PT1622939E - Variantes ativas da proteína de ligação à il-18 e suas utilizações médicas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

VARIANTES ATIVAS DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO À IL-18 E SUAS UTILIZAÇÕES MÉDICAS"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas proteínas de ligação à interleuquina 18 (IL-18BPs). A invenção também se refere a composições farmacêuticas compreendendo essas IL-18BPs, a ácidos nucleicos que codificam essas IL-18BPs e a utilizações médicas das referidas IL-18BPs.

CONTEXTO DA INVENÇÃO

Em 1989 foi descrita uma atividade do soro induzida por endotoxinas que induziu interferão-γ (IFN-γ) obtido de células de baço de ratinho (Nakamura et al., 1989) . Esta atividade do soro funcionou não só como indutor direto de IFN-γ mas também como coestimulador em conjunto com IL-2 ou mitogénios. Uma tentativa de purificar a atividade de soro de ratinho pós-endotoxinas revelou uma proteína de 50-55 kDa aparentemente homogénea. Uma vez que outras citoquinas podem atuar como coestimuladores da produção de IFN-γ, o facto de anticorpos neutralizadores para IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 ou TNF não conseguirem neutralizar a atividade do soro sugeriu tratar-se de um fator distinto. Em 1995, os mesmos cientistas demonstraram que o coestimulador induzido por endotoxinas da produção de IFN-γ estava presente em extratos de fígados de ratinhos pré-condicionados com P. acnes (Okamura et al., 1995). Neste modelo, a população de macrófagos hepáticos (células de Kupffer) expande-se e, nestes ratinhos, uma dose baixa de lipopolissacárido (LPS) bacteriano, que não é letal em ratinhos que não foram pré-condicionados, torna-se letal. O fator, denominado fator 2 indutor de IFN-γ (IGIF) e posteriormente designado interleuquina-18 (IL-18), foi purificado até à homogeneidade a partir de 1 200 gramas de figados de ratinho tratados com P. acnes. Oligonucleótidos degenerados derivados de sequências de aminoácidos de IL-18 purificada foram utilizados para clonar um cDNA de IL-18 murino. A IL-18 é uma proteína de 18-19 kDa com 157 aminoácidos, que não tem semelhanças óbvias com nenhum péptido presente nas bases de dados. RNAs mensageiros para IL-18 e interleuquina-12 (IL-12) são facilmente detetados em células de Kupffer e macrófagos ativados. A IL-18 recombinante induz IFN-gama de modo mais potente do que a IL-12, aparentemente por uma via separada (Micallef et al., 1996). De modo semelhante à atividade do soro induzida por endotoxinas, a IL-18 não induz IFN-γ por si própria, funcionando principalmente como coestimulador com mitogénios ou IL-2. A IL-18 aumenta a proliferação de células T, aparentemente por uma via dependente da IL-2, e aumenta a produção in vitro de citoquinas Thl e exibe sinergia, quando combinada com a IL-12, em termos de produção aumentada de IFN-γ (Micallef et al., 1996).

Depois de clonada a forma murina, a sequência de cDNA humana da IL-18 foi relatada em 1996 (Okamura et al., 1995). Através da clonagem da IL-18 de tecidos afetados e estudo da expressão genética da IL-18 encontrou-se uma associação próxima desta citoquina a uma doença autoimune. O ratinho diabético não obeso (NOD) desenvolve espontaneamente insulite autoimune e diabetes, que podem ser aceleradas e sincronizadas por uma única injeção de ciclofosfamida. O mRNA da IL-18 foi demonstrado por PCR com transcriptase 3 reversa em pâncreas de ratinhos NOD durante fases iniciais da insulite. Os níveis de mRNA de IL-18 aumentaram rapidamente após tratamento com ciclofosfamida e precederam um aumento de mRNA de IFN-γ, e subsequentemente diabetes. É interessante notar que esta cinética imita a do mRNA de IL-12-p40, resultando numa correlação próxima de níveis de mRNA individuais. A clonagem do cDNA da IL-18 a partir de RNA do pâncreas seguido de sequenciação revelou identidade com a sequência da IL-18 clonada de células de Kupffer e macrófagos pré-ativados in vivo. Além disso, macrófagos de ratinhos NOD responderam à ciclofosfamida com expressão genética de IL-18, o mesmo não acontecendo com macrófagos de ratinhos Balb/c tratados em paralelo. Em consequência, a expressão da IL-18 está anormalmente regulada em ratinhos NOD autoimunes e está intimamente associada ao desenvolvimento de diabetes (Rothe et ai., 1997). A IL-18 desempenha um papel potencial na regulação imunológica ou em inflamação por aumento da atividade funcional do ligando Fas em células Thl (Conti et ai., 1997) . A IL-18 também é expressa no córtex adrenal e, em consequência, poderá ser um neuroimunomodulador segregado, desempenhando um papel importante na orquestração do sistema imunológico após uma experiência stressante (Chater, 1986).

In vivo, a IL-18 é formada por clivagem de pró-IL-18, e a sua atividade endógena parece ser responsável pela produção de IFN-γ em P. acnes e letalidade mediada por LPS. A IL-18 madura é produzida a partir do seu precursor pela enzima conversora de IL-Ιβ (enzima conversora de IL-lbeta, ICE, caspase-1) . 4 0 recetor da IL-18 consiste em pelo menos dois componentes, que cooperam na ligação de ligandos. Foram encontrados sítios de ligação de elevada e baixa afinidade para a IL-18 em células T estimuladas com IL-12 murina (Yoshimoto et al., 1998), sugerindo um complexo recetor de múltiplas cadeias. Até à data foram identificadas duas subunidades do recetor, ambas pertencentes à família de recetores da IL-1 (Parnet et al., 1996) . A transdução do sinal da IL-18 envolve ativação de NF-κΒ (DiDonato et al., 1997).

Recentemente, uma proteína solúvel com elevada afinidade para a IL-18 foi isolada de urina humana, e foram descritos os cDNAs humano e de ratinho (Novick et al., 1999; WO 99/09063). A proteína foi designada proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP). A IL-18BP não é o domínio extracelular de um dos recetores conhecidos da IL18, mas sim uma proteína segregada naturalmente em circulação. Pertence a uma nova família de proteínas segregadas. A família também inclui várias proteínas codificadas por Poxvírus que têm elevada homologia com a IL-18BP (Novick et al., 1999) . A IL-18BP é expressa de modo constitutivo no baço, pertence à superfamília das imunoglobulinas e tem homologia limitada com o recetor do tipo II da IL-1. O seu gene foi localizado no cromossoma humano llql3, e não se encontrou nenhum exão que codifique um domínio transmembranar numa sequência genómica de 8,3 kb (Novick et al., 1999).

Quatro isoformas humanas e duas de ratinho da IL-18BP, resultantes do processamento de mRNA e encontradas em várias bibliotecas de cDNA, foram expressas, purificadas e avaliadas quanto a ligação e neutralização de atividades 5 biológicas da IL-18 (Kim et al., 2000). A isoforma a da IL-18BP (IL-18BPa) humana exibiu a afinidade mais elevada para a IL-18, com uma rápida velocidade de associação, uma lenta velocidade de dissociação e uma constante de dissociação (K(d)) de 399 pM. A IL-18BPc partilha o domínio Ig da IL-18BPa excetuando os 29 aminoácidos C-terminais; a K(d) da IL-18BPc é 10 vezes menor (2,94 nM) . Ainda assim, a IL-18BPa e IL-18BPc neutralizam a IL-18 > 95% a um excesso molar de dois. As isoformas IL-18BPb e IL-18BPd estão desprovidas de um domínio Ig completo e não têm capacidade para se ligarem ou neutralizarem a IL-18. As isoformas IL-18BPc e IL-18BPd murinas, que possuem o domínio Ig idêntico, também neutralizam > 95% IL-18 murina a um excesso molar de dois. No entanto, a IL-18BPd murina, que partilha um motivo C-terminal comum com a IL-18BPa humana, também neutraliza a IL-18 humana. Por modelação molecular foi identificado um grande sítio de ligação eletrostático e hidrófobo misturado no domínio Ig da IL-18BP, que pode ser responsável pela sua elevada afinidade de ligação para o ligando (Kim et al., 2000) .

Foi descrito um efeito benéfico da IL-18BP em várias doenças. Exemplos dessas doenças aptas a serem tratadas com IL-18BP são: metástase tumoral (WO 01/07480), artrite, doença inflamatória do intestino e lesão hepática (WO 01/62285), doença cardíaca (WO 02/060479), lesão cerebral traumática (WO 02/096456), sepsia (WO 02/092008), aterosclerose (WO 01/85201), perturbação de hipersensibilidade (W003/033015).

Um domínio de ligação à IL-18 de um homólogo virai da IL-18BP humana foi descrito na literatura (Xiang e Moss, 2003), mostrando que uma forma clivada por furina da 6 proteína de ligação à IL-18 do vírus Molluscum contagiosum tem propriedades de ligação à IL-18. Para além disto, várias mutações pontuais foram introduzidas no homólogo virai da IL-18BP e testadas in vitro quanto à ligação de IL-18, com a finalidade de definir as porções biologicamente ativas da proteína (Xiang e Moss, 2001).

No entanto, e até à data, ainda não foram identificados nem caracterizados fragmentos biologicamente ativos da isoforma a da IL-18BP humana.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na descoberta de que, durante a produção da isoforma a da IL-18BP humana recombinante, podem ser encontradas formas variantes que retêm a atividade biológica da IL-18BP, medido num bioensaio in vitro. Em consequência, a invenção refere-se a variantes da IL-18BP, como definidas nas reivindicações adjuntas, nas quais ocorreu um corte interno da IL-18BP.

Essas variantes representam variantes ativas da IL-18BP madura.

Também são descritas moléculas de ácidos nucleicos que codificam essas variantes da IL-18BP, até composições farmacêuticas compreendendo estas variantes. A invenção refere-se à utilização desses ácidos nucleicos para a preparação de medicamentos destinados ao tratamento e/ou prevenção de perturbações mediadas pela IL-18.

Noutro aspeto, a invenção refere-se à utilização de um vetor de expressão compreendendo a sequência codificadora 7 de uma variante da IL-18BP para o tratamento e/ou prevenção de doenças mediadas pela IL-18. A invenção também se refere a processos de produção das variantes da IL-18BP da invenção.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS

Fiq. 1 Mostra a sequência da isoforma a da IL-18BP completa. Os sítios putativos de N-glicosilação estão marcados como N*. As setas marcam os terminais N das seis variantes da IL-18BP da invenção.

Fig. 2 Mostra um gel de SDS-PAGE corado com prata (A) e a correspondente coloração "Western" (B) de uma preparação de IL-18BP contendo variantes da IL-18BP da invenção. As vias foram carregadas do modo seguinte:

Fig . 2A Fig . 2B 1. Marcador PM 1. Marcador PM 2. r-hIL-18BP CT2 0 (2 pg) 2. r-hIL-18BP CT20 (200 ng) 3. r-hIL-18BP CT2 0 (2 ug) 3. ST1P01/r-hIL-18BP (200 4. r-hIL-18BP CT2 0 (2 ug) ng) 5. STlP01/r-hIL-18BP 4. Marcador PM 3 Mostra o perfil SE-HPLC, bem como o gel de SDS- PAGE corado com prata (A) e a correspondente coloração "Western" (B) dos dois picos obtidos em HPLC em comparação com uma preparação comum da isoforma a da IL-18BP completa pura.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO 8 A presente invenção baseia-se na descoberta de que variantes da IL-18BP puderam ser identificadas durante a produção recombinante da isoforma a da IL-18BP recombinante humana. Estas variantes foram caracterizadas, e verificou-se que representam fragmentos definidos truncados de modo N- e C-terminal da isoforma a da IL-18BP completa. Foi possível definir o padrão da N-glicosilação da IL-18BP recombinante no contexto da presente invenção, conduzindo a uma nova variante da IL-18BP completa.

Surpreendentemente, todas as variantes da IL-18BP exibiram uma atividade biológica comparável à da IL-18BP completa num bioensaio in vitro.

Nestas variantes da IL-18BP ocorreu um corte interno da IL- 18BP.

Assim, a invenção refere-se a uma IL-18BP compreendendo um primeiro polipéptido consistindo nos aminoácidos 1 até 30 da SEQ ID NO: 1 e um segundo polipéptido consistindo nos aminoácidos 31 até 164 ou nos aminoácidos 31 até 163, em que o primeiro e o segundo polipéptidos estão ligados por uma ligação dissulfureto.

Num segundo aspeto, a IL-18BP compreende um primeiro polipéptido consistindo nos aminoácidos 15 até 30 da SEQ ID NO: 1 e um segundo polipéptido consistindo nos aminoácidos 31 até 164 ou nos aminoácidos 31 até 163, em que o primeiro e o segundo polipéptidos estão ligados por uma ligação dissulfureto.

As IL-18BPS podem não estar glicosiladas ou podem estar glicosiladas. Preferivelmente, as IL-18BPs da invenção 9 estão N-glicosiladas em resíduos asparagina Asn 49, Asn 73 e Asn 117 (numeração de acordo com a Fig. 1) .

Durante as experiências conducentes à presente invenção, verificou-se pela primeira vez que a isoforma a da proteína de ligação à IL-18 completa produzida de modo recombinante não está glicosilada em todos os sítios de N-glicosilação putativos, mas apenas em três resíduos Asparagina definidos, que são Asn 49, 73 e 117. Em consequência, é divulgada uma IL-18BP com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 em que a proteína está N-glicosilada em Asn 49, Asn 73 e Asn 117. A sequência da IL-18BP humana completa e suas variantes de processamento/isoformas são divulgadas, por exemplo, em W099/09063, ou em Novick et al., 1999, bem como em Kim et al., 2000. A SEQ ID NO: 1 representa a sequência de aminoácidos da isoforma a da IL-18BP completa madura.

No seguinte, as proteínas da invenção podem ser genericamente designadas "IL-18BP", "IL-18BPs" ou "IL-18BP(s) da invenção". Estes termos, como usados aqui, abrangem todas as variantes da IL-18BP descritas no contexto da presente invenção.

As proteínas de acordo com a presente invenção podem ser derivadas de fontes naturais, como urina, ou então, preferivelmente, podem ser produzidas de modo recombinante. A expressão recombinante pode ser efetuada em sistemas de expressão procarióticos, como E. coli, ou em sistemas de expressão eucarióticos, e preferivelmente de mamíferos. Preferivelmente, também podem ser produzidas em sistemas de expressão humanos. Linhas de células estabelecidas, como a 10 linha de células de ovário de hamster chinês (CHO) ou a linha de células de rim embrionário humano 293, podem ser especialmente úteis para a produção das variantes da IL-18BP da presente invenção.

Outras variantes pertencentes ao âmbito da presente invenção podem ser proteínas com substituições de aminoácidos conservativas das sequências representadas na Fig. 1 ou na listagem de sequências em anexo. Estas variantes podem ser preparadas por técnicas conhecidas de síntese e/ou por técnicas de mutagénese dirigida a sítios, ou qualquer outra técnica conhecida adequada para essa finalidade.

Substituições de aminoácidos conservativas de polipéptidos IL-18BP podem incluir aminoácidos sinónimos dentro de um grupo com propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes para que a substituição entre membros do grupo conserve a função biológica da molécula (Grantham, 1974) . É claro que inserções e deleções de aminoácidos também podem ser feitas nas sequências acima definidas sem alterarem a sua função, particularmente se as inserções ou deleções envolverem apenas alguns aminoácidos, por exemplo, menos de trinta e preferivelmente menos de dez, e não removerem nem deslocarem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos cisteína. Proteínas e muteínas produzidas por essas deleções e/ou inserções caiem na alçada da presente invenção.

Preferivelmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são os definidos na Tabela 1. Mais preferivelmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são os definidos na Tabela 2, e muito 11 11 os preferivelmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são definidos na Tabela 3. TABELA 1

Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

Arruino ácido Grupo Sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Ârg, Gíth lys, Gle, 1¾ Leu íle, Phe„ Tyr, fttei Vai, Leu Pr© Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ata, Gty, Mis, Gin,

Mb Gly, Thr. Pr©, AI®

Vai Met, Tyr, PI®, te. Leu, Vai

Gly Ata, Thr, Pro, Ser, Gly Ite Mel, Tyr, Pb©, Vai, Leu,. |le Ffte Trp, Met Tyr, lie, Vai, Leu, Ria Tyr Trp, Mei Pbe, lie, Vals Lao, Tyr Cys Ser, Thr.. Cys Pfe Gíu, Lys, Gín* Thr, Arg, HSs Gín Glu, Lys, Asa, Hls:, Thr, Ang, Gín Asa Gin, Asp, Ser, Asa Lys Giu, Gia, His, Arg, Lys Asp Giu, .Asa, Asp Gly Asp, Lys, Asa, GSa, PSs, Aig, GSu Μβΐ Phe, te, Vsl, Leu.,. Mst Tfp Τφ TABELA 2

Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinónimos 12

Aminoáeido &ΘΓ

Afg

Leu

Pro

Thf

Ala

Vai <ay ile

Pte

Tyr

Cys 1%

Gm

ÀSR

Lys

Asp GKi

Met Ύψ TABELA 3

Grupos Muito Preferi

Minoác ido

Ser

Afg

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VsE m m

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Grupo S inòn imo

Ser

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Pro, Ala Vai,. Met» ifô Gfy -

Ite. Met, Phe, VaL Leu Met, Tyrs líe, Lati, Phê Phe, Tyr Oys, Ser His, β§Α Arg Giu, Clr». His Asp, A&fí Lys, Arg Asp, Asn Giu, Gin

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Tsp s de Aminoácidos Sinónimos

Grupo S inònimo

Ser

Arg

Leu, Ite, Met

Pro

Thr

Ala

VaS Gíy íle. Meí, Leu

Pire

Tyr 13

Cys Hfe Hiâ Qln Gíra Mn Asn Lys Lys Asp· Asp Qtu Giu Mel Met, Leu Τφ Met É entendido que pequenas alterações na sequência de aminoácidos das variantes da IL-18BP pertencem ao âmbito da invenção, possuindo uma sequência de aminoácidos que duplica suficientemente a de uma variante da IL-18BP descrita aqui, de modo a ter uma atividade comparável à da IL-18BP. Uma atividade da IL-18BP é a sua capacidade de ligação à IL-18. Assim, pode determinar-se se qualquer variante determinada tem substancialmente a mesma atividade da IL-18BP através de experimentação de rotina, que compreende sujeitar essa muteina, por exemplo, a um simples ensaio de competição em sanduíche para determinar se se liga ou não a uma IL-18 apropriadamente etiquetada, como um radioimunoensaio ou ensaio ELISA. Outro ensaio significativo que descreve a atividade da IL-18BP é o bioensaio descrito no exemplo em baixo.

Exemplos de produção de substituições de aminoácidos em proteínas que podem ser utilizados para se obterem variantes de polipéptidos ou proteínas IL-18BP para utilização na presente invenção incluem quaisquer passos de métodos conhecidos, como apresentados nas patentes US 4,959,314, 4,588,585 e 4,737,462, atribuídas a Mark et al.; 5, 116, 943 atribuída a Koths et al., 4,965, 195 atribuída a Namen et al.; 4,879,111 atribuída a Chong et al.; e 14 5,017,691 atribuída a Lee et ai.; e proteínas substituídas com lisina apresentadas na patente US N° 4,904,584 (Shaw et al.) .

Numa forma de realização da invenção, as variantes da IL-18BP são proteínas fundidas. O termo "proteína fundida" refere-se a um polipéptido compreendendo uma IL-18BP da invenção fundido a outra proteína, a qual, por exemplo, tem um tempo de permanência prolongado em fluidos corporais. Assim, uma IL-18BP pode ser fundida a outra proteína, polipéptido ou afins, por exemplo, uma imunoglobulina ou um respetivo fragmento.

Numa forma de realização preferida da invenção, a IL-18BP da invenção compreende uma fusão com uma imunoglobulina, isto é, é uma proteína fundida compreendendo a totalidade ou parte de uma IL-18BP da invenção que está fundida à totalidade ou a uma porção de uma imunoglobulina. Métodos de preparação de proteínas de fusão com imunoglobulinas são bem conhecidos na área, como os descritos em WO 01/03737, por exemplo. O profissional compreenderá que a proteína de fusão resultante da invenção retém a atividade biológica da IL-18BP, em particular a ligação à IL-18. A fusão pode ser direta, ou via um péptido de ligação curto, que pode ser tão pequeno quanto 1 até 3 resíduos de aminoácidos de comprimento ou maior, por exemplo, 13 resíduos de aminoácidos de comprimento. O referido agente de ligação pode ser um tripéptido com a sequência £*F4d por exemplo, ou uma sequência de ligação de 13 aminoácidos compreendendo introduzida entre a sequência da IL-18BP e a sequência da imunoglobulina. A proteína de fusão resultante tem 15 propriedades melhoradas, como um tempo de permanência prolongado em fluidos corporais (semivida), atividade especifica aumentada, nivel de expressão aumentado, ou a purificação da proteína de fusão pode ser facilitada.

Numa forma de realização preferida, a IL-18BP é fundida à região constante de uma molécula Ig. Preferivelmente, é fundida a regiões da cadeia pesada, como os domínios CH2 e CH3 da IgGl ou IgG3 humana, por exemplo. A geração de proteínas de fusão específicas compreendendo IL-18BP e uma porção de uma imunoglobulina é descrita no exemplo 11 de WO 99/09063, por exemplo. Outras isoformas de moléculas Ig também são adequadas para a geração de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção, como as isoformas IgG2 ou IgG4, ou outras classes de Ig, como IgM ou IgA, por exemplo. As proteínas de fusão podem ser monoméricas ou multiméricas, hetero- ou homomultiméricas. A invenção também se refere a um processo para a produção de uma proteína fundida com IL-18BP, que compreende preparar uma construção de DNA que codifica uma IL-18BP da invenção ligada a um ácido nucleico que codifica um segundo polipéptido, em que, por expressão, a referida construção de DNA codifica uma proteína de fusão compreendendo a IL-18BP da invenção fundida ao segundo polipéptido.

Preferivelmente, o segundo polipéptido é uma porção de uma imunoglobulina, mais preferivelmente a porção Fc de uma imunoglobulina.

Noutra forma de realização, as variantes da IL-18BP são derivados funcionais, em que o derivado funcional compreende pelo menos uma fração ligada a um ou mais grupos 16 funcionais que ocorrem na forma de uma ou mais cadeias laterais nos resíduos de aminoácidos. "Derivados funcionais", como usado aqui, abrangem derivados de variantes da IL-18BP ou suas proteínas fundidas, que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem na forma de cadeias laterais nos resíduos ou nos grupos N- ou C-terminais, por meios conhecidos na área, e estão incluídos na invenção desde que permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, que não destruam a atividade da proteína que é substancialmente semelhante à atividade da IL-18BP, ou IL-18BPs virais, e que não confiram propriedades tóxicas a composições que os contêm. Derivados funcionais da IL-18BP podem ser conjugados a polímeros com a finalidade de melhorar as propriedades da proteína, como a estabilidade, semivida, biodisponibilidade, tolerância pelo corpo humano ou imunogenicidade. Para atingir este objetivo, a IL-18BP pode ser ligada, por exemplo, a Polietilenoglicol (PEG). A PEGuilação pode ser efetuada por métodos conhecidos, descritos em WO 92/13095, por exemplo.

Derivados também podem incluir, por exemplo, ésteres alifáticos dos grupos carboxilo, amidas dos grupos carboxilo por reação com amoníaco ou com aminas primárias ou secundárias, derivados N-acilo de grupos amino livres dos resíduos de aminoácidos formados com frações acilo (por exemplo, grupos alcanoílo ou aroílo carbocíclicos) ou derivados O-acilo de grupos hidroxilo livres (por exemplo, os de resíduos serilo ou treonilo) formados com frações acilo. 17 A invenção também se refere a um processo para a produção de um derivado da IL-18BP da invenção, que compreende modificar quimicamente uma IL-18BP da invenção de modo a incluir pelo menos uma fração derivada. Preferivelmente, a fração é uma fração polietilenoglicol.

Ainda outra forma de realização da invenção refere-se a sais das variantes da IL-18BP. 0 termo "sais", usado aqui, refere-se a sais de grupos carboxilo e a sais de adição de ácidos de grupos amino de uma molécula variante da IL-18BP, ou respetivos análogos. Sais de um grupo carboxilo podem ser formados por meios conhecidos na área e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amónio, férricos ou de zinco, e afins, e sais com bases orgânicas, como os formados, por exemplo, com aminas, como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaina e afins. Sais de adição de ácidos incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Obviamente, quaisquer desses sais devem reter a atividade biológica da IL-18BP relevante para a presente invenção, como inibição da indução de IFN-gama no bioensaio descrito nos exemplos em baixo.

Também é descrito um ácido nucleico que codifica uma IL-18BP da invenção. Essa sequência codificadora pode ser facilmente deduzida das sequências de aminoácidos representadas na Fig. 1 ou na listagem de sequências em anexo. 0 profissional apreciará que podem ser concebidas muitas mais sequências de ácidos nucleicos que codificam as 18 IL-18BPs da invenção devido à degenerescência do código genético.

Também é descrita uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico da invenção. Essa célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica, preferivelmente de mamífero, mais preferivelmente uma célula hospedeira adequada para expressão recombinante de proteínas terapêuticas, como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células humanas. A invenção também se refere a um processo para a produção de uma IL-18BP da invenção, que compreende o passo de cultivar uma célula hospedeira como descrito em condições adequadas para expressão da referida IL-18BP. 0 processo de produção de uma IL-18BP também pode compreender o passo de isolar a IL-18BP do sobrenadante da cultura de células de uma célula hospedeira da invenção.

Noutro aspeto, a invenção refere-se a uma composição compreendendo uma IL-18BP de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, é uma composição farmacêutica. Opcionalmente, a composição farmacêutica também compreende surfactantes, excipientes, transportadores, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Pretende-se que a definição de "farmaceuticamente aceitável" abranja qualquer transportador que não interfira na eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo e que não seja tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a(s) proteína(s) ativa(s) pode(m) ser formulada(s) numa 19 forma galénica unitária para injeção em veículos tais como solução salina, solução de dextrose, albumina do soro e solução de Ringer.

Os ingredientes ativos da composição farmacêutica de acordo com a invenção podem ser administrados a um indivíduo numa variedade de modos. As vias de administração incluem as vias intradérmica, transdérmica (por exemplo, em formulações de libertação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracraniana, epidural, tópica, retal e intranasal.

Vias de administração preferidas da invenção são a via subcutânea e a intramuscular.

Pode ser utilizada qualquer outra via de administração terapeuticamente eficaz, por exemplo, absorção através de tecidos epiteliais ou endoteliais, ou por terapia genética, em que uma molécula de DNA que codifica o agente ativo é administrada ao paciente (por exemplo, via um vetor), o que faz com que o agente ativo seja expresso e segregado in vivo. Se for pretendido administrar um vetor de expressão compreendendo a sequência codificadora de IL-18BP(s) da invenção, pode, por exemplo, ser injetado de modo intramuscular na forma de DNA nu.

Para administração parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), a(s) proteína(s) ativa(s) pode(m) ser formulada(s) como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água, solução salina, solução de dextrose) e aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, manitol) ou a estabilidade 20 química (por exemplo, conservantes e tampões). A formulação é esterilizada por técnicas habitualmente utilizadas. A biodisponibilidade da(s) proteína(s) ativa(s) de acordo com a invenção também pode ser melhorada utilizando procedimentos de conjugação que aumentam a semivida da molécula no corpo humano, por exemplo, por ligação da molécula a polietilenoglicol, como descrito no Requerimento de Patente PCT WO 92/13095.

As quantidades terapeuticamente eficazes da(s) proteína(s) ativa(s) serão uma função de muitas variáveis, incluindo o tipo de utilização da IL-18BP, a sua afinidade para a IL-18, qualquer atividade citotóxica residual exibida pela(s) IL-18BP(s), a via de administração, o estado clínico do paciente (incluindo o aspeto desejável de manter um nível não tóxico de atividade de IL-18 endógena).

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é tal que, quando administrada, a variante da IL-18BP origina inibição da atividade biológica da IL-18. A dosagem administrada a um indivíduo, na forma de uma única ou de múltiplas doses, irá variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo propriedades farmacocinéticas da variante da IL-18BP, a via de administração, estados e características do paciente (sexo, idade, peso do corpo, estado de saúde, estatura), extensão dos sintomas, tratamentos concorrentes, frequência do tratamento e o efeito desejado. O ajustamento e manipulação de gamas de dosagem estabelecidas pertencem ao âmbito dos profissionais, bem como métodos in vitro e ín vivo de determinação da inibição da IL-18 num indivíduo. 21

Numa forma de realização preferida da presente invenção, a variante da IL-18BP é usada numa quantidade de cerca de 0,001 até 1000 mg/kg de peso do corpo, ou cerca de 0,001 até 100 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 0, 01 até 10 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 0,1 até 5 mg/kg ou cerca de 1 até 3 mg/kg de peso do corpo. A frequência da administração pode ser diária ou em dias alternados. Também pode ser três vezes por semana ou uma vez por semana.

As doses administradas podem ser sempre iguais ou podem variar, dependendo das necessidades do paciente. As doses são habitualmente administradas em doses divididas ou em forma de libertação prolongada eficaz para se obterem os resultados desejados. Pode ser aplicada uma segunda administração ou administrações subsequentes a uma dosagem que é igual, menor ou maior do que a dose inicial ou prévia administrada ao indivíduo. Pode ser aplicada uma segunda administração ou administrações subsequentes durante ou antes do surgimento da doença.

De acordo com a invenção, a variante da IL-18BP pode ser administrada a um indivíduo de modo profilático ou terapêutico antes, simultânea ou sequencialmente a outros regimes ou agentes terapêuticos (por exemplo, regimes de múltiplos fármacos) , numa quantidade terapeuticamente eficaz, em particular com um interferão e/ou um inibidor do TNF. Agentes ativos que são administrados simultaneamente com outros agentes terapêuticos podem ser administrados na mesma composição ou em composições diferentes. 22

Noutro aspeto, a invenção refere-se à utilização de uma IL-18BP da invenção para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento e/ou prevenção de uma doença ou perturbação mediada pela IL-18. Doenças mediadas pela IL-18 são conhecidas na área (revisto, por exemplo, por Gracie et al., 2003) .

Numa forma de realização preferida, a doença a ser tratada ou prevenida pela variante da IL-18P da invenção é selecionada de psoriase, artrite, em particular artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, em particular doença de Crohn, lesão hepática, aterosclerose, sepsia, enfarte do miocárdio, lesão cerebral traumática, alergia, doença vascular periférica, esclerose múltipla, metástase tumoral.

Para uma descrição e definição pormenorizadas destas doenças referem-se particularmente os seguintes requerimentos de patentes publicados: WO 99/09063, WO 01/07480, WO 01/62285, WO 02/060479, WO 02/096456, WO 02/092008, WO 03/013577.

Os interferões são predominantemente conhecidos por efeitos inibidores na replicação virai e proliferação celular. O interferão-γ, por exemplo, desempenha um papel importante na promoção de respostas imunológicas e inflamatórias. É afirmado que o interferão β (IFN-β, um interferão do tipo I) desempenha um papel anti-inflamatório.

Em consequência, a invenção também se refere à utilização de uma combinação de uma IL-18BP da invenção e um interferão na preparação de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença mediada pela IL-18. 23

Os interferões também podem ser conjugados a polímeros para melhorar a estabilidade das proteínas. Por exemplo, foi descrito um conjugado entre Interferão β e o poliol Polietilenoglicol (PEG) em W099/55377.

Noutra forma de realização preferida da invenção, o interferão é Interferão-β (IFN-β) e, mais preferivelmente, IFN-β la.

Preferivelmente, a IL-18BP da invenção é usada de modo simultâneo, sequencial ou separado com o interferão.

Ainda noutra forma de realização da invenção, uma IL-18BP da invenção é utilizada em combinação com um antagonista do TNF. Os antagonistas do TNF exercem a sua atividade de vários modos. Em primeiro lugar, os antagonistas podem ligar-se ou sequestrar a própria molécula do TNF com afinidade e especificidade suficientes para neutralizarem, parcial ou substancialmente, o epitopo ou epitopos do TNF responsáveis pela ligação do recetor do TNF (daqui em diante denominados "antagonistas de sequestro"). Um antagonista de sequestro pode ser, por exemplo, um anticorpo dirigido contra o TNF.

Alternativamente, os antagonistas do TNF podem inibir a via de sinalização do TNF ativada pelo recetor da superfície celular após ligação do TNF (daqui em diante denominados "antagonistas de sinalização"). Ambos os grupos de antagonistas são úteis, isoladamente ou em conjunto, em combinação com uma variante da IL-18BP, na terapia de perturbações de hipersensibilidade. 24

Os antagonistas do TNF são facilmente identificados e avaliados por rastreio de rotina de candidatos quanto ao seu efeito na atividade do TNF nativo em linhas de células suscetíveis in vitro, por exemplo, células B humanas, nas quais o TNF causa proliferação e secreção de imunoglobulinas. 0 ensaio contém uma formulação de TNF a diluições variáveis do antagonista candidato, por exemplo, desde 0,1 até 100 vezes a quantidade molar do TNF utilizada no ensaio, e controlos sem TNF ou apenas antagonista (Tucci et al., 1992).

Os antagonistas de sequestro são os antagonistas preferidos do TNF a serem utilizados de acordo com a presente invenção. Entre os antagonistas de sequestro são preferidos aqueles polipéptidos que se ligam ao TNF com elevada afinidade e possuem baixa imunogenicidade. São particularmente preferidas moléculas de recetores do TNF solúveis e anticorpos neutralizadores para o TNF. Por exemplo, TNF-RI (também denominado p55) e TNF-RII (também denominado p75) solúveis são úteis na presente invenção. Formas truncadas destes recetores, compreendendo os domínios extracelulares dos recetores ou respetivas porções funcionais, são antagonistas mais particularmente preferidos de acordo com a presente invenção. Recetores do TNF solúveis do tipo I e tipo II são descritos, por exemplo, nas Patentes Europeias EP 308 378, EP 398 327 e EP 433 900.

Estes recetores do TNF solúveis truncados são solúveis e foram detetados em urina e soro na forma de proteínas de ligação inibidoras do TNF, denominadas TBPI e TBPII, respetivamente (Engelmann et al., 1990). A utilização simultânea, sequencial ou separada da variante da IL-18BP 25 com o antagonista do TNF e/ou um Interferão é preferida de acordo com a invenção.

De acordo com a invenção, TBP I e TBPII são antagonistas preferidos do TNF a serem utilizados em combinação com uma variante da IL-18BP da invenção. Também podem ser utilizados na presente invenção derivados, fragmentos, regiões e porções biologicamente ativas das moléculas recetoras que se assemelham funcionalmente às moléculas recetoras. Esse equivalente ou derivado biologicamente ativo da molécula recetora refere-se à porção do polipéptido, ou da sequência codificadora da molécula recetora, que tem uma dimensão suficiente e que é capaz de se ligar ao TNF com uma afinidade tal que a interação com o recetor do TNF ligado a membranas é inibida ou bloqueada. A invenção também se refere à utilização de um vetor de expressão compreendendo a sequência codificadora de uma IL-18BP da invenção na preparação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de perturbações mediadas pela IL-18. Assim, é considerada uma abordagem de terapia genética para distribuir a variante da IL-18BP no sitio onde é requerida. Para tratar e/ou prevenir uma perturbação de hipersensibilidade, o vetor de terapia genética compreendendo a sequência de produção e/ou ação de uma variante da IL-18BP pode ser injetado diretamente no tecido doente, por exemplo, desse modo evitando problemas envolvidos na administração sistémica de vetores de terapia genética, como diluição dos vetores, alcance e abordagem seletiva das células ou tecidos alvo, e de efeitos secundários. 26 A invenção também se refere à utilização de uma célula que foi geneticamente modificada para produzir uma IL-18BP da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença mediada pela IL-18. A invenção também se refere a um método para a preparação de uma composição farmacêutica, que compreende misturar uma quantidade eficaz de uma variante da IL-18BP e/ou um interferão e/ou um antagonista do TNF com um transportador farmaceuticamente aceitável. A invenção também se refere a um método de tratamento de uma doença mediada pela IL-18, que compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma variante da IL-18BP a um paciente necessitado.

Tendo agora descrito completamente esta invenção, os profissionais apreciarão que a mesma pode ser implementada numa gama larga de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem sair do espirito e âmbito da invenção e sem experimentação desnecessária. Não obstante esta invenção ter sido descrita em conexão com respetivas formas de realização especificas, será entendido que pode abarcar outras modificações. Este requerimento destina-se a abranger quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo esses afastamentos da presente divulgação como é conhecido ou prática habitual na área à qual pertence a invenção e tal como podem ser aplicados às características essenciais aqui anteriormente apresentadas como se segue no âmbito das reivindicações adjuntas. 27 A referência a passos de métodos conhecidos, passos de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é, de modo nenhum, uma admissão de que qualquer aspeto, descrição ou forma de realização da presente invenção é divulgado, ensinado ou sugerido na área relevante. A descrição anterior das formas de realização especificas revelará de modo tão completo a natureza geral da invenção que outros, por aplicação de conhecimentos no âmbito da perícia na área (incluindo o conteúdo das referências citadas aqui), podem facilmente modificar e/ou adaptar essas formas de realização específicas a várias aplicações, sem experimentação desnecessária, sem se afastarem do conceito geral da presente invenção. Em consequência, é pretendido que essas adaptações e modificações pertençam ao âmbito de uma gama de equivalentes das formas de realização divulgadas, com base nos ensinamentos e diretrizes apresentados aqui. Deve ser entendido que a fraseologia ou terminologia usada aqui se destina a fins descritivos e não limitadores, de modo que a terminologia ou fraseologia da presente especificação deve ser interpretada pelo profissional à luz dos ensinamentos e diretrizes apresentados aqui, em combinação com o conhecimento do profissional perito na área.

EXEMPLO

IDENTIFICAÇÃO DE VARIANTES DA IL-18BP MATERIAIS E MÉTODOS Materiais e equipamento

Fotómetro de placa de microtítulo de 96 cavidades MCC 349 ou EX Labsystem 28

Balança analítica modelo AG145 Mettler-Toledo

Cartucho Aquapore RP300 30 x 4,6 mm código 0711-0055

Brownlee

Sequenciador automático modelo Procise 494

Applied Biosystem

Pipetas automáticas (P1000, P200, P100, P20) Gilson

Coulter de células Counter-Zl Incubador de C02 "Software" Excel Heraeus Congelador -20°C ± 5°C Angelantoni Congelador -80°C ± 10°C "Software" Graph Pad Prism Angelantoni HPLC modelo Alliance 2690 Waters

Bomba de HPLC modelo 600S com aquecedor da coluna Waters Integrador D2500 Merck

Bancada de Fluxo Laminar Flow Laboratories MALDI-ToF modelo Voyager DE-Pro Perseptive Biosystem Espetrómetro de Massa modelo ZQ Waters Micromass Multiphor II Pharmacia

Multitemp II Pharmacia ou equivalente

Computador pessoal CompaQ

Medidor de pH MA235 Mettler ou equivalente Medidor de pH modelo MP225 Mettler-Toledo

Fonte de alimentação EPS 3501 XL Pharmacia ou equivalente Refrigerador +5°C ± 3°C Angelantoni "Scanner" AGFA Arcus II Agfa ou equivalente Módulo de separação 2690 Alliance Waters "Software" Agfa Fotolook versão 3.0 Agfa ou equivalente "Software" Millennium32 versão 3.20 Waters "Software" Phoretix 1D Phoretix ou equivalente "Software" Picture Publisher v.8 Micrografx ou equivalente Spectrolinker XL 1000 Cross Linker (fonte de UV)

Spectronics Corporation 29 29 3,5 pm 75 x 4,6 mm Waters Mettler-Toledo Waters Waters Waters

Sigma Merck Merck Merck Merck Merck Sigma

Coluna Statgraphics Plus Symmetry C18 código WAT066224

Balança técnica modelo PEG2002

Detetor de UV 2487

Detetor de UV modelo 2487

Detetor de UV modelo 996

Produtos químicos

Ditiotreitol (DTT) código D5545

Tris código 1.08382 EDTA código 1.08418

Acetonitrilo (ACN) código 1.00030

Bicarbonato de amónio código 1.01131

Amoníaco 25% código 1.05432

Cloreto de cálcio 2 H20 código 13381

Endoproteinase Tripsina Bovina, Modificada, qualidade de

Roche Roche Millipore Baker Merck Baker Sigma sequenciação código 1418-025

Neuraminidase (Sialidase) código 1080-725

Água (H20) Qualidade MilliQ Ácido trifluoroacético (TFA) código 9470 Ácido acético glacial código 00063

Hidróxido de Sódio código 7067 Ácido iodoacético código 12512

Acetato de sódio 3 M pH 5,5 código 400471 Applied Biosystem

Merck Sigma Cario Erba Pierce ULTRA Scientific Caracciolo

Acido clorídrico 37% código 1.000314 β-Mercaptoetanol código M 6250 Éter dietílico código 447521 Guanidina código N24115 NaCsI código 700000889-2 Azoto UPP

Metanol qualidade de gradiente código 1.06007 Merck

Eppendorf 1,5 mL Eppendorf Água (H20) purificada por Modulab 2020™ Continental 30

Acetonitrilo (qualidade de HPLC) código 1.00030 Merck Ácido o-fosfórico (H3PO4) 85% código 1.00573 Merck

Sulfato de sódio (Na2SC>4) código 1.06649 Merck

Coluna TSK G2000 SWXL 7,8x300 código 08540 TosoHaas

IgG anti-ratinho de cabra conjugado a HRP código 170-6516

BioRad

Anticorpo monoclonal anti r-hlL-18BP clone 582.10 IPL

ExcelGel SDS tiras de tampão código 17-1342-01 Pharmacia ExcelGel SDS Homogeneous 12,5% código 80-1261-01 Pharmacia Hiperfilme ECL 18 x 24 cm código RPN 2103 Pharmacia-Biotech Estojo ECL código RPN2106 Pharmacia-Biotech

Estojo Silver PlusOne código 17-1150-01 Pharmacia

Membrana de nitrocelulose 0,2 mm código BA-83

Schleicher & Schuell I-Block código AI 300 Tropix

Material de Referência ínterim STlP01/r-hIL-18BP IFS

Marcador de pesos moleculares (97-14 kDa) código 17-0446-01

Pharmacia

Tween 20 Merck

Solução salina tamponada com fosfato (PBS), com iões cálcio e magnésio. Sigma

Placa de 96 cavidades Falcon

Placa de microtitulo de 96 cavidades Maxi Sorp Nunc

IMDM

GIBCO

Sigma Gibco GIBCO Sistema de R & D Systems Sigma R & D Systems Merck 2-Mercaptoetanol Penicilina/Estreptomicina Soro Fetal de Bovino (FBS)

Estojo de Imunoensaio de IFN-γ Humana Desenvolvimento de ELISA DUO Set Albumina de Soro Bovino (BSA)

Solução de substrato Ácido Sulfúrico (H2SO4) 31

Produtos biológicos

Linha de células de leucemia mielógena aguda humana KG-1

Doméstica

Fator de Necrose Tumoral-alfa humano recombinante (TNF-a) R & D Systems

Interleuquina-18 humana recombinante (r-hIL-18)

Produção doméstica

Proteína de Ligação à Interleuquina-18 humana recombinante (r-hIL-18BP) produção doméstica (46,39 mg/mL por Análise de Aminoácidos).

MÉTODOS

MAPEAMENTO DE PEPTIDOS POR TRIPSINA 0 mapeamento foi realizado de acordo com protocolos comuns, esboçados em baixo.

TRATAMENTO COM NEURAMINIDASE

Dissolveram-se cerca de 150 pg de r-hIL-18BP seca com 200 pL de 0,2 M Acetato de Amónio 16 mM Cloreto de Cálcio tampão pH 5,5 e 100 mIU de Sialidase. A reação foi conduzida a 37° ± 1°C durante 1 hora. Em seguida, a proteína foi seca em Speed-Vacuum. Após dessecação, a proteína foi reduzida e alquilada como descrito em baixo.

REDUÇÃO E ALQUILAÇÃO

Dissolvida com 200 pL de 0,5 M Tris-Cl 2 mM EDTA pH 8,5 ± 0,05 6 M Guanidina 11 mg/mL ditiotreitol sob atmosfera de azoto. A reação foi conduzida à temperatura ambiente durante 1 hora. Depois adicionaram-se 25 pL de 250 mg/mL ácido iodoacético sob atmosfera de azoto. A mistura foi incubada no escuro a 37 ± 1°C durante 45 minutos e depois foi terminada por adição de 200 pL de 0,1% TFA aquoso e 20 32 pL de β-mercaptoetanol sob atmosfera de azoto. A reação foi incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos.

PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO

Após redução e alquilação, a proteína foi purificada por RP-HPLC como descrito em baixo.

Coluna: Aquapore RP 300 (4, 6 x 30 mm) código 0711- 0055 Brownlee

Eluente A: 0,1% TFA aquoso

Eluente B: 0,1% TFA em CH3CN

Temperatura da Coluna: + 40°C

Detetor de UV fixado em 214 nm

Gradiente Tempo (minutos) Fluxo (iriL/min) % A % B Curva 0 1 95 5 5 1 95 5 6 6 1 80 20 6 41 1 35 65 6 46 1 20 80 1 47 1 95 5 6 57 1 95 5 6 0 material purificado foi seco em Speed-Vac, dissolvido em 250 pL de 0,1 M bicarbonato de amónio pH 9,0 ± 0,05 e incubado com 5 pL de tripsina bovina modificada a 37 ± 1°C durante 4 horas, com agitação intermitente. A reação foi terminada por adição de 60 pL de 5% TFA aquoso.

RP-HPLC ANALÍTICA DO MAPEAMENTO DE PÉPTIDOS TRÍPTICOS 33

Metade do volume da mistura de péptidos r-hIL-18BP foi purificado por RP-HPLC como descrito em baixo.

Coluna: Eluente A: Eluente B:

Waters Symmetry C18 3,5 pm (4,6 x 75 mm) 0,1% TFA aquoso 0,1% TFA em CH3CN

Temperatura: + 45°C

Detetor de UV fixado em 214 nm

Gradiente Tempo (minutos) Fluxo (mL/min) % A % B Curva 0 1,0 98 2 2 O \—1 98 2 6 61 1,0 57 43 6 63 o «·. \—1 10 90 1 65 1,0 98 2 6

ANÁLISE DE SEQUENCIAÇÃO DE EDMAN

Efetuou-se sequenciação de Edman automática num sequenciador de proteínas Procise, de acordo com as instruções do fabricante.

MALDI-TOF

Registaram-se espetros MALDI-ToF num Voyager PE-Pro, de acordo com as instruções do fabricante.

LC-ES/MS DO MAPEAMENTO DE PÉPTIDOS COM TRIPSINA A r-hIL-18BP foi submetida ao procedimento de mapeamento de péptidos seguindo o procedimento mencionado acima. Após a digestão analisou-se uma alíquota da mistura de péptidos de cada amostra como descrito em baixo. 34 34 Coluna:

Waters Symmetry C18 3,5 μιη (4,6 x 75 mm) Eluente A: 0,1% TFA aquoso

Eluente B: 0,1% TFA em CH3CN

Temperatura: + 45°C

Detetor de UV fixado em 214 nm

Gradiente Tempo (minutos) Fluxo (mL/min) % A % B Curva 0 0,7 98 2 12 0,7 98 2 6 71 0,7 57 43 6 73 0,7 10 90 1 75 0,7 98 2 6

Após o detetor de UV, o fluxo foi dividido para introdução na fonte do espetrómetro a 50 pL/min. 0 espetrómetro de massa foi fixado com os parâmetros seguintes:

Voltagem do capilar: 3,5 KV

Voltagem do cone: 35 V

Lentes HV: 0,45 KV

Temperatura da fonte: 80°C

14 LM

Resolução: 14 HM; MÉTODO SELECIONADO SEC PARA O TEOR DE DÍMEROS/AGREGADOS A análise de SE-HPLC foi realizada como relatado em baixo.

Eluente 0,1 Μ H3PO4, 0,3 M Na2S04, pH 7,3 com NaOH, CAN 3% Tipo de coluna TSK G2 000 SWXL 7,8 x 300 código 08540 Temperatura do dispositivo de + 4°C ± 2°C 35 autoamostragem Temperatura da coluna Temperatura ambiente Comprimento de onda de deteção 214 nm Taxa de fluxo da fase móvel 0,5 mL/min Tempo de análise 30 minutos Retardamento para injeção Não inferior a 5 minutos seguinte

SDS-PAGE E COLORAÇAO COM PRATA

Dois microgramas de r-hIL18BP foram carregados no gel pré-moldado ExcelGel® SDS Homogeneous 12,5% (da Amersham Biosciences) em condições não redutoras e foram processados a voltagem constante (600 V) a 15°C. Também foram carregados no gel marcadores de peso molecular e os Materiais de Referência ínterim STlP01/r-hIL-18BP.

Após o processamento eletroforético, o gel foi corado com o Estojo de Coloração com Prata-Proteína (PlusOne) como descrito nas instruções contidas no folheto do estojo. Em resumo, o gel foi fixado durante 30 minutos numa solução composta por ácido acético e etanol. Após um passo de lavagem, a solução de sensibilização foi adicionada e removida passados 30 minutos. O gel foi lavado de novo e depois reagiu com a solução de prata durante 20 minutos. Após um ciclo de lavagem, a coloração foi desenvolvida em solução de revelação e foi subsequentemente terminada. O gel foi extensamente lavado em água e mantido em solução conservante antes do armazenamento final em Folhas de Celofane.

Os géis foram submetidos a varrimento e os dados foram elaborados utilizando o "software" Phoretix 1D Full. 36 SDS-PAGE E COLORAÇÃO "WESTERN"

Duzentos nanogramas de r-hIL-18BP foram carregados no gel pré-moldado ExcelGel® SDS Homogeneous 12,5% (da Amersham Biosciences) em condições não redutoras e foram processados a voltagem constante (600 V) a 15°C. Também foram carregados no gel marcadores de peso molecular e os Materiais de Referência ínterim STlP01/r-hIL-18BP.

Após o processamento eletroforético, as proteínas foram transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose por contacto passivo durante 60 minutos à temperatura ambiente, e foram sondadas com 0,1 pg/mL do anticorpo monoclonal para o clone de r-hIL-18BP 582.10 (IPL). A reação foi revelada por um substrato quimioluminescente (estojo ECL da Amersham Biosciences) após reação com IgG anti-ratinho de cabra conjugado a HRP diluído 1:2000. A emissão de luz foi detetada por 10 segundos ou 1 minuto de exposição a um filme de autorradiografia sensível.

Adotaram-se métodos de coloração com Azul de Coomassie ou prata para detetar os marcadores de PM.

Após a imunodeteção, o filme foi submetido a varrimento e os valores de peso molecular (PM) das bandas foram automaticamente derivados da curva de calibração de PM utilizando o "software" Phoretix 1-D Full. BIOENSAIO IN VITRO COM CÉLULAS KG-1

A atividade biológica de amostras foi quantificada utilizando um bioensaio in vitro. Este bioensaio baseou-se na capacidade da linha de células de leucemia mielógena aguda humana KG-1 para produzir IFN-γ em resposta a IL-18 humana mais TNF-α humano de um modo dependente da dose. A 37 r-hIL-18BP liga-se especificamente à r-hIL-18 neutralizando a sua atividade biológica, desse modo suprimindo a produção de IFN-γ.

Em resumo, células KG-1, a 1 x 105 células/cavidade, foram adicionadas a uma placa de 96 cavidades já contendo diferentes concentrações de r-hIL-18BP na presença de uma concentração fixa de r-hIL18 (40 ng/mL na cavidade) mais uma concentração fixa de r-hTNF-a (10 ng/mL na cavidade). A concentração de cada uma destas duas substâncias combinadas conseguiu originar a indução submáxima de produção de IFN-γ em células KG-1. Após 24 horas a 37°C, 5% C02, a placa foi colocada a -20°C, para submeter as células tratadas a um ciclo de congelação/descongelação antes da realização do imunoensaio, com a finalidade de determinar a quantidade de IFN-γ presente no sobrenadante celular. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e o IFN-γ humano foi medido empregando um imunoensaio especifico (estojo ELISA h-IFN-γ, Duo Set R&D Systems) . Calculou-se a quantidade de IFN-γ produzido pelas células tratadas (com curva padrão ou amostra de IL-18BP) por interpolação dos valores y (O.D.) na Curva Padrão de IFN-γ, fornecida com o estojo, ajustada por uma transformada Log/Log de resposta à dose sigmoide (4PL), desse modo obtendo-se os valores x (concentrações de IFN-γ) (GraphPad Prism). A atividade biológica da amostra de IL-18BP foi determinada versus a preparação de referência testando a amostra a duas concentrações na parte linear da curva de resposta à dose de referência. Realizaram-se pelo menos duas experiências independentes. Em cada ensaio independente, cada concentração foi testada em duplicados dependentes numa placa. 38

Calculou-se o título da amostra de IL-18BP para cada concentração testada por interpolação dos valores y (O.D.) médios (duas repetições) da quantidade de IFN-γ produzida na parte linear da curva de resposta à dose de referência (transformada Log/Log), desse modo obtendo-se os valores x (atividade de IL-18BP).

Fez-se a média do valor obtido de cada concentração, e a atividade final da amostra de fármaco IL-18BP foi dada pela média aritmética das potências obtidas de cada um dos ensaios independentes realizados.

Calculou-se o título dos diferentes fármacos IL-18BP versus o Material de Referência ínterim STlP01/r-hIL-18BP.

Realizaram-se duas experiências independentes.

RESULTADOS

Contexto A estrutura primária da r-hIL-18BP completa está apresentada na Fig. 1. A proteína tem uma heterogeneidade C-terminal, com moléculas terminando no resíduo 164 (completas) e resíduo 163 (aminoácido C-l), em que a última é a forma principal. A análise espetrométrica de massa de péptidos trípticos mostrou adicionalmente que a molécula está altamente glicosilada, contendo oligossacáridos N- e O-ligados. A molécula contém quatro sítios de N-glicosilação potenciais, em Asn 49, Asn 64, Asn 73 e Asn 117. Apenas três dos quatro sítios estavam glicosilados, isto é, Asn 49, Asn 73 e Asn 117, ao passo que Asn 64 estava glicosilado apenas em quantidades vestigiais. 39 0 peso molecular médio da molécula completa, determinado por SDS-PAGE e SE-HPLC, é aproximadamente 50 kDa. A composição de aminoácidos pode ser inferida da tabela 4. TABELA 4 Composição de aminoácidos Código de Anu.noácido trés letras Código de uma letra Mó % Alanina AÈa A 13 7,9% Arginina Arg R 7 4,3% Aspara gina ÂM N 4 2,4% Acido aspártieo A®p D 2 1,2% Cisteina Cys C 6· 3,7% Glutamina GSn G 12 7,3% Ácido glutâmico Qkt 6 3 s,s% Glicina ety G 3 5,5% Histidina Hàs H 4 2,4% Isoleucina te ! 2 1,2% Leucina Leu L 19 11,6% Lisina Lye K 3 1,8% Metionina Mst M 0 0,0% Fenilalanina Phe F g 3,0% Prolina Fro P 17 10,4% S erina Sei 3 IS 11,0% Treonina Thr T IS 9,1% Triptofano Trp w 4 2,4% Tirosina 1ψ Y 1 0,6% Valina Vãí V 14 8,5% testes QC de rotina de lotes da produção sem revelaram o seguinte: • Havia um perfil de mapeamento de péptidos não conforme (um grande pico adicional já durante a purificação de proteína reduzida e alquilada); • Obteve-se um perfil SE-HPLC anormal;

• Detetou-se uma banda dupla em SDS-PAGE 40 • Obteve-se um perfil semelhante em RP-HPLC • A atividade especifica versus IL-18BP homogénea produzida em meio contendo soro (o "padrão de referência") foi comparável. PROCEDIMENTO DE MAPEAMENTO DE PEPTIDOS Uma vez que a r-hIL-18BP é uma molécula altamente glicosilada, apresentando uma elevada heterogeneidade em termos de glicosilação, a proteína foi submetida a tratamento com Neuraminidase com a finalidade de reduzir a heterogeneidade de oligossacáridos devido ao ácido siálico. A proteína foi depois submetida a redução, carboximetilação e purificação para tornar os sítios de clivagem por tripsina bem acessíveis à enzima. O procedimento dos péptidos foi efetuado com os passos seguintes:

r—I1IL-I8BP 003o de ácido siálico

Redução e alquilação

Purificação por RP-HPLC da proteina alquilada {todos os picos recolhidos em conjunto)

Digestão com tripsina

Análise RP-HPLC de fr agmentos prot.eolit icos 41

Um perfil cromatográfico diferente do da r-hIL-18BP produzida em meio contendo soro já havia sido detetado durante a purificação dos lotes de r-hIL-18BP reduzida e alquilada da produção sem soro (não mostrado).

Além disso, o perfil de mapeamento de péptidos de uma forma truncada da r-hIL-18BP, em comparação com o padrão de referência corrente r-hIL-18BP, revelou um pico extra e uma intensidade relativa diferente de péptidos glicosilados (não mostrado).

ANÁLISE N—TERMINAL A análise de sequências da molécula intacta revelou diferentes fragmentos correspondentes à molécula começando nos resíduos 1, 16, 31, e, em quantidades menores, nos resíduos 69, 70, 107 e 125. A análise N-terminal está ilustrada na Fig. 1.

MALDI-TOF

Os espetros obtidos por MALDI-TOF revelaram um pico adicional a um peso molecular menor (não mostrado).

Análise SDS-PAGE (Fig. 2) A r-hIL-18BP tem um peso molecular relativo de cerca de 50 kDa, atribuído por 12,5% SDS-PAGE. A r-hIL-18BP produzida sem soro revelou uma banda adicional de cerca de 40 kDa detetada por coloração com prata. Ambas as bandas reagiram com um anticorpo especifico para IL-18BP (clone 582.10) em análise de Coloração "Western". O gel de SDS-PAGE corado com prata está ilustrado na Fig. 2 A, a Coloração "Western" na Fig. 2 B.

As vias foram ocupadas do modo seguinte: 42 42 truncada, comum sem formas

6. Marcador de PM 7. r-hIL-18BP CT20 (2 pg) 8. r-hIL-18BP CT20 (2 pg) 9. r-hIL-18BP CT20 (2 pg)

10. ST1P01/r-hIL-18BP CT20 é um lote de IL-18BP IL-18BP completa

5. Marcador de PM 6. r-hIL-18BP CT20 (200 ng) 7. ST1P01/r-hIL-18BP (200 ng)

8. Marcador de PM ao passo que ST1P01 é a truncadas.

BIOENSAIO

Foi avaliado se. Os resultados da atividade específica dos diferentes lotes de fármacos IL-18 BP estão apresentados na tabela 5, onde estão mostradas a forma não truncada (ILNCT16-18 e ST1P01) e truncada (salientado, ILNCT 19-22). TABELA 5

Volumes Atividade Teor proteico por Atividade imnm biológica \QM* especifica UteL mm ioefi jip 1 jLNCTI? 1 167 546 «w '2ÚBM I ILNCnrié 1 150841 ] $$,3 .20.311 \sumw 349 440 i 13413 ÍLNCT20 57,2..... 121.423 ÍUiOfil.................. ; 1 mm ; 20 300

Esta experiência mostra que a IL-18BP truncada tem uma atividade biológica comparável à IL-18BP não truncada. 43

R-HIL-18BP TRUNCADA

Para caracterizar o pico extra detetado por diferentes técnicas empregou-se a análise SE-HPLC para separar os picos de interesse, de modo a submetê-los a passos de caracterização adicionais. Para a finalidade pretendida, os dois picos foram recolhidos separadamente.

Para identificar os picos recolhidos de forma inequívoca, o pico 1 e pico 2 foram injetados novamente na coluna de HPLC.

Os dois picos foram submetidos a mapeamento de péptidos de acordo com o protocolo descrito acima.

Os perfis cromatográficos de amostras reduzidas e alquiladas estão apresentados na Fig. 3.

Apenas os picos principais de cada fração foram submetidos a mapeamento de péptidos e analisados por LC-ES/MS. 0 pico extra (péptido 31-61) que aparece nos perfis de mapeamento de péptidos deve-se a clivagens internas da molécula, confirmado pela análise de sequências dos picos e da molécula intacta.

Além disso, as diferentes intensidades de péptidos glicosilados (Pep. 1-15, Pep. 1-32 e Pep. 16-32) exibem um padrão de glicosilação diferente. A análise N-terminal efetuada no pico 1 e pico 2, recolhidos diretamente da análise de SE-HPLC, deu os resultados seguintes. 44

Análise N-terminal do Pico 1 isolado por SE-HPLC N-term T P V S Q X X aproximadamente 54% Desde 31 A K Q X P A L aproximadamente 46% Desde 16 S T K D P C P vestigial Análise N- -terminal do Pico 2 isolado por SE-HPLC Desde 16 S T K D P C P aproximadamente 63% Desde 31 A K Q X P A L aproximadamente 37% N-term T P V S Q X X vestigial 0 peso molecular aparente atribuído por SDS-PAGE (Fig. 3) foi confirmado por espetros de MALDI-TOF (não mostrado).

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos empregando diferentes ferramentas analíticas mostraram que podem ser identificados os seguintes sítios principais de clivagem: • Proteína truncada no resíduo 15, isto é, a sequência que começa no resíduo 16 e termina no resíduo 163/164; • Proteína clivada no resíduo 30, isto é, a sequência completa, desde o resíduo 1 até ao resíduo 163/164, com um corte interno entre os resíduos 30 e 31, mantidos em conjunto por dissulfuretos; • Proteína truncada no resíduo 15 e clivada no resíduo 30, isto é, a sequência que começa no resíduo 16 e termina no resíduo 163/164, com um corte interno entre os resíduos 30 e 31, mantidos em conjunto por dissulfuretos.

Quando está presente uma forma truncada de r-hIL18BP, os resultados acima mostram o seguinte: 45 • É detetada uma banda dupla por SDS-PAGE de amostras. As duas bandas são detetadas por Coloração com prata e coloração "Western". • A análise de SE-HPLC revela um perfil anómalo. • Os perfis cromatográficos de RP-HPLC de amostras reduzidas e alquiladas são diferentes em comparação com os das amostras intactas. • Os perfis de mapeamento de péptidos revelaram um pico extra. • A análise de sequências N-terminal confirma a presença de formas truncadas da molécula. • Apesar de a forma truncada estar presente, a atividade especifica é comparável à da r-hIL-18BP intacta.

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<210> 1 <211> 164 <212> PRT <213> homo sapiens <4 0 0> 1

Thr Pm Vál Ser Oto Thr Thr Thr Ato Ato Thr Ala. Sm Vel Ari Ser ! 5 10 15

Thr Lys Âsp Pm Cys Fm Ser GIji Pro Pm Vai Plie Fm Ak Ais Ly$ 20 ' 25 ao

Oto Cys Fm Ala hm Oto Vai. Thr Trp Fm Qfu Vai Oto Vál Fm Leu 35 40 45

Am Gfy Thr ta Sm ta. Sm Cys Vai Ala Cys Ser Arg Pfee Fm Am. 50 55 # 48

Pite Ser He Leu Tyr Tip Leu Gíy âm Gly Ser Pbs He Glu His Leu 65 70 75 m

Pro Gly Ατι Leu l>p Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr m m ' 95

Gly Hir Gk Leu Cys Lys Ala Lm Vai Leu Glu Gin Leu Thr 1¼ Âia loo los no

Leu His Ser Thr Am Phe Ser Cys Vai Leu. Vai Asp Pro Glu Glu Vai Ui 120 125

Vaí Gk Arg: His Vai Vai Leu Ala Glu Leu Trp Ala Gly Leu Arg Ala 1.30 135 140

Thr Leu Pro Pro Tfer Gk Glu Ala Lei Pro Ser Ser His Sor Ser Pro 145 ‘ 150 155 160

GkGkGlaGly

<210> 2 <211> 149 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2

Ser Ur Lys Asp Pro Cys Pm Ser Oto Pro Pro Vál Phe Pro Ala Ala I 5 10 15

Lys Gte Qys Pro Ala Leu Gk ValThr Ίφ Pro Gk Vai. Glu Vai 'Pro 20 25 m leu Asa Gly Thr Leu Ser Leu Ser Qp Vai Ala Cys Ser Arg Phe Pro 35 40 45 49

Am Pia Ser He Leu Tyr Τφ hm Gly As» Gly Sm Pie Ile Gíu Hís 50 SS 60

Im Fro Giy Afg Leti Tip Glu Giy Ser T&r Ser Axg Glu Aig Gly Se? $5 m n m

Tir Gly Thr Gin hm Ovs Lys Ak Leu Vai. Leu Gtu Gki Leu IM Pro S5 00 95

Ak Leu His Ser-Tir Am Pie- Ser Cys Vai Leu Vai Asp Pro Glu Glu too los m

Vai Vai Gin Arg Bis Vai Vai Leu Ala Glu Leu Trp Aía Giy Leu Afg 115 IM 125 Aía Tir Lm Fm Fm ΊΜ 61© Glu Ala Leu Pm Ser Ser Mm Ser Ser 130 135 140

Pro Glu Glu Gin Gly

145 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3

Ak Lys Glu Cys Pm Ala Leu Gto Vai Tb.r Trp Pm Glu Vai Glu Vaj 1 5 10 15

Pro Leu Asa Gly IM L«a Ser Leu Ser 0¾¾ Vai Ak €ys Sm Afg Pie 20 25 30

Pm Am Pie Ser I!e Leu TyrTrp Leu Giy Am Gly Ser Pie He Glu 50 35 40 45

His Lee Fro (% Arg Lm Trp OIu Gly Ser Thr Ser Arg Gíu Aig Gly 50 55 40

Ser Thi Gly Hf -Gin Leu Cys Lys Ala Leu Vai Léu Glu Gin Leu Thr 65 70 75 «0

Fro Ala Leu lis Ser Thr Ásn Phe Ser Çys Vai Leu Vai Aâip Fro Glu 85 90 95

Gin Vú Vai Ok Aig Hb Vai Vai Leu Ak Gin Leu Trp Ate Gly .Leu im I05 110

Arg Aía Th.r Leu Pro Fro Thr Oto Glu Àk Leu Pra Ser Ser His Ser 115 120 125

Ser Fro Gte Gin Gk Gly 150

<210> 4 <211> 96 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4

Tyf Trp Leu Gly Asa Gly Ser Fie lie Gfu His Leu Pm Gly Arg; Leu I 5 : 10 15

Trp Gin Gly Ser Thr Ser Arg Glu. Arg Gly Ser Thr Gly Thr Gto Leu 20 25 30

Cy s Lys Ak Leu Vai Leu Glu Gin Leu Thr Fm Âíâ Leu His Ser Thr 35 40 45 51

Asn PI® Ser Gys Vai Leu Vai Àsp Pr© Gfu Gin Vai Vai Gto Ârg His 50 5.5 m

Vai Vai Leu AM Gto Leu Trp Ala Gly Lm Arg Ato Thr Leu Pm Fm 65 70 ?5 SO

Thr Gto Glu Ato Leu Pm Ser Ser Hfe Ser Ser Pm Gto Gto Gin GJy ss 90 m

<210> 5 <211> 95 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5

Trp Leu Gly Asa Gly Ser PLe lie Gto MM ta Pm Gly Arg Leu Ttp I 5 10 15

Giu Oty Ser Thr Ser Árg Gto Arg Gfy Ser Thr Gly Thr Gto Lee Cp 20 25 30

Lys Ato Lar Vai Leu G to Gto ta Thr Pm Ato Leu His Ser Thr Asn .35 40 45

Fhe Ser €ys Vai Leu Vai Asp Pr© Gto Gto. Vai Vil Gto Arg Hto Vai 50 55 60

Vai Lm Ato Gin Leu Tsp Ala Gly ta Arg Ala Thr Leu Pm Pm Thr $5 70 75 m

Gto Gto Ato Leu Pm Ser Ser HM Ser Ser Pm Gto Gto Gto. Gly S5 PO 95 <210> 6 52

<211> 58 <212> PRT <213> homo sapiens <4Ο0> 6

Gls Gía Leu Thr Fro Afe Leu HL Ser Iftr Aso Pfe© Ser Cys Vai Lee 1 S W 15

Vai Asp Fro Gíu Gta Vai Vai Oto Arg HL Vai Vai hm Ala Gin Leu 20 25 30

Trp Ate Gty Leu Arg Ate Ur Leu Fro Fro Ur Gta Glu Ate Leu Fro 35 40 45

Ser Ser Ifk Ser Ser P.ro Gte Gin 0te Gíy m 55

<210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7

Pio Gta Gin Vát Vai Qfe. Arg His Vai ¥M .ta Ate Gta Leu Τφ Afe I 5 10 15

Gly .Leu Arg Ate Tfer Leu Fro Fm Thr Gte Gto Ate Lm Fro Ser Ser 20 25 30

His Ser Ser Fm Gin Gta Olé Gly - 35 40

Lisboa, 15 de Março de 2012

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. IL-18BP compreendendo um primeiro polipéptido consistindo nos aminoácidos 1 até 30 ou nos aminoácidos 15 até 30 da SEQ ID NO: 1 e um segundo polipéptido consistindo nos aminoácidos 31 até 164 ou nos aminoácidos 31 até 163 da SEQ ID NO: 1, em que o primeiro e o segundo polipéptidos estão ligados por uma ligação dissulfureto; ou um respetivo derivado funcional, proteína de fusão ou sal, em que o derivado funcional compreende pelo menos uma fração ligada a um ou mais grupos funcionais que ocorrem na forma de uma ou mais cadeias laterais nos resíduos de aminoácidos.

2. IL-18BP de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína fundida compreende uma fusão com uma imunoglobulina.

3. IL-18BP de acordo com a reivindicação 1, em que a fração é uma fração de polietilenoglicol (PEG).

4. Processo para a produção de uma IL-18BP de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que compreende o passo de cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica uma IL-18BP de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em condições adequadas para expressão da referida IL-18BP.

5. Processo para a produção de uma IL-18BP de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que compreende o passo de isolar a IL-18BP do sobrenadante da cultura de células de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que 2 codifica uma IL-18BP de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

6. Composição compreendendo uma IL-18BP de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3.

7. Utilização de IL-18BP de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento e/ou prevenção de uma doença selecionada das seguintes: metástase tumoral, psoriase, artrite, em particular artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, lesão hepática, aterosclerose, sepsia, enfarte do miocárdio, lesão cerebral traumática, alergia, doença vascular periférica, esclerose múltipla.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o medicamento também compreende um interferão para utilização simultânea, sequencial ou separada.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o interferão é interferão-β.

10. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o medicamento também compreende um inibidor do Fator de Necrose Tumoral (TNF) para utilização simultânea, sequencial ou separada.

11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o inibidor do TNF é um recetor do TNF solúvel.

12. Utilização de acordo com as reivindicações 7 até 11, em que a IL-18BP é utilizada numa quantidade de cerca de 3 0,001 até 1000 mg/kg de peso do corpo, ou cerca de 0,01 até 100 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 0,1 até 10 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 5 mg/kg de peso do corpo.

13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 até 12, em que o medicamento se destina a administração subcutânea.

14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 até 12, em que o medicamento se destina a administração intramuscular.

15. Utilização de um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica uma IL-18BP de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento e/ou prevenção de uma doença selecionada das seguintes: metástase tumoral, psoriase, artrite, em particular artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, lesão hepática, aterosclerose, sepsia, enfarte do miocárdio, lesão cerebral traumática, alergia, doença vascular periférica, esclerose múltipla.

16. Utilização de uma célula que foi geneticamente modificada para produzir uma IL-18BP de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento e/ou prevenção de uma doença selecionada das seguintes: metástase tumoral, psoriase, artrite, artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, lesão hepática, aterosclerose, sepsia, enfarte do miocárdio, 4 4 vascular lesão cerebral traumática, alergia, doença periférica, esclerose múltipla. Lisboa, 15 de Março de 2012