Przedmiotem wynalazku są zastosowanie kompozycji herbicydów zawierającej glifosat i desmedifam/fenmedifam do zwalczania szkodliwych roślin w uprawach buraków cukrowych, sposób zwalczania szkodliwych roślin w tolerujących uprawach buraków cukrowych i preparat chwastobójczy. Wynalazek dotyczy dziedziny środków ochrony roślin, których można użyć przeciw szkodliwym roślinom w tolerujących lub opornych uprawach buraków cukrowych i które jako substancje chwastobójczo czynne zawierają kompozycję dwóch herbicydów.

W publikacji R.W. Downarda, D.W. Morishita, pt.: „Weed control in sugar beets with preplant and preemergence herbicides, Res. Prog. Rep. West. Soc. Weed Sci., str. 63, ujawniono zastosowanie glifosatu+ethfmsl&desmophen (= etofumezat + desmedifam + fenmedifam) w uprawie buraka cukrowego do zwalczania chwastów. W przypadku tego połączenia herbicydów wskazano jedynie zabieg prowadzony przed wysianiem. W publikacji tej nie ujawniono jakiegokolwiek zastosowania w uprawach buraka cukrowego zarówno ani przed wzejściem roślin uprawnych ani po ich wzejściu (tabela 2). W publikacji tej nie ujawniono zastosowania glifosatu samego jak też w połączeniu z innym herbicydem bezpośrednio w uprawach buraka cukrowego. Efekt techniczny uzyskany dzięki zastosowaniu przedmiotowego rozwiązania w porównaniu z publikacją R.W. Downarda i D. W. Morishita polega na tym, że chwasty można zwalczać poprzez stosowanie zastrzeganych kompozycji herbicydów bez uszkadzania upraw buraka cukrowego, nawet przy nanoszeniu po ich wzejściu, tj. gdy buraki cukrowe są widoczne na polu.

W WO 93/04585 ujawniono połączenie herbicydów fosfonianowych lub fosfinianowych z fenmedifamem lub desmedifamem. Fosfonian w tej publikacji został zdefiniowany jako zawierający grupy alkilowe. Z zamieszczonej tam definicji wynika w sposób jasny, że glifosat (N-(fosfonometylo)glicyna), zawierający resztę aminokwasową, nie może być objęty tą definicją. W publikacji tej nie zamieszczono żadnych danych dla glifosatu ani też dla jakiegokolwiek połączenia zawierającego glifosat. Zatem, w WO 93/04585 nie ujawniono mieszaniny glifosatu z fenmedifamem lub desmedifamem, ani jakiegokolwiek ich połączenia. Efekt techniczny uzyskany dzięki zastosowaniu przedmiotowego rozwiązania w porównaniu z publikacją WO 93/04585 polega na tym, że połączenie glifosatu, nieselektywnego herbicydu o szerokim spektrum, z innymi herbicydami, można stosować w uprawach buraka cukrowego bez powodowania niedopuszczalnych uszkodzeń upraw buraka cukrowego ze względu na to, że uprawy buraka cukrowego tolerują glifosat.

Wraz z wprowadzeniem tolerujących lub opornych gatunków i odmian buraków cukrowych, a szczególnie transgenicznych gatunków i odmian buraków cukrowych, tradycyjny system zwalczania chwastów uzupełniono nowymi substancjami czynnymi, które jako takie nie działały selektywnie w znanych gatunkach buraków cukrowych. Tymi substancjami czynnymi są np. znane herbicydy o szerokim spektrum działania, takie jak glifosat, sulfosat, glufosynat, bialafos i herbicydy imidazolinonowe [herbicydy (A)], które można obecnie stosować w wyhodowanych pod kątem ich użycia tolerujących uprawach. Skuteczność tych herbicydów w stosunku do szkodliwych roślin w tolerujących je uprawach jest wysoka, jednak, podobnie jak w przypadku innych zabiegów z użyciem herbicydów, zależy ona od rodzaju użytego herbicydu, dawki jego nanoszenia, postaci preparatu, zwalczanych szkodliwych roślin, warunków klimatycznych i glebowych itd. Herbicydy wykazują niekiedy wady (luki) w przypadku określonych gatunków szkodliwych roślin. Innym kryterium jest czas trwania ich skuteczności lub szybkość rozpadu herbicydu. Czasem należy uwzględnić także zmiany wrażliwości szkodliwych roślin, które mogą wystąpić przy dłuższym stosowaniu herbicydów lub podlegać uwarunkowaniom geograficznym. Gdy jest to możliwe, utratę skuteczności wobec danych roślin można wyrównać przez zwiększenie dawek nanoszenia. Zawsze jednak istnieje zapotrzebowanie na sposoby zapewniające działanie herbicydu przy zmniejszonych dawkach nanoszenia substancji czynnych. Mniejsza dawka nanoszenia zmniejsza nie tylko konieczną do naniesienia ilość substancji czynnej, lecz także zmniejsza zazwyczaj ilość substancji pomocniczych stosowanych do formułowania. Obniża to nakłady ekonomiczne i poprawia ekologiczność zabiegów z użyciem herbicydów.

Możliwość poprawienia profilu stosowania herbicydu można uzyskać dzięki połączeniu tej substancji czynnej z jedną lub większą liczbą innych substancji czynnych, które nadają pożądane dodatkowe właściwości. Przy łącznym stosowaniu większej liczby substancji czynnych występują często zjawiska niezgodności fizycznej i biologicznej, np. brak trwałości ich łącznego preparatu, rozkład substancji czynnej lub antagonizm substancji czynnych. Pożądane są zatem kompozycje substancji czynnych o korzystnym profilu działania, wyższej trwałości i możliwie synergicznie wzmocnionym działaniu,

PL 217 220 B1 które pozwala na zmniejszenie dawek nanoszenia w porównaniu z dawkami, w których substancje czynne zawarte w łącznym preparacie nanosi się przy ich stosowaniu pojedynczo.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że substancje czynne z grupy herbicydu (A) o szerokim spektrum działania w połączeniu z innym herbicydem z grupy (A) i ewentualnie określonym herbicydem (B) wspólnie oddziaływają szczególnie korzystnie gdy stosuje się je w uprawach buraków cukrowych, w których trzeba było dotychczas stosować herbicydy o działaniu selektywnym.

Wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji herbicydów do zwalczania szkodliwych roślin w uprawach buraków cukrowych, charakteryzującego się tym, że kompozycja herbicydów zawiera skuteczną ilość (A) herbicydu o szerokim profilu działania wybranego spośród związku o wzorze (A2) oraz jego soli,

oraz (B) herbicydu wybranego z grupy (B2) obejmującej desmedifam i fenmedifam, a uprawy buraków cukrowych tolerują te zawarte w kompozycjach herbicydy (A) i (B).

Korzystnie jako substancję czynną (A) stosuje się glifosat lub jego sole z metalami alkalicznymi, sole z aminami lub sól trimetylosulfoniową (sulfosat).

Korzystniej jako substancję czynną (A) stosuje się glifosat izopropyloamoniowy.

Korzystnie jako substancję czynną (B) stosuje się desmedifam.

Ponadto korzystnie jako substancję czynną (B) stosuje się fenmedifam.

Ponadto korzystnie jako substancję czynną (B) stosuje się połączenie desmedifamu i fenmedifamu.

Korzystnie kompozycje herbicydów zawierają znane substancje pomocnicze stosowane w ochronie roślin lub substancje pomocnicze stosowane do formułowania.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu zwalczania szkodliwych roślin w tolerujących uprawach buraków cukrowych, który charakteryzuje się tym, że herbicydy lub kompozycję herbicydów, określone powyżej, razem lub oddzielnie nanosi się przedwschodowo lub powschodowo albo przedwschodowo i powschodowo na rośliny, części roślin, nasiona roślin lub glebę uprawną.

Ponadto wynalazek dotyczy preparatu chwastobójczego, który cechuje się tym, że zawiera kompozycję związku chwastobójczego (A) określonego powyżej i desmedifamu, oraz ewentualnie substancje pomocnicze stosowane w ochronie roślin i substancje pomocnicze stosowane do formułowania.

Ponadto wynalazek dotyczy preparatu chwastobójczego, który cechuje się tym, że zawiera kompozycję związku chwastobójczego (A) określonego powyżej i fenmedifamu, oraz ewentualnie substancje pomocnicze stosowane w ochronie roślin i substancje pomocnicze stosowane do formułowania.

Związki nazwano ich „nazwami zwyczajowymi i są znane z „Pesticide Manual, 11. wyd., British Crop Protection Council 1997 (dalej oznaczanym skrótem „PM). Obok kompozycji herbicydów według wynalazku można stosować inne substancje czynne środków ochrony roślin oraz znane substancje pomocnicze używane w ochronie roślin i substancje pomocnicze stosowane do formułowania.

Działanie synergiczne obserwuje się przy wspólnym stosowaniu substancji czynnych (A) i (B), może ono jednak wystąpić przy stosowaniu z przesunięciem czasowym (stosowanie oddzielne). Możliwe jest także stosowanie herbicydów lub kompozycji herbicydów w większej liczbie dawek (stosowanie sekwencyjne), np. po zastosowaniu w okresie przedwschodowym prowadzi się nanoszenie w okresie powschodowym, względnie po wczesnym zabiegu po wzejściu roślin uprawnych prowadzi się nanoszenie w pośrednim lub późniejszym okresie wzrostu. Korzystne jest równoczesne stosowanie substancji czynnych kompozycji, ewentualnie w większej liczbie dawek. Możliwe jest również nanoszenie poszczególnych substancji czynnych kompozycji z przesunięciem czasowym i w niektórych przypadkach może to być korzystne. W tym sposobie stosowania można użyć także innych środków

PL 217 220 B1 ochrony roślin, takich jak fungicydy, insektycydy, akarycydy itd. i/lub różnych substancji pomocniczych, adjuwantów i/lub nawozów.

Działanie synergiczne pozwala na zmniejszenie dawek nanoszenia poszczególnych substancji czynnych, wyższą skuteczność działania przeciw danemu gatunkowi szkodliwych roślin przy tej samej dawce nanoszenia, zwalczenie dotychczas nie objętych zwalczaniem gatunków (luki), rozszerzenie zakresu stosowania i/lub zmniejszenie liczby koniecznych zabiegów jednostkowych, a w przypadku użytkownika zapewnia korzystniejsze ekonomicznie i ekologicznie sposoby zwalczania chwastów.

Dzięki kompozycjom (A) + (B) według wynalazku możliwe jest np. synergiczne zwiększenie skuteczności, która znacznie i nieoczekiwanie przewyższy skuteczność osiąganą z użyciem substancji czynnych (A) i (B) stosowanych oddzielnie.

W WO-A-98/09525 opisano sposób zwalczania chwastów w uprawach transgenicznych, które są oporne na herbicydy zawierające fosfor, takie jak glufosynat lub glifosat, przy czym zastosowano kompozycje herbicydów, które zawierają glufosynat lub glifosat i co najmniej jeden herbicyd wybrany z grupy obejmującej prosulfuron, primisulfuron, dikambę, pirydat, dimetenamid, metolachlor, flumeturon, propachizafop, atrazynę, chlodynafop, norflurazon, ametrynę, terbutylazynę, symazynę, prometrynę, NOA-402989 (3-fenylo-4-hydroksy-6-chloropirydazynę), związek o wzorze

w którym R oznacza 4-chloro-2-fluoro-5-(metoksykarbonylometylotio)fenyl (znany z US-A-4671819), CGA276854 czyli ester 1-alliloksykarbonylo-1-metyloetylowy kwasu 2-chloro-5-(3-metylo-2,6-diokso-4-trifluorometylo-3,6-dihydro-2H-pirymidyn-1-ylo)benzoesowego (= WC9717 znany z US-A-5183492) i ester 4-oksetanylowy kwasu 2-{N-[N-(4,6-dimetylopirymidyn-2-ylo)-aminokarbonylo]aminosulfonylo}benzoesowego (znany z EP-A-496701). W WO-A-98/09525 nie podano żadnych informacji dotyczących zamierzonych lub osiągniętych wyników. Ponadto brak jest przykładów działania synergicznego lub zastosowania tego sposobu w określonych uprawach, jak również konkretnych kompozycji dwóch, trzech lub większej liczby herbicydów.

Przeprowadziwszy odpowiednie próby stwierdzono występowanie nieoczekiwanie dużych różnic pomiędzy przydatnością w uprawach roślin użytkowych kompozycji herbicydowych wspomnianych w WO-A-98/09525 i tych innych publikacjach oraz innych nowych kompozycji herbicydowych.

Kompozycje herbicydowe dostarczone dzięki wynalazkowi można szczególnie korzystnie stosować w tolerujących je uprawach buraków cukrowych.

Związki o wzorze (A2) są znane lub można je wytworzyć sposobami analogicznymi do znanych.

Przykładami związków (A2) są:

(A2.1) glifosat, to znaczy N-(fosfonometylo)glicyna, (A2.2) sól monoizopropyloamoniowa glifosatu, (A2.3) sól sodowa glifosatu, (A2.4) sulfosat, to znaczy sól trimesium N-(fosfonometylo)glicyny czyli sól trimetylosulfoksoniowa N-(fosfonometylo)glicyny.

Glifosat stosuje się zazwyczaj w postaci soli, korzystnie soli monoizopropyloamoniowej lub soli trimetylosulfoksoniowej (soli trimesium = sulfosat). W przeliczeniu na wolny kwas glifosat nanosi się w dawce jednorazowej wynoszącej zazwyczaj 0,5 - 5 kg sc/ha. Glifosat pod względem niektórych aspektów technicznych jego stosowania jest podobny do glufosynatu, jednak w odróżnieniu od niego jest on inhibitorem enzymu syntazy 5-enolopirogroniano-szikimowo-3-fosforanowej w roślinach, patrz „The Pesticide Manual, 11. wyd., British Crop Protection Council 1997, str. 646-649. W przypadku kompozycji według wynalazku glifosat stosuje się zazwyczaj w dawkach nanoszenia wynoszących 20 - 1000 g sc/ha, a korzystnie 20 - 800 g sc/ha.

PL 217 220 B1

Wyhodowano także metodami inżynierii genetycznej i wykorzystano w praktyce rośliny tolerujące związki (A2); patrz „Zuckermbe 47. rocznik (1998), str. 217 i dalsze oraz WO 92/00377, EP-A-115673 i EP-A-409815.

Współskładnikiem (B) w kompozycjach ze składnikiem (A) jest herbicyd z grupy (B1) herbicydów działających poprzez liście i glebę przeciw szkodliwym roślinom jednoliściennym i dwuliściennym, tj. związków (określonych „nazwą zwyczajową i opatrzonych odnośnikiem do „The Pesticide Manual,

11. wyd., British Crop Protection Council 1997 (skrót „PM)), obejmującej (B2) herbicydy skuteczne głównie przeciw szkodliwym roślinom dwuliściennym, tj. związki (B2.1) desmedifam (PM, str. 349-350), to znaczy ester fenylowy kwasu N-[3-(etoksykarbonyloamino)fenylo]karbaminowego i (B2.2) fenmedifam (PM, str. 948-949), to znaczy ester 3-metylofenylowy kwasu N-[3-(metoksykarbonyloamino)fenylo]karbaminowego.

Dawki nanoszenia herbicydów (B) mogą bardzo się różnić w zależności od nanoszonego herbicydu. Ogólnie mogą one wynosić:

dla związków (B2): 5-5000 g sc/ha, korzystnie desmedifam, fenmedifam: 10-5000 g sc/ha.

Stosunki ilościowe związków (A) i (B) wynikają z dawek nanoszenia podanych dla pojedynczych substancji. Szczególnie interesujące są np. następujące stosunki ilościowe:

(A):(B) w zakresie od 1000:1 do 1:1000, korzystnie od 200:1 do 1:100, (A2):(B2) korzystnie od 400:1 do 1:50, zwłaszcza od 100:1 do 1:20.

Szczególnie interesujące jest zastosowanie kompozycji (A2.2) + (B2.1), (A2.2) + (B2.2).

Kompozycje według wynalazku można również stosować razem z innymi substancjami czynnymi, np. z grupy środków zabezpieczających, fungicydów, insektycydów i regulatorów wzrostu roślin lub z grupy znanych w ochronie roślin dodatków i środków pomocniczych stosowanych do formułowania. Dodatkami są np. nawozy i barwniki.

Do tego rodzaju kompozycji z trzema lub większą liczbą substancji czynnych odnoszą się poniższe szczególne uwarunkowania podane dla kompozycji dwuskładnikowych według wynalazku, przede wszystkim gdy te kompozycje dwuskładnikowe według wynalazku są w owych kompozycjach zawarte i odnośnie konkretnych połączeń dwóch składników.

Szczególnie interesujące jest także zgodne z wynalazkiem zastosowanie kompozycji jednego herbicydu z grupy (A), korzystnie (A2.2), i jednego herbicydu z grupy obejmującej (B2') desmedifam i fenmedifam.

Kompozycje według wynalazku (czyli środki chwastobójcze) wykazują doskonałą skuteczność działania chwastobójczego przeciw szerokiemu spektrum ważnych w rolnictwie szkodliwych roślin jedno- i dwuliściennych. Także trudno zwalczalne wieloletnie chwasty szerokolistne wyrastające z kłączy, z odrośli i innych trwałych organów są przez te substancje czynne dobrze zwalczane. Jest przy tym obojętne czy substancje naniesiono w zabiegu przed zasiewem, przed wzejściem roślin lub po wzejściu roślin uprawnych. Korzystne jest stosowanie po wzejściu roślin uprawnych lub drogą wczesnego zabiegu przedwschodowego po wysianiu.

Gdy w poszczególnych przypadkach znanych jest np. kilka gatunków chwastów jednoi dwuliściennych, które mogą być zwalczane przez związki według wynalazku, nie oznacza to żadnego ograniczenia co do oddziaływania na inne określone gatunki chwastów.

Do zwalczalnych gatunków chwastów jednoliściennych należą np. Alopecurus spp., Avena spp., Setaria spp., Echinochloa spp., Apera spp., takie jak Apera spica venti, Agropyron spp. i gatunki chwastów szkodliwe dla zbóż, ale także Digitaria spp., Lolium spp., Phalaris spp., Poa spp., jak również gatunki Cyperus z grupy jednorocznych, a wśród chwastów wieloletnich gatunki Cynodon, Imperata oraz Soryhum i oporne gatunki Cyperus.

W przypadku gatunków chwastów dwuliściennych spektrum działania obejmuje takie gatunki jak np. Chenopodium spp., Matricaria spp., Kochia spp., Veronica spp., Viola spp., Anthemis spp., Polygonum spp., Stellaria spp., Thlaspi spp., Galium spp., Amaranthus spp., Solanum spp., Lamium spp., Cupsella spp. i Cirsium spp., ale także Abutilon spp., Chrysanthemum spp., Ipomoea spp., Pharbitis spp., Sida spp. i Sinapis spp., Convolvulus, Rumex i Artemisia.

Nanoszenie związków według wynalazku na powierzchnię gleby przed okresem kiełkowania powoduje całkowite zahamowanie wzrostu kiełków chwastów, albo wzrost chwastów do stadium pierwszego liścia i zatrzymanie ich dalszego wzrostu, a po okresie 3 - 4 tygodni całkowite zamarcie.

PL 217 220 B1

Przy nanoszeniu substancji czynnych na części zielone roślin w zabiegu powschodowym bardzo szybko po potraktowaniu występuje drastyczne zatrzymanie wzrostu i rośliny chwastów pozostają w stadium wzrostu sprzed naniesienia albo giną po pewnym czasie, dzięki czemu konkurencja szkodliwych chwastów względem roślin uprawnych zostaje bardzo wcześnie i trwale wyeliminowana.

Chwastobójcze środki według wynalazku odznaczają się w porównaniu do pojedynczych preparatów szybszym wnikaniem i dłużej trwającym działaniem chwastobójczym. Trwałość zawartych w kompozycjach według wynalazku substancji czynnych po oprysku jest zazwyczaj zadowalająca. Szczególną, godną podkreślenia zaletą jest to, że mimo, iż zawartość związków (A) i (B) w kompozycjach i skuteczne dawki ich nanoszenia mogą być małe, ich skuteczność działania poprzez glebę jest optymalna. Tak więc nie tylko można je stosować we wrażliwych uprawach, ale także unika się praktycznie zatrucia wód gruntowych. Stosowanie kompozycji substancji czynnych według wynalazku umożliwia znaczne zmniejszenie potrzebnej dawki nanoszenia tych substancji czynnych.

Przy wspólnym stosowaniu herbicydów typu (A)+(B) występuje działanie nadaddytywne (synergiczne). Działanie kompozycji jest zatem silniejsze niż oczekiwana suma działania herbicydów użytych pojedynczo. Efekt synergiczny pozwala na zmniejszenie dawki nanoszenia, zwalczanie szerszego spektrum chwastów szerokolistnych i chwastów trawiastych, szybsze wystąpienie działania chwastobójczego, dłuższy czas działania, lepsze zwalczenie szkodliwych roślin przy tylko jednym lub niewielkiej liczbie zabiegów nanoszenia, jak również na poszerzenie czasokresu stosowania. Zmniejszenie dawki tych środków zmniejsza także częściowo zawartość substancji szkodliwych, takich jak azot lub kwas oleinowy, w roślinach uprawnych.

Podane właściwości i zalety są niezbędne w praktycznym zwalczaniu chwastów dla uwolnienia upraw rolniczych od niepożądanych roślin konkurencyjnych i zapewnienia właściwej jakości i ilości plonów i/lub dla ich podwyższenia. Nowe kompozycje wyraźnie przewyższają techniczne normy w odniesieniu do opisanych właściwości.

Pomimo, że zgodne z wynalazkiem związki wykazują doskonałą chwastobójczą aktywność wobec chwastów jedno- i dwuliściennych, tolerujące lub krzyżowo tolerujące rośliny buraków cukrowych są przez nie uszkadzane tylko nieznacznie lub wcale.

Ponadto zgodne z wynalazkiem środki wykazują znakomite działanie regulujące wzrost roślin buraków cukrowych. Wpływają one regulująco na właściwą roślinom przemianę materii i mogą być stosowane do ukierunkowanego wpływania na zawartość pewnych substancji w roślinach. Nadają się one ponadto do ogólnego sterowania niepożądanym wzrostem wegetatywnym i do jego hamowania, bez uśmiercania przy tym roślin.

Dzięki ich działaniu chwastobójczemu i regulującemu wzrost roślin można te środki stosować do zwalczania szkodliwych roślin w znanych tolerujących lub krzyżowo tolerujących uprawach buraków cukrowych lub w tolerujących uprawach buraków cukrowych jeszcze opracowywanych lub zmienianych metodami inżynierii genetycznej. Transgeniczne rośliny wyróżniają się z reguły szczególnie korzystnymi właściwościami, np. obok oporności wobec środków według wynalazku również opornością wobec chorób roślin lub patogenów chorób roślin, takich jak określone owady lub mikroorganizmy, takie jak grzyby, bakterie lub wirusy. Inne szczególne właściwości dotyczą np. jakości plonów pod względem ilości, jakości, trwałości przy przechowywaniu, składu i zawartości konkretnych substancji. Tak więc są znane transgeniczne rośliny z podwyższoną zawartością oleju lub zmienioną jakością, np. z innym zestawem kwasów tłuszczowych.

Tradycyjne sposoby wytwarzania nowych roślin wykazujących zmodyfikowane właściwości w porównaniu z dotychczas występującymi roślinami, obejmują np. klasyczne metody hodowli lub wytwarzanie mutantów. Nowe rośliny o zmienionych właściwościach można alternatywnie wytwarzać z użyciem metod inżynierii genetycznej (patrz np. EP-A-0221044, EP-A-0131624). Opisano np. wiele przypadków

- realizowanych metodami inżynierii genetycznej zmian roślin uprawnych polegających na zmodyfikowaniu zachodzącej w roślinach syntezy skrobi (np. WO 92/11376, WO 92/14827, WO 91/19806),

- transgenicznych roślin uprawnych wykazujących oporność względem pewnych herbicydów, np. sulfonylomoczników (EP-A-0257993, US-A-5013659),

- transgenicznych roślin uprawnych o zdolności produkowania toksyny Bacillus thuringiensis (toksyny Bt), która nadaje roślinom oporność przeciw określonym szkodnikom (EP-A-0142924, EP-A-0193259),

PL 217 220 B1

- transgenicznych roślin uprawnych o zmodyfikowanym zestawie kwasów tłuszczowych (WO 91/13972),

- transgenicznych roślin buraków cukrowych z opornością przeciw herbicydom typu inhibitorów syntazy acetomleczanowej, takich jak imidazolinony (WO-A-98/02526, WO-A-98/02527, WO-A-98/2562).

Liczne metody biologii molekularnej, z użyciem których można wytwarzać nowe rośliny transgeniczne, są w zasadzie znane; patrz np. Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

2. wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Iub Winnacker „Gene und Klone, VCH Weinheim, 2. wyd., 1996 Iub Christou, „Trends in Plant Science, 1 (1996) 423-431).

W celu takich manipulacji metodami inżynierii genetycznej można cząsteczki kwasu nukleinowego wprowadzić do plazmidów umożliwiających mutagenezę lub zmianę sekwencji w wyniku rekombinacji sekwencji DNA. Z użyciem tych standardowych sposobów można np. dokonać wymiany zasad, odłączyć część sekwencji lub dołączyć sekwencje naturalne lub syntetyczne. Dla połączenia ze sobą fragmentów DNA można między innymi użyć fragmentów adaptorowych lub linkerowych.

Wytworzenie komórek roślin ze zmniejszoną aktywnością produktu genowego można osiągnąć np. przez ekspresję co najmniej jednego odpowiedniego antysensownego RNA, jednego sensownego RNA dla osiągnięcia efektu kosupresji lub ekspresję co najmniej jednego odpowiednio skonstruowanego rybozymu, specyficznie odszczepiającego transkrypty tego produktu genowego.

Można ponadto stosować cząsteczki DNA, które zawierają całą sekwencję kodującą produkt genowy, ewentualnie z sekwencjami flankującymi, jak również cząsteczki DNA, które zawierają tylko część sekwencji kodującej, przy czym te części muszą być wystarczająco długie, aby w komórkach wywołać działanie antysensowne. Możliwe jest także stosowanie sekwencji DNA wykazujących wysoki stopień homologii do sekwencji kodujących produkt genowy, które jednak nie są z nimi identyczne.

W przypadku ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego w roślinach syntetyzowane białko może być lokalizowane w dowolnym przedziale komórki roślinnej. Dla osiągnięcia zlokalizowania w określonym przedziale komórki można np. region kodujący sprzęgnąć z sekwencjami DNA, które zapewniają lokalizację w określonym przedziale. Tego rodzaju sekwencje są fachowcowi znane (patrz np. Braun i in., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald i in., Plant J. 1 (1991), 95-106).

Transgeniczne komórki roślinne mogą być regenerowane znanymi sposobami w całych roślinach. Transgenicznymi roślinami mogą w zasadzie być rośliny dowolnego rodzaju, to znaczy zarówno jednoliścienne, jak i dwuliścienne.

Rośliny transgeniczne o zmienionych właściwościach można wytworzyć przez nadekspresję, supresję lub hamowanie homologicznych (czyli naturalnych) genów lub sekwencji genowych albo ekspresję heterologicznych (czyli obcych) genów lub sekwencji genowych.

Kompozycje substancji czynnych według wynalazku mogą występować zarówno w postaci mieszanych preparatów dwóch składników, ewentualnie wraz z innymi substancjami czynnymi, dodatkami i/lub znanymi środkami pomocniczymi do stosowania przy formułowaniu, które to preparaty mogą być następnie w znany sposób rozcieńczane wodą przed użyciem, albo w postaci tak zwanych mieszanek zbiornikowych wytwarzanych przez rozcieńczenie wodą oddzielnie sformułowanych lub częściowo oddzielnie sformułowanych składników.

Związki (A) i (B) lub ich kompozycje mogą być formułowane różnymi sposobami, w zależności od tego jakie parametry biologiczne i/lub fizykochemiczne chce się uzyskać. Odpowiednimi preparatami są na ogół proszki do zawiesin (WP), koncentraty do emulgowania (EC), roztwory wodne (SL), emulsje (EW), takie jak olej w wodzie i woda w oleju, roztwory lub emulsje opryskowe, dyspersje na bazie oleju lub wody, suspensjoemulsje, preparaty do opylania (DP), zaprawy, granulaty do nanoszenia na glebę lub roztrząsania, granulaty dyspergowalne w wodzie (WG), ultramałoobjętościowe postacie użytkowe (ULV), mikrokapsułki lub woski.

Poszczególne typy preparatów są w zasadzie znane i opisane np. w: Winnacker-Kiichler, „Chemische Technologie, 7. tom, C. Hauser Verlag Mϋnchen, 4. wyd. 1986; van Valkenburg, „Pesticides Formulations, Marcel Dekker N.Y., 1973; K. Martens, „Spray Drying Handbook, 3. wyd. 1979, G. Goodwin Ltd. Londyn.

Niezbędne środki pomocnicze stosowane do formułowania, takie jak substancje obojętne, środki powierzchniowo czynne, rozpuszczalniki i inne substancje pomocnicze, są również znane i opisane np. w: Watkins, „Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers, 2. wyd., Darland Books, Caldwell N.J.; H.v. Olphen, „Introduction to Clay Colloid Chemistry; 2. wyd., J. Wiley & Sons, N.Y. Mars8

PL 217 220 B1 den, „Solvents Guide, 2. wyd., Interscience, N.Y. 1950; McCutcheon's, „Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publ. Corp., Ridegewood N.J.; Sisley and Wood, „Encyclopedia of Surface Active

Egents, Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schonfeldt, ,,Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte, Wiss. Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1976, Winnacker-Kiichler, „Chemische Technologie, 7. tom, C. Hauser Verlag Mϋnchen, 4. wyd. 1986.

Na bazie tych preparatów można wytworzyć kompozycję z innymi pestycydowo skutecznymi substancjami, takimi jak inne herbicydy, fungicydy lub insektycydy, jak również środki zabezpieczające, nawozy i/lub regulatory wzrostu roślin, np. w postaci gotowego preparatu lub mieszanki zbiornikowej.

Proszki do zawiesin (proszki zwilżalne) są preparatami równomiernie dyspergowalnymi w wodzie, które obok substancji czynnej, substancji rozcieńczającej lub obojętnej zawierają jeszcze jonowe lub niejonowe środki powierzchniowo czynne (środki zwilżające, środki dyspergujące), np. polioksyetylowane alkilofenole, polioksyetylowane alkohole tłuszczowe lub aminy tłuszczowe, alkanosulfoniany lub alkilobenzenosulfoniany, lignosulfonian sodu, 2,2'-dinaftylometano-6,6'-disulfonian sodu, dibutylonaftalenosulfonian sodu, a także oleoilometylotaurynian sodu.

Koncentraty do emulgowania wytwarza się przez rozpuszczenie substancji czynnej w rozpuszczalniku organicznym, takim jak np. butanol, cykloheksanon, dimetyloformamid, ksylen lub wyżej wrzące związki aromatyczne lub węglowodory, z dodatkiem jednego lub większej liczby jonowych lub niejonowych środków powierzchniowo czynnych (emulgatorów). Jako emulgatory można stosować np. sole wapniowe kwasów alkiloarylosulfonowych, takie jak dodecylobenzenosulfonian wapnia, lub emulgatory niejonowe, takie jak estry poliglikoli i kwasów tłuszczowych, etery alkiloarylowe poliglikoli, etery poliglikoli i alkoholi tłuszczowych, produkty kondensacji tlenku propylenu i tlenku etylenu, polietery alkilowe, estry sorbitanu i kwasów tłuszczowych, estry polioksyetylenosorbitanu i kwasów tłuszczowych lub estry polioksyetylenosorbitu.

Preparaty do opylania otrzymuje się przez zmielenie substancji czynnej z dobrze rozdrobnionymi materiałami stałymi, np. talkiem, naturalnymi iłami, takimi jak kaolin, bentonit i pirofilit, lub ziemią okrzemkową.

Granulaty można wytwarzać albo przez rozpylenie substancji czynnej na chłonnym zgranulowanym materiale obojętnym lub przez naniesienie ko n ce n tratów substancji czynnych wraz z środkami klejącymi, np. polialkoholem winylowym, poliakrylanem sodu lub olejami mineralnymi, na powierzchnię nośników, takich jak piasek, kaolinity i granulowane materiały obojętne. Odpowiednie substancje czynne można także granulować znanymi sposobami stosowanymi przy wytwarzaniu granulowanych nawozów sztucznych, w razie potrzeby wraz z nawozami. Granulaty dyspergowalne w wodzie wytwarza się zazwyczaj bez użycia stałego materiału obojętnego, takimi sposobami jak suszenie rozpyłowe, granulacja w złożu fluidalnym, granulacja talerzowa, mieszanie w mieszalnikach zapewniających duże naprężenia ścinające i wytłaczanie.

Preparaty agrochemiczne zawierają na ogół 0,1 do 99% wag., a zwłaszcza 2 do 95% wag. substancji czynnych typu A i/lub B, przy czym w zależności od rodzaju preparatu zwykle stosuje się niżej podane stężenia. Stężenie substancji czynnej w proszkach do zawiesin wynosi np. około 10 do 95% wag., a resztę do 100% wag. stanowią zwykłe składniki preparatu. W koncentratach do emulgowania stężenie substancji czynnej wynosi np. 5 do 80% wag.

Preparaty pyłowe zawierają przeważnie 5 do 20% wag. substancji czynnej, a roztwory opryskowe około 0,2 do 25% wag. substancji czynnej.

W granulatach, takich jak granulaty dyspergowalne, zawartość substancji czynnej zależy częściowo od tego, czy czynny związek występuje w stanie płynnym, czy stałym i jakie zastosowano środki pomocnicze do granulacji i wypełniacze. Na ogół w granulatach dyspergowalnych w wodzie zawartość substancji czynnej wynosi 10 - 90% wag.

Ponadto wymienione preparaty substancji czynnych ewentualnie zawierają zwykłe środki adhezyjne, zwilżające, dyspergujące, emulgujące, konserwujące i przeciw zamarzaniu oraz rozpuszczalniki, wypełniacze, barwniki i nośniki, środki przeciwpieniące, środki hamujące odparowywanie i środki wpływające na wartość pH lub lepkość.

Jest wiadome, że np. działanie glufosynatu amonowego, jak również jego L-enancjomerów, można polepszyć przez dodanie środków powierzchniowo czynnych, korzystnie środków zwilżających z grupy siarczanów alkilopolioksyetylenowych zawierających np. 10 - 18 atomów węgla i stosowanych w postaci ich soli z metalami alkalicznymi lub soli amonowych, a także soli magnezu, np. soli sodowej siarczanu eteru glikolu dietylenowego i alkoholu C12/C14-tłuszczowego (®Genapol LRO, Hoechst); patrz EP-A-0476555, EP-A-0048436, EP-A-0336151 lub US-A-4400196, jak również Proc. EWRS

PL 217 220 B1

Symp. „Factors Affecting Herbicidal Activity and Selectivity, 227 - 232 (1988). Ponadto wiadomo, że siarczany alkilopolioksyetylenowe są odpowiednie także jako środek polepszający penetrację i wzmacniający działanie szeregu innych herbicydów, między innymi także herbicydów z grupy imidazolinonów; patrz EP-A-0502014.

Preparaty w zwykłych postaciach handlowych, np. proszki do zawiesin, koncentraty do emulgowania, dyspersje i granulaty dyspergowalne w wodzie, rozcieńcza się ewentualnie przed użyciem wodą, w znany sposób. Preparaty pyliste, granulaty do nanoszenia na glebę lub roztrząsania, jak również roztwory opryskowe zazwyczaj nie są przed stosowaniem rozcieńczane obojętnymi substancjami.

Substancje czynne mogą być nanoszone na rośliny, części roślin, nasiona roślin lub na powierzchnię uprawną (glebę orną), korzystnie na zielone rośliny i części roślin i ewentualnie dodatkowo na glebę orną.

Możliwe jest także łączenie substancji czynnych w postaci mieszanek zbiornikowych, poprzez zmieszanie optymalnie sformułowanych stężonych preparatów poszczególnych substancji czynnych z wodą w zbiorniku, po czym tak otrzymaną ciecz opryskową nanosi się.

Łączny preparat chwastobójczy kompozycji substancji czynnych (A) i (B) według wynalazku ma zaletę łatwiejszego stosowania, ponieważ zawiera składniki w ilości o właściwych proporcjach. Ponadto poszczególne środki pomocnicze zawarte w preparacie są dobrane optymalnie, podczas gdy mieszanka zbiornikowa z różnych preparatów może zawierać niekorzystne kombinacje substancji pomocniczych.

A. Ogólne przykłady preparatów

a) Preparat do opylania otrzymuje się przez zmieszanie 10 części wagowych substancji czynnej/mieszaniny substancji czynnych i 90 części wagowych talku jako substancji obojętnej oraz ich rozdrobnienie w odśrodkowym młynie udarowym.

b) Łatwo dyspergowalne w wodzie zwilżalne proszki otrzymuje się przez zmieszanie 25 części wagowych substancji czynnej/mieszaniny substancji czynnych, 64 części wagowych zawierającego kaolin kwarcu jako substancji obojętnej, 10 części wagowych lignosulfonianu potasu i 1 części wagowej oleoilometylotaurynianu sodu jako środka sieciującego i dyspergującego oraz zmielenie całości w młynie palcowym.

c) Łatwo dyspergowalny w wodzie koncentrat zawiesinowy otrzymuje się przez zmieszanie 20 części wagowych substancji czynnej/mieszaniny substancji czynnych z 6 częściami wagowymi oksyetylenowanego alkilofenolu (®Triton X 207), 3 częściami wagowymi oksyetylenowanego izotridekanolu (8 EO) i 71 części wagowych parafinowego oleju mineralnego (zakres temperatur wrzenia np. około 255°C do 277°C) i zmielenie całości w rozcierającym młynie kulowym do uzyskania uziarnienia poniżej 5 ąm.

d) Koncentrat do emulgowania otrzymuje się z 15 części wagowych substancji czynnej/mieszaniny substancji czynnych, 75 części wagowych cykloheksanonu jako rozpuszczalnika i 10 części wagowych oksyetylenowanego nonylofenolu jako emulgatora.

e) Granulat dyspergowalny w wodzie otrzymuje się przez zmieszanie części wagowych substancji czynnej/mieszaniny substancji czynnych, części wagowych lignosulfonianu wapnia, części wagowych laurylosiarczanu sodu, części wagowych polialkoholu winylowego i części wagowych kaolinu, zmielenie całości w młynie palcowym i granulację proszku w złożu fluidalnym przez natryskiwanie wody jako cieczy granulującej.

f) Granulat dyspergowalny w wodzie można także otrzymać gdy części wagowych substancji czynnej/mieszaniny substancji czynnych, części wagowych 2,2'-dinaftylometano-6,6'-disulfonianu sodu, części wagowe oleoilometylotaurynianu sodu, część wagową polialkoholu winylowego, części wagowych węglanu wapnia i części wagowych wody podda się homogenizacji i rozdrobnieniu w młynie koloidalnym, a następnie zmieli w młynie kulkowym i otrzymaną zawiesinę rozpyli się przez dyszę hydrauliczną i wysuszy w wieży rozpyłowej.

PL 217 220 B1

P r z y k ł a d y b i o l o g i c z n e

1. Działanie na chwasty drogą zabiegu przedwschodowego

Nasiona lub kłącza chwastów jedno- i dwuliściennych umieszczono w tekturowych doniczkach w glebie piaszczysto-gliniastej i przykryto glebą. Środki w postaci stężonych wodnych roztworów, zwilżalnych proszków lub koncentratów emulsyjnych sformułowano jako wodne roztwory, zawiesiny lub emulsje i naniesiono w różnych dawkach na powierzchnię gleby z taką ilością wody, by w przeliczeniu uzyskać dawkę nanoszenia 600 - 800 l/ha. Po potraktowaniu doniczki przeniesiono do szklarni i pozostawiono w warunkach dobrych dla wzrostu chwastów. Optyczną ocenę roślin lub uszkodzeń wzrastających roślin przeprowadzono po wzrastaniu testowych roślin przez 3 - 4 tygodnie i przeprowadzono porównanie z nietraktowanymi roślinami kontrolnymi. Wyniki badań środków według wynalazku wykazują drogą zabiegu przedwschodowego dobre działanie chwastobójcze przeciw szerokiemu spektrum chwastów szerokolistnych i chwastów trawiastych.

Ponadto zaobserwowano, że często działania kompozycji według wynalazku przewyższają formalną sumę działania przy oddzielnym nanoszeniu herbicydów (działanie synergiczne).

Gdy obserwowane działanie przewyższa formalną sumę działań przy oddzielnym nanoszeniu herbicydów, to przewyższa ono również oczekiwaną wartość według Colby'ego, obliczoną według poniższego wzoru i uważaną za wskaźnik wystąpienia synergizmu (patrz S. R. Colby; Weeds 15 (1967) str. 20 - 22):

E = A + B - (A x B/100) gdzie: A i B oznaczają działanie substancji czynnych A lub B w % przy ilości a lub b w g sc/ha; a E oznacza wartość oczekiwaną w % przy ilości a + b w g sc/ha.

Wartości zaobserwowane w próbach wykazują, że przy odpowiednio niskich dawkach działanie kompozycji przewyższa wartości oczekiwane według Colby'ego.

2. Działanie na chwasty drogą zabiegu powschodowego

Nasiona lub kłącza jedno- i dwuliściennych chwastów umieszczono w tekturowych doniczkach w glebie piaszczysto-gliniastej, przykryto glebą, umieszczono w szklarni i hodowano w dobrych warunkach. Po trzech tygodniach od wysiewu testowe rośliny w stadium trzeciego liścia potraktowano środkami według wynalazku. Środki według wynalazku sformułowane jako zwilżalne proszki lub koncentraty emulsyjne zastosowano w różnych dawkach do opryskiwania zielonych części roślin, z użyciem takiej ilości wody by w przeliczeniu dawki nanoszenia wynosiły 600 - 800 l/ha. Po około 3 - 4 tygodniach przebywania testowych roślin w szklarni w optymalnych warunkach wzrostu oceniono optycznie działanie preparatów w porównaniu do nietraktowanych kontrolnych roślin. Środki według wynalazku wykazują drogą zabiegu powschodowego dobre działanie chwastobójcze przeciw szerokiemu spektrum ważnych w rolnictwie chwastów szerokolistnych i chwastów trawiastych.

Ponadto zaobserwowano, że często działania kompozycji według wynalazku przewyższają formalną sumę działania uzyskiwaną przy nanoszeniu pojedynczych herbicydów. Wartości zaobserwowane w próbach wykazują, że przy odpowiednio niskich dawkach działanie kompozycji przewyższa wartości oczekiwane według Colby'ego (patrz ocena w przykładzie 1).

3. Działanie chwastobójcze i oporność roślin uprawnych (próba połowa)

Transgeniczne rośliny buraków cukrowych z opornością przeciw jednemu lub większej liczbie herbicydów (A) wyhodowano razem z typowymi roślinami stanowiącymi chwasty na poletkach o wymiarach 2 x 5 m na wolnej przestrzeni i w naturalnych warunkach pod gołym niebem; alternatywnie dopuszczono do naturalnego zachwaszczenia roślin buraków cukrowych. Traktowanie środkami według wynalazku oraz traktowanie w oddzielnych zabiegach z użyciem poszczególnych substancji czynnych kompozycji w próbach kontrolnych prowadzono w standardowych warunkach za pomocą urządzenia spryskującego poletko przy dawkach nanoszenia wody 200 - 300 litrów/hektar w równoległych próbach według schematu z tabeli 1, to znaczy przed siewem i przedwschodowo, po siewie i przedwschodowo oraz powschodowo we wczesnym, średnim lub późnym stadium.

PL 217 220 B1

T a b e l a 1: Schemat stosowania - przykłady

Nanoszenie substancji czynnych	Przedwschodowo	Powschodowo w stadium do 2. liścia	Powschodowo w stadium 2-4. liścia	Powschodowo w stadium 6. liścia
łączne		(A)+(B)
			(A)+(B)
				(A)+(B)
sekwencyjne		(A2.2)	(B2.2)
		(B2.2)	(A2.2)
		(B2.2)		(A2.2)
		(A.2.2)		(B2.2)
		(A2.2)+(B2.2)
			(A2.2)+(B2.2)
				(A2.2)+(B2.2)
	(A)	(B)
		(B)	(A)
			(B)	(A)
		(A)	(B)
		(A)	(B)	(B)
		(A)+(B)	(A)+(B)
		(A)		(A)+(B)
				(A2.2)+(B2.2)
			(A)+(B)	(B)
	(A)+(B)	(A)+(B)
		(A)+(B)	(A)+(B)
		(A)+(B)	(A)+(B)	(A)+(B)

Skróty w tabeli 1:

(A2.2) = glifosat izopropyloamoniowy (B2.2) = fenmedifam (A) lub (B) oznaczają alternatywnie wszystkie herbicydy typu (A) lub (B) według definicji w opisie

W odstępach 2, 4, 6 i 8 tygodni po naniesieniu badano wizualnie chwastobójczą skuteczność substancji czynnych lub mieszanin substancji czynnych porównując poletka traktowane z nietraktowanymi poletkami kontrolnymi. Brano pod uwagę uszkodzenia i rozwój wszystkich nadziemnych części roślin. Ocenę przeprowadzono w skali procentowej (100% działania = wszystkie rośliny zginęły; 50% działania = 50% roślin i zielonych części roślin zginęło; 0% działania = nie stwierdzono działania = jak na nietraktowanym poletku kontrolnym). Wartości oceny z 4 poletek uśredniono.

Porównanie wykazało, że kompozycje według wynalazku wykazują silniejsze, a częściowo znacznie silniejsze działanie chwastobójcze niż suma działań pojedynczych herbicydów (=E^a). Działanie w badanych odstępach czasu przewyższało wartości oczekiwane według Colby'ego (=E^c) (patrz ocena w przykładzie 1), co wskazuje na synergizm. Rośliny buraków cukrowych nie zostały uszkodzone na skutek traktowania chwastobójczymi środkami lub zostały uszkodzone tylko nieznacznie.

Skróty podane w tabeli:

g sc/ha = gramy substancji czynnej (100% substancji czynnej) na hektar

E^a = formalna suma działania chwastobójczego przy nanoszeniu pojedynczo

E^c = wartość oczekiwana według Colby'ego (patrz ocena w przykładzie 1) „transgeniczny burak cukrowy = burak cukrowy, który na skutek opornościowego genu jest tolerancyjny w stosunku do substancji czynnej (A).

PL 217 220 B1

T a b e l a 2: Działanie chwastobójcze (próba połowa)

Substancja czynna/substancje czynne	Dawka1) g sc/ha	Działanie chwastobójcze2) w % przeciw Galium aparine
(A2.2)	1000	85
	500	60
	250	40
	125	10
(B2.2)	2000	30
	1000	30
	500	20
(B)	413	30
(B1.1+2.1+2.2)	(256+32+125)
(A2.2) + (B2.2)	500+500	85(Ea = 80)
	500+2000	93(Ea = 90)
(A2.2) + (B)	500+413	95(Ea = 90)
	125+413	75(Ea = 40)

Skróty w tabeli 2: patrz powyżej oraz ¹⁾ = Nanoszenie w stadium 4-5. liścia ²⁾ = Ocena w 26 dni po naniesieniu A2.2) = glifosat izopropyloamoniowy (B) = wspólne formułowanie (B1.1)+(B2.1)+(B2.2) (B1.1) = etofumesat (B2.1) = desmedifam (B2.2) = fenmedifam