PT813405E - Extracto de polipódio como agente fotoprotector - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Extracto de polipódio como agente fotoprotector"

Campo do invento 0 presente invento refere-se, de uma maneira geral, ao domínio da dermatologia e em particular à fotoprotecção e protecção antioxidante da pele. 0 invento refere-se ainda particularmente à protecção contra a radiação ultravioleta do sol ou de fontes artificiais.

Antecedentes do invento

Embora a exposição moderada dos indivíduos à luz solar possua muitos efeitos benéficos, incluindo a síntese da vitamina D e a eliminação de certos patogénios, a sobre-exposição da pele humana à luz do sol e, em particular, na zona ultravioleta do espectro, possui muitos efeitos prejudiciais, incluindo as queimaduras solares, fototoxicidade, reacções fotoalérgicas, fotoenvelhecimento e a promoção de cancros da pele. Como resultado das preocupações acerca dos efeitos prejudiciais da sobre-exposição à luz do sol, muita investigação tem sido dirigida para o desenvolvimento de agentes fotoprotectores tópicos e sistémicos e de preparações para utilização em cosméticos e filtros solares (para revisões, ver M.A. Pathak, Dermatologia Clinics 4(2): 321-334 (1986); M.A. Pathak, "Topical and Systemic Photoprotection of Human Skin Against Solar Radiation", em H.W. Lim e N.A. Soter (eds.), Clinicai Photomedicine, New York, Mareei Dekker, Inc. (1993); M.A. Pathak e T.B. Fitzpatrick, "Preventive Treatment of Sunburn, Dermatoheliosis, and Skin Câncer with Sun-Protective Agents", em Fitzpatrick, T.B., et ai. (eds.), Dermatology in General Medicine, 4a edição, New York, McGraw-Hill, (1994)).

Em geral, as preparações tópicas fotoprotectoras, ou "filtros solares", podem ser categorizados como químicos, físicos ou mistos. As preparações tópicas de filtros solares químicos são usualmente preparações translúcidas que contêm um ou mais compostos absorvedores de ultravioletas. As preparações tópicas de filtros solares são usualmente 2 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ preparações opacas ou semi-opacas que contêm compostos que não absorvem necessariamente radiação ultravioleta mas, em vez disso, reflectem ou dispersam a radiação UV devido à sua opacidade e dimensão das partículas (30-100 nm) . As preparações tópicas de filtros solares mistos são, geralmente, formuladas como soluções (em, e.g. álcool; álcool mais glicerol ou propilenoglicol) , ou como loções, cremes ou unguentos (e.g. emulsões de óleo em água ou de água em óleo). Adicionalmente, as preparações tópicas de filtros solares podem ser incluídas em preparações cosméticas em conjunto com agentes cosméticos, tais como pigmentos, perfumes e outros do género.

Embora muitos agentes tenham sido sugeridos como proporcionando possivelmente fotoprotecção sistémica após administração oral, a evidência da sua eficácia permanece largamente anedótica ou ilativa (ver M.A. Pathak e T.B. Fitzpatrick (1994), supra). Mesmo os mecanismos através dos quais muitos destes agentes podem trabalhar são especulativos, variando de filtração óptica e espessamento epidérmico até à inibição da peroxidação do lípido da membrana e protecção do ADN da fotodegradação. 0 Polypodium é um género de plantas típicas da família dos fetos, Polypodiaceae. Em 1967, Horvath et al. relataram que um extracto ou infusão de uma espécie de feto, Polypodium leucotomos, tradicionalmente utilizado pelos nativos do norte das Honduras para tratamento de tumores malignos, mostrou possuir efeitos antitumorais quer in vitro quer in vivo (A. Horvath et al., Nature 214: 1256-1258 (1967)). Desde então, verificou-se que extractos de uma variedade de plantas de fetos, alguns referidos como extractos de Polypodium e alguns referidos como calagualina, possuíam um certo número de efeitos dermatológicos, imunomoduladores e comportamentais.

Verificou-se que os extractos de Polypodium leucotomos, eram eficazes no tratamento da psoríase, dermatite atópica e outras doenças de pele (ver e.g. H. Corrales Padilla, et al., Int. J. Dermatol. , 13 (5): 276-282 (1974); D. Jimenez, et al.r Allergol. Er Immunopathol. , 15 (4): 185-189 (1987)). Nestes casos verificou-se que o extracto causava diminuições 3 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ na hiperqueratose, paraqueratose, mitose epidérmica, espessamento epidérmico, prolongamentos epidérmicos e na gravidade e extensão das lesões epidérmicas.

Os processos para produção de extractos dos fetos Dryopteris crassirhizoma, Polypodium vulgare, Linn., Polypodium leucotomos, Phlebodium decumanum, J. Smith, Polypodium decumanum, Cyathea taiwaniana, ou rizomas de Polypodium aureum, Linn., e Polypodium triseriales foram descritos na patente GB 2024622A de Ramon et al. (apresentada em 24 de Maio de 1979). Esta patente também reivindicava medicamentos preparados a partir de tais extractos e sugeria a sua utilização oral no tratamento da psoriase e parapsoriase.

Similarmente, processos para produzir extractos polares a partir de uma variedade de fetos da família dos Polypodiaceae foram descritos na patente GB 2075834A de Ramon et al. (apresentada em 26 de Março de 1981) . Esta patente sugeria a utilização oral de tais extractos no tratamento de doenças osteolocomotivas (e.g. artrite). A patente U.S. N° 4206222 de Valetas (concedida em 3 de Junho de 1980) descreve também um método para produzir extractos a partir de uma variedade de fetos da família dos Polypodiaceae. Adicionalmente, Valetas reivindica um agente activo com uma estrutura química particular, uma delta-lactona em C8, isolada a partir de fetos. 0 agente activo é descrito como sendo útil no tratamento de doenças do colagénio (e.g. artrite).

Verificou-se também que extractos de Polypodium leucotomos aumentavam o número de linfócitos T8, para diminuir a razão T4/T8 no sangue, para prolongar a sobrevivência de aloenxertos da pele em ratos, para inibir a resposta proliferativa de células do baço de ratos, e para inibir a resposta proliferativa de linfócitos T em mitogénios (ver, e.g. J. Vargas, et al., Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 134(C): 393-400 (1983); D. Jimenez, et al., Allergo. et Immunopathol. 15 (4): 185-189 (1987); M. Tuominem, et al., Phytother. Res. 5: 234-236 (1991); D. Fernandez, et al., Book of Abstracts: First World Cong. 4 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Medicinal and Aromatic Plants for Human Welfare, Maastricht, Holanda, Póster 84 (1992); J. Rayward, et al., Second Int. Cong. on Biol. Response Modifiers, San Diego, EUA (1993)). X.A. Alvarez, et al. testaram os efeitos de um extracto de Polypodium no comportamento e nas citoquinas do cérebro de ratazanas. Os seus dados indicaram que o extracto induz hipocinesia com doses moderadamente elevadas, sem efeito na habituação psicomotora, num teste de actividade psicomotora em espaço aberto; melhora a aprendizagem num teste de alheamento passivo; diminui os niveis de citoquinas IL-Ιβ e IL-2 nos córtexes frontoparietais; diminui a IL-Ιβ no hipocampo; e aumenta o TNF-α no córtex (X.A. Alvarez, et al., Annals of Psychiatry 3: 329-341 (1992)).

Noutro estudo, os extractos de Polypodium decumanum ("Calaguala") foram mostrados como inibindo a libertação do enzima proteolítico elastase em neutrófilos humanos induzida pelo factor de activação das plaquetas (PAF) e como inibindo a biossintese do PAF (M. Tuominem, et al., Plant Med. 58: 306-310 (1992)). Dado que o PAF pode ser envolvido na patogénese da psoríase, os autores deste estudo especularam que a actividade anti-PAF do extracto pode contribuir para a sua eficácia clinica no tratamento da psoríase.

Antes do presente invento, contudo, as propriedades fotoprotectoras e antioxidantes de extracto de Polypodium aplicado topicamente e sistemicamente em pele normal eram desconhecidas. Deste modo, métodos para proporcionar fotoprotecção e protecção antioxidante através de aplicação tópica e sistémica de extractos de Polypodium, eram também desconhecidos antes do presente invento.

No documento WO-A-90 03778, são descritas composições com base em fases lamelares lipídicas hidratadas ou lipossomas contendo um ecdiesteróide ou derivado de ecdiesteróide, que pode ser extraído do Polypodium vulgarem.

Em J. Investigat. Dermatol., Vol. 102, N°.4, 1994, página 651, Resumo 763, é referido que o extracto de Polypodium leuctomos pode ser utilizado como agente antioxidante na terapia das doenças de pele. 5 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Sumário do invento É proporcionada uma preparação para aplicação tópica compreendendo um extracto de Polypodium seleccionado de P. leucotomos, P. percussum ou P. triseriale. A utilização de um extracto de Polypodium fotoprotector para aplicação tópica ou oral é também proporcionada. São proporcionadas preparações incluindo extractos de fetos do género Polypodium. Em particular, os extractos podem ser de qualquer um dos fetos Polypodium aureum, Polypodium crassifolium, Polypodium decumanum, Polypodium lanceolatum, Polypodium leucotomos, Polypodium percussum, Polypodium triseriale ou Polypodium vulgare. As preparações podem ser formuladas para aplicação tópica ou administração oral.

Para aplicação tópica, as preparações incluem um portador farmaceuticamente aceitável para aplicação tópica. Adicionalmente, as preparações tópicas podem incluir agentes filtros solares físicos, agentes filtros solares químicos e/ou agentes cosméticos. Em particular, podem ser incluídos um agente filtro solar físico, tal como dióxido de titânio, dióxido de titânio tratado com silicone, óxido de zinco, óxido ferroso, cloreto férrico, talco, óxido de crómio, ou óxidos de cobalto. Alternativamente ou adicionalmente, podem ser incluídos um agente filtro solar químico, tal como o ácido para-aminobenzóico, ésteres de ácido para-amino-benzóico, salicilatos, cinamatos, benzofenonas, di-hidroxi-acetona, parsol 1789 ou melanina. As preparações podem conter, pelo menos, 1%, 10%, 25% ou 50% em peso de extracto de Polypodium. Adicionalmente, as preparações proporcionam um factor de protecção solar (SPF) para a dose eritemática mínima (MED) avaliada às 24 horas de, pelo menos, 2, 5, 10 ou 15 após aplicação de 2 μΐ/cm2 a pele enormal dos Tipos I a Tipo IV. É também proporcionado um produto embalado incluindo instruções de utilização. Utilizando os produtos do invento, são também proporcionados métodos para proporcionar fotoprotecção a um indivíduo com pele normal. 6 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Para administração oral, as preparações incluem um portador farmaceuticamente aceitável para aplicação oral. É também proporcionado um produto embalado para administração oral, incluindo instruções de utilização. Utilizando os produtos do invento, são também proporcionados métodos para proporcionar fotoprotecção a um indivíduo com pele normal. Estes métodos incluem administração oral a um adulto de uma dosagem de extracto de Polypodium entre 720 mg e 1440 mg num período de 24 horas antes de exposição à radiação ultravioleta, e oralmente administração de uma dosagem entre 360 mg e 720 mg num período de 3 horas antes da exposição.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 regista a geração de anião superóxido em função da dose de UVA. A geração do anião superóxido é medida por alterações na densidade óptica a 560 nm resultante da conversão de NBT em NBF por reacção com um anião superóxido. A riboflavina (RF) foi utilizada como fotossensibilizador. Do topo para a base, os três gráficos mostram a geração do anião superóxido apenas com RF, com RF na presença de extracto de Polypodium (PE) e apenas com PE. A Figura 2 regista a geração de anião superóxido em função da dose de UVB. A geração do anião superóxido é medida por alterações na densidade óptica a 560 nm resultante da conversão de NBT em NBF por reacção com um anião superóxido. A riboflavina (RF) foi utilizada como fotossensibilizador. Do topo para a base, os três gráficos mostram a geração do anião superóxido apenas com RF, com RF na presença de extracto de Polypodium (PE) e apenas com PE. A Figura 3 regista a geração de oxigénio singuleto em função da dose de UVA. A geração do oxigénio singuleto é medida por alterações na densidade óptica a 440 nm resultante no branqueamento da N,N-dimetil-p-nitrosoanilina (RNO) . A histidina (HIS) foi utilizada como receptor selectivo do oxigénio singuleto. Foi utilizado Rose Bengal (RB) como fotossensibilizador. Do topo para a base os quatro gráficos mostram a geração de oxigénio singuleto apenas com RB, com RB na presença de 0,01% de extracto de Polypodium (PE), com RB na presença de 0,02% de PE e com RB na presença 7 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ de 0,05% de PE. Os dois gráficos inferiores mostram a geração de oxigénio singuleto na presença de RB e os conhecidos eliminadores de oxigénio singuleto NaN3 e DABCO.

Descrição detalhada do invento O presente invento refere-se à utilização de extractos de fetos do género Polypodium para fotoprotecção e protecção antioxidante. O presente invento refere-se também a preparações fotoprotectoras e antioxidantes incluindo tais extractos. Num conjunto de formas de concretização, os métodos e as preparações referem-se apenas à utilização tópica dos extractos, enquanto que noutro conjunto de formas de concretização, os extractos podem ser administrados sistemicamente. I. Extractos de polypodium

Os extractos de Polypodium da arte anterior e do presente invento são extractos hidrossolúveis ou hidrofilicos que podem ser produzidos através de extracções correntes com álcool ou solventes polares de folhas secas e/ou rizomas dos fetos do género Polypodium. A extracção polar pode ser precedida ou seguida por uma separação de não-polares ou lipidos, e então o extracto polar pode ser filtrado e concentrado. Podem ser adicionados passos adicionais para remover pigmentos e catiões. Protocolos gerais para produzir extractos polares de Polypodiaceae podem ser encontrados na patente GB 2024622A e GB 2075834A. Adicionalmente, protocolos para produzir dois extractos de Polypodium leucotomos (um etanólico e outro metanólico) estão presentes em Tuominen, et al., Phytotherapy Research 5: 234-136 (1991). Outro e preferido método para extracção é proporcionado no Exemplo 1 a seguir.

Extractos de uma espécie de Polypodium, o Polypodium leucotomos, estão já comercialmente disponíveis em Espanha, Portugal, Honduras e República Dominicana sob a forma de cápsulas para administração oral. A preparação comercial preferida para administração oral é a da Industrial Farmacêutica Cantabria, S.S., Madrid, Espanha (DIFUR®) . 8 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Tal como aqui utilizado a seguir, o termo "extracto de Polypodium" e a abreviação "PE" significarão a fracção polar (ou hidrossolúvel ou hidrofílica ou hidroalcoólica) extractada das folhas e/ou rizomas do feto do género Polypodium e possuindo propriedades fotoprotectoras e antioxidantes.

Os fetos deste género incluem o Polypodium leucotomos (também conhecido como Polypodium aureum e Phlebodium aureum) descrito no Index Londinensis, Vol. 5, Oxford, 1921; Polypodium decumanum (também conhecido como Phlebodium multiseriale e Chrysopteris dictyocallis) descrito em Ann. Bot., Vol. 31, 1917; Polypodium crassifolium (também conhecido como Dipteris crassifolia e Polypodium lanceolatum descrito em Species Plantarum, Estocolmo, 1753-63; Polypodium lanceolatum descrito no Index Londinensis, Vol. 5, Oxford, 1921; Polypodium percussum descrito no Index Londinensis, Vol. 5, Oxford, 1921; Polypodium triseriale descrito no Index Filicum, Copenhaga, 1906; e Polypodium vulgare descrito no Index Londinensis, Vol. 5, Oxford, 1921. Destes, o feto preferido para produzir o extracto do presente invento é o Polypodium leucotomos. ser

Tal como descrito no Exemplo 1, e apenas como exemplo, tais extractos podem ser obtidos através de extracção etanólica ou metanólica de folhas e/ou rizomas de Polypodium. Em formas de concretização preferidas, apenas são utilizadas as partes aéreas das plantas. Outros solventes hidrofilicos podem, com certeza, ser utilizados em vez do etanol ou do metanol (e.g. água, álcoois alquilicos inferiores). Uma extracção hidrofóbica, ou passo de "desengorduração", pode ser também utilizado para remover componentes hidrofóbicos ou lipidicos do extracto polar. Tal como será entendido por um especialista na matéria, uma tal extracção hidrofóbica ou lipidica pode ser empregue quer antes quer após a extracção polar ou hidrofílica. Similarmente, podem ser realizadas extracções múltiplas para refinar ainda mais a fracção polar ou hidrofílica. Na verdade, tal como será entendido por um especialista na matéria, uma variedade de técnicas de fraccionamento e de separação (e.g. cromatografia, diálise, filtração, electroforese) pode ser empregue em várias ordens e 9 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ multiplicidades para refinar ainda mais o extracto polar e para isolar os) ingrediente(s) activo(s). Em cada passo de tal fraccionamento ou separação, podem-se, sem demasiada experimentação, realizar ensaios antioxidantes simples descritos nos Exemplos 6 e/ou 7 para determinar que fracção contém o ingrediente activo de PE. Qualquer uma de tal fracção polar ou hidrofílica de um extracto derivado de folhas e/ou rizomas de Polypodium e possuindo propriedades fotoprotectoras e antioxidantes constitui um "extracto de Polypodium" ou "PE", tal como aqui utilizado e nas reivindicações em anexo.

Após a evaporação dos solventes voláteis, tais extractos são tipicamente de consistência xaroposa e de cor entre âmbar e castanha (mas podem ser clarificados através de carvão activado). Quer a consistência quer a cor, com certeza, variarão dependendo do grau em que o extracto é diluído com água ou outros solventes.

Para fins de quantificação a quantidade de PE numa preparação, e para fins de clareza nas reivindicações em anexo, é necessário reconhecer que um PE pode ser concentrado ou diluído e, por isso, uma maior quantidade de extracto diluído será necessária para se conseguir a mesma utilidade com qualquer dada quantidade de extracto concentrado. Uma preparação contendo, compreendendo ou incluindo x% em peso de PE, em consequência, é definida como uma preparação em que o extracto de Polypodium, se concentrado, constituirá x% em peso. Um extracto de Polypodium concentrado será definido como um que não perca mais do que 25% do seu peso por secagem.

II. As propriedades fotoprotectoras de PE A radiação ultravioleta é subdividida em três bandas de comprimentos de onda mais longos para os mais curtos. Estas três bandas são referidas como UVA, UVB e UVC. A região UVC inclui comprimentos de onda inferiores a aproximadamente 290 nm, mas devido à filtração pelo ozono na camada superior da atmosfera, é grandemente inexistente na superfície da terra. A região UVB estende-se aproximadamente nos 290-320 nm e a região UVA estende-se aproximadamente nos 320-400 nm. 10 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Os efeitos da radiação ultravioleta na pele humana são vários. Por isso, a eficácia de uma composição como fotoprotectora pode ser avaliada através de vários diferentes critérios. Entre estes estão os seguintes. (1) Determinação do espectro de absorção da composição. Se o espectro de absorção de uma composição apresenta uma absorção especifica na banda ultravioleta de 290-400 nm, e particularmente com um pico de absorção a 290-320 nm, a composição pode ser considerada como fotoprotectora contra a reacção de queimadura solar (que é usualmente provocada por uma radiação solar de 290-320 nm). (2) Determinação da dose mínima de radiação solar necessária para induzir um imediato escurecimento por pigmentação com e sem aplicação/administração da composição. A reacção de escurecimento imediato por pigmentação (IPD) pode ser induzida por radiação ultravioleta de comprimento de onda longo (320-400 nm) . A reacção, que é mais verificável em peles castanhas claras ou bronzeadas, é um escurecimento transiente da pele que se torna aparente após ter terminado a exposição aos UVA. Isto resulta de uma reacção de oxidação da melanina pré-existente na pele. A reacção de IPD pode ser inibida por antioxidantes ou, dado que a reacção requer oxigénio, privando a pele de oxigénio. A dose mínima de radiação UVA que produz um envelhecimento visível da pele pode ser determinada pela exposição da pele a doses graduais de radiação UVA variando de 0,5 a 10 J/cm2. A dose mais baixa de radiação UVA que produz um visível escurecimento da pele imediatamente após irradiação é classificada como a dose mínima para IPD. (3) Determinação da dose eritemática mínima com e sem aplicação/administração da composição. A dose eritemática mínima (MED) é definida como a dose mínima de radiação ultravioleta de 290-320 nm que produz uma reacção de queimadura solar perceptível na pele humana com bordos detectáveis 20-24 horas após exposição. A MED pode ser determinada por exposição da pele a doses graduais de radiação UVB. A MED varia de aproximadamente 20 a 80 mJ/cm2 de radiação UVB para indivíduos de peles claras e de aproximadamente 70-120 mJ/cm2 em pessoas morenas ou com a 11 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ pele pigmentada escura. Deve notar-se que os valores de MED variarão com os comprimentos de onda do espectro ultravioleta. A radiação com comprimentos de onda mais curtos (290-320 nm) é 500 a 1000 vezes mais eritemática do que a de comprimentos de onda mais longos (320-400 nm) . Por isso, as MEDs para uma radiação com comprimentos de onda mais longos são superiores (e.g. 20 a 50 J/cm2) . (4) Determinação da dose melanogénica mínima com e sem aplicação/administração da composição. A dose melanogénica mínima (MMD) é definida como a dose mínima de radiação ultravioleta (UVB ou UVA) que produz uma pigmentação persistente e duradoura da pele que seja visível 72 a 129 h após exposição e que não desapareça rapidamente depois disso. Se a pele for examinada microscopicamente, as células de pigmento mostram um aumento da densidade populacional (melanócitos por cm2) , aumento dos processos dendríticos e níveis acrescidos de pigmentação de melanina. A MMD pode ser determinada por exposição da pele a doses graduais de radiação ultravioleta (290-400 nm) e anotação da dose mínima que induz pigmentação persistente. (5) Determinação da dose fototóxica mínima com e sem aplicação/administração da composição. Na determinação da MED, é sabido que a radiação de comprimento de onda mais curto (290-320 nm) é mais eritemogénica do que a radiação de comprimento de onda maior (320-400 nm) . Contudo, na presença de um produto químico ou fármaco fotoreactivo (e.g. 8-metoxipsolareno, 5-metoxipsolareno), a radiação UVA de comprimento de onda maior pode tornar-se muito mais eritemogénico. Isto é devido a uma reacção fototóxica em que a pele mostra vermelhidão (eritema) com uma dose de radiação UVA muito mais reduzida. A dose mínima de radiação UVA requerida para produzir reacção fototóxica após aplicação/administração de um produto químico ou fármaco fototreactivo é definida como a dose fototóxica mínima (MPD) . A MPD pode ser determinada aplicando topicamente, ou administrando oralmente, um produto químico ou fármaco fototreactivo antes da exposição da pele a doses graduais de radiação UVA e anotação da dose mínima que induz uma reacção fototóxica 48 a 72 horas após exposição. 12 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Tal como aqui utilizado, o termo "fotoprotecção" significa (1) a inibição ou o retardamento do eritema ou reacção de queimadura solar e danos nos tecidos da pele e/ou (2) a inibição ou o retardamento da reacção de escurecimento por pigmentação imediato e/ou (3) a inibição ou o retardamento do bronzeamento retardado ou da reacção de MMD e/ou (4) a inibição ou o retardamento da reacção fototóxica produzida pelos psolarenos. Um composto proporcionando tal fotoprotecção é referida como sendo "fotoprotectora" e pode ser referida como "agente f otoprotector".

Para produtos comerciais, a eficácia de uma preparação fotoprotectora é usualmente expressa como o seu "factor de protecção solar" (SPF). 0 SPF é definido em termos de MED da pele protegida e não protegida de acordo com a equação seguinte: SPF = MED (mJ/cm2) de pele protegida com filtro solar MED (mJ/cm2) de pele não tratada (controlo) A U.S. Food and Drug Administration apresenta padrões para a determinação de SPFs. Os padrões requerem a aplicação de produtos de teste a 2 μΐ/cm2 ou 2 mg/cm2 nas costas (região infraescapular) de sujeitos em teste. É seleccionada uma área de pele de 100 cm2 (50x2 cm) para a avaliação de cada produto de teste. Um filtro solar corrente (8% de homosalato) é utilizado como padrão interno para verificar os resultados do teste.

Por analogia ao SPF definido acima, pode-se também definir um "Factor de Protecção" para o IPD e a MMD. Tal como com o SPF, estes factores de protecção são simplesmente razões das doses mínimas necessárias para a pele protegida em relação às doses mínimas necessárias para a pele não protegida. 0 grau de protecção solar necessário depende, com certeza, não apenas da dosagem da radiação mas também do tipo de pele do indivíduo. Em geral, a pele humana normal pode ser classificada em tipos I-VI reactivos ao sol (sendo o Tipo I o mais claro e sensível e o Tipo VI o mais escuro e menos sensível) com base, em grande parte, no grau de 13 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ melanização constitutiva e da capacidade facultativa da pele escurecer ou bronzear em resposta a radiação ultravioleta. Para uma discussão destes tipos de pele, ver M.A. Pathak, Annals New York Academy of Sciences, 453: 328-339 (1985).

Tal como aqui utilizado, o termo "pele normal" significa pele humana que não é fotossenbilizável e que está livre de problemas dermatológicos, tais como a psoriase, dermatite atópica e vitiligo.

Tal como aqui utilizado, o termo "fotossensibilizado" significa tornado mais susceptivel a fotodanificação por ingestão ou aplicação tópica de um composto, tal como o psoraleno.

Para avaliar as propriedades fotoprotectoras do PE, foi realizada uma variedade de experiências utilizando formulações tópicas e orais de PE e utilizando sujeitos com pele normal que foi tratada ou não tratada com agentes de fotossenbilizadores de pele. Os detalhes destas experiências são proporcionados nos Exemplos 2-5 abaixo.

Para a aplicação tópica de PE, foram testadas quatro diferentes formulações. As formulações consistiam cada uma de PE concentrado misturado numa loção, tal como descrito no Exemplo 8. As diferentes formulações diferiam umas das outras (e da loção do Exemplo 8) apenas na percentagem em peso de PE na formulação. De cada formulação, 200 μΐ foi aplicado quer uma vez quer duas vezes em 100 cm2 de superfície de pele, tal como indicado: "10%": 10% de PE aplicado uma vez "25%": 25% de PE aplicado uma vez "50% lx" : 50% de PE aplicado uma vez "50% lx" : 50% de PE aplicado duas vezes

Para administração oral, foram testadas dosagens de até 720 mg por dia (dosagens totais variando de 1440 mg ao longo de dois dias até 3600 mg ao longo de 5 dias) utilizando cápsulas de PE comercialmente disponíveis (DIFUR®, Industrial Farmacêutica Cantabria, S.A., Madrid, Espanha). 14 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Estas experiências demonstraram ο seguinte em indivíduos com pele do Tipo III e IV: (1) Dependendo da concentração, PE topicamente aplicado a pele normal mostrou um factor de protecção para a reacção IPD de entre 2,20 e 3,55, mostrou um factor de protecção (SPF) para a MED de, pelo menos, 2,35 até mais do que 3,00, e mostrou um factor de protecção para a MMD de, pelo menos, 1,96 até mais de 2,23. Ver o Exemplo 2. (2) PE oralmente administrado a doentes com pele normal actua como agente fotoprotector sistémico e, dependendo da dosagem, mostrou um factor de protecção da reacção de IPD de entre 2,70 e 3,09, mostrou um factor de protecção (SPF) para a MED de entre 2,65 e 2,94, e mostrou um factor de protecção para o MMD de entre 1,67 e 2,00. Ver o Exemplo 3. (3) PE topicamente aplicado a pele fotossenbilizada através de psoralenos orais mostrou um factor de protecção para o MPD avaliado às 72 horas que, dependendo da concentração do PE, foi superior a 1,5 até mais do que 2,2 com 5-MOP oral ou que, mesmo para a concentração mais baixa, foi superior a 4,0 com 8-MOP oral. Ver Exemplo 4. (4) PE oralmente administrado a sujeitos com pele fotossensibilizada por psoralenos mostrou um factor de protecção para o MPD medido às 72 h variando de 3,0 (com 5-MOP oral) a 7,0 (8-MOP oral). Ver Exemplo 5.

III. Propriedades antioxidantes do PE O facto de o PE apenas retardar a reacção fototóxica aos psoralenos e UVA ("PUVA", ver Exemplos 4 e 5) mas também retardar a reacção IPD sugere que o seu mecanismo de acção pode envolver a eliminação dos radicais livres e de espécies de oxigénio reactivas. É sabido que os radicais livres e as espécies de oxigénio reactivas desempenham um importante papel na provocação de vários graus de danos celulares e na perpetuação da resposta inflamatória (eritema, edema, vesiculação) a psoralenos (Carraro e Pathak, J. Invest. Dermatol. 90: 267-275, (1988)). Estes estudos indicaram que (1) os psoralenos interagem com o ADN das células 15 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ epidérmicas para produzir fotoaductos com bases de pirimidina (incluindo fotoaductos com uma única ligação e reticulados), e (2) os psoralenos produzem espécies de oxigénio reactivas, incluindo oxigénio singuleto, anião superóxido e radical hidroxilo, que contribuem para o dano das membranas das células epidérmicas, peroxidação de lipidos e o desenvolvimento de resposta inflamatória. Similarmente, a evidência disponível, com base em estudos espectrais de acção, indicam a existência de dois mecanismos distintos de acção da UVR, dependendo dos comprimentos de onda e da natureza dos danos da radiação UV: (1) Um mecanismo de comprimento de onda mais curto envolvendo radiação UVB (290-320 nm) que trabalha através da absorção directa de fotões pelo ADN e resulta no dano do ADN sob a forma de fotoprodutos ciclobutilpirimidina e pirimidina-pirimidona); comprimento de onda intermediários não-ADN reactivas ('02, 02'“ e ' base de ADN (e.g. dimeros de fotoprodutos de citosina 6-4-(2) Um mecanismo de UV de maior que opera através de tais como espécies de oxigénio OH etc.) que são produzidos através quer de agentes de sensibilização endógenos (e.g. NADH, NADPH, riboflavina, quinonas, etc.) quer de agentes de sensibilização exógenos (e.g. psoralenos + UVA). Os comprimentos de onda maiores contribuem também para a inflamação e outras reacções de stress oxidativo que provocam danos ao ADN, lipidos de membrana e organelos citoplásmicos. O radical livre mais reactivo é o radical hidroxilo (ΌΗ) que resulta da geração do anião superóxido (02'-) . Quer o oxigénio singuleto (Ό2) quer o 02'~ podem provocar peroxidação dos lipidos da membrana, danos no ADN e reticulação de proteínas na epiderme assim como na derme.

De modo a testar a eliminação de radicais livres ou as propriedades antioxidantes do PE, foi realizada uma série de experiências in vitro envolvendo reacções de foto-sensibilização por UVA/UVB e riboflavina e por UVA e Rose Bengal. Estas experiências indicam que: (1) PE (0,01%) diminuiu a produção de 02’~ por UVA e riboflavina e por UVB e riboflavina em 42,2% e 55%, respectivamente (ver Exemplo 6). 16 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ (2) ΡΕ (0,01%) diminuiu a produção de 'Cp por UVA e um fotossensibilizador conhecido (ver Exemplo 7).

Embora o PE correntemente disponível não mostre quaisquer picos de absorção característicos nas regiões UVB ou UVA, um extracto em bruto exibiu valores de absorção monotonicamente crescentes nestas regiões. Deste modo, o PE parece actuar de duas maneiras: (a) como absorvedor de UVA e UVB e (b) como eliminador de espécies de oxigénio reactivas. Se o extracto for utilizado na sua forma em bruto sem diluição, este actua parcialmente como um filtro de UV. Quando o PE é utilizado em forma diluída ou sem cor, este apresenta pouca ou nenhuma absorção no espectro de UVB e UVA mas mostra ainda significativas propriedades de terminação ou eliminação de radicais livres relativamente ao 02'“.

Por isso, o PE actua não apenas como agente fotoprotector mas como um antioxidante. No seu papel como antioxidante, o PE pode ser utilizado similarmente a outros antioxidantes conhecidos (e.g. Vitamina C, Vitamina E, β-caroteno) para proteger a pele ou outros tecidos contra o estresse oxidativo que provoca danos na membrana das células, danos no ADN, reacções inflamatórias da pele, fotossensibilização e fotoenvelhecimento. IV. Preparações para administração tópica

Num conjunto de formas de concretização, adicionalmente ao PE, as preparações fotoprotectoras do presente invento incluem um portador farmaceuticamente aceitável para aplicação tópica.

Tais portadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na arte, e na essencialidade, podem incluir qualquer preparação de filtro solar ou cosmética tópica correntemente utilizada e comercialmente disponível, ou combinações de preparações de filtros solares ou cosméticas tópicas correntemente utilizadas e comercialmente disponíveis. Deste modo, pode-se simplesmente modificar uma preparação de filtro solar ou cosmética tópica disponível adicionando PE e ajustando, como necessário, as razões de componentes aquosos e não aquosos para manter uma 17 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ consistência adequada para uma aplicaçao tópica.

Para exemplos dos compostos e classes de compostos tipicamente encontrados nos portadores farmaceuticamente aceitáveis utilizados em preparações fotoprotectoras para aplicação tópica, ver as patentes U.S. N° 5256404 de Marino et al. (26 Out. 1993) e U.S. N° 5306486 de McCook et al. (26 Abr. 1994).

Tal como aqui utilizado, o termo "portador farmaceuticamente aceitável para aplicação tópica" significa uma composição adequada para aplicação tópica à pele humana espalhando ou esfregando, que não provoca irritação na pele humana e que pode ser misturado com PE para formar uma solução, emulsão, gel, loção, unguento, bálsamo, creme ou sólido ou pasta espalhável. Tais portadores farmaceuticamente aceitáveis podem incluir emolientes, tensioactivos, humectantes, lubrificantes, espessantes, agentes à prova de água, agentes bactericidas, agentes de penetração percutânea e conservantes. Adicionalmente, vários agentes cosméticos, tais como fragrâncias e pigmentos podem ser incluídos num portador farmaceuticamente aceitável para aplicação tópica. Dado que há alguma evidência, de que o PE administrado oralmente é mais eficaz sob condições acídicas, pode ser preferível que o portador seja, ligeiramente acídico ou, pelo menos, não alcalino, mesmo para administração tópica. Preferencialmente, a preparação possui um pH > 5 mas < 8.

Um portador farmaceuticamente aceitável para aplicação tópica pode também incluir agentes fotoprotectores que suplementam ou complementam as propriedades fotoprotectoras do PE. Em particular, o portador pode incluir agentes filtros solares químicos, agentes filtros solares físicos e/ou agentes cosméticos aprovados para utilização em seres humanos (através de, por exemplo, a U.S. Food and Drug Administration e a Cosmetics, Toiletries and Fragrance Association).

Tal como aqui utilizado, o termo "agente filtro solar físico" significa um composto que, quando utilizado como componente de um portador farmaceuticamente aceitável para 18 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ aplicação tópica, actua para reflectir e/ou difractar e/ou dispersar radiação ultravioleta e que, quando aplicado com uma concentração de 2 μΐ/cm2 ou 2 mg/cm2, proporciona um SPF de, pelo menos, 2 quando a MED é medida 24 horas após exposição com pele do Tipo I a Tipo IV. Os agentes filtros solares fisicos típicos são dióxido de titânio, dióxido de titânio tratado com silicone, óxido de zinco, óxido ferroso, cloreto férrico, talco, óxido de crómio, óxidos de cobalto, caulino, ictiol e amido. Os agentes filtros solares físicos estão geralmente sob a forma de partículas com diâmetros de 30-100 nm e, preferencialmente, 30-50 nm. Muitos outros agentes filtros solares físicos são conhecidos na arte e não necessitam de ser aqui voltados a mencionar.

Tal como aqui utilizado, o termo "agente filtro solar químico" significa um composto que, quando utilizado como componente de um portador farmaceuticamente aceitável para aplicação tópica, actua para absorver alguma radiação no espectro ultravioleta e que, quando aplicado com uma concentração de 2 μΐ/cm2 ou 2 mg/cm2, proporciona um SPF de, pelo menos 2 quando a MED é medida 24 horas após exposição com pele do Tipo I a Tipo IV. Os agentes filtros solares químicos típicos incluem ácido para-aminobenzóico (PABA) e os seus derivados éster, salicilatos, cinamatos, benzofenonas, di-hidroxiacetona, parsol 1789, melanina e vários hidrocarbonetos. Muitos outros agentes filtros solares químicos são conhecidos na arte e não necessitam de ser aqui voltados a mencionar. Tal como aqui utilizado, o termo "agente filtro solar químico" não engloba especificamente PE.

Tal como aqui utilizado, o termo "agente cosmético" significa um pigmento ou uma fragrância que pode ser aplicada topicamente na pele humana para efeitos estéticos e que não provoca irritação. Os agentes cosméticos são bem conhecidos na arte e estão incluídos em produtos tais como batons, sombras para olhos, rouges, bases e outras formas de "maquilhagem". Tal como aqui utilizado, os "agentes cosméticos" estão limitados aos utilizados para conferir cor ou fragrância à pele humana. O termo "agentes cosméticos" não pretende englobar todos os tipos de agentes, tais como os especificamente utilizados em produtos de cuidados das 19 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ unhas ou do cabelo. Tal como aqui utilizado, o termo "agentes cosméticos" não engloba especificamente o PE.

Em geral, as preparações fotoprotectoras para aplicação tópica do presente invento, devem incluir, pelo menos, 1% de PE em volume, embora, tal como será compreendido por um especialista na matéria, possam ser utilizadas quantidades inferiores com menor vantagem. Em experiências com ratos carecas, por exemplo, foram observados efeitos fotoprotectores para concentrações de PE tão baixas como 0,5% em DMSO. Em formas de concretização preferidas, contudo, a preparação deve compreender, pelo menos, cerca de 5% ou 10% de PE em volume. Concentrações mais elevadas, incluindo PE a concentrações de 25%, 50% ou mais, estão também contempladas e pretendem cair dentro do domínio e espírito das reivindicações em anexo. Tal como será entendido por um especialista na matéria, a percentagem de PE em volume será determinada em aplicações comerciais através de uma variedade de factores, incluindo: o desejo de proteger contra UVA e UVB, o desejo de inibir o bronzeamento, o desejo de inibir a reacção fototóxica, os custos relativos dos diferentes agentes, o desejo de incluir múltiplos agentes com diferentes propriedades fotoprotectoras (e.g. agentes filtros solares químicos e agentes filtros solares físicos) e o desejo de incluir compostos que produzam um produto esteticamente agradável que seja fácil de utilizar (e.g. pigmentos cosméticos, emolientes, perfumes, aloé, agentes de "bronzeamento" sem sol, tais como a di-hidroxiacetona, etc.).

Como exemplos de formas de concretização, as preparações fotoprotectoras para aplicação tópica podem incluir, mas não estão limitadas às descritas no Exemplo 8. V. Preparações para administração sistémica

De modo a facilitar a administração oral, o PE pode ser misturado com qualquer variedade de portadores farmaceuticamente aceitáveis para administração oral. Com o termo "portador farmaceuticamente aceitável para administração oral" pretende significar-se uma composição que é não tóxica, é não irritante para o sistema 20 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ gastrointestinal humano, e que pode ser misturado com PE para formar uma solução, xarope, emulsão, gel ou sólido. Preparações para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou, em geral, parentérica podem ser também produzidas através de métodos conhecidos na arte.

Alguns exemplos de substâncias que podem servir como portadores farmaceuticamente aceitáveis para administração oral são açúcares tais como a lactose, glucose e sacarose; amidos, tais como o amido de milho e o amido de batata; celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; goma adragante em pó; malte; gelatina; talco; ácido esteárico; estearato de magnésio, sulfato de cálcio, óleos vegetais, tais como o óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, azeite e óleo de milho; polióis, tais como o propilenoglicol, glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; polivinilpirrolidona; ácido alginico, água sem pirogénio; solução salina isotónica; soluções de tampão fosfato; manteiga de cacau; emulsionantes; assim como outras substâncias compatíveis não tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas. Agentes de molhabilidade e lubrificantes, tais como o estearato de magnésio, assim como agentes de cor, agentes de sabor, excipientes, agentes de formação de comprimidos, estabilizadores, antioxidantes e conservantes, podem também estar presentes. Outros aditivos farmacêuticos compatíveis e activos podem ser incluídos no portador farmaceuticamente aceitável para utilização nas composições do presente invento.

As preparações para administração oral podem estar sob a forma de comprimidos, capletes, cápsulas de gelatina moles e duras, pílulas, incluindo formulações de libertação atrasada ou prolongada, pós ou grânulos dispersáveis, losangos, saguetas, cápsulas, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerosóis, (sólidos ou em meio líquido), e outros do género.

Numa forma de concretização preferida, o PE toma a forma de uma cápsula com lactose e estearato de magnésio (um lubrificante) como portador farmaceuticamente aceitável para 21 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ administração oral. Como alguns indivíduos são intolerantes à lactose, contudo, um portador alternativo, tal como um amido ou óleo vegetal, pode ser preferido.

Como exemplos de formas de concretização, as preparações fotoprotectoras para administração oral podem incluir, mas não estão limitadas a, as descritas no Exemplo 9. VI. Métodos para proporcionar fotoprotecção

1. Fotoprotecção tópica com PE

Numa forma de concretização do presente invento, é descrito um método para proporcionar fotoprotecção (incluindo protecção ou prevenção de fotoenvelhecimento, dano actinico e cancros da pele) que emprega uma preparação de PE para aplicação tópica.

Numa forma de concretização preferida, uma preparação de PE é formulada como uma solução, emulsão, gel, unguento, loção, bálsamo, creme ou sólido ou pasta espalhável que pode ser aplicada na pele de um indivíduo e untada sobre a pele para formas uma camada fina. A preparação deve ser aplicada antes da exposição à radiação ultravioleta e deve ser novamente aplicada após natação, banho ou transpiração significativa.

Preferencialmente, a preparação de PE inclui também outros agentes filtros solares (físicos ou químicos), emolientes, tensioactivos, humectantes, lubrificantes, espessantes, agentes à prova de água, e/ou conservantes. 0 SPF global proporcionado pela preparação deve ser, pelo menos de 2. Podem ser empregues diferentes formulações em indivíduos com diferentes tipos de pele e tempos de exposição esperados e, por isso, estão contempladas formulações com SPFs iguais ou superiores a 5, 10, 15, 20 e 30. Para indivíduos com uma pele altamente fotossensível, podem ser também empregues formulações com um SPF igual ou superior a 40 ou 50. 22 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

2. Fotoprotecçao oral com PE

Noutra forma de concretização do presente invento, é descrito um método para proporcionar fotoprotecção (incluindo protecção ou prevenção de fotoenvelhecimento, dano actinico ou cancros da pele) que emprega uma preparação de PE para administração oral.

Numa forma de concretização preferida, o PE é formulado sob a forma de uma cápsula em que lactose e estearato de magnésio servem como portador farmaceuticamente aceitável. Contudo, dado que alguns indivíduos são intolerantes à lactose, pode ser preferido um portador alternativo, tal como amido ou óleo vegetal. As cápsulas contêm, preferencialmente, cerca de 100-150 mg de PE e, muito preferencialmente, 120 mg de PE.

Como o PE parece ser melhor absorvido sob condições acídicas, as cápsulas são, preferencialmente, não tomadas com um antiácido e, muito preferencialmente, são tomadas, pelo menos, meia hora antes das refeições. Similarmente, dado que o álcool parece reduzir a absorção e eficácia do PE, a preparação é, preferencialmente, não administrada com bebidas alcoólicas.

Dado que o PE parece aumentar o efeito de digitalis do fármaco, os indivíduos que tomam digitalis devem consultar um médico antes de utilizar uma preparação de PE administrada oralmente e, se adequado, a dosagem de digitalis deve ser reduzida. Preferencialmente, o PE não é utilizado por indivíduos que tomam digitalis.

Para adultos, a dosagem de PE deve ser de, pelo menos, 120 mg tomados no espaço de 3 horas antes da exposição solar ou a outra radiação ultravioleta. Mais preferencialmente, a dosagem é entre 360 e 720 mg tomada no espaço de 3 horas antes da exposição. Demonstrou-se que o PE era seguro para dosagens até 1200 mg/dia e, por isso, dosagens até 120 mg podem ser tomadas nas 24 horas antes da exposição. Preferencialmente, a dosagem de PE deve ser de, pelo menos, 360 mg tomada 24 horas antes da exposição. Mais preferencialmente, a dosagem está entre 720 e 1440 mg tomada 23 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ 24 horas antes da exposição. Adicionalmente, as dosagens diárias de 360-720 mg/dia podem ser tomadas nos dias precedentes à exposição embora o efeito pareça não ser substancialmente cumulativo após o segundo dia.

Para crianças de mais do que 6 anos de idade, as dosagens devem ser limitadas a 120-240 mg por dia.

No caso de resultar desconforto digestivo devido a uma preparação oral de PE, deve ser descontinuada a utilização da preparação. Para indivíduos intolerantes à lactose, a ingestão de pequenas quantidades (e.g. 120-180 mg) de lactose não é provavelmente suficiente para provocar sintomas de intolerância mas, em caso de se desenvolver diarreia, a utilização do produto deve ser descontinuada. Alternativamente, podem ser empregues preparações de PE sem lactose (substituindo, por exemplo, um amido ou óleo vegetal como portador). VII. Exemplos

1. Preparação de PE

Rizomas de Polypodium leucotomos desenvolvidos podem ser separados de Palmeiras Africanas, com as quais cresceram sinbioticamente, e transplantados para plantações em que as condições de solo e de condições metereológicas são favoráveis (e.g. Yojoa Lake, Honduras). Após desenvolvimento completo e esporulação das folhas, as partes aéreas da planta podem ser recolhidas e secas durante 24 horas a temperaturas entre 60-70°C. Um lote de 160 kg de folhas secas pode ser finamente moído e sujeito três vezes a 10 horas de extracção com baixo refluxo em metanol/água (volume total de 1430 litros). O extracto diluído resultante pode ser então concentrado utilizando evaporação por pressão negativa a 25-50°C para remover a maior parte do álcool e para reduzir o volume a aproximadamente 20% do original. Opcionalmente, mas preferencialmente, os lípidos podem ser removidos do extracto concentrado com um solvente hidrofóbico, tal como n-hexano e os catiões podem ser removidos com uma resina de permuta iónica. Opcionalmente, mas preferencialmente, taninos, clorofila e outros pigmentos 24 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ podem ser parcialmente removidos utilizando carvão activado (200-300 g por kg de folhas secas originais). Finalmente, o extracto pode ser filtrado e concentrado sob pressão negativa para originar aproximadamente 16 kg de PE concentrado. O PE resultante deve ter uma cor âmbar a castanha e uma consistência xaroposa. O PE utilizado nas experiências descritas abaixo derivou de Polypodium leucotomos e foi fornecido pela Industrial Farmacêutica Cantábria, S.A., Madrid, Espanha. 2. Aplicação tópica de PE em indivíduos normais

Foram seleccionados ao acaso cinco sujeitos de um grupo de 30 voluntários saudáveis homens e mulheres. Estes eram voluntários com a pele clara do Tipo III ou Tipo IV, com idade de 18 a 35, que não possuíam doenças sistémicas ou cutâneas, não tinham história de fotossensibilidade aos fármaco, não apresentavam uma reacção anormal à luz solar, e não recebiam outros medicamentos. Todos os sujeitos foram capazes de mostrar uma boa resposta de bronzeamento após exposição à luz solar.

Os voluntários foram preparados para exposição solar como segue:

Molduras adesivas com múltiplas janelas de exposição foram afixadas nas costas dos sujeitos. Cada janela tinha uma dimensão de 2x2 cm. As molduras foram fixadas no lado direito e no lado esquerdo da coluna vertebral na região infraescapular.

Uma fila de seis janelas de exposição em cada sujeito foi utilizada para determinar a MED da pele não tratada (não protegida) dos sujeitos. As janelas desta fila foram expostas a radiação solar durante 12,5', 15', 20', 25', 30', e 35' ou 40'.

Todas as outras filas foram expostas durante 20', 40', 60', 80', 100' ou mais. Destas filas, foi utilizada uma como controlo negativo (sem aplicação tópica). Outra fila foi utilizada como controlo positivo com aplicações tópicas de 25 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ um filtro solar comercialmente disponível com um SPF de 15 ("Std SPF 15": contém 3% de Parsol 1789 e 3-5% de 3-benzofenona. As quatro filas remanescentes foram utilizadas para aplicações de 10%, 25%, 50% lx e 50% 2x de PE. As aplicações de produtos de teste foram realizadas 30 minutos antes da exposição ao sol. Os produtos aplicados foram deixados a secar à temperatura ambiente.

Os sujeitos foram juntos ao ar livre. Pediu-se a estes para se deitarem virados para baixo em colchões de ar designados individualmente para cada sujeito. As exposições à luz do sol foram efectuadas entre as 11:30 da manhã e a 1:30 da tarde. A intensidade da luz solar foi medida com um radiómetro pré-calibrado (International Light Co. Newburyport, MA) dando uma média de 27 w/m2. Este nível de intensidade, quando aplicado em peles não tratadas durante 30 minutos, é equivalente a cerca de 50 mJ/cm2 de radiação solar, uma dose adequada para produzir uma reacção de queimadura solar perceptível mínima em indivíduos com pele do Tipo III ou IV. Os tempos de exposição foram os seguintes: MED Controlo 10% PE 25% PE 50% lxPE 50% 2xPE Fila Fila Fila Fila Fila Fila 12,5' 20' 20 ' 20 ' 20' 20 ' 15,0 ' 40 ' 40 ' 40 ' 40 ' 40 ' 20 ' 60 ' 60 ' 60 ' 60 ' 60 ' 25' 80' 80' 80' 80' 80 ' 30 ' 100 ' 100 ' 100 ' 100 ' 100' 35'/40 ' 100 ' 100 ' 100 ' 100' 100'

Após doses adequadas de exposição à luz solar, os locais em teste foram cobertos com uma fita adesiva opaca aos UV. Foram efectuadas observações de todos os locais expostos; (1) imediatamente após exposição da determinação de IPD; (2) 24 horas após exposição para determinação da MED e avaliação do SPF; e (3) no sexto dia após exposição para determinação do MMD. 26 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Tratamento Dose Mínima para IPD Factor de protecção (em min) (em mJ/cm2) * (1) controlo 25, 9 43,1 — (2) 10% PE 56, 9 94,8 2,16 (3) 25% PE 68, 0 113,3 2,63 (4) 50% lxPE 88, 0 147, 0 3,40 (5) 50% 2xPE 92, 0 153,0 3,55 (6) Std SPF 15 80, 0 133,6 3,09 * Intensidade do componente UVB. Um minuto de exposição ~1,66 mJ/cm2. 0 incremento da dose de UV requerida para a reacção de escurecimento imediato por pigmentação (IPD) está claramente relacionado com a concentração do PE aplicado topicamente. 0 PE aplicado topicamente protege por retardamento ou prolongamento contra a reacção de foto-oxidação do pigmento de melanina já presente na pele.

Para determinar os efeitos das aplicações de PE na MED, os sujeitos expostos ao sol foram avaliados em relação a eritema às 24 horas. Os locais da pele tratados com PE receberam uma exposição máxima ao sol de 100 minutos, um equivalente de dose de aproximadamente 3 MED. Esta dose de 3 MED pode produzir reacções de queimadura solar ligeiras a moderadas (cor rosada sem queimadura dolorosa). A tabela apresentada abaixo apresenta valores de MED assim como os factores de protecção solar calculados (SPF) para diferentes aplicações das formulações de teste:

Tratamento Dose Eritemática Mínima (Med) SPF (em min) (em m J / cm2) * (1) controlo 34, 0 56, 0 — (2) 10% PE 80, 0 133, 0 2,35 (3) 25% PE 92, 0 153, 0 2, 71 (4) 50% lxPE >100,0 >168,0 >2,94 (5) 50% 2xPE >100,0 >168,0 >2,94 (6) Std SPF 15 >100,0 >168,0 >2,94 * Intensidade do componente UVB. Um minuto de exposição ~1,66 mJ/cm2.

Cada um dos quatro produtos em teste contendo PE mostrou uma protecção eficaz e nenhum dos locais protegidos com PE apresentou uma reacção de queimadura solar visível. Dado que 27 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ ο tempo de exposição local era limitado a aproximadamente 100' para evitar o risco de queimadura substancial em qualquer sujeito, a exposição foi insuficiente para provocar eritema com os filtros solares 50% lx, 50% 2x e Std SPF 15. Deste modo, as verdadeiras MEDs destas aplicações e os valores de SPF destas formulações continuam por estabelecer (embora sejam claramente superiores a 2,94). O terceiro critério para demonstrar o efeito fotoprotector do PE tópico foi determinar a dose melanoqénica mínima (MMD) da radiação UV requerida para estimular a pigmentação atrasada ou neomelanogénese (reacção de bronzeamento) em pele de controlo não tratada e a dose de UV requerida para estimular a pigmentação atrasada da pele tratada com PE. A resposta de pigmentação atrasada parece ser devida aos efeitos cumulativos da radiação ultravioleta de comprimento de onda longo (>320 nm) . A tabela abaixo regista a dose melanogénica mínima (MMD) requerida para estimular a reacção de pigmentação atrasada (bronzeamento) nos locais de controlo (não protegidos ou não tratados) e em locais protegidos com 10%, 25%, 50% lx, 50% 2x PE. Os valores de dose melanogénica mínima observados apresentados abaixo são consistentes com a natureza fotoprotectora do PE.

Tratamento Dose melanogénica mínima (MMD) (em min) (em mJ/cm2) * Controlo 44, 0 75, 0 10% PE >88, 0 >147,0 25% PE >92, 0 >153,0 50% lxPE >100,0 >167,0 50% 2xPE >100,0 >167,0 Std SPF 15 >100,0 >167,0 * Intensidade do componente UVB. Um minuto de exposição -1,66 mJ/cm2.

Novamente, cada uma das preparações de PE deu origem a uma significativa protecção e, dado que o tempo de exposição total estava limitado a aproximadamente 100' para evitar queimar quaisquer sujeitos, a exposição era insuficiente para provocar neomelanogénese com filtros solares 50% lx, 50% 2x e Std SPF 15. Deste modo, as MMDs reais destas 28 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ aplicações ficam por estabelecer (embora estas sejam claramente superiores a 167 mJ/cm2). 3. Administração oral de PE a indivíduos normais

Após se estabelecer a segurança e não toxicidade de PE oral com dosagens superiores a 1000 mg por dia, foi decidido administrar oralmente PE, duas vezes por dia a voluntários humanos com pele do Tipo III e IV. Os sujeitos foram divididos em dois grupos de teste. No primeiro grupo de sujeitos, o grupo de "dois dias", três sujeitos normais receberam 720 mg de PE no dia antes à exposição solar e uma dose adicional de 720 mg de PE três horas antes da exposição ao sol (dose total de 1440 mg). No segundo grupo, o grupo de "5 dias, cinco sujeitos normais receberam 720 mg de PE em cada dia durante quatro dias consecutivos antes da exposição ao sol e 720 mg de PE, três horas antes da exposição no quinto dia. Dois grupos adicionais de oito sujeitos cada, um grupo de controlo não recebendo PE e um grupo utilizando o filtro solar Std SPF, foram também testados.

Todos os sujeitos foram expostos sob condições idênticas a radiação ultravioleta solar das 11:00 da manhã às 2:00 da tarde. Molduras adesivas com filas pré-cortadas de cinco janelas de exposição cada uma com uma dimensão de 2 cmx2 cm foram fixadas nas costas (região infraescapular) dos voluntários. Cada voluntário teve um mínimo de cinco filas de exposição simetricamente colocadas no lado esquerdo e direito da coluna vertebral. Cada fila possuía cinco ou seis janelas de exposição com uma dimensão de 2 cm x 2 cm. Os locais expostos ao sol foram cobertos com uma fita adesiva opaca aos UV no final de cada medição da dose de exposição.

As respostas às doses graduais de exposição ao sol, variando de 30 minutos (cerca de uma MED) a 45, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos, foram avaliadas em termos de: (1) Dose mínima de radiação solar requerida para resposta de escurecimento imediato por pigmentação (IPD) medida no final do período de exposição; (2) Dose eritemática mínima (MED) de radiação solar requerida reacção de eritema mínima medida 24 horas após o período de exposição; e (3) Dose melanogénica mínima (MMD) requerida para uma resposta de 29 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ pigmentação atrasada medida 3 dias após (72 horas) após o período de exposição.

Os resultados para a resposta de escurecimento imediato por pigmentação (IPD) de sujeitos de controlo (sem PE), sujeitos tratados com PE e sujeitos protegidos com filtro solar, foram como se segue:

Tratamento Número de Dose mínima para IPD Factor de sujeitos (em min) (em mJ/cm2) protecção (D controlo 8 25,9 43,2 — (2) PE 2 dias 3 70,0 116,7 2, 70 (2) PE 5 dias 5 >80,0 >133,3 >3,09 (4) Std SPF 15 8 >80,0 >133,3 >3,09 *Intensidade do componente UVB. Um minuto de exposição -1,66 mJ/cm2.

Torna-se claro a partir dos dados na tabela que o PE administrado oralmente era fotoprotector. Uma protecção ligeiramente melhor foi observada após 5 dias de ingestão de PE oral (dose total de 3600 mg) do que a observada após duas doses orais de PE (dose total de 1440 mg) . Esta diferença nos valores de SPF não era significativa. Por isso, não deve haver uma acumulação substancial do efeito fotoprotector para além de dois dias de doses orais de 720 mg/dia. É possível que o componente f otoprotector de PE não fique retido no sangue ou na pele durante um período extenso mas, em vez disso, seja metabolizado e rapidamente excretado na urina.

Para avaliar o efeito do PE oral na MED, foi possível utilizar os mesmos sujeitos como os seus próprios controlos. Deste modo, a dose eritemática mínima (MED) para cada um dos oitos sujeitos em teste (três do grupo do dia 2 e cinco do grupo do dia 5) foi determinada antes da administração do PE para se obterem os valores de MED de resposta de queimadura solar de pele de controlo não tratada. Então, os MEDs dos mesmos oito voluntários de teste foram determinados após estes terem consumido oralmente PE durante dois ou cinco dias. 30 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Os resultados são apresentados abaixo:

Tratamento Dose Eritemática Mínima (Med) SPF (em min) (em mJ/cm2) * (1) controlo 34, 0 56, 6 — (2) PE dias 90, 0 150, 0 2, 65 (3) PE 5 dias 100,0 166, 7 2, 94 * Intensidade do componente UVB. Um minuto de exposição ~1,66 mJ/cm2.

Os dados indicam que o PE administrado oralmente aumenta os valores de MED quase três vezes. 0 PE administrado oralmente (3600 mg) dado durante cinco dias consecutivos produziu um factor de fotoprotecção de 2,94 enquanto que o PE administrado oralmente dado em 2 dias (1440 mg) produziu um factor de f otoprotecção de 2,65. Isto sugere que o PE é fotoprotector mesmo após apenas dois dias de dosagens orais. Os dados revelam também que não existe uma melhoria adicional significativa de fotoprotecção quando as dosagens de PE eram repetidas diariamente durante 5 dias. Deste modo, os dados parecem demonstrar um efeito fotoprotector máximo do PE no espaço de 3 a 24 horas após a ingestão oral do PE e que o efeito fotoprotector do PE não é cumulativo após este periodo. E ainda de interesse verificar que a pele dos sujeitos tratados com PE não mostrava evidência de reacção de queimadura solar quando os sujeitos eram expostos a dosagens graduais de radiação solar variando até 150 a 180 minutos. Em contraste, a resposta a pele de controlo que não recebeu PE oral mostrou evidência de reacção de queimadura solar após exposição a apenas 30 a 34 minutos de radiação solar ao meio-dia. A exposição ao sol da pele de controlo não protegida durante seis minutos produziu um grau moderado de reacção de queimadura solar com suavidade.

De modo a avaliar os efeitos do PE administrado oralmente na resposta de bronzeamento retardada ou neomelanogénese, foram seleccionados ao acaso sujeitos saudáveis. Para estes sujeitos (a) a dose melanogénica minima (MED) requerida para indução da reacção de bronzeamento retardada foi avaliada sem a administração de PE e (b) a MMD dos mesmos voluntários foi determinada após estes terem recebido doses orais de PE (720 mg/dia) quer durante dois dias consecutivos quer 31 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ durante cinco dias consecutivos. Como controlo positivo foi também medida a dose requerida para a indução da resposta de bronzeamento retardada na pele bem protegida pelo filtro solar Std SPF 15. Devido a constrangimentos de tempo, a indução de resposta de bronzeamento retardada foi avaliada às 72 horas, em vez de no dia 5 (120 horas) após exposição ao sol. Os resultados são apresentados na tabela abaixo:

Tratamento Número de Dose melanogénica mínima Resposta de sujeitos (em min) (em mJ/cm2) pigmentação (D controlo 5 45, 0 75 Moderada (2) PE 2 dias 3 75, 0 125 Mínima (2) PE 5 dias 5 90, 0 150 Fraca (4) Std SPF 15 5 >150,0 >250 Mínima * Intensidade do componente UVB. Um minuto de exposição -1,66 mJ/cm2.

Os dados mostram que o PE oral é fotoprotector e que a dose requerida para indução de resposta de bronzeamento atrasada em peles protegidas com PE é muito superior à dose requerida para indução de resposta de bronzeamento atrasada em peles não protegidas.

Deste modo, determinando a dose requerida para a indução de resposta de bronzeamento atrasada em peles protegidas administrando oralmente PE, mostra-se que o PE é na verdade fotoprotector contra a reacção de queimadura solar e a indução de pigmentação de melanina (reacção de bronzeamento retardada). 4. Aplicação tópica de PE em indivíduos fotossensibilizados

Como outro meio de avaliar as propriedades fotoprotectoras do PE, foram testadas aplicações tópicas em sujeitos deliberadamente tornados fotossensíveis por administração oral de psoralenos. Os psoralenos 8-metoxi-psoraleno (8-MOP) e 5-metoxipsoraleno (5-MOP) são largamente utilizados nos Estados Unidos e em todo o mundo no tratamento da psoríase e vitiligo em ligação com a exposição à radiação UVA (320-400 nm) a partir de fontes de luz artificial ou radiação solar. Estes fármacos são conhecidos por aumentarem a fotossensibilidade da pele ao participar numa reacção fototóxica com radiação ultravioleta e assim, 32 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ induzirem eritema, edema e macieza da pele. PUVA (P = psoraleno; UVA = ultravioletas A) é um protocolo corrente que envolve a ingestão oral de psoralenos e exposição subsequente da pele a radiação ultravioleta. A pele normal do Tipo III ou Tipo IV exposta a radiação solar (320-400 nm) durante até 45 minutos sem o fármaco 8-MOP ou 5-MOP não mostra vermelhidão ou reacção fototóxica (i.e. "queimadura solar") quando examinada 48 a 72 horas após a exposição. Na pele foto-sensibilizada com 8-MOP oral ou 5-MOP oral, contudo, a pele exposta a radiação solar durante tão pouco quanto 10 minutos pode mostrar um grau gradualmente crescente de fototoxicidade ou queimadura solar quando examinada 48 a 72 horas após exposição. A dose de radiação ultravioleta necessária para produzir a fotossensibilização da pele e fototoxicidade é definida como dose fototóxica mínima (MPD). Deste modo, os psoralenos 8-MOP e 5-MOP fotossensibilizam a pele e provocam um grau mensurável de reacção fototóxica. Especificamente, com 8-MOP ou 5-MOP administrados oralmente, é necessária uma dose muito inferior (três a cinco vezes) de radiação UVA para produzir vermelhidão e fototoxicidade. Utilizando PUVA como ensaio, pode-se estabelecer as propriedades fotoprotectoras de uma preparação medindo a sua capacidade de inibir a fotoxicidade em pele fotossensibilizada com 8-MOP ou 5-MOP.

Tal como acima, foram seleccionados quatro sujeitos humanos normais com pele do Tipo III ou IV para demonstrar a capacidade do PE para retardar a reacção de fototoxicidade de 8-MOP ou 5-MOP. O 8-MOP foi administrado a dois sujeitos com uma dose de 0,45-0,6 mg por kg, cerca de 1,5-2 horas antes da exposição solar a radiação UVA. O 5-MOP, um fármaco fototóxico mais fraco do que o 8-MOP, foi administrado a dois sujeitos diferentes com uma dose mais elevada de 1,0-1,2 mg por kg, 1,5-2 horas antes da exposição. Para cada grupo de sujeitos, determinou-se a dose fototóxica mínima (MPD) examinando a vermelhidão e os fotodanos 72 horas após exposição ao sol.

Avaliaram-se as propriedades fotoprotectoras de PE determinando a dose fototóxica mínima (MPD) de UV requerida por sujeitos que receberam aplicação tópica de PE após a administração oral quer de 8-MOP (0,6 mg/kg) quer 5-MOP 33 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ (1,0-1,2 mg/kg), 1,5-2 horas antes da exposição ao sol do meio-dia.

Cada sujeito recebeu aplicações tópicas (2 μΐ/cm2) de formulações contendo 10%, 25% e 50% de PE em forma de loção em locais pré-designados marcados com as molduras adesivas com janelas de exposição de 2x2 cm. Um dos locais da moldura foi utilizado para a aplicação do filtro solar Std SPF 15 para servir como padrão interno. Um local adicional da moldura não recebeu qualquer aplicação tópica e este local serviu como local de controlo não tratado para avaliar o valor de MPD da pele sem qualquer fotoprotecção.

Os resultados para o 8-MOP administrado oralmente e PE aplicado topicamente estão apresentados abaixo: MPD medida às 72 horas Factor de (em min) (em J/cm2) * protecção (1) 8-MOP oral (pele não tratada) 7,5 2,0 — (2) 8-MOP oral + 10% PE tópico >30,0 >8, 0 >4, 0 (3) 8-MOP oral + 25% PE tópico >30,0 >8, 0 >4, 0 (4) 8-MOP oral + 50% PE tópico >30, 0 >8,0 >4, 0 (5) 8-MOP oral + Std SPF 15 >30, 0 >8,0 >4, 0 * Intensidade do componente UVA. Um minuto de exposição ~0,267 mJ/cm2.

Os resultados para 5-MOP administrado oralmente e PE aplicado topicamente são apresentados abaixo: MPD medida às 72 horas Factor de (em min) (em J/cm2) * protecção (1) 5-MOP oral (pele não tratada) 20, 0 5,3 — (2) 5-MOP oral + 10% PE tópico >30, 0 >8, 0 >1,5 (3) 5-MOP oral + 25% PE tópico >45, 0 >12, 0 >2,2 (4) 5-MOP oral + 50% PE tópico >45, 0 >12, 0 >2,2 (5) 5-MOP oral + Std SPF 15 >57, 5 >12, 0 >3,0 *Intensidade do componente UVA. Um minuto de exposição -0,267 mJ/cm2.

Estes dados mostram que o PE administrado oralmente é fotoprotector da pele fotossensibilizada quer por 8-MOP quer por 5-MOP. Deve relembrar-se que o 5-MOP administrado oralmente é menos fototóxico do que o 8-MOP administrado oralmente. Isto explica o requisito de maiores doses para a 34 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ determinação de MPD com 5-MOP do que o requerido para a determinação de MPD de 8-MOP. Tal como nas experiências prévias, de modo a evitar o risco de provocar queimaduras solares significativas incluindo a reacção de formação de bolhas em sujeitos humanos, os tempos de exposição foram adequadamente limitados. Como resultado, os MPDs reais e os factores de protecção permanecem por estabelecer (embora o PE claramente tenha proporcionado um factor de protecção de pelo menos 1,5 a pelo menos 4,0). 5. Administração oral de PE a indivíduos fotossensibilizados

Os efeitos fotoprotectores de PE administrado oralmente foram também avaliados em sujeitos que receberam os fármacos fotossensibilizadores 8-MOP e 5-MOP, como se segue:

Foram seleccionados quatro sujeitos com pele do Tipo III e IV. A dois destes quatro sujeitos foram dadas dosagens orais do fármaco 8-MOP (0,6 mg/kg) duas horas antes de exposição solar. A outros dois sujeitos foi dado 5-MOP (1, ΟΙ, 2 mg/kg) oral 2 horas antes da exposição solar. As doses fototóxicas mínimas (MPD) da pele não protegida destes sujeitos de teste foram então avaliadas às 72 horas para se obterem os valores de MPD de controlo sem PE.

Cada um destes mesmos sujeitos foi então novamente testado em pele previamente não exposta com PE como fotoprotector. A estes foram dadas dosagens orais de 1440 mg de PE (720 mg de PE 18 horas antes da exposição solar e 720 mg de PE três horas antes da exposição solar) . Então, tal como antes, a estes foram dadas uma dose oral de quer o 8-MOP (0,6 mg/kg) quer o 5-MOP (1,0-1,2 mg/kg) duas horas antes da exposição solar. Os sujeitos foram examinados 72 horas após exposição para determinar o MPD na presença de PE administrado oralmente e psoraleno.

Os resultados dos testes com 8-MOP administrado oralmente e PE administrado oralmente são apresentados abaixo: 35 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ MPD medida às 72 horas Factor de (em min) (em J/cm2) * protecção (1) 8-MOP oral apenas (controlo) 7,5 2,0 — (2) 8-MOP oral + 1440 mg PE oral 52,5 14, 0 7,0 * Intensidade do componente UVA. Um minuto de exposição -0,267 mJ/cm2.

Os resultados dos testes com 5-MOP administrado oralmente e PE administrado oralmente são apresentados abaixo: MPD medida às 72 horas Factor de (em min) (em J/cm2) * protecção (1) 5-MOP oral apenas (controlo) 15,0 4,0 — (2) 5-MOP oral + 1440 mg PE oral 45,0 12, 0 3,0 * Intensidade do componente UVA. Um minuto de exposição -0,267 mJ/cm2.

Estes resultados estabelecem a propriedade de fotoprotecção de fototoxicidade do PE administrado oralmente. Este extracto natural aumentou os valores de MPD para a fotossensibilização da pele induzida quer pelos psoralenos 5-MOP ou 8-MOP num factor de três a sete vezes, respectivamente.

6. Eliminação do anião superóxido pelo PE A formação de radicais O2'- (aniões superóxido) foi realizada utilizando riboflavina (RF), um gerador bem conhecido de aniões superóxido (ver Carraro e Pathak, J.

Invest. Dermatol. 90: 267-275, 1988; Beauchamp e Fridovich,

Anal. Biochem. 44: 276-287, 1971) . A produção de C>2'_ foi verificada monitorizando espectrofotometricamente a redução fotossensibilizada por riboflavina de nitro azul de tetrazólio (NBT) em nitro azul de diformazan (NBF) a 560 nm através da reacção NBT + 402'~ -* NBF + 402. A geração de 02'^ foi quantitativamente estimada em função da dose de exposição crescente de UVA (1-10 J/cm2) e registando o aumento do valor de densidade óptica a 560 nm da solução irradiada. A paragem da produção de Cg'- foi confirmada utilizando superóxido dismutase (50 unidades/ml) e uma aliquota de uma solução sem cor diluída de PE (0,01% ou menos). O potencial de eliminação do PE foi também avaliada aumentando a dose de irradiação dos UVA (0,5-1,0 J/cm2) e observação da percentagem de eliminação do CU’- gerado por 36 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ adição de uma aliquota de PE no sistema reaccional.

Os resultados desta investigação são mostrados na Fig. 1 e Fig. 2. A fonte de radiação utilizada era policromática e produzia uma fracção principal de UVB assim como alguma fracção de radiação UVA. A radiação UV produziu 02'” e o aumento da produção de 02,_ com o aumento da dose de radiação é claro. 0 PE só contribuiu pouco para a produção de CU'-. Na presença de riboflavina, contudo, não havia geração significativa de (V-· Quando a geração de C>2'~ foi estudada na presença de riboflavina e de PE (0,01%), observou-se uma redução substancial do rendimento de CV”. Quando os sistemas de riboflavina e os UVA e de riboflavina e UVB foram utilizados para a geração de O2' , a adição de PE produziu reduções de 42,2% e de 55% na produção de 02'”, respectivamente. Não se pode produzir 100% de eliminação da produção de C>2'~ devido à opacidade e aspecto turvo que resultam de maiores concentrações de PE interferindo com a determinação espectrofotométrica.

7. Eliminação de oxigénio singuleto com PE A formação e detecção de '02 (oxigénio singuleto) foram conduzidas através de métodos conhecidos (ver Kraljic e Mohsni, Photochem. Photobiol., 28: 577-581, 1978). 5 ml de uma solução de N,N-dimetil-p-nitrosoanilina (RNO, 0,35-9,4 x 10~5 M) em tampão fosfato 0,5 M, pH 7,0, foi misturada com histidina 10~2 M (HIS, utilizada como receptor selectivo de J O2) e um fotossensibilizador conhecido, tal como um derivado de hematoporf irina, rose bengal, azul de metileno ou psoraleno (3-carbetoxipsoraleno) com uma concentração de 10“5 M. Estas soluções com RNO e fotossensibilizador foram irradiadas com UVA (1-10 J/cm2) e o branqueamento subsequente de RNO foi registado espectrofotometricamente a 440 nm. O potencial de eliminação do PE foi comparado com eliminadores de J02 conhecidos (e.g. NaN3 ou 1, 4-diazabiciclo(2.2.2)-octano (DABCO)) utilizados como compostos de referência. A inibição da produção de '02 foi expressa como uma percentagem dos valores de controlo (sem NaN3 ou DABCO).

Os dados de produção de '02 obtidos com rose bengal (RB 1CT5 M) com e sem a presença de PE são mostrados na Fig. 3. Ao contrário do NaN3 e DABCO, que são eliminadores bem conhecidos de ‘ 02 e que produzem quase 100% de inibição da taxa de produção de Ό2, os efeitos do PE na inibição da 37 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ produção de ‘02 eram menos pronunciados. Menos de 10% de inibição da produção de '02 pode ser observada. 8. Formulações para aplicação tópica

Ingrediente % p/p Loção Gel Solução Creme PE 15.00 6, 00 6, 00 6,00 Hygroplex HHG 5, 00 5, 00 5, 00 5, 00 Acetato de vitamina E 0,20 — — 0,50 Álcool cetílico 3, 00 — — — EDTA Na2+ 0, 10 0, 10 — — Glicerina 5, 10 9,25 6,00 6,00 Hidroxietilcelulose 1,02 1,85 — — Perfume 0,12 0,12 0,20 0,30 Água destilada s/q s/q s/q s/q Kathon CG (bactericida) 0,20 0,20 0,20 0,20 Butil-hidroxitolueno — 0,01 0,01 — Polisorbato (Tween 80) — — 0,20 — Álcool 96 — — 10,00 2,00 Ixafin 15 15.00 — — — Metilparabeno — — — 0,20 Propilparabeno — — — 0,10 Tensioderm — — — 1,00 Miristato de isopropilo — — — 1,50 9. Formulações para administração oral 18 kg de amido de milho foram adicionados a 12,6 kg de xarope de PE concentrado e misturou-se até ser obtida uma massa homogénea. A massa é dessecada numa estufa a 35-40°C durante 8 horas. Então a massa seca é filtrada através de uma malha N 40 DIN. Após 45' de mistura, 18 kg de lactose e 1,5 kg de estearato de magnésio são adicionados. Cápsulas de gelatina dura (tamanho 0) são cheias com o pó resultante. A cápsula média pesa 495 mg e contém PE 126 mg1

Amido de milho 180 mg

Lactose 180 mg

Estearato de magnésio 15 mg 1

Um excesso de 5% é utilizado para compensar a perda de potencial durante o processo de produção. 38 ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ

Como alternativa, os 18 kg de lactose podem ser substituídos por 10 kg de celulose microcristalina e 8 kg de polivinilpirrolidona.

Embora o invento tenha sido descrito acima no que respeita a várias formas de concretização presentemente preferidas, será evidente para um especialista na matéria que podem ser feitas muitas variações e modificações. Por isso, o invento não deve ser entendido como limitado às formas de concretização particulares aqui citadas mas, em vez disso, deve ser entendido como englobando todas as variações e modificações que caiam dentro do espírito e do domínio das reivindicações em anexo.

Lisboa,

Claims (22)

1. ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Preparação para aplicação tópica que compreende uma quantidade eficaz para fotoprotecção de um extracto de Polypodium fotoprotector e um portador farmaceuticamente aceitável para aplicação tópica, em que o extracto de Polypodium é seleccionado do grupo constituído por Polypodium leucotomos, Polypodium percussum e Polypodium triseriale.
2. 2. Preparação de acordo com a reivindicação 1, em que a referida preparação inclui pelo menos cerca de 1% em peso de extracto de Polypodium, preferencialmente pelo menos cerca de 10% em peso, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25% em peso, e muito preferencialmente pelo menos cerca de 50% em peso.
3. 3. Preparação de acordo com a reivindicação 1, em que a referida preparação inclui entre 1% e menos do que 3% de extracto de Polypodium.
4. 4. Preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida preparação proporciona um factor de protecção solar (SPF) para uma dose eritemática mínima (MED) avaliada às 24 horas de pelo menos 2, quando aplicada com uma concentração de 2 μΐ/cm2 em peles normais dos Tipos I a Tipo IV.
5. 5. Preparação de acordo com a reivindicação 4, em que a referida preparação proporciona um factor de protecção solar de pelo menos 5.
6. 6. Preparação de acordo com a reivindicação 4, em que a referida preparação proporciona um factor de protecção solar de pelo menos 10.
7. 7. Preparação de acordo com a reivindicação 4, em que a referida preparação proporciona um factor de protecção solar de pelo menos 15.
8. 8. Preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida preparação é ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ 2/4 preparada através de uma extracção com álcool de uma folha ou um rizoma de uma planta de Polypodium.
9. 9. Preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a preparação inclui uma composição seleccionada do grupo constituído por agentes filtros solares físicos, agentes filtros solares químicos e agentes cosméticos.
10. 10. Preparação de acordo com a reivindicação 9, em que o referido portador inclui um agente filtro solar físico seleccionado do grupo constituído por dióxido de titânio, dióxido de titânio tratado com silicone, óxido de zinco, óxido ferroso, cloreto férrico, talco, óxido de crómio e óxido de cobalto.
11. 11. Preparação de acordo com a reivindicação 9, em que o referido agente filtro solar químico é seleccionado do grupo constituído por ácido para-aminobenzóico, ésteres de ácido para-aminobenzóico, salicilatos, cinamatos, benzofenonas, di-hidroxiacetona, parsol 1789 e melanina.
12. 12. Produto embalado que compreende um recipiente, uma preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes dentro do referido recipiente, e instruções para aplicação tópica da referida preparação, para proporcionar fotoprotecção.
13. 13. Utilização de um extracto de Polypodium fotoprotector na produção de um medicamento para fotoprotecção tópica, em que o medicamento é aplicado topicamente antes da exposição a radiação ultravioleta.
14. 14. Utilização de uma preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11 para a produção de um medicamento para utilização num método para proporcionar fotoprotecção a um indivíduo com pele normal, que compreende a aplicação tópica de uma quantidade eficaz para fotoprotecção da referida preparação à referida pele antes da exposição a radiação ultravioleta. ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ 3/4
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o medicamento compreende uma quantidade de um extracto fotoprotector de Polypodium eficaz para fotoprotecção quando aplicado topicamente à pele e um portador tópico farmaceuticamente aceitável, em que o medicamento compreende ainda uma composição seleccionada do grupo constituído por agentes filtros solares físicos, agentes filtros solares químicos e agentes cosméticos.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o referido portador inclui um agente filtro solar físico seleccionado do grupo constituído por dióxido de titânio, dióxido de titânio tratado com silicone, óxido de zinco, óxido ferroso, cloreto férrico, talco, óxido de crómio e óxido de cobalto.
17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o referido agente filtro solar químico é seleccionado do grupo constituído por ácido para-aminobenzóico, ésteres de ácido para-aminobenzóico, salicilatos, cinamatos, benzofenonas, di-hidroxiacetona, parsol 1789 e melanina.
18. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o referido extracto é seleccionado do grupo constituído por um extracto de Polypodium aureum, um extracto de Polypodium crassifolium, um extracto de Polypodium decumanum, um extracto de Polypodium lanceolatum, um extracto de Polypodium leucotomos, um extracto de Polypodium percussum, um extracto de Polypodium triseriale, e um extracto de Polypodium vulgare.
19. 19. Utilização de um extracto fotoprotector de Polypodium na produção de um medicamento para utilização num método de protecção contra a reacção de queimadura solar e/ou protecção contra reacção de escurecimento imediato por pigmentação assim como reacção de bronzeamento atrasada num indivíduo com pele normal, compreendendo administração oral de uma quantidade eficaz para fotoprotecção antes da exposição a radiação ultravioleta.
20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o medicamento é administrado a um indivíduo com pele normal, ΕΡ Ο 813 405 /ΡΤ 4/4 numa quantidade eficaz para que o extracto de Polypodium proporcione protecção contra a reacção de queimadura solar e/ou indução da piqmentação de melanina no espaço de 2 dias antes da exposição à radiação ultravioleta.
21. 21. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que o referido indivíduo é um adulto e a referida dosagem é de entre 720 mg e 1440 mg, tomada no espaço de um período de 24 horas antes da exposição à radiação ultravioleta.
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o referido indivíduo é um adulto e a referida dosagem é de entre 360 mg e 720 mg, tomada no espaço de um período de 3 horas antes da exposição à radiação ultravioleta. Lisboa,