Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Środek do zastosowania w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji Helicobacter pylori, zastosowanie soli kwasu alfa‑ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych do wytwarzania środka leczniczego oraz dodatku do żywności do zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji Helicobacter pylori
PL226695B1
Poland
- Other languages
English - Inventor
Danuta Kruszewska
Worldwide applications
Application PL380103A events
2006-07-03
2006-07-03
2008-01-07
2017-08-31
Description
translated from
Przedmiotem wynalazku jest środek do zastosowania w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji Helicobacter pylori, zastosowanie soli kwasu alfa-ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych do wytwarzania środka leczniczego oraz dodatku do żywności do zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji Helicobacter pylori.
Hormony żołądkowo-jelitowe - a w wśród nich rodzina peptydów gastryny (gastryna, cholecystokinina - CCK), regulują funkcje przewodu pokarmowego (Nakamura E, Hagen SJ. Role of glutaminę and arginase in protection against ammonia-induced cell death in gastric epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002; 283: 1264-275). Wymienione peptydy charakteryzuje strukturalna identyczność aminokwasów zlokalizowanych w końcu C peptydów, a umiejscowienie reszty tyrozylowej determinuje ich aktywność albo stymuluje wydzielanie soku żołądkowego (gastryna) albo stymuluje opróżnianie pęcherzyka żółciowego i sekrecję enzymów trzustkowych (np. CCK). Wiadomo jest również, że hormony z grupy gastryny działają troficznie na układ pokarmowy (de Oca J, Bettonica C, Cuadrado S, Vallet J, Martin E, Garcia A, Montanes T, Jaurrieta E. Effect of oral supplementation of ornithine-alpha-ketoglutarate on the intestinal barrier after orthotopic small bowel transplantation. Transplantation. 1997; 63: 636-639, Voland P, Weeks DL, Marcus EA, Prinz C, Sachs G, Scott D. Interactions among the seven Helicobacter pylori proteins encoded by the urease gene cluster. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003; 284: 96-106).
Zauważono, że podczas zakażenia H. pylori rozwija się stan zapalny i w pierwotnym jego stadium, któremu towarzyszy powstawanie wrzodów żołądka i dwunastnicy zmniejsza się wydzielanie somatostatyny oraz rozwija się hypergastrynemia, co z kolei prowadzi do zwiększonego wydzielania kwasu solnego (Weeks DL, Eskandari S, Scott DR, Sachs G. A H+-gated urea channel: the link between Helicobacter pylori urease and gastric colonization. Science. 2000; 287: 482-485).
Alfa-ketoglutaran (AKG) jest jedną z soli alfa-ketokwasów obok szczawiooctanu i pirogronianu, która odgrywa podstawową rolę w cyklu kwasu cytrynowego. W wyniku odtwarzających się reakcji dochodzi do syntezy kwasów tłuszczowych, steroli, cholesterolu (z udziałem cytrynianu), porfiryn, hemu, chlorofilu (czynność bursztynylo-CoA), glutaminianu, aminokwasów, zasad nukleotydowych (aktywność AKG). W komórkach prokariotycznych i eukariotycznych alfa-ketoglutaran (AKG) bierze nie tylko udział w biosyntezie, ale też i w degradacji aminokwasów.
Powstające w wyniku rozkładu aminokwasów jony amonowe częściowo biorą udział w biosyntezie związków azotowych, a ich nadmiar po przekształceniu w mocznik zostaje usuwany poza organizm. Enzymy związane z przemianami alfa-ketoglutaranu (AKG) znajdują się również w komórkach prokariotycznych, gdzie uczestniczą w procesie wzrostu bakterii. Zauważono, że inhibitor pompy protonowej lansoprazol i jego pochodne hamują oddychanie H. pylori przez to, że wiążąc się z endogennymi substratami takimi jak pirogronian i alfa-ketoglutaran (AKG) obniżają poziom ATP. Hamowanie wzrostu bakterii nasila się w tych warunkach w środowisku o wysokim stężeniu tlenu (Nagata K, Sone N, Tamura T. Inhibitory activities of lansoprazole against respiration in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: 1522-1527).
Występowanie szczepów H. pylori metronidazolo-wrażliwych i opornych jest związane z aktywnością enzymów komórkowych. W komórkach metronidazolo-opornych oksydoreduktaza alfaketoglutaranu pozostaje nieaktywna i przez to cykl Krebsa, warunkujący wzrost drobnoustrojów, ulega zachwianiu. Bakterie metronidazolo-oporne nie giną jednak aktywując kompensujące szlaki metaboliczne. Komórki H. pylori cechuje metabolizm oddechowy drobnoustrojów mikroaerofilnych, w pełni zależnych od środowiska o zmniejszonej zawartości tlenu (< 21%). Przeżycie w warunkach niemal beztlenowych wymaga włączenia szlaków metabolicznych obecnych u bakterii rosnących beztlenowo, gdzie np. enzymy biorące udział w utlenianiu pirogronianu są odmienne (oksydoreduktaza/dehydrogenaza). Cykl kwasów trikarboksylowych H. pylori wyróżnia aktywność syntazy cytrynianowej, akonitazy, dehydrogenazy cytrynianowej, reduktazy fumaranu, fumarazy, oksydazy alfaketoglutaranu, dehydrogenazy jabłczanowej, syntazy jabłczanowej. W komórce nie występują natomiast takie enzymy jak dehydrogenaza alfa-ketoglutaranu, syntetaza bursztynylo-CoA, dehydrogenaza CoA. Z tego więc wynika, że bursztynylo-CoA nie jest aktywny, a alternatywny szlak generowany przez transferazę CoA może być podstawowym źródłem energii komórki. Jak wykazano, transferaza CoA jest unikalna dla H. pylori i nie występuje w metabolizmie C. jejuni.
Wydaje się, że cykl Krebsa H. pylori przebiega niecyklicznie w sposób rozgałęziony, charakterystyczny dla szlaków metabolicznych bakterii beztlenowych, bezpośrednio ukierunkowanych do produkcji
PL 226 695 B1 bursztynianu, kiedy procesy przebiegają w warunkach redukcyjnych kwasów dikarboksylowych lub do produkcji alfa-ketoglutaranu (AKG) w warunkach utleniających (Hoffman PS, Goodwin A, Johnsen J, Magee K, Veldhuyzen van Zanten SJ. Metabolic activities of metronidazole-sensitive and -resistant strains of Helicobacter pylori:. repression of pyruvate oxidoreductase and expression of isocitrate lyase activity correlate with resistance. J Bacteriol. 1996; 178: 4822-4829, Pitson SM, Mendz GL, Srinivasan S, Hazell SL. The tricarboxylic acid cycle of Helicobacterpylori. Eur J Biochem. 1999; 260: 258-267).
Dotychczas alfa-ketoglutaran wykorzystywano jako istotny czynnik wzrostu wielu drobnoustrojów zaznaczając, że nie jest on niezbędny w hodowli H. pylori. Te bakterie mogą rosnąć w różnych pożywkach płynnych z wyłączeniem buforowanego ekstraktu drożdży z alfa-ketoglutaranem, nawet jeśli hodowla została wzbogacona takimi dodatkami jak surowica płodowa (Shahamat M, Mai UE,
Paszko-Kolva C, Yamamoto H, Colwell RR. Evaluation of liquid media for growth of Helicobacter pylori. J Clin Microbiol. 1991; 29: 2835-2837).
Z drugiej strony komórki H. pylori w warunkach in vitro inkubowane w temp. 4°C, bez dostępu do źródeł węgla i azotu wykazują aktywność oksydacyjną w obecności bursztynianu, alfa-ketoglutaranu i asparaginianu (przez ponad 200 dni). Z tego wynika, że komórki, które nie poddają się hodowli są nadal biochemicznie aktywne (Gribbon LT, Barer MR. Oxidative metabolism in noncultur able Helicobacter pylori and Vibrio vulnificus cells studied by substrate-enhanced tetrazolium reduction and digital image Processing. Appl Environ Microbiol. 1995; 61: 3379-3384).
Obecność alfa-ketoglutaranu lub pirogronianu w podłożu wzrostowym jest niezbędna dla Aquicella lusitana i A. siphonis. Te związki nie są źródłem węgla czy energii lecz zabezpieczają bakteriom oddychanie komórkowe (Santos P, Pinhal I, Rainey FA, Empadinhas N, Costa J, Fields B, Benson R, Verissimo A, Da Costa MS. Gamma-proteobacteria Aquicella lusitana gen. nov., sp. nov., and Aquicella siphonis sp. nov. infect protozoa and require activated charcoal for growth in laboratory media. Appl Environ Microbiol. 2003; 69: 6533-6540). Podobnie w hodowli szczepów laboratoryjnych i klinicznych Porphyromonas gingivalis alfa-ketoglutaran w zakresie stężenia od 5 do 50 mM pozostaje akceptorem elektronów (Milner P, Batten JE, Curtis MA. Development of a simple chemically defined medium for Porphyromonas gingivalis: requirement for alpha-ketoglutarate. FEMS Microbiol Lett. 1996; 140: 125-130).
Obecność ketokwasów jako składnika podłoża dla bakterii z rodzaju Legionella skraca okres logarytmicznego wzrostu drobnoustrojów, wzmaga tempo ich wzrostu i prowadzi do maksymalnej wydajności masy bakteryjnej. Ketokwasy zmieniają metabolizm komórki chroniąc niezbędną dla bakterii, a pochodzącą ze środowiska cysteinę, usuwają toksyczny nadtlenek wodoru, co wynika z ich funkcji „wymiatacza”. W przeciwieństwie do wymogów innych drobnoustrojów alfa-ketoglutaran i pirogronian mogą być zastępowane w podłożu dla Legionella spp. takimi związkami jak bursztynian i szczawiooctan (Pine L, Hoffman PS, Malcolm GB, Benson RF, Franzus MJ. Role of keto acids and reducedoxygen-scavenging enzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol. 1986; 23: 33-42).
Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że alfa-ketoglutaran hamuje proces kolonizacji H. pylori w układzie pokarmowym ssaków.
Wynalazek dotyczy środka do zastosowania w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji Helicobacter pylori, cechującego się tym, że jako substancję czynną zawiera sole kwasu alfa-ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych.
Środek ten, korzystnie zawiera sól sodową lub wapniową kwasu alfa-ketoglutarowego.
Wynalazkiem objęte jest również zastosowanie soli kwasu alfa-ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych do wytwarzania środka leczniczego do zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji Helicobacter pylori.
Wynalazek obejmuje także zastosowanie soli kwasu alfa-ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych do wytwarzania dodatku do żywności do zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji Helicobacter pylori.
Środek można podawać ze znanymi nośnikami i z zaróbkami, które są dopuszczalne farmaceutycznie i kompatybilne ze składnikiem aktywnym. Odpowiednimi zaróbkami są, na przykład, woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol, etanol lub podobne oraz ich kombinacje. Ponadto, jeśli jest to pożądane, środek może zawierać substancje pomocnicze, takie jak, na przykład, czynniki zwilżające lub emulgujące, czynniki modulujące pH, czynniki buforujące.
Środek można przygotować w postaci stałej, płynnej, liofilizowanej lub wysuszonej w inny sposób.
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia zależność między α-ketoglutaranem (AKG) a stopniem kolonizacji Helicobacter pylori oraz funkcjami przewodu pokarmowego myszy (n=28).
PL 226 695 B1
Fig. 2 przedstawia zależność między α-ketoglutaranem (AKG) a stopniem kolonizacji Helicobacter pylori u myszy (n=48).
Myszom podawano zawiesiny oznaczone w następujący sposób,: H. pylori: #, alfa-ketoglutaran: ♦; zbuforowana sól fizjologiczna (PBS): ·. Nazwy szczepów, gęstości i objętości inoculum (H. pylori) oraz stężenia i dawki: alfa-ketoglutaranu, PBS umieszczono w tekście. Zawiesiny bakteryjne (H. pylori) i pozostałe preparaty (alfa-ketoglutaran, PBS) podawano myszom dożołądkowo (ig).
Fig. 3 przedstawia zależność między podawaniem α-ketoglutaranu (AKG) a grubością błony śluzowej żołądka.
PBS - grupa II (n=6); HP - H. pylori (109 cfu/ml) (n=6); HP+AKG - (109 cfu/ml + 30 mM) (n=7). Każda z kolumn przedstawia grubość błony śluzowej w μm (średnia ± SD; n=6-7).
Fig. 4 przedstawia zależność między podawaniem α-ketoglutaranu (AKG) a liczbą komórek 2 produkujących gastrynę mierzonych w mm2.
PBS - grupa II (n=6); HP - H. pylori (109 cfu/ml) (n=6); HP+AKG - (109 cfu/ml + 30 mM) (n=7).
2
Każdy słupek pokazuje liczbę komórek produkujących gastrynę w 1 mm2 (średnia ± SD; n=6-7). Litery umieszczone nad każdym ze słupków wskazują na różnice przy P < 0,05.
Fig. 5 przedstawia zależność między podawaniem α-ketoglutaranu (AKG) a liczbą komórek produkujących CCK mierzonych w mm kosmka.
PBS - grupa II (n=6); HP - H. pylori (109 cfu/ml) (n=6); HP+AKG - (109 cfu/ml + 30 mM) (n=7). Każdy słupek pokazuje liczbę komórek produkujących CCK w 1 mm kosmka (średnia ± SD; n=6-7). Litery umieszczone nad każdym ze słupków wskazują na różnice przy P < 0,05. Gwiazdki wskazują na różnice przy P < 0,05 między ilością komórek produkujących CCK w przedniej i tylnej części jelita.
Fig. 6 przedstawia ruchliwość produktów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) właściwych dla fragmentu 16S rDNA Helicobacter spp. w polu elektrycznym ocenianych techniką DGGE
M; markery: A; H. muridorum, B; H. bilis, C; H. pullorum, D; H. pylori, E; Helicobacter spp. flexispira takson 8 ”F. rappini”, F; H. hepaticus, G; H. bizzozeronii, HP; kontrola dodatnia DNA izolowane z H. pylori CCUG 17874.
P r z y k ł a d I.
Zwierzęta doświadczalne (Fig. 1)
Do badań użyto 42 sześciotygodniowych myszy rasy BALB/cA (samice) o wadze (23 ± 2 g).
Zwierzęta do doświadczeń podzielono na dwie grupy (Fig. 1).
Grupa I A, I B
Czternastu myszom sondą dożołądkową (zew. średnica = 1,3 mm) aplikowano trzykrotnie z odstępami jednodniowymi 0,2 ml zawiesiny H. pylori 119/95 (109 cfu/ml). Dwa tygodnie po ostatnim podaniu, siedem myszy inokulowano dożołądkowo przez dziewięć kolejnych dni w sposób opisany powyżej świeżo przygotowanym roztworem soli sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml, stężenie 30 mM) (grupa I A). Pozostałe 7 myszy otrzymywały 0,01 M PBS (grupa I B) tak samo jak zwierzęta z grupy I A.
Grupa II A, II B
Tej grupie zwierząt tj. 14 kolejnym myszom podawano 0,2 ml PBS według schematu obowiązującego przy zakażaniu zwierząt H. pylori. Po dwutygodniowej przerwie siedem myszy nadal otrzymywało PBS (0,2 ml) przez kolejnych 9 dni (grupa II B). Pozostałym 7 myszom wprowadzano roztwór alfa-ketoglutaranu (0,2 ml, stężenie 30 mM) (grupa II A).
W 30-ym dniu doświadczenia zwierzęta usypiano CO2. Do dalszych badań pobierano od myszy próbki krwi, żołądka, fragmenty przedniej i tylnej części jelita cienkiego.
Bakterie wyhodowano między 5 i 10-tym dniem inkubacji ze wszystkich próbek żołądka zwierząt inokulowanych H. pylori i tych, którym podano następnie alfa-ketoglutaran. Liczba kolonii wyizolowanych z tego materiału wynosiła odpowiednio 78 ± 5,38 ± 5.
Od zwierząt inokulowanych jedynie alfa-ketoglutaranem i PBS nie wyizolowano H. pylori. Z próbek krwi pobranych od wszystkich badanych myszy nie wyhodowano bakterii.
Immunoreaktywność H. pylori wykazano techniką odciskową (colony blots). Odciski hodowli płytkowej żołądków myszy inokulowanych alfa-ketoglutaranem, PBS pozostały niewybarwione, zabarwienie kolonii H. pylori nie stwierdzono w żołądku myszy zakażanych wyłącznie H. pylori a następnie inokulowanych alfa-ketoglutaranem.
Stwierdzono zmiany w morfologii błony śluzowej żołądka, przy czym grubość błony śluzowej jelita cienkiego jak i wysokość kosmków jelitowych oraz głębokość krypt pozostała porównywalna we wszystkich badanych grupach zwierząt (wyników nie przedstawiono).
PL 226 695 B1
Warstwa błony śluzowej żołądka myszy zakażanych H. pylori w stosunku do myszy zakażanych wpierw H. pylori, a następnie inokulowanych alfa-ketoglutaranem wykazywała tendencję do ścieńczenia (-20%) (Fig. 3).
Nie stwierdzono morfologicznych ani morfometrycznych (zgodnie ze stosowanymi parametrami) zmian w części przedniej jak i tylnej jelita cienkiego pomiędzy myszami zakażonymi H. pylori, a pozostałymi zwierzętami.
Obecność spiralopodobnych mikroorganizmów (potwierdzone hodowlą) na powierzchni błony śluzowej żołądka zwierząt zakażanych H. pylori (grupa I B) wykryto przy użyciu przeciwciała krzyżowo reagującego z antygenami wici H. pylori. Natomiast w żołądkach 13 myszy, którym podano alfaketoglutaran, w 2 próbkach wykryto bakterie, które albo występowały pojedynczo rozproszone, albo jako oddzielnie formujące się skupiska.
W preparatach z przedniej części jelita cienkiego myszy kontrolnych wybarwione zostały spiralne mikroorganizmy. Natomiast wśród myszy otrzymujących jedynie alfa-ketoglutaran lub w połączeniu z H. pylori zidentyfikowano po 3 zwierzęta, u których bakterie wykryto w przedniej części jelita i po jednej myszy, gdzie drobnoustroje możliwe były do rozpoznania w tylnym segmencie jelita. W części tylnej jelita cienkiego zwierząt nie wykryto swoistym barwieniem spiralnych drobnoustrojów.
U wszystkich badanych myszy, zarówno u myszy kontrolnych jak i myszy zakażanych H. pylori, komórki produkujące gastrynę zlokalizowano w części odźwiernikowej gruczołów żołądkowych, gdzie układały się pojedynczo lub w pakietach.
Nie stwierdzono statystycznych różnic w ilości komórek u zwierząt, którym aplikowany został alfa-ketoglutaran, ale tendencja do spadku manifestowała się wyraźnie (F test, P=0,22).
W części przedniej jelita cienkiego, w kryptach i kosmkach jelitowych wykazano obecność komórek produkujących CCK.
Tendencję zmniejszenia ilości komórek produkujących CCK obserwowano u myszy zakażonych wpierw H. pylori, a następnie otrzymujących alfa-ketoglutaran (-30% P=0,05). Grupa zwierząt I A (zakażonych wpierw H. pylori, a następnie inokulowanych alfa-ketoglutaranem) nie ujawniała istotnych różnic w liczbie komórek produkujących CCK w porównaniu z grupą myszy zakażanych H. pylori (P=0,25).
Zwierzęta doświadczalne (Fig. 2)
Grupa III, III B
Dwudziestu czterem myszom (Fig. 2) aplikowano dożołądkowo, trzykrotnie z jednodniowymi odstępami po 0,2 ml zawiesiny H. pylori 119/95 (109 cfu/ml). Po ośmiu dniach, szesnastu myszom podawano sondą przez trzy kolejne dni 0,2 ml przygotowanego wlewu (Scott DR, Marcus EA, Weeks DL, Sachs G. Mechanisms of acid resistance due to the urease system of Helicobacter pylori.
Gastroenterology. 2002; 123: 187-195) świeżo sporządzonego roztworu 30 mM soli sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego (grupa III B). Kolejne 8 myszy otrzymywały wyłącznie po 0,2 ml 0,01 M PBS (grupa III) według schematu postępowania z grupą III B.
Grupa IV A, B, C
Dwudziestu czterem myszom (Fig. 2) aplikowano dożołądkowo, trzykrotnie z jednodniowymi odstępami po 0,2 ml 0,01 M PBS. Po ośmiu dniach, szesnastu myszom podawano sondą przez trzy kolejne dni roztwór sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml, stężenie 30 mM) (grupa IV B). Kolejne 8 myszy otrzymywały nadal po 0,2 ml 0,01 M PBS (grupa IV).
W 20-ym dniu doświadczenia zwierzęta usypiano CO2 z zachowaniem przedstawianych wcześniej standardów. Przygotowanie do doświadczenia i hodowlę myszy w czasie trwania badań prowadzono tak jak to podano wcześniej. Do dalszych badań pobierano od myszy próbki żołądka i krwi.
Z żołądka wszystkich myszy zakażanych H. pylori (grupa III, n=8) wyhodowano H. pylori. W DNA wyizolowanym z tych samych próbek żołądka (n=8) wykryto metodą PCR fragment charakterystyczny dla 16S rDNA H. pylori.
Z próbek żołądka pozyskanych od myszy zakażonych H. pylori traktowanych następnie alfa-ketoglutaranem (grupa III B, n=16) nie wyhodowano ani H. pylori, ani też w produktach PCR nie stwierdzono sekwencji właściwych dla H. pylori.
Spośród uzyskanych 48 produktów PCR, w 16 próbkach wykryto DNA liczący 470 par zasad.
Nie uległ powieleniu DNA izolowany z krwi (n=48) i z żołądków myszy, które otrzymywały PBS (grupa IV, n=8) zamiast zawiesiny bakterii i/albo sól sodową i/albo wapniową kwasu alfa-ketoglutarowego (Tab. 1).
PL 226 695 B1
W wyniku sekwencjonowania zreamplifikowanych produktów PCR (n=16) rozdzielonych wcześniej techniką DGGE otrzymane sekwencje odpowiadały H. pylori a także H. rodentium, H. bilis oraz H. hepaticus (Tab. 2, Fig. 6).
DNA trzech różnych gatunków Helicobacter: H. pylori, H. rodentium, H. bilis wykryto u zwierząt z grupy III (H. pylori), i III B (H. pylori/AKG).
T a b e l a 1 A, B. Wyniki hodowli i PCR (A) oraz identyfikacja produktów PCR (B) (n=28) z matrycy DNA próbek żołądków myszy inokulowanych H. pylori lub czynnikami antybakteryjnymi (n=80)
A.
| Wykaz inokulatów* | Liczba wyrośniętych kolonii H. pylon** | |
| H. pylori/PBS (grupa III) | 43 ± 4 | 81/82 |
| H. pylori/AKG (grupa III B) | 0 | 5/16 |
| AKG (grupa IV B) | 0 | 3/16 |
| PBS (grupa IV) | 0 | 0/8 |
B.
| Wykaz inokulatów | Liczba | Identyfikacja produktów pcr**** |
| H. pylori/PBS (grupa III) | 1. | H. pylori |
| 2. | H. pylori | |
| 3. | H. pylori | |
| 4. | H. pylori | |
| 5. | H. pylori, H. bilis | |
| 6. | H. pylori | |
| 7. | H. pylori, H. bilis | |
| 8. | H. pylori | |
| H. pylori/AKG (grupa III B) | 1. | H. rodentium, H. bilis |
| 2. | H. hepaticus | |
| 3. | H. rodentium | |
| 4. | H. hepaticus | |
| 5. | H. rodentium | |
| AKG (grupa IV) | 1. | H. hepaticus |
| 2. | H. hepaticus | |
| 3. | H. rodentium |
* Gęstość i objętość zawiesiny komórek H. pylori (szczep H. pylori 119/95) oraz stężenia i dawkowanie: alfaketoglutaranu (AKG), PBS umieszczono w tekście. Zawiesinę bakterii (H. pylori) i pozostałe inokulaty (alfaketoglutaran, PBS) podawano myszom ig.
** Hodowlę bakterii prowadzono na podłożu wybiórczym o nazwie GAB-CAMP, opis w tekście.
*** Reakcję przeprowadzano ze specyficznymi starterami w celu zlokalizowania fragmentu 16S rDNA Helicobacter spp. w badanej tkance, opis w tekście.
**** Produkty PCR sekwencjonowano w celu identyfikacji fragmentu 16S rDNA charakterystycznego dla określonego gatunku Helicobacter
81/82 Liczba produktów PCR zawierających sekwencje DNA charakterystyczne dla 16S rDNA Helicobacter spp./Liczba przeprowadzonych PCR
PL 226 695 B1
P r z y k ł a d 2.
Sporządzono wodny roztwór mieszaniny lub oddzielnie każdej z osobna soli wapniowej oraz sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego i zastosowano je jako dodatek do produktów mlecznych oraz napojów
Alfa-ketoglutaran sodu 0,001 g do 0,2 g
Glukoza 20 g
Woda do 100 g
Terapeutycznie i/lub profilaktycznie skuteczna ilość wynosi od 0,001 g do 0,2 g/kg masy ciała na dawkę dzienną.
Przy użyciu zwierząt modelowych (myszy) oraz przy udziale ochotników wykazano aktywność profilaktyczną, łagodzącą przebieg zakażenia, a także ograniczającą kolonizację układu pokarmowego przez H. pylori oraz zmieniającą aktywność hormonalną jelita w wyniku wprowadzenia soli sodowej lub/i wapniowej kwasu alfa-ketoglutarowego w formie wodnego roztworu, dożołądkowo lub doustnie.
W żołądku i jelicie cienkim myszy inokulowanych tą zawiesiną kolejno po dożołądkowym wprowadzeniu H. pylori, stwierdzono spadek liczby komórek produkujących gastrynę (Fig. 4) i cholecystokininę (Fig. 5). W jelicie, u wszystkich badanych grup nie stwierdzono różnic w wysokości i długości kosmków jelitowych, głębokości krypt i grubości błony śluzowej. Jednakże, u myszy zakażanych H. pylori, a następnie inokulowanych alfa-ketoglutaranem nastąpiła eradykacja patogenu z żołądka. Stabilizujące zdrowie alfa-ketoglutaran działa w tym wypadku najprawdopodobniej poprzez zahamowanie sekrecji soku żołądkowego gospodarza, na co wskazuje spadek liczby komórek produkujących gastrynę. Niski poziom gastryny z równoczesnym osłabieniem stymulacji komórek okładzinowych produkujących HCl obniża stężenie protonów w; błonie śluzowej żołądka. Jak wiadomo warunkiem podstawowym do skolonizowania żołądka przez H. pylori jest wysoka „protonizacja” czyli niskie pH błony śluzowej żołądka. Spadek liczby komórek produkujących gastrynę/CCK najprawdopodobniej chroni organizm przed hypergastrynemią wyróżniającą ostry przebieg zakażenia H. pylori. Niski poziom gastryny może zakłócać wytwarzanie bakteryjnej ureazy, czynnika niezbędnego w kolonizacji żołądka przez H. pylori a w konsekwencji limitować wzrost bakterii w warunkach przeprowadzonego doświadczenia.
Sól sodowa lub/i wapniowa kwasu alfa-ketoglutarowego po wprowadzeniu do układu pokarmowego myszy reguluje funkcje jelita działając prewencyjne i łagodząco na przebieg zakażenia H. pylori. Powiększeniu grubości błony śluzowej żołądka towarzyszy zwiększenie produkcji śluzu w wyniku dożołądkowego wprowadzenia alfa-ketoglutaranu (Fig. 3). To może indukować nasilenie poziomu czynników wzrostu, co z kolei wpływa na aktywność gastryczną poprzez ograniczenie produkcji kwasu solnego i uwalnianie somatostatyny (hamowanie pompy protonowej i sekrecji gastryny). Bariera śluzu działa nie tylko mechanicznie utrudniając kolonizację H. pylori, a także produkowana w żołądku mucyna wykazuje bakteriobójczą aktywność.
Podstawa działania soli sodowej lub/i wapniowej kwasu alfa-ketoglutarowego utrudniającego zasiedlenie żołądka przez H. pylori jest oparta o syntezę glutaminianu i obecność jonu amonowego produkowanego przy udziale ureazy wytwarzanej przez H. pylori. W komórkach żołądka z egzogennego alfa-ketoglutaranu i jonu amonowego oraz pod kontrolą enzymów komórkowych syntetyzowany zostaje glutaminian. W wyniku działania ureazy rozkładającej mocznik do CO2 i jonu amonowego podniesione pH błony śluzowej żołądka ulega obniżenie przy udziale soli sodowej lub/i wapniowej kwasu alfa-ketoglutarowego. Produkowany jon amonowy zostaje bowiem wykorzystany do syntezy glutaminy. W takich warunkach H. pylori - mikroorganizm wrażliwy na niskie pH - ma utrudnienie z wytworzeniem mikroniszy, w której mógłby przeżyć, kolonizując błonę śluzówką żołądka, a następnie rozwinąć zakażenie.
Powszechnie znaną właściwością H. pylori jest zdolność przeżycia w niskim pH, co tłumaczy się silną aktywnością bakteryjnej ureazy, która hydrolizuje mocznik obecny w błonie śluzowej żołądka i w soku żołądkowym (Saidijam M, Psakis G, Clough JL, Meuller J, Suzuki S, Hoyle CJ, Palmer SL,
Morrison SM, Pos MK, Essenberg RC, Maiden MC, Abu-bakr A, Baumberg SG, Neyfakh AA, Griffith JK, Sachs G, Scott D, Weeks D, Melchers K. Gastric habitation by Helicobacter pylori: insights into acid adaptation. Trends Pharmacol Sci. 2000; 21: 413-416, Sachs G, Weeks DL, Melchers K, Scott DR. The gastric biology of Helicobacter pylori. Annu Rev Physiol. 2003: 65: 349-369, Sidebotham RL, Worku ML, Karim QN, Dhir NK, Baron JH. How Helicobacter pylori urease may affect extemal pH and influence growth and motility in the mucus environment: evidence from in-vitro studies. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003; 15: 395-401).
PL 226 695 B1
Schemat poszczególnych reakcji przebiega następująco:
(1) H2NCONH2 + H2O —► CO2 + 2 NH3 (2) CO2 +H2O —► H2CO3 (3) H2CO3 + 2 NH3 —► NH4+ + HCO3- + NH3 (4) H+Cl- +NH3 —► NH4 + + Cl-
Wynikiem tych procesów jest wytworzenie amoniaku reagującego natychmiast z kwasem solnym, tak że w mikrośrodowisku tkankowym (błona śluzówka żołądka) drobnoustroju dochodzi do miejscowego podniesienia pH. W naturalnych warunkach błona śluzowa żołądka zachowuje odczyn kwaśny z powodu produkowania HCl w komórkach okładzinowych.
Kolonizacja bakteryjna w żołądku jest utrudniona, co wynika oczywiście z kwaśnego odczynu środowiska i dlatego antagonistyczne oddziaływania różnych drobnoustrojów i ich uwalnianych do otoczenia metabolitów są silniej zaznaczone niż w innych odcinkach przewodu pokarmowego. W związku z tym, paradoksalnie, mimo że H. pylori jest mikroorganizmem wrażliwym, trudno hodującym się in vitro, niskie pH bójcze dla innych bakterii sprzyja kolonizacji H. pylori. A to wynika głównie z obecności w otoczeniu endogennego mocznika, którego rozkład przez ureazę bakteryjną do amoniaku jest niezbędny do podniesienia pH w mikrośrodowisku H. pylori i eliminacji letalnego wpływu kwaśnego odczynu na wzrost bakterii. Zauważono także zdolność H. pylori do przemieszczania się w kierunku mocznika i węglanu zgodnie z gradientem stężenia, a chemotaksje przyspiesza sam proces hydrolizy mocznika. W ten sposób można tłumaczyć rozpoczęcie następnej rundy cyklu wzrostu i ustabilizowania się zakażenia w żołądku (Scott DR, Marcus EA, Weeks DL, Sachs G. Mechanisms of acid resistance due to the urease system of Helicobacter pylori. Gastroenterology. 2002;123:187-195., Scott DR, Marcus EA, Weeks DL, Lee A, Melchers K, Sachs G. Expression of the Helicobacter pylori urel gene is required for acidic pH activation of cytoplasmic urease. Infect Immun. 2000; 68: 470-477, Voland P, Weeks DL, Marcus EA, Prinz C, Sachs G, Scott D. Interactions among the seven Helicobacter pylori proteins encoded by the urease gene cluster. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003; 284: 96-106).
Przyczyną tego może być toksyczność jonu amonowego, jednej z najsilniejszych trucizn endogennych. Z drugiej strony należy pamiętać, że jon amonowy jest dla bakterii niezbędnym czynnikiem warunkującym produkcję ich własnych aminokwasów i innych związków zawierających azot w cząsteczce.
Wydaje się, że optymalny zakres stężeń jonu amonowego dla wzrostu bakterii i komórek eukariotycznych jest wąski i nie należy wykluczyć, że stężenie optymalne dla jednych komórek może być zabójcze dla innych.
Alfa-ketoglutaran jest cząsteczką, która łączy metabolizm cukrów i tłuszczów z aminokwasami i metabolizmem puryn. W związku z kluczowym znaczeniem alfa-ketoglutaranu w procesach wzrostowych komórki, śmierć bakterii wiązać można z ograniczeniem dostępu do alfa-ketoglutaranu albo też wyczerpaniem zapasu komórkowego alfa-ketoglutaranu, który jest niezbędny do usuwania jonów amonowych z komórki w procesie syntezy glutaminianu z jonów amonowych i utrzymania niskiego pH (Nakamura E, Hagen SJ. Role of glutamine and arginase in protection against ammonia-induced cell death in gastric epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002; 283: 1264-1275).
W komórkach prokariotycznych występuje syntaza glutaminianowa katalizująca redukcyjną aminację alfa-ketoglutaranu i wykorzystująca glutaminę jako źródło azotu. W wyniku enzymatycznej hydrolizy glutaminy powstaje jon amonowy. Gdy jonu amonowego nie jest dużo, to glutaminian tworzy się wpierw przy udziale syntetazy glutaminianowej i syntazy glutaminianowej. Różne stopnie powinowactwa do jonu amonowego charakteryzują dehydrogenazę i syntetazę glutaminianowe, dehydrogenaza ma niższe powinowactwo do jonu amonowego, jeśli więc np. w środowisku jonu amonowego jest niewiele to syntetaza glutaminianowa przy nakładzie energii czerpanej z hydrolizy ATP może inicjować dalsze przemiany. Nie wykluczone, że przy nadmiarze jonów amonowych koszty energetyczne komórki prokariotycznej są zbyt wysokie, aby podołać syntezie, w związku z czym ginie. Konkurencyjność enzymów w żołądku może być więc kolejnym powodem tego, że alfa-ketoglutaran nie jest wykorzystywany bezpośrednio przez bakterie. Alfa-ketoglutaran najprawdopodobniej zostaje przeniesiony do komórki przy udziale białka błonowego transportującego kwasy dikarboksylowe. Związany z Na+ aktywny transport sprzęgający niekorzystny termodynamicznie transport jednego jonu z korzystnym przepływem innego ułatwia komórce przyswajanie substratów. Rodzina przenośników symportowych sprzęgających przenoszenie dwóch rodzajów jonów tj. dwuwartościowych anionów/Na+ (ang. divalent
PL 226 695 B1 anion/Na+ symporter - DASS) do wnętrza komórki pośredniczy w transporcie anionów kwasów dikarboksylowych jak i anionów kwasów nieorganicznych w sposób zależny od Na+. Białka błonowe należące do tej rodziny to zależne od sodu kotransportery anionów kwasów dikarboksylowych, ale też trikarboksylowych (Na+/dicarboxylate cotransporter NaDC-1, NaDC-3, Na+/citrate transporter, NaCT) i zależne od sodu transportery głównie grupy SO4-- NaSi-1 (ang. Na+/dependent inorganic sulphate transporter-1) i SUT-1, SUT-2 (ang. the sulphate transporter). Zależny od sodu transporter dla anionów kwasów di i trikarboksylowych (NaDC) należy do rodziny białek transportowych odpowiedzialnych za reabsorbcję albo transport intermediatów cyklu kwasów trikarboksylowych głównie bursztynianu, cytrynianu i alfa-ketoglutaranu. Na podstawie stopnia powinowactwa do substratu rodzina tych białek jest różnicowana na kotransportery o niskim powinowactwie NaDC1 i wysokim powinowactwie NaDC3 (Pajor AM. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflugers Arch. 2006; 451: 597-605). Tak więc po dożołądkowym podaniu, alfa-ketoglutaran może być z jednej strony buforem dla nadmiernej ilości jonów amonowych jak i dostarczycielem glutaminianu i glutaminy do dalszej syntezy aminokwasów endogennych. W komórkach żołądka przy udziale alfa-ketoglutaranu i pod kontrolą dehydrogenazy glutaminianu syntetyzowany zostaje glutaminian, czyli następuje inkorporacja wyjściowego amoniaku w aminokwasy. Nadmiar jonów amonowych zlokalizowanych w komórce bakteryjnej przesuwa te reakcje w kierunku produkcji glutaminianu co ma charakter działania ochronnego, ale poprzez usuwanie nadmiaru jonów amonowych następuje uszczuplenie puli alfa-ketoglutaranu. Wyczerpanie i brak alfa-ketoglutaranu w komórce bakteryjnej przyczynić się więc może do zahamowania podstawowych szlaków metabolicznych. W warunkach doświadczalnych in vivo poziom jonu amonowego jest stosunkowe niewielki i jego usunięcie przez alfa-ketoglutaran, który łatwo jest transportowany do komórek dzięki DC transporterowi obecnemu w komórkach błony śluzowej żołądka może prowadzić do śmierci komórek, ponieważ dobroczynna w tym wypadku dla H. pylori produkcja jonu amonowego z mocznika jest niewystarczająca ze względu na utylizację tego jonu przez alfa-ketoglutaran.
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
1. Środek do zastosowania w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji Helicobacter pylori, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera sole kwasu alfa-ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych.
2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sól sodową lub wapniową kwasu alfaketoglutarowego.
3. Zastosowanie soli kwasu alfa-ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych do wytwarzania środka leczniczego do zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji Helicobacter pylori.
4. Zastosowanie soli kwasu alfa-ketoglutarowego z metalami alkalicznymi i ziem alkalicznych do wytwarzania dodatku do żywności do zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji Helicobacter pylori.