Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Штамм бактерий alcaligenes denitrificans-продуцент нитрилазы
RU2177034C1
Russia
- Other languages
English - Inventor
С.В. Полтавска С.В. Полтавская Т.Н. Козулина И.Н. Сингирцев С.В. Козулин С.П. Воронин
Worldwide applications
Application RU2001108752/13A events
2001-04-03
2001-12-20
Application granted
2001-12-20
2002-04-01
Description
translated from
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Alcaligenes denitrificans C-32 VKM B-2243 D - продуцента фермента нитрилазы, катализирующей прямой гидролиз нитрилов карбоновых кислот в соответствующие кислоты.
В литературе описан целый ряд микроорганизмов, обладающих ферментом нитрилаза. Среди них есть представители грибов Fusarium [1], актиномицетов Rhodococcus [2] , Nocardia [3] , грамположительных Corynebacterium [4], Arthrobacter [5] и грамотрицательных бактерий Alcaligenes [6], Klebsiella [7] . Однако большинство описанных нитрилаз способны гидролизовать только ароматические и гетероциклические нитрилы.
Способность к прямому гидролизу алифатических нитрилов с образованием соответствующих им карбоновых кислот описана для штаммов Rhodococcus rhodochrous J-1 [8] , Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833 [9], Rhodococcus rhodocrhous K22 [10], Alcaligenes sp. AK866N [11], Alcaligenes sp. ВКПМ B-6706 [12].
Литературные данные и накопленный опыт показывают - основными характеристиками штаммов, рекомендуемых к использованию в качестве биокатализаторов, являются высокая ферментативная активность и способность давать большой урожай клеток на простых, дешевых средах.
Основные недостатки штаммов Rhodococcus rhodochrous J-1, Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757, Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833, Rhodococcus rhodochrous K22 и Alcaligenes sp. B-6706 проявляются, прежде всего, в том, что в процессе их культивирования необходимо вводить в среду индукторы - токсичные, легко летучие нитрилы, дополнительные факторы роста - аминокислоты и витамины, либо дорогостоящий пептон. С другой стороны эти штаммы отличаются невысокой удельной нитрилазной активностью. Так штамм Rhodococcus rhodochrous J-1 требует для роста пептон, а для проявления нитрилазной активности - изовалеронитрил или капролактам. Максимальная удельная активность штамма по отношению к акрилонитрилу составляет 212.4 ммоль/г•ч при температуре реакции 20oC. Максимальная удельная активность штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833, даже при выращивании на среде, содержащей витамины и ацетонитрил в качестве индуктора, не превышает 82.98 ммоль/г•ч при температуре реакции 30oC. Штамм Alcaligenes sp. B-6706 требует внесения в среду культивирования казаминовых кислот и его удельная нитрилазная активность не превышает 234 ммоль/г•ч при 30oC.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является штамм Alcaligenes sp. AK866N, клетки которого при культивировании на среде, содержащей пептон, пропионитрил или ацетонитрил, проявляют высокую нитрилазную активность в температурном интервале (0-30oC). Так, максимальная нитрилазная активность штамма в отношении акрилонитрила при температуре реакции 30oC составляет 506,0 ммоль/г•ч. Недостатком данного штамма является, прежде всего, необходимость внесения в среду культивирования дорогостоящего пептона и дополнительных индукторов: пропионитрила и ацетонитрила. Кроме того, низкая термостабильность фермента не позволяет проводить реакцию гидролиза нитрилов при температуре выше 30oC.
Целью данного изобретения является получение штамма, обладающего высокой нитрилазной активностью в широком интервале температур и не требующего использования индукторов и дорогостоящих компонентов среды в процессе культивирования.
Поставленная цель достигается путем выделения штамма Alcaligenes denitrificans C-32, который не требует использования в процессе культивирования дорогостоящих питательных компонентов, таких как пептон, казаминовые кислоты, дрожжевой экстракт и витамины, и специальных индукторов: высокотоксичных, летучих нитрилов. Штамм Alcaligenes denitrificans C-32 обладает высокой нитрилазной активностью (555.6 ммоль/г•ч при 30oC) и термостабильностью фермента.
Заявляемый штамм Alcaligenes denitrificans C-32 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером В-2243 D и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.
Культурально-морфологические признаки. Клетки штамма Alcaligenes denitrificans C-32 в возрасте 20-22 часов имеют палочковидную и овоидную форму; расположены поодиночке, реже попарно, Размер клеток 0.7-0.8х0.9-2.0 мкм. Грамнегативные. Спор и капсул не образуют. Подвижные.
При росте на мясопептонном агаре: колонии округлой формы, 2-3 мм в диаметре, выпуклые, с возрастом растекаются по агару. Колонии блестящие, полупрозрачные в проходящем свете. Край неровный, консистенция пастообразная. На мясопептонном бульоне наблюдается равномерное помутнение всей среды с образованием пристенного кольца на поверхности.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб со строго респираторным типом метаболизма, способный к нитратному дыханию. Нитраты восстанавливает до нитритов. Оптимальная температура роста 30-32oC. Не растет при 42oC. Оптимальное значение pH для роста 7.5±0.5. Каталаза-, оксидаза-положительный. Хемоорганотроф, использует различные органические кислоты и аминокислоты в качестве источника углерода. Растет на синтетических средах, содержащих ацетонитрил, пропионитрил и акрилонитрил в качестве единственного источника углерода и/или азота. Способен гидролизовать нитрилы без образования амида в качестве промежуточного продукта реакции. При росте на средах с органическими солями, нитрилами и амидами дает щелочную реакцию. В O/F тестах на среде с сахарами и многоатомными спиртами кислоту не образует. Крахмал и целлюлозу не гидролизует. Желатиназой не обладает. Не образует пигментов на средах "Кинг А" и "Кинг В". Дает слабый рост на среде, содержащей 6.5 % NaCI. Индол и сероводород не образует.
Штамм не токсичен и не патогенен для человека.
На основании перечисленных выше свойств в соответствии с определителем бактерий Берджи штамм C-32 отнесен к роду Alcaligenes виду denitrificans.
Для получения клеток с высокой активностью нитрилазы, штамм C-32 культивировали в течение 72 часов при температуре 32oC на полусинтетических питательных средах.
Ферментативную активность клеток определяли с использованием в качестве субстрата нитрила акриловой кислоты. За единицу удельной нитрилазной активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 ммоль кислоты в единицу времени (1 час), содержащегося в 1 г сухого веса клеток.
Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами.
Пример 1. Выделение штамма Alcaligenes denitrificans C-32 VKM В-2243 D.
Заявляемый штамм был выделен методом ступенчатой адаптации из образцов почвы, взятых на территории производства нитрила акриловой кислоты.
Навеску почвы 1.0 г суспендировали в 10 мл стерильного физиологического раствора и выдерживали в течение 1 ч. После чего 5 мл супернатанта помещали в колбы Эрленмейера объемом 300 мл, заполненные на 1/6 часть средой следующего состава, г: глюкоза 0.5; пептон 1.0; K2HPO4 0.1; MgSO4 0.1; акрилонитрил 0.01; дистиллированная вода 1000, pH среды 7.2±0.2.
Культивирование проводили при 28oC и круговом перемешивании на качалке (160 об/мин). Ежедневно половину культуральной жидкости отбирали, а оставшуюся часть в колбе доводили до общего объема 50 мл средой аналогичного состава. Концентрация акрилонитрила увеличивали ступенчато от 0.01 до 3.0 г/л. В течение 30-суточной адаптации из среды постепенно удалили глюкозу и пептон. Полученные таким образом изоляты высевали на агаризованную среду вышеуказанного состава. Выросшие колонии дважды рассевали на питательной агаризованной среде для проверки на чистоту, после чего анализировали на способность трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту.
Для этого микроорганизмы подращивали на мясопептонном бульоне в течение суток, полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 20 мин при 6000 об/мин. Клетки отмывали в 0.01 М фосфатном буфере, pH 7.5±0.2, ресуспендировали в 1 мл такого же буфера, содержащего акрилонитрил в концентрации 10.0 г/л, создавая оптическую плотность 1.0 (длина волны 540 нм, толщина слоя 5.07 мм). Трансформацию проводили при температуре 30oC. Реакцию останавливали через 1 ч внесением в реакционный раствор 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Количественное определение образовавшейся акриловой кислоты осуществляли методом газовой хроматографии.
Пример 2. Выращивание штамма Alcaligenes denitrificans C-32 VKM B-2243 D в лабораторном ферментере.
Клетки штамма Alcaligenes denitrificans C-32 подращивали в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных на 1/6 часть бульоном Хоттингера, в течение суток при круговом перемешивании на качалке (160 об/мин) при температуре 30oC. Полученную культуральную жидкость использовали для засева лабораторного ферментера.
Ферментацию проводили в 3-литровом лабораторном ферментере, заполненном на 1/2 объема средой следующего состава (г/л):
Na2HPO4 • 12H2O - 6,0
KH2PO4 - 2,0
MgSO4•7H2O - 0,7
CH3COONH4 - 10,0
NH4Cl - 2,0
Кукурузный экстракт - 5,0
pH - 7,3
Вода дистиллированная
Культивирование проводили при температуре 32oC, аэрации 1,5 мин-1, постоянном перемешивании 560 об/мин.
Na2HPO4 • 12H2O - 6,0
KH2PO4 - 2,0
MgSO4•7H2O - 0,7
CH3COONH4 - 10,0
NH4Cl - 2,0
Кукурузный экстракт - 5,0
pH - 7,3
Вода дистиллированная
Культивирование проводили при температуре 32oC, аэрации 1,5 мин-1, постоянном перемешивании 560 об/мин.
В процессе ферментации, по мере истощения в среде ростового субстрата, по принципу обратной связи в ферментер вводили раствор уксусной кислоты.
Периодически из ферментера отбирали пробы культуральной жидкости для определения урожая клеток и их нитрилазной активности. Концентрацию клеток определяли фотоколориметрическим методом при длине волны 540 нм, толщине слоя 5.07 мм. Единица оптической плотности соответствовала 0.58 г/л (по сухому весу). Нитрилазную активность клеток оценивали следующим образом. Исследуемую суспензию клеток центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин. Осадок отмывали 0.01 М фосфатным буфером, pH 7.5. Клетки ресуспендировали в том же буфере до величины оптической плотности 1.0. По 1 мл клеточной суспензии переносили в герметичные пластиковые пробирки и помещали их в водяную баню с температурой 20oC. В пробы вносили акрилонитрил до конечной концентрации 20.0 г/л. Трансформацию проводили при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Реакцию останавливали внесением в реакционную смесь 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриловой кислоты в надосадочной жидкости определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 255 нм.
Урожай клеток на 72 часа культивирования составил 9.3 г/л (по сухому весу), удельная нитрилазная активность клеток в отношении акрилонитрила достигла 342 ммоль/г•ч.
Пример 3. Влияние температуры реакции трансформации на нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.
Зависимость нитрилазной активности клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32 от температуры изучали в процессе гидролиза акрилонитрила в акриловую кислоту. Штамм наращивали и подготавливали к процессу трансформации, как описано в примере 2. Условия трансформации были аналогичны описанным для штамма прототипа.
Образцы реакционной смеси, содержащие 0.3 мг/мл клеток (по сухому весу) в 0.01 М фосфатном буфере, pH 7.5, инкубировали в течение 5 мин при температуре от 0 до 70oC. Затем в реакционную смесь добавляли нитрил акриловой кислоты до конечной концентрации 20.0 г/л. Реакцию трансформации проводили при перемешивании в течение 20 мин на водяной бане при температурах от 0 до 70oC. Реакцию останавливали внесением 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 2 мин. В надосадочной жидкости определяли концентрацию образовавшейся акриловой кислоты. Зависимость удельной нитрилазной активности клеток от температуры представлена в табл. 1.
Анализ данных, представленных в табл. 1, показывает, что клетки штамма Alcaligenes denitrificans C-32 обладают более высокой нитрилазной активностью и термозащищенностью фермента (удельная нитрилазная активность при 30oC - 555.6 ммоль/г•ч, температурный диапазон проявления ферментативной активности 0-70oC), по сравнению с клетками штамма-прототипа Alcaligenes sp. AK. 866N (удельная нитрилазная активность при 30oC - 506.0 ммоль/г•ч, температурный диапазон проявления ферментативной активности 0-30oC). Максимальная нитрилазная активность клеток C-32 отмечается при температуре 65oC (1606 ммоль/г•ч.
Пример 4. Влияние значений pH реакционной среды на нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.
Штамм наращивали и подготавливали к процессу трансформации, как описано в примере 2. Образцы реакционных смесей, содержащие 0.58 мг/мл клеток (по сухому весу) в 0.01 М фосфатном буфере, pH 4,0 - 8.0, или в 0.01 М NaOH - глициновом буфере, pH 9.0 - 12.0, инкубировали в течение 5 мин при 20oC. Затем в реакционные смеси (объемом 1 мл) добавляли акрилонитрил до конечной концентрации 20.0 г/л. Реакцию трансформации проводили при 20oC в течение 20 мин на водяной бане при перемешивании. Реакцию останавливали внесением 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 2 мин. Концентрацию акриловой кислоты в надосадочной жидкости определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 255 нм. Зависимость удельной нитрилазной активности клеток от значений рН реакционной смеси представлена в табл. 2.
Как видно из данных, представленных в табл. 2, нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32 проявляется в более широком интервале значений pH, интервал pH 4-12, по сравнению с клетками штамма-прототипа, интервал pH 6-10.
Пример 5. Влияние концентрации акрилонитрила на нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.
Нитрилазную активность клеток оценивали как в примере 3, с тем отличием, что концентрация клеток в реакционных образцах составляла 0.23 мг/мл, а начальная концентрация акрилонитрила соответствовала значениям, представленным в табл. 3. Температура реакции 30oC.
Как видно из данных, представленных в табл.3, нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32 практически не зависит от начальной концентрации нитрила акриловой кислоты в реакционной смеси вплоть до предела растворимости субстрата.
Таким образом, заявляемый бактериальный штамм Alcaligenes denitrificans C-32 VKM В-2243 D обладает конститутивной нитрилазой, осуществляющей прямой гидролиз акрилонитрила в акриловую кислоту в широком интервале температур 0-70oC и pH среды 4 - 12. Высокая нитрилазная активность клеток достигается при росте штамма на среде, не содержащей дорогостоящих компонентов и дополнительных индукторов. Удельная нитрилазная активность штамма в отношении акрилонитрила составляет при 30oC 555.6 ммоль/г•ч. Максимальная нитрилазная активность клеток штамма 1606.0 ммоль/г•ч проявляется при 65oC.
Штамм Alcaligenes denitrificans C-32 VKM B-2243 D может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилазы и использован в биотехнологических процессах получения карбоновых кислот.
Источники информации
1. Harper D. B. Fungal degradation of aromatic nitriles. Enzymology of C-N cleavage by Fuzarium solani // Biochem. J. - 1977. - V.167, N 3.- P. 685-692.
1. Harper D. B. Fungal degradation of aromatic nitriles. Enzymology of C-N cleavage by Fuzarium solani // Biochem. J. - 1977. - V.167, N 3.- P. 685-692.
2. Mathew C.D., Nagasawa Т., Kobayashi M., Yamada H. Nitrilase - catalized prodaction of nicotinic acid from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous Jl // Appl. Environ. Microbiol. - 1988.- V.54, N 4.- P. 1030-1032.
3. Collins P.A., Knowles C.J. The utilization of nitriles and amides by Nocardia rhodochrous // J. Gen. Microbiol.- 1983.- V.129, N 3.- P. 711-718.
4. Fukuda Y. , Fukui M., Harada Т., Izumi Y. Formation of α-aminoacid from α-aminonitrile by cell suspensions of a strain of Corinebacterium // J. Ferment. Technol. - 1971.- V.49, N 12. - P. 1011-1016.
5. Bandyopadhyay A.K., Nagasawa Т., Asano Y., Fujishiro K., Tani Y., Yamada H. Purification and characterization of benzonitrilases from Arthrobacter sp. strain J-l // Appl. and Environ. Microbiol. - 1986. - V. 51, N 2. -P. 302-306.
6. Nagasava T. , Mauger J., Yamada H. A novel nitrilase, arylacetonitrilase, of Alcaligenes faecalis JM3. Purification characterization // Eur. J. Biochem. - 1990. - V 194, N 3.- P. 765-772.
7. Stalker D.M., Malyj L.D., Mc. Bride K.E. Purification and properties of a nitrilase specific for the herbicide bromoxynil and corresponding nucleotide sequence analysis of the boon gene // J. Biol. Chem. - 1988. - V. 263, N 13. - P. 6310-6314.
8. Nagasawa Т. , Nakamura Т., Yamada H. ε-Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase // Arch. Microbiol. - 1990.- V. 155.- P. 13-17.
9. Pat. 5998180 USA, Int. C16 C 12 P 007/60, C 12 N 009/78, C 12 N 004/20. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous for converting acrylonitrile directly to acrylic acid / Armitage Y.Ch., Hughes J., Webster N.A. - 18 p.
10. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Hyperinduction of an aliphatic nitrilase by Rhodococcus rhodochrous K22 // FEMS Microbiol. Lett. - 1991.- V.77.- P. 121- 124.
11. Appl. 1-132392 JP, Int. C14 C 12 P 7/40, C 12 R1:05.Microbiologocal production of monocarboxylic acid / Kawakami K., Tanabe Т., Inoue Sh.- 16 p.
12. Пат. 2081169 C 1 RU, МКИ6 C 12 N 9/78, C 12 P 7/40, 13/02, C 12 R1: 05. Штамм бактерий Alcaligenes species - продуцент нитрилазы / Забазная Е.В. , Козулин С.В., Куликова Л.К., Воронин С.П.-10 с.
Claims (1)
Hide Dependent
translated from
Claims (1)
Hide Dependent
translated from
- Штамм бактерий Alcaligenes denitrificans VKM B-2243 D - продуцент нитрилазы.