PT87763B

PT87763B - Processo para a preparacao de peptiolidos ciclico

Info

Publication number: PT87763B
Application number: PT87763A
Authority: PT
Inventors: Roland Wenger; Michael Morris Dreyfuss; Hans Tscherter; Alexander Haslberger
Original assignee: Sandoz Sa
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1992-10-30
Also published as: EP0296123B1; PH25933A; DE3851268T2; IL86789A0; KR970010928B1; HU204101B; DE3851268D1; NZ225071A; AU1812488A; PT87763A; US5116816A; HUT50220A; FI87928B; ATE110784T1; AU623078B2; JPS6425798A; KR890000518A; IE881838L; MY103735A; IE64008B1

Description

para

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PEPTÓLILOS CÍCLICOS que apresenta

SANDOZ, S.Á., suiça, industrial, com sede ea Basileia, Suiça

RESUMO

A invenção refere-se ao processo para a preparação de peptólidos cíclicos tendo a estrutura de uma ciclosporina na qual a ligação de amida é substituída por uma ligação de éster obtida por fermentação da estirpe de fungos do género Cylindrotrichum Bonorden, ou por ciclização de um hidroxi-undecapéptido. Os peptólidos cíclicos têm propriedades imunosupressivas, anti-inflamatórias e anti-parasíticas.

A presente invenção referè-se a novos peptólidos úteis como fármacos.

termo peptólido é usado para designar um composto natural ou sintético compreendendo of-hidróxi ácidos e <\-amino ácidos, ligados entre si tanto por ligações amida como éster. Logo, a estrutura obtida pela substituição por uma ligação amida por uma ligação éster num péptido denomina-se peptólido.

Uma classe importante de péptidos é constituída pelas ciclosporinas que se caracterizam por possuírem uma estrutura cíclica compreendendo normalmente resíduos de 13 aminoácidos, um dos quais é o resíduo M-metil-(4R)-4-but-

-2E-en-l-il-4-metil-(L)-treonil, designado por MeBmt, ou um seu derivado. Muitas ciclosporinas têm propriedades farmacológicas, particularmente, propriedades imunossupressoras e anti-inflamatórias. A primeira ciclosporina a ser isolada foi a ciclosporina A produzida naturalmente por metabolismo fúngico, (Ciclosporin) disponível comercialmente sob a marca registada de Sandimmune ® . Este composto tem a estrutura indicada na fórmula I

I

-MeBmt-Abu-Sar-MeLeu-Val-Meleu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal1234 56 7 8 9 10 11

Na Tabela II, encontra-se uma lista completa das abreviaturas usadas na presente memória descritiva.

Por convenção, os resíduos de aminoácidos das ciclosporinas são numerados no sentido do movimento dos ponteiros do relógio começando a partir do resíduo de MeBmt.

Todos os /^-aminoácidos têm a configuração (l) a menos que seja indicado doutra forma; assim na fórmula I a alanina na posição 8 tem a configuração (D). 0 símbolo Me antes da abreviatura dum aminoácido significa que o resíduo do aminoácido é N-metilado no azoto da ligaçao amida,

A presente invenção refere-se a um peptólido cíclico, o qual tem a estrutura de uma ciclosporina na qual uma ligação amida é substituída por uma ligação éster.

Preferivelmente, o peptólido cíclico é composto por um resíduo de MeBmt ou um seu derivado, 9 outros resíduos de of-aminoácidos e um resíduo de cy-hidroxiácido, o qual se localiza de preferência na posição 8.

Os derivados preferidos de MeBmt são o derivado de

8' hidroxi (8’-OHMeBmt) e o derivado dihidro saturado

MeBmtH^, tendo as estruturas abaixo representadas

Os peptólidos cíclicos preferidos de acordo com a presente invenção tem a estrutura indicada na fórmula II

-W - Thr - X - Y - Z - Meleu - Ala - A - Meleu - leu - MeVál· 12 3456 7 89 10 11

II na qual

W é MeBmt, 8’-0HMeBmt ou MeBmtHg,

X é Sar ou Gly,

Y é Meleu ou leu,

Z é leu, Ile ou Vai, e

A é o resíduo de um ácido e--hidroxicarhoxílico preferivelmente de fórmula III

R

- 0 - CH - CO - III na qual R é alquilo em Cj_^.

De preferência, na fórmula III, R é isopropilo, de

i maneira que A representa

CH /°^Η3 ‘CH — 0 — CH — CO o resíduo do ácido tX-hidroxi-isovalérico, é abreviado por Hiv. 0 composto de maior preferência de acordo com a invenção é aquele no qual, na fórmula II, W é MeBmt, X é Sar, Y é Meleu, Z é leu e Ae (D)Hiv. Este pode ser representado pela fórmula estrutural completa como se representa na fórmula IV

Cd

Α ο — co a

o co Α ο-Α ro

A 0=0 o I co t I

A A w 0—0—0 A Cd

CM

Α A 0—0

0=0 / \ ro

A o

aoPi

A—A

A

O A A co A o—te co a

o \

0=0

A A 0-0 A

CO

CO a

o

CO

A > O-A

I

O o Cd I A A A 0-0-0 ro

A

O

O·

co

A

O c / A A A o—o—o

CO

A

O \α^γ

A—A

I o A A A lp> A 0—0—0

0=0

CO A

A—O vo ro

O co

A

O

CO

A o

CO

A

O

Cd

A A A* o—o— c

CO o

A—A r- A

CO A A 0—0 I o

o cr«

A

O I

Cd

A

O

I

A o

o co

A

O

CO

A o

J ou usando a actual nomenclatura convencional para as ciclos porinas, baseada na estrutura da Ciclosporina (Ciclosporina A) representada na fórmula I. Esta nomenclatura é feita listando por ordem cada resíduo existe na molécula o qual difere daquele encontrado na ciclosporina e adicionando o termo Ciclosporina. Assim, o composto de fórmula IV pode representar-se como i

I ί (Thr)² (Leu)^ (L-Hiv)⁸ (leu)¹⁰ - Ciclosporina í | ί isto é, uma ciclosporina na qual Thr substitui Abu na posii ção 2, leu substitui Vai na posição 5, (D)Hiv substitui (D)Ala na posição 8 e Leu substitui MeLeu na posição 10, sendo os outros resíduos idênticos aos da Ciclosporina.

' Os péptidos cíclicos de acordo com a presente inI ; .

venção podem ser produzidos através da cultura de uma βει pécie de microrganismos produtores num meio nutriente. Os ι microrganismos preferidos são os de espécies de fungos do género Cylindrotrichum Bonorden, particularmente da espécie i; NRRL 18230, que produz ciclopeptólidos cíclicos de fórmula

I!

( II.

A estirpe foi isolada a partir de uma amostra de ί folhas de Waldenburg no Jura Suísso e uma cultura viável ; da estirpe foi depositada em 17 de Junho de 1987 no Deparj tamento da Agricultura dos E.U. (Região Norte Central, i! Northern Regional Research Centre), Reoria, 111 e foi-lhe i dado o n5. de referência NRRL 18230.

( A cultura pode também ser obtida através da Sandoz ii _z ii Ltd., Basileia, Suissa.

| I í I ;i A estirpe fúngica NRR1 18230 é um hifomiceto e, quando incubado a 21-24°C em 2% de extracto de malte/agar (=KA; 2% de extracto de malte, 0,4% de extracto de levedura, 2% de agar em água desmineralizada) produz conídios asseptatos ou frequentemente conídios hialinos 1-septatos baci-

liformes, com 6-15 >u x 1,5-2,7 M (na maior parte das vezes

9,5-13,5 u) de comprimento.

As células conidiogénicas são geralmente cilíndricas e têm um colarete bem distinto; algumas células têm um aspecto simpodial-polifialídicas. Le acordo com a chave de identificação de Μ. B. Elles (Dematiaceous Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 1971), a espécie pode ser melhor classificada no género Cylindrotrichum Bonorden.

A espécie fúngica NRR1 18230 cresce relativamente devagar e após 10 dias de incubação à temperatura de 21°C forma colónias com 4-7 mm de diâmetro com micélio aéreo cinzento aveludado. A temperatura óptima de crescimento é entre os 18°C e 27°C e a cerca de 33°O não ocorre crescimento.

micélio aéreo ramificado e septato das colónias cultivadas em MA a 21°C tem geralmente 1,5-3,5 (usualmente 2-3 /i) de largura; no substrato, podem observar-se hifas do micélio, com até 5,5 /u de largura.

A invenção proporciona também caldos de fermentação obtidos por cultura do género de fungos Cylindrotrichum Bonorden. A nova estirpe NRR1 18230 pode ser cultivada por um processo superficial aeróbio ou por um processo de imersão a temperaturas adequadas numa variedade de meios nutrientes compreendendo os nutrientes e minerais na forma usual.

Assim, o meio nutriente deve conter um forte assimilável de carbono e opcionalmente sais minerais e factores de crescimento. Todos estes constituintes podem ser adicionados na forma de compostos simples bem definidos ou sob a forma de misturas complexas obtidas através de fontes biológicas. A cultura é levada a cabo com métodos convencionais e os peptólidos cíclicos que se formaram durante a fermentação podem finalmente ser isolados do meio de cultura pelo

uso de métodos cromatograficos conhecidos. Os peptólidos cíclicos da invenção podem também ser obtidos por cultura de estirpes variantes ou mutadas obtidas por selecção ou ί por acção de agentes de indução de mutações, por exemplo,

I luz U.V., raios-X ou mutagénicos químicos sobre NRRL 18230 ou outras estirpes de Cylindrotrichum Bonorden.

Os peptólidos cíclicos da presente invenção podem í , z z Z também ser preparados através de métodos sintéticos ou semi-sintéticos, por exemplo, pela ciclização de um peptólido linear ou de um peptido linear tendo um grupo terminal -OH no lugar de um grupo terminal -NHg, ou pela substituição í de uma ligação amida numa ciclosporina natural, sintética ou semi-sintética por uma ligação ester.

À síntese total dos compostos preferidos de fórmula II pode ser levada a cabo duma maneira análoga às sínteses totais da ciclosporina A e análogas como se descreve, por exemplo, na Patente Europeia N². 34 567 ou por R. Wenger ji em Transplantation, vol. XV pág. 2230-2241 (1983). De acor![ do com este método, o heptapeptídeo C-protegido tendo a i fórmula V

I

W - Thr - X - Y - Z - Meleu - Ala - OBz V í

2 3 4 5 6 7 : na qual Bz é o grupo benzilo e W, X, Y, Z como se definiu acima é preparado em primeiro lugar e depois feito reagir

I com um tetrapéptido correspondendo à sequência 8 a 11.

Este tetrapéptido, de fórmula VI

HO - A - Keleu - leu - MeVal VI

10 11 compreende três ligações de péptidos normais, mas tem um

grupo O-terminal no lugar de um N-terminal, visto que o resíduo na posição 3 deriva de um x-hidroxi ácido de preferêr cia a um •x-aminoácido.

tetrapéptido pode esquema que se representa no ser preparado de acordo com o seguinte diagrama de fluxo:

BOC - KeLeu + leu - OBz

BOC - MeLeu - leu - OBz 10

H₂/Pd

BOC - MeLeu - Leu - OH 10 + Me Vai - OBz BOC - MeLeu - Leu - MeVal - OBz

R'

MeLeu - Leu - MeVal - OBz

9		10	11
		t	+ R' - A -	OH
A -	MeLeu -	Leu - MeVal	- OBz
8	9		10 11
	1	t	H₂/Pd
A -	MeLeu -	Leu - MeVal	- OH
8	9		10 11

no qual BOC é o grupo t-butiloxicarbonilo de protecção do átomo de N e R’ e um grupo protector do 0 adequado. Assim, o reagente acima representado como R' - A - OH é um ácido c^-hidroxicarboxílico com OH protegido, o qual quando A tem a fórmula III, tem a fórmula VII

tBuSi(CHj

Os

R

R' - 0 - CH - C00H VII em que R é como se definiu acima.

Preferivelmente, o grupo R' é seleccionado de entre os grupos

C₂H₅O - CH - , CH₃OCH₂ - e compostos preferidos da fórmula VII podem ser obtidos fazendo reagir o ^-hidroxi ácido na forma como carbonilo protegido, por exemplo, na forma do éster de benzilo, com hidrofurano, etoxietileno, t-butilmetilclorossilano ou éter clorodimetílico respectivamente.

A reacção do heptapéptido com COOH-protegido V com o hidroxitetrapéptido VI, sob a forma com OH protegido, origina um hidroxi-undecapéptido linear de fórmula VII tendo a seguinte sequência desde 8 até 7.

R'-A-MeLeu-Ieu-MeVal-W-Thr-X-Y-Z-MeLeu-Ala-OBz VIII

10 11 123456 7

Finalmente, a ciclização deste hidroxipéptido linear pode ser levada a cabo por remoção dos grupos protectores por hidrólises em meio ácido e em meio básico e acoplamento de resíduos 8 a 7 com a formação de uma ligação éster. A reacção de acoplamento é preferivelmente levada a cabo em cloreto de metileno usando um reagente de carbodiimida, por exemplo, N-etil-N’-(3-dimetilamino)propil carbodiimida.

heptapéptido de fórmula V e o tetrapéptido de fórmula VI podem também ser obtidos por hidrólise controlada de peptólidos cíclicos de fórmula II a partir de fermentação.

Este tratamento com ácido trifluoroacético a baixa tempera; tura quebra a ligação entre os resíduos 11 e 1 para origi! nar um undecapeptólido compreendendo os resíduos 1 (N-teri minai) a 11 (C-terminal), com uma ligação éster em 7-8.

A hidrólise alcalina origina 1-7-heptapéptido e o 8-11-hidroxitetrapéptido. Podem-se então preparar peptóli dos cíclicos semi-sintéticos, por exemplo, fazendo reagir j o hidroxitetrapéptido produzido desta maneira com um heptapeptido sintético ou vice versa, e ciclizando o produto liI' near.

' Para o propósito de ser submetido à reacção de ci| clização o peptido pode, se assim se desejar, estar sob a forma 0-protegido, isto é, os grupos hidroxi presentes no

I i grupo Ι-MeBmt ou seus derivados, e/ou no resíduo de 2-treoi ! nina podem possuir grupos protectores, tal como se descreve j na Patente Europeia 34 567. Esses grupos de O-protecção são então removidos, subsequentemente à reacção de fechamento

I do anel por métodos habituais. Por exemplo, a remoção dum í grupo benzilo por hidrogenação pode também provocar a hidrogenação de MeBmt originando MeBmtH₉ e, em qualquer caso, os h , ciclo peptolidos inicialmente produzidos contendo um resiI ~ ί duo MeBmt na posição 1 podem ser transformados no corresponj dente composto de MeBmtHg por hidrogenação.

h j De acordo com o descrito, a invenção proporciona ! um processo para a preparação de uni peptólido cíclico de fórmula II, acima descrita, caracterizado pelo facto de compreender:

j a) a remoção dos grupos de protecção de 0 de um peptólido cíclico de fórmula II na forma O-pro!

| tegido;

í b) a ciclização de um hidroxi-endecapéptido de cadeia linear de fórmula VIII, numa forma não pro12

tegida ou de O-protegido e um ou ambos os resíduos 1 e 2, e, quando se pretenda, levando a cabo o passo do processo (a); e, quando desejado,

c) a hidrogenação de um peptólido cíclico de fórmula II assim obtido em que W é MeBmt para se obter o correspondente peptólido cíclico em que W é MeBmtl·^.

Os peptólidos cíclicos de acordo com a presente invenção apresentam actividade farmacológica e podem, portanto^ ser úteis como produtos farmacêuticos. Em particular, os compostos mostram actividade imunossupressiva, anti-inflamatória e anti-parasítica nos seguintes testes:

ENSAIOS DO MOBEBO IN VITRO (1-3)

1. Inibição da Interleucina 2 (IL-2)

A interleucina 2 é induzida por estimulação mitogénica de células de baço de rato. Os sobrenadantes de 48 horas foram recolhidos e ensaiados relativamente ao seu conteúdo em IL-2 usando uma linha de células dependente IL-2 (GTLL). 0 crescimento destas células é ensaiado ao fim de 48 horas usando um ensaioenzimático o qual mede a actividade mitocondrial.

/T. Mosmann J. Immunol. Methods 65:55-63 (1983/7

Os compostos da invenção têm um efeito inibitório a concentrações ΟΙ^θ de 0,01 a aproximadamente 0,l _zug/ml

2. Resposta Rroliferativa de Linfócitos a estimulação Alogénica - Reacção dos linfócitos à murina mista

Células de baço (0,5 x 10^) de ratos Balb/c (fêmeas, 8-10 semanas) são co-incubadas durante 5 dias com

0,5 x 10 células de baço de ratos CBA (fêmeas, 8-10 semanas), irradiadas (2000 rads) ou tratadas com mitomicina C. A irradiação halogénica de células induz uma resposta proliferativa em células de baço de Balb c, que pode ser medida por incorporação de uni percursor rotulado no DNA. Desde que as células estimuladoras sejam irradiadas (ou tratadas com mitomicina) não responderão às células de Balb/c com proliferação mas retem a sua antigenicidade.

Zr. Meo Immunological Methods, L. lefkovits e B. Pernis, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239 (197927

Os compostos da invenção têm um efeito inibitório a concentrações de ΙΟ^θ = 0,0001 a aproximadamente 0, 001 jug/ml.

3. Resposta imune humoral primária a glóbulos vermelhos do sangue de carneiro in-vitro (ensaio de Mishell-Dutton)

Células de baço de rato (OEI, fêmea, 8-10 semanas, x 10 ) são co-cultivadas com eritrocitos de ovelha 7 (SRBC, 3 x 10 ) durante 3 dias em 1 ml do volume final em 24 placas Petri. Os linfócitos são recolhidos, lavados e colocados em placas 1 x 10 células em agar soft com antigene fresco (SRBC). Um complemento (soro de porco guinea) é adicionado após um período 60-90 minutos cujo teste é avaliado por contagem das placas sob o micróscopico. Durante os 3 dias de incubação, os linfócitos estão sensíveis ao antigene (SRBC). Quan do incubados novamente com antigene, os B-linfócitos segregam anticorpos específicos que retêm o antigene na vizinhança da secreção linfócita. A adição dos complementos causa a lise dos eritrocitos co-ligados com anticorpos formando uma placa. Cada placa representa

uma simples célula produtora de anticorpos.

/R. I. Mishell & R.W. Dutton J.Exp. Med. 126:423-442 (196727

A supressão das células formando placas é observada a concentrações do composto de acordo com a invenção de IC_5Q 0,01 a aproximadamente 0,1 ug/ml.

MODELOS IN VIVO (4-9)

4. Formação de células que formam’placa (resposta imune humoral)

Ratas (OFA) são imunizadas com uma injecção i.v. de eritrócitos de carneiro (1 x 10 ) e tratados durante 3 dias consecutivos com drogas sob investigação. Uma suspensão de células de baço é preparada 6 dias depois da imunização e 1 x 10^ linfócitos são colocados em agar soft em presença de um indicador de células e complemento. A lise de células indicadoras dota a secreção de um anticorpo específico e a presença do complemento rentabiliza as placas. 0 número de placas por colocar são contadas e corrigidas para o número de placas por baço.

/N.K. Jerne & A.A. Nordin Science 140:405 (1969);

N.K. Jerne, A.A. Nordin & C. Henry (1963) In: Gell j Bound Antibodies, B. Amos & H. Koprowski, Eds., Wistar Inst. Press, Philadelphia pp. 109-125 (196327·

Os compostos de acordo com a presente invenção produzem este efeito no rato quando administrados oralmente em ED^q de aproximadamente 6,0-8,0 mg/kg.

5· Enxerto localizado-versus-reacção do hospedeiro

Células de baço (1 x 10’) de uma fêmea Wistar/Furth (V.T) de 6 semanas de idade são injectadas subcutaneamente no dia 0 na pata posterior esquerda de (F 344 x x WF)FI ratos fêmea pesando cerca de 100 g. Os animais são tratados durante quatro dias consecutivos e os tumores de linfa poplítica são removidos no 7°. dia. A diferença de peso entre os dois tumores linfáticos é tomada como parâmetro para avaliar a reacção.

/W.L. Ford, W. Burr & M, Simonsen Transplantation 10:258-266 (1970J2 composto da invenção tem um ΕΒ^θ oral, neste teste de aproximadamente 20-30 mg/Kg.

6. Artrite Adjuvante de de Freund

OFA e ratos Wistar (macho ou fêmea, 150 g de peso) são injectados i.c. na base da cauda ou na pata posterior com 0,1 ml de óleo mineral contendo 0,6 mg de Kycobacterium smegmatis liofilizadas mortas por calor. 0 tratamento começa no dia 14, quando a inflamação secundária está bem desenvolvida (dias 14-20). No fim da experiência, o inchaço nas articulações é medido por meio de um micro compasso. ΕΒ^θ é a dose oral em mg/Kg, oralidade esta que reduz o inchaço primário ou secundário) a metade dos que estão contro lados. Para os compostos da invenção ο ΕΒ^θ oral ó acima de 30 mg/Kg.

/c.a. Winter & C-.W. Nuss Arthritis e Rheumatism 9:394-404 (1966J7

7. Reacção Alográfice do rim num rato

Um rim de um rato fêmea Fisher é transplantado para o recipiente renal de um rato receptor nefrectomizado unilateralmente (lado esquerdo) usando uma anastasome de extremidade-a-extremidade. A anastomose uretérica é também de extremidade a extremidade. 0 tratamento inicia-se no dia da transplantação e continua durante 14 dias. Faz-se uma nefrectomia contralateral sete dias depois da transplantação, deixando o recipiente confiando na actuação do rim doador. A sobrevivência do receptor é tomada como o parâmetro para um enxerto funcional.

/P.C. Hiestand, et al Immunology 55 249-255 (1985/7 composto da invenção é eficiente em ratazanas a oral desde 6 a aproximadamente 9 mg/Kg.

8. UV Teste Eritema teste é levado a cabo em porcos albino guinea, de aproximadamente 150 g peso. Rapam-se ambos os flancos dos animais usando uma micro barbeadora Braun, sem causar irritação de pele. Para cada substância teste cinco animais são submetidos a uma intensidade definida de radiações UV durante 10 segundos em cada uma das quatro areas de pele (10 mm de diâmetro). Imediatamente a seguir 50 microlitros da solução de substância teste em etanol/propileno glicol/dimetilacetamida (19:19:2 v/v) é aplicada em 2 das areas irradiadas em cada animal e 50 microlitros de mistura dissolvente para os outros dois como controlo. Quatro horas após a aplicação, o grau do eritema é estimado visualmente.

/Raake, W. Arzneim.-Forsch. 34(1) N². 4 (1984/7

Os compostos da invenção são eficientes a concentrações de 1 a 10%.

9· Teste anti-malaria

Ratos (OFI, machos) são infectados i.p. no dia 0 com 0,2 ml de uma suspensão de eritrócitos contendo 10' células parasitadas por Plasmodium berghei (Strain NK 65). A substância teste é administrada s.c. varian do as dosagens usando 5 a 10 ratos/dose (MED) calculado por comparação de tempo de sobrevivência com os de controlo não tratados. Para controlo, o tempo de sobrevivência é aproximadamente 7 dias. 0 MED é a dosagem à qual o tempo de sobrevivência é duplicado.

/1. Rane em Chemotherapy and Drug Resistance in Malaria, ed. W. Peters, Academic Press, New York (1979).7

Tendo em vista a sua actividade imunossupressiva os compostos são indicados para uso na profilaxia e tratamento de condições e doenças que requerem a supressão de respostas imunitórias, por exemplo em doenças de autoimunidade,a prevenção de rejeição de tecidos na transplantação,

e.g. medula óssea e transplantação renal. Doenças específicas de autoimunidade, para as quais os compostos da invenção podem ser usados incluem: anemia aplastica, anemia dos glóbulos vermelhos, trombocitopenia idiopática, eritematoses lupus sistémica, policondrite, sceleroderma, granulomatose de Wegner, dermatomiosite, hepatite crónica activa, miastenia grave, síndrome Steven-Johnson, psoríase, psilose idiopática, doença de Crohn, oftalmopatia de Graves, sarcoidose, esclerose múltipla, cirrose biliar primária, diabetes juvenis primárias, uveite posterior, fibrose pulmonar intersticial e artrite psoriática.

Devido às suas propriedades anti-inflamatórias os compostos desta invenção são indicados no uso de tratamento í de condições inflamatórias, partioularmente estados inflaI í matórios com uma etiologia a qual inclui um componente autoimune, por exemplo o tratamento de artrites e doenças reumáticas tais como a artrite crónica progressiva.

I

Tendo em conta a sua actividade anti-parasita, os j compostos podem também ser indicados para uso em tratamen; tos de doenças parasíticas, por exemplo xistosomiase, filai riase, leixomaniose, coccidioidomicose e, em particular, malaria.

Os compostos da invenção estão também indicados |i para uso em tratamento de certas doenças dermatológicas e condições, as quais incluem, em adição às já acima referidas alopecia areata, urticária, vasculite, eritema, dermatite d atópica, eczema, eosinofiline cutânea e angioderma.

Para estas indicações uma dosagem diária situa-se : no intervalo entre 70 a cerca de 3000 mg do composto de ί acordo com a invenção, convenientemente administrada em doses divididas em 4 vezes por dia.

Os compostos da invenção podem ser administrados ' i : por um método convencional, em particular oralmente, por exemplo sob a forma de comprimidos ou cápsulas, parenteralmente sob a forma de soluções injectáveis ou suspensões ou topicamente sob a forma de loção, creme ou gel.

i i

A presente invenção desenvolve também composições farmacêuticas compreendendo um composto de acordo com a invenção em associação com, pelo menos, um transportador farj macêutico ou diiuente. Tal composição pode ser manufacturada ί de forma convencional. A forma de dosagem unidade contém, [ por exemplo, 20 mg a 1500 mg do composto de acordo com a invenção.

Os exemplos seguintes, nos quais todas as tempera-

turas se encontram em graus centígrados (°C), ilustram a invenção.

Exemplo 1

Cultura da espécie NRR1 18230 em Erlenmeyer

I

I, s ~ h As culturas iniciais da especie NRKL 18230 sao incubadas a 21° durante 14 dias em MA em tubos inclinados.A ρηέ í -cultura é então produzida por homogeneização do conteúdo total de uma cultura inicial sob condições estéreis, transai feridas para um Erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml de solução nutriente M (2% de extracto de malte, 0,4/í de extrac^!l to de levedura em água desmineralizada), e incubadas numa misI turadora rotatória a 200 r.p.m. durante 10 dias a 21°.

As misturas intermédias são então obtidas por transH ferência de 20 ml de pré-cultura, para um Erlenmeyer, de

I '

500 ml contendo 200 ml de solução nutriente M e incubadas ί numa misturadora rotatória a 200 r.p.m. durante 7 dias a , 21°.

í Finalmente para a cultura de produção, inoculam-se '' em 100 Erlenmeyers cada um contendo 200 ml de solução nui triente M com 20 ml de culturas intermediárias. Os frascos incubados a 21° numa misturadora rotatória a 200 r.p.m.

Após 10 dias os 20 litros do caldo de fermentação são com[ binados para a extracção do produto.

I h

í Exemplo 2 'i i I i ι ί Isolação de (Thr)^ (Leu)^ (Ρ-Ηίν)θ (Lenj^^-Ciclosporin

Os 20 litros das culturas médias obtidas através doi i Exemplo 1 são submetidos a corte-elevado e misturando com j | uma vareta misturadora (Lutz, Wertheim, Germany) para romper as células então extrai-se três vezes com 20 litros de

etil acetato. Os 60 litros de fase orgânica são combinados, secado em excesso com sulfato de sódio anidro e evaporado à secura sob vácuo, produzindo um resíduo de 17,4 g.

resíduo é dissolvido em 80 ml de metanol e cromatografado em uma coluna de 90 mm de diâmetro compreendendo 1300 g Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden). Fracções de 100 ml são tomadas, quando (Thr)² (Leu)⁹ (D-Hiv)⁸ (Leu)⁴'⁽⁴-Ciclosporin aparece em fracções 22-30. Estes são combinados e evaporados sob vácuo originando 8400 mg de espuma sólida colorida brilhante. Este resíduo é dissolvido e® aôdtato de etilo húnido e cromatografado numa coluna de 55 mm de diâmetro compreendendo 500 g de Kieselgel (Merck) de partículas de tamanho 0,04 - 0,063 mm. 0 desejado produto é detectado em frações 9-14 (100 ml tamanho de fracção). A evaporação origina um resíduo amarelo pálido (4200 mg). 0 tratamento com o descolorizante charcoal (Merck) em dietiléter e a filtração através de um fino leito de talco origina (Thr)^ (Leu)⁷ (D-Hiv) (Leu)^x -Ciclosporin com o aspecto de pó branco recristalizado a partir de éter m.p. 163-164° (decomp.); /5/7²° = -186°, (c = 1 em MeOH), /v/²⁰ = -223° (c = 1 em CHCl^.

Exemplos 3-7

Por modificação pelas técnicas cromatográficas acima descritas, os compostos seguintes podem ser isolados em quantidades menores através do caldo de fermentação produzido :

Ex. N2. Composto (Thr)² (D-Hiv)⁸ (Leu)¹⁰-Ciclosporin (Thr)² (Ile)⁹ (D-Hiv)⁸ (Leu)⁴⁽⁴-Ciclosporin (Thr)² (Leu)⁴ (Leu)⁹ (D-Hiv)⁸ (Leu)⁴'^í4-Ciclosporin (Thr)² (GlyP (Leu)⁹ (D-Hiv)⁸ (Leu)⁴⁽⁴-Ciclosporin (8'-OHMeBmt)¹ (Thr)² (Leu)⁹ (D-Hiv)⁸ (Leu)¹⁰-Ciclosporin

Os compostos têm as propriedades que se mostram na Tabelai

TABELA ο

CU ο

•«d00 r-1 I ο

Ο ι—I I ο

χΤ

Ρι—I I

Ο χίLP

ο ο

Ρ

ΚΙ οι Ο ίΣ,

Ρ, ε · ο χ Ο Α ο

				Ζ—X	ra
		ζ—X	z~x	o	P		P
		ο	o	Φ	φ		ra
	Ζ~X	φ	Φ	ná	-p	z-“X	ra
	ο		Ό	X_-Z	P	O	P
	φ	χ^ζ	X_z		•rd	Φ	B
	Τ3			ΡΩ	ra	tS
Ο	χ^ζ	ΡΩ	CO		X_z	'—z	Q)
ο		rs	r.				•P
	χΤ	ι—1	kO	o	00	LP
Α	kO	ΙΓ\	kD		LP	σ>	P
Β	rd	rd	ι—1	rd	rd	rd	•rd
							P
							-P
*							<u
ο							B
τζ)							O
Ρ							P
Ρ							•P
Ρ							o
Ρ							Φ
ο							A
ο	σ>	kD	kD	kD			ra
Ρ	r\	•s	Λ	«t			ω
φ	cO	Ρ-	ΡΩ	ΡΩ	ΡΩ
	ΡΩ	xj-	ΡΩ	ΡΩ	kD		Z~X
£=	CU	cu	cu	cu	CU		o
§	rd	rd	rd	rd	ι—1		•tí
							•rd
							Λ
							'P
							A
ο
rd	kD	c-	kD	kD	p-		o
Ρ							o
ο	CO		cO	CO	CO		•H
	ΡΩ		ro	cO	kD		B
te	CU	Ckl	cu	CU	CU		Ό
	rd	rd	i—1	ι—1	ι—1		P
							-<
							o
							-P
							P
							Φ
							Φ
	xf-				LP		nd
	Η	r—l	rd	rd	rd		P
	Ο	o	o	o	o		P
	Ο	o	o	o			A
	rd	rd	rd	rd	H		a
	zJ	P;	ta				o
Ρ	CU	-Φ	cu	CU			A
rd	rd	rd	rd	rd	1—1		x^-z
Ρ	rd	rd	rd	rd	rd
Β	W	w	w	w	A		A
Ρ	ΓΟ	xl-	CO	co	4		«P
Ό	kD	kD	kD	kD	kD		A
Ρ4	ο	o	O	o	O
							Φ

							o
							♦rd
							Φ

co

LP kD

Exemplo 8

Síntese de (Thr)² (Leu)⁸ (D-Hiv)⁸ (Leu)¹⁰-Ciclosporin por ciclização

À temperatura ambiente, 2,4 g (2,29 mmol de um hidroxiundecapeptídeo não protegido)

HO-(D)Hiv-MeLeu-Leu-MeVal-MeBmt-Thr-Sar-MeLeu-Leu-MeLeu-Àla

-OH,

0,84 g (6,88 mmol) de 4-dimetilaminopiridina e 0,66 g (1,5 equiv, 3,4 mmol) de N-etil-N-(3-dimetilamino)propil carbodiimida são dissolvidos em 145 ml de cloreto de metileno e reagem durante três dias com agitação e excluindo a humidade. A solução resultante é diluída com 300 ml de cloreto de metileno, misturada com 100 ml de água acidificada a pH 2 com HC1 IN, filtrado através de talco e evaporada. 0 resíduo é cromatografado em 100 g de sílica gel usando 10% ΚβΟΗ/σΗ₂Ο1₂, para dar o título do composto (2,55 g 89%). É estabelecida a identidade com o composto do Exemplo 2 por espectroscopia RMN e = -220°, (c=l em CHCl^).

Abu	TABELA II Abreviaturas ácido cx-aminobutírico
Ala	Alanina
BOC	t-butiloxicarbonil
Bz	benzil
Gly	glicina
Hiv	ácido a<-hidroxiisovalérico
Ile	isoleucina
leu	leucina
MeBmt	N-metil-(4R)-4-but-2E-en-l-il-4-metil-(L)-
MeBmtH₂	-treonina N-metil-(4R)-4-but-l-il-4-metil-(L)-treonina
8’OHMeBmt	N-metil-(4R)-4-(4'-hidroxibut-2E-en-l-il)-4-
Sar	-metil-(l)-treonina sarcosina
Thr	treonina
Vai	valina

Claims

REIVINDICAÇÕES

I^a. - Processo para a preparação de peptólidos cíclicos que têm a estrutura de ciclosporina em que uma ligação de amida é substituída por uma ligação de éster, caracterizada pelo facto de compreender a operação de se cultivar um microrganismo produtor em presença de um nutriente médio.
2^a. - Processo para a preparação de um peptélido cíclico de acordo com a reivindicação 1, de fórmula II

-W - Thr - X - Y - Z - MeLeu - Ala - A - MeLeu - Leu - MeVal123456 789 10 11

II na qual

W é MeBmt, 8'-0HMeBmt ou MeBmtl·^,

X é Sar ou Gly,

Y é MeLeu ou Leu,

Z é Leu, Ile ou Vai, e A é o resíduo de um ácido .'h-hidroxicarboxílico, caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe de fungos do género Cylindrotrichum Bonorden em presença de um meio nutritivo.
3-· - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, no composto de fórmula II, A ser (D) Hiv.
4^ê. - Processo para a preparaçao de (Thr) (Leu)^

8 10 (D-Hiv) (Leu) -ciclosporina, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe NRRL 18230 ou um seu rautante ou derivado, na presença de um meio nutritivo.

I .ι
5-· - Processo para obtenção de caldo de fermentaj ção, contendo peptólidos cíclicos, caracterizado pelo facto de se proceder à cultura duma estirpe produtora de peptólidos cíclicos, do género Cylindrotrichum Bonorden.

j
6?. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o caldo de fermentação ser obtido a partir da cultura de espécie NRRB 18230, ou um seu derivado ou mutante.

ί l ~ ,
7$. - Processo para a preparaçao de um peptolido cíclico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de compreender a ciclização dum peptólido linear ou dum peptólido que tem uma extremidade de hidroxi em vez do grupo terminal amino.
8§. - Processo para a preparação de nm peptólido ί _f ~

I cíclico de formula II, de acordo com a reivindicação 2, caji racterizado pelo facto de compreender

a) a remoção dos grupos O-protectores de um pep'! . z tolido cíclico de formula II na forma O-protegido;

ί < b) a ciclização de uma cadeia linear de hidroxiii -undecapéptido de fórmula VIII, numa forma não protegida I: ou de O-protegido num ou em ambos os resíduos 1 e 2, e, ;! quando assim se pretenda, se levar a cabo a fase de processo q

- (a); e quando desejado,

c) a hidrogenação de um peptólido cíclico de fórmula II assim obtido, em que W é MeBmt para se obter o correspondente peptólido cíclico em que W é MeBmtí^.

j : lisboa, 17 de Junho de 1988

0 Agente Oficial da Propriedade Industrial /7—Λ 1 /--