PL227996B1 - Sposób wytwarzania materiału kompozytowego chitozan/ hydroksyapatyt/krzemionka - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania materiału kompozytowego chitozan/hydroksyapatyt/krzemionka, przeznaczonego na substytuty kości.

W związku z koniecznością częstej transplantacji tkanki kostnej trwają badania nad wynalezieniem optymalnego materiału kościozastępczego. Wszczepiany implant musi wykazywać właściwoś ci osteogenne (zdolność żywych komórek z przeszczepu do osteogenezy - powstawania kości), osteoindukcyjne (materiał implantu musi być źródłem substancji indukujących powstawanie kości w tkankach otaczających ubytek kostny) i osteokondukcyjne (zapewnienie odpowiednich warunków dla wrastania elementów kościotwórczych pochodzących z sąsiedztwa).

Z uwagi na powyższe wymagania optymalne są przeszczepy autogenne (dawcą i biorcą jest ten sam osobnik). Wykazują one jednak szereg wad, do których zalicza się ograniczoną ilość uzyskiwanego materiału tkankowego, nieprzewidywalną resorpcję, ryzyko powikłań, takich jak infekcja, powstanie krwiaka, uszkodzenia nerwów, wystąpienie przewlekłych pooperacyjnych dolegliwości bólowych w miejscu pobrania, a także częstych zniekształceń pooperacyjnych miejsca dawczego.

Z uwagi na wymienione możliwości działań niepożądanych oraz fakt, że często wykorzystanie własnej tkanki pacjenta jest niemożliwe lub istnieją znaczne ograniczenia własnej tkanki kostnej pacjenta, prowadzone są badania dotyczące substancji mogących pełnić funkcję substytutów tkanki kostnej. Do substytutów kości należą między innymi materiały syntetyczne.

Idealny substytut kości powinien posiadać, podobnie jak przeszczepy autogenne, właściwości osteogenne, osteokondukcyjne, osteoindukcyjne oraz charakteryzować się bio-kompatybilnością, nie może być kancerogenny i nie może przenosić infekcji, powinien być bioresorbowalny, musi zapewniać synchronizację zakresu resorpcji lub degradacji z odbudową kości, nie może wywoływać martwicy tkanek uwarunkowanej toksycznością, powinien zapewniać podobną do naturalnej kości, którą ma zastąpić, wytrzymałość na obciążenia, a nadto powinien charakteryzować się jednorodnością składu chemicznego i brakiem tendencji do tworzenia zakrzepów.

Znane jest stosowanie jako materiału implantacyjnego w chirurgii kostnej i w stomatologii ceramiki hydroksyapatytowej (HAp), wytworzonej z fosforanów wapnia, związków chemicznych będących budulcem naturalnym kości. Niestety wytrzymałość tego materiału jest niska i nie może on być stosowany jako substytut kości nośnych.

W związku z tym w celu poprawy właściwości mechanicznych HAp tworzy się kompozyty HAp z polimerami.

Jako materiały polimerowe stosuje się do hodowli tkanki kostnej także skaffoldy chitozanowe. Rusztowania chitozanowe są elastyczne, lecz ich właściwości mechaniczne są gorsze w porównaniu z wytrzymałością kości, ponadto sam chitozan nie jest osteoinduktywny. Stąd dużą uwagę w inżynierii tkankowej kości zwraca się na chitozanowe materiały kompozytowe. W celu poprawienia właściwości chitozanu i wykorzystania go jako matrycy do wzrostu komórek tkanki kostnej, łączy się go z substancjami poprawiającymi osteoinduktywność, na przykład z hydroksyapatytem, alginianem sodu, kwasem hialuronowym, fosforanem wapnia, kolagenem czy czynnikami wzrostu (czasopismo Biomaterials, Volume 26, Issue 30, 2005, 5983-5990).

Gros badań z zakresu inżynierii tkankowej kości dotyczy jednak chitozanowych materiałów kompozytowych łączonych z bioceramiką. Wprowadzenie materiałów ceramicznych poprawia osteoindukcyjność i wytrzymałość mechaniczną (wytrzymałość na ściskanie, moduł Younga odporności na kruche pękanie) - czasopisma Composites Science and Technology, 2001, 1189-1224, European Polymer Journal, Volume 42, Issue 12, 2006, 3171-3179, Materials Science and Engineering A, 2009, 513-514, 197-201, Progress in Solid State Chemistry, 2012,40,17-30.

Za jedne z najlepszych materiałów do regeneracji tkanki kostnej, z uwagi na biokompatybilność ze środowiskiem ludzkiego ciała oraz własności osteoindukcyjne, uważany jest obecnie chitozan i hydroksyapatyt (HAp) - czasopisma Marine Drugs. 2010, 8(8), 2252-2266 published online Aug 2, 2010, doi: 10.3390/md8082252, PMCID: PMC2953403, Recent Developments in Bio-Nanocomposites for Biomedical Applications, Nova Science Publishers, Inc., 2011, chapter 18, European Polymers Journal, 49, 780-792, (2013), Progress in Polymer Science, 39, 1644-1667 (2014).

Najczęściej kompozyty chitozanowe z hydroksyapatytem wytwarza się metodą in situ z użyciem mikro- bądź nanogranulek hydroksyapatytowych, które wprowadza się do octanu chitozanu, a następnie tworzy się strukturę 3D metodą wymrożenia i suszenia liofilizacyjnego lub następczo obydwu procesów, po czym neutralizuje głównie NaOH bądź 1 m Na₂HPO₄ lub 1 m buforem fosforanowy

PL 227 996 B1 o pH 7.4, NaH₂PO₄ i Na₂HPO₄). Do wytwarzania kompozytów stosuje się również metodę separacji faz indukowaną termicznie (czasopisma: Journal of Materials Science: Materials in Medicine 15, 3, 255-260 (2004), Acta Biomaterialia 5, 4, 1182-1197 (2009), European Polymer Journal 42, 12, 3171-3179 (2006), Materials Science & Engineering C, 28, 3, 434-437 (2008), Materials Letters 62,19, 3376-3378 (2008), Journal of Biomedical Materials als Research Part A. 2009, 89,1079-1087, Biomaterials. 2002, 23, 4167-4176, Materials Science & Engineering C. 2009, 29, 29-35, Journal of Non-Crystalline Solids 2007, 353, 2367-2373, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2004, 15, 255-260.

Podstawowym problemem w otrzymywaniu kompozytów z hydroksyapatytem jest uzyskanie jednorodnego rozłożenia hydroksyapatytu w strukturze. Problem aglomeracji cząstek hydroksyapatyt u próbuje się rozwiązać w drodze zdyspergowania hydroksyapatytu za pomocą ultradźwięków, bądź tworząc hydroksyapatyt w trakcie formowania kompozytu.

Kompozyty chitozanowe z hydroksyapatytem wytwarza się także w następujący sposób: Ca(NO₃)₂-4H₂O i KH₂PO₄ (pH 4.1-4.5) rozpuszcza się w kwasie octowym, następnie dodaje się chitozan, roztwór wylewa się, po czym działając roztworem wodnym NaOH wytrąca się chitozan i hydro ksyapatyt (czasopismo Biomaterials, 2004, 25, 779-785).

Znane są również kompozycje chitozanowe zawierające krzem w postaci organicznej. Ceramika krzemowa (bioszkło) stanowi alternatywny materiał w stosunku do kruchego hydroksyapatytu. Jest ona najczęściej wykorzystywaną substancją krzemową do wytwarzania struktur z przeznaczeniem do wykorzystania w inżynierii tkanki kostnej (czasopismo Progress in Polymer Science 39 (2014), 1644-1667).

Wykorzystuje się również nanokrzemionkę (nSiO₂) bądź krzemionkę wytwarzaną metodą zol-żel.

Znany jest również 2-etapowy sposób wytwarzania struktur chitozanowych z udziałem krzemionki, w którego pierwszym etapie wytwarza się sole chitozanowe (octan chitozanu) sieciowane genipinem in situ i post loading, które neutralizuje się w roztworze NaOH. W drugim etapie wprowadza się krzemionkę metodą zol-żel stosując jako prekursory 3-glicydoksypropylotrimetoksysilany (GPTMS) i tetraetylortokrzemiany (TEOS) - czasopismo Materials Science and Engineering Volume 42, 1 September 2014, p. 553-561.

Znane jest również stosowanie kompozytów trójskładnikowych, zawierających chitoza n, hydroksyapatyt oraz krzem jako materiału na substytutu kości.

Znany jest, z czasopisma Acta Biomaterialia, 2010, 6, 466-476, sposób otrzymywania takich trójskładnikowych kompozytów, w których hydroksyapatyt tworzy się w strukturze podczas formowania żelu chitozanowego, wprowadzając do soli chitozanowej Ca(CH3COO)2 i NaHPO4, w wyniku czego otrzymuje się wykrystalizowany związek CaHPO₄ · 2H₂O i następnie formując granulki podczas koagulacji w Na₃PO₄/Na₅P₃O₁₀ (pH 12-13) tworzy się HAp, krzem wprowadza się w trakcie formowania granulek, prowadząc ich koagulację w roztworze Na₂SiO₃/Na₅P₃O₁₀ (pH 12-13).

W znanej metodzie otrzymywania trójskładnikowych kompozytów chitozan/hydroksyapatyt/krzem, w drodze współstrącania, zarówno HAp jak i krzem otrzymuje się w trakcie formowania scaffoldu. Jako prekursor krzemu stosuje się tetraetylortokrzemian (TEOS) - czasopismo Materials Science and Enginnering: c, Volume 31, issue 2, 12 March 2011, p. 290-299.

Znane jest także wytwarzanie materiału kompozytowego chitozan/hydroksyapatyt/krzem, przeznaczonego na substytuty kości bądź skaffoldy do hodowli komórek kości o właściwościach osteoi ndukcyjnych, w drodze wprowadzania w struktury chitozanowe zarówno hydroksyapatytu jak i zwią zków krzemu, oddzielnie lub jako wieloskładnikowych kompozytów.

Sposób wytwarzania materiału kompozytowego chitozan/hydroksyapatyt/krzemionka, przeznaczonego na substytuty kości, z soli chitozanowej, hydroksyapatytu i związku krzemu, z wykorzystaniem ultradźwięków, według wynalazku polega na tym, że roztwór wodny soli chitozanowej, jak octan, chlorek, mleczan lub cytrynian chitozanu, sporządzonej z chitozanu o masie cząsteczkowej poniżej 1000 kDa, miesza się z nanoproszkiem hydroksyapatytowym użytym w ilości 3-13% masowych w stosunku do masy soli chitozanowej oraz ewentualnie z glicerofosforanem wapnia użytym w ilości 3-20% masowych w stosunku do końcowej masy mieszaniny, za pomocą ultradźwięków do uzyskania homogenicznej pasty, którą wprowadza się następnie do zolu nieorganicznego związku krzemu tj. do zolu kwasu metakrzemowego zawierającego 20-50% masowych krzemionki, o pH 9-10, stosując 1 część masową pasty na 2-3 części masowe zolu, całość miesza się, po czym otrzymany kompozyt suszy się konwekcyjnie w temperaturze 50-100°C.

PL 227 996 B1

Sposób wytwarzania materiału kompozytowego chitozan/hydroksyapatyt/krzemionka, przeznaczonego na substytuty kości, z soli chitozanowej, octanu wapnia, wodorofosforanu sodu, fosforanu sodu, trifosforanu pentasodowego i związku krzemu, według wynalazku polega na tym, że sól chitozanową jak octan, chlorek, mleczan lub cytrynian chitozanu, o masie cząsteczkowej poniżej 1000 kDa miesza się z roztworem wodnym octanu wapnia i roztworem wodnym wodorofosforanu sodu stosując 1,5-3,2 części masowe octanu wapnia i 1-2 części masowych wodorofosforanu sodu na 1 część masową soli chitozanowej o stężeniu chitozanu 1,5-3,0%, po czym do otrzymanej mieszaniny wprowadza się 0,5-1,2 części masowych zolu kwasu metakrzemowego o zawartości krzemionki 20-50% masowych i o pH 9-10, zawierającego 1 część masową roztworu wodnego fosforanu sodu i trifosforanu pentasodowego użytych w stosunku masowym 1:1, następnie całość miesza się, po czym otrzymany kompozyt suszy się konwekcyjnie w temperaturze 50-100°C. Mieszaninę soli chitozanowej z roztworem wodnym octanu wapnia i wodorofosforanu sodu stosuje się w ilości 10-15 części masowych na 5-30 części masowych zolu zawierającego roztwór wodny fosforanu sodu i trifosforanu pentasodowego.

W sposobie według wynalazku zol kwasu metakrzemowego w połączeniu z chitozanem tworzy sieć, która może stanowić mocne, sztywne, rusztowanie substytutu kości, w którym zamknięty jest hydroksyapatyt. W sposobie według wynalazku, w pierwszym etapie wykorzystuje się słabe wiązanie hydroksyapatytu z cząsteczką chitozanu, umożliwiające wprowadzenie zolu kwasu krzemowego, a następnie poprzez wiązania (mostki wodorotlenowe) utworzenie sieci z kwasem krzemowym.

Produkt otrzymany sposobem według wynalazku charakteryzuje się rozwiniętą powierzchnią z ultraporami o wielkości poniżej 10 μm, gęstością porównywalną z gęstością kości rzędu 300-1100 kg/m oraz wytrzymałością na ściskanie rzędu 0,3-10 MPa (parametry mechaniczne dla kości gąbczastej:

wytrzymałość na ściskanie 2-12 MPa, wartość modułu Younga 0,05-0,5 GPa), gęstość zdrowej kości ₃ gąbczastej waha się, w zależności od wieku, pomiędzy 100-1111 kg/m³), skurczem objętościowym poniżej 60%. Produkt ten jest nietoksyczny, na jego powierzchni następuje wzrost osteoblastów.

Właściwości produktu otrzymanego sposobem według wynalazku predysponują go do zastosowania jako interesujący materiał na substytut kości.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1

0,4 g chitozanu o masie cząsteczkowej 380 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 10 g 4% roztworu wodnego kwasu octowego, następnie wprowadzono nanoproszek hydroksyapatytowy zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 2:1, całość mieszano w łaźni ultradźwiękowej do uzyskania homogenicznej pasty, po czym do zolu kwasu krzemowego wprowadzono otrzymaną pastę przy stosunku masowym zolu do pasty 2:1. Po wymieszaniu całości wylano ją do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 50°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzował się gęstością 800 kg/m³ oraz modułem Younga dla ściskania rzędu 0,06 GPa, wytrzymałością na ściskanie 1,25 MPa, skurczem objętościowym poniżej 60%.

P r z y k ł a d 2

0,4 g chitozanu o masie cząsteczkowej 380 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 10 g 4% roztworu wodnego kwasu octowego, następnie wprowadzono nanoproszek hydroksyapatytowy zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 2:1, całość mieszano w łaźni ultradźwiękowej do uzyskania homogenicznej pasty, po czym otrzymaną pastę wprowadzono do zolu kwasu krzemowego przy stosunku masowym zolu do pasty 2:1, całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 100°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzował się gęstością 800 kg/m oraz modułem Younga dla ściskania rzędu 0,03 GPa, wytrzymałością na ściskanie 0,3 MPa, skurczem objętościowym poniżej 55%.

P r z y k ł a d 3

Do 10,4 g roztworu wodnego octanu chitozanu, otrzymanego przez rozpuszczenie 0,4 g chitozanu o masie cząsteczkowej 220 kDa i stopniu deacetylacji 90% w 4% roztworze wodnym kwasu octowego, wprowadzono nanoproszek hydroksyapatytowy zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 2:1, całość mieszano w łaźni ultradźwiękowej do uzyskania homogenicznej pasty, po czym otrzymaną pastę wprowadzono do zolu kwasu krzemowego przy stosunku masowym zolu do pasty 2:1, całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 100°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzował się gęstością 1200 kg/m oraz modułem Younga dla ściskania rzędu 0,04 GPa, wytrzymałością na ściskanie 0,35 MPa, skurczem objętościowym, poniżej 40%.

PL 227 996 B1

P r z y k ł a d 4

0,4 g chitozanu o masie cząsteczkowej 380 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 10 g 4% roztworu wodnego kwasu octowego, następnie wprowadzono nanoproszek hydroksyapatytowy zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 4:1 i b-glicerofosforan wapnia zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 2:1, całość mieszano w łaźni ultradźwiękowej do uzyskania homogenicznej pasty, po czym otrzymaną pastę wprowadzono do zolu kwasu krzemowego przy stosunku masowym zolu do pasty 2:1, całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 100°C.

Otrzymany materiał charakteryzował się gęstością 930 kg/m oraz modułem Younga dla ściskania rzędu 0,09 GPa, wytrzymałością na ściskanie 6,55 MPa, skurczem objętościowym poniżej 45%.

P r z y k ł a d 5

0,6 g chitozanu o masie cząsteczkowej 380 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 15 g 4% roztworu wodnego kwasu mlekowego, następnie wprowadzano nanoproszek hydroksyapatytowy zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 3:1, całość mieszano w łaźni ultradźwiękowej do uzyskania homogenicznej pasty, po czym otrzymaną pastę wprowadzono do zolu kwasu krzemowego przy stosunku masowym zolu do pasty 3:1, całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 50°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzował się gęstością 730 kg/m oraz modułem Younga dla ściskania rzędu 0,06 GPa, wytrzymałością na ściskanie 4,77 MPa, skurczem objętościowym poniżej 55%.

P r z y k ł a d 6

0,6 g chitozanu o masie cząsteczkowej 380 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 15 g 4% wodnego roztworu kwasu mlekowego, następnie wprowadzono nanoproszek hydroksyapatytowy zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 3:1, całość mieszano w łaźni ultradźwiękowej do uzyskania homogenicznej pasty, po czym otrzymaną pastę wprowadzono do zolu kwasu krzemowego przy stosunku masowym zolu do pasty 3:1, całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 100°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzował się gęstością 730 kg/m³ oraz modułem Younga dla ściskania rzędu 0,02 GPa, wytrzymałością na ściskanie 0,6 MPa, skurczem objętościowym poniżej 40%.

P r z y k ł a d 7

0,4 g chitozanu o masie cząsteczkowej 380 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 10 g 4% kwasu octowego. Następnie nanoproszek hydroksyapatytowy wprowadzono do zolu kwasu metakrzemowego zachowując stosunek masowy proszku do zolu 1:10 i mieszano do uzyskania homogenicznego układu, po czym układ ten połączono z roztworem soli chitozanowej w stosunku masowym

1:2. Całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 100°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzuje się gęstością 370 kg/m oraz modułem Younga dla ściskania rzędu 0,01 GPa, wytrzymałością na ściskanie 0,3 MPa, skurczem objętościowym poniżej 60%.

P r z y k ł a d 8

1,2 g chitozanu o masie cząsteczkowej 200 kDa i stopniu deacetylacji 90% rozpuszczono w 20 ml 4% wodnego roztworu kwasu octowego, następnie wprowadzono 38 ml 5% roztworu wodnego Ca(CH₃COO)₂ i 29 ml 5% roztworu wodnego NaHPO₄. Do 30 ml zolu kwasu krzemowego dodano 40 ml roztworu wodnego zawierającego Na3PO4 i Na5P3O10 w stosunku masowym 1:1, w łącznej ilości 70 ml, po czym dodano do roztworu soli chitozanowej. Całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 70°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzował się gęstością 700 kg/m³ oraz wytrzymałością na ściskanie 0,5 MPa, skurczem objętościowym poniżej 50%.

P r z y k ł a d 9 g chitozanu o masie cząsteczkowej 100 kDa i stopniu deacetylacji 92% rozpuszczono w 20 g 4% roztworu wodnego kwasu cytrynowego, następnie wprowadzono nanoproszek hydroksyapatytowy zachowując stosunek masowy kwasu do proszku 4:1, całość mieszano w łaźni ultradźwiękowej do uzyskania homogenicznego układu, po czym do zolu kwasu krzemowego wprowadzono sól chitozanową zawierającą hydroksyapatyt, przy stosunku masowym zolu do soli chitozanowej zawierającej hydroksyapatyt 2:1, całość mieszano, wylano do formy o kształcie walca i suszono w temperaturze 100°C.

₃

Otrzymany materiał charakteryzuje się gęstością 850 kg/m oraz wytrzymałością na ściskanie 0,45 MPa, skurczem objętościowym poniżej 50%.

Claims (2)

1. Sposób wytwarzania materiału kompozytowego chitozan/hydroksyapatyt/krzemionka, przeznaczonego na substytuty kości, z soli chitozanowej, hydroksyapatytu i związku krzemu, z wykorzystaniem ultradźwięków, znamienny tym, że roztwór wodny soli chitozanowej, jak octan, chlorek, mleczan lub cytrynian chitozanu, sporządzonej z chitozanu o masie cząsteczkowej poniżej 1000 kDa, miesza się z nanoproszkiem hydroksyapatytowym użytym w ilości 3-13% masowych w stosunku do masy soli chitozanowej oraz ewentualnie z glicerofosforanem wapnia użytym w ilości 3-20% masowych w stosunku do końcowej masy mieszaniny, za pomocą ultradźwięków do uzyskania homogenicznej pasty, którą następnie wprowadza się do zolu kwasu metakrzemowego zawierającego 20-50% masowych krzemionki i o pH 9-10, stosując 1 część masową pasty na 2-3 części masowe zolu, całość miesza się, po czym otrzymany kompozyt suszy się konwekcyjnie w temperaturze 50-100°C.

2. Sposób wytwarzania materiału kompozytowego chitozan/hydroksyapatyt/krzemionka, przeznaczonego na substytuty kości, z soli chitozanowej, octanu wapnia, wodorofosforanu sodu, fosforanu sodu, trifosforanu pentasodowego i związku krzemu, znamienny tym, że sól chitozanową jak octan, chlorek, mleczan lub cytrynian chitozanu, o masie cząsteczkowej poniżej 1000 kDa miesza się z roztworem wodnym octanu wapnia i roztworem wodnym wodorofosforanu sodu, stosując 1,5-3,2 części masowych octanu wapnia i 1-2 części masowych wodorofosforanu sodu na 1 część masową soli chitozanowej o stężeniu chitozanu 1,5-3,0%, po czym do otrzymanej mieszaniny wprowadza się 0,5-1,2 części masowych zolu kwasu metakrzemowego o zawartości krzemionki 20-50% masowych i o pH 9-10, zawierającego 1 część masową roztworu wodnego fosforanu sodu i trifosforanu pentasodowego użytych w stosunku masowym 1:1, następnie całość miesza się, po czym otrzymany kompozyt suszy się konwekcyjnie w temperaturze 50-100°C, przy czym mieszaninę soli chitozanowej z roztworem wodnym octanu wapnia i wodorofosforanu sodu stosuje się w ilości 10-15 części masowych na 5-30 części masowych zolu zawierającego roztwór wodny fosforanu sodu i trifosforanu pentasodowego.