PT1748791E

PT1748791E - Los de neisseria meningitidis lgtb utlizados como adjuvantes

Info

Publication number: PT1748791E
Application number: PT05745670T
Authority: PT
Inventors: Peter Andr Van Der Ley; Liana Juliana Josephine Steeghs; Johannes Gerardus Joseph Van De Winkel
Original assignee: Staat Der Nederlanden Vert Doo
Priority date: 2004-05-11
Filing date: 2005-05-11
Publication date: 2010-07-15
Also published as: BRPI0511026B1; BRPI0511026C1; MXPA06013093A; PL1748791T3; NZ551250A; AU2005239963A1; ES2344114T3; DK1748791T3; AU2005239963B2; JP2007537248A; KR101270838B1; CA2566409A1; SI1748791T1; JP5174457B2; EP1748791B1; DE602005020608D1; CN1997392A; KR20070029742A; CN1997392B; BRPI0511026A

Description

DESCRIÇÃO LOS DE NEISSERIA MENINGITIDIS lgtB UTLIZADOS COMO ADJUVANTES Campo da invenção A presente invenção refere-se a lipo-oligossacarídeos (LOS) Neisseria que têm aumentado a actividade imunoestimuladora. Os LOS' s Neisserial da invenção compreendem um núcleo externo de trissacarideo que mostra uma ligação aumentada a um receptor nas células dendríticas. 0 núcleo externo do trissacarideo dos LOS' s Neisserial combinado com uma fracção do Lípido A com toxicidade reduzida é útil como um adjuvante nas preparações das vacinas.

Antecedentes da invenção LPS Neisserial meningiditis tem recebido atenção como um candidato de vacina potencial devido à sua capacidade para induzir respostas imunes especificas do LPS assim como é um adjuvante potente. No entanto até aos nossos dias, a actividade endotóxica do LPS tem limitado o seu uso nas vacinas.

0 LPS meningocócico está composto por uma parte do lipido A hidrofóbico que o fixa à membrana bacteriana externa e de um núcleo do oligossacarídeo hidrófilo, que é exposto à superfície bacteriana (figura 1) . A inclusão da cadeia do oligossacarídeo inicial nas preparações da vacina é desaconselhável devido à sua semelhança estrutural com os antigénios glicolipidicos do hospedeiro. A engenharia genética das vias da biossintese do oligossacarídeo do LPS tem permitido a produção de séries de mutantes de N. meningitidis que expressam as cadeias de oligossacarídeos truncadas (figura 1). As propriedades endotóxicas e adjuvantes do LPS parecem ser determinadas pela parte do lípido A da molécula. Previamente tínhamos gerado um único conjunto de mutantes do lípido A de N. meningitidis com propriedades farmacológicas altamente melhoradas. Em particular, 1/25 a inactivação do gene lpxLl(htrBl) envolvido na aciloxiacilação do lípido A resultou no isolamento de um mutante do lípido A que expressa o lípido A penta-acilado em vez de hexa-acilado, com actividade endotóxica reduzida ainda que com adjuvante retido. Além disso, foi isolado um mutante de N. meningitidis completamente carente de LPS devido à inactivação do gene lpxA meningocócico. Assim, a modificação da parte do lípido A assim como a parte do oligossacarídeo de LPS meningocócico têm aberto novas possibilidades para o desenvolvimento das vacinas meningocócicas.

As células dendríticas (DC) tornaram-se de maior interesse devido ao seu papel na iniciação de uma resposta imune tanto durante a infecção natural como na resposta à vacinação. As respostas imunes a bactérias são iniciadas pelas DC, que fagocitam e processam os antigénios bacterianos para a apresentação às células T. Mostramos recentemente que o LPS de N. meningitidis desempenha um papel importante durante as interacções com as DC humanas. Além disso o LPS é requerido para a internalização das bactérias e a activação completa das DC. 0 Pedido Internacional de Patente WO2004/14417 descreve preparações de bolhas Neisserial derivadas de estirpes de lgtB” Neisserial. 0 Pedido de Patente holandesa NL-A-9 101 359 descreve o uso do LPS de lgtB" Neisseirial em conjugação com um peptídeo. 0 Pedido Internacional de Patente WO 00/26384, van der Ley et al., van der Ley et al. 2001, Infect. Immun. 69: 5981-5990, e Steeghs et al., 2004, J. Endotoxin Res. 10: 113-119 todos descrevem moléculas de LPS Neisserial com uma fracção de lípido A modificado com uma toxicidade reduzida ainda que com adjuvante retido. 2/25

Descrição da invenção Definições

Os adjuvantes na presente invenção são definidos para incluir qualquer substância ou composto que, quando é usado em combinação com um antigénio, para imunizar um mamífero, preferencialmente um humano, estimular o sistema imune, desse modo provocando, melhorando ou facilitando a resposta imune contra o antigénio, preferencialmente sem gerar uma resposta imune específica ao próprio adjuvante. Os adjuvantes preferidos aumentam a resposta imune contra um antigénio dado pelo menos por um factor de 1.5, 2, 2.5, 5, 10 ou 20, em comparação com a resposta imune gerada contra o antigénio sob as mesmas condições mas na ausência do adjuvante. Os testes para determinar um aumento médio estatístico da resposta imune contra um antigénio dado como o produzido por um adjuvante num grupo de animais ou seres humanos sobre um grupo de controlo correspondente estão disponíveis na técnica. Preferencialmente, o adjuvante é capaz de aumentar a resposta imune contra pelo menos dois antigénios diferentes. Habitualmente, o adjuvante da invenção será um composto que é estranho a um mamífero, excluindo assim compostos imunoestimuladores que são endógenos aos mamíferos, tais como por exemplo interleucinas, interferões e outras hormonas.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção está baseada no descobrimento surpreendente de que um LPS Neisserial com uma estrutura de núcleo externa de trissacarídeo particular, mostra uma ligação aumentada e internalização com células humanas dendríticas (DC's). A ligação e a internalização do LPS que contém trissacarídeos, ou mais exactamente LOS (lipo-oligossacarídeo) contendo trissacarídeos, são mediados por DC-SIGN da lectina tipo C que são expressas em DC's humanas e resulta na activação e maturação da DC a um nível aumentado. A actividade imunoestimuladora melhorada deste novo 3/25 LOS contendo trissacarídeos Neisserial permite o seu uso como um adjuvante potente na imunização e na vacinação.

Assim, num primeiro aspecto a invenção refere-se a um método para a imunização ou para a vacinação de um mamífero com um antigénio, compreendendo o método a administração (ao mamífero) do antigénio e o LOS Neisserial é representado com fórmula (I):

KDO oí2-»4

GlcNAc β1-3 Gal β1-»4 Glc β1-»4 Hep al-5 KDO - LA al-*3

Hep-»PEA (3 ou 6) al-2 GlcNAc, na qual LA é uma fracçao do lípido A tipo selvagem, preferencialmente de uma estirpe de Neisseria, ou mais preferencialmente uma fracçao de lípido A com toxicidade reduzida. Na fórmula (I), GlcNAc define D-glucosamina; G3.1 define D- galactose; Glc define D-glicose; Hep define D-heptose; KDO define ácido 3-desoxi-D-mano-octulosónico; PEA define fosfo-etanolamina; βΐ—>4 define uma ligação β-glicosídica entre a primeira e a quarta posições; βΐ—»3 define uma ligação β-glicosídica entre as primeira e a terceira posições; al—»5 define uma ligação α-glicosídica entre as primeira e a quinta posições; al—>3 define uma ligação α-glicosídica entre a primeira e a terceira posições; al—>2 define uma ligação α-glicosídica entre as primeira e a segunda posições; a2—»4 define uma ligação a-glicosídica entre as segunda e quarta posições; PEA(3 ou 6) indica que a fosfo-etanolamina tanto pode ser ligada na terceira ou na sexta posição da heptose ou pode estar completamente ausente. 4/25 A invenção refere-se assim ao uso de um LOS Neisserial como o acima definido na fabricação de um medicamento para a imunização ou para a vacinação de um mamífero. Preferencialmente o LOS Neisserial da invenção são usados como um adjuvante. Mais preferencialmente, o LOS Neisserial são usados em combinação com um antigénio na fabricação de um medicamento para aumentar uma resposta imune contra (ou vacinação com) o antigénio no mamífero.

Nos métodos e usos da invenção, o mamífero é preferencialmente um humano. 0 antigénio é preferencialmente um antigénio de ou produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alergénio como o definido adicionalmente abaixo. 0 antigénio e LOS Neisserial são preferencialmente utilizados no tratamento e/ou na prevenção de uma doença infecciosa provocada por uma bactéria, vírus, fungo, ou parasita, ou de um tumor provocado pela célula cancerosa, ou de uma alergia provocada pelo alergénio.

Nas formas preferidas de realizar a invenção, o LOS Neisserial da invenção tem uma fracção de lípido A (LA) modificada com toxicidade reduzida. A toxicidade do LA modificado é preferencialmente inferior à toxicidade de um LA tipo selvagem correspondente, mais preferencialmente o LA modificado é inferior a 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 ou 0.2% da toxicidade do LA do tipo selvagem. As toxicidades do tipo selvagem e os diferentes LA's modificados com toxicidade reduzida podem ser determinados em qualquer ensaio adequado conhecido na técnica. Um ensaio preferido para determinar a toxicidade, isto é a actividade biológica dos LA's ou LOS' s Neisserial da invenção é o teste WEHI para a indução de TNF-alfa na linha celular macrófaga de MM6 (Espevik & Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95: 99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Câncer 41: 456-461). 5/25

Por outro lado, o LOS Neisserial da invenção com um LA com toxicidade reduzida deverá ter ainda actividade imunoestimuladora suficiente, isto é actividade adjuvante. 0 LOS Neisserial da invenção com toxicidade reduzida preferencialmente tem pelo menos 10, 20, 40, 80, 90 ou 100% da actividade imunoestimuladora do LOS Neisserial correspondente a um LA tipo selvagem, no qual a actividade imunoestimuladora é determinada com a medição da produção de pelo menos uma citocina ou a expressão de pelo menos uma molécula co-estimuladora como o descrito no exemplo 3 da presente invenção. LOS's Neisserial com toxicidade reduzida da fracção de lipido A mas retendo (parte) da actividade do adjuvante, podem por exemplo ser obtidos de patogénos Gram negativos geneticamente modificados e como está revisado no Pedido Internacional de

Patente W002/09746. Em particular, LOS's Neisserial preferidos com LA's com toxicidade reduzida incluem: (a) LOS' s com uma fracção de lipido A como a obtenível de uma estirpe de Neisseria com uma mutação que causa uma redução ou inactivação da expressão de um ou mais dos genes lpxLl e lpxL2 (anteriormente conhecidos como genes htrB e msbB) ou homólogos dos mesmos (ver por exemplo o Pedido de Patente europeia EP 1 127 137; Pedido de Patente norte-americana US 5,997,881); (b) LOS' s com uma fracção de lipido A como a obtenível por remoção de um ou mais ácidos gordos esterifiçados secundários 0-ligados de uma fracção de lipido A tipo selvagem com o tratamento com uma aciloxihidrolase ou hidrólise alcalina (Pedido de Patente norte-americana US 5,103,661; Erwin et al., 1991, Infect. Immun. 59: 1881-87); (c) LOS' s com uma fracção de lipido A como a obtenível por tratamento de hidrazina de uma fracção de lipido A do tipo selvagem (Gu et al., 1996, Infect. Immun. 64: 4047-53; Polotsky 6/25 et al. 1994, Infect. Iiranun. 62: 210-14; Gu et al., 1998

Infect. Immun. 66:1891-97, 1998); (d) LOS' s com uma fracção de lípido A como a obtenível por desfosforilação de uma fracção de lípido A com uma fosfatase alcalina (Pedido de Patente norte-americana US 6,290,952); e, (e) LOS's obtenível por desfosforilação enzimática ou desacilação de LOS produzido num hospedeiro Neisserial em que um gene heterólogo lpxE ou pagL é expresso.

Na presente, expressão reduzida entender-se-á que se refere a aumentada ou reduzida quando comparada com uma estirpe de tipo selvagem correspondente, pela qual o nível de expressão preferencialmente pelo menos é diferente num factor 2, 5 ou 10 da estirpe correspondente do tipo selvagem. LA' s preferidos com toxicidade reduzida incluem assim LA com um Cl2-acilo secundário somente na glucosamina redutora, LA com um Cl2-acilo secundário somente na glucosamina não reduzida, LA carente dos dois grupos Cl2-acilo secundários, LA's carentes de um ou mais grupos fosfato tanto da posição 1 como da 4' e combinações das desacilações e defosforilações anteriormente mencionadas.

Noutro aspecto a descrição refere-se a um LOS Neisserial que é representado pela fórmula (I):

KDO «2-4

GlcNAc βΐ—3 Gal β1-4 Glc β1-4 Hep «1-5 KDO - LA «1-3

Hep-PEA (3 ou 6) al—2 GlcNAc, 7/25 na qual preferencialmente LA é uma fracção de lípido A com toxicidade reduzida tal como o acima definido.

Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se a uma composição que compreende um LOS Neisserial como acima definido na presente invenção, um portador aceite na Indústria Farmacêutica, e um antigénio de ou é produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alergénio. As composições farmacêuticas podem também compreender agentes estabilizantes, agentes osmóticos, agentes tampão, agentes de dispersão, e outros aceites na Indústria Farmacêutica. A forma preferida da composição farmacêutica dependerá do modo previsto para a sua administração e do seu uso terapêutico. 0 portador farmacêutico pode ser qualquer substância compatível não tóxica adequada para distribuir os ingredientes activos, isto é o LOS Neisserial e o antigénio, ao doente. Os portadores aceites na Indústria Farmacêutica para a libertação intranasal são exemplificados por água, soluções salinas tamponadas, glicerina, polisorbato 20, cremophor EL, e uma mistura aquosa de glicerídeo caprílico/cáprico, e podem ser tamponados para prover um ambiente de pH neutro. Os portadores aceites na Indústria Farmacêutica para a libertação parenteral são exemplificados com 0.9% de NaCl estéril tamponado ou 5% de glicose opcionalmente suplementada com um 20% de albumina. As preparações para administração parental devem ser estéreis. A via parental para a administração dos ingredientes activos é de acordo com métodos conhecidos, por exemplo injecção ou infusão por vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial ou intralesional. As composições da invenção são preferencialmente administradas por injecção em bola. Uma composição farmacêutica típica para a injecção intramuscular seria composta para conter, por exemplo, de 1 a 10 ml de soro salino tamponado com fosfato e 1 a 100 μgr preferencialmente 15-45 μρ de antigénio ela 100 μρ, preferencialmente 15-45 μg do LOS Neisserial da invenção. Para administração oral, a substância activa pode ser administrada em 8/25 formas de doses líquidas, tais como elixires, xaropes, e suspensões. As formas de doses líquidas para administração oral podem conter corantes e aromatizantes para aumentar a aceitação do doente. Os métodos para preparar as composições administráveis parenteralmente, oralmente ou intranasalmente são bem conhecidos na técnica e são descritos mais detalhadamente em diferentes fontes, incluindo, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) . O antigénio na composição da invenção é preferencialmente um antigénio que provém ou é produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alergénio. Os antigénios víricos que podem ser combinados com o LOS Neisserial da invenção podem ser derivados de qualquer classe de vírus, exemplos não limitativos destes vírus são: Retroviridae tal como o vírus da imunodeficiência humana (VIH); um rubella vírus; paramyxoviridae tal como o vírus da parainfluenza, sarampo, papeira, vírus respiratório sincitial, metapneumovírus humano; flaviviridae tal como vírus da febre amarela, vírus da dengue, vírus da hepatite C (HCV), vírus da encefalite japonesa (JEV), encefalite transmitida por carraças, encefalite de St. Louis ou vírus do Nilo do Oeste; Herpesviridae tal como vírus Herpes

Simplex, citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr; Bunyaviridae;

Arenaviridae; Hantaviridae tal como Hantaan; Coronaviridae;

Papovaviridae tal como Papilomavírus humano; Rhabdoviridae tal como vírus da raiva. Coronaviridae tal como coronavírus humano;

Alfaviridae, Arteriviridae, filoviridae tal como Ebolavírus,

Arenaviridae, poxviridae tal como vírus do botulismo, e vírus da peste suína africana. Deste modo os LOS's neisserial da invenção podem ser combinados com antigénios derivados de bactérias patogénicas, fungos (incluindo fermento), ou parasitas. Os antigénios deste tipo incluem antigénios bacterianos de por exemplo Helicobacter, tal como H. pylori, Neisseria, tal como N. mengitidis, Haemophilus, tal como H. influenza, Bordetella, tal como B. pertussis, Chlamydia, Streptococcus, tal como 9/25

Streptococcus sp. serótipo A, Vibrio, tal como V. cholera, patogénicos gram-negativos entéricos incluindo por exemplo Salmonella, Shigella, Campylobacter e Escherichia, assim como os antigénios de bactérias que causam o carbúnculo, a lepra, a tuberculose, a difteria, a doença de Lyme, a sífilis, a febre tifoide, e a gonorréia. Os antigénios de parasitas por exemplo incluem antigénios de protozoários, tal como Babeosis bovis, Plasmodium, Leishmania spp. Toxoplasma gondii, e Trypanosoma, tal como T. cruzi. Antigénios fúngicos podem incluir antigénios de fungos tais como Aspergillus sp., Candida albicans, Cryptococcus, tal como por exemplo C. neoformans, e Histoplasma capsulatum.

Apesar de que a vacinação é geralmente aplicada para a protecção profiláctica contra os patogénicos ou para o tratamento de doenças depois de uma infecção patogénica, o técnico especializado é consciente da aplicação das vacinas para o tratamento de tumores. Além disso, foi descoberto que um número cada vez maior de proteínas específicas de tumores são entidades apropriadas que podem ser marcadas com anticorpos humanos ou humanizados. Estas proteínas específicas de tumores estão também dentro do âmbito da presente invenção. Muitos antigénios tumorais específicos são conhecidos na técnica. Portanto, numa forma de realização preferida, a invenção provê composições que compreendem um antigénio específico de tumores e um LOS Neisserial tal como o acima definido. Os antigénios tumorais adequados incluem por exemplo antigénio carcino-embrionário, antigénio de membrana específica da próstata, antigénio específico da próstata, proteína MZ2-E, mucina epitelial polimórfica (PEM), proteína de ligação ao folato LK26, receptor epidérmico (truncado) do factor de crescimento (EGRF) , HER2, antigénio de Thomsen-Friedenreich (T), gangliossídeos GM-2 e GD-2, Ep-CAM, mucina-1, glicoproteína-2 epitelial, e antigénio específico do cólon. 10/25

Além disso, os antigénios podem ser marcados para DC' s para induzir a tolerância na prevenção da doença auto-imune. Os alergénios deste tipo estão também dentro do âmbito da presente invenção. Noutro aspecto a descrição refere-se a métodos para a produção de um LOS Neisserial tal como o acima definido. Um método preferido compreende as fases de: (a) cultivar uma estirpe de N. menigitidis, onde a estirpe expressa um LOS Neisserial de imunotipo L2, L3 ou L4 e carece de um gene lgtB activo, ou expressa um LOS Neisserial de imunotipo L6, e onde a estirpe transporta uma mutação que inactiva ou reduz a expressão de um ou mais dos genes lpxLl e lpxL2; e, (b) recuperar o LOS Neisserial.

De forma alternativa, o método compreende as fases de: (a) cultivar uma estirpe de N. menigitidis, em que a estirpe expressa um LOS Neisserial de imunotipo L2, L3 ou L4 e carece de um gene lgtB activo, ou expressa um LOS Neisserial de imunotipo L6; (b) recuperar o LOS Neisserial; e, (c) tratar o LOS Neisserial com pelo menos um de hidrazina, fosfatase alcalina ou aciloxihidrolase para reduzir a toxicidade da fracção do lípido A.

No método, a ordem das fases (b) e (c) pode ser mudada. Num método preferido, na fase c) a toxicidade é reduzida até menos de 80% da toxicidade do LOS Neisserial tipo selvagem, como determinado num ensaio WEHI como o acima descrito.

Ainda noutro aspecto a descrição refere-se a OMV's (Outer

Membrane Vessicles - vesícula da membrana externa) ou bolhas gram-negativas que compreendem os LOS's neisserial como o acima 11/25 definido. Os meios e métodos para produzir OMV's ou bolhas gram-negativas estão descritos no Pedido Internacional de Patente WO 02/09746. As bolhas gram-negativas assim obtidas podem ser combinadas com o LOS Neisserial da invenção para produzir bolhas gram-negativas que compreendem os LOS's Neisserial. De forma alternativa as bolhas podem ser produzidas de uma estirpe Neisserial como o acima definido, que é capaz de produzir um LOS Neisserial da invenção. As bolhas gram-negativas que os compreendem podem ainda ser combinadas com um antigénio como o acima descrito e/ou com portadores aceites na Indústria Farmacêutica como os acima descritos.

Descrição das figuras

Figura 1: Representação esquemática do LPS tipo selvagem (Wild Type - WT) L3 de N. meningitidis e os seus mutantes oligossacarideos que podem ser gerados por inactivação insercional dos genes (indicados em itálico) que codificam as glicosiltransferases.

Figura 2: As Células dendríticas (DC) foram cultivadas com bactérias marcadas com FITC com um rácio de 1:50 durante 24h. Nos pontos temporais indicados, foram tiradas amostras para medir a associação das bactérias às DC' S com FACS. Um representativo de três experiências separadas de três doadores diferentes é mostrado.

Figura 3: As DCs foram estimuladas com bactérias marcadas com FITC com um rácio de 1:50 durante 18h na presença de brefeldina A e seguidamente tingidas para TNF-α e IL-12 intracelular. Os diagramas de pontos mostram a percentagem das DC associadas às bactérias não produtoras (quadrante direito inferior) ou produtoras (quadrante direito superior) das citocinas intracelulares. 12/25

Figura 4: A produção de TNF-α, IL-12; Il-ΐβ, IL-10 e IL-6 por DC em resposta ao tipo selvagem (Wild Type - WT) de N. meningitidis e mutantes foram medidas em sobrenadantes de cultura por ELISA depois de 18h de co-cultura. Uma média e SEM de três experiências separadas estão mostradas.

Figura 5: Expressão de CD40 e CD86 depois de 18h de co-cultura do tipo selvagem (Wild Type - WT) de N. meningitidis e mutantes com DCs como o indicado com a intensidade de fluorescência mediana (MFI).

Figura 6: Ligação de moléculas de Fc de lectina do tipo C para o tipo selvagem (Wild Type - WT) de N. meninigitidis e mutantes num ensaio de adesão solúvel.

Figura 7: Associação da DC do tipo selvagem (Wild Type - WT) de N. meninigitidis e mutante de lgtB na presença e na ausência de anticorpos anti-DC-SIGN AZN-D1 de 20 microgramas por ml.

Figura 8: Proliferação de células Thl/Th2 conduzida por DC:

As DC foram incubadas com H44/76 tipo selvagem de N. meningitidis, o mutante de lgtB, LPS de E. coli, poly I:C ou PGE2 durante 48 h, lavadas e (A) analisadas para marcadores de maturação (média e SEM de três experiências separadas) ou (B) co-cultivadas com células T de CD45RA+ CD4+ altamente purificadas. As células T inertes foram re-estimuladas com PMA e ionomicina, e IL-4 (cinzento) e IFN-γ (negro) intracelular foram analisadas numa base de célula individual por citometria de fluxo. Os dados de três doadores diferentes estão mostrados. 13/25

Figura 9: Associação das DC e indução da citocina das bactérias vivas. As células dendriticas (DC) foram cultivadas com N. meningitidis tipo selvagem marcadas com FITC e mutantes de LPS num rácio de 1:100. Nos pontos temporais indicados, foram tiradas amostras para medir a associação das bactérias às DCs com FACS. Os resultados são mostrados com células de dois doadores diferentes.

Exemplos 1 Materiais e métodos 1.1 Estirpes bacterianas O núcleo do oligossacarideo e os mutantes do lipido A foram derivados do tipo selvagem (WT) grupo B de N. meningitidis H44/7 6 e foram descritos previamente:

Estirpe ou mutante Referência H44/76 Holten, 1979, J. Clin. Microbiol. 9: 186-188 galE Jennings et al., 1993, Mol.Microbiol. 10: 361-369 lgtB Jennings et Al., 1995, Mol.Microbiol. 18: 729-740 lpxLl van der Ley et al., 2001, Inf ect-Immun. 69:5981-5990 A estrutura dos mutantes do núcleo do oligossacarideo utilizados neste estudo são mostrados na figura 1. Todas as estirpes cresceram em agar gonocócica (Difco, Basingstoke, UK) suplementado com Vitox (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) numa atmosfera de 6% de C02 em ar a 36 °C. As bactérias foram usadas num fase estacionária depois da cultura durante 18 horas. As suspensões das bactérias foram preparadas no meio RPMI 1640 sem 14/25 vermelho fenol (Gibco, Paisley, UK) , e a sua densidade óptica foi medida a 540nm. A densidade óptica de 1 foi calculada para corresponder a 109 organismos/ml. As bactérias foram fixadas em 0.5% de paraformaldeído (PFA) num tampão de fosfato salino (PBS) durante 15 minutos e lavadas cuidadosamente no meio RPMI. As bactérias marcadas com FITC foram preparadas por incubação com 5mg/ml de FITC (Sigma, Poole, UK) durante 20 minutos a 37 °C seguidas de lavagem extensiva. 1.2 Células

As DC's foram geradas a partir das células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMC) como o previamente descrito (F. Sallusto & A. Lanzavecchia, 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118; H. Uronen-Hansson et al., 2004, Immunology 111: 173- 178). Resumindo, os monócitos foram preparados a partir de PBMC por centrifugação em gradientes de Percoll multifase. A fracção do monócito foi >95% CD14+/CD3-/CD19. Para gerar DC's, os monócitos foram incubados durante 7 dias em RPMI suplementado com 10% FCS inactivado por calor, 2.4mM de L-glutamina, lOOU/ml de Penicilina-estreptomicina (todos de Gibco, Paisley, UK), lOOng/ml de GM-CSF recombinante humano e 50ng/ml de IL-4 recombinante humano (Schering-Plough, Welwyn Garden City, Herts, UK) . As DC' s imaturas preparadas desta maneira foram CD14low, CD83~ve, CD86l0W, CD25~ve. Também expressaram HLA DR, HLA DQ, HLA Classe I, CD40 e CDla, e foram negativos tanto para CD 19 como para CD3.

As DC' s a uma concentração de 5xl05/ml foram cultivadas com bactérias H44/76 de N. meningitidis com um rácio DC/bactérias entre 1:50 e 1:200 (como o indicado na legenda da figura) em RPMI 1640 suplementada com 10% de FCS. Quando as citocinas intracelulares deviam ser medidas, foi adicionado o inibidor 15/25

Brefeldina A (Sigma, Poole, UK) de transporte da proteína a lC^g/mL. A especificidade da ligação do mutante de lgtB para as DCs foi determinado incubando as DCs imaturas com 20 μρ/ιηΐ anti-DC-SIGN mAb AZN-D1 durante 30 minutos a 37 °C, e posteriormente com bactérias tipo selvagem e mutantes durante 45 minutos a 37 °C. 1.3 Ligação das DC e internalizaçao A ligação da DC e internalização das bactérias foram determinadas por uma combinação de citometria de fluxo e microscopia confocal. Para a detecção por citometria de fluxo, as DCS foram incubadas com bactérias marcadas com FITC durante períodos de tempo entre 30 minutos e 24 horas, fixadas em FACSFix (BD) , lavadas e analisadas num FACSCalibur. As DCs associadas às bactérias foram facilmente identificadas por fluorescência na população controlada por DC. Para a microscopia confocal, as DCs estimuladas com N. meningitidis marcadas com FITC permitiu a adesão durante 10 minutos a uma lâmina de adesão (Bio-Rad Laboratories Ltd., Herts, UK). Para deter a internalização, as DC' s foram fixadas com 4% de PFA durante 10 minutos. As DC' s foram visualizadas por coloração com 5μρ/ιη1 de anticorpos monoclonais anti MHC Classe II (Dako, Glostrup, Denmark). Depois da lavagem, o anticorpo ligado foi detectado com 5μρ/ιη1 de anticorpo anti-rato de cabra conjugado com Texas Red (sondas moleculares) durante lh. As lâminas foram lavadas e montadas em Citifluor (Citifluor Ltd, UK) . As imagens confocais foram obtidas usando um sistema de microscópio de varrimento laser Leica SP2 confocal (Leica, Milton Keynes, UK) ajustado com conjuntos de filtros apropriados. Para identificar as bactérias intracelulares, 15 - 20 secções ópticas (0.2-0.5μιη) abrangendo a 16/25 totalidade das DC's foram projectadas e sobrepostas com software de formação de imagens Leica confocal. 1.4 Medições de citocina

Para medir a produção de citocina intracelular, as DC's foram fixadas com 4% de PFA em PBS durante 15 minutos, lavadas em PBS contendo 0.1% de azida de sódio e 0.5% de BSA (todos de Sigma) e permeabilizadas em 25μ1 de solução de permeabilização (Caltag). Seguidamente, as células foram incubadas com anticorpos monoclonais para TNF-a(Becton Dickinson BD, Oxford UK) e IL-12 p40/70 (Pharmigen) ou controlos coincidentes com isótipos durante 30 minutos à temperatura ambiente e às escuras. Seguidamente, as células foram lavadas duas vezes em PBS, fixadas em CellFix (Becton Dickinson) e analisadas por citometria de fluxo num FACSCalibur usando o software Cell Quest (Becton Dickinson). As DC's constituíram uma população diferente identificada com a dispersão frontal e em ângulo recto. Pelo menos 95% das células desta população eram DC's como as definidas com a sua expressão de MHC II, CDla, CD25; CD80; CD83 e CD86. Um mínimo de 3000 eventos nas barreiras correspondentes às DC foram recolhidas para análise. Para ensaios ELISA das citocinas solúveis, kits ELISA CytoSets™ (Biosource Europe S.A, Nivelles Belgium) para IL-12, TNF-α e IL-10, IL6 e ILip humanos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. 1.5 Ensaio de adesão a Fc-lectina tipo C solúvel

As moléculas de Fc-lectina tipo C consistem na parte extracelular do receptor da lectina tipo C (DC-SIGN, MGL e Dectina-1B) fundidas no termo COOH a um fragmento de IgGl-Fc humano (T. Geijtenbeek et al., 2003, J. Exp. Med. 197: 7-17). O ensaio de adesão de lectina-Fc solúvel tipo C foi executado da seguinte maneira. A totalidade das células (OD540=0.1) foram revestidas nas placas ELISA (100 μΐ/poço) durante 18 horas à 17/25 temperatura ambiente (RT), seguido do bloqueio com 1% de BSA durante 30 minutos a 37 °C. O sobrenadante solúvel de lectina-Fc tipo C foi adicionado durante 2h a RT, A Fc-lectina tipo C não ligada foi lavada e a ligação foi determinada por anti-IgGl ELISA.

1.6 Diferenciação da Thl/Th2 conduzida pela DC

As DC foram cultivadas de monócitos de doadores saudáveis num meio Dulbecco modificado de Iscove (Gibco), suplementado com 10% de FCS (BioWithaker, Verviers, Belgium) , 500 U/ml de IL-4 e 800 U/ml de GM-CSF (ambos de Schering-Plough). Ao 6°. dia a maturação da DC foi induzida com tipo selvagem de N. meningitidis e mutante de lgtB a uma multiplicidade de infecção de 10. Os controlos positivos seguintes foram incluídos no ensaio (i) resposta de Thl/Th2 misturado, 10 ng/ml de LPS de Escherichia coli (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (ii) diferenciação de Thl, 20 μρ/ιηΐ de poly I:C (Sigma-Aldrich) e

(iii) diferenciação de Th2, 10 μg/ml de PGE2 10 ng/ml de LPS (Sigma-Aldrich). Ao 2o. dia, as DC foram analisadas para marcadores de maturação (CD80; CD83; CD86 e HLA-DR) por citometria de fluxo.

Para avaliar a diferenciação das células T, as DC amadurecidas foram incubadas com células T CD45RA+/CD4+ (5.103 células T/ 20.103 DC) . Entre o 12°.e 15°. dia, as células T inertes foram re-estimuladas com 10 ng/ml de PMA (Sigma-Aldrich) e 1 μρ/ιηΐ de ionomicina (Sigma-Aldrich) durante 6 horas. Depois de 1 hora 10 μρ/πιΐ de Brefeldina A (Sigma-Aldrich) foram adicionadas às células T. A produção de células individuais de IL-4 e IFN-18/25 ^- foi determinada por análise intracelular de citometria de fluxo. As células foram fixadas em 2% de PFA, permeabilizadas com 0.5% de saponina (Sigma-Aldrich) e tingidas com anti-IFN-γ humano-FITC e anti-IL-4 humano PE (BD Pharmingen, San Diego, CA). 2. Exemplo: Ligação, e internalização das estirpes mutantes do núcleo de oligossacarideo de Neisseria meningitidis com as DC's

Para investigar a ligação e a internalização do tipo selvagem de N. meningitidis foi usada uma técnica de citometria de fluxo, os mutantes do oligossacarideo e o mutante deficitário de LPS com as DC's humanas. As DC's imaturas foram co-cultivadas com estirpes mutantes marcadas com FITC derivadas do tipo selvagem de N. meningitidis H44/76 com um rácio entre DC/bactérias de 1:50 (figura 2) e 1:200 (dados não mostrados) e analisadas por FACS para a presença de bactérias marcadas com FITC associadas às DC. O aumento dependente do tempo e das doses em associação com DC foi observado tanto para o tipo selvagem como para os mutantes do oligossacarideo. Dificilmente qualquer associação das DC foi encontrado para o mutante deficitário de LPS nas primeiras seis horas do curso do tempo. O mutante de lgtB mostrou uma associação de DC consistentemente mais alta que os tipos selvagens ou mutantes de galE com as duas concentrações.

Para distinguir entre a ligação bacteriana e a internalização, a seguir usamos microscopia confocal para estudar a internalização das DC do tipo selvagem de N. meningitidis e mutantes (não mostrado). As bactérias FITC foram facilmente detectadas nas lâminas como pequenas partículas verdes. O corante MHC Classe II foi usado para visualizar as DC' s. A maioria das DC' s já tinha internalizado mais lgtB depois de lh de incubação em comparação com as bactérias tipo selvagem ou o mutante de galE.

Dificilmente qualquer internalização foi vista para o mutante deficitário de LPS. Adicionalmente a um nível alto de 19/25 internalização, a aderência de superfície manteve-se geralmente alta para as bactérias mutantes de lgtB em todo o curso do tempo. Estes resultados confirmam os resultados por FACS; associação aumentada das bactérias com resultados de DC' s em internalização aumentado de bactérias. 3. Exemplo: Activação e maturação das DC's em resposta a estirpes mutantes de Neisseria meningitidis

Para estudar a relação entre a internalização das bactérias e a produção da citocina, IL12 e TNF-α produzidas por DC's em resposta ao tipo selvagem e aos mutantes foram medidos intracelularmente e a análise foi executada em simultâneo para internalização (figura 3). As DC's foram co-cultivadas com bactérias marcadas com FITC com um rácio de 1:50 durante 18 horas e seguidamente tingidas para a produção intracelular de TNF-α e IL12. Os quadrantes foram colocados para separar as células que estavam associadas às bactérias FITC das células que não tinham bactérias FITC unidas. As percentagens dadas são a percentagem das citocinas intracelulares produtoras das DC's (quadrante direito superior) ou não produtoras das DC' s (quadrante direito inferior) depois da internalização das bactérias. O tipo selvagem, mutante de lgtB e galE foram todos indutores potentes da produção de TNF-a e IL-12 com as DC' s enquanto que o mutante deficitário de LPS não o foi. Praticamente todas as DC's que tinham internalizado o tipo selvagem de N. meningitidis, o mutante de lgtB e galE foram produtores de níveis altos de TNF-α. No caso de IL-12, foi descoberto que a produção foi aproximadamente 50% das DC' s que tinham internalizado as bactérias marcadas com FITC.

Adicionalmente às medições da citocina intracelular, também foram medidos os níveis de citocina segregada pelas DC's em resposta à N. meningitidis (figura 4). As DC's foram co-cultivadas com o mutante e bactérias tipo selvagem com um rácio 20/25 1:200 durante 18h e os sobrenadantes foram recolhidos para análise de IL12; IL10, TNF-α, IL6 e IL-β segregados. Os resultados estão mostrados como a percentagem da produção de citocina em comparação com o tipo selvagem (WT=100%). Tanto o mutante de lgtB como o mutante de galE induziu algo menos IL 12, TNF-α e IL-β em comparação com as bactérias tipo selvagem. A produção de IL-10 e IL-6 tanto de lgtB como de galE resultaram ser parecidas com a estirpe tipo selvagem. Foi dificilmente observada alguma produção de citocina para a estirpe deficitária de LPS.

Finalmente, a maturação das DC' s estimuladas com bactérias tipo selvagem e mutantes foi estudada medindo a expressão das moléculas co-estimuladoras CD40 e CD86 (figura 5). A expressão de CD40 e em particular CD86 foi mais alta quando as DC' s foram estimuladas com o mutante de lgtB em comparação com as DC' s estimuladas com bactérias tipo selvagem ou mutantes de galE. Dificilmente foi descoberta qualquer expressão de CD40 e CD86 quando as DCs foram estimuladas com o mutante de lpxA.

Em conclusão, estes dados demonstram que a ligação e a internalização do mutante de lgtB com as DCs resultam na activação e maturação das DCs comparável ao nível de activação e maturação da DC induzida com bactérias tipo selvagem.

4. Exemplo: Identificação do receptor mediador da ligação e internalização do mutante de lgtB A ligação e absorção aumentada com as DCs do mutante de lgtB estimulou-nos a investigar se esta ligação e internalização são mediadas via um receptor das DC específicas. Portanto analisamos a capacidade dos tipos selvagens e dos mutantes para ligar os receptores de lectina tipo C que são capazes de reconhecer os oligossacarídeos e são altamente expressos nas DCs imaturas. A ligação de um painel quimérico de Fc-lectina tipo C à totalidade 21/25 das células do tipo selvagem e bactérias mutantes foi estudada num ensaio de adesão solúvel (figura 6) . Enquanto que o tipo selvagem, o mutante de galE e o mutante deficitário de LPS não ligou nenhuma das Fc-lectina tipo C quiméricas, foi descoberto uma forte ligação DC-SIGN-Fc para o mutante de lgtB. A ligação do mutante de lgtB a DC-SIGN foi também descoberta nas células HEK293T transitoriamente transfectadas com DC-SIGN ou células K562 que expressam de forma estável DC-SIGN (dados não mostrados). Além disso, a especificidade do LPS de lgtB para DC-SIGN foi demonstrado estudando a fagocitose da DC do mutante de lgtB na presença ou na ausência do anticorpo de bloqueio anti-DC-SIGN AZN-D1 (figura 7) . Na presença de AZN-D1, a fagocitose de lgtB com DC's foi reduzida ao nível da ligação observada para o tipo selvagem demonstrando claramente que DC-SIGN liga e internaliza o mutante de lgtB. 5. Exemplo: A marcação do mutante de lgtB para DC-SIGN inicia uma resposta imune de TH1

Para avaliar a relevância funcional, se a houvera, da interacção do LPS do mutante de lgtB com DC-SIGN, estudamos as respostas das células T conduzidas com as DC depois de pulsar as DC imaturas tanto com bactérias tipo selvagem como com mutantes de lgtB fixadas com PFA. Não foi descoberta nenhuma diferença na maturação da DCs pulsadas com DCs com bactérias tipo selvagem ou com mutantes de lgtB como o avaliado com a expressão de moléculas co-estimuladoras e marcadores de maturação (figura 8a). No entanto, diferenças marcadas foram observadas nos perfis de Th1/TH2 induzidos com estas estirpes (figura 8b). As DC pulsadas com N. meningitidis do tipo selvagem geraram predominantemente uma resposta imune do tipo TH2 dado que a maioria das células T foram produtoras de IL-4. As DC pulsadas com o mutante de lgtB evocou de forma predominante células T produtoras de IFN-γ, mudando assim o equilíbrio das células TH1-versus TH2 para TH1. Esta mudança no equilíbrio de TH1/TH2 foi 22/25 observado em 3 doadores independentes. Estes dados indicam que a marcação específica de LPS de lgtB para DC-SIGN gera sinais de DC que conduzem a uma resposta imune em TH1, que é um fenómeno altamente desejável para os adjuvantes. Ver também P. Moingeon et al. (2001) Vaccine 19:4363-4372. 6. Exemplo: A ligação e a internalização do oligossacarídeo/lípido A duplica as estirpes mutantes de Neisseria meningitidis com DC's

Uma técnica de citometria de fluxo foi usada para investigar a ligação e a internalização do tipo selvagem de N. meningitidis, mutantes oligossacarídeos de lgtA e lgtB e seus mutantes duplos de lpxLl, e o mutante deficitário de LPS com DC' s humanas. As DC's imaturas foram co-cultivadas com estirpes mutantes marcadas com FITC derivadas do tipo selvagem de N. meningitidis H44/76 com um rácio de DC/bactérias de 1:100 e analisadas por FACS para a presença de bactérias marcadas com FITC associadas com DC (figura 9) . O mutante individual de lgtB mostrou consistentemente uma associação a DC maior do que o tipo selvagem ou o mutante individual de lgtA. Além disso, também no entorno do mutante de lpxLl a mutação de lgtB resultou numa associação mais alta do que as estruturas do oligossacarídeo de tipo selvagem ou lgtA, indicando que a ligação aumentada mediada por lgtB para DC-SIGN é também possível com o lípido A de lpxLl penta-acilado contendo LPS.

Lisboa, 7 de Julho de 2010 23/25

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição

• WO 200414417 A • EP 1127137 A • NL 9101359 A • US 5997881 A • WO 0026384 A • US 5103661 A • WO 209746 A • US 6290952 B

Literatura citada na descrição que não é Pedido de Patente • Ley et al. Infect. Immun., 2001, vol. 69, 5981-5990 [0005] • Steeghs et al. J. Endotoxin Res., 2004, vol. 10, 113-119 [0005] • Espevik; Niessen. [0012] J. Immunol. Methods, 1986, vol. 95, 99-105 • Ziegler-Heitbrock 461 [0012] et al. Int. J. Câncer, 1988, vol. 41, 456- • Erwin et al. Infect. Immun., 1991, vol. 59, 1881-87 [0014] • Gu et al. Infect. Immun., 1996, vol. 64, 4047-53 [0014] • Polotsky et al. Infect. Immun., 1994, vol. 62, 210-14 [0014 24/25 • Gu et al. Infect. Inunun., 1998, vol. 66, 1891-97 [0014] •Remington's Pharmaceutical Science. Mack Publishing 1980. [0017] •Holten. J. Clin. Microbiol., 1979, vol. 9, 186-188 [0024] •Jennings et al. Mol. Microbiol., 1993, vol. 10, 361-369 [0024] •Jennings et al. Mol. Microbiol., 1995, vol. 18, 729-740 [0024] • F. Sallusto; A. Lanzavecchia. J. Exp. Med., 1994, vol. 179, 1109-1118 [0026] •H. Uronen-Hansson et al. Immunology, 2004, vol. 111, 173-178 [0026] • T. Geijtenbeek et al. J. Exp. Med., 2003, vol. 197, 7-17 [0031] • P. Moingeon et al. Vaccine, 2001, vol. 19, 4363-4372 [0040] 25/25

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uso de um LOS Neisserial na fabricação de um medicamento para a imunização de um mamífero, em que o LOS Neisserial é representado pela fórmula (I): KDO a2-»4 GlcNAc β 1—»3 Gal β1-*4 Glc β1—4 Hep al-»5 KDO - LA al-*3 Hep-»PEA (3 ou 6) al-2 GlcHAc, onde LA é uma fracção de lípido A tipo selvagem ou uma fracção de lípido A com toxicidade reduzida e onde o LOS Neisserial é usado como um adjuvante.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o LOS Neisserial ser usado em combinação com um antigénio na fabricação de um medicamento para aumentar uma resposta imune contra o antigénio no mamífero.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o antigénio prover ou ser produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alergénio.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por LA ser uma fracção de lípido A cuja toxicidade é inferior a 80% da toxicidade de uma fracção de lípido A tipo selvagem, como o determinado num ensaio WEHI.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por a fracção de lípido A ser seleccionada do grupo constituído por: 1/5 (a) uma fracção de lípido A como a obtenível a partir de uma estirpe de Neisseria com uma mutação que reduz a actividade ou inactiva um gene lpxLl ou lpxL2 ou um homólogo destes; (b) uma fracção de lípido A como a obtenível por remoção de um ou mais ácidos gordos secundários O-ligados esterifiçados de uma fracção de lípido A tipo selvagem pelo tratamento com uma aciloxihidrolase; (c) uma fracção de lípido A como a obtenível pelo tratamento de hidrazina de uma fracção de lípido A tipo selvagem; (d) uma fracção de lípido A como a obtenível por desfosforilação com uma fosfatase alcalina.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por a fracção de lípido A ser seleccionada do grupo constituído por: (a) uma fracção de lípido A com um Ci2-acilo secundário somente na glucosamina redutora; (b) uma fracção de lípido A com um Ci2-acilo secundário somente na glucosamina não redutora; (c) uma fracção de lípido A carente nos dois grupos Ci2-acilo secundários; (d) uma fracção de lípido A carente de um ou mais grupos fosfato tanto na posição 1 como na posição 4'; e, (e) uma fracção de lípido A com uma combinação das desacilações em (a); (b) ou (c) e as desfosforilações em (d) .

7. LOS Neisserial representado pela fórmula (I): 2/5 KDO α2-*4 GlcNAc βΙ-,3 Gal β1-»4 Glc β1-»4 Hep od-»5 KDO - LA al-»3 Bep->PEA (3 ou 6) al-2 GlcNAc, em que LA é uma fracção de lípido A tipo selvagem ou uma fracção de lípido A com toxicidade reduzida, para ser usada como adjuvante num tratamento para imunização de um mamífero.

8. LOS Neisserial de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o LOS Neisserial ser usado no tratamento em combinação com um antigénio para aumentar uma resposta imune contra o antigénio no mamífero.

9. LOS Neisserial de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o antigénio ser de ou produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alergénio.

10. LOS Neisserial de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizado por LA ser uma fracção de lípido A tal e como o definido em qualquer uma das reivindicações de 4 a 6.

11. Composição que compreende um LOS Neisserial representada pela fórmula (I): KDO 0(2-,4 GlcNAc β1-3 Gal β1-4 Glc β1-»4 Hep od-,5 KDO - LA al-»3 Hep-,ΡΕΑ (3 ou 6) al-*2 GlcNAc, onde LA é uma fracção de lípido A tipo selvagem ou uma fracção de lípido A com toxicidade reduzida, onde a composição compreende também um antigénio de ou produzido por um vírus, um 3/5 fungo, um parasita, uma célula cancerosa, um alergénio ou uma bactéria, onde a bactéria é seleccionada do grupo constituído por Helicobacter, Haemophilus, Bordetella, Chlamydia, Streptococcus, Vibrio, um patogénio entérico Gram-negativo, Salmonella, Shigella, Campylobacter, Escherichia, e bactérias causadoras do carbúnculo, da lepra, da tuberculose, da difteria, doença de Lyme, da sífilis, ou da febre tifoide, e onde a composição compreende um portador aceite na Indústria Farmacêutica.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a toxicidade da fracção de lípido A ser inferior a 80% da toxicidade de uma fracção de lípido A do tipo selvagem, como o determinado num ensaio WEHI.

13. Composição de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada por a fracção de lípido A ser seleccionada do grupo constituído por: (a) uma fracção de lípido A como o obtenível a partir de uma estirpe de Neisseria com uma mutação gue reduz a actividade ou inactiva um gene lpxLl ou lpxL2 ou um homólogo destes; (b) uma fracção de lípido A como a obtenível por remoção de um ou mais ácidos gordos secundários O-ligados esterifiçados de uma fracção de lípido A tipo selvagem pelo tratamento com uma aciloxihidrolase; (c) uma fracção de lípido A como a obtenível pelo tratamento de hidrazina de uma fracção de lípido A do tipo selvagem; (d) uma fracção de lípido A como a obtenível por desfosforilação com uma fosfatase alcalina.

14. Composição de acordo com qualguer uma das reivindicações de 11 a 13, caracterizada por a fracção de lípido A ser: 4/5 (a) uma fracçao de lípido A com um Ci2-acilo secundário somente na glucosamina redutora; (b) uma fracção de lípido A com um Ci2-acilo secundário somente na glucosamina não redutora; (c) uma fracção de lípido A carente de ambos grupos secundários Ci2-acilo ; (d) uma fracção de lípido A carente de um ou mais grupos fosfato tanto na posição 1 como na posição 4'; e, (e) uma fracção de lípido A com uma combinação das desacilações em (a); (b) ou (c) e as desfosforilações em (d) . Lisboa, 7 de Julho de 2010 5/5

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FITC wt í\i ~ !

FITC IgtB Fig 3a Fig 3b Fig 3c 3/16

-τ 260203 robin1;25.038

ττ 260203 robin 1:25.027 Ο -4 <Ό

FITC galE τ 260203 robin 1;25.039

Fig 3d Fig 3e 4/16 TNF

Estirpe Fig 4a 5/16 IL-12

EstirpeFig 4b 6/16 IL-1beta

Estirpe Fig 4c 7/16 IL-10

EstirpeFig 4d 8/16 IL-6 200ι- 160-=

Wt IgtB galE IpxA não bact. Estirpe Fig 4e 9/16

ιο ο> • LL 10/16 tO;S ,Έ Õl .c c TO E.TO C TO to to Φ Z (D T3 to TO ‘TO O to TO T3 TO T3 TO TO O 'TO O Og. 4-* TO c 0 TO 1 O TO T3 O TO O TO O)

CQ i C o & C .g> (Λ O) (D e iq d <N d o O «0 CO
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Fig 8a 13/16 doador 1 50 τ

LPS poly tC FGE2 H44/76 IgtB Estímulos doador 2 50 T-

LPS poly LC PGE2 H44A76 IgtB Estímulos doador 3 50 η------------------ u> 40--------------—----

LPS poly tC PGE H44/76 IgtB Estímulos Fig 8b 14/16

tempo (h) Fig9a Η44/76 —·—igtB —·—igtA —B—IpxLI —e—IpxLIIgtB —e— IpxLI IgtA —A— LPS- 15/16

tempo (h) Fig 9b —H44/76 —·—IgtB —·—igtA —B— IpxLI —θ— lp>dL1 IgtB —e—IpxLI IgtA —*—LPS- 16/16