RU2228530C2 - Диагностический анализ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к анализу на основе нуклеиновых кислот для обнаружения вируса гепатита В. Сущность изобретения состоит в проведении одностадийного амплификационного анализа для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот вируса гепатита В, идентификации варианта вируса гепатита и нуклеотидных последовательностей, применимых в качестве иммунологического маркера и/или для генерирования иммуноглобулинов для применения в диагностике и/или терапии. Техническим результатом является разработка одностадийного амплификационного анализа нуклеиновых кислот для скрининга нуклеотидных последовательностей вируса гепатита В и идентификации указанных последовательностей. 6 с. и 5 з.п.ф-лы, 2 ил., 2 табл.

Description

Область изобретения

Изобретение относится в общем к анализу на основе нуклеиновых кислот для обнаружения присутствия вирусного патогена, в частности вируса гепатита В. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает одностадийный амплификационный анализ для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот вируса гепатита В. Анализ данного изобретения является легко адаптируемым для автоматизации и делает возможной быструю пропускную способность тестирования подлежащих тестированию проб. Данное изобретение обеспечивает также агенты, применимые для проведения анализа детектирования на основе нуклеиновых кислот на вирус гепатита В, и набор, содержащий эти агенты.

Предпосылки изобретения

Библиографические подробности публикаций, цитируемых в виде цифр в описании, приводятся в конце описания.

Вирус гепатита В (далее называемый “HBV”) может вызывать изнуряющие патологические состояния и может приводить к острой печеночной недостаточности, кровотечению вследствие цирроза и первичному раку печени. HBV инфицирует миллионы индивидуумов ежегодно и способствует по меньшей мере миллиону смертей каждый год.

HBV представляет собой ДНК-вирус, который реплицируется через промежуточные РНК и использует обратную транскрипцию в его репликационной стратегии. Геном HBV является геномом сложной природы, имея частично двухцепочечную структуру ДНК с перекрывающимися открытыми рамками считывания, кодирующими различные вирусные белки.

Несмотря на доступность HBV-вакцины, сотни миллионов индивидуумов являются носителями этого вируса. HBV обычно идентифицируют детектированием поверхностного антигена HBV (HBsAg), внутреннего (корового) антигена вируса (НВсАg) и антител к НВеАg (анти-НВеАg).

После инфекции HBV или вакцинации HBsAg появляются антитела к HBsAg (анти-HBs). Это было основанием для иммунного детектирования HBsAg. В этой системе детектирования скринингу подвергают HBsAg или анти-HBs. Этот анализ использовали для скрининга крови перед переливанием крови (гемотрансфузией) в случае HBV, для детектирования связанного с HBV заболевания печени у пациентов с острым и хроническим гепатитом, циррозом печени и первичным раком печени и скрининга на носителей HBV, например, в случае реципиентов и доноров при трансплантации.

HBsAg содержит антигенный район, называемый детерминантой “а” (1). Детерминанта “а” является комплексной, конформационной и зависит от образования дисульфидной связи среди высококонсервативных остатков цистеина. Считалось, что генетическая изменчивость, приводящая к изменениям в детерминанте “а”, участвует в образовании мутантов HBV, которые ускользают от иммунологической реакции, генерируемой общепринятыми вакцинами (2-6). Одной особенно распространенной мутацией является замена глицина (G) на аргинин (R) в положении аминокислоты 145 (G145F) HBsAg. Эта мутация влияет на район эпитопа “а”.

Все увеличивающаяся надежда на химическое и иммунологическое вмешательство в лечении или предупреждении инфекции HBV приводит к более селективному давлению в отношении появления вариантов HBV, которые являются резистентными к подобной интервенционной терапии. Благодаря перекрывающейся геномной структуре HBV может происходить прямая или опосредованная селекция (отбор) вариантов HBV в результате использования химических агентов или вакцин.

Таким образом, общепринятые анализы на основе антител для HBsAg могут приводить к ложноотрицательным результатам. Это может иметь очень серьезные последствия в отношении борьбы с распространением этого заболевания и лечения пациентов.

В исследовании, приведшем к данному изобретению, авторы изобретения искали альтернативный анализ на HBV. В соответствии с данным изобретением авторы изобретения разработали одностадийный амплификационный анализ нуклеиновых кислот для скрининга последовательностей нуклеиновых кислот HBV из HBV, которые могут обнаруживать или могут не обнаруживать иммунодетектируемые вирусные маркеры. Анализ на основе нуклеиновых кислот данного изобретения обеспечивает чувствительный анализ на HBV-агенты, в частности, когда такие агенты не могут быть детектированы общепринятыми иммунологическими диагностическими тестами. Кроме того, анализ данного изобретения позволяет получать специфический иммуноглобулин (например, IgG) и вакцины на основе консервативных районов среди вариантов HBV.

Сущность изобретения

Во всем данном описании, если контекст не требует иного значения, слово “содержат” или его вариации, такие как “содержит” или “содержащий”, следует понимать как включение указанного элемента, или целого, или группы элементов, или целых, но не как исключение любого другого элемента, или целого, или группы элементов, или целых.

Один аспект данного изобретения обеспечивает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ включает в себя подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ предусматривает подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и где эти праймеры выбраны для гибридизации с районами, соответствующими консервативной нуклеотидной последовательности или фланкирующими консервативную нуклеотидную последовательность в нуклеотидной последовательности или части нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Еще один аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает необязательное подвергание этой пробы условиям обратной транскрипции для получения одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК, подвергание этой пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных молекул ДНК, соответствующих указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью ДНК указанной последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК.

Еще один аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает необязательное подвергание этой пробы условиям обратной транскрипции для получения одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК, подвергание этой пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных молекул ДНК, соответствующих указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью ДНК указанной последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, причем один из указанных праймеров помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, а другой из указанных праймеров помечен улавливаемой частью молекулы, подвергание указанной пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации продукта, содержащего комплементарные продукты удлинения, имеющие репортерную молекулу, способную обеспечивать идентифицируемый сигнал, на одной цепи и улавливаемую твердым носителем часть молекулы на другой цепи, иммобилизацию продукта амплификации через его улавливаемую часть молекулы и затем скрининг на детектируемый сигнал, причем присутствие этого сигнала свидетельствует о присутствии продукта амплификации и, следовательно, происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК.

Еще один аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает введение указанной пробы в реакционный сосуд, содержащий праймер, иммобилизованный на твердом носителе, и второй праймер в фазе раствора, причем оба праймера способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью на комплементарных отдельных цепях происходящей из HBV ДНК в районе, находящемся в консервативном районе, вблизи него или смежно с ним на геноме HBV, и причем праймер фазы раствора помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, подвергание этого реакционного сосуда условиям, облегчающим амплификацию, и затем детектирование присутствия идентифицируемого сигнала, причем присутствие указанного сигнала свидетельствует о присутствии происходящей из HBV ДНК.

Еще один аспект данного изобретения относится к способу обнаружения одной или нескольких происходящих из HBV последовательностей-мишеней ДНК из одинаковых или различных штаммов или вариантов HBV, причем указанный способ предусматривает контактирование пробы, предположительно содержащей происходящую из HBV ДНК в одноцепочечной форме, с двумя или более праймерами, иммобилизованными по отдельности или в виде ряда на твердом носителе, в реакционном сосуде, причем реакционный сосуд дополнительно содержит праймеры фазы раствора, имеющие партнер, иммобилизованный на твердом носителе, причем этот иммобилизованный праймер и его праймер-партнер фазы раствора способны амплифицировать в условиях амплификации район происходящей из HBV ДНК, причем праймер фазы раствора несет репортерную молекулу, способную давать идентифицируемый сигнал, так что присутствие сигнала в определенном местоположении на твердом носителе позволяет идентифицировать конкретный изолят или вариант HBV.

Другой аспект данного изобретения обеспечивает ряд из двух или более олигонуклеотидных праймеров, иммобилизованных на твердом носителе, причем указанные праймеры способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью из происходящей из HBV ДНК.

Еще один аспект данного изобретения обеспечивает применение матрицы, содержащей ряд (массив) олигонуклеотидов, определяемых формулой a₁a₂...a_n, имеющих координаты на этой матрице (x₁y₁), (х₂y₂)...(х_ny_n), где а₁a₂...a_n обозначают одинаковые или различные олигонуклеотиды, всего n олигонуклеотидов, и каждый олигонуклеотид определяется координатами координатной сетки (x₁y₁), (х₂y₂)...(x_ny_n), и где эти олигонуклеотиды имеют партнеров амплификации, определяемых b₁b₂...b_n, так что олигонуклеотиды a₁b₁, а₂b₂...a_nb_n способны гибридизоваться с комплементарными цепями происходящей из HBV ДНК, причем интронная ДНК содержит последовательность нуклеотидов, консервативную между двумя или более вариантами HBV, такими как HBsAg-варианты, причем указанная матрица применима для детектирования конкретных HBV-агентов, определяемых тем, что они несут консервативный район амплификации указанной происходящей из HBV ДНК.

Можно отметить, что согласно настоящему изобретению детектируется любой вариант поверхностного антигена вируса гепатита В (таких как глицин 145 аргинин и глицин 130 аспартат мутанты) из существующих диких типов путем технологии изолирования и детектирования этих двух мутантных цепей, которые не могут быть детектированы стандартными технологиями.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 является схематическим представлением, показывающим структурную организацию поверхностного антигена HBV. (А) Локализация основной гидрофильной петли, охватывающей консервативную детерминанту “а” (заимствованную из Chen et al. (7). Указан размер полноразмерного HBsAg в аминокислотных остатках (1-400). Положения рrеS1 (1-118), preS2 (119-174) и основного HBsAg (175-400) показаны ниже этого блока. Указано также положение основной гидрофильной петли относительно полноразмерного HBsAg. Соответствующее положение основной гидрофильной петли в основном HBsAg (SHBsAg) является положением от аминокислоты 100 до аминокислоты 160, а консервативной детерминанаты “а” от 124 до 147 в SHBsAg. (В) Геномная локализация района, кодирующего SHBsAg Положения 5’- и 3’-конца кодирующего района показаны ниже этого блока (nt 156 и 835 генома HBV соответственно, причем положение 1 определяется как первый нуклеотид А EcoRI-сайта - GAATTC (<400>3) HBV дикого типа с номером доступа банка генов (GenBank) Z35717). Положения праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении (<400>1 и <400>2), также указаны ниже блока (начинающиеся от nt 456 и 689 генома HBV соответственно). Размер ПЦР-амплифицированного ДНК-фрагмента с использованием праймерных олигонуклеотидов данного изобретения (<400>1 и <400>2) составляет 233 пар оснований (п.н.), как указано под блоком.

Фиг.2 является фотографическим представлением, показывающим распределение при электрофорезе ПЦР-амплифицированного фрагмента HBV из тест-проб, отрицательных в отношении HBsAg при применении иммунологических диагностических наборов, но положительных в отношении анти-НВс и анти-HBs при использовании праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении (<400>1 и <400>2). В дорожке 4 показаны положения миграции маркеров молекулярного веса (100 п.н.-лестница, MBI Fermentas). Дорожка 1 соответствует первой тест-пробе в таблице 1; дорожка 2 соответствует второй тест-пробе в таблице 1. Дорожки 6 и 9 соответствуют третьей и четвертой тест-пробам в таблице 1 соответственно. Не обнаружены продукты амплификации в дорожках 3, 5, 7 и 8, которые представляют тест-пробы, обнаруживающие одинаковые вирусные маркеры (отрицательные в отношении HBsAg, положительные в отношении анти-НВс и анти-HBs).

Подробное описание предпочтительных вариантов

Данное изобретение основано отчасти на идентификации нуклеотидных последовательностей, которые являются консервативными среди вариантов HBV, и их применении для получения праймеров для основанных на амплификации диагностических анализов на HBV.

Некоторые термины определены ниже для внесения ясности.

“Смесь для амплификации” обозначает водный раствор, содержащий различные реагенты, требующиеся для амплификации происходящей из вируса последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Они включают в себя фермент, водные буферы, соли, нуклеиновую кислоту-мишень и дезоксинуклеозидтрифосфаты.

“Система амплификации” обозначает любой способ in vitro для увеличения числа копий последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Термин “реагенты амплификации” относится к различным буферам, ферментам, праймерам и дезоксинуклеозидтрифосфатам, требующимся для амплификации.

Термин “нуклеиновая кислота” относится к рибонуклеотидному или дезоксирибонуклеотидному полимеру либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме.

Термин “полимераза” относится к ферментам, способным катализировать синтез ДНК из нуклеозидтрифосфатных предшественников. В ПЦР-амплификации данного изобретения полимеразы являются предпочтительно зависимыми от матрицы, термостабильными и обычно присоединяют нуклеотиды к 3’-концу удлиняемого ДНК-полимера.

Термин “олигонуклеотид” относится к молекуле, состоящей из двух или нескольких рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов.

“Праймер” обозначает олигонуклеотид, природный или синтетический, способный действовать в качестве точки инициации синтеза ДНК в условиях, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который комплементарен цепи-мишени нуклеиновой кислоты. Эти условия включают в себя четыре различных нуклеозидтрифосфата и полимеразу в подходящем буфере и при подходящей температуре. Праймер является предпочтительно одноцепочечным олигодезоксинуклеотидом. Подходящая длина праймера зависит от цели и условий применения этого праймера (в том числе консервативности последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, условий ПЦР-циклирования и состава праймера).

Данное изобретение обеспечивает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ включает в себя подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться на их 3’-концах с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

В одном варианте последовательность-мишень соответствует району на геноме HBV, который является консервативным среди вариантов HBV и, в частности, вариантов HBV, имеющих измененные HBsAg. Измененный HBsAg может содержать замену, делецию и/или присоединение одной или многочисленных аминокислот, что происходит в результате замены, делеции и/или присоединения одного или многочисленных нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg. Предполагается, что консервативный район в геноме HBV и, в частности, в нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg, остается относительно стабильным несмотря на иммунологические изменения HBsAg. Таким образом, предполагается согласно данному изобретению, что варианты HBV, которые могут уже не детектироваться в иммунологическом анализе на HBsAg, все еще будут детектируемыми через консервативный район в гене HBsAg. Однако данное изобретение распространяется на применение рассматриваемого способа для идентификации вариабельных районов генома HBV, таких как районы, приводящие к модифицированным или новым эпитопам (например, на HBsAg).

Ссылка на варианты HBsAg включает в себя также варианты в других перекрывающихся генах, таких как ген ДНК-полимеразы.

Этот и другие аспекты данного изобретения не должны ограничиваться термином “ген”, который может называться такими терминами, как “молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая”, “нуклеотидная последовательность, кодирующая” и “генетическая последовательность, кодирующая”.

Термин “ген” используется в самом широком смысле и включает в себя кДНК, соответствующую экзонам гена. Таким образом, должно быть понятно, что ссылка здесь на “ген” включает в себя

(i) классический геномный ген, состоящий из регуляторных последовательностей транскрипции и/или трансляции и/или кодирующего района и/или нетранслируемых последовательностей (т.е. интронов, 5’- и 3’-нетранслируемых последовательностей); или

(ii) мРНК или кДНК, соответствующие кодирующим районам (т.е. экзонам) и 5’-и 3’-нетранслируемые последовательности данного гена.

Термин “ген” используется также для описания синтетических или слитых молекул, кодирующих весь продукт экспрессии или часть продукта экспрессии. В конкретных вариантах термины “молекула нуклеиновой кислоты” и “ген” могут быть использованы взаимозаменяемо.

Таким образом, другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ предусматривает подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и где эти праймеры выбраны для гибридизации с районами, соответствующими консервативной нуклеотидной последовательности или фланкирующими консервативную нуклеотидную последовательность в нуклеотидной последовательности или части нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Проба представляет собой обычно, но не исключительно, биологическую пробу, содержащую ткань или экстракт ткани, жидкость, в том числе кровь или экскрецию, или любой другой материал, который потенциально содержит частицы HBV или ДНК, мРНК или репликативные промежуточные РНК HBV. Таким образом, первая стадия могла бы обычно включать в себя выделение пробы из субъекта-млекопитающего, в том числе в предпочтительном варианте, субъекта-человека. Проба может быть также пробой, относящейся к окружающей среде, или пробой из потенциального источника загрязнения HBV.

Хотя данное изобретение относится, в частности, к “ускользающим” (от иммунологического надзора) вариантам HBV, т.е. вариантам, с которыми по существу уже не взаимодействуют антитела к по меньшей мере одной форме HBsAg, данное изобретение дополнительно распространяется на любой район генома HBV, который является консервативным среди вариантов HBV, в частности клинически релевантных вариантов HBV, и который служит в качестве применимой последовательности-мишени. Конкретно применимыми районами, рассматриваемыми на геноме HBV, являются районы, которые кодируют новые эпитопы или HBsAg. Такие районы применимы для генерирования рекомбинантных пептидов для диагностических целей.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает средство для обнаружения HBV путем детектирования происходящих из HBV последовательностей нуклеиновых кислот. “Происходящая из HBV” последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя сам геном HBV, его одноцепочечные ДНК-формы, репликативные промежуточные РНК, а также одно- или двухцепочечные молекулы кДНК, полученные с использованием обратной транскриптазы. Что касается последних, мРНК-транскрипт из происходящей из HBV нуклеотидной последовательности может быть подвергнут обратной транскрипции с образованием комплементарной цепи ДНК. Последняя цепь и/или ее ДНК-комплемент может быть затем подвергнут реакции амплификации. Детектирование репликативных промежуточных последовательностей РНК и/или кДНК, соответствующих происходящей из HBV мРНК, также является указанием на активную репликацию вируса.

Любая форма реакции амплификации может быть использована в практике данного изобретения, в том числе, но не только, полимеразная цепная реакция (ПЦР), реакция лигирования цепи, амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты, амплификация на основе репликазы Q, способ вытеснения цепи, циклически повторяющаяся амплификация и рециркулирующее аллель-специфическое удлинение праймера. Однако предпочтительной является ПЦР.

Таким образом, другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает необязательное подвергание этой пробы условиям обратной транскрипции для получения одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК, подвергание этой пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных молекул ДНК, соответствующих указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью ДНК указанной последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК.

В особенно предпочтительном варианте праймеры выбирают из последовательности, находящейся внутри нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg. Наиболее предпочтительно, праймеры представляют собой <400>1 [смысловой праймер] и <400>2 [антисмысловой праймер]. Данное изобретение распространяется также на олигонуклеотидные праймеры, имеющие по меньшей мере приблизительно 70%-ное сходство с <400>1 или <400>2, а также праймеры, способные гибридизоваться с <400>1 или <400>2 или их комплементами в условиях низкой строгости.

Термин “сходство” в применении здесь включает в себя точную идентичность между сравниваемыми последовательностями на нуклеотидном уровне. Если имеется неидентичность на нуклеотидном уровне, “сходство” включает в себя различия между последовательностями, которые приводят к отличающимся аминокислотам, которые тем не менее являются родственными друг другу на структурном, функциональном, биохимическом и/или конформационном уровнях. В особенно предпочтительном варианте сравнения нуклеотидных последовательностей проводят на уровне идентичности, а не сходства.

Термины, используемые для описания родства между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами, включают в себя “ссылочную последовательность”, “окно сравнения”, “сходство последовательности”, “идентичность последовательности”, “процент сходства последовательностей”, “процент идентичности последовательностей”, “по существу одинаковые” и “существенная идентичность”. “Ссылочной последовательностью” является последовательность длиной по меньшей мере 12, но часто 15-18 и часто по меньшей мере 25 или выше, например 30 мономерных единиц, в том числе нуклеотидов и аминокислотных остатков. Поскольку каждый из двух полинуклеотидов может содержать (1) последовательность (т.е. только часть полной полинуклеотидной последовательности), которая является одинаковой между этими двумя полинуклеотидами, и (2) последовательность, которая отличается между этими двумя полинуклеотидами, сравнения последовательности между двумя или несколькими полинуклеотидами обычно проводят посредством сравнения последовательностей этих двух полинуклеотидов на протяжении “окна сравнения” для идентификации и сравнения локальных районов сходства последовательностей. “Окно сравнения” представляет собой концептуальный сегмент обычно из 12 непрерывных остатков, который сравнивают со ссылочной последовательностью. Окно сравнения может содержать присоединения или делеции (т.е. гэпы) приблизительно 20% или менее в сравнении со ссылочной последовательностью (которая не содержит присоединений или делеции) для оптимального сопоставления этих двух последовательностей. Оптимальное сопоставление последовательностей для выстраивания окна сравнения может проводиться посредством компьютеризованных обеспечении алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wl, USA) или путем внимательного обследования и наилучшего сопоставления (т.е. с получением наивысшей процентной гомологии на протяжении окна сравнения), получаемого любым из различных выбранных способов. Можно сослаться на семейство программ BLAST, как описано, например, Altschul et al. (8). Подробное обсуждение анализа последовательности может быть найдено в Unit 19.3 Ausubel et al. (9).

Термины “сходство последовательностей” и “идентичность последовательностей” в применении здесь относятся к степени, в которой последовательности являются идентичными или функционально или структурно одинаковыми на основе сравнения нуклеотида за нуклеотидом на протяжении окна сравнения. Так, “процент идентичности последовательностей”, например, рассчитывают посредством сравнения двух оптимально сопоставленных последовательностей на протяжении окна сравнения, определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, А, Т, С, G, I) находится в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Для целей данного изобретения “идентичность последовательностей” следует понимать как “процент совпадений”, рассчитанный при помощи компьютерной программы DNASIS (Версия 2.5 для Windows; доступная из Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA) с использованием стандартных значений по умолчанию, как указано в руководстве, прилагаемом к этому программному обеспечению. Подобные замечания относятся и к сходству последовательностей.

Ссылка здесь на низкую строгость включает в себя и требует от по меньшей мере приблизительно 0 до по меньшей мере приблизительно 15% об./об. формамида и от по меньшей мере приблизительно 1 М до по меньшей мере приблизительно 2 М соли для гибридизации и от по меньшей мере приблизительно 1 М до по меньшей мере приблизительно 2 М соли для условий промывки. Обычно низкая строгость включает в себя температуру от приблизительно 25-30°С до приблизительно 42°С. Температура может быть изменена и могут быть использованы более высокие температуры для вытеснения формамида и/или для получения альтернативных условий строгости. Альтернативные условия строгости могут применяться, если необходимо, например, умеренная строгость, которая включает в себя и требует от по меньшей мере приблизительно 16% об./об. до по меньшей мере приблизительно 30% об./об. формамида и от по меньшей мере приблизительно 0,5 М до по меньшей мере приблизительно 0,9 М соли для гибридизации и от по меньшей мере приблизительно 0,5 М до по меньшей мере приблизительно 0,9 М соли для условий промывки, или высокая строгость, которая включает в себя и требует от по меньшей мере приблизительно 31% об./об. до по меньшей мере приблизительно 50% об./об. формамида и от по меньшей мере 0,01 М до по меньшей мере приблизительно 0,15 М соли для гибридизации и от по меньшей мере приблизительно 0,01 М до по меньшей мере приблизительно 0,15 М соли для условий промывки. Обычно промывку проводят Т_m=69,3+0,41 (G+C)% (10). Однако Т_m, дуплексной ДНК уменьшается на 1°С с каждым увеличением на 1% числа несовпадающих пар оснований (11). Формамид является необязательным в этих условиях гибридизации. Таким образом, особенно предпочтительные уровни строгости определяются следующим образом: низкая строгость представляет собой 6 × SSC-буфер, 0,1% м./об. ДСН при 25-42°С; умеренная строгость представляет собой 2 × SSC-буфер, 0,1% м./об. ДСН при температуре в диапазоне 20°С-65°С; высокая строгость представляет собой 0,1 × SSC-буфер, 0,1% м./об. ДСН при температуре по меньшей мере 65°С.

Ссылка здесь на “праймер” не должна пониматься как какое-либо ограничение в отношении структуры, размера или функции. Праймер может быть использован в качестве молекулы для амплификации или может быть использован в качестве зонда для целей гибридизации. Предпочтительной формой этой молекулы является форма праймера нуклеиновой кислоты для амплификации.

Ссылка здесь на “праймер нуклеиновой кислоты” включает в себя ссылку на последовательность дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, содержащих по меньшей мере 3 нуклеотида. Обычно праймер нуклеиновой кислоты содержит от приблизительно 3 до приблизительно 100 нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов и даже более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 25 нуклеотидов. Праймер, имеющий менее 50 нуклеотидов, может здесь называться “олигонуклеотидным праймером”. Праймеры данного изобретения могут быть получены синтетически, например, ступенчатым добавлением нуклеотидов или могут быть фрагментами, частями, участками или продуктами удлинения других молекул нуклеиновых кислот. Термин “праймер” используют в его наиболее обычном смысле для любой длины нуклеотидов, которая при применении для целей амплификации может обеспечить свободную 3’-гидроксильную группу для инициации синтеза ДНК ДНК-полимеразой. Синтез ДНК приводит к удлинению праймера с образованием продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты, с которой этот праймер гибридизовался.

Удлинение гибридизованного праймера для образования продукта удлинения называют здесь термином “амплификация”. Амплификация происходит обычно в виде циклов денатурации с последующими гибридизацией и удлинением праймера. Данное изобретение включает в себя от приблизительно 1 цикла до приблизительно 120 циклов, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 70 циклов и даже более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 40 циклов, в том числе 10, 15, 20, 25 и 30 циклов.

Продукт амплификации (также называемый амплимером) может быть обнаружен любым из подходящих способов. В одном варианте продукты амплификации разделяют при помощи электрофореза и затем визуализируют с использованием, например, ультрафиолетового света после окрашивания бромидом этидия. Альтернативно, продукты амплификации могут быть разделены различными формами хроматографии, такими как ВЖХ, или спектроскопией, такой как MALDI-TOF, и масс-спектрометрией. Другая альтернатива использует праймеры, помеченные репортерной молекулой. Что касается последней, один из праймеров может быть помечен репортерной молекулой, тогда как другой праймер может быть помечен улавливающей частью молекулы для прикрепления амплимеров к твердому носителю, которые затем идентифицируют через репортерный сигнал. Этот вариант может быть применен с набором праймеров, используемых для амплификации, или со вторым, “вмонтированным” набором праймеров. Однако в предпочтительном варианте используют только один набор праймеров, так что этот анализ является одностадийным анализом амплификации.

Таким образом, другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает необязательное подвергание этой пробы условиям обратной транскрипции для получения одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК, подвергание этой пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных молекул ДНК, соответствующих указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью ДНК указанной последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, причем один из указанных праймеров помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, а другой из указанных праймеров помечен улавливаемой частью молекулы, подвергание указанной пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации продукта, содержащего комплементарные продукты удлинения, имеющие репортерную молекулу, способную обеспечивать идентифицируемый сигнал, на одной цепи и улавливаемую твердым носителем часть молекулы на другой цепи, иммобилизацию продукта амплификации через его улавливаемую часть молекулы и затем скрининг на детектируемый сигнал, причем присутствие этого сигнала свидетельствует о присутствии продукта амплификации и, следовательно, происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК.

Многочисленные вариации вышеуказанного анализа будут очевидными квалифицированному специалисту. Например, реакция амплификации может иметь место в сосуде или в лунке микротитрационного планшета, причем молекула улавливания иммобилизована на стенках сосуда или лунки. Молекулой улавливания может быть, например, праймер, способный гибридизоваться и улавливать нуклеотидную последовательность, находящуюся внутри амплимера, или нуклеотидную последовательность, комплементарную молекуле улавливания на улавливаемой части молекулы одного из праймеров. Альтернативно, молекула улавливания может быть ДНК-связывающим белком, способным специфически узнавать улавливаемую часть молекулы одного из праймеров. Молекула улавливания может также участвовать в реакции амплификации.

Молекула улавливания может быть иммобилизована на твердой фазе любым подходящим способом. Твердой фазой может быть любая структура, имеющая поверхность, которая может быть дериватизована для прикрепления праймера нуклеиновой кислоты или другой молекулы улавливания. Предпочтительно твердой фазой является плоский материал, такой как стенка микротитрационной лунки или сторона измерительного стержня.

Твердые носители, рассматриваемые здесь, обычно представляют собой стекло или полимер, такой как, но не только, целлюлоза, керамический материал, нитроцеллюлоза, полиакриламид, найлон, полистирол и его производные, поливинилидендифторид (ПВДФ), метакрилат и его производные, поливинилхлорид или полипропилен. В частности, используют нитроцеллюлозу. Твердый носитель может быть также гибридом, таким как нитроцеллюлозная пленка, нанесенная на стекло или полимерный матрикс. Термин “гибрид” включает в себя слоистое расположение двух или нескольких стеклянных или полимерных поверхностей, перечисленных выше. Твердый носитель может быть в форме мембраны или пробирок, гранул, дисков или микропланшетов, измерительных стержней, лунок микротитрационных панелей или любой другой поверхности, подходящей для проведения этого анализа.

В одном варианте прикрепленная нуклеиновая кислота улавливает молекулу нуклеиновой кислоты-мишени посредством гибридизации и необязательно участвует в реакции амплификации. Альтернативно, прикрепленная молекула нуклеиновой кислоты улавливает амплифицированные молекулы нуклеиновых кислот.

Способы связывания молекул нуклеиновых кислот с твердыми носителями хорошо известны в данной области. Процессы для связывания праймера с твердой фазой включают в себя амидную связь, тиоэфирную связь и введение аминогрупп на эту твердую фазу. Примеры связи с твердой фазой могут быть найдены в Международной патентной заявке №PCT/AU92/00587 [WO 93/09250].

Прикрепленный праймер может участвовать с праймером твердой фазы в реакции амплификации. Альтернативно, “общий” праймер прикрепляют к твердому носителю для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность-мишень. Специфическая амплификация последовательности-мишени может затем достигаться при помощи праймеров фазы раствора.

Может быть использован целый ряд меток, обеспечивающих детектируемый сигнал. Метка может быть связана с конкретной молекулой нуклеиновой кислоты или нуклеотидом или она может быть присоединена к промежуточному продукту, который затем связывается с молекулой нуклеиновой кислоты или нуклеотидом.

Метка может быть выбрана из группы, состоящей из хромогена, катализатора, фермента, флуорофора, люминесцентной молекулы, хемилюминесцентной молекулы, иона лантанида, такого как европий (Еu³⁴), радиоизотопа и прямой визуальной метки. В случае прямой визуальной метки можно использовать коллоидальную металлическую или неметаллическую частицу, частицу красителя, фермент или субстрат, органический полимер, латексную частицу, липосому или другой носитель, содержащий продуцирующее

сигнал вещество, и т.п. Большое число ферментов, подходящих для применения в качестве меток, описано в патенте Соединенных Штатов №№4366241, 4843000 и 4849338. Подходящие ферментные метки, применимые в данном изобретении, включают в себя щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена, люциферазу, β-галактозидазу, глюкозооксидазу, лизоцим, малатдегидрогеназу и т.п. Ферментная метка может быть использована отдельно или в комбинации со вторым ферментом, который находится в растворе. Альтернативно, флуорофор, который может быть использован в качестве подходящей метки в соответствии с данным изобретением, включает в себя, но не ограничивается ими, флуоресцеин, родамин, Техасский красный, люциферовый желтый или R-фикоэритрин.

В другом варианте один из праймеров прикрепляют к твердому носителю, такому как стенка сосуда или микротитрационной лунки, а другой из праймеров находится в фазе раствора. Праймер фазы раствора обычно метят репортерной молекулой. После реакции амплификации присутствие детектируемого сигнала является признаком амплимера.

Таким образом, другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает введение указанной пробы в реакционный сосуд, содержащий праймер, иммобилизованный на твердом носителе, и второй праймер в фазе раствора, причем оба праймера способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью на комплементарных отдельных цепях происходящей из HBV ДНК в районе, находящемся в консервативном районе, вблизи него или смежно с ним на геноме HBV, и причем праймер фазы раствора помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, подвергание этого реакционного сосуда условиям, облегчающим амплификацию, и затем детектирование присутствия индетифицируемого сигнала, причем присутствие указанного сигнала свидетельствует о присутствии происходящей из HBV ДНК.

Еще в одном варианте данное изобретение использует ряд праймеров к различным районам генома HBV, таким как консервативные районы или консервативные и вариабельные районы на геноме HBV. Это применимо, в частности, если HBV требует типирования (определения типа) или идентификации его вариабельного района. В одном применимом варианте многочисленные праймеры, относящиеся к различным районам генома HBV, иммобилизуют на твердом носителе, таком как микрокристалл, стенка реакционного сосуда, измерительный стержень, предметное стекло или другой матрикс. Праймеры обычно помещают в виде ряда (матрицы) с конкретными координатами для идентификации праймера. Однако термин “ряд” (матрица) не должен подразумевать какой-либо конкретный порядок, и “ряд” (матрица) может также включать в себя случайные пятна в общем распределении.

В любом случае каждый иммобилизованный праймер должен обычно иметь второй праймер в фазе раствора, так что конкретные районы генома HBV могут быть мишенями для амплификации. Праймеры фазы раствора обычно несут репортерную молекулу, способную давать идентифицируемый сигнал. При амплификации присутствие сигнала в определенных местоположениях на этой матрице может быть использовано для типирования конкретного HBV.

Таким образом, другой аспект данного изобретения относится к способу обнаружения одной или нескольких происходящих из HBV последовательностей-мишеней ДНК из одинаковых или различных штаммов или вариантов HBV, причем указанный способ предусматривает контактирование пробы, предположительно содержащей происходящую из HBV ДНК в одноцепочечной форме, с двумя или более праймерами, иммобилизованными индивидуально или в виде ряда (матрицы) на твердом носителе в реакционном сосуде, причем реакционный сосуд дополнительно содержит праймеры фазы раствора, имеющие партнера, иммобилизованного на твердом носителе, причем иммобилизованный праймер и его партнер фазы раствора способны амплифицировать в условиях амплификации район происходящей из HBV ДНК, причем праймер фазы раствора несет репортерную молекулу, способную давать идентифицируемый сигнал, так что присутствие сигнала в определенном местоположении на твердом носителе позволяет идентифицировать конкретный изолят или вариант HBV.

Как отмечалось выше, предпочтительными праймерами являются праймеры, представленные в <400>1 и <400>2, или праймеры, имеющие по меньшей мере приблизительно 70%-ное сходство с <400>1 или <400>2, а также праймеры, способные гибридизоваться с <400>1 или <400>2 или их комплементами в условиях низкой строгости. Предпочтительно их получают химическим синтезом, однако они могут быть также получены в виде фрагментов молекул нуклеиновых кислот, таких как, но не только, рестрикционные фрагменты. Праймеры обычно выбирают после сопоставления последовательностей известных штаммов HBV, в том числе вариантов, таких как несущие мутации в основной гидрофильной петле HBsAg. Если показано, что приблизительно 20 непрерывных (смежных) нуклеотидов являются консервативными, то их выбирают в качестве праймеров-кандидатов для консервативных районов генома HBV.

Таким образом, еще один аспект данного изобретения обеспечивает ряд из двух или более олигонуклеотидных праймеров, иммобилизованных на твердом носителе, причем указанные праймеры способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью из происходящей из HBV ДНК.

Предпочтительно район, с которым гибридизуются праймеры, находится внутри, смежно или проксимально относительно нуклеотидной последовательности из приблизительно 10 - приблизительно 50 нуклеотидов, консервативной среди двух или более вариантов HBsAg.

Предпочтительно эта матрица находится в форме биокристалла или другого микроматрикса, стенки микротитрационной лунки, предметного стекла, измерительного стержня или другого подходящего матрикса.

Эта матрица может быть также приспособлена для анализа при помощи компьютерной программы, которая способна детектировать присутствие иммобилизованных амплимеров, обеспечивающих детектируемый сигнал.

Таким образом, другой аспект данного изобретения рассматривает способ с использованием компьютерной программы для детектирования или идентификации происходящих из HBV последовательностей нуклеиновых кислот, причем этот способ включает в себя:

(i) средства для проведения реакции амплификации с использованием набора праймеров, содержащего по меньшей мере два праймера, причем по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени и по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной указанной первой упомянутой цепи;

(ii) средства обработки данных для регистрации присутствия идентифицируемого сигнала.

Еще один аспект данного изобретения обеспечивает применение матрицы, содержащей ряд олигонуклеотидов, определяемых формулой a₁a₂...a_n, имеющих координаты на этой матрице (x₁y₁), (х₂y₂)...(x_ny_n), где a₁a₂...a_n обозначают одинаковые или различные олигонуклеотиды, всего n олигонуклеотидов, и каждый олигонуклеотид определяется координатами координатной сетки (x₁y₁), (х₂y₂)...(x_ny_n), и где эти олигонуклеотиды имеют партнеров амплификации, определяемых b₁b₂...b_n, так что олигонуклеотиды a₁b₁, a₂b₂...a_nb_n способны гибридизоваться с комплементарными цепями происходящей из HBV ДНК, причем интронная ДНК содержит последовательность нуклеотидов, консервативную между двумя или более вариантами HBV, такими как HBsAg-варианты, причем указанная матрица применима для детектирования конкретных HBV-агентов, определяемых тем, что они несут консервативный район амплификации генома HBV.

Праймерные олигонуклеотиды данного изобретения используют в сочетании с реакцией амплификации, такой как ПЦР нуклеиновой кислоты-мишени HBV. Хотя способы амплификации хорошо известны в данной области, некоторая общая информация о процедурах ПЦР, используемых данным изобретением, дается ниже для целей ясности.

Для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени HBV в тест-пробе эта последовательность должна быть доступной компонентам системы амплификации. Это достигается выделением нуклеиновой кислоты-мишени HBV из пробы перед ПЦР-амплификацией. Способы экстракции молекул нуклеиновых кислот из биологических проб хорошо разработаны и широко используются (12).

Первая стадия каждого цикла ПЦР-амплификации заключается в разделении дуплекса нуклеиновой кислоты HBV, например, нагреванием пробы при подходящей температуре, такой как 95°С. После разделения цепей следующая стадия в ПЦР заключается в гибридизации разделенных цепей с праймерами, которые фланкируют последовательность-мишень. Затем эти праймеры удлиняются с образованием комплементарных копий цепей мишени. Для ПЦР-амплификации праймеры конструируют таким образом, что положение, в котором каждый праймер гибридизуется вдоль дуплексной последовательности, является таким, что продукт удлинения, синтезируемый от одного праймера, при отделении от матрицы служит в качестве матрицы для удлинения другого праймера. Цикл денатурации, гибридизации и удлинения повторяют в течение одного цикла - приблизительно 120 циклов, но обычно приблизительно 35 циклов для минимизации числа мутаций, вводимых в амплифицируемый продукт посредством ПЦР-амплификации.

Зависимое от матрицы удлинение праймеров в ПЦР-амплификации катализируется полимеризующим агентом в присутствии адекватных количеств четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (обычно dATP, dGTP, dCTP и dTTP) в реакционной среде, содержащей подходящие соли, катионы металлов и рН-буферящую систему. Подходящими полимеризующими агентами являются ферменты, которые, как известно, катализируют зависимый от матрицы синтез ДНК. Они включают в себя Taq-полимеразу, термостабильную ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus, и Pfu-полимеразу высокой точности. Последний фермент широко используется в амплификациях высокой точности. ПЦР-амплификацию обычно проводят в виде автоматизированного процесса с термостабильным ферментом. В этом процессе температура реакционной смеси изменяется циклически через фазу денатурации, фазу отжига праймеров и фазу реакции удлинения.

Экспериментальные меры предпринимаются для того, чтобы избежать загрязнения ПЦР-амплификации амплифицированной нуклеиновой кислотой из других реакций и неспецифической амплификации. Для устранения загрязнения из других реакций каждую реакционную смесь, содержащую подходящие соли, катионы металлов и рН-буферящую систему, адекватные количества четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (обычно dATP, dGTP, dCTP и dTTP), ДНК-полимеразу и праймерные олигонуклеотиды, но без вирусной нуклеиновой кислоты-мишени, выделенной из биологической пробы, подвергают УФ-освещению в течение 5 минут при 260 нм. Эта обработка элиминирует все потенциальные двухцепочечные молекулы ДНК в реакционной смеси пред-амплификации с сохранением в то же время интактными одноцепочечных праймерных олигонуклеотидов и других вышеуказанных компонентов этой реакционной смеси. С другой стороны, секвенирующий анализ амплифицируемой вирусной нуклеиновой кислоты будет не только элиминировать случаи загрязнения вследствие неспецифических амплификации, но также определять природу ампплифицируемых продуктов, в частности, потенциальные мутации на основной гидрофильной петле, которые приводят к ускользанию вируса от детектирования с использованием существующих в настоящее время иммунологических диагностических анализов.

Таким образом, данное изобретение включает в себя новые варианты HBV, такие как варианты, идентифицируемые в соответствии со способом данного изобретения.

Таким образом, другой аспект данного изобретения обеспечивает вариант HBV, обычно в изолированной форме, причем вариант HBV идентифицируют при помощи способа обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ предусматривает подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и затем выделение детектированного таким образом HBV.

Дополнительный аспект данного изобретения обеспечивает средство для идентификации продуктов экспрессии, таких как пептид, полипептид или белок, применимых в качестве иммунологических маркеров и/или для генерирования иммуноглобулинов для применения в диганостике и/или терапии.

Нуклеотидные последовательности HBV, идентифицированные данным изобретением, могут быть использованы в разнообразных системах рекомбинантной экспрессии. Такие нуклеотидные последовательности могут быть консервативными или вариабельными. Примером последних является модифицированный или новый эпитоп на HBsAg. Такие системы экспрессии делают возможной адекватную экспрессию желательных генов, в частности, гена, кодирующего HBsAg или его варианты. Рекомбинантная экспрессия нуклеотидных последовательностей в прокариотических и/или эукариотических хозяевах хорошо установлена, причем экспрессируемые таким образом белки используют в индукции иммуноглобулинов, специфических для определенных HBsAg. Затем эти иммуноглобулины могут быть использованы в анализах для детектирования присутствия этого вируса. Эти белки могут также использоваться для детектирования присутствия антител в пациентах, инфицированных HBV.

Желательные вирусные последовательности обычно встраивают в подходящий вектор перед трансформацией/трансфекцией с использованием стандартных способов в клеточные линии млекопитающих, дрожжей или насекомых для экспрессии. Прокариотические клетки предпочтительно используют для промежуточных стадий клонирования, но они могут эффективно использоваться для высоких уровней индуцируемой экспрессии желательных вирусных последовательностей.

Конкретная процедура, используемая для введения измененного генетического материала в клетку-хозяина для экспрессии вирусных последовательностей, не является, в частности, критической. Может быть использована любая из хорошо известных процедур для введения чужеродных нуклеотидных последовательностей в клетки-хозяева. Они включают в себя использование кальций-фосфатной трансфекции, электропорации, липосом, плазмидных векторов, вирусных векторов и любых других хорошо разработанных способов для введения клонированных вирусных ДНК, в частности ДНК, идентифицированных данным изобретением в тест-пробе, которые могут обнаруживать или могут не обнаруживать вирусные маркеры, которые могут быть или могут не быть детектируемыми иммунологическими диагностическими тестами.

Конкретный вектор, используемый для переноса генетической информации в клетку, не является, в частности, критическим. Могут быть использованы любые общепринятые векторы, используемые для экспрессии рекомбинантных белков в эукариотических клетках.

Экспрессирующий вектор содержит эукариотическую транскрипционную единицу или экспрессионную кассету, которая содержит все элементы, необходимые для экспрессии вирусных последовательностей нуклеиновых кислот в эукариотических клетках. Типичная экспрессионная кассета содержит промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей вирусный белок, и сигналы, требующиеся для эффективного полиаденилирования транскрибируемой мРНК.

Экспрессирующий вектор данного изобретения обычно содержит прокариотические последовательности, которые облегчают клонирование вектора в бактериях (например, Е. coli), а также одну или несколько эукариотических транскрипционных единиц, которые экспрессируются только в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих. Вектор может содержать или может не содержать эукариотический репликон. Если такой репликон присутствует, то этот вектор способен амплифицироваться в эукариотических клетках с использованием подходящего селективного маркера. Если вектор не содержит эукариотический репликон, то эписомальная амплификация не является возможной. В этом состоянии трансфицированная ДНК интегрируется в геном клеток-хозяев и экспрессия вирусного гена запускается ко-интегрированным промотором млекопитающего на экспрессирующем векторе.

После введения экспрессирующего вектора в клетки, трансфицированные клетки культивируют в условиях, благоприятствующих экспрессии вирусного белка, и этот белок очищают из культуры с использованием стандартных способов. Можно использовать ряд стандартных процедур для очистки белков, таких как, например, аффинная хроматография, гель-фильтрация и ионообменная хроматография.

Кроме использования белков, кодируемых желательным вирусным геномом, пептиды, которые имитируют эпитопы, специфические для данного вируса, могут быть также использованы для индукции антител, специфических для данного вируса.

Очищенные полипептиды или синтетические пептиды, обсуждаемые выше, могут быть затем использованы для индукции антител с использованием стандартных процедур. Иммуноглобулины могут быть использованы для разнообразных применений. Например, они могут быть использованы для анализа на присутствие этого вируса в тест-пробе или для очистки вирусного антигена, например, с использованием аффинной хроматографии. Они могут быть также использованы для нейтрализации соответствующего вирусного белка, в том числе ингибирования инфекционности целого вируса. Таким образом, множество способов, доступных для получения и манипулирования различных иммуноглобулинов, могут быть легко применены для получения молекул, применимых для диагностики и детектирования конкретного штамма HBV в тест-пробе, который может обнаруживать или может не обнаруживать вирусные маркеры, которые могут быть или могут не быть детектируемыми иммунологическими диагностическими тестами.

Антитела, которые связывают эпитопы, специфические для желательного штамма HBV, могут быть получены различными способами. Получение моноклональных антител не человека (например, мышиных антител) хорошо известно и может выполняться иммунизацией животного препаратом, содержащим этот вирус или его фрагмент. Продуцирующие антитела клетки, полученные из этих иммунизированных животных, подвергают скринингу с использованием стандартных способов.

Иммуноглобулины, полученные, как описано выше, могут быть затем использованы в различных диагностических анализах на присутствие штамма HBV в тест-пробе, который может обнаруживать или может не обнаруживать вирусные маркеры, которые могут или не могут быть детектированы иммунологическими диагностическими тестами. Например, меченые иммуноглобулины могут быть использованы в анализах, заключающихся в контактировании иммуноглобулинов с тест-пробой, подозреваемой в содержании штамма HBV, который может обнаруживать или может не обнаруживать вирусные маркеры, которые могут или не могут быть детектированы иммунологическими диагностическими тестами, и детектировании, образуется ли комплекс. Большое разнообразие меток может быть использовано для связывания с иммуноглобулинами. Обычный способ детектирования представляет собой применение авторадиографии с ¹²⁵I или ³⁵S. Могут быть использованы нерадиоактивные метки. Такие метки включают в себя хемилюминесцентные агенты и ферменты. Эти нерадиоактивные метки часто присоединяют непрямым способом. Обычно молекулу лиганда (например, биотина) ковалентно связывают с этой молекулой. Затем данный лиганд связывается с молекулой антилиганда (например, стрептавидина), которая либо сама является детектируемой, либо ковалентно связана с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флуоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение.

Эти молекулы могут быть также конъюгированы непосредственно с генерирующими сигнал соединениями, например конъюгированием с ферментом. Представляющими интерес в качестве меток ферментами могут быть фосфатазы и пероксидазы.

Для детектирования присутствия этих комплексов смесь контактируют с белком, способным связывать Fc-район иммуноглобулинов, таким как второе антитело, белок А или белок G. Этот белок предпочтительно иммобилизован на твердой поверхности, и эту твердую поверхность промывают для удаления несвязанных иммуноглобулинов, специфических для желательного вируса. Могут быть использованы многочисленные способы иммобилизации биомолекул. Например, твердая поверхность может быть мембраной (например, нитроцеллюлозой), микротитрационной чашкой (например, из полистирола) или гранулой. Желательный компонент может быть ковалентно связан или нековалентно присоединен посредством неспецифического связывания. Затем этой меткой манипулируют с использованием стандартных способов.

Рекомбинантно экспрессируемый и очищенный вирусный белок или вирусные лизаты могут быть использованы в диагностических процедурах. Эти процедуры обычно заключаются в контактировании биологической пробы (например, сыворотки), подозреваемой в содержании антител, с HBV и детектировании иммунологической реакции. Эту реакцию обычно детектируют с использованием меченых белков, как описано выше.

Способ данного изобретения применим, следовательно, в идентификации консервативных районов генома HBV, которые могут соответствовать консервативным районам белков HBV, таких как HBsAg. Этот способ может также идентифицировать вариабельные районы. Таким образом, пептиды, полипептиды и белки, соответствующие консервативным районам, применимы в качестве вакцинных компонентов и в диагностических тестах. Подобным образом, пептиды, полипептиды и белки, включающие в себя вариабельные районы, могут быть применимы для специфических вакцин для конкретных вариантов HBV или в качестве диагностических агентов.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает рекомбинантные или химически синтезированные пептид, полипептид или белок или их производные, гомологи или аналоги, содержащие последовательность аминокислот, включающую в себя консервативную аминокислотную последовательность между двумя или более изолятами HBV или отличающуюся от HBV дикого типа. Считается, что HBV дикого типа содержит композиционную (смешанную) или консенсусную нуклеотидную или аминокислотную последовательность из генотипов Е и А-F(13).

Термин “производное” обозначает часть, долю, фрагмент, участок или район полипептида, в том числе полипептида, содержащего одиночные или множественные замену, присоединение и/или делецию аминокислот. Для краткости пептид и белок называют термином “полипептид”.

Данное изобретение распространяется на химические аналоги рассматриваемых полипептидов, в том числе аналоги с модификациями в боковых цепях и/или аналоги, которые включают в себя неприродные аминокислоты. Такие химически модифицированные или синтетические аналоги полипептидов могут быть более стабильными для применения в качестве диагностических агентов или для применения в терапии.

Примеры модификаций боковых цепей, рассматриваемых данным изобретением, включают в себя модификации аминогрупп, например, восстановительным алкилированием посредством реакции с альдегидом с последующим восстановлением NaBH₄; амидинированием метилацетимидатом; ацилированием уксусным ангидридом; карбамоилированием аминогрупп цианатом; тринитробензилированием аминогрупп 2, 4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS); ацилированием аминогрупп янтарным ангидридом и тетрагидрофталевым ангидридом и пиридоксилированием лизина пиридоксаль-5-фосфатом с последующим восстановлением NaBH₄.

Гуанидиновая группа может быть модифицирована образованием гетероциклических конденсированных продуктов с использованием реагентов, таких как 2,3-бутандион, фенилглиоксаль и глиоксаль.

Карбоксильная группа может быть модифицирована карбодиимидной активацией через образование О-ацилизомочевины с последующей дериватизацией, например, до соответствующего амида.

Сульфгидрильные группы могут быть модифицированы такими способами, как карбоксиметилирование иодуксусной кислотой или иодацетамидом; окисление пермуравьиной кислотой до цистеиновой кислоты; образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями; реакция с малеимидом, малеиновым ангидридом или другим замещенным малеимидом; образование производных ртути с использованием 4-хлормеркурбензоата, 4-хлормеркурфенилсульфоновой кислоты, фенилмеркурхлорида, 2-хлормеркур-4-нитрофенола и других ртутьсодержащих соединений; карбамоилирование цианатом при щелочном рН.

Остатки триптофана могут быть модифицированы, например, окислением N-бромсукцинимидом или алкилированием индольного кольца 2-гидрокси-5-нитробензилбромидом или сульфонилгалогенидами. Остатки тирозина, с другой стороны, могут быть изменены нитрованием тетранитрометаном с образованием производного 3-нитротирозина.

Модификация имидазольного кольца остатка гистидина может быть выполнена алкилированием производными иодуксусной кислоты или N-карбэтоксилированием диэтилпирокарбонатом.

Примеры включения неприродных аминокислот и производных во время пептидного синтеза включают в себя, но не ограничиваются им, применение норлейцина, 4-аминомасляной кислоты, 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты, 6-аминогексановой кислоты, трет-бутилглицина, норвалина, фенилглицина, орнитина, саркозина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты, 2-тиенилаланина и/или D-измеров аминокислот. Список неприродных аминокислот, обсуждаемых здесь, показан в таблице 1.

Полипептиды данного изобретения могут быть использованы в фармацевтической композиции для вакцинации против HBV или варианта HBV. Фармацевтическая композиция содержит рассматриваемые полипептиды, а также один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей.

Фармацевтически приемлемые носители и/или разбавители включают в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Предполагается их применение в терапевтических композициях, за исключением случаев, когда какие-либо среда или агент являются несовместимыми с активным ингредиентом. В эти композиции могут быть также включены дополнительные активные ингредиенты.

Фармацевтическая композиция может также содержать генетические молекулы, такие как вектор, способный трансфицировать клетки-мишени, причем этот вектор несет молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рассматриваемый полипептид или кодирующую рибозим или антисмысловую молекулу относительно происходящей из HBV генетической последовательности. Вектор может быть, например, вирусным, бактериальным или эукариотическим вектором.

Как отмечалось выше, данное изобретение распространяется дополнительно на антитела к рассматриваемому полипептиду. Антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Такие антитела применимы для терапии и в диагностических анализах.

Другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения HBV в биологической пробе из субъекта, причем указанный способ предусматривает контактирование указанной биологической пробы с антителами, специфическими в отношении HBV или его вариантов, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплекса антитело-HBV, и затем детектирование указанного комплекса.

Присутствие HBV может быть выполнено любым из многих способов, таким как Вестерн-блоттинг или процедуры ELISA. Доступен большой диапазон способов иммуноанализа, как можно видеть из ссылки на патенты США №№4016043, 4424279 и 4018653. Они включают в себя как односайтный, так и двухсайтный или “сэндвич”-анализы неконкурентного типа, а также традиционные конкурентные анализы связывания. Эти анализы включают в себя также прямое связывание меченого антитела с мишенью.

Сэндвич-анализы находятся в числе наиболее ценных и обычно применяемых анализов и являются предпочтительными для применения в данном изобретении. Существует ряд вариаций способа сэндвич-анализа, и предполагается, что все они включены в данное изобретение. Вкратце, в типичном прямом анализе немеченое антитело иммобилизуют на твердом субстрате и подлежащую тестированию пробу приводят в контакт со связанной молекулой. После подходящего периода инкубации в течение периода времени, достаточного для образования комплекса антитело-антиген, добавляют второе антитело, специфическое для данного антигена, меченное репортерной молекулой, способной производить детектируемый сигнал, и инкубируют в течение времени, достаточного для образования другого комплекса антитело-антиген-меченое антитело. Любой непрореагировавший материал вымывают и присутствие антигена определяют наблюдением сигнала, производимого репортерной молекулой. Результаты могут быть качественными, т.е. простым наблюдением видимого сигнала, или могут быть сделаны количественными путем сравнения с контрольной пробой, содержащей известное количество гаптена. Вариации в прямом анализе могут включать в себя одновременный анализ, в котором как пробу, так и меченое антитело добавляют одновременно к связанному антителу. Эти способы хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области, в том числе любые небольшие вариации, как будет вполне очевидно. В соответствии с данным изобретением пробой является проба, которая, возможно, содержит HBV или происходящий из HBV полипептид, в том числе клеточный экстракт, биопсия ткани или, возможно, сыворотка, слюна, слизистые выделения, лимфа, тканевая жидкость и респираторная жидкость. Таким образом, проба обычно представляет собой биологическую пробу, содержащую биологическую жидкость, но она может быть также ферментационной жидкостью и жидкостью супернатанта, например, из культуры клеток.

В типичном прямом сэндвич-анализе первое антитело, обладающее специфичностью в отношении HBV или его антигенной части, ковалентно или пассивно связано с твердой поверхностью. Твердой поверхностью обычно является стекло или полимер, причем наиболее часто используемыми полимерами являются целлюлоза, полиакриламид, найлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен. Твердые подложки могут быть в форме пробирок, гранул, лунок микропланшетов или любой другой поверхности, подходящей для проведения иммуноанализа. Способы связывания хорошо известны в данной области и обычно состоят из сшивающего ковалентного связывания или физической адсорбции, комплекс полимер-антитело промывают в подготовке для тест-пробы. Затем аликвоту тестируемой пробы добавляют к твердофазному комплексу и инкубируют в течение достаточного периода времени (например, 2-40 минут или в течение ночи, если это более удобно) и при подходящих условиях (например, от комнатной температуры до приблизительно 37°С, в частности приблизительно 25°С), чтобы сделать возможным связывание любой субъединицы, присутствующей в данном антителе. После этого периода инкубации твердую фазу с субъединицами антител промывают и сушат и инкубируют со вторым антителом, специфическим для части гаптена. Второе антитело связано с репортерной молекулой, которую используют для указания на связывание второго антитела с гаптеном.

Альтернативный способ предусматривает иммобилизацию молекул-мишеней в биологической пробе и затем экспонирование иммобилизованной мишени специфическому антителу, которое может быть или может не быть меченным репортерной молекулой. В зависимости от количества мишени и силы сигнала репортерной молекулы связанная мишень может детектироваться прямым мечением антителом.

Альтернативно, второе меченое антитело, специфическое относительно первого антитела, экспонируют комплексу мишень-первое антитело для образования тройного комплекса мишень-первое антитело-второе антитело. Этот комплекс детектируют с использованием сигнала, испускаемого репортерной молекулой.

Под “репортерной молекулой” в данном описании подразумевают молекулу, которая вследствие ее химической природы обеспечивает аналитически идентифицируемый сигнал, который позволяет детектировать антиген-связанное антитело. Детектирование может быть либо качественным, либо количественным. Наиболее часто используемыми репортерными молекулами в этом типе анализа являются либо ферменты, флуорофоры, либо содержащие радионуклид молекулы (т.е. радиоизотопы) и хемилюминесцентные молекулы.

В случае ферментного иммуноанализа фермент конъюгируют со вторым антителом, обычно посредством глутарового альдегида или периодата. Однако, как будет легко понятно, существует большое разнообразие способов конъюгирования, которые легко доступны квалифицированному специалисту. Обычно используемые ферменты включают в себя, среди прочих, пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, β-галактозидазу и щелочную фосфатазу. Субстраты для применения с этими специфическими ферментами обычно выбирают для получения, при гидролизе соответствующим ферментом, детектируемого изменения цвета. Примеры подходящих ферментов включают в себя щелочную фосфатазу и перокисдазу. Можно также использовать флуорогенные субстраты, которые дают флуоресцентный продукт, а не хромогенные субстраты, указанные выше. Во всех случаях меченное ферментом антитело добавляют к комплексу первое антитело-гаптен, позволяя связываться, и затем избыток реагента вымывают. Затем раствор, содержащий подходящий субстрат, добавляют к комплексу антитело-антиген-антитело. Субстрат будет реагировать с ферментом, связанным со вторым антителом, давая качественный визуальный сигнал, который может быть дополнительно превращен в количественный, обычно спектрофотометрически, с обеспечением указания количества гаптена, присутствующего в данной пробе. Термин “репортерная молекула” распространяется также на применение агглютинации клеток или ингибирования агглютинации, например, эритроцитов на гранулах из латекса, и т.п.

Альтернативно, флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин и родамин, могут быть химически связаны с антителами без изменения из связывающей способности. При активации освещением светом определенной длины волны меченное флуорохромом антитело поглощает световую энергию, индуцируя состояние возбудимости в этой молекуле, с последующим испусканием света характерного цвета, визуально детектируемого при помощи светового микроскопа. Как и в ЕIA (ммуноферментном анализе), флуоресцентно меченному антителу дают связаться с комплексом первое антитело-гаптен. После вымывания несвязавшегося реагента оставшийся тройной комплекс экспонируют затем свету подходящей длины волны, наблюдаемая флуоресценция указывает на присутствие представляющего интерес гаптена. Иммунофлуоресцентный и иммуноферментный (ЕIА) способы, оба, хорошо разработаны в данной области и особенно предпочтительны для данного способа. Однако могут быть также использованы другие репортерные молекулы, такие как радиоизотопные, хемилюминесцентные или биолюминесцентные молекулы.

Данное изобретение описывается далее посредством следующих неограничительных примеров.

Пример 1

Обнаружение и идентификация мутантов поверхностного антигена HBV в живущих в Сингапуре взрослых индивидуумах и вакцинированных высокими уровнями анти-HBs детях, но дающих отрицательную реакцию на поверхностный антиген

Присутствие ДНК HBV в живущих в Сингапуре взрослых людях и вакцинированных детях, отрицательных в отношении HBsAg, исследовали с использованием амплификации посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении. Были отобраны шестьдесят три взрослых и 15 вакцинированных детей (в возрасте менее 15 лет и с рекомбинантной вакциной) из различных этнических групп, которые дают отрицательный результат в отношении HBsAg при использовании четырех независимых коммерческих иммунологических диагностических наборов (таблица 2). Все они являются положительными в отношении общих антител к внутреннему (коровому) антигену HBV (анти-НВс) (Corzyme, Abbott Laboratories, USA). Все являются также положительными в отношении анти-HBs (Ausab, Abbott Laboratories, USA) (таблица 2). ДНК из 100 мкл сыворотки экстрагируют обработкой протеиназой К с последующими экстракцией смесью хлороформ/фенол и осаждением этанолом. Олигонуклеотиды, обеспеченные в данном изобретении, используют в амплификации с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) с ДНК-полимеразой Pfu (Stratagene, USA). Амплификацию проводили в 35 циклах, каждый из которых состоял из денатурации при 94°С (1 мин), отжига при 50°С (2 мин) и удлинения при 73°С (3 мин). Результаты показывают, что ДНК HBV амплифицируется с использованием праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении, в трех из 15 детей (20%) и восьми из 63 (13%) взрослых. Идентификация мутантов HBsAg в группе отрицательных в отношении HBsAg детей представила отличающуюся ситуацию в сравнении с прежним сообщением авторов изобретения об обнаружении мутантов HBsAg в вакцинированных детях Сингапура, которые давали положительную реакцию в отношении HBsAg. ДНК HBV амплифицируется с использованием праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении, во всех пробах в этой группе вакцинированных детей.

Прямое секвенирование амплифицированных ДНК-фрагментов выявило мутации в различных положениях MHR в этих пробах (таблица 2). Они включают в себя наиболее обычную ускользающую от вакцины (т.е. от иммунологического надзора) мутацию G145R в шести случаях. Здесь имеются также три случая с мутацией G130D (таблица 2), которая, как было недавно обнаружено в одном сообщении о подобном случае, связана с терапией ламивудином. Кроме того, в четырех случаях идентифицирована мутация T131N. В противоположность сообщенной связанной с генотипом мутации T131N, которая всегда несет сопутствующую мутацию T114S на HBsAg, мутация T131N, идентифицированная с использованием праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении, имеет S (серин) дикого типа в остатке 114. Это в свою очередь предполагает, что этот вариант может быть вариантом, способным ускользать от детектирования.

Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что описанное здесь изобретение может подвергаться вариациям и модификациям, иным, чем конкретно описанные здесь. Должно быть понятно, что все подобные вариации и модификации включены в данное изобретение. Данное изобретение охватывает также все стадии, признаки, композиции и соединения, которые цитируются или указываются в данном описании, индивидуально или вместе, и любые и все комбинации любых двух или более стадий или признаков.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Carman et al., Gastroenterology 102:711-719, 1992.

2. Carman et al., Lancet 336:325-329, 1990.

3. Okamoto et al., Paediatric Research 32:264-268, 1992.

4. McMahon et al., Hepatology 15:757-766, 1992.

5. Fujii et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:1152-1157, 1992.

6. Harrison et al., J. Hepatol. 13:5105-5107, 1991.

7. Chen et al., FEBS Lett. 453:237-242, 1999.

8. Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389. 1997.

9. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc., 1994-1998, Chapter 15.

10. Bonner and Laskey Eur. J. Biochem. 46:83, 1974.

11. Marmur and Doty J. Mol. Biol. 5:109, 1962.

12. Oon et al., Vaccine 13:699-702, 1999.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> УН Чонг Дж.

<120> Диагностический анализ

<130> 2269257/EJH

<140>

<141>

<160> 3

<170> Patent In Ver. 2.1

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Описание синтетической последовательности: праймер

<400> 1

caaggtatgt tgcccgtttg t 21

<210> 2

<211> 23

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Описание синтетической последовательности: праймер

<400> 2

tggctagtt tactagtgcc att 23

<210>3

<211> 6

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Описание синтетической последовательности: праймер

<400> 3

gaattc 6

Claims (11)

1. Способ обнаружения происходящей из вируса гепатита В (НВV) последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, предусматривающий подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, по меньшей мере один из которых способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, а по меньшей мере один другой - с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, причем указанные праймеры могут удлиняться с 3′-конца нуклеотидной цепи с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, при этом способ предусматривает также подвергание указанной пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия продукта амплификации, свидетельствующего о присутствии указанной происходящей из НВV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры гибридизуются с районами, соответствующими нуклеотидной последовательности или фланкирующими нуклеотидную последовательность в нуклеотидной последовательности, кодирующей НВsAg, или ее части.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что праймеры гибридизуются с районами, соответствующими консервативной нуклеотидной последовательности или фланкирующими консервативную нуклеотидную последовательность в части нуклеотидной последовательности, кодирующей НВsAg.

4. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что он дополнительно предусматривает предварительное подвергание пробы условиям обратной транскрипции с получением одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из НВV мРНК.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что один из указанных праймеров помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, а другой из указанных праймеров помечен уловленной частью молекулы.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры выбраны из смысловых праймеров и антисмысловых праймеров или праймеров, имеющих по меньшей мере 70%-ное сходство с ними, или праймеров, способных гибридизоваться со смысловыми или с антисмысловыми праймерами в условиях низкой строгости.

7. Способ обнаружения происходящей из НВV последовательности-мишени ДНК в пробе, предусматривающий введение указанной пробы в реакционный сосуд, содержащий праймер, иммобилизованный на твердом носителе, и второй праймер в фазе раствора, причем оба праймера способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью на комплементарных отдельных цепях происходящей из НВV ДНК в районе, находящемся в консервативном районе, вблизи него или смежно с ним на геноме НВV, а праймер фазы раствора помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, при этом способ предусматривает подвергание указанного реакционного сосуда условиям, облегчающим амплификацию, и затем детектирование присутствия идентифицируемого сигнала, свидетельствующего о присутствии происходящей из НВV ДНК.

8. Способ обнаружения одной или нескольких происходящих из НВV последовательностей-мишеней ДНК из одинаковых или различных штаммов или вариантов НВV, предусматривающий контактирование пробы, предположительно содержащей происходящую из НВV ДНК в одноцепочечной форме, с двумя или более праймерами, иммобилизованными индивидуально или в виде ряда (матрицы) на твердом носителе в реакционном сосуде, дополнительно содержащем праймеры фазы раствора, имеющие партнера, иммобилизованного на твердом носителе, причем иммобилизованный праймер и его партнер фазы раствора способны амплифицировать в условиях амплификации район происходящей из НВV ДНК, при этом праймер фазы раствора несет репортерную молекулу, способную давать идентифицируемый сигнал, присутствие которого в определенном местоположении на твердом носителе позволяет идентифицировать конкретный изолят или вариант НВV.

9. Матрица из двух или более олигонуклеотидных праймеров, иммобилизованных на твердом носителе и способных гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью из происходящей из НВV ДНК, причем матрица определяется формулой а₁а₂...а_n, имеющих координаты на этой матрице (х₁y₁), (х₂y₂)...(х_ny_n), где а₁а₂...а_n обозначают одинаковые или различные олигонуклеотиды, всего n олигонуклеотидов, и каждый олигонуклеотид определяется координатами координатной сетки (х₁y₁), (х₂y₂)...(х_ny_n), при этом указанные олигонуклеотиды имеют партнеров амплификации, определяемых b₁, b₂...b_n, так что олигонуклеотиды а₁b₁, a₂b₂...а_nb_n способны гибридизоваться с комлементарными цепями происходящей из НВV ДНК, причем интронная ДНК содержит последовательность нуклеотидов, консервативную между двумя или более вариантами НВV, такими как НВsAg-варианты, при этом указанная матрица применима для детектирования конкретных НВV-агентов, определяемых тем, что они несут консервативный район амплификации указанной происходящей из НВV ДНК.

10. Вариант НВV, обычно в изолированной форме, идентифицируемый при помощи способа по п.1 с последующим выделением детектированного таким образом НВV.

11. Нуклеотидная последовательность НВV, обнаруженная способом по пп.1-8 для идентификации продуктов экспрессии, таких как пептид, полипептид или белок, применимых в качестве иммунологического маркера и/или для генерирования иммуноглобулинов для применения в диагностике и/или терапии.

Images