PL221489B1 - Kwas (1R, 4S, 5S, 6S)-4-(2^'S-4^'-metylotio-2^'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2λ⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowy, jego hydrat, zastosowanie, oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca te związki do leczenia zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny prolek pobudzających aminokwasów; kwas (1R, 4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. Przedmiotem wynalazku są ponadto zastosowanie i kompozycja farmaceutyczne zawierająca przedmiotowy związek dc leczenia zaburzeń neurologicznych i zaburzeń psychiatrycznych.

Stan techniki

Leczenie zaburzeń neurologicznych lub psychiatrycznych, takich jak stany lękowe, wiąże się z selektywną aktywacją receptorów metabotropowych dla aminokwasów pobudzających. Na przykład w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5688826 (w skrócie '826), wydanym 18 listopada 1997 ujawniono, że kwas (+)-4-amino-2-sulfonylobicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowy jest aktywnym agonistą receptora mGluR2. Ponadto w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5958960 (w skrócie '960), wydanym 28 września 1999, ujawniono, że kwas (+)-2-amino-4-fluorobicyklo[3.1.0]heksano-2,6-dikarboksylowy jest aktywnym agonistą receptora mGluR2.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są formy proleków agonistów receptora mGluR2, które wzmagają in vivo moc odpowiednich związków macierzystych i zapewniają lepszą ekspozycję związku macierzystego po podaniu doustnym. Związki według niniejszego wynalazku stanowią najkorzystniejsze rozwiązanie pod względem zachowania bezpieczeństwa i skuteczności w porównaniu do uprzednio ujawnionych agonistów receptora mGluR2 o zwiększonej biodostępność po podaniu doustnym.

Syntetyczne proleki aminokwasów pobudzających i sposoby ich wytwarzania ujawniono w międzynarodowych zgłoszeniach o nr PCT/US01/45866 i PCT/US02/00488.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest związek kwas (1R, 4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tiabicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Przedmiotem wynalazku jest także monohydrat kwasu (1R, 4S,5S,6S)-4-(2M5-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tiabicyklo[3.1.0] heksano-4,6-dikarboksylowego.

Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca przedmiotowy związek lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym, nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub rozczynnikiem.

Kolejnym aspektem niniejszego wynalazku jest zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniu 1 albo 2, do wytwarzania leku do podania skutecznej ilości związku o wzorze (II),

w którym, X oznacza grupę SO₂, R¹⁰ i R¹¹ oznaczają atom wodoru.

Kolejnym aspektem niniejszego wynalazku jest zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniu 1 albo 2, do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia neurologicznego u pacjenta.

Korzystnie, związek znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia neurologicznego wybranego z grupy obejmującej niedobory mózgowe w następstwie wszczepienia bajpasów naczyń wieńcowych mięśnia sercowego i przeszczepu; niedokrwienia mózgu; uraz rdzenia kręgowego; uraz głowy; chorobę Alzheimera; pląsawicę Huntingtona; stwardnienie zanikowe boczne; otępienia wywołanego przez AIDS; niedotlenienie okołoporodowe; uszkodzenie neuronalne w wyniku hipoglikemii; uszkodzenie gałki ocznej i retinopatii; zaburzenia poznawcze; zaburzenie idiopatyczne i polekowe chorobę Parkinsona; skurcze mięśni; migrenowe bóle głowy; nietrzymanie moczu; tolerancję na lek, wycofanie, przerwanie i uzależnienie od leku; odstawienie nikotyny; wymioty; obrzęk mózgu; przewlekły ból; zaburzenia snu; drgawki; zespół Tourette'a; zaburzenia z deficytem uwagi; i opóźnioną dyskinezę.

Korzystnie, związek znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia neurologicznego wybranego z grupy obejmującej tolerancję, wycofanie, przerwanie i uzależnienie od leku; lub odstawienie nikotyny.

PL 221 489 B1

Kolejnym aspektem niniejszego wynalazku jest zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniu 1 albo 2, do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia psychiatrycznego u pacjenta.

Korzystnie, do leczenia zaburzeń psychiatrycznych wybranych z grupy obejmującej schizofrenię, stany lękowe i związane z nimi zaburzenia, depresję, zaburzenia dwubiegunowe, psychozę i natręctwa myślowe, oraz czynności przymusowe.

Przedmiotowe związki określone w zastrzeżeniu 1 można otrzymywać sposobem analogicznym do znanego w dziedzinie chemii, stosowanego do wytwarzania strukturalnie analogicznych związków heterocyklicznych, albo nowym sposobem ujawnionym poniżej. Takie sposoby i związki pośrednie, przydatne do wytwarzania związku zdefiniowanego powyżej, zilustrowano w poniższych sposobach, w których, jeśli nie wyspecyfikowano inaczej, rodniki mają zdefiniowane powyżej znaczenia.

Sposób wytwarzania związków określonych w zastrzeżeniu 1 obejmujący acylowanie związku o wzorze (ii):

11 w którym X oznacza SO₂, R oznacza atom wodoru i R oznacza atom wodoru, z zastosowaniem odpowiedniego aminoacylu o wzorze III

Pg^N-A- (III), w którym Pg^N oznacza grupę zabezpieczająca atom azotu i A oznacza metionyl, po czym, we wszystkich ujawnionych sposobach, gdy grupę funkcyjną zabezpieczono stosując grupę zabezpieczająca, usuwa się tę grupę zabezpieczającą; po czym, we wszystkich ujawnionych sposobach: gdy wymagane jest otrzymanie farmaceutycznie dopuszczalnej soli związku określonego w zastrzeżeniu 1, zasadową formę takiego związku poddaje się reakcji z kwasem, uzyskując farmaceutycznie dopuszczalny przeciwjon; lub grupę kwasową w takim związku poddaje się reakcji z zasadą, uzyskując farmaceutycznie dopuszczalny kation; lub w przypadku dwubiegunowego związku określonego w zastrzeżeniu 1, zobojętnia się, uzyskując sól addycyjną z kwasem lub sól addycyjną z zasadą takiego związku określonego w zastrzeżeniu 1, lub stosuje się dowolną inną typową procedurę.

Szczegółowy opis wynalazku

Stwierdzono, że związki według wynalazku są przydatnymi prolekami związków, które wykazują selektywnie aktywność agonistów metabotropowych receptorów glutaminianowych, a zatem są przydatne do leczenia chorób centralnego układu nerwowego, takich jak choroby neurologiczne, np. zwyrodnienia neurologiczne, oraz jako środki o działaniu przeciwpsychotycznym, przeciwlękowym, łagodzącym objawy zespołu odstawienia leku, przeciwdepresyjnym, przeciwdrgawkowym, przeciwbólowym oraz przeciwwymiotnym.

Zakres niniejszego wynalazku obejmuje farmaceutycznie dopuszczalne sole związku określonego w zastrzeżeniu 1. Te sole mogą występować w połączeniu z częścią kwasową lub zasadową cząsteczki i mogą mieć formę soli addycyjnej z kwasem, pierwszorzędowej, drugorzędowej, trzeciorzędowej lub czwartorzędowej amoniowej, z metalem alkalicznym lub metalem ziem alkalicznych. Na ogół, sole addycyjne z kwasami można uzyskać na drodze reakcji kwasu ze związkiem określonym w zastrzeżeniu 1. Alternatywnie, sole addycyjne z kwasami można wytworzyć poprzez poddanie przedostatniego związku (zabezpieczonego związku pośredniego) reakcji z odpowiednimi równoważnikami kwasów, w celu wytworzenia formy odpowiedniej soli, którą z kolei można poddać przekształceniu w związek określony w zastrzeżeniu 1, lub inną sól. Sole z metalem alkalicznym i metalem ziem alkalicznych na ogół wytwarza się na drodze reakcji wodorotlenku pożądanego metalu ze związkiem określonym w zastrzeżeniu 1.

Niektóre szczególne sole nadają preparatowi pewne zalety, dzięki ich formie krystalicznej. Niekrystaliczne formy bezpostaciowe związków mogą być higroskopijne. Krystaliczne formy związków farmaceutycznych są czasem bardziej pożądane, ponieważ wykazują korzystne właściwości w stanie stałym.

Kwasy powszechnie stosowane do otrzymywania takich soli obejmują kwasy nieorganiczne, np. kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, azotowy, siarkowy lub fosforowy lub kwasy organiczne, takie

PL 221 489 B1 jak organiczne kwasy karboksylowe, np. kwas glikolowy, maleinowy, hydroksymaleinowy, fumarowy, jabłkowy, winowy, cytrynowy, salicylowy, o-acetoksybenzoesowy lub organiczne kwasy sulfonowe, w tym kwas 2-hydroksyetanosulfonowy, tolueno-p-sulfonowy, metanosulfonowy, naftaleno-2-sulfonowy, benzenosulfonowy lub etanosulfonowy.

Oprócz farmaceutycznie dopuszczalnych soli, inne sole mogą one służyć jako związki pośrednie w procesie oczyszczania lub do wytwarzania innych farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami albo są przydatne do procesów identyfikacji, charakteryzacji lub oczyszczania.

Według niniejszego wynalazku, związek określony w zastrzeżeniu 1 obejmuje solwaty, szczególnie hydraty.

Wykazano, że zaburzenia wielu funkcji fizjologicznych powstają pod wpływem nadmiernej lub niewłaściwej stymulacji przewodzenia aminokwasów pobudzających. Przyjmuje się, że związki według niniejszego wynalazku mają zdolność do leczenia rozmaitych zaburzeń neurologicznych u ssaków związanych z tym stanem, obejmujących ostre zaburzenia neurologiczne, takie jak niedobory mózgowe w następstwie zabiegu operacyjnego wszczepienia bajpasów naczyń wieńcowych mięśnia serc owego oraz przeszczepu, udaru, niedokrwienia mózgu, urazu rdzenia kręgowego, urazu głowy, niedotlenienia okołoporodowego, zatrzymania akcji serca i uszkodzenia neuronalnego w wyniku hipoglik emii. Przyjmuje się, że związki według wynalazku mają zdolność do leczenia wielu przewlekłych zab urzeń neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera, pląsawica Huntingtona, stwardnienie zanikowe boczne, otępienie wywołane przez AIDS, uszkodzenie gałki ocznej i retinopatia, zaburzenia poznawcze i idiopatyczne, oraz polekowe zaburzenia typu parkinsonowskiego. Przedmiotem niniejszego wynalazku są także sposoby leczenia tych zaburzeń, które obejmują podawanie wymagającemu tego pacjentowi skutecznej ilości związku o wzorze I lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Związki według niniejszego wynalazku wykazują działanie w wielu innych zaburzeniach neurologicznych związanych z nieprawidłowościami przemian glutaminianu, obejmujących skurcze mięśni, drgawki, migrenowe bóle głowy, nietrzymanie moczu, ból, zespół napięcia przedmiesiączkowego (PMS), psychozę (taką jak schizofrenia), tolerancję, wycofanie, przerwanie i uzależnienie od leków (takich jak nikotyna, opiaty, kokaina, benzodiazepiny i etanol), stany lękowe i związane z nimi zaburzenia, wymioty, obrzęk mózgu, przewlekły ból i opóźnioną dyskinezę. Związki o wzorze 1 są także przydatne jako środki przeciwdepresyjne i przeciwbólowe.

Niniejszy wynalazek dostarcza sposoby leczenia tych zaburzeń, które obejmują podawanie wymagającemu tego pacjentowi skutecznej ilości związku według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Poniższe definicje przedstawiono w celu wyjaśnienia znaczenia i zakresu różnych terminów stosowanych w tym opisie. Ogólne terminy stosowane w tym opisie mają swoje zwyczajowe znaczenia.

Termin „działając na” w odniesieniu do związku o wzorze II obejmuje działanie agonistyczne na receptor aminokwasu pobudzającego. Termin „receptor aminokwasu pobudzającego” odnosi się do metabotropowego receptora glutaminianowego, który sprzęga się z efektorami komórkowymi poprzez wiązanie białka GTP. Termin „metabotropowy receptor glutaminianowy związany z cAMP” odnosi się do receptora metabotropowego, który jest sprzężony z hamowaniem aktywności cyklazy adenylanowej.

Termin „zaburzenie neurologiczne” odnosi się zarówno do ostrych, jak i przewlekłych stanów zwyrodnień neurologicznych, obejmujących niedobory mózgowe w następstwie zabiegu operacyjnego wszczepienia bajpasów naczyń wieńcowych mięśnia sercowego i przeszczepu, niedokrwienia mózgu (np. udaru powstałego w wyniku zatrzymania akcji serca), urazu rdzenia kręgowego, urazu głowy, choroby Alzheimera, pląsawicy Huntingtona, stwardnienia zanikowego bocznego, otępienia wywołanego przez AIDS, niedotlenienia okołoporodowego, uszkodzenia neuronalnego w wyniku hipoglikemii, uszkodzenia gałki ocznej i retinopatii, zaburzeń poznawczych, idiopatycznych i zaburzeń polekowych, oraz choroby Parkinsona. Ten termin obejmuje także inne schorzenia neurologiczne wywołane przez nieprawidłowości przemian glutaminianu, obejmujące skurcze mięśni, migrenowe bóle głowy, nietrzymanie moczu, tolerancję, wycofanie, przerwanie i uzależnienie od leków (tj. opiatów, benzodiazepin, nikotyny, kokainy lub etanolu), odstawienie nikotyny, wymioty, obrzęk mózgu, przewlekły ból, zaburzenia snu, drgawki, Zespół Tourette'a, zaburzenia z deficytem uwagi i opóźnioną dyskinezę.

Termin „zaburzenie psychiatryczne” odnosi się zarówno do ostrych, jak i przewlekłych schorzeń psychiatrycznych, obejmujących schizofrenię, stany lękowe i związane z nimi zaburzenia (np. ataki paniki i zaburzenia sercowo-naczyniowe wywołane stresem), depresję, zaburzenia dwubiegunowe, psychozę, natręctwa myślowe i czynności przymusowe, uogólnione stany lękowe, zaburzenia wywołane nagłym stresem i stany paniki.

PL 221 489 B1

Stosowany tu termin „skuteczna ilość” odnosi się do ilość lub dawki związku, która po pojedynczym lub wielokrotnym podaniu pacjentowi, zapewnia pożądane działanie diagnostyczne lub lecznicze.

Skuteczną ilość może łatwo określić lekarz prowadzący, będący specjalistą w tej dziedzinie, poprzez zastosowanie znanych technik i analizę wyników uzyskanych w podobnych okolicznościach. Określając skuteczny ilość lub dawkę podawanego związku, lekarz prowadzący powinien wziąć pod uwagę wiele czynników, obejmujących, lecz nieograniczających się do nich: gatunek ssaka; jego wie lkość, wiek i ogólny stan zdrowia; specyficzną leczoną chorobę; stopień lub stan zaawansowania leczonej choroby; odpowiedź osobniczą pacjenta; konkretny podawany związek; sposób jego podawania; biodostępność podawanego preparatu; wybrany reżim dawkowania; stosowane równolegle inne leki; i inne stosowne okoliczności. Na przykład typowa dzienna dawka może obejmować od około 5 mg do około 300 mg substancji czynnej. Związki można podawać wieloma sposobami, w tym doustnie, doodbytniczo, przez skórnie, podskórnie, dożylnie, domięśniowo, podpoliczkowo lub donosowo. Związek można alternatywnie podawać metodą ciągłego wlewu.

Stosowany tu termin „pacjent” odnosi się do ssaka, takiego jak mysz, świnka morska, szczur, pies lub człowiek. Zrozumiałe jest, że korzystnie pacjentem jest człowiek.

Stosowany tu termin „leczenie” (lub „leczyć”) obejmuje ma ogólnie używane znaczenie, które obejmuje zapobieganie, ograniczenie i spowolnienie, zatrzymanie lub odwrócenie postępu choroby. Jako takie, zastosowanie związku według wynalazku obejmują podawanie w celach i terapeutycznych, i profilaktycznych.

Stosowany tu termin „grupa zabezpieczająca atom azotu”, i oznaczany symbolem „PgN”, odnosi się do tych grup, które zabezpieczają lub blokują atom azotu przed niepożądanymi reakcjami podczas syntezy. Wybór odpowiedniej zastosowanej grupy zabezpieczającej atom azotu będzie zależał od warunków stosowanych w późniejszych etapach reakcji, w których wymagane jest zabezpieczenie, a także od wiedzy fachowców w dziedzinie. Powszechnie stosuje się grupy zabezpieczające atom azotu opisane przez T.W. Greene i P.G.M. Wuts, w „Protective Groups in Organic Synthesis”, wydanie 3 (John Wiley & Sons, Nowy York (1999)). Korzystną grupą zabezpieczającą atom azotu jest tert-butoksykarbonyl.

Stosowany tu termin „grupa zabezpieczająca karboksyl”, oznaczany symbolem „PgC”, odnosi się do estrowych pochodnych kwasu karboksylowego, powszechnie stosowanych do blokowania lub zabezpieczania grupy karboksylowej podczas prowadzenia reakcji z udziałem innych grup funkcyjnych związku. Poszczególne przykłady obejmują np. metyl, etyl, tert-butyl, benzyl, metoksymetyl, trimetylosilil itp. Następne przykłady takich grup można znaleźć w publikacji T.W. Greene i P.G.M. Wuts, „Protective Groups in Organic Synthesis” wydanie 3 (John Wiley & Sons, Nowy York (1999)). Korzystnymi grupami zabezpieczającymi karboksyl są metyl i etyl. Ester rozkłada się stosując typową procedurę, która nie wpływa na inne części cząsteczki.

Termin „grupa zabezpieczająca hydroksyl” odnosi się do grup znanych fachowcom w dziedzinie chemii organicznej typów opisanych w Rozdziale 2 publikacji Greene'a i Wuts'a. Reprezentatywne grupy zabezpieczająca hydroksyl obejmują np. grupy eterowe, podstawione etylem grupy eterowe, grupy izopropyloeterowe, grupy fenylo- i podstawione fenylo-eterowe, grupy benzylo- i podstawione benzylo-eterowe, grupy alkilosililoeterowe, grupy zabezpieczające ester itp. Zastosowany rodzaj grupy zabezpieczającej hydroksyl nie jest krytyczny, o ile uzyskana pochodna grupy hydroksylowej jest trwała w warunkach późniejszej reakcji (późniejszych reakcji) zachodzących w innych pozycjach cząsteczki związku pośredniego i można ją selektywnie usunąć w odpowiednim momencie, bez uszkadzania pozostałej części cząsteczki obejmującej dowolną inną grupę zabezpieczającą hydroksyl (grupy zabezpieczające hydroksyl).

Chociaż wszystkie związki według wynalazku są przydatne jako aktywni agoniści receptora mGluR2, niektóre związki są szczególnie korzystne. Poniżej zdefiniowano korzystne klasy.

A) Związek jest wolną zasadą.

B) Związek występuje w formie soli.

C) Związek występuje w formie chlorowodorku.

D) Związek występuje w formie soli mezylanu.

E) Związek występuje w formie sól ezylanu.

F) Związek występuje w formie soli tosylanu.

Związki według wynalazku są przydatne do leczenia zaburzeń u ssaków, a korzystnie u ludzi.

Związki według niniejszego wynalazku można otrzymać stosując rozmaite sposoby, z których wybrane zilustrowano na poniższych Schematach. Kolejność poszczególnych etapów wymagana w celu otrzymania związków według wynalazku zależy od poszczególnego syntetyzowanego związku,

PL 221 489 B1 związku wyjściowego oraz względnej labilności podstawionych grup. W poniższych schematach pom inięto niektóre podstawniki przez wzgląd na przejrzystość, ale nie ogranicza to w jakikolwiek sposób zastosowania schematów. Fachowcy w dziedzinie zauważą, że podstawniki R¹⁵ i R¹⁶ oznaczają łańcuch boczny, odpowiedni do wytworzenia pożądanego metionylu.

Jeśli nie są dostępne w handlu, konieczne substancje wyjściowe w poniższych schematach można otrzymywać metodami, obejmującymi typowe techniki chemii organicznej i heterocyklicznej, techniki analogicznych syntez, znanych, strukturalnie podobnych związkach oraz sposoby opisane w syntezach i przykładach, obejmujące nowe sposoby.

Związki z zastrzeżenia 1 przekształca się w procesie enzymatycznym lub hydrolitycznym in vivo, do wytworzenia związków o wzorze II, jak pokazano powyżej, na Schemacie 1. W szczególności, krystaliczną postać związku z zastrzeżenia 1 można wytworzyć stosując szlak przedstawiony poniżej, na Schemacie 2.

gdzie X oznacza SO₂, R oznacza wodór, p oznacza liczbę 1.

PL 221 489 B1

Hydroliza zabezpieczonego di-esterowego związku peptydowego o wzorze (iii), z zastosowaniem odpowiedniej zasady, takiej jak wodorotlenek litu lub wodorotlenek sodu, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak IHF lub mieszanina THF/woda, daje zabezpieczony di-kwasowy związek peptydowy o wzorze (iv). Związek o wzorze (iv) można odbezpieczyć stosując odpowiedni kwas w odp owiednim rozpuszczalniku, takie warunki pozwalają na wytworzenie odpowiedniej soli z kwasem dikwasowego związku peptydowego, przedstawionej jako sól we Wzorze I, w postaci bezpostaciowego ciała stałego lub, bezpośrednio, krystalicznego ciała stałego, w którym X oznacza odpowiedni anion. W przypadku bezpostaciowego ciała stałego, później można prowadzić krystalizację z odpowiednich rozpuszczalników. Sole karboksylanowe można utworzyć przez wprowadzenie cząsteczek o charakterze kationowym stosując reagent, taki jak octan sodu.

Na koniec, dwubiegunowy związek można otrzymać metodą traktowania krystalicznej soli związku stosując odpowiednią zasadę.

Np. zabezpieczony di-kwasowy związek peptydowy o wzorze (iv), po potraktowaniu kwas gazowym chlorowodorem w odpowiednim rozpuszczalniku przekształca się w odbezpieczony chlorowodorek w postaci bezpostaciowego ciała stałego. Bezpostaciowy chlorowodorek można następnie krystalizować z acetonu i wody, z wytworzeniem krystalicznego chlorowodorku. W przypadku krystalicznego ciała stałego, które powstaje bezpośrednio, filtracja mieszaniny reakcyjnej pozwala uzyskać krystaliczną sól. Związek dwubiegunowy uzyskuje się metodą traktowania krystalicznego chlorowodorku wodorotlenkiem sodu; alternatywnie, traktowanie soli mezylanowej związku lub soli tosylanowej związku, z zastosowaniem wodorotlenku sodu także daje związek dwubiegunowy. Fachowcy w dziedzinie zauważą, że związek o wzorze I można wytworzyć stosując procedurę, w której wskazanych związków pośrednich nie wydziela się.

Na schemacie 3, X oznacza SO₂, R oznacza wodór, p oznacza liczbę 1.

Di-ester o wzorze (ii) acyluje się związkiem o wzorze III, stosując odpowiedni środek sprzęgający, z wytworzeniem zabezpieczonego di-estrowego związku peptydowego o wzorze (iii). Alternatywnie tę transformację można przeprowadzić stosując chlorek kwasowy związku o wzorze III.

Odpowiedni reagenty sprzęgające peptydy obejmują dicykloheksylokarbodiimid (DCC), 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimid (EDC), chloromrówczan izobutylu, chlorofosforan difenylu, 2-chloro-4,6-dimetoksy-1,3,5-triazynę (CDMT), chlorek bis(2-okso-3-oksazolidynylo)fosfinowy i heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksytris(dimetyloamino)fosfoniowy.

Schemat 4

H

PL 221 489 B1

Na schemacie 4, X oznacza SO₂, R oznacza wodór.

Na powyższym Schemacie 4, związek o wzorze II, di-kwas, traktuje się odpowiednim środkiem zabezpieczającym karboksyl, takim jak katalityczna ilość kwasu chlorowodorowego lub chlorku tionylu i metanol lub etanol, uzyskując odpowiedni di-ester o wzorze (ii). Alternatywnie, związek o wzorze II najpierw można potraktować środkiem zabezpieczającym atom azotu takim jak BOC₂O, z wytworzeniem związku z zabezpieczonym atomem azotu o wzorze (i). Następnie, związek o wzorze (i) można potraktować środkiem zabezpieczającym karboksyl, takim jak jodek metylu, w obecności zasady, takiej jak węglan potasu, po czym środkiem odbezpieczającym atom azotu, takim jak kwas chlorowod orowy lub kwas trifluorooctowy, z wytworzeniem związku o wzorze (ii).

Ponadto, fachowcy w dziedzinie zauważą, że zależnie od X, konieczne może być zastosowanie odpowiedniego środka zabezpieczającego. Np. jeśli X oznacza CR³R⁴, R³ oznacza hydroksyl i R⁴ oznacza atom wodoru, wówczas fachowcy w dziedzinie zauważą, że może być konieczne zastosowanie odpowiedniej grupy zabezpieczającej hydroksyl, przed rozpoczęciem reakcji według dowolnego z powyższych schematów.

Związki o wzorze II są znane w dziedzinie. Np. preparaty tych związków ujawniono w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki o nr 5688826 ('826) i 5958960 (w skrócie '960).

W sposobach ujawnionych wcześniej wprowadzono różne ulepszenia szlaków syntezy związków o wzorze II. Ulepszenia obejmują utlenianie siarki i alkoholu, jak również rozdzielanie różnych związków pośrednich z wykorzystaniem właściwości optycznych, jak opisano poniżej.

Pierwsze ulepszenie dotyczy konwersji ujawnionej w opisie patentowym US 5688826 w kolumnie 8, wersy 22-34 i w kolumnie 7, rozpoczynając od kolumny 33 (Wzór V) i obejmuje ono utlenianie związku o wzorze VII według patentu US 5688826.

Wzór (VII) według patentu US 5688826 z wytworzeniem związku o wzorze V według patentu US 568826.

Wzór (V) według patentu US 568826

Stwierdzono, że kompleks tritlenek siarki-pirydyna lub bezwodnik trifluorooctowy, w połączeniu z DMSO są korzystne w wielu sposobach utlenianie prowadzonych w dziedzinie.

Po drugie, w odniesieniu do wydzielania związku o wzorze III według patentu US 5688826,

Wzór (III) według patentu US 5688826, ₂ w którym R oznacza karboksyl, opisane go w kolumnie 8, w wersach 3-7 i w kolumnie 6, rozpoczynając od linii 1 (Wzór III), stwierdzono, że korzystne są (R)-a-metylobenzyloamina i chinina. (R)-a-metylobenzyloamina jest szczególnie korzystna.

Następnie, stwierdzono, że podczas utleniania siarczku o wzorze III według patentu '826, w którym X oznacza atom siarki, z wytworzeniem związku o wzorze III według patentu '826, w którym X oznacza sulfonyl, co opisano w patencie '826 w kolumnie 8, wersy 39-53, korzystne jest zastosowanie zasadowego układu wodnego i nadtlenku wodoru, w połączeniu z katalizatorem.

PL 221 489 B1

Poniższe przykłady ilustrują dodatkowo związki według niniejszego wynalazku oraz sposoby ich syntezy. Przykłady nie ograniczają pod żadnym względem zakresu niniejszego wynalazku nie należy ich interpretować w ten sposób. Wszystkie Doświadczenia prowadzono w atmosferze suchego azotu lub argonu. Jeśli nie wskazano tego inaczej, wszystkie rozpuszczalniki i reagenty zakupiono ze źródeł znanych na rynku i zastosowano w postaci otrzymanej. Suchy tetrahydrofuran (THF) można otrzymać przez oddestylowanie przed użyciem z sodu lub ketyl benzofenonu sodu. Widma protonowego jądrowego rezonansu magnetycznego ( H NMR) otrzymano stosując urządzenia Bruker Avance II bay-500 przy 500 MHz, Bruker Avance I bay-200 przy 200 MHz lub Varian Inova/Varian 300/Varian 400 przy 500 MHz. Spektroskopię masową z elektrorozpylaniem (ESI) przeprowadzono stosując instrument Agilent MSD/B, stosując jako fazę ruchomą układ acetonitryl/wodny roztwór octanu amonu. Spektroskopię masową z bombardowaniem wolnymi atomami (FABMS) przeprowadza się z zastosowaniem aparatu VG ZAB-2SE. Spektroskopię masową z desorpcją pola (FDMS) przeprowadza się stosując albo aparat VG 70SE albo aparat Varian MAI 731. Skręcalność optyczną mierzono stosując polarymetr typu Perkin-Elmer 241. Chromatograficzne rozdzielanie prowadzono w aparacie Waters Prep 500 LC, na ogół stosując liniowy gradient rozpuszczalników wskazanych w opisie. Reakcje are na ogół monitoruje się w celu wyznaczenia momentu ich zakończenia stosując chromatografię cienkowarstwową (ILC). Chromatografię cienkowarstwową przeprowadza się stosując płytki E. Merck Kieselgel 60 F254, o wymiarach 5 cm x 10 cm, o grubości 25 mm. Plamki obserwuje się stosując kombinację UV i wywoływania chemicznego (płytki zanurza się w roztworze molibdenianu cerowo amonowego [75 g molibdenianu amonowego i 4 g siarczanu ceru (IV) w 500 ml 10% wodnego roztworu kwasu siarkowego], a następnie ogrzewa na gorącej płytce). Szybką chromatografię przeprowadza się sposobem opisanym przez Still, i in. Still, Kahn i Mitra, J. Org. Chem., 43, 2923 (1978). Analizy elementarne zawartości węgla, wodoru i azotu wykonywano w urządzeniu Control Eguipment Corporation 440 Elemental Analyzer lub przeprowadzano w Universidad Complutense Analytical Centre (Facultad de Farmacia, Madrid, Spaln). Temperatury topnienia określano w otwartych szklanych kapilarach stosując urządzenie Gallenkamp, łaźnię z gorącym powietrzem lub urządzenie Buchi do oznaczania temperatury topnienia i wartości nie korygowano.

Skróty, symbole i terminy stosowane w przykładach mają następujące znaczenia.

Ac = acetyl

Anal. = analiza elementarna

ATR = atenuowane ogólne odbicie wewnętrzne

Bn lub Bzl = benzyl

Bu = butyl

BOC = t-butoksykarbonyl calcd = obliczono

D₂O = tlenek deuteru

DCC = dicykloheksylokarbodiimid

DCM = 1,2-dichlorometan

DIBAL-H = wodorek diizobutyloglinu

DMAP = 4-dimetyloaminopirydyna

DMF = dimetyloformamid

DMSO = sulfotlenek dimetylu

DSC = różnicowa kalorymetria skaningowa

EDC = chlorowodorek N-etylo-N'N'-dimetyloaminopropylokarbodiimidu

ES = Elektrorozpylanie

Et = etyl

EtOH = etanol

FAB = Bombardowanie szybkimi atomami (Spektroskopia Masowa)

FDMS = Widmo masowe desorpcji polowej

FTIR = Transformata Fouriera spektrometrii w podczerwieni

HOAt = 1-hydroksyio-7-azabenzotriazoi

HOBt = 1-hydroksybenzotriazoi

HPLC = Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa

HRMS = Widmo masowe o dużej rozdzielczości i-PrOH = izopropanol IR = Widmo podczerwieni

PL 221 489 B1

L = litr

Me = metyl

MeOH = metanol

MPLC = Średniociśnieniowa chromatografia cieczowa

Mp = Temperatura topnienia

MTBE = eter metylowy t-butylu

NBS = N-bromosukcynoimid

NMR = Jądrowy REZONANS magnetyczny

PC-TLC = Preparatywna odśrodkowa chromatografia cienkowarstwowa

Ph = fenyl

p.o. = podawanie doustnie i-Pr = izopropyl

Sól Rochelle = winian potasowo sodowy rt = temperatura pokojowa

SM = substancja wyjściowa

IBS = tert-butylodimetylosilil

TEA = trietyloamina

Temp. = temperatura

TFA = kwas trifluorooctowy

THF = tetrahydrofuran

ILC = chromatografia cienkowarstwowa t-BOC = tert-butoksykarbonyl

Procedura ogólna A

EDC sprzęganie pomiędzy aminami i N-BOC-(L)-aminokwasami

Wyjściowy ester amino-dialkilowy (związek o wzorze ii, Schemat 3) (1,0 równoważnik) zawiesza się w suchym dichlorometanie, w atmosferze azotu. Kolejno dodaje się odpowiedni N-Boc-(L)-aminokwas (1,5-2,0 równoważnika), EDC (1,5-2,0 równoważnika), HOBt (1,5-2,0 równoważnika) i dimetyloaminopirydynę (DMAP, 0,1-0,2 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej aż do zakończenia reakcji, co ocenia się metodą TLC, jeśli nie wskazano tego inaczej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu i przemywa kolejno nasyconym, wodnym roztworem NaHCO₃ i/lub wodnym roztworem NaHSO₄ i solanką. Po osuszeniu nad siarczanem sodu i zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, surową pozostałość (związek o wzorze iii) oczyszcza się metodą chromatografii na żelu krzemionkowym, stosując odpowiedni eluent (typowo mieszaninę octan etylu/heksany).

Procedura ogólna C

Sekwencja usunięcia grup zabezpieczających N-Boc i estrowej

Odpowiednią pochodną N-Boc diestrową peptydu (związek o wzorze iii, Schemat 2) (1,0 równoważnik) miesza się w mieszaninie THF/2,5N LiOH, 1:1 (10-20 równoważników), w temperaturze pokojowej przez czas do 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się H₂O i przemywa octanem etylu. Warstwę organiczną odrzuca się. Wartość pH fazy wodnej doprowadza się do 2 z 1 N roztwór HCl (jeśli to potrzebne, do fazy wodnej dodaje się NaCl w celu zwiększenia zdolności ekstrakcji) i pr odukt, kwas N-boc dikarboksylowy (związek o wzorze iv) ekstrahuje się dokładnie octanem etylu. Wszystkie części organiczne łączy się, przemywa solanką, suszy nad MgSO₄ i zatęża do suchej masy pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując pożądany produkt karboksylanowy w postaci spienionego ciała stałego. Produkt rozpuszcza się w octanie etylu i chłodzi do temperatury 0°C. Mieszaninę reakcyjną przedmuchuje się bezwodnym gazowym HCl aż do uzyskania nasycenia HCl. Uzyskaną mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze 0°C przez czas do 4 godzin. Całkowicie odbezpieczoną pochodną peptydową izoluje się w postaci jej chlorowodorku przez filtrację w atmosferze azotu albo metodą zatężenia mieszaniny reakcyjnej do suchej masy, a następnie rozcieranie z octanem etylu lub Et₂O i zatężenie do białego proszku. Ewentualnie, w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika i nadmiaru HCl, produkty roztwarza się w H₂O, zamraża i później liofilizuje, uzyskując chlorowodorek pożądanych produktów.

Synteza 1

Ester dietylowy kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

PL 221 489 B1

Do zawiesiny kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego (10 g, 42,5 mmola, ujawnionego w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5688826) w 100 ml 2B etanolu w temperaturze pokojowej dodano kroplami chlorek tionylu (15,5 ml,

212,6 mmola) w czasie 20 minut, a następnie przepłukano 40 ml etanolu. Zawiesinę ogrzano do tem₁ peratury wrzenia pod chłodnicą zwrotną i mieszano przez noc. Analiza metodą 500 MHz H NMR (CD₃OD) zatężonej próbki wykazała całkowite zużycie substancji wyjściowej i związku pośredniego, monoestru. Uzyskany roztwór pozostawiono do oziębienia do temperatury pokojowej, następnie zatężono do uzyskania galaretowatej pozostałości. Do galaretki dodano EtOAc (50 ml), a następnie mieszaninę zatężono do ciała stałego, po czym rozcieńczono dodatkowymi 94 ml EtOAc. Do mieszaniny dodano powoli 15% wodny roztwór węglanu sodu (70 ml) stosując mieszanie ręczne w celu uzyskania stopniowego rozpuszczania, uzyskując końcową wartość pH 7,95. Uzyskany osad z węglanem sodu przesączono przed ekstrakcją. Warstwę wodną ekstrahowano ponownie stosując EtOAc (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (1 x 100 ml), osuszono (MgSO₃), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując słabo żółty olej, który zestalił się, uzyskując tytułowy związek w postaci białawego ciała stałego (11,71 g, wydajność 95%).

Rekrystalizacja

Mieszaninę tytułowego związku (200 mg) w EtOAc (800 pl) ogrzano do temperatury 56°C, po czym nastąpiło rozpuszczenie. Po wymieszaniu przez 15 minut w temperaturze 56°C, do roztworu wkroplono heptan (1 ml). ogrzewanie wyłączono. Roztwór pozostawiono do oziębienia do temperatury 52°C, po czym wystąpiło wytrącanie. Po oziębieniu i dodatkowym rozcieńczeniu heptanem (600 pl), powstała zawiesina. Uzyskaną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed przesączeniem, przemyto heptanem (2 x 500 pl) i suszono w temperaturze 45°C przez noc, uzyskując 145 mg (odzysk 73%) tytułowego związku w postaci białego ciała stałego, Temperatura topnienia 80-83°C.

[α]²⁵ο-57,7° (c 1,04, CH₃OH).

500 MHz ¹H NMR (CD3CI3) δ 4,31 (q, 2H, J=7,0 Hz), 4,20 (m, 2H), 3,78 (d, 1H, J=15,0 Hz) , 3,36 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 2,93 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 2,81 (d, 1H, J=15,0 Hz), 2,46 (t, 1H, J=4,0), 1,34 (t, 3H, J=7,0), 1,30 (t, 3H, J=7,0).

¹³C NMR (125 MHz, CD₃Cl₃) 5 171,68, 168,57, 63,26, 59,96, 56,06, 43,78, 32,25, 22,49, 14,31,

14,25.

FTIR (ATR) 3364,15 (s), 1725,95 (s), 1304,91 (s), (s), 1200,84 (s), 1104,91 (s), 1022,99 (s), 896,45 (s), 851,21 (s) cm^-1.

Analiza obliczona dla C₁₁H₁₇NO₆S: C-45, 35; H-5,88; N-4,81. Znalezione: C-45,02; H-5,75; N-4,82.

Synteza 4

Ester dimetylowy kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

Do energicznie mieszanej zawiesiny kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego (10,0 g, 42,5 mmola, opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5688826) w MeOH (170 ml, 5°C) dodano kroplami chlorek tionylu (6,2 ml, 85,0 mmoli). Po dodaniu całości, mieszaninę reakcyjną pozostawiono do powolnego ogrzania do temperatury pokojowej, następnie ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 48 godzin. Części lotne usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość podzielono pomiędzy nasycony roztwór NaHCO3 (200 ml) i octan etylu (400 ml). Warstwy rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu (każdorazowo 2 x 400 ml). Połączone warstwy organiczne osuszono nad K₂CO₃ i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 8,10 g (30,8 mmola) tytułowego związku z wydajnością 72%.

PL 221 489 B1

[O]²³D= -84° (c = 0,5, MeOH).

Anal. obliczone dla C9H13NO6S: C-41,06; H-4,98; N-5,32. Znalezione: C-40,94; H-4,93; N-5,30.

MS (ES) m/z 264,0 [M+H]+.

Synteza 12

Ester dimetylowy kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-tert-butoksykarbonyloamino-4'-metylosulfanylobutyryloamino)-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

Proces prowadzono według procedury ogólnej A, stosując dostępną w handlu Boc-(h)-metioninę (0,71 g, 2,9 mmola) i ester dimetylowy kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego (0,5 g, 1,9 mmola, Synteza 4). Oczyszczenie przeprowadzono stosując PC-TLC (octan etylu/heksany), uzyskując 0,85 grama (90,5%) tytułowego związku.

[o]²³d= -20,4 (c=0,49, CHCI3).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 1,46 (9H, s), 1,69 (1H, s), 1,8-2,05 (2H,m), 1,9-2,0 (1H, m), 1,95-2,3 (3H, szeroki s), 2,0-2,2 (1H, m), 2,4-2,8 (2H, m), 2,48 (1H, t, J=4,0 Hz), 2,58 (1H, szeroki s), 2,92 (1H, d, J=14,7 Hz), 3,01 (1H, dd, 3=4A, 7,0 Hz), 3,42 (1H, dd, J=3,7, 7,3 Hz), 3,78 (3H, s), 3,87 (3H, s), 4,22-4,24 (2H, m), 5,06 (1H, d, J=7,7 Hz), 7,27 (1H, s).

MS (ES) m/z 493, 1 [M-1]^-.

Synteza 53

Ester dietylowy kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

Do zawiesiny kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego (10 g, 42,5 mmola, opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5688826) w 100 ml 2B etanolu w temperaturze pokojowej (15,5 ml, 212,6 mmola) kroplami dodano chlorek tionylu w czasie 20 minut, następnie mieszaninę przepłukano 40 ml etanolu. Zawiesinę ogrzano do temperatury wrzenia pod chłodnicą zwrotną i Mieszano przez noc. Uzyskany roztwór oziębiono do temperatury pokojowej i zatężono do galaretowatej pozostałości. Do tej pozostałości dodano octan etylu (50 ml), a następnie mieszaninę rozcieńczono dodatkowo 94 ml octanu etylu. Do mieszaniny powoli dodano 15% wodny roztwór węglanu sodu (70 ml) z mieszaniem ręcznym, uzyskując stopniowe rozpuszczenie i otrzymując końcową wartość pH 7,95. Mieszaniną przesączono i warstwy rozdzielono. Warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (1 x 100 ml), osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując tytułowy związek w postaci słabo żółtego oleju, który zestalił się w białawe ciało stałe (11,71 g, wydajność 95%).

Temperatura topnienia 80-83°C.

[a]²⁵D -57,7 (c 1,04, CH₃OH).

500 MHz ¹H NMR (CDCI₃) δ 4,31 (q, 2H, J=7,0 Hz), 4,20 (m, 2H), 3,78 (d, 1H, J=15,0 Hz), 3,36 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 2,93 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 2,81 (d, 1H, J=15,0 Hz), 2,46 (t, 1H, J=4,0), 1,34 (t, 3H, J=7,0), 1,30 (t, 3H, J=7,0).

¹³C NMR (125 MHz, CD₃CI₃) δ 171,68, 168,57, 63,26, 59,96, 56,06, 43,78, 32,25, 22,49,

14,31, 14,25.

FTIR (ATR) 3364,15 (s), 1725,95 (s), 1304,91 (s), (s), 1200,84 (s), 1104,91 (s), 1022,99 (s),

896,45 (s), 851,21 (s) cm^-1.

PL 221 489 B1

Analiza obliczono dla C-H-NO₆S: C-45,35; H-5,88; N-4,81. Znaleziono: C-45,02; H-5,75;

N-4,82.

Synteza 54

Ester dietylowy kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0jneksano-4,6-dikarboksylowego

Do klarownego roztworu N-Boc-L-metioniny (32,64 g, mmola) w 110 ml chlorku metylenu dodano N-metylomorfolinę (14,4 ml, 130,9 mmola), w temperaturze -22°C w atmosferze azotu, a następnie dodano kroplami chloromrówczan izo-butylu (17 ml, 130,9 mmola) w czasie 7 minut, utrzymując temperaturę mieszaniny reakcyjnej na poziomie -22°C. Po zakończeniu dodawania, utworzyła się rzadka zawiesina. Tę mieszaninę mieszano w temperaturze -22 do -26°C przez 30 minut. Dodano roztwór estru dietylowego kwasu (1 R,4S,5S,6S)-4-amino-2,2-diokso-2A,6-tia-bicyklo[3.1.0]-heksano-4,6-dikarboksylowego (35,65 g, 122,4 mmola, Synteza 53) w 107 ml chlorku metylenu, w czasie 15 minut, po czym mieszaninę przemyto 36 ml chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną usunięto z łaźni chłodzącej i mieszano w temperaturze pokojowej przez 70 minut. Do roztworu dodano 51 ml 5N kwasu chlorowodorowego, następnie warstwy rozdzielono. Warstwę wodną ekstrahowano ponownie chlorkiem metylenu (2 x 107 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (1 x 107 ml), osuszono (MgSO₄), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 65,82 g (wydajność masowa 103%) tytułowego związku, w postaci białej pianki.

[α]²⁵ο -12,7 (c 1,2, CH3OH).

500 MHz ¹H NMR (CDCI3) δ 7,53 (s, 1H), 5,06 (d, 1H, J=8,0 Hz), 4,34-4,20 (m, 6H), 3,41 (dd, 1H, J=4,0, 7,0), 2,97-2,89 (m, 2H), 2,64-2,59 (m, 2H, J=4,0), 2,12-1,89 (m, 5H), 1,47 (s, 9H), 1,32 (t, 6H, J=7,0).

¹³C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 172,53, 169,03, 167,88, 156,00, 80,62, 63,45, 62,56, 60,20, 55,33, 52,78, 42,81,31,52, 31,38, 30,12, 28,4 9, 22,69, 15,44, 14,23, 14,143.

FTIR (ATR) 3341,88 (w), 2979,38 (s), 1733,03 (s), 1674,92 (s), 1514,58 (s), 1315,80 (s), 1255,15 (s), 1161,47 (s), 1142,63 (s), 1025,68 (s), 854,85 (s., 763,53 (s) cm^-1.

Synteza 55 sól monosodowa kwasu (1 R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

Do roztworu estru dietylowego kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-di-karboksylowego (58,95 g, 112,8 mmola, teoretycznie, Synteza 54) w 141 ml tetrahydrofuranu dodano 141 ml (282 mmole) 2N roztworu wodorotlenku sodu w temperaturze pokojowej. Mieszaninę mieszano energicznie w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Roztwór rozcieńczono 141 ml eteru metylowo-tert-butylowego, po czym warstwy rozdzielono. Następnie warstwę wodną rozcieńczono 141 ml wody i dodano kroplami stężony kwas chlorowodorowy w celu obniżenia wartości pH do 4,46. Mieszaninę mieszano przez 10 minut, uzyskując rzadką zawiesinę. Do zawiesiny dodano więcej stężonego kwasu chlorowodorowego w celu obniżenia wartości pH do 1,4 (w sumie zastosowano 17 ml stężonego HCl, 204 mmoli). Po wymieszaniu przez 2 godziny, zawiesinę przesączono. Placek filtracyjny przemyto wodą (2 x 118 ml) i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C przez 1 godzinę, przed przeniesieniem na szalkę. Placek filtracyjny suszono ponownie pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C przez 16 godzin i w temperaturze 58°C przez 5 godzin, uzyskując 52,96 g (96% wydajności masowej) tytułowego związku w postaci białego ciała stałego.

Temperatura topnienia (rozkład) 258°C.

[o]²⁵d -25,2 (c 1,03,H₂O).

500 MHz ¹H NMR (D₂O) δ 4,07-4,01 (m, 2H), 3,45-3,43 (m, 1H), 3,11 (d, 1H, J=15,0 Hz), 2,85 (m, 1H), 2,71 (s, 3H), 2,47-2,35 (m, 3H), 1,96-1,90 (m, 4H), 1,78-1,72 (m, 1H), 1,28 (s, 9H).

PL 221 489 B1 ¹³C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 174,45, 173, 58, 172,80, 157,46, 81,71, 61,41, 55,04, 53,24, 42,29, 31,71,30,85, 29,41,27,79, 23,65, 14,41.

FTIR (ATR) 3287,62 (s), 1698,00 (s), 1528,91 (s), 1327,36 (s), 1283,74 (s), 1245,90 (s), 1174,81 (s), 1109,06 (s), 1053,05 (s), 874,27 (s), 808,95 (s) cm^-1.

Synteza 56

Kwas (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo-[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowy

Do roztworu estru dietylowego kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanoilo)-amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0)heksano-4,6-dikarboksylowego (166,15 g, 318 mmoli, Synteza 54) w 480 ml tetrahydrofuranu dodano 397 ml (795 mmola) 2N roztworu wodorotlenku sodu w temperaturze pokojowej. Mieszaninę mieszano energicznie w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, po czym mieszanina reakcyjna stała się homogeniczna, otrzymano klarowny słabo żółto/zielony roztwór. Mieszaninę mieszano przez dodatkowe dwie godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór rozcieńczono 480 ml eteru metylowo-tert-butylowego, następnie warstwy rozdzielono. Warstwę wodną dodano kroplami do roztworu stężonego kwasu chlorowodorowego (71,5 ml, 858 mmoli) w wodzie (960 ml). Dodano octan etylu (500 ml), a następnie pozostałą część warstwy wodnej, uzyskując w wyniku emulsję, a następnie mieszaninę rozcieńczono octanem etylu (460 ml). Emulsję mieszano przez 40 minut, przesączono i przemyto wodą (2 x 250 ml). Warstwy przesączu rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano ponownie octanem etylu (500 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką (75 ml), osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 125,26 g (wydajność skorygowana 84%) tytułowego związku w postaci białej pianki.

Synteza 63 (6S)-4-tiabicyklo[3.1.0]heks-2-eno-6-karboksylan etylu

Do trójszyjnej kolby o pojemności 5 litrów, zaopatrzonej w mieszadło, termoparę i teflonową rurkę dozującą oraz wlot N_x wprowadzono 2000 ml tiofenu (d = 1,05 g/ml, 25,0 moli na początku i zwiększając do 45 moli przez dodanie roztworu diazooctanu etylu w tiofenie, 17,1 równoważnika w przeliczeniu na ogólną dodaną ilość diazooctanu etylu i nie korygowaną z uwzględnieniem czystości EDA, 19,0 równoważników w przeliczeniu na skorygowaną czystość diazooctanu etylu). Do tego dodano, w atmosferze azotu, 0,968 g Rh₂ (oktanonian)₄ (1,24 mmola, 0,0472% molowych, w przeliczeniu na g diazooctanu etylu nie korygowane z uwzględnieniem czystości, 0,052% molowych w przeliczeniu na mole czystego diazooctanu etylu, Johnson Mathey: nr serii 059255001). Zawiesinę ogrzano do temp eratury 46°C i mieszano w temperaturze 46°C przez 10 minut, uzyskując rozpuszczenie do zielonego roztworu. Do roztworu dodano pompą wyporową roztwór 300 g diazooctanu etylu (90% czystości, 2,63 moli, 2,37 moli pura, 1,00 równoważnik, Aldrich: nr serii 17603PI) rozpuszczono w 1600 ml tiofenu. Szybkość dodawania była taka, aby sumaryczny czas dodawania wynosił 8 godzin; mała szybkość dodawania hamuje powstawanie estrów etylowych maleinianu i fumaranu. Gdy diazooctan etylu wyczerpał się (w przybliżeniu trzydzieści minut), ciemnobursztynową mieszaninę reakcyjną (3,985 g) ochładza się do temperatury 23°C. Mieszaninę reakcyjną podzielono na porcje i większą część (3,240 g z 3,985 g ogółem = 81,3%) zatężono bezpośrednio do oleju. Surowy produkt przepuszczono przez urządzenie do destylacji membranowej pod ciśnieniem 1,5 tora i w temperaturze 23°C w celu odgazowania produktu i w celu usunięcia pozostałej ilości tiofenu. Następnie produkt destylowano w temperaturze 120°C i pod ciśnieniem 1,3 tora. Tytułowy związek (słabo żółty) zebrano w dwóch frakcjach,

PL 221 489 B1

155,0 g i 32,2 g. Analiza metodą HPLC określiła czystość 78% i 76% odpowiednio dla dwóch porcji. Krystalizację destylatu z powyższego produktu przeprowadzono przez rozpuszczenie w metanolu (2 ml na 1 g destylatu) i oziębienie do temperatury -10°C, po czym roztwór zaszczepiono, gdyż nie wystąpił wzrost kryształów. Gdy wzrost kryształów rozpoczął się, mieszaninę ochłodzono do temperatury -45°C i mieszano przez 2-3 godziny, przesączono i przemyto zimnym (-45°C) metanolem (1 x 1 ml na 1 g destylatu). Substancję osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 24°C, uzyskując tytułowy związek w postaci białego do białawego ciała stałego z 80-85% odzysku i czystością >98%.

Synteza 64 (4S,6S)-4-hydroksylo-2-tiabicyklo[3.1.0]heksano-6-karboksylan etylu

Do roztworu (6S)-4-tiabicyklo[3.1.0]heks-2-eno-6-karboksylanu etylu (22,2 g, 131 mmoli) w 136 ml tetrahydrofuranu w atmosferze azotu w temperaturze 0°C dodano kompleks borowodór-THF (98 ml, 98 mmoli) w czasie 15-20 minut. Po wymieszaniu w temperaturze 0°C przez 30 minut, mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury 15°C i mieszano aż do zakończenia reakcji, co potwierdzono metodą HPLC (1,5-2 godzin). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 0°C i przeniesiono w czasie 10-15 minut do 111 ml ochłodzonego wstępnie (0°C) 1N buforu o wartości pH 7, utrzymując temperaturę na poziomie 0°C. Do mieszaniny dodano monohydrat nadb oranu sodu (15,6 g, 157 mmoli) w postaci ciała stałego w pięciu porcjach tak, aby temperatura utrz ymywała się poniżej 20°C. Roztwór pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez 1 godzinę, następnie dodano 222 ml wody.

Po wymieszaniu przez 2 godziny, reakcję nadtlenków zatrzymano przez dodanie pentahydratu tiosiarczanu sodu (9,7 g) rozpuszczonego w 24 ml wody, po czym mieszano przez 10 minut. Mieszaninę ekstrahowano octanem etylu (2 x 222 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto nasyconym, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (1 x 222 ml), a następnie solanką (1 x 222 ml), po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do suchej masy. Surowy produkt rozpuszczono w 1,2-dichloroetanie (1 ml na 1 g surowego oleju) i wprowadzono do kolumny wypełnionej żelem krzemionkowym (4 g żelu krzemionkowego na 1 g surowego oleju, zawieszono i pakowano w 15% mieszaninie octan etylu-heptan). Kolumnę eluowano 15% mieszaniną octan etylu-heptan aż stwierdzenia obecności produktu metodą TLC, po czym rozpuszczalnik zmieniono na 50% mieszaninę octan etylu heptan. Wszystkie frakcje zawierające tytułowy produkt połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do oleju. Wydajność ogólna mieściła się w zakresie 55-65%.

Synteza 65 (6S)-4-okso-2-tiabicyklo[3.1.0]heksano-6-karboksylan etylu

Do roztworu sulfotlenku dimetylu (33,4 ml, 471 mmoli) w 194 ml chlorku metylenu w temperaturze -70°C powoli dodano roztwór bezwodnika trifluoroctowego (33,2 ml, 235 mmoli) w 73 ml chlorku metylenu, w czasie 30 minut (temperaturę utrzymywano poniżej -66°C). Po wymieszaniu przez 20 minut, dodano roztwór (4S,6S)-4-hydroksylo-2-tiabicyklo[3.1.0]heksano-6-karboksylanu etylu (34,1 g, 181 mmola) w 194 ml chlorku metylenu w czasie 60 minut tak, aby temperatura utrzymywała się poniżej -60°C. Po wymieszaniu przez 1 godzinę, mieszaninę reakcyjną potraktowano trietyloaminą (75,7 ml, 543 mmoli) w czasie 35 minut tak, aby temperatura pozostawała poniżej -50°C. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono z mieszaniem przez dodatkową 1 godzinę, po czym łaźnię chłodzącą usunięto i dodano 400 ml 2N roztworu kwasu chlorowodorowego. Po ogrzaniu do temperatury 0°C, warstwy rozdzielono i warstwę organiczną przemyto 2N roztworem kwasu chlorowodorowego (1 x 300 ml), 1N wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (1 x 670 ml) i wodą (1 x 300 ml), następnie osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do czerwonego oleju, który

PL 221 489 B1 zestalił się po odstaniu. Surowy produkt przepuszczono przez warstwę żelu krzemionkowego (2 g na 1 g wyjściowego alkoholu pakowanego chlorkiem metylenu) i eluowano chlorkiem metylenu (200-300 ml). Wszystkie frakcje zawierające produkt zebrano i zatężono, uzyskując tytułowy związek w postaci pomarańczowo/brunatnego ciała stałego. Typowa wydajność skorygowana mieści się w zakresie 85-90%.

Synteza 66

Kwas (6S,11S)-8,10-diokso-2-tiaspiro[bicyklo[3.1.0]heksano-4,5'-imidazolidyno]-6-karboksylowy

Węglan amonu (2,46 g, 25,6 mmola) i cyjanek potasu (0,817 mg, 12,5 mmola) połączono w 19,9 ml metanolu i pozostawiono z mieszaniem przez 30 minut. Mieszaninę potraktowano roztworem (6S)-4-okso-2-tiabicyklo[3.1.0]heksano-6-karboksylanu etylu (2,39 g, 12,8 mmola) w 19,9 ml metanolu i mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury 30°C i mieszano przez 23 godziny. Części lotne odparowano i pozostałość rozpuszczono w 2,75 N roztworze wodorotlenku sodu (13,1 ml) i mieszano przez 1 godzinę. Po rozcieńczeniu 13,1 ml wody, wartość pH obniżono do 3,1 stężonym kwasem chlorowodorowym i mieszaninę zaszczepiono kwasem (6S,11R)-8,10-diokso-2-tiaspiro[bicykloheksano-4,5'-imidazolidyno]-6-karboksylowym. Wartość pH obniżono do 1,0 i zawiesinę ochłodzono do temperatury 0°C i mieszano przez 1,25 godziny. Brązowe ciało stałe zebrano, przemyto zimną wodą (2,3 ml i 0,8 ml) i suszono przez noc pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C, uz yskując 2,00 g (55% skorygowane z uwzględnieniem czystości) kwasu (6S,11R)-8,10-diokso-2-tiaspiro[bicyklo[3.1.0]heksano-4,5'-imidazolidyno]-6-karboksylowego. Przesącz rozcieńczono 50 ml octanu etylu i potraktowano 18 g chlorku sodu. Po wymieszaniu przez 15 minut, warstwy rozdzielono i następnie warstwę wodną przemyto octanem etylu (2 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne osuszono siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do zawiesiny (około 5 ml), do której dodano eter metylowo-tert-butylowy (25 ml), po czym mieszano przez noc. Ciało stałe zebrano, przemyto eterem metylowo-tert-butylowym i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C przez 2 godziny, uzyskując 0,64 g (10% skorygowane z uwzględnieniem czystości) tytułowego związku w formie mieszaniny diastereomerów 1:1 hydantoiny. Tę drugą część hydantoiny połączono z pierwszą częścią i poddano następnemu etapowi.

Rozdzielanie

Do zawiesiny racemicznej kwasu (15 g, 65,7 mmola, około stosunek diastereomerów hydantoiny 6:1) w 300 ml etanolu i 75 ml wody dodano (R)-fenyloglicynol (9,0 g, 65,7 mmola). Mieszaninę ogrzano do temperatury około 80°C w celu uzyskania rozpuszczenia. Ciemny roztwór pozostawiono do powolnego ochłodzenia i wytrącanie obserwowano w temperaturze 40-45°C. Następnie zawiesinę ochłodzono do temperatury 0°C i pozostawiono przez 1 -1,5 godziny. Ciało stałe zebrano, przemyto (mieszając) mieszaniną etanol:woda 4:1 (1 x 60 ml, wstępnie ochłodzoną do temperatury 0°C) i s uszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 65°C przez 12-24 godziny. Typowe wydajności rozdzielania soli mieszczą się w zakresie 37-45% z >98% de i >98% nadmiaru enencjomerycznego. Rozdzieloną sól rozpuszczono w 6 objętościach (ml na g) wody, następnie potraktowano 1,1 równoważnika stężonego HCl. Zawiesinę ochłodzono do temperatury 0°C i pozostawiono z mieszaniem przez 1 godzinę, po czym przefiltrowano, przepłukano 1 objętością zimnej wody i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 60°C. Typowe wydajności tytułowego związku wynosiły >90% z % de i % nadmiaru enencjomerycznego >99%.

Synteza 67

Kwas (6S,11S)-2,2,8,10-tetraokso-2-tiaspirorbicyklo[3.1.0]-heksano-4,5'-imidazolidyno]-6-karboksylowy

PL 221 489 B1

Do mieszaniny 6,8 ml wody, 0,7 ml 50% wodnego roztworu wodorotlenku sodu i 186 mg (0,74 mmola) kwasu wolframowego dodano kwas (6S,11S)-8,10-diokso-2-tiaspiro[bicyklo[3.1.0]heksano-4,5'-imidazolidyno]-6-karboksylowy (3,4 g, 14,9 mmola). Uzyskany roztwór ogrzano do temperatury 50°C i potraktowano 35% nadtlenku wodoru (7,7 ml, 74,5 mmola) powoli, w czasie 66 minut. Następnie mieszaninę reakcyjną pozostawiono z mieszaniem w temperaturze 47-48°C przez 5 godzin, po czym oziębiono ją do temperatury 0°C, przesączono przez cienką warstwą Celitu i płukano zimną wodą (1 x 2 ml). Przesącz ogrzano do temperatury 50°C i potraktowano stężonym kwasem chlorowodorowym do wartości pH = 1,5. Zawiesinę pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej i mieszano przez noc. Po oziębieniu do temperatury 0°C, zawiesinę przesączono, przemyto zimną wodą (2 x 2 ml) i suszono pod silnie zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 55°C do stałej masy, uzyskując 3,19 g (82%) tytułowego związku, w postaci białego ciała stałego:

[α]²⁵ο -48,6 (c, 1,19, 1N NaOH).

Temperatura topnienia 275°C (szary), 295°C (brunatny).

500 MHz ¹H NMR (DMSO-d6) δ 13,15 (szeroki s, 1H), 10,99 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 3,85 (d, 1H, J=15,0 Hz), 3,74 (dd, 1H, J=7,0, Hz), 3,03 (d, 1H, J=15,5 Hz), 2,80 (dd, 1H, 7,0, 4,0 Hz), 2,39 (t, 1H, J=4,0Hz).

NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 174,39, 169,87, 156,35, 62,67, 52,59, 44,16, 31,69, 21,92;

FTIR (KBr) 3317 (s), 3250 (s), 3211 (s), 3086 (w), 1791 (s), 1742 (s), 1713 (s), 1327 (s), 1192 (s), 1140 (s) cm^-1.

Analiza Obliczona dla C₈H₈N2O6S: C-36,93; H-3,10; N-10,77. Znalezione: C-36,76; H-3,07; N-10,60.

Synteza 68

Kwas (1 R,4S,5S,6S)-4-amino-(2-sulfonylobicyklo[3.1.0]heksano)-4,6-dikarboksylowy

Do reaktora Parr'a ze stali nierdzewnej dodano kwas (6S,11S)-2,2,8,10-tetraokso-2-tiaspiro[bicyklo[3.1.0]heksano-4,5'-imidazolidyno]-6-karboksylowy (2,50 g, 9,60 mmola) i 2N roztwór wodorotlenku sodu (24,0 ml, 48,0 mmoli). Po ogrzaniu mieszaniny do temperatury 95°C i mieszaniu przez 21 godzin, mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i potraktowano aktywowanym węglem drzewnym (1,25 g). Mieszaninę przesączono przez celit i przesącz zatężono do 17 g i rozcieńczono H₂O, uzyskując masę 24 g. Wartość pH obniżono do 6,5 stosując stężony HCl i mieszaninę ogrzewano do 62°C. Po obniżeniu wartości pH do 2,5 stosując stężony HCl, wystąpiła krystalizacja. Zawiesinę pozostawiono do ochłodzenia do temperatury 30°C przed uregulowaniem wartości pH do 1,7 i jej temperaturę obniżono do 5°C. Zawiesinę pozostawiono w tej temperaturze przez 18 godzin, ciało stałe zebrano i przemyto zimną H₂O (2 x 2,9 ml). Białe ciało stałe osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C, uzyskując tytułowy związek (1,81 g, 80%). Tytułowy związek zawieszono w 10 objętościach wody i ogrzano do temperatury 85°C na 3-4 godziny, ochłodzono do temperatury pokojowej, mieszano przez 2-3 godziny, przesączono i przemyto wodą (1 x 1 objętość). Odzysk wynosi >95%.

P r z y k ł a d 5

Chlorowodorek kwasu (1 R,4S,5S,6S)-4-(2'S-amino-4'-metylosulfanylo-butyloamino)-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]-heksano-4,8-dikarboksylowego

PL 221 489 B1

Proces prowadzono według procedury ogólnej C, stosując ester dimetylowy kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-tert-butoksykarbonylo-amino-4'-metylosulfanylo-butyryloamino)-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0.]heksano-4,6-dikarboksylowego (0,77 g, 1,6 mmola, Synteza 12), uzyskując 0,41 g (54,9%) tytułowego związku.

[α] d = +4 (c=1,00, MeOH).

¹H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 2,1-2,2 (2H, m), 2,13 (3H, s), 2,47 (1H, t, J=4,4 Hz), 2,56-2,63 (2H, m), 3,02 (1H, dd, J=4,0, 7,0 Hz), 3,12 (1H, d, J=14,7 Hz), 3,52 (1H, dd, J=3,3, 6,6 Hz), 3,98 (1H, t, J=6,2 Hz), 4,14 (1H, d, J=14,7 Hz).

HRMS obliczone dla C12H19N2O7S2, 367,0634.

Znaleziono: 367,0634.

P r z y k ł a d 41

Monohydrat kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

Zawiesinę soli monosodowej kwasu (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego (110,04 g, 225,3 mmola, Synteza 55) w acetonie (110 ml) i wodzie (550 ml) ogrzano do temperatury 55°C. Do mieszanej zawiesiny dodano kroplami stężony kwas chlorowodorowy (56 ml, 675,8 mmola) w celu uzyskania stopniowego rozpuszczenia. Po zakończeniu dodawania, roztwór mieszano w temperaturze 55°C przez 2 godziny. Ogrzewanie usunięto i roztwór pozostawiono do oziębienia do temperatury pokojowej. Roztwór przesączono i przemyto 20 ml wody. Do roztworu powoli dodano 2N roztwór wodorotlenku sodu (165 ml, 330 mmoli) w celu podwyższenia wartości pH do 1,71 po czym wystąpiło wytrącanie. Utworzoną rzadką zawiesinę mieszano przez 10 minut; i wartość pH spadła do 0,98. Dodano więcej 2N roztworu wodorotlenku sodu (62 ml, 124 mmole) w celu uzyskania podwyższenia wartości pH zawiesiny do 3,06, po czym mieszano przez 3 godziny, uzyskując końcową wartość pH 3,24. Zawiesinę przesączono, przemyto wodą (2 x 165 ml) i suszono w temperaturze 45°C przez 15 godzin, uzyskując 73,27 g (wydajność masowa 85%) tytułowego związku w postaci białego ciała stałego.

Temperatura topnienia (DSC) 203°C.

[a]²⁵D +13,4 (c 1,19, 1N roztwór HCl).

500 MHz ¹H NMR (D2O) δ 3,99 (t, 1H, J=6,0 Hz), 3,93 (d, 1H, J=15,0 Hz), 3,50 (dd, 1H, J=1,0, 4,0 Hz), 3,12 (d, 1H, J=15,0 Hz), 2,95 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 2,48 (t, 2H, J=8,0 Hz), 2,33 (t, 1H, J=4,0), 2,09-1,98 (m, 5H).

¹³C NMR (125 MHz, D2O) δ 173,50, 172,60, 169,18, 61,66, 54,76, 52,19, 42,55, 31,70, 30,10, 28,09, 23,53, 14,14.

FUR (AIR) 3558, 54 (s), 3024, 05 (s), 2959, 87 (s), 1748,83 (s), 1692,89 (s), 1681,99 (s),

1617,50 (s), 1567,63 (s), 1497,65 (s), 1314,11 (s), 1282,22 (s), 1263,26 (s), 1239,01 (s), 1101,46 (s),

884,62 (s), 809,95 (s), 773,46 (s) cm^-1.

Analiza Obliczona dla C₁2H₁₈N2O7S2*H2O: C-37, 49; H-5,24; N-7,29. Znalezione: C-37,34;

H-5,04; N-7,15.

PL 221 489 B1

P r z y k ł a d 42

Tosylan kwasu (1 R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo [3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

Mieszaninę kwasu (1 R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanonylo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego (118,09 g skorygowana, 253 mmole, Synteza 56) i monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego (54 g, 278 mmola) w toluenie (1180 ml) ogrzano do 75°C, co spowodowało powstanie gęstej zawiesiny. Zawiesinę mieszano w temperaturze wrzenia przez 165 minut. Ogrzewanie usunięto i umożliwiono oziębienie zawiesiny do temperatury pokojowej, z mieszaniem przez noc. Zawiesinę przesączono, przemyto toluenem (3 x 240 ml) i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C przez 22 godziny, uzyskując 134,92 g (wydajność 98%) tytułowego związku.

Temperatura topnienia (DSC) 255°C.

[α]²³ο +8,3 (c 1,2, CH3OH).

500 MHz ¹H NMR (CD3OD) δ 7,71 (d, 2H, J=8,0 Hz), 7,24 (d, 2H, J=8,0 Hz), 4,14 (d, 1H, J=15 Hz), 4,00 (t, 1H, J=6,0 Hz), 3,54 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 3,13 (d, 1H, J=15 Hz), 3,01 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 2,60 (t, 2H, J=8,0 Hz), 2,49 (t, 1H, J=4,0 Hz), 2,37 (s, 3H), 2,19-2,12 (m, 5H).

¹³C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 170,4 9, 169,69, 168,99, 142,18, 140,67, 182,73, 125,79, 60,26, 54,76, 52,21,42,44, 30,90, 30,77, 27,20, 22,33, 20,17, 13,96.

FTIR (ATR) 3091,19 (w), 1730,91 (s), 1668,22 (s), 1563,97 (s), 1518,49 (s), 1312,69 (m), 1247,46 (s), 1212,05 (s), 1156,33 (s), 1123,09 (s), 1035,95 (s), 1011,36 (s), 892,41 (s), 814,02 (s), 683,69 (s) cm^-1.

P r z y k ł a d 43

Mezylan kwasu (1 R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego

Zawiesinę kwasu (1 R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-(tert-butoksykarbonylo)aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego (1,08 g, 2,31 mmola, Synteza 56) w 13 ml propionitrylu ogrzano do temperatury 85°C. Do zawiesiny dodano wodę (540 pl), następnie kroplami dodano kwas metanosulfonowy (225 pl, 3,47 mmola). Zawiesinę mieszano przez 90 minut. Ogrzewanie usunięto i dodano propionitryl (30 ml). Zawiesinę ochłodzono do temperatury pokojowej i mieszano przez 90 minut. Przesączono, przemyto propionitrylem (3 x 2,7 ml) i suszono w temperaturze 45°C przez noc, uzyskując 1,04 g (97%) tytułowego związku.

Temperatura topnienia (DSC) 244°C.

[a]²⁵D +10,2 (c 1,16, CH₃OH).

500 MHz ¹H NMR (CD₃OD) δ 4,16 (d, 1H, J=15 Hz), 4,00 (t, 1H, J=6,0 Hz), 3,54 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 3,15 (d, 1H, J=15 Hz), 3,01 (dd, 1H, J=4,0, 7,0 Hz), 2,71 (s, 3H), 2,61 (t, 2H, J=8,0), 2,51 (t, 1H, J=4,0), 2,20-2,14 (m, 5H).

¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ 170,50, 169,71, 169,00, 60,27, 54,78, 52,18, 42,43, 38,35,

30,90, 30,78, 28,20, 22,35, 13,96.

FTIR (ATR) 3055,57 (m), 1725,90 (s), 1693,60 (s), 1527,33 (s), 1528,96 (s), 1320,89 (s),

1176,86 (s), 1152,70 (s), 1118,55 (s), 1051,42 (s), 816,49 (s), 786,63 (s) cm^-1.

PL 221 489 B1

Analiza Obliczona dla C₁₂H₁₈N₂O7S₂«CH₄O₃S: C-33,76; H-4,79; N-6,06. Znalezione: C-33,98; H-4,82; N-5,98.

Związki typu proleku według niniejszego wynalazku można porównać z odpowiednim związkiem macierzystym, stosując różne testy wychwytu komórkowego. W wyniku tych testów można otrzymać dane porównawcze, umożliwiające fachowcom w tej dziedzinie identyfikację związków, które łatwo wnikają do komórki, zapewniając lepszą ekspozycję. Dwa z takich testów obejmują test wychwytu Gly-Sar i test Caco-2 opisane poniżej.

Test wychwytu Gly-Sar

Stwierdzono, że niektóre podawane doustnie peptydomimetyki są absorbowane poprzez układ jelitowego transportu peptydów. Yang i in., Pharm. Res. 16(9) (1999). W szczególności badano jelitowy transporter peptydów hPepT1 w zakresie ekspresji hamowania wychwytu peptydów i odpowiedni poziom jego rozpoznawania w komórce. Meredith, i in., Eur. J. Biochem., 267, 3723-3728 (2000). Ponadto, charakteryzując mechanizm jelitowej absorpcji aminokwasów, jako cel przyjęto transporter hPepT1 , jako skuteczną strategię identyfikacji zwiększenia absorpcji leku po podaniu doustnym. Han i in., Polim. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polim. Chem) 40(1): 259-260 (1999); Sawada, i in., J. Pharmacol. Exp. Ther., 291(2): 705-709 (1999).

W opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5849525 ujawniono sposoby pomiaru poziomu powinowactwa związków według niniejszego wynalazku do transportera hPepT1.

Na przykład do badania związków według niniejszego wynalazku można zastosować trwale transfekowane komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) z nadekspresją transportera hPepT1. W komórkach CHO monitoruje się wówczas wychwyt Gly-Sar, który, w obecności związków typu proleku według niniejszego wynalazku, jeśli jest silniejszy niż, gdy komórka nie zawiera związków typu proleku według niniejszego wynalazku, wskazuje na aktywność agonistyczną; a gdy wychwyt związków typu proleku według niniejszego wynalazku jest słabszy od wychwytu bez związków typu proleku według niniejszego wynalazku, wskazuje na aktywność hamującą. Związki według niniejszego wynalazku na ogół mają wartości EC₅₀ poniżej 5 mM.

Test Caco-2

Inną metodą pomiaru wychwytu związków według niniejszego wynalazku przez komórki jest badanie nośnika w transporcie peptydów ludzkiej linii komórek jelitowych Caco-2. Ludzkie komórki gruczolakorakowe (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centrum, Rye, NY, i/lub ATCC, Rockville, MD) pasażuje się w ośrodku Eagle'a zmodyfikowanym przez Duibecco zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej i 1% roztworu aminokwasów nie podstawowych w minimalnym ośrodku podstawowym bez dodatku pirogronianu sodu lub antybiotyków. Te komórki nie zawierają mikoplazmy i wybiera się je z pomiędzy 28 i 40 pasażu. Dla dokonania pomiarów przepływu, od 5 do 10 x 10⁴ komórek hoduje się na pokrytych kolagenem płytkach wielostudzienkowych przez 13-18 dni, wymieniając co dwa do trzech dni pożywkę.

Wychwyt leku mierzy się w temperaturze 37°C, stosując badany związek, z zastosowaniem techniki grupowania na płytkach (patrz Gazzola i in., Anal. Biochem. 115, 368-74 (1981)). Buforem do badania przepływu jest nie zawierający wodorowęglanów zrównoważony roztwór soli Earle'a zawierający 25 mM Mes, zmiareczkowany do wartości pH 6,0 z zastosowaniem KOH, i chlorek choliny zamiast chlorku sodu. Osmolowość buforu do badania przepływu reguluje się do 300±5 mosmoli/kg ₃ z zastosowaniem chlorku choliny. Jako znacznik płynu pozakomórkowego stosuje się [ H]inulinę, która przywiera do komórek podczas procedury przemywania, pozwalając na ustalenie czasu zero do określania szybkości wychwytu. Codziennie przygotowuje się świeże roztwory badanych związków i dipeptydów. Pod koniec doświadczenia komórki lizuje się w wodzie, a badane związki można wykrywać w lizatach komórkowych, stosując LC/MS/MS. Zawartość białka mierzy się sposobem opisanym przez Smith'a i in., Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).

Wychwyt mierzy się w czasie 40 minut. Początkową szybkość wychwytu oblicza się w obszarze liniowym krzywej regresji i ustala się czas zero w sposób opisany powyżej, stosując regresję liniową. Procentową wartość hamowania oblicza się uwzględniając kontrolną szybkość wychwytu zmierzoną bez dipeptydu. Przykłady testu Caco-2 można znaleźć u Dantzig'a & Bergin'a, Biochim. Biophys. Acta 1027, 211 -17 (1990).

Ekspozycja in vivo z wykorzystaniem pomiarów stężeń w osoczu szczura

W celu zbadania in vivo ekspozycji związków o wzorze II, po doustnym podaniu związków z zastrzeżenia 1, w porównaniu do związków o wzorze II, przeprowadza się pomiary stężeń w osoczu szczurów odpowiednich związków o wzorze II. Dojrzałe szczury płci męskiej Fischer 344 (o masie

PL 221 489 B1

190-270 gramów) zakupione od Harlan Sprague-Dawley, Cumberland, IN, USA aklimatyzuje się przed rozpoczęciem badania przez 3 dni. W 4 dniu, związki badane rozpuszczono w buforowanej wodzie (1 mg/ml = związek badany/20 mM dwuwodorofosforanu potasu, wartość pH = 2) i podaje doustnie w dawce pojedynczej 5 mg/kg. Poprzez zatokę oczodołową lub nakłucie serca (ostatni punkt czasowy) pobiera się próbki krwi po 0,5 i 1 godzinie lub, alternatywnie, po 1 i 3 godzinach. Przed analizą próbki osocza przechowuje się w temperaturze -20°C w obecności fluorku fenylometylosulfonylu, inhibitora proteazy. Próbki osocza i wewnętrzne związki wzorcowe wstępnie poddaje się ekstrakcji w fazie stałej (nośnik SAX, metanol/woda/rozcieńczony kwas octowy).

Stężenia osoczowe (ng/ml) odpowiedniego związku o wzorze II dla każdego badanego związku określa się metodą LC/MS/MS i przedstawia się jako sumę stężeń po 0,5 i 1 godzinie lub, alternatywnie, po 1 i 3 godzinach, w próbkach pobranych w tych punktach czasowych.

Po podaniu doustnym szczurom, związki według wynalazku wykazują porównywalne stężenie osoczowego związku macierzystego. Jest to dowodem, że związki według niniejszego wynalazku przekształcają się in vivo w związki macierzyste - związki o wzorze II.

Związki według niniejszego wynalazku korzystnie mają postać kompozycji farmaceutycznej. Zatem inny aspekt według niniejszego wynalazku obejmuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą związek z zastrzeżenia 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub rozczynnik. Kompozycje farmaceutyczne można otrzymywać sposobami dobrze znanymi fachowcom w tej dziedzinie. Dla celów przygotowania kompozycji według niniejszego wynalazku, substancję czynną zazwyczaj miesza się z nośnikiem lub rozcieńcza nośnikiem, lub zamyka wewnątrz nośnika, i mogą mieć one postać kapsułki, saszetki, torebki lub innego pojemnika. Gdy nośnik służy jako rozcieńczalnik, może być on stały, półstały lub ciekły i działać jako rozczynnik, ro zcieńczalnik lub ośrodek dla substancji czynnej. Kompozycje mogą mieć postać tabletek, pigułek, proszków, pastylek do ssania, saszetek, kapsułek z opłatka, eliksirów, zawiesin, emulsji, roztworów, syropów, aerozoli, maści zawierających np. aż do 10% wagowych substancji czynnej, miękkich i twardych kapsułek żelatynowych, czopków, sterylnych roztworów do wstrzykiwania i sterylnych proszków do przygotowania roztworu.

Niektóre z przykładów odpowiednich nośników, rozczynników i rozcieńczalników obejmują laktozę, dekstrozę, sacharozę, sorbitol, mannitol, skrobie, gumy, gumę arabską, fosforan wapnia, alginiany, gumę tragankową, żelatynę, krzemian wapnia, mikrokrystaliczną celulozą, poliwinylopir olidon, celulozę, syrop wodny, metylocelulozę, hydroksybenzoesany metylu i propylu, talk, stearynian magnezu i olej mineralny. Preparaty mogą ponadto zawierać środki poślizgowe, środki zwilżające, środki zawieszające i emulgatory, środki konserwujące, środki słodzące lub środki smakowe. Kompozycje według wynalazku można komponować tak, aby uzyskać natychmiastowe, przedłużone lub opóźnione uwalnianie substancji czynnej po podaniu pacjentowi, stosując dobrze znane w tej dziedzinie metody.

Kompozycje korzystnie występują w jednostkowych postaciach dawkowania, przy czym każda dawka zawiera od około 5 mg do około 500 mg substancji czynnej, korzystnie około 25 mg do około 300 mg substancji czynnej. Stosowany tu termin „substancja czynna” odnosi się do związku określonego w zastrzeżeniu 1.

Termin „jednostkowa postać dawkowania” odnosi się do fizycznie osobnej jednostki stanowiącej pojedynczą dawkę leku, którą można podać ludziom i innym ssakom, przy czym każda jednostka zawiera wstępnie określoną ilość substancji czynnej, zapewniającą pożądany efekt terapeutyczny, w połączeniu z odpowiednim farmaceutycznym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub rozczynnikiem.

Claims (12)

1. Związek, którym jest kwas (1R,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Związek według zastrz. 1, którym jest monohydrat kwasu (1RS,4S,5S,6S)-4-(2'S-4'-metylotio-2'-aminobutanoilo)amino-2,2-diokso-2X⁶-tia-bicyklo[3.1.0]heksano-4,6-dikarboksylowego.

3. Związek według zastrz. 1 albo 2 do zastosowania w terapii.

4. Zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniu 1 albo 2, do wytwarzania leku do podania skutecznej ilości związku o wzorze (II),

PL 221 489 B1

10 11 w którym, X oznacza grupę SO₂, R i R oznaczają atom wodoru.

5. Zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniu 1 albo do wytwarzania leku do leczenia schorzeń neurologicznych u pacjenta.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, do leczenia zaburzenia neurologicznego wybranego z grupy obejmującej niedobory mózgowe w następstwie wszczepienia bajpasów naczyń wieńcowych mięśnia sercowego i przeszczepu; niedokrwienia mózgu; uraz rdzenia kręgowego; uraz głowy; chorobę Alzheimera; pląsawicę Huntingtona; stwardnienie zanikowe boczne; otępienie wywołanego przez AIDS; niedotlenienie okołoporodowe; uszkodzenie neuronalne w wyniku hipoglikemii; uszkodzenie gałki ocznej i retinopatii; zaburzenia poznawcze; zaburzenie idiopatyczne i polekowe chorobę Parkinsona; skurcze mięśni; migrenowe bóle głowy; nietrzymanie moczu; tolerancję na lek, wycofanie, przerwanie i uzależnienie od leku; odstawienie nikotyny; wymioty; obrzęk mózgu; przewlekły ból; zaburzenia snu; drgawki; zespół Tourette'a; zaburzenia z deficytem uwagi; i opóźnioną dyskinezę.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, do leczenia zaburzenia neurologicznego wybranego z grupy obejmującej tolerancję, wycofanie, przerwanie i uzależnienie od leku; lub odstawienie nikotyny.

8. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 albo 2, do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń psychiatrycznych u pacjenta.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, do leczenia zaburzeń psychiatrycznych wybranych z grupy obejmującej schizofrenię, stany lękowe i związane z nimi zaostrzenia, depresję, zaburzenia dwubiegunowe, psychozę i natręctwa myślowe, oraz czynności przymusowe.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, do leczenia zaburzeń psychiatrycznych wybranych z grupy obejmującej stany lękowe i związane z nim zaburzenia.

11. Zastosowanie według zastrz. 9, do leczenia zaburzenia psychiatrycznego, którym jest schizofrenia.

12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że stanowi połączenie związku określonego w zastrz. 1 albo 2, lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub rozczynnikiem.