RS52377B

RS52377B - Primena timozina 1, samog ili u kombinaciji sa ptx3 ili ganciklovirom, za lečenje infekcije citomegalovirusom

Info

Publication number: RS52377B
Application number: RS20120363A
Authority: RS
Inventors: Luigina Romani; Francesco Bistoni; Enrico Garaci
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2007-04-12
Publication date: 2012-12-31
Also published as: PL2012816T3; US8337828B2; CA2649063C; WO2007128647A1; KR20090007621A; SI2012816T1; HK1128622A1; EP2012816B1; CY1113277T1; JP2009535373A; BRPI0711136A2; JP5441685B2; ES2389452T3; EP2012816A1; MX2008013872A; CA2649063A1; AU2007247292B2; DK2012816T3; HRP20120676T1; KR101380360B1

Abstract

Primena timozina α1, za dobijanje leka za prevenciju i/ili lečenje herpes virusnih bolesti kod subjekta koji je sisar.Prijava sadrži još 3 patentna zahteva.

Description

Opis pronalaska

[0001]Ovde opisani pronalazak se odnosi na primenu timozina alfa 1 (Ta1), samog ili u kombinaciji sa dugim pentraksinom PTX3 (PTX3) ili sa jednim od njegovih funkcionalnih derivata, za dobijanje leka za prevenciju ili lečenje virusnih bolesti i/ili za inhibiranje aktivacije virusa, pri čemu je pomenuti virus izabran iz grupe koja se sastoji od herpes virusa, kao Stoje citomegalovirus (CMV).

[0002]Humani citomegalovirus (HCMV) je herpes virus koji se obično nalazi kod oko 50% opšte populacije. Oko 90% ljudi sa HlV-om nosi i HCMV. Kod opšte populacije, posle inicijalne infekcije virus obično ostaje latentan, odn. neaktivan u telesnim tkivima. Međutim, on se može rasejavati iz usta, urina i genitalnog trakta služeći kao izvor infekcije za druge ljude. Infekcija sa HCMV može rezultovati sekundarnim, ozbiljnijim infekcijama, ukoliko imuni sistem postane kompromitovan, odn. oslabljen iz bilo kog razloga.

[0003]Približno 5% novorođenčadi koja dobiju HCMV usled vertikalnog prenošenja imaće ozbiljne kongenitalne (urođene) defekte. Oni mogu obuhvatati oštećenje mozga, zastoj rasta, slepilo i druge defekte. Ovaj problem se obično javlja kada se majka tokom trudnoće po prvi put inficira sa HCMV.

[0004]Kod opšte populacije odraslih. HCMV je latentan, ali je možda povezan sa razvojem koronarne arterijske bolesti. Infekcija sa HCMV je povezana sa razvojem arterijskih plakova i ateroskleroze.

[0005]HCMV može izazvati ozbiljne probleme kod ljudi sa oslabljenim imunim sistemom.

[0006]Ovo je najčešće problem kod ljudi sa AIDS-om ili kod pacijenata na imunosupresivnoj terapiji. HCMV-om se inficira između 75 i 100% HIV pozitivnih pacijenata. Najčešće komplikacije koje su povezane sa HCMV-om obuhvalaju horioretinitis; infekcije gastrointestinalnog trakta, uključujući hepatitis, ezofagitis. kolitis, gastritis i pankreatitis; neurološka oboljenja, uključujući encefalitis i poliradikulitis; plućna oboljenja; i epididimitis.

[0007]Ljudi sa metastaziralim tumorom ili ljudi kojima je transplantiran organ ili koštana srž često oboljevaju. Do infekcije može doći zbog izlaganja HCMV po prvi put ili kao rezultat reaktivacije HCMV. Kod pacijenata sa izvršenom transplantacijom i pacijenata sa tumorom, HCMV obično izaziva pneumoniju ili gastrointestinalnu infekciju koja rezu 11 uje sa dijarejom i može dovesti do smrti. Dalje, HCMV doprinosi razvoju hronične disfunkcije alografta kod primalaca transplantacije čvrstih organa. Odnos između HCMV oboljenja i razvoja bronhiolitis obliteransa kod primalaca transplantacije pluća je dobro dokumentovan. Pored toga, HCMV je jedan od više faktora rizika koji mogu dovesti do oštećenja alografta. Direktna invazija virusa na alograft može izazvati HCMV hepatitis kod pacijenata kojima je transplantirana jetra ili bubreg. Osim sindroma koje direktno uzrokuje HCMV. infekcija sa ovim virusom može povećati opasnost od gljivičnih i drugih oportunističkih infekcija, kao što su Pneumocvstis carinii pneumonija i limfoproliferativna bolest izazvana Epštajn-Barovim virusom posle transplantacije.

[0008]Većina ljudi se inficira sa HCMV u vreme kada su odrasli. Svako ko primi transfuziju krvi ili mu bude transplantiran organ nalazi se pod rizikom od HCMV infekcije.

[0009]Pored toga, ljudi sa oslabljenim imunim sistemom i nerođena deca su pod rizikom od ozbiljne bolesti.

[0010]Lečenje aktivnog HCMV kod ljudi sa oslabljenim imunim sistemom se sada vrši sa antivirusnim agensima, kao što su ganciklovir. foskarnet i cidofovir.

[0011]Influenca virusi izazivaju grip. zaraznu bolest koja kod ljudi inficira respiratorni trakt (nos, grlo i pluća). Influenca se obično pojavljuje iznenada i može izazvati ove simptome: groznicu, glavobolju, slabost (osećanje da je čovek bolestan i da nema energije, koje može biti ekstremno), kašalj, bolove u grlu, curenje nosa i bolove u telu

[0012]Paramyxoviridae virusi izazivaju širok spektar karakterističnih kliničkih bolesti kod ljudi, a tu spadaju virus malih boginja; virus zaušaka, koji izaziva simptome parotitisa, orhitisa i encefalitisa; i parainfluenca virusi koji su respiratorni patogeni.

[0013]Respiratorni sincicijski virus (RSV) je najčešći uzrok bronhiolitisa i pneumonije kod novorođenčadi i dece ispod 1 godine starosti. Bolest najčešće počinje sa groznicom, curenjem nosa, kašljem i ponekad sa otežanim disanjem, odn. šištanjem. RSV takođe izaziva ponovljene infekcije tokom života, koje su obično povezane sa umerenim do ozbiljnim simptomima nalik prehladi; međutim, u bilo kom uzrastu može doći do ozbiljnih bolesti donjih disajnih puteva, a naročito kod starijih ljudi ili kod onih sa oslabljenim srčanim, plućnim ili imunim sistemom.

[0014]Koronavirusi inficiraju mnoge vrste sisara i ptica, dok kod ljudi izazivaju respiratorne infekcije uključujući i teški akutni respiratorni sindrom (engl. Severe Acute Respiratorv Sindrom, skr. SARS), infekcije gastrointestinalnog trakta i neurološke sindrome. Infekcije kod odraslih su manje uobičajene, a izgleda da se tokom života pojavljuju ponovljene infekcije.

[0015]Virus humane imunodeficijencije (eng. Human Immunodeficiencv Virus, skr. HIV) je retrovirus. Genetska informacija u retrovirusnoj čestici je kodirana pomoću RNK. Nakon ulaska u ćeliju domaćina ova RNK se kopira u DNK pomoću virusnog enzima reverzne transkriptaze. Ova kDNK (engl. cDNA) kopija genetičke informacije virusa se može integrisati u hromozome u jedru ćelije domaćina. Ovaj provirus može ostati neaktivan tokom većeg broja deoba ćelije pre nego što se reaktivira i stvori još infektivnih retrovirusnih čestica.

[0016]Virusni hepatitis predstavlja bilo koji tip zapaljenja jetre koji je izazvan virusnom infekcijom. Sada je utvrđeno da bolesti jetre najčešće izazivaju tri virusa: hepatitis A, hepatitis B, i hepatitis ne-A, ne-B (takođe poznat i kao hepatitis C). Otkriveno je postojanje i nekoliko drugih tipova: hepatitis D, hepatitis E. i nedavno identifikovani hepatitis G. Sumnja se da postoji i sedmi tip (hepatitis F), ali njegovo postojanje još uvek nije potvrđeno.

[0017]Rotavirus je najčešći izazivač ozbiljne dijareje kod dece, koja je uzrok hospitalizacije približno 55.000 dece svake godine u Sjedinjenim Državama i smrti preko 600.000 dece godišnje širom sveta.

[0018]Timozin alfa 1 je jedinjenje koje je dobro poznato u oblasti medicine.

[0019]Ovo jedinjenje predstavljaju kiseli peptidi koji se nalaze u ekstraktu timusa, a koji ispoljavaju imunoregulatorna svojstva u nekolikoin vitroiin vivotestova (1972; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69,1800-1803).

[0020]Prethodna primena timozina alfa 1 je već poznata.

[0021]Subkutana primena timozina alfa 1 na bezdlakim miševima, koji su prethodno bili inficirani sa ćelijama humanog nesitnoćelijskog karcinoma pluća (engl. non-small cell lung cancer, skr. "NSCLC"), značajno je smanjila volumen tumora.

[0022]Pulmonarne, odnosno plućne metastaze kod miševa sa fibrosarkomom indukovanim pomoću metilholantrena su takođe bile redukovane pomoću timozina alfa 1. a lokalni rast sarkoma, kao i metastaze ćelija limfosarkoma na jetri i plućima bile su značajno smanjene kod BALB/c miševa koji su bili tretirani sa timozinom alfa 1.

[0023]PTX3 je protein koji se izražava u različitim tipovima ćelija (Bottazzi, et al., J. Biol. Chem, 1997; 272; 32817-32823), a naročito u mononuklearnim fagocitima i endotelijalnim ćelijama posle izlaganja inflamatornim citokinima interleukinlbeta (IL-lbeta) i tumorskom faktoru nekroze alfa (engl. Tumor Necrosis Factor alpha, skr. TNF-a).

[0024]Ovaj protein se sastoji od dva strukturna domena, N-terminalnog kraja koji nije u vezi ni sa jednim poznatim molekulom i C-terminalnog kraja koji je sličan kratkim pentraksinima, kao što je C-reaktivni protein (CRP). Otkriveno je da postoji suštinska sličnost između humanog PTX3 (hPTX3) i životinjskih PTX3-ova.

[0025]PTX3 gen je lociran na mišjem hromozomu 3, u regionu koji je sličan humanom 3q regionu (q24-28), po zadržavanju dokumentovane lokacije hPTX3 u 3q 25 regionu. Pored toga, mišji PTX3 (mPTX3) (Introna, M., et al.: Blood. 87 (1996); 1862-1872) je veoma sličan hPTX3 u pogledu organizacije, lokacije i sekvence (Breviario, F., et al.: J. Biol. Chem., 267. 22190, 1992).

[0026]Posebno treba naglasiti da je stepen identičnosti sekvenci između humanog gena i mišjeg gena 82%, a da dostiže 92% ako se uzmu u obzir konzervativne supstitucije.

[0027]Visok stepen sličnosti između sekvence hPTX3 i one mPTX3 je znak visokog stepena konzervacije pentraksina u toku evolucije (Adv. Immunol. 34: 141. 1983).

[0028]Za pregled pentraksina, vidi H. Gewurz, et al., Current Opinion in Immunologv, 1995. 7. 54-64.

[0029]Već su poznate prethodne primene dugog pentraksina PTX3.

[0030]U međunarodnoj prijavi patenta VV099/32516 je opisana primena dugog pentraksina PTX3 za terapiju infektivnih (gljivičnih, bakterijskih, protozoalnih ili virusnih). zapaljenskih ili tumorskih bolesti. U VV099/32516 nije uopšte navedeno da bi PTX3 mogao biti koristan za lečenje HCMV ili influenca virusa.

[0031]U VVO02/38169 je opisana primena dugog pentraksina PTX3 za dobijanje leka koji je koristan za lečenje bolesti koje su povezane sa abnormalnom aktivacijom faktora rasta FGF-2.

[0032]U VVO02/36151 je opisana primena dugog pentraksina PTX3 za lečenje autoimunih bolesti.

[0033]U VVO03/011326 je opisana primena dugog pentraksina PTX3 za lečenje neplodnosti kod žena.

[0034]U VVO2005060997 je opisana primena inhibitora dugog pentraksina PTX3 za dobijanje leka za prevenciju i lečenje autoimunih bolesti i degenerativnih bolesti kostiju i hrskavice.

[0035]U Blood, 1. januar 2006, tom 107, broj 1. opisano je da PTX3 doprinosi ograničavanju oštećenja tkiva kod zapaljenskih oboljenja i aktivacije autoreaktivnih ćelija.

[0036]Ganciklovir je antivirusni agens koji je dobro poznat u oblasti medicine. On se koristi za lečenje infekcija izazvanih citomegalovirusom kod ljudi čiji imuni sistem ne funkcioniše u potpunosti. Ovo obuhvata pacijente sa sindromom stečene imunodeficijencije (engl. acquired immune deficiencv svndrom. skr. AIDS). On se takođe primenjuje kao pomoć u prevenciji CMV infekcije kod pacijenata kojima je transplantiran organ ili koštana srž, kao i kod pacijenata sa uznapredovalom infekcijom sa virusom humane imunodeficijencije (HIV).

[0037]Kao iznenađujuće i neočekivano, sada je otkriveno da je timozin alfa 1, sam ili u kombinaciji sa dugim pentraksinom PTX3 ili ganciklovirom. koristan za dobijanje leka za inhibiranje aktivacije virusa i/ili prevenciju ili lečenje herpes virusnih bolesti.

[0038]Zbog toga je cilj predmetnog pronalaska primena delotvorne količine timozina alfa 1, samog ili u kombinaciji sa dugim pentraksinom PTX3. za dobijanje leka za inhibiranje herpes virusnih bolesti, kao što je citomegalovirus (CMV); kod subjekta koji je sisar.

[0039]Sledeći cilj predmetnog pronalaska je primena delotvorne količine timozina alfa 1, samog ili u kombinaciji sa dugim pentraksinom PTX3 za dobijanje leka za prevenciju i/ili lečenje herpes virusnih bolesti, kao što je citomegalovirus (CMV): kod subjekta koji je sisar.

[0040]Sledeći cilj predmetnog pronalaska je primena delotvorne količine timozina alfa 1, samog ili u kombinaciji sa dugim pentraksinom PTX3. za dobijanje leka za lečenje sindroma prouzrokovanog citomegalovirusom, pri čemu: - pomenuti sindrom je CMV mononukleoza; - pomenuti sindrom je vezan za domaćina sa kompromitovanim imunitetom; - pomenuti domaćin sa kompromitovanim imunitetom ima AIDS; - pomenuti domaćin sa kompromitovanim imunitetom je primalac transplantacije organa.

[0041]Pronalazak ilustruju sledeći primeri koji nisu ograničavajući.

OPIS SLIKA NACRTA:

Slika 1

TcM štiti od MCMV infekcijein vivo

[0042]BALB/c (Slika la) i C57BL6 (Slika lb) miševi su inficirani sa 1 x 10"ili 5 x 10<5>PFU MCMV, respektivno. Titri virusa su kvantifikovani na MEF ćelijama standarnom tehnikom plaka na tkivima uzetim u različitim vremenskim trenucima (Slika 1a) ili nedelju dana posle infekcije (Slika 1b) i izraženi su kao log 10 (srednja ± standardna greška. SE). Timozin alfa 1 (200 ug/kg davano je tokom 7 ili 14 dana) i GCV (40 mg/kg davano je tri puta nedeljno) su primenjivani počevši od dana infekcije. Kontrole su primale peptidni analog. odnosno peptid sa izmenjenim redosledom aminokiselina. Dobijeni su rezultati iz 4 nezavisna eksperimenta. Stupci označavaju standardne greške.<*>P<0,05, virusno opterećenje između tretiranih i netretiranih miševa.

Slika 2

Ta1 promoviše reaktivnost NK ćelija kod MCMV infekcije

[0043]Fenotipska analiza svih (Slika 2a. Slika 2b) ili NK (Slika 2c) ćelija iz slezine BALB/c miševa inficiranih sa MCMV, koji su bili netretirani (-) ili tretirani (+) sa 200 ug/kg timozina alfa 1 tokom jedne nedelje; nula predstavlja neinficirane miševe. Brojevi se odnose na procenat pozitivnih ćelija u FACS analizi, jednu nedelju posle infekcije. Histogrami predstavljaju 1 od 4 nezavisna eksperimenta. (Slika 2d) Citotoksična aktivnost (pomoću standardnog testa oslobađanja 51 Cr pri lizi YAC-1 kao ciljeva) i frekvencija IFN-. -stvaranja NK ćelija su određeni pomoću ELISPOT testa kod miševa koji su tretirani isto kao gore. Stupci označavaju standardne greške.<*>P < 0,05, inficirani prema neinficiranim miševima. "P < 0,05, inficirani miševi tretirani sa timozinom alfa 1 prema netretiranim. Rezultati koji su prikazani potiču iz 5 nezavisnih eksperimenata.

Slika 3

Timozin alfa 1 promoviše replikaciiu virusa, aktivaciju IRF7 i produkciju citokina u pDC

[0044](Slika 3a) CD11b+DC ili pDC su generisane iz koštane srži BALB/c miševa, pa su inficirane sa MCMV, a onda je pomoću svetlosne mikroskopije određena morfologija i replikacija virusa pomoću PCR u realnom vremenu ekspresijom transkripata MCMV gB (oba posle 48 h) ili IRF7 nuklearna ekspresija pomoću imunoblotinga sa anti-IRF7 (2 h kasnije). Ćelije su bile izložene (+) ili nisu (-) dejstvu 50 ug/ml timozina alfa 1 tokom 2 h na 37°C pre infekcije. - predstavlja neinficirane ćelije. Prikazani rezultati predstavljaju jedan reprezentativan eksperiment od 3.

[0045]Nuklearno frakcionisanje je provereno blotiranjem sa anti-aldolaza (kao negativna kontrola) antitelima.

[0046]Strelica pokazuje induktibilnu traku. Traka 1. neinficirane ćelije; traka 2, inficirane sa MCMV; traka 3, tretirane sa timozinom a1; traka 4. tretirane sa MCMV+ timozinom a1. (Slika 3b) Produkcija citokina (pg/ml) sa DC podskupovima koji su tretirani isto kao gore. Stupci označavaju standardne greške.<*>P < 0,05. produkcija citokina u DC inficiranim sa MCMV prema neinficiranim DC.<**>P < 0.05, tretirane sa timozinom alfa 1 prema netretiranim DC.

(Slika 3c) Produkcija citokina kod miševa tokom MCMV infekcije. Nivoi citokina (pg/ml) u supernatantima kultura ćelija slezine miševa sa MCMV infekcijom i tretiranim tokom nedelju dana sa timozinom alfa 1 ili GCV.<*>P < 0.05. tretirani prema netretiranim miševima. ND, nije urađeno.

Slika 4

Ta1 aktivira proces zavisan od TLR9/ MvD88.

[0047]Virusno opterećenje (Slika 4a) i produkcija citokina (Slika 4b) kod C57BL6, TLR4-/-, TLR9-/- i MyD88-/- miševa inficiranih sa 5 x 10<5>PFU MCMV i tretiranih sa 200 ug/kg Ta1 tokom nedelju dana. Titri virusa, izraženi kao log 10. su kvantifikovani na MEF ćelijama standardnom tehnikom plaka na inficiranim tkivima uzetim nedelju dana posle infekcije i tretmana. Nivoi citokina (pg/ml) u supernatantima kultura ćelija slezine su određeni ELISA testom. Stupci označavaju standardne greške.<*>P < 0.05. miševi tretirani sa Ta1 prema netretiranim miševima. Prikazani su rezultati iz 3 nezavisna eksperimenta.

Slika 5

Timozin alfa 1 je delotvoran u kombinaciji sa GCV.

[0048]BALB/c ili C57BL6 miševi su inficirani sa 10<*>ili 5x10" PFU MCMV. respektivno. Titri virusa, izraženi kao log 10. kvantifikovani su na MEF ćelijama standardnom tehnikom plaka na plućnim tkivima, uzetim 7 dana posle infekcije. Ta1 (200 ug/kg/dnevno davano je nedelju dana) i/ili GCV (40 mg/kg. davano je tri puta nedeljno) su primenjivani počevši od dana infekcije. Nivoi citokina (pg/ml) u supernatantima kulture ćelija slezine (7 dana) su određeni sa ELISA testom. Stupci označavaju standardne greške.<*>P <0.05. tretirani prema netretiranim miševima. Prikazani su rezultati iz 3 nezavisna eksperimenta.

Slika 6

To. 1 je delotvoran u kombinaciji sa PTX3 kod mišje citomegalovirusne infekcije

[0049]C57BL6 i BALB/c miševima dobijenim ukrštanjem u srodstvu ubrizgano je intraperitonealno (i.p.) 1 x 10"s (BALB/c) ili 5 x 10!' (C57BL6) tačaka gde su se formirali plakovi (engl. plaque forming units, skr. PFU) MCMV. Titri virusa su kvantifikovani na MEF ćelijama sa standardnom tehnikom plaka na tkivima koja su uzeta jedan dan posle tretmana. Tretmani su bili izvedeni kao što sledi: primenjeni su To1 (200 mg/kg/ip) i PTX3 (1 mg/k/ip) (SIGMA-Tau, Pomezia, Rim, Italija) 7 uzastopnih dana počevši od dana infekcije. Kontrole su primile peptidni analog. Svi organi neinficiranih životinja su bili negativni na viruse. Titri virusa su izraženi kao log 10 (srednja ± standardna greška. SE).

PRIMER 1

Materijali i metode

[0050] Miševi.Divlji (engl. wild-type, skr. WT) C57BL6 i BALB/c miševi, dobijeni ukrštanjem u srodstvu, stari od 8 do 12 nedelja nabavljeni su od Charles River Breeding Laboratories (Calco, Italija). Miševi (na C57BL6 osnovi), kojima su nedostajali parovi homozigota TLR9-(TLR9-/-), TLR4-(TLR4-/-) i MyD88-(MyD88-/-). odgajeni su pod specifičnim uslovima bez patogena u objektima za gajenje Univerziteta Peruđa. u Perudi, Italija. Eksperimenti su izvedeni prema protokolima koje je odobrio komitet u čijoj su nadležnosti životinje i u skladu sa Direktivom Saveta Evropske Ekonomske Zajednice, kao i odgovarajućim metodologijama za negu i upotrebu životinja.

[0051] Virus,infekcija i tretmani. Uzorci Smitovog soja MCMV iz ekstrakata pljuvačnih žlezda pripremljeni su od BALB/c miševa, pa su titrovani standardnom tehnikom plaka na BALB/c mišjim embrionskim fibroblastnim (MEF) ćelijama (J. Gen. Virol. 2002; 83:2983-2993) . Miševima je intraperitonealno (i.p.) ubrizgano 1 x 10<!>>(BALB/c) ili 5 x 10<5>(C57BL6) tačaka gde su se formirali plakovi (PFU) MCMV. Titri virusa su kvantifikovani na MEF ćelijama standardnom tehnikom plaka na tkivima koja su bila uzeta u različitim vremenskim trenucima. Tretmani su izvedeni kao što sledi: nabavljeni su timozin alfa 1 i polipeptidni analog (oba nabavljena od SciClone Farmaceutcals. San Mateo. CA) u vidu prečišćenih (nivoi endotoksina su bili <0,03 pg/ml, određeno pomoću standardnog testa limulus lizata) sterilnih, liofiliziranih, acetilovanih polipeptida. Sekvence su bile kao što sledi: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-lle-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-0 (Ta1) i Ac-Ala-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-Glu-Thr-Ser-Ser-Glu-lle-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-OH (peptidni analog). Liofilizirani prahovi su rekonstituisani u sterilnoj vodi, pa je po 200 ug/kg/i.p. dnevno davano tokom 7 ili 14 uzastopnih dana počevši od dana infekcije. Ganciklovir (GCV) (Cvmevene: nabavljen od Recordati, Milan, Italija) je davan u količini od 40 mg/kg/i.p.. tri puta nedeljno, svakog drugog dana, počevši od 6 h posle infekcije. Kontrole su primile peptidni analog ili samo razređivač.

[0052] Generisanje DC podskupa.DC su dobijene kultivisanjem 10<6>/ml BALB/c ćelija koštane srži u Iskoveovom modifikovanom medijumu. koji je sadržao 10% filtriranog goveđeg seruma, 50 uM 2-merkaptoetanola. natrijum piruvat (1 mM). 2 mM L-glutamina. HEPES (10 mM) i 50 pg/ml gentamicina u prisustvu 150 U/ml mišjeg rGM-CSF (Sigma) i 75 U/ml rlL-4 (R&D Systems) tokom 7 dana da bi se dobile CD11b+DC ili 200 ng/ml FLT3-L (lmmunex Corporation, Sijetl, WA), tokom 9 dana da bi se dobile pDC. Finalno sazrevanje je ostvareno dodavanjem 1 pg/ml LPS ili 2 pg/ml citozin fosforotioat-gvanin oligodeoksinukleotida (CpG-B ODN 1668) (Coley Pharmaceutical Group. Wellesley. MA) tokom dodatnih 24 h CD11b+DC ili pDC, respektivno (Blood 2003; 102: 3807-344: 3814) CD11b+DCsu bile diskriminisane na osnovu visoke ekspresije CD11 i kao distinktivno je utvrđeno da su ih sačinjavale CD8a+ DC i CD11b+ DC. pDC su definisane kao CD11clow. Ly6C+, CD8a+/- ćelije. Fotografije su snimljene korišćenjem Microscopy Color Camera AxioCam sa visokom rezolucijom, uz upotrebu the AxioVision Software Rel. 3.1 (Carl Zeiss S.p.A., Milano, Italija).

[0053] Analiza protočnomcitometrijom. Posle blokiranja FcR-ova sa anti-CD 16/32 (2.4G2) antitelom, ćelije su bile analizirane u pogledu ekspresije antigena sa FACScan protočnim citofluorometrom (Becton Dickinson. Mountain View, CA) koji je bio snabdeven sa CELLOuestTM softverom. Kontrolno bojenje ćelija sa irelevantnim Ab je upotrebljeno da bi se dobile vrednosti pozadinske fluorescencije. Ab-ovi su nabavljeni od proizvođača PharMingen.

[0054] Tehnika plaka.Tehnika plaka je sprovedena na ćelijama koje su gajene do subkonfluencije, pa su zatim inkubirane sa serijski razređenim uzorcima virusa tokom 2 h na 37°C (10). Svi organi neinficiranih životinja bili su negativni na viruse. Titri virusa su bili izraženi kao log 10 (srednja + standardna greška. SE).

[0055] Inhibicija replikacijevirusa. DC (10<B>/po bunarčiću) su bile prethodno inkubirane tokom 2 h na 37°C sa 50 pg/ml timozina alfa 1 razređenog sa DMEM bez seruma, a onda im je dodato 10<5>PFU MCMV. Infektivnost je bila merena 48 h kasnije.

[0056] Citotoksična aktivnost NKćelija. NK ćelije, prečišćene iz slezina sa DX5 mikroperlama (Miltenvi Biotec), bile su definisane kao NK1.1+CD3-ćelije. NK citolitička aktivnost je bila određena na YAC-1 limfoma ćelijama markiranim, odnosno obeleženim sa 51 Cr(Blood 2005; 106:4397-4406).

[0057] Imunoblot analiza IRF7.DC su bile izložene dejstvu od 2 do 50 ug/ml timozina alfa 1 ili 10<5>PFU MCMV, bilo same ili u kombinaciji. Jedarni ekstrakti su bili pripremljeni sa NE-PER jedarnim i citoplazmatičnim ekstrakcionim reagensima (Pierce. Celbio S.r.L Milano, Italija), a koncentracija proteina nuklearnih ekstrakata je određena sa BCA-200 kitom za testiranje proteina (Pierce) prema uputstvu proizvođača. Jedarni sadržaj IRF7 je bio određen sa VVestem blotom korišćenjem zečjeg anti-IRF7 (H246) antitela i goveđe anti-zečije-ren peroksidaze (Santa Cruz Biotechnologv). Vizualizacija je izvršena sa ECL VVestern bloting sistemom za analizu proizvođača Amersham i sa Kodak Biomax filmovima.

[0058] RT-PCR urealnom vremenu za kvantifikaciju iRNK (engl.mRNA).RT-PCR test visoke osetljivosti je upotrebljen za amplifikaciju 356-bp segmenta MCMV glikoproteina B (gB) DNK iz celokupne ćelijske RNK (51). Sinteza i PCR kDNK su izvršeni kao što je opisano (Blood 2003; 102:3807-344 3814). Sintetički DNK oligonukleotidni prajmeri su bili izabrani iz objavljene sekvence MCMV gB gena (17). Smisaoni prajmeri su bili bazirani na kDNK br. 2416-2443: 5- AAG-CAG-CAC-ATC-CGC-ACC-CTG-AGC-GCC-S'. a antismisaoni prajmeri na br. 2745-2772: 5,-CCA-GGC-GCT-CCC-GGC-GGC-CCG-CTC-TCG-3,. Uslovi za ciklizaciju su bili inicijalna denaturacija tokom 3 min na 95°C. što je onda bilo praćeno ciklusima od 1 min na95"C,1 min na 50°C, i 20 s na 72"C, i konačna ekstenzija tokom 10 min na 72°C. Za svaki uzorak je izvršena PCR amplifikacija na „housekeeping" p-aktin genu radi kontrole opterećenja uzorka i omogućavanja normalizacije između uzoraka, prema uputstvu proizvođača (Applied Biosvstems).

Kvantifikacija citokina pomoću ELISAi ELISPOT testova.

[0059]Nivoi citokina u supernatantima kultura sa mitogenom stimulisanih ćelija slezine (48 h stimulacije sa 10 pg/ml ConA) ili sa MCMV-pulsiranim DC (24 h) su određeni pomoću ELISE (R&D Svstems i PBL, Biomedical Lab, Milano. Italija). Granice detekcije (pg/ml) testova su bile

< 16 za IL-12 p70, < 10 za IFN-., < 3 za IL-10 i < 10 za IFN-a. NK ćelije koje stvaraju IFN su bile izbrojane pomoću ELISPOT testa na prečišćenim NK (Virus Res. 2003: 98:17-467 25).

Rezultati su bili izraženi kao srednji broj ćelija koje proizvode citokin (±SE) na 10<5>ćelija, stoje izračunato korišćenjem replikata serijskih 2-strukih razređenja ćelija.

[0060]Statističke analize. Studentov upareni t test je upotrebljen za određivanje vrednosti značajnosti u eksperimentalnim grupama (značajnost je bila određena kao P < 0,05). Podaci o preživljavanju su bili analizirani upotrebom Man-Vitnijevog U testa. In vivo grupe su se sastojale od po 6 životinja. Osim ukoliko nije drugačije navedeno, podaci predstavljaju srednju vrednost ±SE.

REZULTATI

[0061]Timozin alfa 1 štiti od MCMV infekcije. Bili su određeni efekti primene timozina a1 u akutnoj primarnoj MCMV infekciji bilo kod podložnih, odn. nerezistentnih (BALB/c) ili kod rezistentnih (C57BL6) miševa. Miševi su bili inficirani sa subletalnom dozom MCMV, pa su zatim tretirani sa timozinom alfa 1 ili GCV. a onda su bila određena titarska opterećenja u slezini, plućima, jetri i pljuvačnim žiezdama u različitim nedeljama posle infekcije titracijom sa standardnom tehnikom plaka. MCMV se replikovao sa višim titrima u visceralnim organima nerezistentnih (Slika 1a) nego rezistentnih (Slika 1b) miševa, a naročito u ranoj fazi infekcije. Timozin alfa 1, koji je primenjivan u količini od 200 ug/kg tokom 7 dana, ali ne i peptidni analog, značajno je smanjio virusno opterećenje u različitim visceralnim organima, i kod nerezistentnih i kod rezistentnih miševa. Efekat je bio sličan onome od GCV i bio je viši kada je timozin alfa 1 primenjivan tokom 14 dana. Kod rezistentnih miševa, efekat timozina alfa 1 je bio naročito evidentan u pljuvačnim žiezdama i jetri (Slika 1b). Timozin alfa 1 je takođe značajno smanjio virusno opterećenje kod BALB/c miševa inficiranih sa višim PFU (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati su pokazali da timozin alfa 1 ima terapeutska dejstva kod MCMV infekcije.

[0062]Timozin a1 obnavlja reaktivnost NK i promoviše produkciju citokina kodMCMVinfekcije. Ly49H NK ćelije imaju presudnu ulogu u kontroli MCMV infekcije putem različitih mehanizama, uključujući recipročnu regulaciju CD8a+DC (4). Određivan je efekat timozina alfa 1 na ekspresiju i funkcionalnu aktivnost NK ćelija u slezini sa miševa inficiranih sa MCMV. Slika 2 prikazuje jednonedeljni tretman sa timozinom alfa 1, koji nije uticao na ekspanziju CD4+ ili CD8+ T ćelija (Slika 2a). a ekspandovao je NK1.1+ NK ćelije (Slika 2b). NK ćelije su bile u potpunosti aktivirane, što je utvrđeno putem povećanja ekspresije aktivacionog markera CD69 (Slika 2c). Frekvencija ćelija koje proizvode IFN-.- i citotoksična aktivnostex- vivoprečišćenih NK ćelija slezine bile su regulisane značajno naviše posle tretmana sa timozinom alfa 1 (Slika 2d).

[0063]Timozin a1 promoviše virusnu infekciju, aktivaciju IRF7 i produkciju citokina u pDC. Pošto je rana aktivacija NK ćelija kod MCMV infekcije posredovana sa IFN-a/B, koji promoviše citotoksičnost i proliferaciju NK ćelija, i IL-12 koji indukuje produkciju IFN (Nat. Immunol. 2001; 2: 1144-1150; An. J. Immunol. 1996. 156. 1138-1142). određivanje model produkcije citokina sa podskupovima DC izloženim MCMV u prisustvu timozina alfa 1. Akutna infekcija sa MCMV je indukovala prolaznu, ali izraženu imunosupresiju kod nerezislentnih BALB/c miševa, koja može biti u vezi sa infekcijom CD11b+DC (Nat. Immunol. 2001; 2: 1077-1084). CD11b+DC podržavaju produktivnu infekciju sa MCMV i in vitro, i in vivo (Nat. Immunol. 2001; 2: 1077-1084), dok se MCMV ne replikuje u pDC (J. Exp. Med. 2003; 197:885-898; J. Exp. Med. 2002; 195:517-528). Podskupovi CD11b+DC ili pDC koji potiču od koštane srži neinficiranih miševa su bili ponovo sortirani, pa je direktno bio određen efekat timozina a1 na produkciju citokina i na replikaciju virusa u različitim DC podskupovima. U skladu sa prethodnim studijama (Nat. Immunol 2001:2: 1077- 1084; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101:3516-3521). MCMV su se replicirali u CD11b+DC. ali ne i u pDC Interesantno je da timozin a1 nije uticao na replikaciju virusa u CD11b+DC. ali je aktivno promovisao u pDC (Slika 3a). Poznato je da HCMV pobuđuje koordinisani ćelijski odgovor, odnosno reakciju koja obuhvata privremenu aktivaciju IRF3 i IRF7 koja rezultuje akumulacijom ovih faktora u jedru. Pošto je IRF7 glavni regulator antivirusnog lipa 1 IFN piodukcije u pDC. onda su nivoi nukleusne IRF7 ekspresije u oba DC podskupa posle izlaganja virusu i/ili timozinu alfa 1 bili određeni imunoblotiranjem sa anti-IRF7 antitelom. Uočena je translokacija IRF7 bilo posle izlaganja virusu ili timozinu alfa 1, bilo samom ili u kombinaciji u pDC, ali ne u CD11b+DC (Slika 3a). Takođe je uočena IRF3 fosforilacija i translokacija i utvrđeno je da je aktivirana u CD11b+DC posle izlaganja samo virusu ili zajedno sa timozinom o1, ali nije detektovana u pDC (podaci nisu prikazani). Sto se tiče produkcije citokina. oba DC podskupa su stvarala IFN-a i IL-12p70 kao reakciju na virus, kao što je već poznato, mada pDC više nego CD11b+DC. Međutim, prethodni tretman pDC sa timozinom alfa 1 je značajno povećao IFN-a, pri čemu nije uticao na produkciju IL-12p70. Posebno je interesantno da je timozin alfa 1 je blago promovisao IFN-a sa CD11b+DC (Slika 3b). Ovi podaci predstavljaju dokaz da timozin a1 promoviše antivirusni program zavisan od IRF7-a u pDC. Da bi se korelisao model produkcije citokina in vitro sa onom koja se odvija in vivo. bila je merena produkcija IL-12p70, IFN-a, IFN- i IL-10 u supernatantima kultura ćelija slezine BALB/c miševa sa MCMV infekcijom i tretiranih sa timozinom alfa 1. Utvrđeno je da tretman sa timozinom alfa 1 značajno povećava produkciju IFN-a i IFN-. a naročito u prvim nedeljama infekcije. IL-12p70 se takođe blago povećao odmah posle tretmana, da bi se posle toga smanjio. Ovi efekti se mogu uporediti sa onima koji se dobijaju sa GCV. Interesantno je da timozin alfa 1 takođe dramatično povećava produkciju IL-10 (Slika 3c). Zajedno posmatrani, ovi podaci pokazuju da timozin alfa 1 podstiče aktivaciju procesa zavisnog od IFN-a/IFN209 kao reakciju na MCMV.

[0064]Timozin a1 aktivira proces zavisan od TLR9/MyD88. Delotvorni anti-MCMV imuni nadzor zahteva funkcionalne TLR signale a naročito TLR9/MyD88 signalni proces ima krucijalnu ulogu za antivirusni program zavisan od IRF7 (27) i brz MCMV klirens, dok izgleda da TLR2, TLR3, i TLR4 ne igraju značajnu ulogu (J. Immunol 2005: 175:6723- 6732). Da bi se odredila uloga TLR za dejstvo timozina alfa 1 kod infekcije. TLR-deficijentni miševi su bili zaraženi sa MCMV, pa su onda tretirani sa timozinom alfa 1 i praćena je replikacija virusa kod njih. U skladu sa publikovanim podacima (J. Immunol. 2005: 175:6723-6732). TLR9-/-, a naročito, MyD88-/- miševi su bili podložniji MCMV nego C57BL6 miševi, dok deficijencija TLR4 nije značajno uticala na otpornost miševa (Slika 4a). Timozin alfa 1 je bio delotvoran kod C57BL6 i kod TLR4-/- miševa, ali je bio u potpunosti nedelotvoran kod TLR9-/- i MyD88-/- miševa, pri čemu ovaj nalaz sugeriše da je kod antivirusne aktivnosti timozina alfa 1 uključena signalizacija zavisna od TLR9/MyD88. Ovde se ponovo naglašava da je efikasnost timozina alfa 1 direktno korelisana sa produkcijom IFN-a, više nego sa IL-12p70. i IFN-, čiji nivoi su značajno porasli u supernatantima splenocita C57BL6 i TLR4-/- miševa, ali ne i TLR9-/- ili MyD88-/- miševa (Slika 4b).

PRIMER2

Timozin alfa 1 deluje sinergistički u kombinaciji sa GCV.

[0065]Primenom metoda koje su opisane u primeru 1. utvrđeno je da bi timozin alfa 1 mogao delovati u kombinaciji sa GCV. Za tu svrhu, nerezistentni ili rezistentni miševi inficirani sa MCMV bili su uporedno tretirani tokom jedne nedelje sa GCV i/ili timozinom alfa 1, pa su im bili određeni titri virusa i modeli produkcije citokina. Dobijeni preliminarni rezultati su pokazali da je ova kombinacija sinergistička u smanjenju titara virusa u plućima kod oba tipa miševa i da promoviše produkciju IFN-a i IFN-T.

PRIMER3

Timozin a1 deluje sinergistički u kombinaciji sa PTX3

[0066]Primenom metoda koji su opisani u primeru 1. bilo je utvrđeno da bi timozin alfa 1 mogao delovati u kombinaciji sa PTX3.

[0067]Za ovu svrhu, nerezistentni (BALB/c) ili rezistentni (C57BL6) miševi inficirani sa MCMV bili su sekvencijalno tretirani tokom jedne nedelje sa PTX3 i/ili timozinom alfa 1, pa su im bili određeni titri virusa u plućima. Rezultati (Slika 6) su potvrdili da kod oba tipa miševa i sam agens smanjuje titre virusa u plućima. Pored toga je iznenađujuće da je i kod nerezistentnih, i kod rezistentnih miševa kombinacija aktivnih sastojaka ispoljila neočekivani sinergizam, u pogledu restrikcije replikacije virusa, i u pogledu produkcije IFN-a i IFN-g, IL-12p70 i IFN-g.

[0068]Predmetni pronalazak se odnosi na terapeutsko pakovanje za davanje, ili za primenu za davanje pacijentu koji treba da se leči od virusne bolesti (ili za inhibiciju aktivacije virusa), koje sadrži jednu ili više pojedinačnih doza. a svaka pojedinačna doza sadrži količinu timozina alfa 1, i eventualno količinu dugog pentraksina PTX3, koja je pri takvom periodičnom davanju jedne ili više pomenutih pojedinačnih doza delotvorna za lečenje. na primer, HCMV; i gotov farmaceutski kontejner za njih. pri čemu pomenuti kontejner dalje sadrži ili obuhvata oznaku ili etiketu koja ukazuje na to da je timozin cd. i eventualno dugi pentraksin PTX3, namenjen za lečenje pacijenata, na primer. sa HCMV.

[0069]Dodatno tome, predmetni pronalazak se odnosi na proizvod koji sadrži ambalažni materijal i timozin alfa 1, i eventualno dugi pentraksin PTX3. koji su smešteni u pomenutom ambalažnom materijalu, pri čemu je dugi pentraksin PTX3 terapeutski delotvoran za lečenje HCMV, i pri čemu ambalažni materijal sadrži etiketu koja ukazuje na to da se dugi pentraksin PTX3 može primeniti za lečenje HCMV.

[0070]Prema predmetnom pronalasku timozin a1 i eventualno dugi pentraksin PTX3 mogu se davati u odvojenim farmaceutskim oblicima ili u jednom farmaceutskom obliku koji sadrži aktivne sastojke i eventualno razređivač ili ekscipijense koji su farmaceutski prihvatljivi.

[0071]Prema predmetnom pronalasku kada se timozin alfa 1. i eventualno dugi pentraksin PTX3, daju u odvojenim farmaceutskim oblicima (t). u 2 različita davanja), onda se pomenuti aktivni sastojci mogu davati uporedno (tj. u istom trenutku) ili uzastopno prema rasporedu koji je sugerisan na gore navedenoj etiketi.

[0072]Pri upotrebi prema predmetnom pronalasku, izrazi "lečiti" ili "lečenje" imaju svoja uobičajena značenja koja uključuju prevenciju, prohibiciju (sprečavanje), ublažavanje, inhibiranje, poboljšanje, zaustavljanje, blokiranje, usporavanje ili reverziju progresije, aktivacije ili redukcije ozbiljnosti virusne bolesti.

[0073]Kada se koristi prema predmetnom pronalasku, izraz "delotvorna količina" se odnosi na količinu jedinjenja kojom se može ostvariti željeni rezultat. Na primer. delotvorna količina timozina alfa 1, i eventualno dugog pentraksina PTX3. koja se daje u cilju lečenja virusne bolesti je količina koja je dovoljna za prevenciju, prohibiciju, ublažavanje, inhibiranje, poboljšanje, zaustavljanje, blokiranje, usporavanje ili reverziju progresije, aktivacije ili redukcije ozbiljnosti pomcnute virusne bolesti, a dnevna doza koja treba da se daje zavisi od procene lekara koji je primarno nadležan, od telesne težine subjekta, uzrasta i opšteg zdravstvenog stanja pacijenta.

[0074]Predmetni pronalazak takođe obuhvata metode korišćenja farmaceutskih formulacija, koje sadrže, kao aktivni sastojak, timozin alfa 1. i eventualno dugi pentraksin PTX3 ili ganciklovir, zajedno sa farmaceutskim nosačima. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti tehnike poznaje takve formulacije i njihovo pripremanje, vidi, npr. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16. izdanje. 1980).

[0075]Formulacije se prvenstveno formulišu u pojedinačne farmaceutske oblike farmaceutskog sastojka. Izraz "pojedinačni farmaceutski oblik" odnosi se na fizički diskretne oblike koji su podesni kao pojedinačne doze za humane subjekte, pri čemu svaki oblik sadrži unapred određenu količinu timozina alfa 1 i eventualno dugi pentraksin PTX3, koja je određena tako da se ostvari željeno terapeutsko dejstvo. zajedno sa podesnim farmaceutskim ekscipijensom.

[0076]Timozin alfa 1. a eventualno i dugi pentraksin PTX3 se mogu davati u obliku farmaceutske kompozicije sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili ekscipijensima, čija proporcija i priroda su određeni rastvorljivošću i hemijskim svojstvima jedinjenja u izabranim nosačima i/ili ekscipijensima. izabranim načinom primene i standardnom farmaceutskom praksom.

[0077]Farmaceutske kompozicije se pripremaju na način koji je dobro poznat u oblasti farmacije, vidi, npr. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16. izdanje, 1980).

[0078]Nosač ili ekscipijens može biti čvrsti, polučvrsti ili tečni materijal, koji može služiti kao nosač ili medijum za aktivni sastojak. Podesni nosači ili ekscipijensi su dobro poznati iz stanja tehnike. Farmaceutska kompozicija može biti prilagođena za oralnu, inhalacionu, parenteralnu, ili topičku primenu i može se davati pacijentu u obliku tableta, kapsula, aerosola, inhalanata, supozitorija, rastvora, suspenzija, lipozoma ili sličnog.

Claims

1. Primena timozina a1. za dobijanje leka za prevenciju i/ili lečenje herpes virusnih bolesti kod subjekta koji je sisar

2. Primena prema zahtevu 1, pri čemu \ e timozin alta 1 u kombinaciji sa dugim pentraksinom PTX3.

3. Primena prema zahtevu 1. pri čemu je herpes virus citomegalovirus (CMV).

4. Primena prema zahtevu 1 ili 2, za lečenje sindroma prouzrokovanog citomegalovirusom, pri čemu: pomenuti sindrom je CMV mononukleoza. pomenuti sindrom je vezan na domaćina sa kompromitovanim imunitetom; pomenuti domaćin sa kompromitovanim imunitetom ima AIDS; pomenuti domaćin sa kompromitovanim imunitetom je primalac transplantacije organa.