Claims (45)
1. Способ модификации генома кукурузы, где указанный способ включает:1. A method of modifying the genome of corn, where the specified method includes:
(а) получение компетентной по трансформации гаплоидной ткани кукурузы, происходящей от микроспор и содержащей геном гаплоидной ткани;(a) obtaining competent for the transformation of the haploid tissue of maize derived from microspores and containing the haploid tissue genome;
(b) доставку полинуклеотида, кодирующего сайт-специфическую нуклеазу, в компетентную по трансформации гаплоидную ткань; и(b) delivery of a polynucleotide encoding a site-specific nuclease to a transformation competent haploid tissue; and
(c) подтверждение модификации генома гаплоидной ткани кодируемой сайт-специфической нуклеазой.(c) confirmation of the modification of the haploid tissue genome encoded by site-specific nuclease.
2. Способ по п.1, где компетентной по трансформации гаплоидной тканью является ткань эмбриона или каллуса.2. The method according to claim 1, where the competent for transformation of the haploid tissue is the tissue of the embryo or callus.
3. Способ по п.1 или 2, где указанный способ включает доставку полинуклеотида, кодирующего сайт-специфическую нуклеазу, в компетентную по трансформации гаплоидную ткань методом трансформации растений, выбранным из группы, состоящей из метода трансформации посредством бомбардировки микрочастицами; метода трансформации Agrobacterium; метода трансформации фосфатом кальция; метода трансформации полибреном; метода трансформации посредством электропорации; метода ультразвуковой трансформации; метода липосомной трансформации; метода трансформации посредством микроинжекции; метода трансформации «оголенной» ДНК; метода трансформации плазмидным вектором; метода трансформации вирусным вектором; метода трансформации, оспосредуемой карбидом кремния; метода трансформации посредством распыления аэрозоля и метода ПЭГ-трансформации.3. The method according to claim 1 or 2, wherein said method comprises the delivery of a polynucleotide encoding a site-specific nuclease to a haploid tissue competent for transformation using a plant transformation method selected from the group consisting of a microparticle transformation method; Agrobacterium transformation method; transformation method calcium phosphate; polybrene transformation method; transformation method by electroporation; ultrasonic transformation method; liposome transformation method; method of transformation through microinjection; a method for transforming bare DNA; plasmid vector transformation method; viral vector transformation method; transformation method mediated by silicon carbide; transformation method by aerosol spraying; and PEG transformation method.
4. Способ по любому из пп.1-2, где полинуклеотид сайт-специфической нуклеазы кодирует нуклеазу, выбранную из группы, состоящей из нуклеазы «цинковый палец», нуклеазы TALEN, мегануклеазы и нуклеазы CRISPR.4. The method according to any one of claims 1 to 2, where the site-specific nuclease polynucleotide encodes a nuclease selected from the group consisting of zinc finger nuclease, TALEN nuclease, meganuclease and CRISPR nuclease.
5. Способ по любому из пп.1-2, где указанный способ также включает:5. The method according to any one of claims 1 to 2, where the specified method also includes:
(b) доставку донорного полинуклеотида и стабильную интеграцию донорного полинуклеотида в модифицированный геном гаплоидной ткани.(b) the delivery of a donor polynucleotide and the stable integration of a donor polynucleotide into a modified haploid tissue genome.
6. Способ по п.5, где каждый донорный полинуклеотид содержит один или два домена, которые по меньшей мере на 85% идентичны последовательности геномной области ДНК-мишени генома гаплоидной ткани.6. The method according to claim 5, where each donor polynucleotide contains one or two domains that are at least 85% identical to the sequence of the genomic region of the target DNA of the haploid tissue genome.
7. Способ по любому из пп.1-2, 6, где компетентная по трансформации ткань, происходящая от микроспор, представляет собой ткань кукурузы, имеющей свойства элитных сортов.7. The method according to any one of claims 1 to 2, 6, wherein the competent transformation tissue derived from microspores is corn tissue having the properties of elite varieties.
8. Способ по п.7, где компетентная по трансформации ткань, происходящая от микроспор, представляет собой ткань гибридной кукурузы, полученной в результате скрещивания линий кукурузы элитных сортов с другой линией кукурузы, обладающей высокой восприимчивостью к культивированию с микроспорами.8. The method according to claim 7, where the transformation competent tissue derived from microspores is hybrid maize obtained by crossing elite cultivar lines with another maize line that is highly susceptible to microspore cultivation.
9. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанный способ включает подтверждение модификации генома гаплоидной ткани с помощью ПЦР-анализа, Саузерн-блот-анализа, Нозерн-блот-анализа, анализа на экспрессию белка, вестерн-блот-анализа, ELISA-анализа или анализа на секвенирование новой генерации.9. The method according to any one of claims 1 to 2, 6, wherein said method includes confirming the modification of the haploid tissue genome using PCR analysis, Southern blot analysis, Northern blot analysis, protein expression analysis, western blot analysis, ELISA analysis or sequencing analysis of a new generation.
10. Способ по любому из пп.1-2, где указанный способ также включает:10. The method according to any one of claims 1 to 2, where the specified method also includes:
(d) обработку гаплоидной ткани, содержащей модифицированные геном гаплоидной ткани, агентом для удвоения хромосом;(d) treating the haploid tissue containing the haploid tissue gene modified with an agent for doubling the chromosomes;
(e) продуцирование дигаплоидной ткани кукурузы, содержащей модифицированный геном дигаплоидной кукурузы; и(e) producing a dihaploid maize tissue comprising a genetically modified dihaploid maize; and
(f) регенерацию дигаплоидной ткани кукурузы с получением дигаплоидного растения кукурузы, содержащего гомозиготный модифицированный дигаплоидный геном кукурузы.(f) regenerating the maize dihaploid tissue to produce a maize dihaploid plant containing a homozygous modified maize dihaploid genome.
11. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанную компетентную по трансформации гаплоидную ткань, происходящую от микроспор кукурузы получают способом, включающим:11. The method according to any one of claims 1 to 2, 6, wherein said transformation competent haploid tissue derived from corn microspores is obtained by a method comprising:
(i) сбор метелок кукурузы, содержащих микроспоры;(i) collecting panicles of corn containing microspores;
(ii) инкубирование метелок при температуре приблизительно 4-12°C;(ii) incubating panicles at a temperature of about 4-12 ° C;
(iii) выделение пыльника, содержащего микроспоры, из этих метелок;(iii) isolation of anther containing microspores from these panicles;
(iv) культивирование пыльников в среде для культивирования пыльников с получением эмбрионов микроспор; и(iv) culturing anthers in anther culture medium to produce microspore embryos; and
(v) культивирование эмбрионов микроспор в среде для культивирования каллуса с получением компетентной по трансформации гаплоидной ткани, происходящей от микроспоры.(v) culturing the microspore embryos in a callus culture medium to obtain haploid tissue competent transformation from microspores.
12. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанный способ включает:12. The method according to any one of claims 1 to 2, 6, where the specified method includes:
(bʹ) доставку донорного полинуклеотида и стабильную интеграцию одного или более донорных полинуклеотидов в модифицированный геном гаплоидной ткани;(bʹ) delivery of a donor polynucleotide and stable integration of one or more donor polynucleotides into a modified haploid tissue genome;
(bʹʹ) стабильную интеграцию донорного полинуклеотида в область-мишень генома гаплоидной ткани; и(bʹʹ) stable integration of the donor polynucleotide into the target region of the haploid tissue genome; and
(c) подтверждение интеграции донорного полинуклеотида в область-мишень генома гаплоидной ткани.(c) confirmation of the integration of the donor polynucleotide into the target region of the haploid tissue genome.
13. Способ по любому из пп.1-2, 6, где интегрированный донорный полинуклеотид экспрессируется в гаплоидной ткани кукурузы.13. The method according to any one of claims 1 to 2, 6, where the integrated donor polynucleotide is expressed in the haploid tissue of corn.
14. Способ по любому из пп.1-2, 6, где интегрированный донорный полинуклеотид сообщает нужный агрономический признак.14. The method according to any one of claims 1 to 2, 6, where the integrated donor polynucleotide reports the desired agronomic trait.
15. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанный способ также включает:15. The method according to any one of claims 1 to 2, 6, where the specified method also includes:
(b) экспрессию сайт-специфической нуклеазы и введение мутации в гаплоидный геном кукурузы; и(b) expression of a site-specific nuclease and introducing a mutation into the maize haploid genome; and
(c) подтверждение присутствия мутации в гаплоидном геноме кукурузы.(c) confirmation of the presence of a mutation in the haploid genome of maize.
16. Растение кукурузы, регенерированное из ткани, содержащей модифицированный гаплоидный геном ткани по любому из пп.1-15.16. A corn plant regenerated from tissue containing a modified haploid tissue genome according to any one of claims 1 to 15.
17. Растение кукурузы, регенерированное из модифицированного дигаплоидного генома ткани по любому из пп.1-16, где регенерированное растение имеет геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.17. A corn plant regenerated from the modified dihaploid tissue genome according to any one of claims 1-16, wherein the regenerated plant has a genomic modification introduced by an encoded site-specific nuclease.
18. Дигаплоидное растение кукурузы, регенерированное из модифицированного дигаплоидного генома ткани по п.10, где регенерированное растение имеет модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.18. The maize digaploid plant regenerated from the modified tissue diaploid genome of claim 10, wherein the regenerated plant has a modification introduced by an encoded site-specific nuclease.
19. Способ получения потомства растения кукурузы, имеющего модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, где указанный способ включает:19. A method for producing offspring of a corn plant having a modification introduced by an encoded site-specific nuclease, wherein said method comprises:
(а) скрещивание растения кукурузы по п.17 с растениями другой родительской линии кукурузы с получением потомства F1 растений;(a) crossbreeding a corn plant according to claim 17 with plants of another parental line of corn to obtain offspring of F1 plants;
(b) отбор одного или более потомств F1 растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы; и(b) selecting one or more progeny of F1 plants having a genomic modification introduced by an encoded site-specific nuclease to obtain one or more progeny of a corn plant having a modification introduced by an encoded site-specific nuclease; and
(c) необязательно, (i) возвратное скрещивание потомства F1 растения кукурузы с растением кукурузы по п.18 или с другой родительской линией кукурузы с получением потомства «бэксроссов» растения кукурузы, (ii) отбор «бэксроссов» потомства растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, и (iii) необязательное повторение стадий (i) и (ii) с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.(c) optionally, (i) backcrossing the offspring F1 of the corn plant with the corn plant of claim 18 or with another parent line of the corn to produce the backsross offspring of the corn plant, (ii) selecting the “backsrosses” of the offspring of plants having a genomic modification, introduced by encoded site-specific nuclease, and (iii) optionally repeating steps (i) and (ii) to produce one or more offspring of a corn plant having a genomic modification introduced by encoded site-specific nuclease.
20. Способ получения потомства растения кукурузы, имеющего модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, где указанный способ включает:20. A method for producing offspring of a corn plant having a modification introduced by an encoded site-specific nuclease, wherein said method comprises:
(а) скрещивание растения кукурузы по п.18 с растениями другой родительской линии кукурузы с получением потомства F1 растений;(a) crossbreeding a corn plant according to claim 18 with plants of another parental line of the corn to produce offspring of F1 plants;
(b) отбор одного или более потомств F1 растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы; и(b) selecting one or more progeny of F1 plants having a genomic modification introduced by an encoded site-specific nuclease to obtain one or more progeny of a corn plant having a modification introduced by an encoded site-specific nuclease; and
(c) необязательно, (i) возвратное скрещивание потомства F1 растения кукурузы с растением кукурузы по п.18 или с другой родительской линией кукурузы с получением потомства «бэксроссов» растения кукурузы, (ii) отбор «бэксроссов» потомства растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, и (iii) необязательное повторение стадий (i) и (ii) с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.(c) optionally, (i) backcrossing the offspring F1 of the corn plant with the corn plant of claim 18 or with another parent line of the corn to produce the backsross offspring of the corn plant, (ii) selecting the “backsrosses” of the offspring of plants having a genomic modification, introduced by encoded site-specific nuclease, and (iii) optionally repeating steps (i) and (ii) to produce one or more offspring of a corn plant having a genomic modification introduced by encoded site-specific nuclease.
21. Зерно потомства растения кукурузы, содержащее модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, полученной способом по п.19.21. Grain of the offspring of a corn plant containing a modification introduced by an encoded site-specific nuclease obtained by the method of claim 19.
22. Зерно потомства растения кукурузы, содержащее модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, полученной способом по п.20.22. Grain of the offspring of a corn plant containing a modification introduced by an encoded site-specific nuclease obtained by the method of claim 20.