PT666762E - Processo de fabricar conjugados de lipidos - Google Patents
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Description
Θο6,^ 6TL
DESCRIÇÃO "PROCESSO DE FABRICAR CONJUGADOS DE LÍPIDOS"
Antecedentes da Invenção
As células vivas são principalmente compostas por proteínas, hidratos de carbono e lípidos. A membrana de plasma que envolve as células e com efeito todas as membranas biológicas são conjuntos de moléculas de lípidos e de proteínas mantidas em conjunto por interacções não-covalentes. Os três principais tipos de lípidos em membranas celulares são fosfolípidos (os mais abundantes), colesterol e glicolípidos. Todos os três são anfipáticos, ou seja, têm uma extremidade hidrofílica ("adora-água" ou polar) e uma extremidade hidrofóbica ("detesta-água" ou não polar).
Quando as moléculas antipáticas estão rodeadas por todos os lados por um ambiente aquoso, tendem a agregar-se de maneira a enterrar as caudas hidrofóbicas e deixar as cabeças hidrofílicas expostas à água. Ao fazê-lo, podem formar qualquer uma das seguintes estruturas: 1. ) micelas esféricas, com as caudas para dentro 2. ) folhas biomoleculares, ou 3. ) bicamadas, com as caudas hidrofóbicas entaladas entre o grupo de cabeças hidrofílicas. -2- A maioria dos fosfolípidos e glicolípidos formam bicamadas espontaneamente em ambientes aquosos. Portanto, a formação da porção lipídica das membranas biológicas é um processo de auto-montagem. Além disso, essas bicamadas de lípidos tendem a fechar-se sobre si próprias para formarem compartimentos selados. Pela mesma razão por que as bicamadas de lípidos se auto-montam, quando rasgadas auto-selam-se.
Embora a bicamada lipídica compreendendo uma membrana de plasma celular seja fluida, é relativamente impermeável e, portanto, serve como uma barreira efectiva para a entrada no citoplasma de uma célula. Esta função protectora é servida por outras membranas biológicas incluindo membranas mucosas (por exemplo, a mucosa gástrica e a mucosa nasal) e mesmo a pele.
Contudo, para fins terapêuticos, seria útil obter certos agentes terapêuticos através de membranas biológicas. Os lipossomas estão a ser investigados como veículos para a entrega de agentes terapêuticos através de membranas biológicas. Os lipossomas são estruturas de lípidos esféricas que podem ser preparadas de maneira a encapsular moléculas biologicamente activas solúveis em água no interior aquoso. Quando administradas in vivo, os lipossomas fundem-se com membranas biológicas e por isso entregam a molécula biologicamente activa contida lá dentro.
Contudo, descobriu-se que os lipossomas injectados no corpo nem sempre fazem a entrega no local pretendido e, em vez disso, acumulam-se no fígado e no baço; e nos locais de inflamação (Ostro, MJ. e P.R. Cullis, "Am. J. Hop. Pharm 46”: 1576-1587 (1989)). Lipossomas funcionalizados estão a ser investigados como veículos para a entrega de medicamentos a um alvo. Os fosfolípidos galactossilados, por exemplo, têm sido incorporados em lipossomas e são usados para entregar os lipossomas especificamente aos receptores da
asialoglicoproteína do sistema hepático (Haensler, J. e F. Schuber, "Glycoconjugate J." 1991, 8, pp 116-124). Os imunolipossomas, construídos por conjugação covalente de anticorpos às porções fosfode lípidos sobre a superfície lipossomal, também se mostraram promissores na entrega de lipossomas tendo como alvo tecidos celulares específicos (Nassander, R.U., PA. Steerenber, H. Poppe, G. Storm, L.G. Poels, W.H. De Jong, D.J.A. Crommelin, "Canc. Res." 1992, 52, pgs. 46-653, e Pinnaduwage, P. e L. Huang, "Biochemistry” 1992, 31, pgs. 2850-2855).
Além da entrega a um alvo, o tamanho dos lipossomas foi reduzido para melhorar a sua entrega a um alvo e a sua transferência através de membranas biológicas. Moléculas de lípidos de cadeia linear mostraram ser eficazes para entregarem pequenos péptidos. Por exemplo, descobriu-se que a etanolamina fosfolipídica de fosfatidilo conjugada a tripéptido de muramilo para formar (MTP-PE) era activa in vivo e verificou-se a sua presença em vários órgãos 24 horas depois da injecção, ao passo que se descobriu que o péptido principal foi excretado para fora do corpo 60 minutos depois da injecção (Fogler, W.E., R. Wade, D.E. Brundish, I.J. Fidler, "J. Immunol." 1985, 135, pgs. 1272-1377, e Phillips, N.C., J. Rioux, M.-S. Tsao, "Hepatology" 1988, 8, pgs. 1046-1050). Estes resultados sugerem que a absorção de um péptido é potenciada pela conjugação a uma porção lipofílica. Outros agentes que têm sido acoplados a fosfolípidos incluem aciclovir (Welch, C.J., A. Larsson, A.C. Ericson, B. Oberg, R. Datema, J. Chattopadhyaya, Acta Chem. Scand. 1985, B39, pgs. 47-54), gangliossido GM1 (Pacuszka, T., R.M. Bradley, P.H. Fishman, "Biochemistry" 30, pgs. 2563-2570), oligossacaridos (Childs, R.A., K. Drickamer, T. Kawasaki, S. Thiel, T. Mizuochi, T. Feizi, "Biochem. J." 1989, 262, pgs. 131-138), trasferina do soro (Azelius, P. E.J.F. Demant, G.H. Hansen, P.B. Jensen, "Biochim. Biophys. Acta" 1989, 979, pgs, 231-238), biotina, e reagentes fluorescentes. -4-
Foram descritos vários métodos de derivatizar fosfolípidos para facilitar a sua conjugação com outras moléculas ou porções (para informação, ver Heath, T.D. e F.J. Martin, "Chemistry and Physics ofLipids" 1986, 40, pgs. 347-358). Contudo, cada um destes métodos padece de várias dificuldades na sua aplicação prática. Por exemplo, um método compreende a activação por glutaraldeído de fosfatidiletanolamina e conjugação final com aminas por aminação redutora. O problema da dimerização tanto entre os fosfolípidos como entre as proteínas tem feito com que este método seja menos do que ideal. Um método alternativo compreende a formação da amida entre a fosfatidiletanolamina e o término carboxílico de um péptido ou proteína. Contudo, este método enferma de baixos rendimentos e formação de subprodutos.
Ainda noutra abordagem, o fosfolípido e a proteína são activados em primeiro lugar e são então reagidos para formarem o conjugado. Por exemplo, Hutchinson et. al. descrevem um método em que a fosfatidiletanolamina é activada com N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA) e tratada com uma hidroxilamina para produzir um deriyado fosfolípido-tiolítico. A proteína de interesse é também activada com maleimida e é então tratada com o derivado fosfolipídico para formar um conjugado estável por meio de um tioéter (Hutchinson et. al., "FEBS Lett. 1986, 234, pgs. 493-6). Numa variante deste protocolo, a fosfatidiletanolamina é activada com uma porção de maleimida e o resíduo de lisina de uma proteína é activado com um tiol protegido (Loughrey, H.C. et. al., "J. Immun. Methods" 1990, 132, pgs. 25-35). Na prática, protocolos utilizando estas abordagens são difíceis de realizar e o custo do agente de derivatização é proibitivamente caro para escalas superiores a quantidades de alguns gramas. -5-
Os conjugados fosfode lípidos também foram formados pela funcionalização de fosfatidiletanolamina usando um reagente de ligação cruzada (por exemplo, ditiobis(succinimidil-propionato)) e pela reacção deste / intermediário com uma proteína contendo lisina de maneira que a porção de succinimidilo seja deslocada pelo grupo amino do resíduo de lisina (Afzelius, P., "Biochem. Biophys. Acta" 1989, 979, pgs. 231-8). Contudo, os reagentes de ligação cruzada não são economicamente viáveis para a produção de conjugados fosfode lípidos, particularmente em grande escala. Ainda noutro método, a fosfatidiletanolamina pode ser acoplada a proteínas glicossiladas por meio da cadeia de hidratos de carbono da proteína. Por exemplo, os glicanos podem ser oxidados com periodato de sódio para produzirem aldeídos reactivos que podem então ser acoplados a fosfatidiletanolamina por meio da aminação redutiva com cianoboro-hidreto de sódio (Heath, T. et. al., "Biochim. Biophys. Acta" 1980, 599:42). A aplicação deste método só é limitada às glicoproteínas e é frequentemente associada a baixos rendimentos e à formação de subprodutos.
Nenhum dos métodos atrás descritos descreve um sistema simples, geralmente aplicável, eficaz e económico (ou seja, prático) para gerar fosfolípi-dos ou outros conjugados de lípidos.
Sumário da Invenção
Em geral, a invenção descreve um processo prático, fácil de efectuar, de conjugar agentes activos biológicos a certos lípidos reactivos (isto é, lípidos contendo nucleófilo como lipoaminas e lipo-alcoóis). O processo envolve misturar uma concentração apropriada do lípido reactivo com uma quantidade apropriada de diceteno a uma temperatura e pH adequados e durante um período de tempo adequado para formar um lípido aceto-acetilado que pode então ser isolado, dissolvido num meio adequado, e misturado com um agente -6- biologicamente activo contendo nucleófilos para formar um conjugado de lípido-agente biologicamente activo. Altemativamente, o lípido acetoacetilado pode ser misturado com uma poliamina para formar um lípido catiónico.
Os lípidos reactivos preferidos para uso na presente invenção incluem fosfolípidos, glicolípidos, poli-isoprenoídos, éter-lípidos ou esteróides tendo pelo menos um álcool nucleofílico ou porção de amina. Lípidos de partida especialmente preferidos são as fosfatidilalcanolaminas.
Conjugados de agente biologicamente activo-lípido feitos pelo processo da presente invenção são úteis, por exemplo, na entrega de agentes biologicamente activos através de membranas biológicas e até às células, são úteis como auxiliares e também no estudo da biofísica das membranas. Os lípidos catiónicos preparados de acordo com o método aqui descrito são também úteis para a entrega de medicamentos.
Descrição Pormenorizada A presente invenção proporciona um processo para a produção de um conjugado de agente biologicamente activo - (fosfo)lípido ou um (fosfo)lípi-do catiónico a partir de um lípido acetoacetilado caracterizado pelo facto de compreender: (a) misturar um lípido reactivo correpondendo à seguinte fórmula geral:
W-T-X-Y-Z num solvente orgânico com diceteno ou um análogo ou derivado do mesmo correspondendo à seguinte fórmula geral: -7- F:7
P 3 \ onde W representa uma cadeia longa de ácido gordo alquílico ou alquenílico, ou uma cadeia longa de alquilo ou alquenilo, ou um esteróide tendo uma ligação amido ou éster ou um radical correspondendo à seguinte fórmula geral: CH,— CH, — CH-> * t»
I I o o onde Ri e R2 representam, independentemente, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, qualquer dos quais pode ser substituído, ou C(0)R3 representa alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, qualquer dos quais pode ser substituído; T representa um grupo correspondendo à seguinte fórmula geral: o
II — o — P — Ο Ι
OA onde A representa uma porção catiónica ou -O- ou está ausente; X representa alquilo, alquenilo, aralquilo, qualquer dos quais pode ser substituído, ou está ausente; -8- Y representa uma cadeia alquilo opcionalmente substituída com ligações amida, éster, amina e éter. Z representa -OH ou NH(Ri0) onde Ri0 representa H, alquilo e arilo; e R5, Re, R7 e R8 representam, independentemente, H ou alquilo inferior; (b) isolar o lípido acetoacetilado resultante; (c) dissolver o lípido acetoacetilado num meio adequado; (d) misturar o lípido acetoacetilado com um agente biologicamente activo contendo nucleófilo, que é um péptido, proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono ou outro composto tendo uma porção amino ou hidrazina, ou uma poliamina contendo três ou mais unidades NH ou NH2; opcionalmente, contactar o conjugado de agente biologicamente activo-lípido ou lípido catiónico com um agente de redução; e (e) isolar o resultante conjugado agente biologicamente activo-lípido ou lípido catiónico.
Preferivelmente, em (a): a concentração no solvente orgânico é de -9- 0,001 a 0,1 M, a temperatura é de 10 a 50°C e o pH é de 3 a 8; e/ou em (d): a concentração do lípido é de lmM a 1,0M, a temperatura é de 0 a 60°C e o pH é de 2 a 9.
Noutro modelo de realização, a presente invenção proporciona um processo para a produção de uma fosfatidilalcanolamina N-substituída correspondendo à seguinte fórmula geral:
onde
Ri e R-2 representam, independentemente, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo ou C(0)R3 onde R3 representa alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo ou aralquilo; R4 representa H, alquilo ou arilo; R5, R^, R7 e Rg representam, independentemente, H ou alquilo; X representa alquilo, alquenilo ou aralquilo; e Y representa uma porção catiónica; sendo qualquer um dos grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo e aralquilo opcionalmente substituído; caracterizado pelo facto de compreender: (a) misturar uma fosfatidilalcanolamina num solvente orgânico com diceteno ou um análogo ou derivado do mesmo como atrás definido, sendo a concentração no solvente orgânico de 0,001 a 0,1 M, sendo a temperatura de 10 a 50°C e o pH de 3 a 8; e (b) isolar a resultante fosfatidilalcanolamina N-substituída.
Ainda noutro modelo de realização, a presente invenção proporciona uma fosfatidilalcanolamina N-substituída que pode ser obtida por um processo caracterizado pelo facto de ser 1,2-dimiristoíl- ou -diestearoil-sn-glicero-3-fosfo-(N-acetoacetil)-etanolamina.
Tendo indicado o âmbito da presente invenção, será a mesma agora descrita e ilustrada em termos mais generalizados.
Tal como são aqui usadas, as seguintes palavras e frases terão o significado que se segue:
Definições "agente biologicamente activo" - significará um péptido, proteína, ácido nucleico (por exemplo, ADN ou ARN), hidrato de carbono ou outro composto (por exemplo, medicamento); -11 - "agente biologicamente activo contendo nucleófilo" - significará um agente biologicamente activo tendo uma porção amino (-NH2) ou hidrazino (-NH-NH2). Por exemplo, uma porção amino pode estar presente no término amino de uma proteína ou péptido ou pode estar presente se a proteína incluir um resíduo de lisina ou omitina; "lípido reactivo" - significará uma substância contento nucleófilo que é solúvel num solvente orgânico. Exemplos de lípidos reactivos incluem lipo-aminas (isto é, lípidos contendo uma porção amina -NH) e lipo-alcoóis (isto é, lípidos contendo uma porção álcool -OH). Lípidos reactivos podem ser, por exemplo, fosfolípidos (isto é, compostos de uma coluna de glicerol acilada com ácidos gordos nas posições Ci e C2 e fosforilada no término remanescente); os lípidos de éter (isto é, lípidos com um grupo alquilo (ou alquenilo) ligado à função hidroxilo de glicerol (por exemplo, factor de activação das plaquetas)); glicolípidos (isto é, lípidos compostos por uma região hidrofilica contendo 2 longas caudas de hidrocarbonetos e uma região polar que contém 1 ou mais resíduos de açúcar; poli-isoprenoídos (isto é, lípidos compostos por unidades de repetição de isopreno); ou esteróides (isto é, lípidos compostos por unidades de isopreno numa estrutura de anel (por exemplo, colesterol e testosterona). Lípidos reactivos adequados como materiais de partida para os processos aqui revelados têm a seguinte fórmula geral:
W-T-X-Y-Z
Onde: w é uma cadeia longa de ácido gordo alquílico ou alquenílico, ou uma cadeia longa de alquilo ou alquenilo, ou um esteróide com uma ligação amido ou éster, ou um radical da fórmula geral: - 12- CHo—CH2—CH2 2 I 2 Ο Ο t ι Ri R2 onde Rj, R2 representam, independentemente, alquilo, alquilo substituído, alquenilo, alquenilo substituído, alcnilo, alcnilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquiol, arilalquilo substituído; ou C(0)R3 onde R3 representa alquilo, alquilo substituído, alquenilo, alquenilo substituído, alcnilo, alcnilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído; T é
O ti -O—P—ΟΙ
OA onde A é uma porção catiónica incluindo H+, iões de metal alcalino, iões de metal alcalino-terrosos, ião de amónio, e iões de amónio substituídos por grupos alquilo inferior; ou -0-; ou está ausente; X é alquilo, alquenilo, arilalquilo, alquilo substituído, arilalquilo substituído, alquenilo substituído, ou está ausente; Y é uma cadeia alquilo opcionalmente substituída com ligações amida, éster, amina, e éter. Um exemplo pode ser uma poliamina com uma ligação amida como -B-(CH)m-j—
1 ,n N-H
I R4 - 13- onde η = 1 a 5; m = 2 a 6; R4 é H, ou um grupo bloqueador como carbamatos ou amidas; B é
D Ο Η Η O
I II I I II N—C—C—N—C- R* onde R5 é H, ou um radical alquilo contendo 1 a 4 átomos de carbono opcionalmente substituídos com um radical fenilo, D é W-T-X como atrás definido, ou está ausente.
Outro exemplo de Y pode ser um radical de fórmula geral f6 N—R„—R9 *7 onde Ré, R7 representam, independentemente, grupos H, ou Q a C24 alquilo ou alquenilo; R8 é uma cadeia linear ou ramificada de Ci a C24 alquilo; R9 é -O-C(0)-(CH2)p-, ou ácido -O-aminocarboxílico que é alquilo, arilo, ou arilalquilo; ou -0-C(0)-(CH2)p-NH- ligado ao referido ácido aminocarboxílico onde péla 18, ou está ausente; e Z é -OH, ou NH(Rio) onde R[0 representa H, alquilo e arilo;
Fosfolípidos, que são os componentes primários de muitas membranas biológicas, são um material de partida preferido para uso no processo revelado. Especialmente preferidos são as fosfatidilalcanolaminas da fórmula geral: - 14-
ΟΥ r2
0 II
ÇU -ΟΧ—N-H onde Ri, R2 representam, independentemente, alquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo ou C(0)R3, onde R3 representa alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo e arilalquilo R4 representa H, alquilo, arilo X representa alquilo, alquenilo, arilalquilo; e Y representa uma porção catiónica incluindo H+, iões de metal alcalino, iões de metal alcalino-terrosos, ião amónio, e iões amónio substituídos. O alquilo, alquenilo, arilo, arilalquilo e alquinilo podem ser opcionalmente substituídos. "diceteno" - significará o próprio diceteno (C(0)-0-C(=CH2)-CH2) ou um análogo ou derivado de diceteno tendo a fórmula:
Onde R5, Ré, R7 e R8 representam H ou um alquilo inferior. "lípido aceto-acetilado" - significará um produto obtido a partir da reacção de um lípido reactivo com diceteno e terá a seguinte fórmula geral: W-T-X-Y-Z’ W é uma cadeia longa de ácido gordo de alquilo ou alquenilo, ou uma cadeia longa de alquilo ou alquenilo, ou um esteróide com uma ligação amido ou éster, ou um radical da fórmula geral:
CH2—CH2-CH2 1 I 0 o 1 1
Ri R2 onde Rh R2 representam, independentemente, alquilo, alquilo substituído, alquenilo, alquenilo substituído, alcnilo, alcnilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído; ou C(0)R3 onde R3 representa alquilo, alquilo substituído, alquenilo, alquenilo substituído, alcnilo, alcnilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído; T é
O
II -O—P—οι
OA onde A é uma porção catiónica incluindo H+, iões de metal alcalino, iões de metal alcalino-terrosos, ião de amónio, e iões de amónio substituídos com grupos alquilo inferiores, ou -O-, ou está ausente; - 16- X é alquilo, alquenilo, arilalquilo, alquilo substituído, arilalquilo substituído, alquenilo substituído, ou está ausente; Y é uma cadeia alquilo opcionalmente substituída com amida, éster, amina, e ligações éter. Um exemplo pode ser uma poliamina com uma ligação amida como -B_ (CH)m4- 1 Jn
N-H
I R4 onde η = 1 a 5; m = 2 a 6; R4 é H, ou um grupo bloqueador como carbamatos ou amidas; B é
Η Η OI I li—C—N—C- IRs onde R5 é H, ou um radical alquilo contendo 1 a 4 átomos de carbono opcionalmente substituídos por um radical fenilo, D é W-T-X como atrás definido, ou está ausente.
Outro exemplo de Y pode ser um radical de fórmula geral 16 -N—Rg—R9 r7 onde R6, R7 representam, independentemente, grupos H, ou Q a C24 alquilo ou -17- alquenilo; Rg é uma cadeia linear ou ramificada de Q a C24 alquilo; R9 é -O-C(0)-(CH2)p-, ou ácido -O-aminocarboxílico que é alquilo, arilo, ou arilalquilo; ou -0-C(0)-(CH2)p-NH- ligado ao referido ácido aminocarboxílico onde péla 18, ou está ausente; Z'é H I N-
O II
O II 0 ^13 II c- 1 0 1 0 1 X 1 I r12 Rl4 Ί" 0 «13 I13 n -Ο —c- —c—1 ι 1 Ri2 R14 ou
Fosfatidilalcanolamina reagida com diceteno produz fosfatidilal-canolaminas N-substituídas tendo a fórmula geral:
Ri 0 r2 onde R1} R2 representam, independentemente, alquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo ou C(0)R3, onde R3 representa alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, e arilalquilo R4 representa H, alquilo, arilo R5R$ representa, independentemente, H, alquilo -18- R7Rg representa, independentemente, H, alquilo X representa alquilo, alquenilo, arilalquilo; e Y representa uma porção catiónica incluindo H+, iões de metal alcalino, iões de metal alcalino-terrosos, ião de amónio, e iões de amónio substituído. O alquilo, alquenilo, arilo, arialquilo e alquinilo podem ser opcionalmente subsituídos. "amina" significará um composto contendo uma unidade NH ou NH2.
"poliamina" - um composto contendo três ou mais unidades NH ou NH2. "substituído" significará funcionalmente modificado com um grupo hidroxi (por exemplo, éteres e ésteres); grupo amino (por exemplo amidas); átomos de halogénio; grupo trifluorometilo; ou grupo carboxílico (por exemplo, ésteres e amidas).
Em geral, o processo da presente invenção compreende misturar um lípido reactivo com um diceteno, produzindo assim um lípido acetoacetilado e misturando então o lípido acetoacetilado com um agente activo biologicamente adequado ou uma poliamina para gerar um conjugado. Para uso na presente invenção, um lípido reactivo de partida pode ser sintético, semi-sintético ou isolado a partir de fontes naturais. Lípidos naturalmente existentes, por exemplo, podem ser extraídos da mioleira dos bovinos, da mioleira das ovelhas, do fígado -19- dos bovinos, do fígado de porcos, dos grãos de soja, da gema do ovo ou de extractos celulares de E. coli. Lípidos sintéticos podem ser obtidos, por exemplo, junto de vários comerciantes.
De acordo com um método da invenção, um lípido acetoacetilado é produzido a partir de um lípido reactivo de partida perante uma reacção com diceteno. Preferivelmente, a reacção é efectuada numa mistura de solvente orgânico (por exemplo, uma mistura de metanol e clorofórmio ou diclorometano). Devem ser evitadas as misturas de solventes contendo aminas primárias e secundárias porque as aminas competirão com o lípido reactivo pela reacção com o diceteno. Preferivelmente, a concentração do lípido reactivo usado está na gama de cerca de 0,001 a 0,1 M. Uma concentração de 0,01-0,05 M é ' especialmente preferida. Preferivelmente, o pH do soluto é mantido na gama de 3-8. Contudo, um pH na gama de 4-7 é especialmente preferido. A reacção deve ser efectuada a uma temperatura em que o lípido reactivo seja completamente solúvel no particular solvente orgânico. Por exemplo, temperaturas na gama de 10°C a 50°C são geralmente úteis, embora esta gama possa variar dependendo do sistema de solvente e da natureza global do lípido reactivo. Os lipo-alcoóis podem ter de ser aquecidos até temperaturas superiores a 100°C para reagirem.
Um excesso de diceteno pode ser adicionado ao lípido reactivo. Preferivelmente, a proporção de diceteno para lípido reactivo está na gama de cerca de 0,9:1 a 100:1, sendo uma proporção superior a 15:1 particularmente preferida. Uma baixa proporção de diceteno para lípido reactivo ou diceteno impuro pode resultar em reacções parciais e baixos rendimentos. A mistura de reacção pode ser agitada à temperatura atrás indicada até que todo o lípido reactivo tenha reagido. Tipicamente, este processo requer 1 -20- a 48 horas, após o que o derivado de lípido acetoacetilado pode ser isolado usando métodos normalizados que são do conhecimento do especialista na técnica. Por exemplo, a mistura de reacção pode ser concentrada até menos de metade do seu volume original e o produto precipitado por acetona. O precipitado, usualmente um pó branco, pode ser recolhido quer por filtração quer por centrifugação. Pode obter-se mais produto se se evaporar mais o líquido-mãe e se se proceder à precipitação por acetona. Outros métodos de isolamento incluem a cromatografia por coluna e a cristalização. O lípido acetoacetilado purificado pode ser analisado, por exemplo, usando espectroscopia por ressonância magnética nuclear (NMR), espectroscopia por infra-vermelhos (IR), cromatografia de camada fina (tlc) ou cromatografia por líquido a alta pressão (HPLC).
Os lípidos acetoacetilados da presente invenção podem ser contactados com um nucleófilo contendo agente biologicamente activo para formar um conjugado de lípido-agente biologicamente activo. Altemativamente, um lípido acetoacetilado pode ser conjugado com uma amina ou poliamina para produzir um "lípido catiónico", (isto é, um lípido tendo uma carga positiva líquida).
Por exemplo, um lípido acetoacetilado pode ser conjugado com agentes biologicamente activos contendo um nucleófilo por meio de um grupo amino pendente (por exemplo, um término de amino ou um resíduo de lisina ou omitina de um péptido ou proteína) ou por meio de um grupo hidrazino. São preferidos os grupos amino primários e secundários, sendo os grupos amino primários especialmente preferidos porque as reacções se podem processar sem impedimento estérico.
Agentes biologicamente activos contendo nucleófilos, aminas ou -21 - poliaminas (a que doravante nos referiremos como compostos amino) a serem conjudadas com um lípido acetoacetilado como aqui descrito pode, por exemplo, ser sintetizado quimicamente, isolado a partir de fontes naturais, ou obtidas por meio da tecnologia de engenharia genética. Exemplos de agentes biologicamente activos a serem conjugados com um lípido acetoacetilado podem incluir, mas não se limitam a, hormona de estimulação da tiróide, β-glucocerebrosidase, regulador da transmembrana de fibrose quística, prolactina comossaína, ananaína, a-galactosidase, hormona de libertação da tirotropina, insulina, vasopressina, calcitonina, oxitocina, prolactina, amilina, hormona de luteinização libertando porções de péptido da hormona destas proteínas e ácidos nucleicos que as codificam. Poliaminas para uso no presente processo podem incluir lipopoliaminas (por exemplo como descritas na Patente U.S. No. 5.171.678 "Lipopoliaminas, Sua Preparação e Uso" por Behr e Loeffler).
Em geral a conjugação de um lípido acetoacetilado com um agente biologicamente activo contendo uma porção amino (NH) e/ou hidrazino (NH-NH2) pode ser conseguida pela mistura de dois compostos num meio adequado para formar um intermediário de imina o qual, se necessário, pode ser reduzido para produzir uma ligação amino estável.
Preferivelmente, antes de ser reagido com um composto amino ou hidrazino, um lípido acetoacetilado é dissolvido num solvente orgânico. Solventes clorinados ou uma mistura de solventes clorinados e metanol são os preferidos. Um lípido acetoacetilado pode também ser dissolvido num tampão aquoso que contém um ou mais detergentes. Preferivelmente, a molaridade de um acetoacetilado está na gama de cerca de 1 mM a 1,0M. Contudo, uma molaridade na gama de lOmM-lOOmM é especialmente preferida.
Antes de ser reagida com um lípido acetoacetilado, um agente -22- biologicamente activo contendo amina/ou poliamina pode ser dissolvido num meio quer orgânico quer aquoso. Exemplos de meios orgânicos típicos incluem clorofórmio, diclorometano, metanol, dimetilformamida ou dimetilsulfóxido. Um exemplo de um meio aquoso típico é um soluto tampão suave. Contudo, os tampões que contêm aminas primárias e secundárias devem ser evitados porque irão competir com o grupo amino pela reacção com o lípido. A proporção do lípido acetoacetilado para o composto amino pode ser de 1:1 ou qualquer dos dois reagentes pode estar em excesso. Pode permitir-se que a mistura de lípido acetoacetilado, composto amino e agente de redução reajam a uma temperatura na gama de cerca de 0°C a 60°C durante um período de tempo na gama de cerca de 4 a 60 horas.
Preferivelmente, o pH do soluto resultante é mantido na gama de cerca de 2 a 9. Contudo, um valor de pH na gama de 4 a 6 é especialmente preferido, porque favorece a formação e a subsequente redução da imina intermediária. A porção imina formada entre o lípido acetoacetilado e o composto amino pode ser mais reduzido para produzir uma ligação amino estável. O cianoboro-hidreto de sódio é um agente de redução preferido porque é específico para a redução da porção imina. A proporção molar do agente de redução até à imina pode variar de acordo com o particular agente de redução utilizado. Uma proporção preferida de cianoboro-hidreto de sódio para imina é de 3 para 1 ou mais. O produto de aminação redutora pode ser isolado a partir da mistura, por exemplo, por precipitação da acetona ou por outros métodos normalizados como cromatografia por silica gel ou cristalização. O novo conjugado lipídico pode então ser caracterizado (por exemplo, usando métodos normalizados de tlc, NMR ou HPLC).
Utilidade O processo ora reivindicado produz um sistema eficiente, eficaz em termos de custo, de gerar conjugados de lípidos. Por exemplo, este processo pode ser útil para conjugar um lípido a um agente biologicamente activo. Esses conjugados de lípido/agente biologicamente activo quer "tal e qual" ou preparados como lipossomas podem funcionar como "veículos de entrega de medicamentos" facilitando o transporte do agente biologicamente activo através de membranas de muco e para dentro da corrente sanguínea (por exemplo, para entrega oral do agente biologicamente activo) e/ou através de membranas de plasma e para dentro de células. (Shen et. al. "Advanced Drug Delivery-Reviews"1 8: 105 (1992)). O processo aqui descrito também pode ser útil para conjugar lípidos a agentes biologicamente activos que sejam reconhecidos pelas células de proteínas superficiais (por exemplo, receptores). A incorporação destes conjugados de lípidos em veículos de entrega (por exemplo, lipossomas ou micro-esferas) pode ser usado para designar células alvo tendo a particular proteína de superfície. Por exemplo, os conjugados de factor de crescimento epidérmico/lípido pode ser usado para designar células alvo tendo receptores do factor de crescimento. O uso do presente processo para conjugar poliaminas a lípidos neutros ou aniónicos é útil para gerar lípidos catiónicos que, por sua vez, interagem ionicamente com ácidos nucleicos formando um complexo lipofílico 1
Entrega Avançada de Medicamentos - Estudos (N.T.) -24- que pode ser usado por exemplo, para a transfecção de células in vivo ou in vitro. (Ver, por exemplo, WO 91/16024 "Cationic Lipids for Intracellular Deliver of Biologically Active Molecules"1 por Felgner et. al.)
Os conjugados de lípidos de péptidos ou de hidratos de carbono produzidos pelo método aqui descrito podem aumentar a imunogenicidade do péptido ou hidrato de carbono principal e ser portanto útil como auxiliar.
Conjugados de moléculas biológicas-lípidos marcados por fluorescência podem ser preparados como sondas de membrana (por exemplo, para estudar a biofísica da membrana (Molecular Probes Inc. Catálogo). A presente invenção será agora ilustrada pelos exemplos que se seguem, os quais não pretendem nem devem, de maneira nenhuma, ser considerados limitativos.
Exemplo 1 Síntese de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfo-(N-acetoacetil)-etanolamina (N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina, N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina, N-acetoacetil DSPE)
Um soluto de diestearoil-fosfatidiletanolamina (1,42 g, 1,64 mmol) (Genzyme Corporation, Cambridge, MA) numa mistura a 3:1 de clorofórmio/metanol (60 mL total) foi aquecido até 50°C até toda a fosfatidiletanolamina estar dissolvida. Adicionou-se diceteno (5 mL, 65 mmol) ao soluto resultante. O soluto foi agitado a 40°C durante 6 h. Adicionou-se outra porção de diceteno (5 mL, 65 mmol). A mistura foi então agitada a 40°C durante mais 16 h. A análise por cromatografia de camada fina da mistura de reacção 1 Lípidos Catiónicos para a Entrega Intracelular de Moléculas Biologicamente Activas (N.T.) -25- sobre placa revestida a sílica (clorofórmio/metanol/água a 65:35:5, visualizada por reagente azul de molibdénio) mostrou que toda a fosfatidiletanolamina de partida (valor Rf:0,49) tinha reagido e que se tinha formado um novo derivado de fosfolípido (valor Rf: 0,54). A mistura de reacção foi concentrada sob pressão reduzida até cerca de um terço do volume original por roto-evaporação e acetona (cerca de 20 mL) e foi adicionada à mistura até se formar um precipitado branco. Permitiu-se que a mistura heterogénea repousasse durante 15 minutos. O precipitado foi recolhido por centrifugação e lavado com acetona fria (5 ml). O sólido recolhido foi então seco sob alto vácuo (560 mg, 36% de rendimento). O produto adicional foi obtido pela evaporação do filtrado até cerca de um sexto deste volume original seguido pela precipitação com acetona (cerca de 20 mL). O precipitado foi recolhido como atrás se descreveu (650 mg, 42%).
Análise NMR do produto (CDCl3/MeOH-d4 a 3:1) usando uma máquina Varian VXR 400 MHz mostrou uma mudança em sentido descendente do grupo metileno (-CH2-NH) a partir de 3,2 ppm a 3,4 ppm. A mudança é consistente com uma amida formada a partir de uma amina primária. Além disso, a presença de um singuleto a 2,3 ppm é também indicativa da metil-cetona na porção N-acetoacetílica. NMR 'H (CDCIOíô 5,25 (br. s, 1 H), 4,37 (dd, J = 6, 12 Hz, 1 H), 4,10 (sobrepondo-se m e br. s, 5H), 3,55 (br. s, 2 H), 3,50 (s, 2 H), 2,33 (dd, J = 7 Hz, 4 H), 2,30 (s, 3H), 1,80 (br. s, 4 H), 1,25 (br. s, 56 H), 0,9 (t, J = 7 Hz, 6 H).
Exemplo 2 Síntese de 1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-(N-acetoacetil)-etanolamina (N-acetoacetil-dimiristoíl-fosfatidiletanolamina, N-acetoacetil DMPE) A um soluto de dimiristoíl-fosfatidiletanolamina (24 mg, 0,03 mmol) (Genzyme Corp., Cambridge, MA) numa mistura a 3:1 de clorofór- -26- mio/metanol (4 mL) foi adicionado um excesso de diceteno (1 mL). A resultante mistura homogénea foi agitada a temperatura ambiente durante 19 h. A mistura de reacção foi concentrada sob pressão reduzida até menos de 1 mL e adicionou-se acetona (cerca de 5 mL) à mistura de reacção concentrada. O precipitado branco que se formou foi recolhido por centrifugação como descrito no exemplo 1 (13 mg, 50%). NMR lH (CDCl3/MeOH-d4 a 3:1):δ 5,17 (br. s, 1 H), 4,32 (br. d, J = 11 Hz, 1 H), 4,05 (m, 3 H), 3,93 (m, 2 H), 3,89 (m, 2 H), 3,42 (br. t, J = 8,4 Hz, 2 H), 2,25 (t, J = 6 Hz, 4 H), 2,21 (s, 3 H), 1,53 (br. s, 4 H), 1,25 (br.s), 0,83 (t, J = 6 Hz, 6 H).
Exemplo 3
Aminação redutora de N-acetoacetil-diestearoil fosfatidiletanolamina com α-Ν-acetil lisina metil éster
Um soluto de N-acetoacetil-diestearoil fosfatidiletanolamina (94 mg, 0,1 mmol), α-Ν-acetil lisina etil éster (sal HC1, 127 mg, 0,5 mmol) (Sigma Chemical Co.), trietilamina (67 uL, 0,5 mmol), cianoboro-hidreto de sódio (10 mg, 0,16 mmol) foi agitado a temperatura ambiente durante 68 horas. Formou-se um soluto amarelo e uma pequena quantidade de sólido branco. O sólido foi removido da mistura de reacção por centrifugação e o soluto resultante foi evaporado até secar produzindo uma borracha amarela. A borracha amarela foi triturada com metanol/acetona a 1:1 (5 mL) e o precipitado branco assim formado foi recolhido por centifugação (60 mg). O produto bruto foi mais purificado numa coluna de sílica gel equilibrada com clorofórmio/metanol a 1:1 para produzir um sólido branco (25 mg, 22% de rendimento). %). NMR 'H (CDCl3/MeOH-d4 a 3:1) δ 5,18 (br. s, 1 H), 4,38 (m, 1 H), 4,35 (dd, J = 3,12 Hz, 1 H), 4,10 (dd, J = 5, 12 Hz, 1H), 4,05 (m, 1 H), 3,9 (t, J = 6 Hz, 2 H), 3,68 (s, 3 H), 3,45 (br. d, J = 13 Hz, 2 H), 3,20 (m, 1 H), 2,87 (m, 1 H), 2,78 (m, 1 H), 2,42 (br. s, 2 H), 2,25 (sobrepondo-se t, J = 7 Hz, 4H), 1,95 (s, 3 H), 1,78 (m, 1 H), -27- 1,62 (m, 3 Η), 1,46 (br. s, 4 H), 1,38 (m, 2 H), 1,20 (br.s), 0,8 (sobrepondo-se t, J = 7 Hz, 6 Η). A análise por cromatografia de camada fina (clorofórmio/me-tanol/água a 65:35:5):Rf para 0,69 de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatildil-etanolamina, para 0,78 de produto.
Exemplo 4
Aminação redutora de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina com Pro-Fe-Gli-Lis A uma solução agitada do tetrapéptido Pro-Fe-Gli-Lis (40 mg, 0,08 mmol) (Sigma Chemical Co.) em metanol (2 mL) foi adicionado um soluto de N-acetoacetil diestearoil-fosfatidiletanolamina (74 mg, 0,08 mmol) em clorofórmio (2,5 mL). Depois de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, adicionou-se um soluto de cianoboro-hidreto de sódio (17 mg, 0,27 mmol) em metanol (1 mL). Permitiu-se que o soluto resultante fosse agitado a temperatura ambiente durante 16 h, após o que a mistura de reacção foi concentrada sob pressão reduzida até aproximadamente 1 mL e o produto foi precipitado por adição de acetona (aproximadamente 5 mL) a temperatura ambiente. O precipitado branco foi recolhido por centrifugação e foi lavado uma vez com acetona fria (aproximadamente 5 mL). O precipitado branco foi então redissolvido em clorofórmio/metanol a 1:1 e evaporado até secar. A análise por cromatografia de camada fina (clorofórmio/metanol/água a 65:35:5) mostrou o desaparecimento da N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina e a formação concomitante de um novo derivado de fosfolípido (Rf: N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina: 0,82, maior produto: 0,89). A análise HPCL de fase reversa da mistura de reacção, usando uma coluna YMC-A-301-3, mostrou um pico maior que era diferente do tetrapéptido e da N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina. A análise HPLC, usando uma Coluna Phenomenex Sperisorb 3u (fase normal) sobre um Sistema Waters 600 E equipado com um -28- detector de evaporação de massa, também mostrou um pico maior (tempo de retenção: 24,98 min., área percentual: 69,7). Os dados HPLC também confirmaram que, tal como se esperava, o novo derivado de fosfolípido era mais hidrofóbico do que o tetrapéptido e, mais hidrofílico do que a N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina.
Para melhor caracterizar o produto, uma alíquota do produto bruto foi passada através de uma coluna de fase reversa (Coluna YMC Cis> 10 mm x 250 mm, clorofórmio/metanol/água/ácido trifluoroacético a 40:60:15:0,1) e o material sob o maior pico foi isolado. O produto parcialmente purificado foi então sujeito a análises de ácido gordo e de aminoácido. Os resultados destas duas análises indicaram inequivocamente a existência de ácido esteárico, prolina fenilalanina, glicina e lisina na mesma amostra, confirmando assim que o produto isolado continha os constituintes de aminoácido de Pro-Fe-Gli-Lis e os resíduos de ácido esteárico presentes no reagente de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidileta-nolamina. Dados seleccionados de NMR 'Η: δ 7,19 (m, 2 Η, H aromático), 7,12 (m, 3 Η, H aromático), 5,13 (m, 1 H, (sn-2)CH), 4,43 (dd, J = 4,4, 8,4 Hz, 1 H, parte de (sn-l)CH2), 4,07 (dd, J - 6,8, 12 Hz, 2 H, (sn-3)CH2), 2,21 (t, J = 7,5 Hz), 4 H, -0-C(0)-CH2.), 0,79 (t, J = 7 Hz, 6 H, -0-(0)-C-(CH2)16-CH3.
Exemplo 5
Aminação redutora de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina com benzilamina A um soluto agitado de N-acetoacetil-diestearoil- fosfatidileta-nolamina (50 mg, 0,052 mmol) em clorofórmio (5 mL) foi adicionada benzilamina (35 ul, 0,32 mmol) e cianoboro-hidreto de sódio (10 mg, 0,16 mmol) em metanol (5 mL). O soluto homogénio foi agitado a temperatura ambiente durante 18 h. A análise por cromatografia de camada fina da mistura de reacção -29- (clorofórmio/metanol/água a 65:35:5) mostraram o desaparecimento de N-acetoacetil diestearoil fosfatidiletanolamina e o aparecimento de dois produtos (Rf para N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina: 0,73, para o maior produto: 0,77, para o menor produto: 0,76). Os novos derivados fosfode lípidos foram isolados por precipitação de acetona e centrifugação como descritos no exemplo 1. Foi usada a cromatografia por coluna de sílica gel para separar os dois produtos. O produto menor foi eluído com clorofórmio/metanol a 3:1 (7 mg, 13%) enquanto o produto maior foi eluído com clorofórmio/metanol a 2:1 (30 mg, 56%). A análise NMR do produto maior confirmou uma incorporação a 1:1 de benzilamina na porção fosfolipídica. NMR !H: (CDCls/MeOH-dt) 6 7,4 (m, 5 H), 5,18 (br. s, 1 H), 4,32 (dd, J = 3,12 Hz, 1 H,), 4,11 (br. d, J = 12 Hz, 1 H), 4,0 (m, 1 H), 3,88 (t, J = 6 Hz, 2 H), 3,85 (m, 1H), 3,41 (br. dd, J = 4, 11 Hz, 2 H), 3,29 (m, 1 H), 3,22 (dd, J = 4, 10 Hz, 1H), 3,18 (dd, J = 4, 10 Hz, 1 H), 2,50 (dd, J = 8,16 Hz, 1H), 2,42 (dd, J = 4,16 Hz, 1H, 2,22 (t, J = 7 Hz, 2 H), 2,15 (t, J = 7 Hz, 2 H), 1,58 (br.s, 4 H), 1,2 (br.s, 59 H), 0,9 (sobrepondo-se t, J - 7 Hz, 6 H). O produto menor foi dissolvido numa mistura de clorofórmio/metanol a 1:1 (1 mL) e foi mais submetido a cianoboro-hidreto de sódio (2 mg) para 16 h a temperatura ambiente. Tanto a NMR como a tlc indicaram que o novo produto formada a partir da segunda redução foi idêntico ao maior produto previamente isolado, sugerindo assim que o produto menor era a imina intermediária entre a N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina e a benzilamina.
Exemplo 6
Aminação redutora de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina com Tre-Ser-Lis
Um soluto do tripéptido, Tre-Ser-Lis (4 mg, 8 umol) (Sigma Chemical Co.), N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina (11 mg, 12 umol), -30- cianoboro-hidreto de sódio (2 mg, 32 umol) em clorofórmio/metanol 1:1 (2 mL) foi agitada a temperatura ambiente durante 16 h. Passado esse tempo a mistura de reacção foi concentrada sob pressão reduzida até cerca de 0,5 mL e adicionou-se acetona (cerca de 3 mL). O precipitado assim formado foi recolhido por centrifugação (12 mg, quantitativo). A cromatografia de camada fina sobre sílica: Rf para N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina 0,73, maior produto 0,30, menor produto 0,45. A análise HPLC usando uma Coluna Phenomenex Sperisorb 3u (fase normal) sobre um Sistema Waters 600 E mostrou que mais de 90% da N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina de partida tinha reagido para produzir quatro novos produtos (tempos de retenção: 22,33 minutos, 22,35%; 23,08 min., 25,82%, 24,43 min., 37,81%, 25,55 min, 10,39%). Estes novos produtos podem representar péptido-fosfolípidos acoplados no término amino do péptido, no grupo ε-amino no resíduo de lisina, um difosfolípido-péptido acoplado quer no término amino quer no grupo ε-amino sobre a lisina, e intermediários da imina formada entre a N-acetoacetil-diestearoil-fosfati-diletanolamina e o péptido.
Exemplo 7
Aminação redutora de N-acetoacetil diestearoil fosfatidiletanolamina com Tre-Tir-Ser A uma suspensão do tripéptido, Tre-Tir-Ser (9 mg, 0,024 mmol) (Sigma Chemical Co.) em metanol (2 mL) foi adicionado um soluto de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina (25 mg, 0,026 mmol) em clorofórmio (2 mL). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante lhe adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (10 mg). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 60 h e a fase de solução foi então separada da fase sólida por decantação. O soluto foi concentrado sob pressão reduzida até aproximadamente 1 mL e a desejada mistura de produto foi isolada por -31 - precipitação de acetona (aproximadamente 5 mL). O precipitado branco foi recolhido pro centrifugação e lavado uma vez com acetona fria (28 mg, 82%). Dados seleccionados de NMR ’H: δ 6,99 (dd, J = 8 Hz, 2 Η, H aromático sobre Tir), 6,66 (br. d, J = 8 Hz, 2H, H aromático na Tir), 5,18 (m, 1 H, (sn-2)CH), 2,23 (br. t, J = 7 Hz, 4 H, 0-(0)-C-CH2-), 1,52 (br. s, 4 H, -0-(0)-C-CH2-CHr), 0,81 (t, J = 7 Hz, 6 H, -(0)-C-(CH2)16CH3>.
Exemplo 8
Reacção de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina com dansil-hydrazida
Um frasco de fundo redondo foi carregado com um soluto de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina (12 mg, 0,013 mmol) em clorofórmio (0,5 mL) e um soluto de dansil-hidrazida (3 mg, 0,011 mmol) (Sigma Chemical Co.) em clorofórmio (0,9 mL). Depois de agitar a 0°C durante 30 min., a N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina mostrou estar completamente reagida e formou-se um novo produto, que mostrou actividade de fluorescência e foi manchado com reagente azul de molibdénio. A mistura de reacção foi agitada a 0°C durante 60 minutos adicionais e foi então evaporada até secar sob pressão reduzida. O resultante sólido de cor laranja foi purificado sobre uma coluna de sílica gel. O produto desejado foi eluído a partir da coluna com clorofórmio/metanol a 2:1 como um sólido amarelado (11 mg, 81%). A análise por cromatografia de camada fina sobre sílica (clorofórmio/metanol/água a 65:35:5): Rf para N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina 0,61, para 0,72 de produto. A análise NMR do produto mostrou a ausência da porção de metil-cetona, e a incorporação da porção de dansil foi evidenciada pela presença dos protões de aromático entre 7 e 8 ppm. Seleccionado NMR Ή (400 MHz) δ: 8,38 (m, 1 H), 8,30 (m, 1 H), 8,10 (m, 1 H), 7,40 (m, 2 H), 7,02 (m, 1 H), 5,05 (m, 1 H), 4,20 (br. d, J = 12 Hz, 1 H), 4,0 (m, 2 H), 3,78 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H), 2,70 (s, 3 H), 2,68 (s, 3 H), 2,18 (br. t, J = 7 Hz, 4H), 1,50 (br. s, 4 H), 1,20 (br. s, 56 H), 0,78 (t, J = 7 Hz, 6 H). -32-
Exemolo 9
Aminação redutora de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina com (Arg )-vasopressina A um soluto agitado da (Arg8)-vasopressina (H2N-Cis-Tir-Fe-Gln8 mg, 5 umole, Bachem Bioscience) em metanol (0,5 mL) foi adicionado um soluto de N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina (7 mg, 8 umole) em clorofórmio (0,5 ml). Depois de agitar a temperatura ambiente durante 30 min., adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (7 mg, 111 umole). Permitiu-se que o soluto resultante fosse agitado a temperatura ambiente durante 16 h. A análise HPLC de fase reversa da mistura de reacção, usando uma coluna YMC ODS-A (4,6 x 100 mm, 3u, 120 Â, clorofórmio/metanol/água/ácido trifluoroacético a
Q 400:600:150:1) mostrou um pico maior que era diferente da (Arg )-vasopressina e N-acetoacetil-diestearoil-fosfatidiletanolamina. Este novo produto foi isolado por HPLC preparativa de fase reversa (4 mg) e mostrou ser >99% puro. A análise NMR !H (400 MHz) mostrou que o produto era um conjugado a 1:1 do fosfolípido e do péptido.
Lisboa, 29 de Setembro de 2000
Agente Oficial da Propriedade Industrie RUA VICTOR CÒRDON, 14 1200 LISBOA
Claims (4)
- REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a produção de um conjugado de agente biologicamente activo-(fosfo)lípido ou um (fosfo)lípido catiónico a partir de um lípido acetoacetilado caracterizado pelo facto de compreender: (a) fórmula geral: misturar um lípido reactivo correspondendo à seguinte W-T-X-Y-Z num solvente orgânico com diceteno ou um análogo ou derivado do mesmo correspondendo à seguinte fórmula geral:*8 onde W representa uma cadeia longa de ácido gordo de alquilo ou alquenilo, ou uma cadeia longa de alquilo ou alquenilo, ou um esteróide tendo uma ligação amido ou éster, ou um radical correspondendo à seguinte fórmula geral: CH 2 CH 9 CH 2 0 O 1 I Rl ^2 onde Rie R2 representam, independentemente, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, -2- aralquilo, qualquer dos quais pode ser substituído, ou C(0)R3 onde R3 representa alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, qualquer dos quais pode ser substituído; T representa um grupo correspondendo à seguinte fórmula geral: 0 II — o — p — O — 1 OA onde A representa uma porção catiónica ou -O- está ausente; X representa alquilo, alquenilo, aralquilo, qualquer dos quais pode ser substituído, ou está ausente; Y representa uma cadeia alquilo opcionalmente substituída por ligações amida, éster, amina e éter; Z representa -OH ou NH(Ri0) onde Rio representa H, alquilo e arilo; e R5, R<5, R7 e R8 representam, independentemente, H ou alquilo inferior; (b) isolar o resultante lípido acetoacetilado; (c) dissolver o lípido acetoacetilado num meio adequado; -3- (d) misturar o lípido acetoacetilado com um agente biologicamente activo contendo um nucleófilo, que é um péptido, proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono ou outro composto tendo uma porção amino ou hidrazina, ou uma poliamina contendo três ou mais unidades NH ou NH2; opcionalmente, contactar o conjugado de agente biologicamente activo-lípido ou lípido catiónico com um agente de redução; e (e) isolar o resultante conjugado de agente biologicamente activo-lípido ou lípido catiónico.
- 2. Um processo, como reivindicado na reivindicação 1, onde em (a): a concentração no solvente orgânico é de 0,001 a 0,1 M, a temperatura é de 10 a 50° C e o pH é de 3 a 8; e/ou em (d): a concentração do lípido é de lmM a 1,0 M, a temperatura é de 0 a 60°C e o pH é de 2 a 9.
- 3. Um processo para a produção de uma fosfatidilalcanolamina N-substituída correspondendo à seguinte fórmula geral:-Ιο-χ-ίΛ<^ onde Ri e R2 representam, independentemente, alquilo, alquenilo, alqui-nilo, arilo, aralquilo ou C(0)R3 onde R3 representa alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo ou aralquilo; -4- R4 representa H, alquilo ou arilo; R5, Rô, R7 e R8 representam, independentemente, H ou alquilo; X representa uma porção catiónica; sendo qualquer dos grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo e aralquilo opcionalmente substituídos; caracterizado pelo facto de compreender: (a) misturar uma fosfatidilalcanolamina num solvente orgânico com diceteno ou um análogo ou derivado do mesmo como definido na reivindicação 1, sendo a concentração no solvente orgânico entre 0,001 e 0,1 M, a temperatura de 10 a 50° e o pH entre 3 e 8; e (b) isolar a resultante fosfatidilalcanolamina N-substituída.
- 4. Uma fosfatidilalcanolamina N-substituída que pode ser obtida por um processo como reivindicado na reivindicação 3 caracterizado pelo facto de ser 1,2-dimiristoíl- ou -diestearoil-sn-glicero-3-fosfo-(N-acetoacetil)-etanolamina. Lisboa, 29 de Setembro de 2000 V JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrie) RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBOA
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