4283 and 4304 (SEQ ID NO: 103 and 104, respectively). Дальнейший анализ выделенных клонов привел к определению удлиненных последовательностей-кДНК для ID-4320, ID-4278, ID-4288, ID-4283, ID-4304, ID-4296 и ID-4280, представленных в SEQ ID NO:200-206 соответственно. Further analysis of the isolated clones led to the identification of elongate cDNA sequence for ID-4320, ID-4278, ID-4288, ID-4283, ID-4304, ID-4296 and ID-4280, provided in SEQ ID NO: 200-206, respectively .

Клоны кДНК, выделенные из вычитания 1 предстательной железы и вычитания 2 предстательной железы, описанных выше, амплифицировали при помощи ПЦР колоний и их уровни экспрессии мРНК в опухоли предстательной железы, нормальной предстательной железе и в различных других, здоровых тканях определяли с использованием технологии микроматрицы (Sуnteni, Palo Alto, CA). CDNA clones derived from subtracting 1 prostate and subtracting 2 prostate, described above, was amplified by colony PCR and their mRNA expression levels in prostate tumor, normal prostate and in various other normal tissues were determined using microarray technology (Sunteni , Palo Alto, CA). Вкратце, продукты ПЦР-амплификации наносили в виде пятен на предметные стекла в формате микроматрицы, причем каждый продукт занимал уникальное местоположение в этой матрице. Briefly, the PCR amplification products applied as spots on the slides in microarray format, with each product has a unique location in the array. мРНК экстрагировали из испытуемого образца ткани, обратно транскрибировали и генерировали флуоресцентно меченные кДНК-зонды. mRNA was extracted from the test sample of tissue, transcribed back and generate fluorescently labeled cDNA probes. Микроматрицы зондировали мечеными кДНК-зондами, предметные стекла сканировали и измеряли интенсивность флуоресценции. Microarrays were probed with the labeled cDNA probes, the slides scanned and fluorescence intensity was measured. Эта интенсивность коррелирует с интенсивностью гибридизации. This intensity correlates with the hybridization intensity. Было обнаружено, что два клона (называемые P509S и P510S) сверхэкспрессировались в опухоли предстательной железы и здоровой предстательной железе и экспрессировались при низких уровнях во всех других испытанных нормальных тканях (печени, поджелудочной железе, коже, костном мозгу, головном мозгу, молочной железе, надпочечнике, мочевом пузыре, яичках, слюнных железах, толстой кишке, почке, яичнике, легком, спинном мозгу, скелетной мышце и ободочной кишке). It was found that two clones (referred to as P509S and P510S) overexpressed in prostate tumor and healthy prostate and expressed at low levels in all other tested normal tissues (liver, pancreas, skin, bone marrow, brain, breast, adrenal gland , bladder, testes, salivary glands, colon, kidney, ovary, lung, spinal cord, skeletal muscle and colon). Определенные последовательности-кДНК для P509S и P510S представлены в SEQ ID NO:223 и 224 соответственно. Certain cDNA sequences for P509S and P510S are shown in SEQ ID NO: 223 and 224, respectively. Сравнение этих последовательностей с последовательностями в банке генов, как описано выше, обнаружило некоторую гомологию с ранее идентифицированными EST. Comparison of these sequences with the sequences in the gene bank as described above, revealed some homology to previously identified EST.

Кроме того, исследования привели к выделению полноразмерной последовательности кДНК для P509S. In addition, research has led to the isolation of full-length cDNA sequences for P509S. Эта последовательность представлена в SEQ ID NO:332, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:339. This sequence is shown in SEQ ID NO: 332 and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 339.

ПРИМЕР 2 EXAMPLE 2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТКАНЕВОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ DETERMINATION OF TISSUE SPECIFICITY OF TUMOR POLYPEPTIDES PROSTATE

С использованием ген-специфических праймеров уровни экспрессии мРНК для показательных опухолевых полипептидов предстательной железы F1-16, H1-1, J1-17 (также называемого P502S), L1-12 (также называемого P501S), F1-12 (также называемого P504S), и N1-1862 (также называемого P503S) исследовали в различных нормальных и опухолевых тканях при помощи ОТ-ПЦР. Using gene-specific primers, mRNA expression levels for illustrative prostate tumor polypeptides F1-16, H1-1, J1-17 (also referred to as P502S), L1-12 (also referred to as P501S), F1-12 (also referred to as P504S), and N1-1862 (also referred to as P503S) were investigated in various normal and tumor tissues using RT-PCR.

Вкратце, общую РНК экстрагировали из различных нормальных и опухолевых тканей с использованием реагента Тризола, как описано выше. Briefly, total RNA was extracted from various normal and tumor tissues using Trizol reagent as described above. Синтез первой цепи проводили с использованием 1-2 мкг общей РНК обратной транскриптазой SuperScript (BRL Life Technologies) при 42°С в течение одного часа. Synthesis of first strand was performed using 1-2 .mu.g of total RNA with reverse transcriptase SuperScript (BRL Life Technologies) at 42 ° C for one hour. Затем эту кДНК амплифицировали при помощи ПЦР с ген-специфическими праймерами. Then this cDNA was amplified by PCR with gene-specific primers. Для обеспечения полуколичественного характера ОТ-ПЦР β-актин использовали в качестве внутреннего контроля для каждой из испытанных тканей. To ensure the semiquantitative nature of the RT-PCR β-actin was used as an internal control for each of the tested tissues. Сначала готовили серийные разведения кДНК первой цепи и анализы ОТ-ПЦР проводили с использованием β-актин-специфических праймеров. First we prepared serial dilutions of the first strand cDNA and RT-PCR assays were performed using β-actin specific primers. Затем выбирали разведение, которое делало возможной амплификацию линейного диапазона матрицы β-актина и которое было достаточно чувствительным для отражения различий в первоначальных копийностях. Then the selected dilution which enables the linear amplification range of the matrix, and β-actin which was sensitive enough to reflect the differences in the initial copy number. С использованием этих условий уровни β-актина определяли для каждой реакции обратной транскрипции из каждой ткани. Using these conditions β-actin levels were determined for each reverse transcription reaction from each tissue. Загрязнение ДНК минимизировали обработкой ДНКазой и обеспечением результата отрицательной ПЦР, когда использовали кДНК первой цепи, которую получали без добавления обратной транскриптазы. DNA contamination minimized by DNase treatment and providing a negative PCR result when using first strand cDNA that was prepared without adding reverse transcriptase.

Уровни экспрессии мРНК определяли в четырех различных типах опухолевой ткани (опухоли предстательной железы из 2 пациентов, опухоли молочной железы из 3 пациентов, опухоли ободочной кишки, опухоли легкого) и шестнадцати различных нормальных тканях, в том числе предстательной железе, ободочной кишке, почке, печени, легком, яичнике, поджелудочной железе, скелетной мышце, коже, желудке, яичках, костном мозгу и головном мозгу. mRNA expression levels were determined in four different types of tumor tissue (prostate tumor from 2 patients, breast tumor from 3 patients, colon tumors, lung tumor), and sixteen different normal tissues, including prostate, colon, kidney, liver , lung, ovary, pancreas, skeletal muscle, skin, stomach, testes, bone marrow and brain. Было обнаружено, что F1-16 экспрессировался при высоких уровнях в ткани опухоли предстательной железы, опухоли ободочной кишки и нормальной предстательной железе и при низких уровнях в нормальной печени, коже и яичках, причем экспрессия была неопределяемой в других исследованных тканях. It was found that F1-16 is expressed at high levels in prostate tumor tissue, colon tumor and normal prostate, and at lower levels in normal liver, skin and testes, with expression was undetectable in the other tissues examined. Было обнаружено, что Н1-1 экспрессировался при высоких уровнях в опухоли предстательной железы, опухоли легкого, опухоли молочной железы, нормальной предстательной железе, нормальной ободочной кишке и нормальном головном мозгу, при гораздо более низких уровнях в нормальном легком, поджелудочной железе, скелетной мышце, коже, тонкой кишке, костном мозгу и не определялся в других исследованных тканях. It was found that N1-1 expressed at high levels in prostate tumor, lung tumor, breast tumor, normal prostate, normal colon and normal brain, at much lower levels in normal lung, pancreas, skeletal muscle, skin, small intestine, bone marrow, and was not detected in the other tissues examined. J1-17 (P502S) и L1-12 (P501S), по-видимому, специфически сверхэкспрессировались в предстательной железе, причем оба гена экспрессировались при высоких уровнях в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе, но при низких - неопределяемых - уровнях во всех других исследованных тканях. J1-17 (P502S) and L1-12 (P501S), apparently specifically overexpressed in prostate, with both genes were expressed at high levels in prostate tumor and normal prostate but at low - undetectable - levels in all other tissues examined. Было обнаружено, что N1-1862 (P503S) сверхэкспрессировался в 60% опухолей предстательной железы и был определяемым в нормальной ободочной кишке и почке. It was found that N1-1862 (P503S) overexpressed in 60% of prostate tumors and was determined in normal colon and kidney. Таким образом, результаты ОТ-ПЦР показывают, что F1-16, H1-1, J1-17 (P502S), N1-1862 (P503S) и L1-12 (P501S) либо являются специфическими для предстательной железы, либо экспрессируются при значительно повышенных уровнях в предстательной железе. Thus, the RT-PCR results indicate that F1-16, H1-1, J1-17 (P502S), N1-1862 (P503S) and L1-12 (P501S) are either prostate specific or are expressed at significantly elevated levels in the prostate gland.

Последующие ОТ-ПЦР-исследования показали, что F1-12 (P504S) сверхэкспрессируется в 60% опухолей предстательной железы, является определяемым в нормальной почке, но неопределяемым во всех остальных исследованных тканях. Further RT-PCR studies showed that F1-12 (P504S) is over-expressed in 60% of prostate tumors is determined in normal kidney, but undetectable in all other tissues examined. Подобным образом было показано, что R1-2330 сверхэкспрессировался в 40% опухолей предстательной железы, был определяемым в нормальных почке и печени, но не определялся во всех остальных исследованных тканях. Similarly, it was shown that the R1-2330 overexpressed in 40% of prostate tumors, was determined in normal kidney and liver, but was not detected in all other tissues examined. Было обнаружено, что U1-3064 сверхэкспрессировался в 60% опухолей предстательной железы и также экспрессировался в опухолях молочной железы и ободочной кишки, но не определялся в нормальных тканях. It was found that U1-3064 overexpressed in 60% of prostate tumors, and also expressed in breast tumors and colon, but was not detected in normal tissues.

ОТ-ПЦР-характеристика R1-2330, U1-3064 и ID-4279 показала, что эти три антигена сверхэкспрессируются в предстательной железе и/или опухолях предстательной железы. RT-PCR characterization of R1-2330, U1-3064 and ID-4279 showed that these three antigens over-expressed in prostate and / or prostate tumors.

Нозерн-анализ с четырьмя опухолями предстательной железы, двумя образцами нормальной предстательной железы, двумя ВРН-простатами и нормальными ободочной кишкой, печенью, легким, поджелудочной железой, скелетной мышцой, головным мозгом, желудком, яичками, тонкой кишкой и костным мозгом показал, что L1-12 (P501S) сверхэкспрессируется в опухолях предстательной железы и нормальной предстательной железе, тогда как является неопределяемым в других нормальных исследованных тканях. Northern analysis with four prostate tumors, two samples of normal prostate, two BPH, prostate, and normal colon, liver, lung, pancreas, skeletal muscle, brain, stomach, testes, small intestine and bone marrow showed that L1 -12 (P501S) is over-expressed in prostate tumors and normal prostate, while is undetectable in other normal tissues examined. J1-17 (P502S) определялся в двух опухолях предстательной железы, но не в других испытанных тканях. J1-17 (P502S) was determined in two prostate tumors, but not in other tissues tested. Было обнаружено, что N1-1862 (P503S) сверхэкспрессировался в трех опухолях предстательной железы и экспрессировался в нормальных предстательной железе, ободочной кишке и почке, но не в других исследованных тканях. It was found that N1-1862 (P503S) overexpressed in three prostate tumors and is expressed in normal prostate, colon and kidney, but not in other tissues examined. Было обнаружено, что F1-12 (P504S) экспрессировался на высоком уровне в двух опухолях предстательной железы и был неопределяемым во всех остальных исследованных тканях. It was found that F1-12 (P504S) was expressed at high levels in two prostate tumors and was undetectable in all other tissues examined.

Технологию микроматрицы, описанную выше, использовали для определения уровней экспрессии показательных антигенов, описанных здесь, в опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы и следующих нормальных тканях: предстательной железе, печени, поджелудочной железе, коже, костном мозгу, головном мозгу, молочной железе, надпочечнике, мочевом пузыре, яичках, слюнных железах, толстой кишке, почке, яичнике, легком, спинном мозгу, скелетной мышце и ободочной кишке. Technology of microarrays, as described above, was used to determine expression levels indicative antigens described herein in prostate tumor, breast tumor and the following normal tissues: prostate, liver, pancreas, skin, bone marrow, brain, breast, adrenal gland , bladder, testes, salivary glands, colon, kidney, ovary, lung, spinal cord, skeletal muscle and colon. Было обнаружено, что L1-12 (P501S) сверхэкспрессируется в нормальной предстательной железе и в опухоли предстательной железы и некоторая экспрессия определяется в нормальной скелетной мышце. It was found that L1-12 (P501S) is over-expressed in normal prostate and prostate tumor and some normal expression determined in skeletal muscle. Было обнаружено, что как J1-12, так и F1-12 (P504S) сверхэкспрессируются в опухоли предстательной железы, причем экспрессия является более низкой или неопределяемой во всех других исследованных тканях. It has been found that, as J1-12, and F1-12 (P504S) overexpressed in prostate tumors, wherein the expression is low or undetectable more in all other tissues examined. Было обнаружено, что N1-1862 (P503S) экспрессируется при высоких уровнях в опухоли предстательной железы и в нормальной предстательной железе и при низких уровнях в нормальной толстой кишке и нормальной ободочной кишке, причем экспрессия является неопределяемой во всех других исследованных тканях. It was found that N1-1862 (P503S) is expressed at high levels in prostate tumor and normal prostate, and at low levels in normal large intestine and normal colon, with expression is undetectable in all other tissues examined. Было обнаружено, что R1-2330 сверхэкспрессируется в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе и экспрессируется при более низких уровнях во всех остальных исследованных тканях. It was found that the R1-2330 overexpressed in prostate tumor and normal prostate and expressed at lower levels in all other tissues examined.

Было обнаружено, что ID-4279 сверхэкспрессируется в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе, экспрессируется при более низких уровнях в нормальном спинном мозгу и является неопределяемым во всех остальных исследованных тканях. It has been found that ID-4279 overexpressed in prostate tumor and normal prostate, expressed at lower levels in normal spinal cord, and is undetectable in all other tissues examined.

Дополнительный анализ с использованием микроматрицы для специального определения степени, с которой P501S (SEQ ID NO:110) экспрессируется в опухоли молочной железы, выявил умеренную сверхэкспрессию не только в опухоли молочной железы, но также в метастатической опухоли молочной железы (2/31) с незначительной - низкой - экспрессией в нормальных тканях. Additional analysis using a microarray for a specific determination of the degree to which P501S (SEQ ID NO: 110) expressed in breast tumor revealed moderate overexpression not only in breast tumor, but also in breast cancer (2/31) tumor with a low metastatic - low - expression in normal tissues. Эти данные предполагают, что P501S может сверхэкспрессироваться в различных опухолях молочной железы так же, как в опухолях предстательной железы. These data suggests that P501S may be overexpressed in various breast tumors as well as in prostate tumors.

Уровни экспрессии 32 EST (меток экспрессируемых последовательностей), описанных Vasmatzis et al., Proc. Expression levels of 32 EST (expressed sequence tags) described by Vasmatzis et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 95:300-304, 1998), в различных опухолевых и нормальных тканях исследовали с использованием способа микроматрицы, как описано выше. USA 95: 300-304, 1998) in various tumor and normal tissues was examined using a microarray method, as described above. Было найдено, что два из этих клонов (называемые Р1000С и Р1001С) сверхэкспрессровались в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе и экспрессировались при низких - неопределяемых - уровнях во всех остальных исследованных тканях (нормальной аорте, вилочковой железе, покоящихся и активированных РВМС (мононуклеарных клетках периферической крови), эпителиальных клетках, спинном мозгу, надпочечнике, фетальных тканях, коже, слюнных железах, толстой кишке, костном мозгу, печени, легком, дендритных клетках, желудке, лимфатиче It was found that two of these clones (called R1000S and R1001S) sverhekspressrovalis in prostate tumor and normal prostate and expressed at low - undetectable - levels in all other tissues examined (normal aorta, thymus, resting and activated PBMC (mononuclear cells peripheral blood), epithelial cells, spinal cord, adrenal gland, fetal tissues, skin, salivary glands, colon, marrow, liver, lung, dendritic cells, stomach, limfatiche ких узлах, головном мозгу, сердце, тонкой кишке, скелетной мышце, ободочной кишке и почке. Определенные последовательности-кДНК для Р1000С и Р1001С представлены в SEQ ID NO:384 и 472 соответственно. Было обнаружено, что последовательность Р1001С имеет некоторую гомологию с ранее выделенной мРНК человека для белка JM27. Не были обнаружены значимые гомологии относительно последовательности Р1000С. . FIR nodes, brain, heart, small intestine, skeletal muscle, colon and kidney Certain sequences of cDNA for R1000S and R1001S shown in SEQ ID NO:. 384 and 472, respectively, has been found that the sequence R1001S has some homology to previously isolated mRNA for human JM27 protein. No significant homology to sequences R1000S were found.

Экспрессия полипептида, кодируемого полноразмерной последовательностью-кДНК для F1-12 (также называемого P504S; SEQ ID NO:108), исследовали при помощи иммуногистохимического анализа. Expression of the polypeptide encoded by the full-length cDNA sequence for F1-12 (also referred to as P504S; SEQ ID NO: 108) were examined by immunohistochemical analysis. Кроличьи поликлональные антитела против P504S генерировали против полноразмерного белка P504S при помощи стандартных способов. Rabbit polyclonal antibodies against P504S P504S generated against full length protein using standard techniques. Последующее выделение и характеристику поликлональных антител также выполняли способами, хорошо известными в данной области. The subsequent isolation and characterization of the polyclonal antibodies were also performed by methods well known in the art. Иммуногистохимический анализ показал, что полипептид P504S экспрессировался в 100% исследованных образцах рака предстательной железы (n=5). Immunohistochemical analysis showed that the P504S polypeptide expressed in 100% of the investigated samples of prostate cancer (n = 5).

Кроличьи поликлональные антитела против P504S, по-видимому, не метили доброкачественные клетки предстательной железы с тем же самым цитоплазматическим гранулярным окрашиванием, но скорее с легким ядерным окрашиванием. Rabbit polyclonal antibodies against P504S, apparently not labeled benign prostate cells with the same cytoplasmic granular staining, but rather with light nuclear staining. Анализ нормальных тканей выявил, что указанный кодируемый полипептид, как было обнаружено, экспрессируется в некоторых, но не во всех нормальных тканях человека. Analysis of normal tissues showed that this encoded polypeptide have been found to be expressed in some but not all normal human tissues. Положительное цитоплазматическое окрашивание кроличьими поликлональными антителами против P504S было обнаружено в нормальных почке, печени, головном мозгу, ободочной кишке и легочно-ассоциированных макрофагах человека, тогда как сердце и костный мозг были отрицательными. Positive cytoplasmic staining with rabbit polyclonal antibodies against P504S was detected in normal kidney, liver, brain, colon and lung-associated human macrophages, whereas heart and bone marrow were negative.

Эти результаты показывают, что полипептид P504S присутствует в тканях рака предстательной железы и что имеются качественные и количественные различия в окрашивании между тканями доброкачественной гиперплазии предстательной железы и тканями рака предстательной железы, что предполагает, что указанный полипептид может определяться избирательно в опухолях предстательной железы и, следовательно, быть полезным в диагностике рака предстательной железы, These results indicate that the P504S polypeptide is present in the tissues of prostate cancer and that there are qualitative and quantitative differences in the staining between tissues of benign prostatic hyperplasia and tissues of prostate cancer, which suggests that the polypeptide can be determined selectively in prostate tumors and therefore to be useful in the diagnosis of prostate cancer,

ПРИМЕР 3 EXAMPLE 3

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕВЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫЧИТАНИЯ НА ОСНОВЕ ПЦР Isolation and Characterization of Tumor PROSTATE POLYPEPTIDES USING PCR BASED ON SUBTRACTION

Являющуюся результатом вычитания библиотеку кДНК, содержащую кДНК из нормальной предстательной железы, полученную вычитанием с кДНК десяти других нормальных тканей (головного мозга, сердца, почки, печени, легкого, яичника, плаценты, скелетной мышцы, селезенки и тимуса) и затем подвергнутую первому циклу ПЦР-амплификации, покупали в Clontech. It is the result of subtraction cDNA library containing cDNA from normal prostate obtained by subtracting a cDNA ten other normal tissues (brain, heart, kidney, liver, lung, ovary, placenta, skeletal muscle, spleen and thymus) and then subjected to the first PCR cycle -amplifikatsii bought in Clontech. Эту библиотеку подвергали второму циклу ПЦР-амплификации в соответствии с протоколом изготовителя. This library was subjected to a second round of PCR amplification according to manufacturer's protocol. Полученные кДНК-фрагменты субклонировали в вектор рТ7 Blue Т-вектор (Novagen, Madison, WI) и трансформировали в Е.coli XL-1 Blue MRF (Stratagene). The resulting cDNA fragments were subcloned into the vector pT7 Blue T-vector (Novagen, Madison, WI) and transformed into E. coli XL-1 Blue MRF (Stratagene). ДНК выделяли из независимых клонов и секвенировали с использованием автоматизированного секвенатора модели 373А Perkin Elmer/Applied Biosystems Division. DNA was isolated from independent clones and sequenced using an automated sequencer model 373A Perkin Elmer / Applied Biosystems Division.

Секвенировали пятьдесят девять положительных клонов. Fifty-nine sequenced positive clones. Сравнение последовательностей-ДНК этих клонов с последовательностями в банке генов, как описано выше, не выявило значимых гомологий к 25 из этих клонов, далее называемых Р5, Р8, Р9, Р18, Р20, Р30, Р34, Р36, Р38, Р42, Р49, Р50, Р53, Р55, Р60, Р64, Р65, Р73, Р75, Р76, Р79 и Р84. Sequence comparison of DNA from these clones with the sequences in the gene bank as described above revealed no significant homologies to 25 of these clones, hereinafter referred to as P5, P8, P9, P18, P20, P30, P34, P36, P38, P42, P49, P50, p53, P55, P60, P64, P65, P73, P75, P76, P79 and P84. Определенные последовательности кДНК для этих клонов представлены в SEQ ID NO:41-45, 47-52 и 54-65 соответственно. Certain cDNA sequences for these clones are presented in SEQ ID NO: 41-45, 47-52 and 54-65, respectively. Было обнаружено, что Р29, Р47, Р68, Р80 и Р82 (SEQ ID NO:46, 53 и 66-68 соответственно) обнаруживают некоторую степень гомологии с ранее идентифицированными последовательностями ДНК. It has been found that the P29, P47, P68, P80 and P82 (SEQ ID NO: 46, 53 and 66-68, respectively) show some homology to previously identified DNA sequences. Насколько известно авторам изобретения, ни одна из этих последовательностей не была описана ранее в качестве присутствующей в предстательной железе. As far as the inventors know, none of these sequences have not been described previously as present in the prostate.

Дальнейшие исследования с использованием методологии на основе ПЦР, описанной выше, привели к выделению более 180 дополнительных клонов, из которых, как было обнаружено, 23 клона не имели значимых гомологий с известными последовательностями. Further studies using the PCR-based methodology described above resulted in the isolation of more than 180 additional clones, of which, as has been found, clone 23 did not have significant homology with known sequences. Определенные последовательности-кДНК для этих клонов представлены в SEQ ID NO:115-123, 127, 131, 137, 145, 147-151, 153, 156-158 и 160. Было обнаружено, что двадцать три клона (SEQ ID NO:124-126, 128-130, 132-136, 138-144, 146, 152, 154, 155 и 159) обнаруживают некоторую гомологию с ранее идентифицированными EST. Certain cDNA sequences for these clones are presented in SEQ ID NO: 115-123, 127, 131, 137, 145, 147-151, 153, 156-158 and 160. It has been found that the twenty-three clones (SEQ ID NO: 124 -126, 128-130, 132-136, 138-144, 146, 152, 154, 155 and 159) show some homology to previously identified EST. Было найдено, что дополнительные десять клонов (SEQ ID NO:161-170) имеют некоторую степень гомологии с известными генами. It was found that an additional ten clones (SEQ ID NO: 161-170) have some degree of homology to known genes. Более крупные кДНК-клоны, содержащие последовательность Р20, представляют сплайсинговые варианты гена, называемого P703S. Larger cDNA clones containing the P20 sequence represent splice variants of the gene, called P703S. Определенные последовательности ДНК для этих вариантов, называемых DE1, DE13 и DE14, представлены в SEQ ID NO:171, 175 и 177 соответственно с соответствующими предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:172, 176 и 178 соответственно. Certain DNA sequences for these options, called DE1, DE13 and DE14, are presented in SEQ ID NO: 171, 175 and 177, respectively, with the corresponding predicted amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 172, 176 and 178 respectively. Определенная последовательность-кДНК для удлиненной сплайсинговой формы P703S представлена в SEQ ID NO:225. Specific cDNA sequence for P703S elongate splicing forms presented in SEQ ID NO: 225. Последовательности-ДНК для сплайсинговых вариантов, называемых DE2 и DE6, представлены в SEQ ID NO:173 и 174 соответственно. DNA sequences for splice variants, called DE2 and DE6, presented in SEQ ID NO: 173 and 174, respectively.

Уровни экспрессии мРНК для показательных клонов в опухолевых тканях (предстательной железы (n=5), молочной железы (n=2), ободочной кишки и легкого), нормальных тканях (предстательной железы (n=5), ободочной кишки, почки, печени, легкого (n=2), яичника (n=2), скелетной мышцы, кожи, желудка, тонкой кишки и головного мозга) и активированных и не активированных РВМС определяли при помощи ОТ-ПЦР, как описано выше. mRNA Expression levels for illustrative clones in tumor tissues (prostate (n = 5), breast (n = 2), colon and lung) normal tissues (prostate (n = 5), colon, kidney, liver, lung (n = 2), ovary (n = 2), skeletal muscle, skin, stomach, small intestine and brain), and activated and non-activated PBMC was determined by RT-PCR as described above. Экспрессию определяли в одной пробе каждого типа ткани, если нет других указаний. Expression was measured in one sample of each tissue type unless otherwise indicated.

Было обнаружено, что Р9 экспрессируется в высокой степени в нормальной предстательной железе и опухоли предстательной железы в сравнении со всеми испытанными нормальными тканями за исключением нормальной ободочной кишки, показавшей сравнимую экспрессию. It was found that R9 is highly expressed in normal prostate and prostate tumor compared to all normal tissues tested except for normal colon which showed comparable expression. Было найдено, что Р20, часть гена P703S, экспрессируется в высокой степени в нормальной предстательной железе и опухоли предстательной железы в сравнении со всеми двенадцатью исследованными нормальными тканями. It has been found that the P20, part P703S gene is highly expressed in normal prostate and prostate tumor, compared to all twelve normal tissues examined. Умеренное увеличение экспрессии Р20 в опухоли молочной железы (n=2), опухоли ободочной кишки и опухоли легкого наблюдали в сравнении со всеми испытанными нормальными тканями за исключением легкого (1 из двух) Увеличенная экспрессия Р18 была обнаружена в нормальной предстательной железе, опухоли предстательной железы и опухоли молочной железы в сравнении с другими нормальными тканями за исключением легкого и желудка. A moderate increase in expression of P20 in breast tumor (n = 2), colon and lung cancer tumors were observed when compared with all tested normal tissues except lung (1 of two) Increased expression of P18 was found in normal prostate, prostate tumor and breast tumor compared to other normal tissues except lung and stomach. Умеренное увеличение экспрессии Р5 наблюдали в нормальной предстательной железе в сравнении с большинством других нормальных тканей. A moderate increase in expression of P5 was observed in normal prostate compared to most other normal tissues. Однако некоторое повышение экспрессии наблюдали в нормальном легком и РВМС. However, some increased expression was observed in normal lung and PBMC. Повышенную экспрессию Р5 также наблюдали в опухолях предстательной железы (2 из 5), молочной железе и пробе одной опухоли легкого. Increased expression of P5 was also observed in prostate tumors (2 of 5), breast and lung tumors audio sample. Для Р30 наблюдали одинаковые уровни экспрессии в нормальной предстательной железе и опухоли предстательной железы в сравнении с шестью из двенадцати других исследованных нормальных тканей. For P30 observed similar expression levels in normal prostate and prostate tumor, compared to six of twelve other normal tissues tested. Увеличенную экспрессию наблюдали в опухолях молочной железы, образце одной опухоли легкого и образце одной опухоли ободочной кишки, а также в нормальных РВМС. Increased expression was observed in breast tumors, one lung tumor sample and one sample of colon tumors and also in normal PBMC. Было найдено, что Р29 сверхэкспрессировался в опухоли предстательной железы (5 из 5) и нормальной предстательной железе (5 из 5) в сравнении с большинством нормальных тканей. It has been found that the P29 overexpressed in prostate tumor (5 of 5) and normal prostate (5 of 5) compared to most normal tissues. Однако существенную экспрессию Р29 наблюдали в нормальной ободочной кишке и нормальном легком (2 из 2). However, substantial expression of P29 was observed in normal colon and normal lung (2 of 2). Было обнаружено, что Р80 сверхэкспрессировался в опухоли предстательной железы (5 из 5) и нормальной предстательной железе (5 из 5) в сравнении со всеми другими исследованными нормальными тканями, причем увеличенную экспрессию наблюдали также в опухоли ободочной кишки. It has been found that the P80 overexpressed in prostate tumor (5 of 5) and normal prostate (5 of 5) compared to all other normal tissues examined, with increased expression also observed in colon tumors.

Дальнейшие исследования привели к выделению двенадцати дополнительных клонов, далее называемых 10-d8, 10-h10, 11-с8, 7-g6, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3, 8-h11, 9-f12 и 9-f3. Further research led to the isolation of twelve additional clones, hereinafter referred to as 10-d8, 10-h10, 11-c8, 7-g6, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3, 8-h11 9-f12 and 9-f3. Определенные последовательности-ДНК для 10-d8, 10-h10, 11-с8, 8-d4, 8-d9, 8-h11, 9-f12 и 9-f3 представлены в SEQ ID NO:207, 208, 209, 216, 217, 220, 221 и 222 соответственно. Certain sequences of DNA for 10-d8, 10-h10, 11-c8, 8-d4, 8-d9, 8-h11, 9-f12 and 9-f3 shown in SEQ ID NO: 207, 208, 209, 216, 217, 220, 221 and 222 respectively. Определенные прямые и обратные последовательности-ДНК для 7-g6, 8-b5, 8-b6 и 8-g3 представлены в SEQ ID NO:210 и 211, 212 и 213, 214 и 215 и 218 и 219 соответственно. Certain direct and reverse DNA sequences for 7-g6, 8-b5, 8-b6 and 8-g3 are shown in SEQ ID NO: 210 and 211, 212 and 213, 214 and 215 and 218 and 219 respectively. Сравнение этих последовательностей с последовательностями в банке генов не выявило значимых гомологий к последовательности 9-f3. Comparison of these sequences with the sequences in the gene bank revealed no significant homologies to the sequence of 9-f3. Было обнаружено, что клоны 10-d8, 11-c8 и 8-g11 обнаруживают некоторую гомологию с ранее выделенными EST, тогда как, как было показано, 10-h10, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3 и 9-f12 обнаруживают некоторую гомологию с ранее идентифицированными генами. It has been found that clones 10-d8, 11-c8 and 8-g11 show some homology to previously isolated EST, whereas, as shown, 10-h10, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9 , 8-g3 and 9-f12 show some homology to previously identified genes. Дополнительная характеристика 7-G6 и 8-G3 показала идентичность с известными генами РАР и PSA соответственно. Additional Feature 7-G6 and 8-G3 showed identity with known genes PAP and PSA, respectively.

Уровни экспрессии мРНК для этих клонов определеляли с использованием способа микроматрицы, описанного выше. mRNA Expression levels for those clones using the method shall designate a microarray as described above. Было обнаружено, что клоны 7-G6, 8-G3, 8-В5, 8-B6, 8-D4, 8-D9, 9-F3, 9-F12, 9-Н3, 10-А2, 10-А4, 11-С9 и 11-F2 сверхэкспрессировались в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе, причем экспрессия в других испытанных тканей была низкой или неопределяемой. It was found that the clones 7-G6, 8-G3, 8-B5, 8-B6, 8-D4, 8-D9, 9-F3, 9-F12, 9-H3, 10-A2, 10-A4, 11 -S9 and 11-F2 overexpressed in prostate tumor and normal prostate, and expression in other tissues tested were low or undetectable. Увеличенную экспрессию 8-F11 наблюдали в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе, мочевом пузыре, скелетной мышце и ободочной кишке. Increased expression of 8-F11 observed in prostate tumor and normal prostate, bladder, skeletal muscle and colon. Увеличенную экспрессию 10-Н10 наблюдали в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе, мочевом пузыре, легком, ободочной кишке, головном мозгу и толстой кишке. Increased expression of 10-H10 observed in prostate tumor and normal prostate, bladder, lung, colon, brain and colon. Увеличенную экспрессию 9-В1 наблюдали в опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы и нормальной предстательной железе, слюнных железах, толстой кишке и коже, а увеличенную экспрессию 11-C8 наблюдали в опухоли предстательной железы и нормальной предстательной железе и толстой кишке. Increased expression of 9-B1 observed in prostate tumor, breast tumor and normal prostate, salivary glands, colon, and skin, and increased expression of 11-C8 observed in prostate tumor and normal prostate and large intestine.

Было обнаружено, что дополнительный кДНК-фрагмент, полученный из вычитания на основе ПЦР нормальной предстательной железы, описанного выше, является специфическим для предстательной железы согласно как способу микроматрицы, так и ОТ-ПЦР. It has been found that the additional cDNA fragment derived from the PCR-based subtraction normal prostate, as described above, is specific for prostate method according to both microarray and RT-PCR. Определенная последовательность-кДНК этого клона (называемого 9-А11) представлена в SEQ ID NO:226. Specific cDNA sequence of this clone (referred to as 9-A11) shown in SEQ ID NO: 226. Сравнение этой последовательности с последовательностями в общественных базах данных выявило 99% идентичность с известным геном НОХВ13. Comparison of this sequence with sequences in the public databases revealed 99% identity with the known gene NOHV13.

Дальнейшие исследования привели к выделению клонов 8-С 6 и 8-Н7. Further studies led to the identification of clones 8, 6 and 8-H7. Определенные последовательности-кДНК для этих клонов представлены в SEQ ID NO:227 и 228 соответственно. Certain cDNA sequences for these clones are presented in SEQ ID NO: 227 and 228, respectively. Было обнаружено, что эти последовательности имеют некоторую гомологию с ранее выделенными EST. It was found that the sequences have some homology to previously isolated EST.

Методологии на основе ПЦР и на основе гибридизации использовали для получения более длинных последовательностей-кДНК для клона Р20 (также называемого Р703Р), что привело к получению трех дополнительных кДНК-фрагментов, которые прогрессивно удлиняют 5'-конец этого гена. Methodologies based on PCR and on the basis of hybridization used to obtain longer cDNA sequences for the clone P20 (also referred R703R), resulting in a three additional cDNA fragments that progressively extend the 5 'end of the gene. Эти фрагменты, называемые P703PDE5, Р703Р6.26 и Р703РХ-23 (SEQ ID NO:326, 328 и 330 с предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:327, 329 и 331 соответственно), содержат дополнительную 5'-последовательность. These fragments, called P703PDE5, and R703R6.26 R703RH-23 (SEQ ID NO: 326, 328 and 330 with the predicted amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 327, 329 and 331, respectively) contain additional 5 'sequence. P703PDE5 извлекали скринингом библиотеки кДНК (№141-26) с частью Р703Р в качестве зонда. P703PDE5 recovered by screening cDNA libraries (№141-26) with part R703R as a probe. Р703Р6.26 извлекали из смеси трех кДНК опухоли предстательной железы и Р703РХ-23 извлекали из библиотеки кДНК (№438-48). R703R6.26 removed from a mixture of three prostate tumor cDNAs and R703RH-23 was recovered from cDNA library (№438-48). Вместе эти дополнительные последовательности все включают в себя возможную зрелую сериновую протеазу вместе с частью возможной сигнальной последовательности. Together, the additional sequences include all the possible mature serine protease along with part of a possible signal sequence. Дальнейшие исследования с использованием библиотеки, полученной вычитанием на основе ПЦР, пула опухолей предстательной железы, подвергнутого вычитанию против пула нормальных тканей (называемому JP: ПЦР-вычитанием), привели к выделению тринадцати дополнительных клонов, семь из которых не имели какой-либо значимой гомологии с известными последовательностями GenBank. Further studies using the library obtained by subtracting based PCR pool prostate tumors subjected to subtraction against a pool of normal tissues (called JP: PCR subtraction) resulted in the isolation of thirteen additional clones, seven of which did not have any significant homology with known sequences of GenBank. Определенные последовательности-кДНК для этих семи клонов (Р711Р, Р712Р, новый 23, Р774Р, Р775Р, Р710Р и Р768Р) представлены в SEQ ID NO:307-311, 313 и 315 соответственно. Certain cDNA sequences for these seven clones (R711R, R712R new 23 R774R, R775R, R710R and R768R) are shown in SEQ ID NO: 307-311, 313 and 315 respectively. Было показано, что остальные шесть клонов имеют некоторую гомологию с известными генами. It was shown that the remaining six clones share some homology to known genes. Согласно анализу с использованием микроматрицы все тринадцать клонов обнаружили трехкратную или более высокую сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в том числе в опухолях предстательной железы, ВРН и нормальной предстательной железе в сравнении с нормальными не относящимися к предстательной железе тканями. According to the analysis using microarray all thirteen clones found triple or higher overexpression in prostate tissues including tumors of the prostate, BPH and normal prostate as compared to normal unrelated to the prostate tissues. Клоны Р711Р, Р712Р, новый 23 и Р768Р обнаружили сверхэкспрессию в большинстве испытанных опухолей предстательной железы и тканях ВРН (n=29) и в большинстве нормальных тканей предстательной железы (n=4), но показали уровни фона или уровни низкой экспрессии во всех нормальных тканях. Clones R711R, R712R, the new 23 and R768R found overexpression in most of the tested prostate tumors and tissues BPH (n = 29) and in most normal tissues of the prostate (n = 4) but showed background levels or levels low expression in all normal tissues .

Клоны Р774Р, Р775Р и Р710Р показали сравнительно более низкую экспрессию и экспрессию в меньшем числе опухолей предстательной железы и проб ВРН, с отрицательной - низкой - экспрессией в нормальной предстательной железе. Clones R774R, R775R and R710R showed comparatively lower expression and expression in fewer prostate tumors and BPH samples, with negative - low - expression in normal prostate.

Полноразмерную кДНК для Р711Р получали путем применения частичной последовательности SEQ ID NO:307 для скрининга библиотеки кДНК предстательной железы. The full-length cDNA for R711R was prepared by applying a partial sequence of SEQ ID NO: 307 to screen a prostate cDNA library. Конкретно, направленно клонированную библиотеку кДНК предстательной железы получали с использованием стандартных способов. Specifically, a directionally cloned prostate cDNA library was prepared using standard methods. Один миллион колоний этой библиотеки высевали на LB/Аmр-чашки. One million colonies of this library were plated on LB / Amp-cup. Найлоновые мембранные фильтры использовали для подъема этих колоний и кДНК, которые извлекались этими фильтрами, денатурировали и сшивали с фильтрами при помощи УФ-света. Nylon membrane filters were used to lift these colonies, the cDNA which have been removed by these filters were denatured and crosslinked to the filters by UV light. Р711Р-фрагмент кДНК SEQ ID NO:307 радиоактивно метили и использовали для гибридизации с этими фильтрами. R711R cDNA fragment SEQ ID NO: 307 was radiolabeled and used to hybridize with these filters. Положительные клоны отбирали и кДНК получали и секвенировали с использованием автоматического секвенатора Perkin Elmer/Applied Biosystems. Positive clones were selected, and cDNAs were prepared and sequenced using an automated sequencer Perkin Elmer / Applied Biosystems. Определенная полноразмерная последовательность Р711Р представлена в SEQ ID NO:382 с соответствующей предсказанной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:383. Certain R711R full length sequence presented in SEQ ID NO: 382 with the corresponding predicted amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 383.

С использованием методологий на основе ПЦР и на основе гибридизации дополнительную информацию о последовательностях кДНК получали для двух вышеописанных клонов, 11-С9 и 9-F3, далее называемых Р707Р и Р714Р соответственно (SEQ ID NO:333 и 334). Using methodologies based PCR and hybridization-based additional cDNA sequence information was obtained for the above two clones 11 C9 and 9-F3, hereinafter called R707R and R714R respectively (SEQ ID NO: 333 and 334). После сравнения с самым последним банком генов было обнаружено, что Р707Р является сплайсинговым вариантом известного гена НохВ13. After comparison with the most recent bank of genes it was found that R707R is NohV13 splice variant form of the gene. В противоположность этому не было обнаружено значимых гомологий к Р714Р. In contrast, there were no significant homology to R714R.

Было найдено, что клоны 8-В3, Р89, Р98, Р130 и Р201 (описанные в патентной заявке Соединенных Штатов № 09020956, поданной 9 февраля 1998 года) содержатся в одной непрерывной последовательностии, называемой Р705Р (SEQ ID NO:335, с предсказанной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:336), которая, как было определено, является сплайсинговым вариантом известного гена NKX3.1. It was found that 8-B3 clones P89, P98, P130 and P201 (as described in patent application United States № 09020956 filed 9 February 1998 years) are contained in a single continuous sequence, called R705R (SEQ ID NO: 335, with the predicted amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 336), which has been determined, is a splice variant form of the gene NKX3.1.

ПРИМЕР 4 EXAMPLE 4

СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ polypeptide synthesis

Полипептиды могут быть синтезированы на пептидном синтезаторе 430А Perkin Elmer/Applied Biosystems с использованием FMOC-химии с HPTU-активацией (активацией гексафторфосфатом О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония). Polypeptides may be synthesized on a peptide synthesizer 430A Perkin Elmer / Applied Biosystems using FMOC-chemistry with HPTU-activation (activation hexafluorophosphate O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate). Последовательность Gly-Cys-Gly может быть присоединена к амино-концу этого пептида для обеспечения способа конъюгации, связывания с иммобилизованной поверхностью или мечения пептида. The sequence Gly-Cys-Gly may be attached to the amino terminus of the peptide to provide a method of conjugation, binding to an immobilized surface, or labeling of the peptide. Отщепление этих пептидов от твердого носителя может проводиться с использованием следующей отщепляющей смеси: трифторуксусная кислота : этандитиол : тиоанизол : вода : фенол (40:1:2:2:3). Cleavage of the peptides from the solid support may be carried out using the following cleaved mixture: trifluoroacetic acid: ethanedithiol: thioanisole: water: phenol (40: 1: 2: 2: 3). После отщепления в течение 2 часов пептиды могут быть осаждены в холодном метил-трет-бутиловом эфире. After cleaving for 2 hours the peptides may be precipitated in cold methyl tert-butyl ether. Затем осадки пептидов могут быть растворены в воде, содержащей 0,1% трифторуксусную кислоту (ТФУ), и лиофилизированы перед очисткой обращенно-фазовой ВЖХ на С18. Then precipitates peptides may be dissolved in water containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and lyophilized prior to purification by reverse phase HPLC on C18. Градиент 0-60% ацетонитрила (содержащего 0,1% ТФУ) в воде (содержащей 0,1% ТФУ) может быть использован для элюции пептидов. Gradient 0-60% acetonitrile (containing 0.1% TFA) in water (containing 0.1% TFA) may be used to elute the peptides. После лиофилизации чистых фракций пептиды могут быть охарактеризованы с использованием электрораспылительной или других типов масс-спектрометрии и аминокислотного анализа. After lyophilization of the pure fractions peptides may be characterized using electrospray or other types of mass spectrometry and amino acid analysis.

ПРИМЕР 5 EXAMPLE 5

ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕВЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ПОМОЩИ ВЫЧИТАНИЯ НА ОСНОВЕ ПЦР Further isolation and characterization of tumor POLYPEPTIDES PROSTATE by subtraction PCR-BASED

Библиотеку кДНК, генерированную из мРНК первичной опухоли предстательной железы, как описано выше, вычитали с кДНК из нормальной предстательной железы. A cDNA library generated from mRNA primary prostate tumors as described above was subtracted with cDNA from normal prostate. Вычитание проводили с использованием протокола на основе ПЦР (Clon-tech), который был модифицирован для генерирования более крупных фрагментов. The subtraction was performed using PCR-based protocol (Clon-tech), which was modified to generate larger fragments. В этом протоколе тестируемую и драйверную двухцепочечную кДНК отдельно расщепляли пятью рестрикционными ферментами (рестриктазами), которые узнают состоящие из шести нуклеотидов сайты рестрикции (MluI, MscI, PvuII, SalI и StuI). In this protocol, the test and Driver double-stranded cDNA was separately digested with five restriction enzymes (restriction enzymes) which recognize six nucleotide consisting of restriction sites (MluI, MscI, PvuII, SalI and StuI). Это расщепление приводило к среднему размеру кДНК 600 п.н., а не к среднему размеру 300 п.н., который достигается при расщеплении RsaI согласно протоколу Clontech. This cleavage resulted in an average cDNA size of 600 bp, rather than the average size of 300 bp, which is achieved by cleaving RsaI according Clontech protocol. Эта модификация не влияла на эффективность вычитания. This modification does not affect the efficiency of the subtraction. Затем создавали две различные тестируемые популяции с различными адаптерами, а драйверную библиотеку оставляли без адаптеров. Then we create two different test populations with different adapters, and Driver library allowed without adapters.

Затем тестируемую библиотеку и драйверную библиотеку гибридизовали с использованием избытка драйвер-кДНК. Then a test library and Driver library was hybridized using excess driver cDNA. В первой стадии гибридизации драйвер отдельно гибридизовали с каждой из двух тестируемых популяций кДНК. In the first step of hybridization driver separately hybridized with each of two cDNA populations tested. Это приводило к популяциям (а) негибридизованных тестируемых кДНК, (b) тестируемых кДНК, гибридизованных с другими тестируемыми кДНК, (с) тестируемых кДНК, гибридизованных с драйвер-кДНК, и (d) негибридизованных драйвер-кДНК. This resulted in populations of (a) the non-hybridized cDNA tested, (b) the test cDNAs hybridized to other test cDNA (s) of the test cDNAs hybridized to driver cDNAs and (d) non-hybridized driver cDNA. Затем эти две отдельные реакции гибридизации объединяли и повторно гибридизовали в присутствии дополнительной денатурированной драйвер-кДНК. Then, these two separate hybridization reactions were combined and re-hybridized in the presence of additional denatured driver cDNA. После этой второй гибридизации кроме популяций (а)-(d), получали пятую популяцию (е), в которой тестируемая кДНК с одним адаптером гибридизовалась с тестируемой ДНК со вторым адаптером. Following this second hybridization, in addition populations of (a) - (d), to give a fifth population (e), in which the test cDNA with one adapter hybridized to the test DNA with the second adapter. Вследствие этого вторая гибридизация приводила к обогащению дифференциально экспрессируемых последовательностей, которые могли бы использоваться в качестве матриц для ПЦР-амплификации с адаптер-специфическими праймерами. Consequently, the second hybridization resulted in enrichment of differentially expressed sequences which could be used as templates for PCR amplification with adapter-specific primers.

Затем концы достраивали и ПЦР-амплификацию проводили с использованием адаптер-специфических праймеров. Then the filled-ends, and PCR amplification was performed using adapter-specific primers. Только популяция (е), которая содержала тестируемую ДНК, которая не гибридизовалась с драйвер-кДНК, амплифицировалась экспоненциально. Only population (e), which contained the test DNA which is not hybridized with the driver cDNA amplified exponentially. Затем проводили вторую стадию ПЦР-амплификации для уменьшения фона и дополнительного обогащения дифференциально экспрессируемых последовательностей. Then performed a second PCR amplification step to reduce background and further enrich differentially expressed sequences.

Указанный способ вычитания на основе ПЦР нормализует дифференциально экспрессируемые кДНК таким образом, что могут быть извлечены редкие (необычные) транскрипты, которые сверхэкспрессируются в ткани опухоли предстательной железы. The method based on the PCR subtraction normalizes differentially expressed cDNAs so that rare may be extracted (unusual) transcripts that are overexpressed in prostate tumor tissue. Такие транскрипты было бы трудно извлечь традиционными способами вычитания. Such transcripts would be difficult to remove by conventional means subtraction.

Кроме генов, о которых известно, что они сверхэкспрессируются в опухоли предстательной железы, были идентифицированы семьдесят семь дополнительных клонов. In addition genes which are known to be overexpressed in prostate tumor, seventy-seven additional clones were identified. Последовательности этих частичных кДНК представлены в SEQ ID NO:29-305. Sequences of these partial cDNAs are shown in SEQ ID NO: 29-305. Большинство этих клонов не имели значимой гомологии с последовательностями баз данных. Most of these clones had no significant homology to database sequences. Исключениями были JPTPN23 (SEQ ID NO:231; сходство с валозин-содержащим белком свиньи), JPTPN30 (SEQ ID NO:234; сходство с мРНК субъединицы протеасомы крысы), JPTPN45 (SEQ ID NO:243; сходство с цитозольной НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназой крысы norvegicus), JPTPN46 (SEQ ID NO:244; сходство с ДНК-последовательностью субклона человека Н8 4 d4), JP1D6 (SEQ ID NO:265; сходство с легкой цепью А динеина G.gallus), JP8D6 (SEQ ID NO:288; сходство с клоном RG016J04 ВАС человека), JP8F5 (SEQ ID NО:289; сходство с ДНК-последовательностью субклона Н8 3 b5 человека) и JP8E9 (SEQ ID NO:299; сходство с последовательностью Alu человека). Exceptions were JPTPN23 (SEQ ID NO: 231; similarity to valozin-containing protein pig), JPTPN30 (SEQ ID NO: 234; similarity to mRNA subunits of the proteasome rat), JPTPN45 (SEQ ID NO: 243; similarity to cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase rat norvegicus), JPTPN46 (SEQ ID NO: 244; similarity to the DNA sequence of human subclone H8 4 d4), JP1D6 (SEQ ID NO: 265; similarity with the light chain dynein a G.gallus), JP8D6 (SEQ ID NO: 288 ; similarity to human BAC clone RG016J04), JP8F5 (SEQ ID NO: 289; similarity to the DNA sequence subclone H8 3 b5 human) and JP8E9 (SEQ ID NO: 299; similarity to human Alu sequence).

Дополнительные исследования с использованием библиотеки вычитания на основе ПЦР, состоящей из пула опухоли предстательной железы, подвергнутого вычитанию против пула нормальной предстательной железы (называемому ПО-ПН ПЦР-вычитанием) давало три дополнительных клона. Additional studies using the PCR-based subtraction library consisting of a prostate tumor pool subjected to subtraction against a pool of normal prostate (called ON-PN PCR subtraction) yielded three additional clones. Сравнение последовательностей-кДНК этих клонов с самым последним банком генов не выявило значимых гомологий к этим двум клонам, названным Р715Р и Р767Р (SEQ ID NO:312 и 314). Comparison of these sequences cDNA clones with the latest gene bank revealed no significant homologies to the two clones, named R715R and R767R (SEQ ID NO: 312 and 314). Оставшийся клон, как было обнаружено, показал некоторую гомологию с известным геном KIAA0056 (SEQ ID NO:318). The remaining clone was found, he showed some homology to known gene KIAA0056 (SEQ ID NO: 318). С использованием анализа микроматриц для измерения уровней экспрессии мРНК в различных тканях было обнаружено, что все три клона сверхэкспрессируются в опухолях предстательной железы и в тканях ВРН. Using microarray analysis to measure the mRNA expression levels in various tissues was found that all three clones over-expressed in prostate tumors and BPH tissues. Конкретно, клон Р715Р сверхэкспрессировался в большинстве опухолей предстательной железы и в тканях ВРН с коэффициентом 3 или более, причем повышенная экспрессия наблюдалась в большинстве проб нормальной предстательной железы и фетальной ткани, но экспрессия была отрицательной - низкой - во всех других нормальных тканях. Specifically, R715R clone overexpressed in most prostate tumors and BPH tissues by a factor of 3 or more, the increased expression observed in the majority of normal prostate samples and fetal tissues, but the expression was negative - low - in all other normal tissues. Клон Р767Р сверхэкспрессировался в нескольких опухолях предстательной железы и тканях ВРН с умеренными уровнями экспрессии в половине проб нормальной предстательной железы, и уровни экспрессии были равны фону или были низкими во всех других исследованных нормальных тканях. Clone R767R overexpressed in several prostate tumors and BPH tissues with moderate expression levels in half of the samples of normal prostate, and the expression levels were equal to the background or were low in all other tested normal tissues.

Дополнительный анализ при помощи вышеописанной микроматрицы, библиотеки вычитания ПО-ПН ПЦР и библиотеки вычитания ДНК, содержащей кДНК из опухоли предстательной железы, подвергнутую вычитанию с пулом кДНК нормальной ткани, привел к выделению 27 дополнительных клонов (SEQ ID NO:340-365 и 381), которые, как было определено, сверхэкспрессировались в опухоли предстательной железы. Additional analysis using the above described microarray software library subtraction-PN PCR subtraction library and DNA containing cDNA from prostate tumor, subjected to a subtraction with a pool of normal tissue cDNAs, led to the isolation of 27 additional clones (SEQ ID NO: 340-365 and 381) which, as defined, is overexpressed in prostate tumors. Было обнаружено, что клоны SEQ ID NО:341, 342, 345, 347, 348, 349, 351, 355-359, 361, 362 и 364 сверхэкспрессируются в нормальной предстательной железе. It was found that the clones of SEQ ID NO: 341, 342, 345, 347, 348, 349, 351, 355-359, 361, 362 and 364 over-expressed in normal prostate. Было найдено, что экспрессия всех 26 клонов в различных нормальных тканях была низкой или неопределяемой за исключением P544S (SEQ ID NО:356), который, как было обнаружено, экспрессировался в тонкой кишке. It was found that expression of all 26 clones in a variety of normal tissues were low or undetectable except P544S (SEQ ID NO: 356), which has been found to be expressed in the small intestine. Было обнаружено, что из этих 26 клонов 10 (SEQ ID NO:340-349) обнаруживают некоторую гомологию с ранее идентифицированными последовательностями. It was found that 26 of the 10 clones (SEQ ID NO: 340-349) show some homology to previously identified sequences. Не были обнаружены значимые гомологии к клонам SEQ ID NO:350-365. 350-365: Not significant homology to SEQ ID NO clones were found.

ПРИМЕР 6 EXAMPLE 6

ПЕПТИДНОЕ ПРАЙМИРОВАНИЕ МЫШЕЙ И РАЗМНОЖЕНИЕ ЛИНИЙ ЦТЛ Peptide priming mice and reproduction CTL LINES

6.1. 6.1. Указанный пример иллюстрирует получение линии клеток ЦТЛ (цитотоксических Т-лимфоцитов), специфической в отношении клеток, экспрессирующих ген P502S. This example illustrates the preparation of a CTL cell line (CTL) specific for cells expressing P502S gene.

Мышей, экспрессирующих трансген для HLA A2.1 человека (предоставленный доктором L.Sherman, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA), иммунизировали пептидом P2S#12 (VLGWVAEL; SEQ ID NO:306), который был получен из гена P502S (также называемого здесь J1-17, SEQ ID NO:8), как описано Theobald et al., Proc. Mice expressing the transgene for human HLA A2.1 (provided by Dr. L.Sherman, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA), were immunized with P2S # 12 peptide (VLGWVAEL; SEQ ID NO: 306), which was obtained from the P502S gene ( also referred to herein as J1-17, SEQ ID NO: 8), as described by Theobald et al, Proc.. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 92:11993-11997, 1995) со следующими модификациями. USA 92: 11993-11997, 1995) with the following modifications. Мышей иммунизировали 100 мкг P2S#12 и 120 мкг связывающего пептида IA b , произведенного из белка вируса гепатита В, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда. Mice were immunized with 100 ug P2S # 12 and 120 micrograms of the peptide binding IA b, manufactured from a hepatitis B virus protein emulsified in incomplete Freund's adjuvant. Спустя три недели мышей умерщвляли и получали суспензии одиночных клеток с использованием найлонового сита. Three weeks later the mice were sacrificed and single cell suspensions prepared using a nylon sieve. Затем клетки ресуспендировали при 6×10 6 клеток/мл в полной среде (RPMI-1640; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), содержащей 10% ФТС, 2 мМ глутамин (Gibco BRL), пируват натрия (Gibco BRL), ненезаменимые аминокислоты (Gibco BRL), 2×10 -5 М 2-меркаптоэтанол, 50 Е/мл пенициллина и стрептомицина, и культивировали в присутствии облученных (3000 рад) кратковременно обработанных Р2S#12 (5 мг/мл P2S#12 и 10 мг/мл β2-микроглобулина) ЛПС-бластов (трансгенных клеток селезенки А2, культивируемых в присутствии 7 мкг/мл сульфата декстрана и 25 мкг/мл ЛПС в течение 3 дней). Cells were then resuspended at 6 × 10 6 cells / ml in complete medium (RPMI-1640; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , supplemented with 10% FCS, 2 mM glutamine (Gibco BRL), sodium pyruvate (Gibco BRL), nenezamenimye amino acids ( Gibco BRL), 2 × 10 -5 M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin and streptomycin and cultured in the presence of irradiated (3000 rad) briefly treated R2S # 12 (5 mg / ml P2S # 12 and 10 mg / ml β2 -microglobulin) LPS blasts (A2 transgenic spleens cells cultured in the presence of 7 mg / ml dextran sulfate, and 25 ug / ml LPS for 3 days). Спустя 6 дней клетки (5×10 5 клеток/мл) повторно стимулировали (2/5×10 6 клеток/мл) облученными (20000 рад) кратковременно обработанными пептидом клетками EL4A2Kb (Sherman et al., Science 258:815-818, 1992) и 3×10 6 клеток на мл питающими трансгенными клетками селезенки А2 один раз в неделю, как описано, в подготовке для клонирования этой линии. After 6 days, the cells (5 × 10 5 cells / ml) were restimulated (2/5 × 10 6 cells / ml), irradiated (20000 rad) peptide EL4A2Kb briefly treated cells (Sherman et al, Science 258:. 815-818, 1992 ) and 3 × 10 6 cells per ml feeder A2 transgenic spleen cells once a week, as described, in preparation for cloning the line.

Линию P2S#12 клонировали с использованием анализа лимитирующего разведения с кратковременно обработанными пептидом опухолевыми клетками EL4 А2Кb (1×10 4 клеток на лунку) в качестве стимуляторов и трансгенными клетками А2 селезенки в качестве клеток-фидеров (питающих клеток) (5×10 5 клеток на лунку), выращиваемыми в присутствии 30 Е/мл IL-2. Line P2S # 12 cloned using analysis of limiting dilution with short peptide treated tumor cells EL4 A2Kb (1 × 10 4 cells per well) as stimulators and transgenic cells A2 spleen as feeder cells (feeder cells) (5 × 10 5 cells per well) were grown in the presence of 30 U / ml IL-2. В день 14 клетки повторно стимулировали, как описано ранее. At day 14, cells were restimulated as described above. В день 21 клоны, которые росли, выделяли и поддерживали в культуре. On the day of 21 clones that were growing were isolated and maintained in culture. Некоторые из этих клонов продемонстрировали значимо более высокую реактивность (лизис) против фибробластов человека (экспрессирующих HLA А2.1), трансдуцированных P502S, в сравнении с контрольными фибробластами. Some of these clones demonstrated significantly higher reactivity (lysis) against human fibroblasts (HLA A2.1 expressing) transduced with P502S, as compared to control fibroblasts. Пример представлен на фигуре 1. An example is shown in Figure 1.

Эти данные показывают, что P2S#l2 представляет природно процессируемый эпитоп белка P502S, который экспрессируется в контексте молекулы HLA A2.1 человека. These data show that the P2S # l2 represents the natural epitope of the processed P502S protein that is expressed in the context of HLA A2.1 molecule person.

6.2. 6.2. Указанный пример иллюстрирует получение мышиных линий ЦТЛ и ЦТЛ-клонов, специфических в отношении клеток, экспрессирующих ген P501S. This example illustrates the preparation of murine CTL lines and CTL clones specific for cells expressing P501S gene.

Эту серию экспериментов проводили подобно серии, описанной выше. This series of experiments was conducted similarly to the series described above. Мышей иммунизировали пептидом P1S#10 (SEQ ID NO:337), который был получен из гена P501S (также называемого здесь L1-12, SEQ ID NO:110). Mice immunized with peptide P1S # 10 (SEQ ID NO: 337), which was obtained from the P501S gene (also referred to herein L1-12, SEQ ID NO: 110). Пептид P1S#10 был произведен анализом предсказанной полипептидной последовательности для P505S на потенциальные HLA-A2-связывающие последовательности, определяемые при помощи опубликованных мотивов НLА-А2-связывания (Parker, КС, et al., J.Immunol., 152:163, 1994). P1S # 10 peptide was produced by analysis of the predicted polypeptide sequence for P505S for potential HLA-A2-binding sequences determined using the published HLA-A2 binding motifs (Parker, CS, et al, J.Immunol, 152:.. 163, 1994 ). Пептид P1S#10 синтезировали, как описано в примере 4, и эмпирически тестировали на HLA-A2-связывание с использованием конкурентного анализа на основе Т-клеток. P1S # 10 peptide was synthesized as described in Example 4, and empirically tested for HLA-A2-binding using a competition assay based on T-cells. Предсказанные А2-связывающие пептиды испытывали на их способность конкурировать за представление HLA-А2-специфического пептида НLА-А2-рестриктированному ЦТЛ-клону (D150M58), который является специфическим в отношении НLА-А2-связывающего пептида fluM58 матрикса вируса гриппа. Predicted A2 binding peptides were tested for their ability to compete for presentation of HLA-A2-specific peptide-HLA-A2 restricted CTL clone (D150M58), which is specific for HLA-A2-binding peptide fluM58 influenza virus matrix. D150М58-ЦТЛ секретирует TNF в ответ на самопредставление пептида fluM58. D150M58-CTL secretes TNF in response to the self-representation fluM58 peptide. В этом конкурентном анализе тест-пептиды в количестве 100-200 мкг/мл добавляли в культуры 0150М58-ЦТЛ для связывания HLA-A2 на этих ЦТЛ. In this competition assay, test peptides in an amount of 100-200 micrograms / ml were added to cultures 0150M58-CTLs for HLA-A2 binding to these CTLs. Спустя тридцать минут ЦТЛ, культивируемые с тест-пептидами или контрольными пептидами, испытывали на их зависимость ответа от дозы антигена в отношении пептида fluM58 в стандартном биотесте на TNF. After thirty minutes, CTL cultured with test peptides or control peptides, were tested for their dependence on the antigen dose response against fluM58 peptide in a standard bioassay for TNF. Как показано на фигуре 3, пептид P1S#10 конкурирует за HLA-A2-рестриктированное представление fluM58, демонстрируя, что пептид Р1S#10 связывает HLA-A2. As shown in Figure 3, the peptide P1S # 10 competes for the HLA-A2-restricted presentation fluM58, demonstrating that peptide binds R1S # 10 HLA-A2.

Мышей, экспрессирующих трансген для HLA-A2 человека, иммунизировали, как описано Theobald et al., Proc. Mice expressing the transgene for human HLA-A2, were immunized as described by Theobald et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 92:11993-11997, 1995) со следующими модификациями. USA 92: 11993-11997, 1995) with the following modifications. Мышей иммунизировали 62,5 мкг P1S#10 и 120 мкг связывающего пептида IA b , произведенного из белка вируса гепатита В, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда. Mice were immunized with 62.5 P1S # 10 micrograms and 120 micrograms of the peptide binding IA b, produced from a hepatitis B virus protein emulsified in incomplete Freund's adjuvant. Спустя три недели мышей умерщвляли и получали суспензии одиночных клеток с использованием найлонового сита. Three weeks later the mice were sacrificed and single cell suspensions prepared using a nylon sieve. Затем клетки ресуспендировали при 6×10 6 клеток/мл в полной среде (описанной выше) и культивировали в присутствии облученных (3000 рад) кратковременно обработанных P1S#10 (2 мг/мл P1S#10 и 10 мг/мл β2-микроглобулина) ЛПС-бластов (трансгенных клеток селезенки А2, культивируемых в присутствии 7 мкг/мл сульфата декстрана и 25 мкг/мл ЛПС в течение 3 дней). The cells were then resuspended at 6 × 10 6 cells / ml in complete medium (described above) and cultured in the presence of irradiated (3000 rad) briefly treated P1S # 10 (2 mg / ml P1S # 10 and 10 mg / ml β2-microglobulin) LPS -blastov (A2 transgenic spleens cells cultured in the presence of 7 mg / ml dextran sulfate, and 25 ug / ml LPS for 3 days). Спустя 6 дней клетки (5×10 5 клеток/мл) повторно стимулировали (2,5×10 6 клеток/мл) облученными (20000 рад) кратковременно обработанными пептидом клетками EL4A2Kb, как описано выше, и 3×10 6 клеток на мл питающими трансгенными клетками селезенки А2. After 6 days, the cells (5 × 10 5 cells / ml) were restimulated (2,5 × 10 6 cells / ml), irradiated (20000 rad) peptide EL4A2Kb briefly treated cells as described above, and 3 × 10 6 cells per ml feeder A2 transgenic spleen cells. Клетки культивировали в присутствии 20 Е/мл IL-2. Cells were cultured in the presence of 20 U / ml IL-2. Клетки повторно стимулировали один раз в неделю в подготовке для клонирования. The cells were restimulated once a week in preparation for cloning. После трех циклов стимуляций in vitro была получена одна линия, которая узнавала обработанные кратковременно P1S#10 клетки-мишени Jurkat A2Kb и трансдуцированные P501S мишени Jurkat, как показано на фигуре 4. After three stimulations in vitro cycles was obtained one line which recognize treated briefly P1S # 10 target cells and transduced Jurkat A2Kb targets P501S Jurkat, as shown in Figure 4.

P1S#10-специфическую ЦТЛ-линию клонировали с использованием анализа лимитирующего разведения с обработанными кратковременно пептидом опухолевыми клетками EL4 A2Kb (1×10 4 клеток на лунку) в качестве стимуляторов и трансгенными клетками селезенки А2 в качестве фидеров (питающих клеток) (5×10 5 клеток на лунку), выращенных в присутствии 30 Е/мл IL-2. P1S # 10-specific CTL line was cloned using the analysis by limiting dilution with treated briefly peptide tumor cells EL4 A2Kb (1 × 10 4 cells per well) as stimulators and transgenic A2 spleen cells as feeders (feeder cells) (5 × 10 5 cells per well) were grown in the presence of 30 U / ml IL-2. В день 14 клетки повторно стимулировали, как и прежде. At day 14, cells were re-stimulated as before. В день 21 жизнеспособные клоны выделяли и поддерживали в культуре. On day 21 the viable clones were isolated and maintained in culture. Как показано на фигуре 5, пять из этих клонов продемонстрировали специфическую цитолитическую реактивность против трансдуцированных P501S мишеней Jurkat A2Kb. As shown in Figure 5, five of these clones demonstrated specific cytolytic reactivity against P501S targets transduced Jurkat A2Kb. Эти результаты показывают, что P1S#10 представляет природно процессируемый эпитоп белка P501S, который экспрессируется в контексте молекулы HLA-A2.1 человека. These results show that P1S # 10 is naturally of the processed epitope P501S protein that is expressed in the context of HLA-A2.1 molecule person.

ПРИМЕР 7 EXAMPLE 7

СПОСОБНОСТЬ Т-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА УЗНАВАТЬ ОПУХОЛЕВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ABILITY OF HUMAN T CELLS recognize tumor Polypeptides PROSTATE

Указанный пример иллюстрирует способность Т-клеток, специфических в отношении опухолевого полипептида предстательной железы, узнавать опухоль человека. This example illustrates the ability of T cells specific for a tumor polypeptide prostate recognize human tumor.

CD8 + Т-клетки человека праймировали in vitro пептидом P2S-12 (SEQ ID NO:306), произведенным из P502S (также называемого J1-17), с использованием дендритных клеток в соответствии с протоколом Van Tsai et al. Human CD8 + T cells primed in vitro P2S-12 peptide (SEQ ID NO: 306), produced from P502S (also called J1-17), using dendritic cells according to Van Tsai et al protocol. (Critical Reviews in Immunology 18:65-75, 1998). (Critical Reviews in Immunology 18: 65-75, 1998). Полученные микрокультуры CD8 + Т-клеток испытывали на их способность узнавать пептид P2S-12, представляемый аутологичными фибробластами или фибробластами, которые были трансдуцированы для экспрессии гена P502S, в анализе ELISPOT с γ-интерфероном (Lalvani et al., J. Exp. Med. 186:859-865, 1997). The resulting microcultures CD8 + T-cells were tested for their ability to recognize the P2S-12 peptide, presented by autologous fibroblasts or fibroblasts which were transduced to express the P502S gene in ELISPOT assay with γ-interferon (Lalvani et al., J. Exp . Med. 186: 859-865, 1997). Вкратце, титрующиеся количества Т-клеток анализировали в двух повторностях на 10 4 фибробластах в присутствии 3 мкг/мл β 2 -микроглобулина человека и 1 мкг/мл пептида P2S-12 или контрольного пептида Е75. Briefly, titrated number of T cells were analyzed in duplicate per 10 4 fibroblasts in the presence of 3 mcg / ml of human β 2 -microglobulin and 1 ug / ml P2S-12 peptide or control E75 peptide. Кроме того, Т-клетки одновременно анализировали на аутологичных фибробластах, трансдуцированных геном P502S, или, в качестве контроля, фибробластах, трансдуцированных HER-2/neu. In addition, T cells were analyzed for both autologous fibroblasts transduced gene P502S, or, as a control, fibroblasts transduced with HER-2 / neu. Перед анализом фибробласты обрабатывали 10 нг/мл γ-интерферона в течение 48 часов для положительной регуляции экспрессии МНС класса I. Одна из этих микрокультур (№5) продемонстрировала сильное узнавание обоих обработанных кратковременно пептидом фибробластов, а также трансдуцированных фибробластов в анализе ELISPOT с γ-интерфероном. Before analysis fibroblasts treated with 10 ng / ml γ-interferon in 48 hours for a positive regulation of the expression of MHC class I. One of the microcultures (№5) demonstrated strong recognition of both a short peptide treated fibroblasts as well as transduced fibroblasts in ELISPOT assay γ- interferon. Фигура 2А демонстрирует, что было сильное увеличение числа пятен γ-интерферона с увеличением количеств Т-клеток на фибробластах, кратковременно обработанных пептидом P2S-12 (сплошные столбцы), но не контрольным пептидом Е75 (белые столбцы). Figure 2A demonstrates that there was a strong increase in the number of γ-interferon spots with increasing numbers of T cells on fibroblasts treated briefly P2S-12 peptide (solid bars), but not the control peptide E75 (white columns). Это показывает способность этих Т-клеток специфически узнавать пептид P2S-12. This shows the ability of these T cells specifically recognize the P2S-12 peptide. Как показано на фигуре 2В, эта микрокультура показала также увеличение числа пятен γ-интерферона с увеличением количеств Т-клеток на фибробластах, трансдуцированных для экспрессии гена P502S, но не гена HER-2/neu. As shown in Figure 2B, this microculture also demonstrated an increase in the number of γ-interferon spots with increasing numbers of T cells on fibroblasts transduced to express the P502S gene but not the gene HER-2 / neu. Эти результаты обеспечивают дополнительное подтверждающее доказательство, что пептид P2S-12 является природно процессируемым эпитопом белка P502S. These results provide further supporting evidence that the P2S-12 peptide is the epitope of the processed natural P502S protein. Кроме того, это также показывает, что в популяции Т-клеток человека существуют высокоаффинные Т-клетки, которые способны узнавать указанный эпитоп. Moreover, it also shows that in a population of human T-cells there are high affinity T cells which are capable of recognizing said epitope. Эти Т-клетки должны также быть способными узнавать опухоли человека, экспрессирующие ген P502S. These T cells should also be capable of recognizing human tumor expressing P502S gene.

ПРИМЕР 8 EXAMPLE 8

ПРАЙМИРОВАНИЕ ЦТЛ in vivo ПУТЕМ ИММУНИЗАЦИИ ДЕПРОТЕИНИЗИ-РОВАННОЙ ДНК С АНТИГЕНОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Priming CTL in vivo by immunizing DEPROTEINIZI Rowan-DNA C PROSTATE ANTIGEN

Опухолевый антиген предстательной железы L1-12, описанный выше, называют также P501S. The tumor antigen prostatic L1-12, described above, also referred to as P501S. Мышей HLA А2Кb Тg (предоставленных доктором L.Sherman, The Scipps Research Institute, La Jolla; CA) иммунизировали 100 мкг VR10132-P501S либо внутримышечно, либо внутрикожно. HLA A2Kb Tg mice (provided by Dr. L.Sherman, The Scipps Research Institute, La Jolla; CA) were immunized with 100 ug VR10132-P501S either intramuscularly or intradermally. Мышей иммунизировали три раза с двухнедельным интервалом между иммунизациями. Mice were immunized three times at two-week intervals between immunizations. Через две недели после последней иммунизации иммунные клетки селезенки культивировали с трансдуцированными стимуляторными клетками Jurkat A2Kb-P501S. Two weeks after the last immunization, immune spleen cells were cultured with stimulator cells transduced Jurkat A2Kb-P501S. ЦТЛ-линии стимулировали один раз в неделю. CTL line stimulated once a week. После двух недель стимуляции in vitro оценивали активность ЦТЛ против трансдуцированных P501S мишеней. After two weeks of in vitro stimulation of CTL activity was assessed against P501S-transduced targets. Две из 8 мышей развили сильные ответы ЦТЛ против P501S. Two out of 8 mice developed strong CTL responses against P501S. Эти результаты показывают, что P501S содержит по меньшей мере один природно процессируемый А2-рестриктированный эпитоп ЦТЛ. These results indicate that P501S comprises at least one of the processed natural A2-restricted CTL epitope.

ПРИМЕР 9 EXAMPLE 9

ГЕНЕРИРОВАНИЕ ЦТЛ ЧЕЛОВЕКА in vitro ПОСРЕДСТВОМ ПРАЙМИРОВАНИЯ ЦЕЛЫМ ГЕНОМ И СПОСОБЫ СТИМУЛЯЦИИ ОПУХОЛЕВЫМ АНТИГЕНОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ GENERATION OF HUMAN CTL priming in vitro BY WHOLE GENOME AND METHODS FOR STIMULATION OF PROSTATE TUMOR ANTIGEN

Посредством праймирования целым геном in vitro с трансдуцированными P501S (в ретровирусном векторе) аутологичными фибробластами (например, Yee et al., The Journal of Immunology, 157 (9):4079-86, 1996) получали линии ЦТЛ человека, которые специфически узнают аутологичные фибробласты, трансдуцированные P501S (также известным как L1-12), как определено при помощи анализа ELISPOT с γ-интерфероном. By priming whole gene in vitro transduced with P501S (in the retroviral vector) autologous fibroblasts (e.g., Yee et al, The Journal of Immunology, 157 (9). 4079-86, 1996), human CTL lines were obtained, which specifically recognize autologous fibroblasts transduced with P501S (also known as L1-12), as determined by ELISPOT assay with γ-interferon. С использованием панели с HLA-несовместимыми фибробластными линиями, трансдуцированными P501S, было показано, что эти линии ЦТЛ рестриктированы аллелем HLA-A2 класса I. Конкретно, дендритные клетки (ДК) дифференцировались из культур моноцитов, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) нормальных доноров человека путем выращивания в течение пяти дней в среде RPMI, содержащей 10% сыворотку человека, 50 нг/мл GM-CSF человека и 30 нг/мл IL-4 человека. Using a panel of HLA-incompatible with fibroblast lines transduced with P501S, it was shown that the CTL lines restricted allele HLA-A2 class I. Specifically, dendritic cells (DC) were differentiated from monocyte cultures derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of normal human donors by culturing for five days in RPMI medium containing 10% human serum, 50 ng / ml human GM-CSF and 30 ng / ml human IL-4. После культивирования ДК инфицировали в течение ночи рекомбинантным содержащим P501S вирусом коровьей оспы при множественности заражения (MOI) пять, и они созревали в течение ночи под действием 3 мкг/мл лиганда CD40. After culturing DC were infected overnight with recombinant P501S containing vaccinia virus at a multiplicity of infection (MOI) five and they matured overnight by the action of 3 mg / ml ligand CD40. Вирус инактивировали облучением УФ. The virus was inactivated by UV irradiation. CD8 + Т-клетки выделяли с использованием системы с магнитными гранулами и культуры для праймирования инициировали с использованием стандартных способов культивирования. CD8 + T cells were isolated using a magnetic beads system for priming and culture was initiated using standard culture techniques. Культуры повторно стимулировали каждые 7-10 дней с использованием аутологичных первичных фибробластов, трансдуцированных при помощи ретровирусного вектора P501S. Cultures were restimulated every 7-10 days using autologous primary fibroblasts transduced using the retroviral vector P501S. После четырех циклов стимуляции идентифицировали линии CD8 + Т-клеток, которые специфически продуцировали интерферон-γ при стимуляции Р501S-трансдуцированными аутологичными фибробластами. Following four stimulation cycles, CD8 identified line + T cells that specifically produced interferon-γ upon stimulation R501S-transduced autologous fibroblasts. Р501S-специфическая активность могла поддерживаться продолжающейся стимуляцией культур Р501S-трансдуцированными фибробластами в присутствии IL-15. R501S-specific activity could be maintained continuing R501S-stimulation cultures transduced fibroblasts in the presence of IL-15. Панель HLA-несовместимых линий фибробластов, трансдуцированных P501S, генерировали для определения аллеля рестрикции (ограничения) этого ответа. Panel HLA-incompatible fibroblast lines transduced with P501S, was generated to determine the allele restriction (limitation) of this response. Путем измерения интерферона-γ в анализе ELISPOT было показано, что P501S-специфическая ответная реакция была рестриктирована (ограничена) HLA-A2. By measuring interferon-γ in ELISPOT analysis it showed that P501S-specific response was restricted (limited) HLA-A2. Эти результаты показывают, что CD8 + ЦТЛ-ответ на P501S может быть индуцирован. These results show that the CD8 + CTL response may be induced by P501S.

ПРИМЕР 10 EXAMPLE 10

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРИРОДНО ПРОЦЕССИРУЕМОГО ЭПИТОПА ЦТЛ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В АНТИГЕНЕ ОПУХОЛИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Identification of natural of the processed CTL epitope CONTAINED IN antigens prostate tumors

9-мерный пептид р5 (SEQ ID NO:338) получали из антигена Р703Р (также называемого Р20). 9-mer peptide p5 (SEQ ID NO: 338) was obtained from R703R antigen (also called P20). Пептид р5 является иммуногенным в донорах HLA-A2 и является природно процессируемым эпитопом. P5 peptide is immunogenic in HLA-A2 donors and is a natural epitope of the processed. Антиген-специфические CD8 + Т-клетки могут быть праймированы после повторяемых стимуляций in vitro моноцитами, кратковременно обработанными пептидом р5. Antigen-specific CD8 + T cells can be primed following repeated in vitro stimulations monocytes treated briefly peptide p5. Эти ЦТЛ специфически узнают обработанные кратковременно пептидом р5 клетки-мишени как в анализе ELISPOT, так и в анализе с высвобождением хрома. These CTLs specifically recognize short peptide p5 treated target cells in the ELISPOT assay and in the chromium release assay. Кроме того, иммунизация HLA-A2 трансгенных мышей с P509S приводит к генерированию линий ЦТЛ, которые узнают различные Р703Р-трансдуцированные клетки-мишени, экспрессирующие либо HLA-A2Kb, либо HLA-A2. Moreover, immunization with HLA-A2 transgenic mice with P509S results in the generation of CTL lines which recognize a variety R703R-transduced target cells expressing either HLA-A2Kb, or HLA-A2. Конкретно, HLA-A2-трансгенных мышей иммунизировали подкожно в подушечку лапки 100 мкг пептида р5 вместе с 140 мкг корового пептида вируса гепатита В (пептида Th) в неполном адъюванте Фрейнда. Specifically, HLA-A2-transgenic mice were immunized subcutaneously in the footpad with 100 ug p5 peptide together with 140 ug core peptide of hepatitis B virus (Th peptide) in Freund's incomplete adjuvant. Через три недели после иммунизации клетки селезенки из иммунизированных мышей стимулировали in vitro ЛПС-бластами, кратковременно обработанными пептидом. Three weeks after the immunization, spleen cells from immunized mice were stimulated in vitro LPS-blasts, briefly treated with peptide. Активность ЦТЛ оценивали анализом высвобождения хрома через пять дней после первичной стимуляции in vitro. CTL activity was evaluated chromium release assay after five days of primary stimulation in vitro. Ретровирусно трансдуцированные клетки, экспрессирующие контрольный антиген P703S и HLA-A2, использовали в качестве мишеней. Retroviral transduced cells expressing the control antigen P703S and HLA-A2, was used as targets. Линии ЦТЛ, которые специфически узнавали как кратковременно обработанные P509S мишени, так и экспрессирующие P703S мишени, были идентифицированы. CTL lines that specifically recognized both briefly treated target P509S and P703S expressing targets were identified.

Эксперименты по праймированию in vitro человека показали, что пептид р5 является иммуногенным в человеке. Experiments in vitro priming of human have shown that p5 peptide is immunogenic in man. Дендритные клетки (ДК) дифференцировали из культур моноцитов, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) нормальных доноров человека путем культивирования в течение пяти дней в среде RPMI, содержащей 10% сыворотку человека, 50 нг/мл GM-CSF человека и 30 нг/мл IL-4 человека. Dendritic cells (DC) were differentiated from cultures of monocytes obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of normal human donors by culturing for five days in RPMI medium containing 10% human serum, 50 ng / ml GM-CSF human and 30 ng / ml human IL-4. После культивирования ДК обрабатывали кратковременно пептидом р5 и культивировали с GM-CSF и IL-4 вместе с обогащенными CD8 + Т-клетками РВМС. After culturing DC was treated briefly p5 peptide and cultured with GM-CSF and IL-4 together with enriched CD8 + T cells PBMC. Линии ЦТЛ повторно стимулировали один раз в неделю кратковременно обработанными р5 моноцитами. CTL lines were restimulated once a week for a short p5 treated monocytes. Через пять-шесть недель после инициации культур ЦТЛ было продемонстрировано узнавание ЦТЛ кратковременно обработанных пептидом р5 клеток-мишеней. After five or six weeks after the initiation of CTL cultures it was demonstrated CTL recognition of p5 short peptide-treated target cells.

ПРИМЕР 11 EXAMPLE 11

ЭКСПРЕССИЯ ПОЛУЧЕННОГО ИЗ ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ АНТИГЕНА В ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЕ EXPRESSION OF OBTAINED FROM BREAST CANCER antigen in prostate

Выделение антигена B305D из опухоли молочной железы посредством дифференциального изображения описано в патентной заявке США № 08/700014, поданной 20 августа 1996 года. Isolation of the antigen B305D from breast tumor by differential image is described in U.S. Patent Application № 08/700014, filed 20 August 1996 of the year. Несколько различных сплайсинговых форм указанного ангтигена были выделены. Several different splice forms of this angtigena been allocated. Определенные последовательности-ДНК для этих сплайсинговых форм представлены в SEQ ID NO:366-375 с предсказанными аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:292, 298 и 301-303, представленными в SEQ ID NO:299-306 соответственно. Certain DNA sequences for these splice forms are shown in SEQ ID NO: 366-375 and predicted amino acid sequences corresponding to sequences SEQ ID NO: 292, 298 and 301-303 presented in SEQ ID NO: 299-306 respectively.

Уровни экспрессии B305D в различных опухолевых и нормальных тканях исследовали ПЦР реального времени и Нозерн-анализом. B305D expression levels in various tumor and normal tissues examined the real time PCR and by Northern analysis. Результаты показали, что B305D экспрессируется на высоком уровне в опухоли молочной железы, опухоли предстательной железы, нормальной предстательной железе и нормальных яичках, причем экспрессия является низкой или неопределяемой во всех других испытанных тканях (опухоли ободочной кишки, опухоли легкого, опухоли яичника и нормальном костном мозгу, ободочной кишке, почке, печени, легком, яичнике, коже, тонкой кишке, желудке). The results indicated that B305D is highly expressed in breast tumors, prostate tumors, normal prostate and normal testis, and the expression is low or undetectable in all other tested tissues (colon tumors, lung tumors, ovarian tumors and normal bone marrow , colon, kidney, liver, lung, ovary, skin, small intestine, stomach).

ПРИМЕР 12 EXAMPLE 12

ВЫЗЫВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДЛЯ АНТИГЕНА ОПУХОЛИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЦТЛ-ОТВЕТОВ В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Evoke antigen specific prostate tumor CTL RESPONSES IN HUMAN BLOOD

Указанный пример иллюстрирует способность опухолевого антигена предстательной железы вызывать ЦТЛ-ответ в крови здоровых людей. This example illustrates the ability of a tumor antigen prostatic induce CTL response in the blood of healthy people.

Аутологичные дендритные клетки (ДК) дифференцировали из культур моноцитов, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) нормальных доноров человека путем выращивания в течение пяти дней в среде RPMI, содержащей 10% сыворотку человека, 50 нг/мл GM-CSF человека и 30 нг/мл IL-4 человека. Autologous dendritic cells (DC) were differentiated from cultures of monocytes obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of normal human donors by culturing for five days in RPMI medium containing 10% human serum, 50 ng / ml GM-CSF human and 30 ng / ml human IL-4. После культивирования ДК инфицировали в течение ночи рекомбинантным экспрессирующим P501S вирусом коровьей оспы при множественности заражения (MOI) 5 и они созревали в течение 8 часов под действием 2 мкг/мл лиганда CD40. After culturing DC were infected overnight with recombinant P501S expressing vaccinia virus at a multiplicity of infection (MOI) of 5 and they matured for 8 hours under the action of 2 mg / ml of ligand CD40. Вирус инактивировали облучением УФ, CD8 + Т-клетки выделяли положительным отбором с использованием магнитных гранул и культуры для праймирования инициировали в 24-луночном планшете. The virus was inactivated by UV irradiation, CD8 + T cells were isolated by positive selection using magnetic beads, and priming cultures for initiated in 24-well plate. После пяти циклов стимуляции идентифицировали CD8 + линии, которые специфически продуцировали интерферон-гамма при стимуляции аутологичными Р501S-трансдуцированными фибробластами. Following five stimulation cycles, CD8 + lines were identified that specifically produced interferon-gamma when stimulated with autologous-transduced fibroblasts R501S. P501S-специфическая активность клеточной линии 3А-1 могла поддерживаться после дополнительных циклов стимуляции на аутологичных B-LCL, трансдуцированных P501S. P501S-specific activity 3A-1 cell line can be maintained following additional stimulation cycles on autologous B-LCL, transduced with P501S. Было показано, что линия 3А-1 узнает аутологичные B-LCL, трансдуцированные для экспрессии P501S, но не EGFP-трансдуцированные аутологичные B-LCL, как измерено при помощи анализов на цитотоксичность (высвобождения 51 Сr) и анализа с продуцированием интерферона-гамма (ELISPOT с интерфероном-гамма; см. выше и Lalvani et al., J. Exp. Med. 186:859-865, 1997). It has been shown that the line 3A-1 recognize autologous B-LCL, transduced to express P501S, but not EGFP-transduced autologous B-LCL, as measured using the assays for cytotoxicity (release 51 Cr) and analysis with the production of interferon-gamma (ELISPOT interferon-gamma; see above and Lalvani et al, J. Exp Med 186: 859-865, 1997)..... Результаты этих анализов представлены на фигурах 6А и 6В. The results of these analyzes are shown in Figures 6A and 6B.

ПРИМЕР 13 EXAMPLE 13

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИГЕНОВ ОПУХОЛИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ПОМОЩИ АНАЛИЗА С МИКРОМАТРИЦЕЙ Identify antigenic prostate tumors by analyzing microarray C

Указанный пример описывает выделение некоторых опухолевых полипептидов предстательной железы из библиотеки кДНК опухоли предстательной железы. This example describes the isolation of certain prostate tumor polypeptides from a prostate prostate tumor cDNA library.

Экспрессионную библиотеку кДНК опухоли предстательной железы человека, описанную выше, подвергали скринингу с использованием анализа с микроматрицей для идентификации клонов, которые проявляют по меньшей мере трехкратную сверхэкспрессию в опухоли предстательной железы и/или нормальной предстательной железе в сравнении с не относящимися к предстательной железе нормальными тканями (за исключением яичка). The expression of tumor cDNA library of human prostate as described above were screened using an assay with a microarray to identify clones that exhibit at least three-fold overexpression in prostate tumor and / or normal prostate compared to outside the prostate normal tissues ( except testis). Были идентифицированы 372 клона и 319 были успешно секвенированы. Clone 372 and 319 were successfully sequenced were identified. Таблица 1 представляет суммирование этих клонов, которые показаны в SEQ ID NO:385-400. Table 1 represents the summation of these clones are shown in SEQ ID NO: 385-400. Из этих последовательностей SEQ ID NO:386, 389, 390 и 302 соответствуют новым генам, a SEQ ID NO:393 и 396 соответствуют ранее идентифицированным последовательностям. Of these sequences SEQ ID NO: 386, 389, 390 and 302 correspond to novel genes, a SEQ ID NO: 393 and 396 correspond to previously identified sequences. Другие (SEQ ID NO:385, 387, 388, 391, 294, 395 и 397-400) соответствуют известным последовательностям, как показано в таблице 1. Other (SEQ ID NO: 385, 387, 388, 391, 294, 395 and 397-400) correspond to known sequences, as shown in Table 1.

Figure 00000002

CGI-82 проявлял 4,06-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. CGI-82 showed 4.06 fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 43% опухолей предстательной железы, 25% нормальных предстательных желез, не определялся в других испытанных нормальных тканях. He is overexpressed in 43% of prostate tumors, 25% normal prostate, not detected in other normal tissues tested. L-идитол-2-дегидрогеназа обнаружила 4,94-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. L-iditol-2-dehydrogenase, found 4.94 fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Она сверхэкспрессировалась в 90% опухолей предстательной железы, 100% нормальных предстательных желез и не определялась в других испытанных нормальных тканях. It is overexpressed in 90% of prostate tumors, 100% of normal prostate and not detected in other normal tissues tested. Ets фактор транскрипции PDEF проявлял 5,55-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. Ets transcription factor PDEF showed a 5.55-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 47% опухолей предстательной железы, 25% нормальных предстательных желез и не определялся в других испытанных нормальных тканях. He is overexpressed in 47% of prostate tumors, 25% normal prostate and not detected in other normal tissues tested. hTGR1 обнаруживал 9,11-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. hTGR1 showed 9.11 fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 63% опухолей предстательной железы и не определялся в испытанных нормальных тканях, в том числе в нормальной предстательной железе. He is overexpressed in 63% of prostate tumors and not detected in normal tissues tested, including normal prostate. KIAA0295 обнаруживал 5,59-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. KIAA0295 showed 5.59 fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 47% опухолей предстательной железы, имел низкую - неопределяемую - экспрессию в испытанных нормальных тканях, в том числе в тканях нормальной предстательной железы. He is overexpressed in 47% of prostate tumors had low - undetectable - expression in normal tissues tested, including normal prostate tissues. Кислая фосфатаза предстательной железы обнаружила 9,14-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. Acid phosphatase prostate found 9.14-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Она сверхэкспрессировалась в 67% опухолей предстательной железы, 50% нормальных предстательных желез и не определялась в других испытанных нормальных тканях. It is overexpressed in 67% of prostate tumors, 50% normal prostate and not detected in other normal tissues tested. Трансглутаминаза обнаружила 14,84-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. Transglutaminase found 14.84-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Она сверхэкспрессировалась в 30% опухолей предстательной железы, 50% нормальных предстательных желез и не определялась в других испытанных нормальных тканях. It is over-expressed in 30% prostate tumors, 50% normal prostate and not detected in other normal tissues tested. Связывающий белок липопротеин высокой плотности (HDLBP) обнаружил 28,06-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. The binding protein of high density lipoprotein (HDLBP) found 28.06-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 97% опухолей предстательной железы, 75% нормальных предстательных желез и был неопределяемым в других испытанных нормальных тканях. It is overexpressed in 97% of prostate tumors, 75% normal prostate and was undetectable in other normal tissues tested. CGI-69 обнаружил 3,56-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. The CGI-69 found a 3.56-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он был слабо представленным геном, определялся в более 90% опухолей предстательной железы и в 75% нормальных предстательных желез. It was weakly shown gene was determined in 90% of prostate tumors and 75% normal prostate glands. Экспрессия указанного гена в нормальных тканях была очень низкой. Expression of the gene in normal tissues was very low. KIAA0122 обнаружил 4,24-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими нормальными тканями. KIAA0122 discovered 4.24 fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues. Он сверхэкспрессировался в 57% опухолей предстательной железы и был неопределяемым во всех испытанных нормальных тканях, в том числе в тканях нормальной предстательной железы. He is overexpressed in 57% of prostate tumors and was undetectable in all normal tissues tested, including normal prostate tissues. 19142.2 bangur обнаружил 23,25-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. 19142.2 bangur found 23.25-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 97% опухолей предстательной железы и 100% нормальных предстательных желез. It is overexpressed in 97% of prostate tumors and 100% of normal prostate glands. Он был неопределяемым в других испытанных нормальных тканях. He was undetectable in other normal tissues tested. 5566.1 Wang обнаружил 3,31-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. I found 5566.1 Wang 3.31 fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 97% опухолей предстательной железы, 75% нормальных предстательных желез и также сверхэкспрессировался в нормальном костном мозгу, поджелудочной железе и активированных РВМС. It is overexpressed in 97% of prostate tumors, 75% normal prostate and is also overexpressed in normal bone marrow, pancreas, and activated PBMC. Новый клон 23379 обнаружил 4,86-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. New clone 23379 found 4.86-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он был определяемым в 97% опухолей предстательной железы и 75% нормальных предстательных желез и является неопределяемым во всех других испытанных нормальных тканях. It was determined in 97% of prostate tumors and 75% of normal prostate and is undetectable in all other tested normal tissues. Новый клон 23399 обнаружил 4,09-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. New clone 23399 found 4.09-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он сверхэкспрессировался в 27% опухолей предстательной железы и был неопределяемым во всех испытанных нормальных тканях, в том числе в тканях нормальной предстательной железы. He is overexpressed in 27% of prostate tumors and was undetectable in all normal tissues tested, including normal prostate tissues. Новый клон 23320 обнаружил 3,15-кратную сверхэкспрессию в тканях предстательной железы в сравнении с другими испытанными нормальными тканями. New clone 23320 found 3.15-fold overexpression in prostate tissues as compared to other normal tissues tested. Он был определяемым во всех испытанных опухолях предстательной железы и 50% тканей нормальной предстательной железы. It was determined in all tested prostate tumors and 50% of normal prostate tissue. Он также экспрессировался в нормальных ободочной кишке и трахее. It is also expressed in normal colon and trachea. Другие нормальные ткани не экспрессировали указанный ген на высоком уровне. Other normal tissues do not express this gene at high level.

ПРИМЕР 14 EXAMPLE 14

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИГЕНОВ ОПУХОЛИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ПОМОЩИ ЭЛЕКТРОННОГО ВЫЧИТАНИЯ Identify antigenic prostate tumors by electronic SUBTRACTION

В указанном примере описано использование электронного способа вычитания для идентификации антигенов опухоли предстательной железы. In the above example describes the use of an electronic subtraction method for identification of prostate tumor antigens.

Потенциальные специфические для предстательной железы гены, присутствующие в базе данных EST человека GenBank, идентифицировали при помощи электронного вычитания (электронной субтракции) (подобно способу, описанному Vasmatizis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:300-304, 1998). Potential prostate-specific genes present in the GenBank human EST database data identified by electronic subtraction (subtraction e) (the method described Vasmatizis et al, Proc Natl Acad Sci USA 95:..... 300-304, 1998 ). Последовательности EST-клонов (43482), произведенные из различных библиотек предстательной железы, были получены из публичной базы данных EST человека банка генов. The sequences of EST-clones (43 482) derived from various prostate libraries were obtained from a public database of gene bank of human EST database. Каждую EST-последовательность предстательной железы использовали в качестве запрашиваемой последовательности при поиске в BLASTN (Национальном Центре информации по биотехнологии) в сравнении с базой данных EST человека. Each EST-sequence of the prostate were used as the query sequence when searching BLASTN (National Center for Biotechnology Information) database as compared to the human EST database. Все совпадения, рассматриваемые как идентичные (длина совпадающей последовательности >100 п.н., плотность идентифицированных совпадений на протяжении указанного района >70%), группировали (выравнивали для сравнения) вместе в кластер. All matches considered as identical (length of matching sequence> 100 bp, identified matches density over a specified area> 70%) were grouped (aligned for comparison) together in a cluster. Кластеры, содержащие более 200 EST, отбрасывали, так как они, возможно, представляли повторяющиеся элементы или экспрессируемые на высоком уровне гены, такие как гены для рибосомных белков. Clusters containing more than 200 EST, discarded, since they may represent repetitive elements or expressed at a high level genes such as genes for ribosomal proteins. Если два или более кластеров имели общие EST, то эти кластеры группировали вместе в “суперкластер”, что дало 4345 суперкластеров. If two or more clusters were common EST Unique visitors, then these clusters are grouped together in a "supercluster", which gave 4345 superclusters.

Записи для 479 библиотек кДНК человека, представленные в выданном банком генов списке, загружали для создания базы данных записей этих библиотек кДНК. Entries for the 479 libraries of human cDNA, presented in the authorized bank of genes that start to create a database of records of these cDNA libraries. Эти 479 библиотек кДНК группировали на три группы: Плюс (библиотеки нормальной предстательной железы и опухоли предстательной железы и линии клеток молочной железы, в которых была желательной экспрессия), Минус (библиотеки из других тканей взрослых индивидуумов, в которых экспрессия не была желательной), и Другие (фетальные ткани, ткани новорожденных, ткани, обнаруживаемые только у женщин, опухоли, не относящиеся к предстательной железе, и клеточные линии, не являющиеся клеточными линиями предстательной железы, в которых экспрессия рассмат These 479 cDNA libraries were grouped into three groups: Plus (libraries of normal prostate and prostate tumor and lines of breast cells in which has the desired expression), Minus (libraries from other tissues of adult individuals in which expression was not desirable), and other (fetal tissue, newborn tissue, tissue, is found only in women, tumors unrelated to the prostate gland, and cell lines, cell lines are not of the prostate, in which expression rassmat ривалась как неуместная). regarded as inappropriate). Суммирование этих групп библиотек представлено в таблице II. Summation of these library groups is presented in Table II.

Figure 00000003

Каждый суперкластер анализировали на EST в суперкластере. Each supercluster analyzed for EST in the super cluster. Отмечали источник ткани для каждого ЕSТ-клона и использовали для классификации суперкластеров на четыре группы: ЕSТ-клоны Типа 1, обнаруживаемые только в библиотеках группы Плюс; Mentioned tissue source of each EST clone and used to classify the superclusters into four groups: EST-clones of Type 1, is found only in libraries Group Plus; отсутствие определяемой экспрессии в библиотеках групп Минус и Другие; absence of expression determined in libraries Minus and Other group; ЕSТ-клоны Типа 2, обнаруживаемые только в библиотеках групп Плюс и Другие; EST clones Type 2, is found only in libraries and other groups Plus; отсутствие определяемой экспрессии в группе Минус; absence of expression determined in the Minus group; ЕSТ-клоны типа 3, обнаруживаемые в библиотеках групп Плюс, Минус и Другие, но экспрессия в группе Плюс является более высокой, чем в группах Минус или Другие; EST clones 3 type found in libraries groups Plus, Minus and Other, but expression in the Plus group is higher than in the Minus or Other groups; и ЕSТ-клоны Типа 4, обнаруживаемые в библиотеках групп Плюс, Минус и Другие, но экспрессия в группе Плюс является более высокой, чем экспрессия в группе Минус. and EST clones Type 4 found in libraries groups Plus, Minus and Other, but expression in the Plus group is higher than the expression in the Negative group. Указанный анализ идентифицировал 4345 кластеров молочной железы (таблица III). This analysis identified clusters 4345 Breast (Table III). Из этих кластеров 3172 ЕSТ-клона были заказаны из Research Genetics, Inc., и они были получены в виде замороженных исходных растворов в глицерине в 96-луночных планшетах. Of these clusters 3172 EST-clones were ordered from Research Genetics, Inc., and they were received as frozen glycerol stock solutions in 96-well plates.

Figure 00000004

Вставки ПЦР-амплифицировали с использованием амино-связанных ПЦР-праймеров для анализа микроматриц Synteni. PCR-amplified inserts using amino-linked PCR primers for the analysis of microarray Synteni. При получении более одного ПЦР-продукта для конкретного клона указанный ПЦР-продукт не использовали для анализа экспрессии. If more than one PCR product specific for said clone PCR product was not used for expression analysis. Всего 2528 клонов из способа электронного вычитания были подвергнуты анализу микроматриц для идентификации полученных электронным вычитанием клонов молочной железы, которые имели высокий уровень мРНК опухолей в сравнении с уровнем мРНК нормальной ткани. In total 2528 clones from the electronic subtraction method were analyzed microarrays to identify the received electronic subtraction breast clones that had high levels of mRNA in tumors compared to normal tissue mRNA level. Такие скрининги проводили с использованием микроматрицы Synteni (Palo Alto, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя (и по существу, как описано Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 и Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997). Such screenings are conducted using microarray Synteni (Palo Alto, CA) according to manufacturer's instructions (and essentially as described by Schena et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:..... 10614-10619, 1996 and Heller et al ., Proc Natl Acad Sci USA 94:.... 2150-2155, 1997). В этих анализах клоны выстраивали в виде рядов на микросхеме, которую затем зондировали флуоресцентными зондами, генерируемыми из кДНК нормальной и имеющей опухоль предстательной железы, а также различных других нормальных тканей. In these assays, clones were lined up in rows on a chip, which was then probed with fluorescent probes generated from normal and cDNA having a tumor of the prostate, as well as various other normal tissues. Эти слайды сканировали и измеряли интенсивность флуоресценции. These slides scanned and fluorescence intensity was measured.

Клоны с коэффициентом экспрессии более 3 (т.е. уровень кДНК в опухоли предстательной железы был по меньшей мере в три раза более высоким, чем уровень кДНК в нормальной предстательной железе) идентифицировали как последовательности, специфические для опухоли предстательной железы (таблица IV). Clones with an expression ratio greater than 3 (i.e. the cDNA level in prostate tumor was at least three times higher than the level of the cDNA in the normal prostate gland) was identified as a sequence specific prostate (Table IV) to the tumor. Последовательности этих клонов представлены в SEQ ID NO:401-453, а некоторые новые последовательности представлены в SEQ ID NO:407, 413, 416-419, 422, 426, 427 и 450. The sequences of these clones are shown in SEQ ID NO: 401-453, and some novel sequences are presented in SEQ ID NO: 407, 413, 416-419, 422, 426, 427 and 450.

Figure 00000005

Figure 00000006

Figure 00000007

ПРИМЕР 15 EXAMPLE 15

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИГЕНОВ ОПУХОЛИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА МИКРОМАТРИЦ ADDITIONAL identify antigenic prostate tumors by analyzing microarray

В этом примере описано выделение дополнительных полипептидов опухоли предстательной железы из библиотеки кДНК опухоли предстательной железы. This example describes the isolation of additional prostate tumor polypeptides from a prostate tumor cDNA library.

Экспрессионную библиотеку кДНК предстательной железы человека, описанную выше, подвергали скринингу с использованием анализа микроматриц для идентификации клонов, которые обнаруживают по меньшей мере трехкратную сверхэкспрессию в опухоли предстательной железы и/или в нормальной ткани предстательной железы в сравнении с не относящимися к предстательной железе нормальными тканями (за исключением яичка). An expression cDNA library of human prostate as described above were screened using the assay microarrays to identify clones that exhibit at least a three-fold overexpression in prostate tumor and / or normal prostate tissue as compared to outside the prostate normal tissues ( except testis). Были идентифицированы и секвенированы 142 клона. They have been identified and sequenced 142 clones. Некоторые из этих клонов представлены в SEQ ID NO:454-467. Some of these clones are shown in SEQ ID NO: 454-467. Из этих последовательностей SEQ ID NO:459-461 соответствуют новым генам. Of these sequences SEQ ID NO: 459-461 correspond to novel genes. Другие (SEQ ID NO:454-458 и 461-467) соответствуют известным последовательностям. Other (SEQ ID NO: 454-458 and 461-467) correspond to known sequences.

ПРИМЕР 16 EXAMPLE 16

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕНА Р710Р ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Additional characteristics antigen R710R PROSTATE

В этом примере описано полноразмерное клонирование Р710Р. This Example describes the full length cloning R710R.

Библиотеку кДНК предстательной железы, описанную выше, подвергали скринингу фрагментом Р710Р, описанным выше. Library prostate cDNA described above were screened R710R fragment described above. Один миллион колоний высевали на чашки с LB/ампициллином. One million colonies were plated on LB / ampicillin. Найлоновые мембранные фильтры использовали для подъема (лифтинга) этих колоний и затем кДНК, извлеченные этими фильтрами, денатурировали и сшивали с фильтрами облучением УФ-светом. Nylon membrane filters were used to lift (lifting) of these colonies and then cDNA was extracted by these filters were denatured and crosslinked to the filters by UV light irradiation. Фрагмент Р710Р радиоактивно метили и использовали для гибридизации с фильтрами. R710R fragment was radiolabeled and used to hybridize with the filters. Положительные кДНК-клоны отбирали и их кДНК извлекали и секвенировали при помощи автоматического ABI-секвенатора. Positive cDNA clones were selected and their cDNAs recovered and sequenced using automatic ABI-sequencer. Были получены четыре последовательности и они представлены в SEQ ID NO:468-471. Four sequences were obtained and are presented in SEQ ID NO: 468-471.

На основании вышеописанного должно быть понятно, что хотя с целью иллюстрации здесь были описаны характерные варианты данного изобретения, различные модификации могут быть произведены без отхода от идеи и объема данного изобретения. Based on the foregoing it should be understood that although for illustration purposes described herein specific embodiments of the invention, various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. Таким образом, данное изобретение не ограничивается ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения. Thus, the present invention is not limited except by the appended claims.

Claims (2)

  1. 1. Полинуклеотид, выделенный из опухолевой ткани предстательной железы, кодирующий опухолевые полипептиды предстательной железы и содержащий последовательность SEQ ID NO:225 или SEQ ID NO:326. 1. A polynucleotide isolated from the tumor tissue prostate tumor polypeptides encoding prostate and comprising the sequence SEQ ID NO: 225 or SEQ ID NO: 326.
  2. 2. Выделенный опухолевый полипептид предстательной железы, содержащий последовательность SEQ ID NO:327. 2. An isolated prostate tumor polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 327.
RU2001104349A 1997-02-25 1999-07-14 Tumor polypeptide isolated from prostate and polynucleotide encoding thereof RU2234942C2 (en)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09115453 US6657056B2 (en) 1997-02-25 1998-07-14 Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use
US09/116,134 1998-07-14
US09/115,453 1998-07-14
US09/159,822 1998-09-23
US09/159,812 1998-09-23
US09/232,880 1999-01-15
US09232149 US6465611B1 (en) 1997-02-25 1999-01-15 Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use
US09/232,149 1999-01-15
US09/288,946 1999-04-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2001104349A true RU2001104349A (en) 2003-02-20
RU2234942C2 true RU2234942C2 (en) 2004-08-27

Family

ID=33422454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2001104349A RU2234942C2 (en) 1997-02-25 1999-07-14 Tumor polypeptide isolated from prostate and polynucleotide encoding thereof

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2234942C2 (en)

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2460075C2 (en) * 2006-12-19 2012-08-27 Дзе Юниверсити Оф Суррей Cancer biomarkers
RU2478400C2 (en) * 2006-12-27 2013-04-10 Эмори Юниверсити Compositions and methods of treating infections and tumours
RU2508125C2 (en) * 2007-10-09 2014-02-27 Куревак Гмбх Composition for treating prostate carcinoma (pc)
RU2519089C2 (en) * 2008-08-05 2014-06-10 Торэй Индастриз, Инк. Method for detection of malignant tumours
US8828398B2 (en) 2010-02-04 2014-09-09 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
US8911740B2 (en) 2010-02-04 2014-12-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
US8937160B2 (en) 2010-02-04 2015-01-20 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
US9115200B2 (en) 2010-02-04 2015-08-25 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating cancer using a monoclonal antibody having immunological reactivity with CAPRIN-1
US9175074B2 (en) 2011-08-04 2015-11-03 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9180187B2 (en) 2010-02-04 2015-11-10 Toray Industries, Inc. Medicament for treating and/or preventing cancer
US9181334B2 (en) 2011-08-04 2015-11-10 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9181348B2 (en) 2011-08-04 2015-11-10 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9260513B2 (en) 2012-02-21 2016-02-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
US9266958B2 (en) 2012-02-21 2016-02-23 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
US9273128B2 (en) 2011-08-04 2016-03-01 Toray Industries, Inc Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9273130B2 (en) 2012-02-21 2016-03-01 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
US9409993B2 (en) 2011-08-04 2016-08-09 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of pancreatic cancer
US9416193B2 (en) 2012-03-30 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of liver cancer
US9416192B2 (en) 2008-08-05 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancers
US9428581B2 (en) 2012-03-30 2016-08-30 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of gallbladder cancer
US9573993B2 (en) 2012-02-21 2017-02-21 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment of cancer comprising an anti-CAPRIN-1 peptide antibody
US9753038B2 (en) 2012-07-19 2017-09-05 Toray Industries, Inc. Method for detecting cancer via measurement of caprin-1 expression level
US9772332B2 (en) 2012-07-19 2017-09-26 Toray Industries, Inc. Method for detecting CAPRIN-1 in a biological sample
US9796775B2 (en) 2011-08-04 2017-10-24 Toray Industries, Inc. Method for detecting pancreatic cancer
US9862774B2 (en) 2013-08-09 2018-01-09 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Биохимия гормонов и гормональная регуляция. Под ред. Н.А.Юдаева. - М., 1976, с.76-95. *

Cited By (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2460075C2 (en) * 2006-12-19 2012-08-27 Дзе Юниверсити Оф Суррей Cancer biomarkers
RU2478400C2 (en) * 2006-12-27 2013-04-10 Эмори Юниверсити Compositions and methods of treating infections and tumours
RU2508125C2 (en) * 2007-10-09 2014-02-27 Куревак Гмбх Composition for treating prostate carcinoma (pc)
RU2519089C2 (en) * 2008-08-05 2014-06-10 Торэй Индастриз, Инк. Method for detection of malignant tumours
US9982059B2 (en) 2008-08-05 2018-05-29 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancers
US9416192B2 (en) 2008-08-05 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancers
RU2671497C2 (en) * 2008-08-05 2018-11-01 Торэй Индастриз, Инк. Method for detecting malignant tumours
US9416191B2 (en) 2010-02-04 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
US8937160B2 (en) 2010-02-04 2015-01-20 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
US9180187B2 (en) 2010-02-04 2015-11-10 Toray Industries, Inc. Medicament for treating and/or preventing cancer
US9115200B2 (en) 2010-02-04 2015-08-25 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating cancer using a monoclonal antibody having immunological reactivity with CAPRIN-1
US8828398B2 (en) 2010-02-04 2014-09-09 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
US8911740B2 (en) 2010-02-04 2014-12-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
US9181334B2 (en) 2011-08-04 2015-11-10 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9796775B2 (en) 2011-08-04 2017-10-24 Toray Industries, Inc. Method for detecting pancreatic cancer
US9175074B2 (en) 2011-08-04 2015-11-03 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9409993B2 (en) 2011-08-04 2016-08-09 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of pancreatic cancer
US9181348B2 (en) 2011-08-04 2015-11-10 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9273128B2 (en) 2011-08-04 2016-03-01 Toray Industries, Inc Pharmaceutical composition for treatment and/or prophylaxis of cancer
US9273130B2 (en) 2012-02-21 2016-03-01 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
US9260513B2 (en) 2012-02-21 2016-02-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
US9573993B2 (en) 2012-02-21 2017-02-21 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment of cancer comprising an anti-CAPRIN-1 peptide antibody
US9266958B2 (en) 2012-02-21 2016-02-23 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
US9428581B2 (en) 2012-03-30 2016-08-30 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of gallbladder cancer
US9416193B2 (en) 2012-03-30 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of liver cancer
US9753038B2 (en) 2012-07-19 2017-09-05 Toray Industries, Inc. Method for detecting cancer via measurement of caprin-1 expression level
US9772332B2 (en) 2012-07-19 2017-09-26 Toray Industries, Inc. Method for detecting CAPRIN-1 in a biological sample
US9862774B2 (en) 2013-08-09 2018-01-09 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5922836A (en) Mammaglobin antigens
US6306640B1 (en) Melanoma antigenic peptides
US20030072767A1 (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US20020172952A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20030185830A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US20030087818A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20030118599A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20030157089A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US20030039635A1 (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US20020192763A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US6800746B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US20020132237A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US7311914B2 (en) MAGE-A4 antigenic peptides and uses thereof
US6962980B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US7258860B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2001000828A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6620922B1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US7579160B2 (en) Methods for the detection of cervical cancer
WO2002014503A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of her-2/neu-associated malignancies
WO2000018795A2 (en) Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
US20030166064A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
WO2001072295A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2002074237A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of kidney cancer
US6387697B1 (en) Compositions for treatment and diagnosis of breast cancer and methods for their use
WO2002089747A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20090715