PL233903B1

PL233903B1 - Sposób otrzymywania biofilmu bakterii Lactobacillus rhamnosus na powierzchni metalicznej oraz bioelektroda uzyskana tym sposobem

Info

Publication number: PL233903B1
Application number: PL421407A
Authority: PL
Inventors: Kamil Kamiński; Magdalena Jarosz; Karolina Gawlak; Joanna Grudzień; Grzegorz D. Sulka; Maria Nowakowska
Original assignee: Uniwersytet Jagiellonski; Uniwersytet Jagielloński
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2019-12-31
Also published as: PL421407A1; WO2018199785A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania biofilmu bakterii na powierzchni metalicznej, charakteryzujący się tym, że: powierzchnię wykonaną ze złota pokrywa się warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu), a uzyskaną w tym etapie zmodyfikowaną polikationem powierzchnię metaliczną zasiedla się bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG poprzez zanurzenie w zawiesinie tych bakterii. Przedmiotem zgłoszenia jest też bioelektroda charakteryzująca się tym, że posiada powierzchnię wykonaną ze złota pokrytą warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu) zasiedloną bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biofilmu probiotycznych bakterii Lactobacillus rhamnosus GG na powierzchni złota oraz bioelektroda uzyskana tym sposobem.

Mikrobiologiczne układy bioelektrochemiczne (z ang. microbial bioelectrochemical systems, BESs) są intensywnie rozwijającą się dziedziną z pogranicza biologii i elektrochemii. Wykorzystują one zdolność mikroorganizmów zasiedlających anodę lub katodę do przekształcania energii chemicznej w energię elektryczną [1-3], Taki proces jest możliwy dzięki transferowi elektronów pochodzących ze szlaku metabolicznego tych organizmów, zwanych elektrochemicznie aktywnymi mikroorganizmami [1]. Dotychczas BESs znalazły zastosowanie w wielu dziedzinach, zwłaszcza w konstrukcji biosensorów. Przykładem może być wykorzystanie bakterii z rodziny Acetobacter do konstrukcji bioelektrody wchodzącej w skład sensora czułego na nadtlenek wodoru [4]. Kolejnym przykładem jest monitorowanie poziomu glukozy za pomocą sensorów z immobilizowanymi bakteriami Escherichia coli [5], które znalazły również zastosowanie w produkcji energii elektrycznej oraz oczyszczaniu ścieków [6]. Także inne gatunki bakterii, takie jak: Shewanella, Streptococcus, Pseudomonas, znalazły zastosowanie do konstrukcji elektrod wykorzystywanych przy produkcji wodoru, odsalania wód, czy też w syntezie chemicznej [7-11].

Znanym rodzajem BESs, są mikrobiologiczne ogniwa paliwowe (ang. microbial fuel cells, MFCs). Ze względu na rosnącą potrzebę pozyskiwania energii z odnawialnych źródeł, cieszą się one coraz większym zainteresowaniem [12-13], Układy MFC oparte są na wytworzonym na anodzie biofilmie, czyli warstwie bakterii, które zasiedlają powierzchnię elektrody i pokryte są otoczką z substancji organicznych i nieorganicznych, a całość wykazuje aktywność elektrochemiczną. Ponadto, możliwe jest także występowanie planktonicznych organizmów w elektrolicie, które również posiadają elektrochemiczną aktywność i mogą znaleźć zastosowanie w konstrukcji ogniw. Zasada działania ogniwa opartego o mikroby polega na tym, że elektrony powstałe w wyniku utleniania związków organicznych przez bakterie zostają przekazane do anody, a następnie do katod y, co powoduje przepływ prądu w układzie [14]. Transfer elektronów może odbywać się na kilka sposobów. Obecnie w literaturze wyróżnia się cztery podstawowe mechanizmy przeniesienia elektronów z biofilmu do powierzchni anody [13,15]:

a) transfer przy pomocy sztucznych mediatorów (głównie syntetycznych barwników),

b) abiotyczne utlenianie na powierzchni elektrody zredukowanych związków organicznych powstałych w wyniku fermentacji bakteryjnej,

c) transfer dzięki naturalnym, produkowanym przez bakterie mediatorom;

d) bezpośredni transfer elektronów do anody.

To, z jakim mechanizmem mamy do czynienia zależy od wielu czynników, takich jak rodzaj elektrody, szczep bakterii, a także rodzaj stosowanego elektrolitu.

W znanych przykładach układów bioelektrochemicznych zazwyczaj stosuje się mikroorganizmy chorobotwórcze lub potencjalnie patogenne. Jednym z takich szczepów jest Escherichia coli, czyli pałeczka okrężnicy, która pomimo tego, że występuje w ludzkiej florze bakteryjnej, znana jest ze zdolności wywoływania chorób m.in. układu pokarmowego [16]. Inną grupą bakterii stosowanych w BES są te pozyskiwane ze ścieków, osadów rzecznych czy też gleb [7, 10]. Stosowanie tych szczepów stwarza więc ryzyko powstania wielu zagrożeń, dlatego też pożądane jest dostarczenie rozwiązań opartych na wykorzystaniu mikroorganizmów przyjaznych zarówno dla człowieka, jak i środowiska.

Jednym z takich rozwiązań może być zastosowanie szczepu Lactobacillus rhamnosus. Należy ona do bakterii Gram-dodatnich, które występują w postaci pałeczek, a ich cechą charakterystyczną jest tworzenie łańcuchów. Niektóre szczepy, np. Lactobacillus rhamnosus GG, używane są do produkcji probiotyków oraz jogurtów [17]. Pomimo korzystnych właściwości, nie znalazły one jednak dotychczas zastosowania w bioelektrochemii, gdyż bakterie te nie tworzą biofilmu na powierzchniach metalicznych. Szczególnym problemem wymagającym rozwiązania jest zaproponowanie modyfikacji powierzchni elektrod metalicznych tak, aby umożliwić tworzenie się filmu bakteryjnego przez ten szczep.

Ważnym aspektem konstrukcji elementów układu biologicznego do zastosowań elektrochemicznych jest rodzaj i budowa elektrody. Zarówno materiał, z którego zrobiona jest elektroda, jak i jej morfologia mogą mieć znaczący wpływ na zasiedlanie powierzchni przez mikroorganizmy. Obecnie do konstrukcji anod najpowszechniej stosuje się materiały węglowe (grafitowe [1, 18], z tkaniny węglowej, papieru węglowego, szczotek węglowych [1]), które można poddać licznym modyfikacjom. Mają one tę

PL 233 903 B1 zaletę, że są tanie, jednakże adhezja bakterii do ich powierzchni może być utrudniona ze względu na zbyt małą chropowatość elektrody. W konsekwencji wydajność takiego ogniwa bądź sensora będzie niewystarczająca. Dlatego też wciąż poszukuje się nowych materiałów, które pozwolą na zwiększenie wydajności generowanego prądu, a jednocześnie nie będą toksyczne dla zasiedlających je bakterii. Metale takie jak miedź, srebro czy złoto mogłyby być obiecującą alternatywą dla materiałów węglowych, jednakże powszechnie znane są ich właściwości bakteriostatyczne czy nawet bakteriobójcze [19-21], Aby umożliwić adhezję i namnażanie się mikroorganizmów na powierzchni takich metali, konieczna jest jej modyfikacja.

Zasadniczym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania biofilmu Lactobacillus rhamnosus na powierzchni złota.

Nieoczekiwanie, określone powyżej problemy zostały rozwiązane w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biofilmu bakterii na powierzchni metalicznej, charakteryzując się tym, że:

a) powierzchnię wykonaną ze złota pokrywa się warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu),

b) uzyskaną w etapie a) zmodyfikowaną polikationem powierzchnię złota zasiedla się bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG poprzez zanurzenie w zawiesinie tych bakterii.

Korzystnie, w stosowanym w sposobie według wynalazku polikationem jest polimer wybrany z grupy obejmującej: polimer otrzymany poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharyd, korzystnie dekstran, pululan albo inulina.

Korzystnie, w etapie a) sposobu według wynalazku warstwę polimeru nanosi się na powierzchnię złota poprzez zanurzenie jej w roztworze zawierającym naładowane dodatnio cząsteczki polimeru (technika „layer by layer”).

Korzystnie, w etapie b) sposobu według wynalazku zasiedlanie bakteriami Lactobacillus rhamnosus GG odbywa się poprzez zanurzenie powierzchni w zawiesinie tych bakterii w medium hodowlanym zwłaszcza MRS, korzystnie na około 2 h.

Korzystnie, w etapie b) sposobu według wynalazku zasiedloną powierzchnię dodatkowo pozostawia się w medium hodowlanym na czas od 24 do 72 godzin.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest bioelektroda, charakteryzująca się tym, że posiada powierzchnię wykonaną ze złota pokrytą warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu) zasiedloną bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG.

Korzystnie, polikationem jest polimer wybrany z grupy obejmującej: polimer otrzymany w poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharyd, korzystnie dekstran, pululan albo inulina.

Korzystnie, bioelektroda według wynalazku została otrzymana sposobem określonym powyżej.

Bioelektrody według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie do wytwarzania ogniwa paliwowego lub biosensora.

W sposobie według wynalazku możliwe jest uzyskanie biofilmu Lactobacillus rhamnosus, zwłaszcza szczepu Lactobacillus rhamnosus GG, na powierzchni złota, która została wstępnie zmodyfikowana poprzez pokrycie jej warstwą polikationu, korzystnie otrzymaną metodą LbL. Nieoczekiwanie, utworzenie polikationowej warstwy na powierzchni złota, umożliwiło bakteriom Lactobacillus rhamnosus GG adhezję na tak zmodyfikowanej powierzchni metalu. Dzięki temu, nie zaobserwowano negatywnego wpływu metalu szlachetnego na przeżywalność mikroorganizmów. Nieoczekiwanie, bakterie nadal rozmnażały się i tworzyły biofilm bakteryjny na powierzchni metalu pokrytej polikationem. Pozwoliło to również na zachowanie aktywności elektrochemicznej przez szczep Lactobacillus rhamnosus GG, umożliwiając na uzyskanie bioelektrody według wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem przez „biofilm” rozumie się skupisko bakterii żywych, nie pozbawionych aktywności elektrochemicznej manifestującej się możliwością wpływania na potencjał otrzymanej w ten sposób elektrody metalicznej, korzystnie złotej.

Zgodnie z wynalazkiem powierzchnię metalu, zwłaszcza złota, pokrywa się warstwą polikationów. W kontekście wynalazku „polikationy” to wszelkie znane polimery posiadające trwały ładunek dodatni, wynikający z obecności w ich strukturze dodatnio naładowanych ugrupowań, przykładowo będących aminami 4-rzędowymi, na przykład trimetyloamoniowych. Nadające się do wykorzystanie zgodnie z wynalazkiem polimery mogą być pochodzenia naturalnego, takie jak kationowe polisacharydy, lub też syntetycznego. Przykładami kationowych polisacharydów są dekstran, pululan, inulina

PL 233 903 B1 bądź inny polisacharyd pochodzenia naturalnego, które zostały przekształcone na skutek przyłączenia odpowiedniej aminy. Natomiast przykładem syntetycznych polikationów nadających się do wykorzystania zgodnie z wynalazkiem są produkty polimeryzacji odpowiednich aminopochodnych kwasu metakrylowego bądź akrylowego. Kationowe polimery w roztworach wykazują zazwyczaj dużą toksyczność (analogicznie do kationowych surfaktantów), choć w grupie polikationów naturalnych zdarzają się wyjątki. Związki te często są stosowane do zmieniania własności powierzchni charakteryzujących się ładunkiem dodatnim.

Nadającą się do wykorzystania w sposobie według wynalazku metodą, która pozwala na naniesienie na powierzchnię metalu warstwy polikationu, jest metoda „layer by layer”. W technice tej materiał o danym znaku potencjału powierzchniowego zostaje zanurzony w roztworze zawierającym makromolekuły o przeciwnym ładunku. W skutek oddziaływań (m.in. elektrostatycznych) pomiędzy powierzchnią i adherującymi cząsteczkami dochodzi do samoistnego formowania się na niej warstwy tych molekuł. Możliwe jest też tworzenie wielowarstw poprzez zanurzanie materiału naprzemiennie w roztworach zawierających polimery o dodatnim i ujemny potencjale powierzchniowym, z pośrednimi etapami przemywania powierzchni wodą. Modyfikacja powierzchni materiału metodą layer by layer może korzystnie zmieniać jej właściwości (np. hydrofobowa powierzchnia może stać się hydrofilowa).

Dla lepszego zrozumienie istoty wynalazku jego opis został wzbogacony poniższymi przykładami wykonania oraz załączonymi rysunkami.

Na Figurze 1 przedstawiony został schemat opisanej w przykładzie 5 bioelektrody według wynalazku z biofilmem bakteryjnym L. rhamnosus uzyskanej na bazie blaszki miedzianej pokrytej cienką warstwą złota oraz polikationem naniesionym metodą LbL.

Na Figurze 2 przedstawione zostały mikrofotografie SEM filmów bakteryjnych uzyskanych na różnych podłożach: Cu - blaszka miedziana; Cu/DEX-G - blaszka miedziana z naniesioną warstwą LbL kationowej pochodnej dekstranu; Cu/Au - blaszka miedziana pokryta warstwą złota; Cu/Au/DEX-G - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej dekstranu; Cu/Au/PMAPTAC - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej MAPTAC; Cu/Au/INU-G - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej inuliny; Cu/Au/PUL-G - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej pululanu.

Na Figurze 3 przedstawione zostały przykładowe krzywe woltamperometryczne dla badanych elektrod, (a) porównanie krzywych CV dla elektrod nie pokrytych filmem bakteryjnym (Cu/Au oraz Cu/Au/dex) oraz z biofilmem,L. rhamnosus (żywe) zarejestrowane w medium; (b) krzywe CV zarejestrowane dla elektrody z biofilmem w elektrolicie mieszanym (medium: KNO3) dla różnych szybkości skanowania.

P r z y k ł a d 1. Synteza dekstranu modyfikowanego chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym (GTMAC) [22] g dekstranu 40 kDa rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej, a następnie dodano 0,4 g NaOH oraz 12 ml GTMAC (90% roztwór w wodzie). Tak otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 60°C przez 4 godziny. Następnie roztwór polimeru oczyszczano (dializowano) przez 5 dni, stosując tubę celulozową przepuszczalną dla cząstek mniejszych niż 12 kDa. Po tym czasie polimer wyizolowano stosując liofilizacje. Stopień modyfikacji wyniósł około 0,5 cząsteczek GTMAC na każda jednostkę glukozową.

P r z y k ł a d 2. Synteza pululanu modyfikowanego GTMAC [22] g pululanu 200 kDa rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej, a następnie dodano 0,4 g NaOH oraz 24 ml GTMAC (90% roztwór w wodzie). Tak otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 60°C przez 4 godziny. Następnie roztwór polimeru dializowano przez 5 dni stosując tubę celulozową przepuszczalną dla cząstek mniejszych niż 12 kDa. Po tym czasie polimer wyizolowano stosując liofilizacje. Stopień modyfikacji wyniósł około 0,5 cząsteczek GTMAC na każda jednostkę glukozową.

P r z y k ł a d 3. Synteza inuliny modyfikowanej GTMAC [22] g inuliny 5 kDa rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej, a następnie dodano 0,4 g NaOH oraz 24 ml GTMAC (90% roztwór w wodzie). Tak otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 60°C przez 4 godziny. Następnie roztwór polimeru oczyszczano przez 5 dni stosując tubę celulozową przepuszczalną dla cząstek mniejszych niż 3 kDa. Po tym czasie polimer wyizolowano stosując liofilizacje. Stopień modyfikacji wyniósł około 0,5 cząsteczek GTMAC na każda jednostkę glukozową.

PL 233 903 B1

P r z y k ł a d 4. Synteza polimeru powstałego na skutek polimeryzacji chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego

Przez 6 ml wody destylowanej przepuszczano przez 0,5 h argon w celu usunięcia tlenu. Następnie dodano do tej objętości 6 g 50% roztworu monomeru MAPTAC (chlorku metakrylamidopropylotrimetyloamoniowego) oraz 15 mg inicjatora kwasu 4,4’-Azobis(4-cyjanowalerianowego). Całość mieszano przez 4 h w temperaturze 70°C. Otrzymaną mieszaninę dializowano do wody destylowanej przez 5 dni. Polimer wyizolowano stosując liofilizator.

P r z y k ł a d 5. Budowa i formowanie elektrody

a) Przygotowanie powierzchni elektrody pokrytej złotem

Jako materiał wyjściowy zastosowano odpowiednio przygotowaną folię miedzianą. Odtłuszczone próbki zostały poddane polerowaniu (elektrochemicznemu i chemicznemu), a następnie były płukane w wodzie destylowanej i etanolu i suszone na powietrzu. Tak przygotowane próbki napylano cienką warstwą złota (około 20 nm), którą następnie pogrubiano chronopotencjometrycznie. Proces prowadzono w konwencjonalnym standardowym układzie trójelektrodowym, gdzie elektrodę pracującą stanowiła napylona próbka, a elektrody odniesienia i porównawczą siatki platynowe. Jako elektrolit zastosowano komercyjnie dostępny roztwór złota (Auruna®5000), zawierający 7 g/dm³ złota. Proces prowadzono przy zadanej wartości prądu (1,5 mA/cm²) przez 300 s. Następnie próbkę przepłukano wodą destylowaną i etanolem i suszono na powietrzu.

b) Modyfikacja powierzchni elektrody polikationami - metoda layer by layer

Sporządzono roztwory polikationów uzyskanych w przykładach 1-4 w buforze fosforanowym (PBS) o pH = 7,4 i stężeniu 0,1 g/dm³. Wcześniej przygotowane podłoża metaliczne zanurzano na 15 min w odpowiednich roztworach polikationów, a następnie przepłukiwano wodą destylowaną i umieszczano w roztworze PBS.

c) Tworzenie biofilmu Lactobacillus rhamnosus na metalicznych elektrodach

Najpierw przygotowano mikrobiologiczne medium zawierające 20 g/dm³ glukozy, poprzez rozpuszczenie 12,75 g medium MRS Broth w 250 ml wody destylowanej oraz dodanie 250 gl Tween®80. Następnie roztwór autoklawowano przez 15 min w temperaturze 121°C. Do tak przygotowanego medium wprowadzono zawartość kapsułki probiotyku (Dicoflor®60, Bayer) i wytrząsano 24 h w temperaturze 37°C. Niemodyfikowane oraz modyfikowane metodą layer by layer podłoża przepłukiwano roztworem medium i umieszczano w jałowych szalkach Petriego. Następnie nanoszono na nie roztwór medium zawierający bakterie i pozostawiano na około 2 h w celu inokulacji bakterii na powierzchni elektrod. Po tym czasie odpłukiwano nadmiar mikroorganizmów roztworem PBS oraz medium i umieszczano w probówkach z medium. Tak przygotowane próbki pozostawiano na 24 h lub 72 h, aby ułatwić tworzenie się biofilmu bakteryjnego. Schemat powstałej elektrody przedstawiono na Fig 1.

P r z y k ł a d 6. Potwierdzenie zasiedlania elektrody przy pomocy mikroskopii elektronowej

W celu potwierdzenie zasiedlenia elektrod przez mikroorganizmy, próbki zostały utrwalone zgodnie z procedurą przedstawioną poniżej. Elektrody po hodowli bakteryjnej przepłukiwano roztworem PBS, a następnie umieszczano w 3% roztworze aldehydu glutarowego w buforze fosforanowym na około 30 min. Następnie przepłukiwano je roztworem PBS oraz wodą. Bakterie odwadniano w wodnym szeregu alkoholowym o następujących, zwiększających się stężeniach: 60% < 70% < 80% <90% <100%. Każdy etap trwał 5 min. Ostateczne odwodnienie i suszenie przeprowadzano przy użyciu heksametylodisilazanu. Próbki zanurzano w tym roztworze na około 1 min, a następnie suszono na powietrzu. Tak przygotowane elektrody napylano złotem i obrazowano ich powierzchnię przy pomocy skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Figura 2 przedstawia mikrofotografie otrzymanych próbek.

Przedstawione mikrofotografie potwierdzają, że bakterie L. rhamnosus adherują, dzielą się i tworzą film bakteryjny tylko na elektrodach miedzianych pokrytych warstwą złota i modyfikowanych kationowymi pochodnymi polimerów. Elektrody miedziane, zarówno czyste, jak i pokryte tylko polimerem, bądź tylko złotem nie wpływają korzystnie na wzrost bakterii. Na zdjęciach SEM widocznie widać mniejszą ilość zaadherowanych bakterii. Co więcej, komórki bakteryjne są zniszczone i nie tworzą charakterystycznych dla tego gatunku bakterii łańcuszków. Potwierdza to ostatecznie, że warstwowa konstrukcja elektrody (metal - złoto - kationowa pochodna polimerów) jest najkorzystniejsza dla tworzenia się biofilmu tego szczepu bakterii.

P r z y k ł a d 7. Potwierdzenie aktywności elektrochemicznej stworzonej elektrody

Przygotowane złote elektrody pokryte warstwą polikationu i zasiedlone biofilmem bakteryjnym zostały poddane wstępnym testom elektrochemicznym. Przeprowadzono pomiary woltampe

PL 233 903 B1 rometrii cyklicznej (CV) w celu sprawdzenia, czy testowane elektrody dają odpowiedź prądową. Do badań zastosowano dwa elektrolity: (i) medium hodowlane oraz (ii) mieszaninę medium hodowlanego i 0,1-molowego roztworu KNO3 (1:1 obj.). Woltamperogramy rejestrowano dla zakresu potencjałów - 0,6 - 0,5 V względem nasyconej elektrody kalomelowej (SCE). Krzywe rejestrowano dla niepokrytej polimerem elektrody złotej, elektrody z warstwą LbL dekstranu oraz dla elektrody z biofilmem bakteryjnym. Wyniki przedstawione na Fig. 3 dowodzą, że w przeciwieństwie do niezasiedlonych elektrod, bakterie L. rhamnosus tworzące biofilm na elektrodzie złotej pokrytej warstwą polimeru dają odpowiedź prądową. Widoczne są dwa piki (utleniania i redukcji), odpowiadające reakcjom elektrodowym zachodzącym w układzie.

Przedstawione na Fig. 3 woltamperogramy potwierdzają, że wytworzony na opisanych elektrodach biofilm wykazuje aktywność elektrochemiczną. Daje to dobre podstawy do wykorzystania takiego układu, np. w konstrukcji elektrody do ogniwa paliwowego bądź też biosensora.

Literatura:

[1] Xie X., Criddle C., Cui Y., Energy Environ. Sci. 2015, 8, 3418-3441.

[2] Logan B.E., Rabaey K., Science 2012, 337, 686-690.

[3] Rittmann B.E., Krajmalnik-Brown, Halden R.U., Nat. Rev. Microbiol. 2008, 6, 604-612.

[4] Rajasekar S., Rajasekar R., Narasimhan K.C., Bull. Electrochem., 16, 25-28.

[5] Ito Y., Yamazaki S., Ikeda T., Biosens. Bioelectron., 2002, 17, 993-998.

[6] Zhang T., Zeng Y., Chen S., Ai X., Yang H., Electrochem. Commun., 2007, 9, 349-353.

[7] Bond D.R., Holmes D.E., Tender L.M., Lovley D.R., Science 2002, 295, 483-485.

[8] Chaudhuri S.K., Lovley D.R., Nat. Biotechnol., 2003, 21, 1229-1232.

[9] Cao X., Huang X., Liang P., Xiao K., Zhou Y., Zhang X., Logan B.E., Environ. Sci. Technol.,

2009, 43,7148-7152.

[10] Butler C.S., Clauwaert P., Green S.J., Verstraete W., Nerenberg R., Environ. Sci. Technol.,

2010, 44, 4685-4691.

[11] Liang S., Wenzhao J., Changjun H., Yu L., Biosens. Bioelectron., 2011,26, 1788-1799.

[12] Cheng K.Y., Cord-Ruwisch R., Ho G., Bioelectrochem. 2009, 74, 227- 231.

[13] Lovley D.R., Curr. Opin. Biotechnol. 2006, 17, 327-332.

[14] Borole A.P., Reguera G., Ringeisen B., Wang Z.W., Feng Y., Kim B.H., Energy Environ. Sci., 2011,4, 4813-4834.

[15] Dulon S., Parot S., Delia M.-L., Bergel A., J. Appl. Electrochem., 2007, 37, 173 - 179.

[16] Ochoa T.J., Contreras C.A., Curr. Opin. Infect. Dis., 2011,24, 478-483.

[17] Salminen S., Bouley C., Boutron-Ruault M.C., Cummings J.H., Franck A., Gibson G.R., Isolauri E., Moreau M.C., Roberfroid M., Rowland L, British J. Nutr., 80, S147-S171.

[18] Liu Y., Harnisch F., Fricke K., Schroder U., Climent V., Felin J.M., Biosens. Bioelectron., 2010, 25,2167-2171.

[19] Grass G., Rensing C., Solioz M., Appl. Environ. Microbiol., 2011,77, 1541-1547.

[20] Morones J.R., Elechiguerra J.L., Camacho A., Holt K., Kouri J.B., Ramirez J.T., Yacaman M.J., Nanotechnology, 2005, 16, 2346-2353.

[21] Fricker S.P., Transition Met. Chem., 1996, 21,377-383.

[22] Kamiński K., Płonka M., Ciejka J., Szczubiałka K., Nowakowska M., Lorkowska B., Korbut R., Lach R., J. Med. Chem., 2011,54, 6586-6596.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania biofilmu bakterii na powierzchni metalicznej, znamienny tym, że:

a) powierzchnię wykonaną ze złota pokrywa się warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu), przy czym polikation wybiera się z grupy obejmującej: polimer otrzymany poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub polisacharyd modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym.

b) uzyskaną w etapie a) zmodyfikowaną polikationem powierzchnię metaliczną zasiedla się bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG poprzez zanurzenie w zawiesinie tych bakterii.

PL 233 903 Β1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) jako modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharyd stosuje się modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym dekstran lub pululan albo modyfikowaną chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym inulinę.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) warstwę polimeru nanosi się na powierzchnię metaliczną poprzez zanurzenie jej w roztworze zawierającym dodatnio naładowane cząsteczki polimeru (technika „layer by layer”).
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) powierzchnię zanurza się, korzystnie na około 2 h, w zawiesinie bakterii w medium hodowlanjm zwłaszcza MRS.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że w etapie b) zasiedloną powierzchnię dodatkowo pozostawia się w medium hodowlanym na czas od 24 do 72 godzin.
6. Bioelektroda, znamienna tym, że posiada powierzchnię wykonaną ze złota pokrytą warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu) zasiedloną bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG, przy czym polikationem jest polimer wybrany z grupy obejmującej: polimer otrzymany poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub polisacharyd modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym.
7. Bioelektroda według zastrz. 6, znamienna tym, że modyfikowanym chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharydem jest modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym dekstran lub pululan albo modyfikowana chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym inulina.
8. Bioelektroda według zastrz. 6, znamienna tym, że została otrzymana sposobem określonym w zastrz. 1-5.