NO861580L - PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF CELL ADHESION INHIBITORS. - Google Patents
PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF CELL ADHESION INHIBITORS.Info
- Publication number
- NO861580L NO861580L NO861580A NO861580A NO861580L NO 861580 L NO861580 L NO 861580L NO 861580 A NO861580 A NO 861580A NO 861580 A NO861580 A NO 861580A NO 861580 L NO861580 L NO 861580L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antiadhesins
- glycoproteins
- glycolipids
- antiadhesin
- treatment
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims abstract description 18
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005852 acetolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 2
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 claims description 2
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000002778 food additive Substances 0.000 claims 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 244000309466 calf Species 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 3
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 2
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 2
- 241000985694 Polypodiopsida Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- RMMXTBMQSGEXHJ-UHFFFAOYSA-N Aminophenazone Chemical compound O=C1C(N(C)C)=C(C)N(C)N1C1=CC=CC=C1 RMMXTBMQSGEXHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 206010012742 Diarrhoea infectious Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000009338 Gastric Mucins Human genes 0.000 description 1
- 108010009066 Gastric Mucins Proteins 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M Methantheline bromide Chemical compound [Br-].C1=CC=C2C(C(=O)OCC[N+](C)(CC)CC)C3=CC=CC=C3OC2=C1 PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010064983 Ovomucin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000035992 Postmortem Changes Diseases 0.000 description 1
- 102000005583 Pyrin Human genes 0.000 description 1
- 108010059278 Pyrin Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000212 aminophenazone Drugs 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 1
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000009388 chemical precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004320 controlled atmosphere Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005218 dilaceration Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000012812 general test Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Description
Foreliggende oppfinnelse angår forbedringer ved-rørende fremstilling av celleadhesjonsinhibitorer, de således erholdte antiadhesiner og legemidler og næringsmidler inneholdende disse. The present invention relates to improvements relating to the production of cell adhesion inhibitors, the thus obtained antiadhesins and pharmaceuticals and foodstuffs containing these.
Det er nå ålment erkjent at en meget stor del av mikroorganismer og spesielt patogene mikroorganismer har den egenskap at de kan festes til overflaten av det omgivende medium (enhver type av fast substans, human, animal, plante-celler) . Infektiøse mikroorganismer adherer til målcellene i kraft av organiserte molekylære strukturer i form av cap-sider, ytre membraner og/eller pili, fimbriae, flagella eller lignende, som generelt angis som adhesiner. It is now widely recognized that a very large proportion of microorganisms and particularly pathogenic microorganisms have the property that they can be attached to the surface of the surrounding medium (any type of solid substance, human, animal, plant cells). Infectious microorganisms adhere to the target cells by virtue of organized molecular structures in the form of caps, outer membranes and/or pili, fimbriae, flagella or the like, which are generally referred to as adhesins.
I et utall tilfeller er et absolutt krav for infek-sjonsmekanismen en foregående adhesjon av mikroorganismen til det omgivende medium eller direkte til ett av de enkelte ganger spesifikke membranreseptorer, idet dette er en betin-gelse for hver bakteriell kolonisering. Arten av disse mikrobielle strukturer eller adhesiner, og den av reseptorene som er ansvarlig for adhesjonsfenomenet, er fremdeles ikke fullstendig belyst, et stort antall studier publisert av forskjellige forfattere har funnet ut at dette fenomen med økende hell (se spesielt arbeidet av G. Chabanon i "Revue de 1'Inst. Pasteur de Lyon", 1984, t. 18, s. 85 - 105; G.W. Jones i "Microbial Interactions" Series B, Vol. 3, s. 141 - 176 In numerous cases, an absolute requirement for the infection mechanism is a prior adhesion of the microorganism to the surrounding medium or directly to one of the individual time-specific membrane receptors, as this is a condition for every bacterial colonization. The nature of these microbial structures or adhesins, and that of the receptors responsible for the adhesion phenomenon, is still not fully elucidated, a large number of studies published by different authors have found this phenomenon with increasing success (see especially the work of G. Chabanon in "Revue de 1'Inst. Pasteur de Lyon", 1984, p. 18, pp. 85 - 105; G. W. Jones in "Microbial Interactions" Series B, Vol. 3, pp. 141 - 176
(1977); og A. Gunnarsson et al. i "Infection and Immunity", (1977); and A. Gunnarsson et al. in "Infection and Immunity",
Juli 1984, s. 41 - 46, etc). Resultatet av disse studierJuly 1984, pp. 41 - 46, etc). The result of these studies
er at adhesiner virker ved hjelp av enkelte ganger spesifikke interaksjoner som er etablert mellom enkelte av deres seter eller enkelte av deres strukturelle enheter og kjemiske grup-per tilstedeværende i naboomgivelsene av den ytre membran av målcellen eller strukturen og/eller på dets overflate. is that adhesins work by means of sometimes specific interactions established between some of their sites or some of their structural units and chemical groups present in the immediate vicinity of the outer membrane of the target cell or structure and/or on its surface.
Blant forskjellige midler som for tiden anvendesAmong various means currently used
for å bekjempe infektiøse midler anvendes i særdeleshet føl-gende to: to combat infectious agents, the following two are used in particular:
- vaksinasjon (preventiv virkning),- vaccination (preventive effect),
- antibioterapi (legende virkning).- antibiotic therapy (legend effect).
I noen tid (cf. Sharon et al. i "Adhesion and Microorganism Pathogenicity" Ciba Foundation Symposium 80, s. 119 - 135; D.C. OLD i J.gen. Microbiol. 1972, 71, s. 149 - 157; og G.W. JONES er imidlertid en metode for å bekjempe infeksjon blitt anbefalt som består i inhibering av adhesjons-egenskaper av mikroorganismer. Denne inhibering ved konkur-rering innbefatter enkle sukkere av veldefinert struktur, slik som monosaccharider. De erholdte resultater, selv om disse er oppmuntrende, har ikke gitt en tilfredsstillende løsning på problemet. For some time (cf. Sharon et al. in "Adhesion and Microorganism Pathogenicity" Ciba Foundation Symposium 80, pp. 119 - 135; D.C. OLD in J.gen. Microbiol. 1972, 71, pp. 149 - 157; and G.W. JONES however, a method of combating infection has been recommended which consists in the inhibition of adhesion properties of microorganisms. This inhibition by competition involves simple sugars of well-defined structure, such as monosaccharides. The results obtained, although encouraging, have not provided a satisfactory solution to the problem.
I en grundig studie av fenomenet med bakteriell adhesjon, spesielt på dyr, har søkeren satt seg det mål å forbedre metoden for inhibering ved konkurrering og utvikle nye terapeutiske midler, antiadhesiner, som er i stand til å forhindre adhesjonen av patogene bakterier, idet man har satt seg det mål å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av antiadhesiner hvis virkning både er legende og forhind-rende: - legende når det infeksiøse middel allerede er nær eller i kontakt med målstrukturer eller cellen, idet det forårsaker dette å løsgjøres, - preventiv når risikoen for infeksjon er høy og administrering av antiadhesinene vil forhindre det patogene middel fra å nå målet. In a thorough study of the phenomenon of bacterial adhesion, especially in animals, the applicant has set himself the goal of improving the method of inhibition by competition and developing new therapeutic agents, antiadhesins, which are able to prevent the adhesion of pathogenic bacteria, having set itself the goal of providing a method for the production of antiadhesins whose effect is both curative and preventive: - curative when the infectious agent is already close to or in contact with target structures or the cell, as it causes this to become detached, - preventive when the risk for infection is high and administration of the antiadhesins will prevent the pathogenic agent from reaching its target.
Søkeren har funnet at de kjemiske interaksjoner involvert i fenomenet ved celleadhesjon passer inn i utallige modeller. Enkelte er spesifikke og basert på et fenomen med molekylær gjenkjennelse mellom et makromolekyl, som generelt er protein (lecitin eller lignende) og en membranreseptor; andre er ikke-spesifikke og medfører fenomener innbefattende ladning av hydrofob, elektrostatisk eller ionisk type eller hydrogenbindinger. Generelt er det sistnevnte fenomen ikke tilstrekkelig til å sikre en varig adhesjon, men de bidrar ofte til en stabilisering av de spesifikke interaksjoner. The applicant has found that the chemical interactions involved in the phenomenon of cell adhesion fit into countless models. Some are specific and based on a phenomenon of molecular recognition between a macromolecule, which is generally protein (lecithin or similar) and a membrane receptor; others are non-specific and involve phenomena including charge of the hydrophobic, electrostatic or ionic type or hydrogen bonds. In general, the latter phenomenon is not sufficient to ensure lasting adhesion, but they often contribute to a stabilization of the specific interactions.
I det sistnevnte tilfelle er de molekylære enheter som er aktive i reseptorene generelt av carbohydrat-karakter. In the latter case, the molecular units that are active in the receptors are generally of a carbohydrate nature.
Målet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av substanser som kan betraktes ut fra et kjemisk synspunkt som strukturer som imiterer receptorene involvert i gjenkjennelsesfenomenet. The aim of the present invention is to provide a method for the production of substances which can be considered from a chemical point of view as structures that imitate the receptors involved in the recognition phenomenon.
Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av inhibitorer av celleadhesjon, The present invention thus relates to a method for producing inhibitors of cell adhesion,
eller antiadhesiner, hvori glycoproteiner og/eller glycopeptider, lipidstrukturer og/eller glycolipider inneholdt i eller som stammer fra forskjellige væskeformige eller faste organiske substrater enzymatisk og/eller kjemisk lyseres, or antiadhesins, in which glycoproteins and/or glycopeptides, lipid structures and/or glycolipids contained in or originating from various liquid or solid organic substrates are enzymatically and/or chemically lysed,
og hvor strukturene som er resistente overfor lyset, som er delvis eller fullstendig av osidisk karakter og hvis molekylvekt alltid er større enn 1000, oppsamles og steriliseres. and where the structures which are resistant to the light, which are partially or completely osidic in nature and whose molecular weight is always greater than 1000, are collected and sterilized.
De således erholdte antiadhesiner, som kan podesThe thus obtained antiadhesins, which can be grafted
på forskjellige bærere om ønsket, motvirker adhesjonen av flere mikroorganismer og utgjør et foretrukket legemiddel for bekjempelse eller forhindring av infeksjon. on different carriers if desired, counteracts the adhesion of several microorganisms and constitutes a preferred medicament for combating or preventing infection.
I en fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen behandles glycoproteiner og/eller glycolipider uten å ekstraheres fra det organiske substrat. In an advantageous embodiment of the method according to the invention, glycoproteins and/or glycolipids are treated without being extracted from the organic substrate.
I en annen fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hydrolyseres glycoproteinene og/eller glycopeptidene og/eller glycolipidene etter at de er blitt ekstrahert fra det biologiske medium hvori de forelå. In another advantageous embodiment of the method according to the invention, the glycoproteins and/or glycopeptides and/or glycolipids are hydrolysed after they have been extracted from the biological medium in which they were present.
I en metode for utførelse av denne utførelsesform ekstraheres glycoproteinene med: a) behandling i et organisk medium med ethanol i nærvær av Na caprylat, etterfulgt av In a method of carrying out this embodiment, the glycoproteins are extracted by: a) treatment in an organic medium with ethanol in the presence of Na caprylate, followed by
b) varmebehandling (60 - 70° C) og separering avb) heat treatment (60 - 70° C) and separation of
de utf elte glycoproteiner, og sluttelig c) proteolyse etterfulgt om hensiktsmessig, med hydrazinolyse. the precipitated glycoproteins, and finally c) proteolysis followed, if appropriate, by hydrazinolysis.
Ved en annen metode for utførelse av denne utføre-lsesform ekstraheres glycolipidene ved virkningen av en blanding av løsningsmidler, og underkastes deretter hydrolyse. In another method of carrying out this embodiment, the glycolipids are extracted by the action of a mixture of solvents and then subjected to hydrolysis.
Løsningsmidlene anvendt for å ekstrahere glucn-lipinene kan bestå av den binære blanding kloroform/ethanol eller den ternære blanding kloroform/ethanol/aceton. The solvents used to extract the glucnlipins can consist of the binary mixture chloroform/ethanol or the ternary mixture chloroform/ethanol/acetone.
Ifølge oppfinnelsen utføres hydrolysen som følger:According to the invention, the hydrolysis is carried out as follows:
1) Når det gjelder glycoproteiner, ved hjelp av1) In the case of glycoproteins, by means of
et protease, og fortrinnsvis ved hjelp av termolysin i nærværa protease, and preferably by means of thermolysin in the presence
av calsiumioner ved pH på mellom 5 og 7 og ved en temperatur under eller lik 80° C, etterfulgt av hydrazinolyse eller en analog kjemisk behandling som gjør det mulig å frigjøre antiadhesinbestanddelen; 2) når det gjelder glycolipider, ved mild alkalisk hydrolyse etterfulgt av acetolysis eller en analog behandling for å isolere oligosaccharidstrukturen. of calcium ions at a pH of between 5 and 7 and at a temperature below or equal to 80° C, followed by hydrazinolysis or an analogous chemical treatment which makes it possible to release the antiadhesin component; 2) in the case of glycolipids, by mild alkaline hydrolysis followed by acetolysis or an analogous treatment to isolate the oligosaccharide structure.
I en fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter prosedyren rensing av oligosaccharidartene, og i særdeleshet, etter den enzymatis-ke hydrolyse, inaktivering av enzymet eller nøytralisering når det gjelder kjemisk lyse, hvoretter molekylærfiltrering gjør det mulig å oppsamle artene med en molekylvekt større enn 1000, hvoretter det foretas en sterilisering på en fil-termembran etter klaring av filtratet. In an advantageous embodiment of the method according to the invention, the procedure includes purification of the oligosaccharide species, and in particular, after the enzymatic hydrolysis, inactivation of the enzyme or neutralization in the case of chemical lysis, after which molecular filtration makes it possible to collect the species with a molecular weight greater than 1000 , after which sterilization is carried out on a filter membrane after clarification of the filtrate.
I en særlig fordelaktig utførelsesform konsentreres løsningen av antiadhesiner før sterilisering. Denne konsen-treringsprosess kan utføres ved hjelp av konvensjonelle midler slik som ultrafiltrering, utfelling, molekylekslusjons-kromatografi, ionebytterharpikser eller affinitetskromato-grafi. In a particularly advantageous embodiment, the solution of antiadhesins is concentrated before sterilization. This concentration process can be carried out by conventional means such as ultrafiltration, precipitation, molecular exclusion chromatography, ion exchange resins or affinity chromatography.
Foreliggende oppfinnelse angår også adhesiner erholdt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvilke antiadhesiner delvis eller fullstendig er av oligosaccharid-karakter, omfattende minst tre enkle eller substituerte oser, hvor én av osene nødvendigvis må være galactose eller glucose, og hvor molekylvekten av antiadhesinet alltid er større enn 1000. The present invention also relates to adhesins obtained by means of the method according to the invention, which antiadhesins are partially or completely of an oligosaccharide character, comprising at least three simple or substituted oses, where one of the oses must necessarily be galactose or glucose, and where the molecular weight of the antiadhesin is always greater than 1000.
Disse molekyler utgjør glimrende adhesjonsinhibi-torerfog de kan administreres i et utall av farmasøytiske former og kan også blandes med næringsmidler. Disse molekyler kan ha meget variert konfigurasjon. I deres strukturer har de kjerne, eller et skjelett, og perifere, terminale og/eller antennære sekvenser. De utviser i det minste enkle eller substituerte gal eller gle. Fig. 1-3 viser enkelte av disse strukturer ved hjelp av ikke-begrensende eksempler. Således viser fig. 1 en glycanstruktur av oligomannosid-typen av animalsk opprinnelse, These molecules make excellent adhesion inhibitor compounds, they can be administered in a number of pharmaceutical forms and can also be mixed with foodstuffs. These molecules can have very varied configurations. In their structures, they have core, or a skeleton, and peripheral, terminal and/or antennal sequences. At least they exhibit simple or substituted gal or gle. Fig. 1-3 show some of these structures by means of non-limiting examples. Thus, fig. 1 a glycan structure of the oligomannoside type of animal origin,
- fig. 2 viser en glycanstruktur av oligomannosid-type av - fig. 2 shows an oligomannoside-type glycan structure of
vegetabilsk opprinnelse,vegetable origin,
- fig. 3 og 4 viser den typiske struktur av glycaner inneholdende repeterende eller ikke-repeterende, substituerte eller usutstituerte N-acetyllactoseaminenheter, og - fig. 5-7 viser noen få eksempler på indre sekvenser av kjernen podet på bæreren: et glycopeptid av animalsk opprinnelse på protein eller peptidbærere (fig. 5) - fig. 3 and 4 show the typical structure of glycans containing repeating or non-repeating, substituted or unsubstituted N-acetyllactoseamine units, and - fig. 5-7 show a few examples of internal sequences of the core grafted on the carrier: a glycopeptide of animal origin on protein or peptide carriers (Fig. 5)
et glycopeptid av vegetabilsk opprinnelse på protein eller peptidbærere (fig. 6), og a glycopeptide of vegetable origin on protein or peptide carriers (Fig. 6), and
et antiadhesin podet på væskeformige bærere (fig. 7). an antiadhesin grafted onto liquid carriers (Fig. 7).
Følgende forkortelser anvendes i figurene: The following abbreviations are used in the figures:
I realiteten er alle organiske substrater egnet for fremstilling av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen. In reality, all organic substrates are suitable for the production of the antiadhesins according to the invention.
Således har søkeren anvendt:Thus, the applicant has used:
av biologiske væsker: blodplasma,fosterblodplasma-erythrocyter, urin, lymfevæske, cerebrespinalvæske, amniotisk væske, synovial væske; of biological fluids: blood plasma, fetal blood plasma-erythrocytes, urine, lymphatic fluid, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, synovial fluid;
av sekreter av forskjellige humane og animalske arter: melk, colostrum, gastrisk mucin, saliva, mucus; plantesekreter; of secretions of various human and animal species: milk, colostrum, gastric mucin, saliva, mucus; plant secretions;
fra kilder av procaryoter og eucaryoter, dvs. helcelle-ekstrakter av normale celler eller celler overført ved infeksjon: vira, fager, bakterier, fungi, gjær, alger, moser, lav, bregner, celler fra høyere dyr, celler fra høyere planter; from sources of prokaryotes and eukaryotes, i.e. whole-cell extracts of normal cells or cells transferred by infection: viruses, phages, bacteria, fungi, yeasts, algae, mosses, lichens, ferns, cells of higher animals, cells of higher plants;
av forskjlelige ekstrakter: celleekstrakter fra embryo, kjertler og vev, hjerne og nervevev, øyne, thymus, thyroid, pancreas, lunger, nyrer, lever, milt, tarmer, ben, muskler og placenta. of different extracts: cell extracts from embryos, glands and tissues, brain and nervous tissue, eyes, thymus, thyroid, pancreas, lungs, kidneys, liver, spleen, intestines, bones, muscles and placenta.
Oppfinnelsen forklares nærmere ved hjelp av den etterfølgende ytterligere beskrivelse, som henviser til eksempler for fremstilling av produktene ifølge oppfinnelsen, og også farmakologiske og kliniske forsøksrapporter som ved-rører aktiviteten av legemidlene ifølge oppfinnelsen. The invention is explained in more detail by means of the subsequent further description, which refers to examples for the production of the products according to the invention, and also pharmacological and clinical test reports relating to the activity of the drugs according to the invention.
De etterfølgende preparative eksempler såvel som testene for demonstrering av den inhiberende aktivitet av antiadhesinene, er gitt av illustrative grunner uten på noen måte å begrense oppfinnelsen. The following preparative examples as well as the tests for demonstrating the inhibitory activity of the antiadhesins are given for illustrative purposes without in any way limiting the invention.
PREPARATIVE EKSEMPLERPREPARATIVE EXAMPLES
A. Andtiadhesiner fra blodplasma av forskjellige arter Eksempel 1 A. Antiadhesins from blood plasma of different species Example 1
Blod oppsamlet med tilsatt antikoagulant ble sen-trifugert og separart i to faser: Plasma og cruor (suspen-sjon av erythrocyter). Plasmaet ble hydrolysert med et varmestabilt bakterielt protease, slik som thermolysin, som er i form av et lyofilisat inneholdende 25 % Na og Ca acetat bubbersalter (cf. Fransk patent 83 21033), Blood collected with added anticoagulant was later centrifuged and separated into two phases: Plasma and cruor (suspension of erythrocytes). The plasma was hydrolysed with a heat-stable bacterial protease, such as thermolysin, which is in the form of a lyophilisate containing 25% Na and Ca acetate bubble salts (cf. French patent 83 21033),
Etter inaktivering av enzymet ved varmebehandling (ved 75° C eller høyere) eller ved kjemisk utfelling, ble antiadhesinene med molekylvekt større enn 1000 oppsamlet og deretter klaret, ble befridd for lipider på en filterpresse ved hjelp av filterhjelpestoff, og ble sterilisert på en 0,22 y memb.ansikt. Antiadhesinene er eller kan erholdes ved bestemte kjemiske behandlinger, ved hydrasinolyse og/ eller ved hjelp av spesifike endoglycosidaser. Utbyttet av antiadhesin er ca. 5 % i forhold til proteinutgangsmaterialet. After inactivation of the enzyme by heat treatment (at 75°C or higher) or by chemical precipitation, the antiadhesins with molecular weight greater than 1000 were collected and then clarified, delipidated on a filter press using filter aid, and sterilized on a 0, 22 y memb.face. The antiadhesins are or can be obtained by certain chemical treatments, by hydrasinolysis and/or by means of specific endoglycosidases. The yield of antiadhesin is approx. 5% in relation to the protein starting material.
Eksempel 2Example 2
Plastmaet ble behandlet med ethanol (8 %) og natriumcaprylat (4 x 10 3 M). Etter varmebehandling i 15 minutter ved 68° C ble de utfelte glycoproteiner separert fra albuminet ved filtrering på en filterpresse i nærvær av filterhjelpestoffer. The plastic was treated with ethanol (8%) and sodium caprylate (4 x 10 3 M). After heat treatment for 15 minutes at 68° C, the precipitated glycoproteins were separated from the albumin by filtration on a filter press in the presence of filter aids.
Den vaskede "kake" av glycoproteiner utgjør sub-stratet for proteolyse. Utbyttet av antiadhesiner er ca. 10 %. The washed "cake" of glycoproteins constitutes the substrate for proteolysis. The yield of antiadhesins is approx. 10%.
Eksempel 3Example 3
Antiadhesinene erholdt ved hydrolyse i henholdThe antiadhesins obtained by hydrolysis according to
til Eksempel 1 og 2 ble konsentrert ved fysiokjemiske metoder: Ultrafiltrering, selektiv utfelling, molekylær ekstrusjonskromatografi, ionebyttekromatografi, affinitets-kromatografi. Denne sistnevnte teknikk ble anvendt for å separere de spesifikke individuelle arter. to Examples 1 and 2 were concentrated by physiochemical methods: Ultrafiltration, selective precipitation, molecular extrusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography. This latter technique was used to separate the specific individual species.
B. Antiadhesiner fra erythrocytmembraner fra forskjellige arter B. Antiadhesins from erythrocyte membranes from different species
Eksempel 4Example 4
De røde celler erholdt ved sentrifugering av blod oppsamlet med tilsatt antikoagulant ble vasket og cellemem-branene ble bearbeidet ved en modifisert versjon av fremgangsmåten beskrevet av A. Faure, J. Debrieun og M. Caron (Red. Cell. Ghosts: a tool for purification of lectins in lectins, 1983, vol. 3, s. 661 - 665, publ. Walter de Gruyter, Berlin). Utbyttet av lyofiliserte membraner var ca. 4 g pr. liter blod. The red cells obtained by centrifugation of blood collected with added anticoagulant were washed and the cell membranes were processed by a modified version of the method described by A. Faure, J. Debrieun and M. Caron (Ed. Cell. Ghosts: a tool for purification of lectins in lectins, 1983, vol. 3, pp. 661 - 665, publ. Walter de Gruyter, Berlin). The yield of lyophilized membranes was approx. 4 g per liters of blood.
Eksempel 5Example 5
Erythrocytmembranene erholdt i henhold til Eksempel 4 ble underkastet en proteolyttisk behandling lik den som er beskrevet i Eksempel 1, hvilket muliggjorde erholdelse av antiadhesinene båret av strukturer av protein-type. The erythrocyte membranes obtained according to Example 4 were subjected to a proteolytic treatment similar to that described in Example 1, which made it possible to obtain the antiadhesins carried by protein-type structures.
Eksempel 6Example 6
Erythrocytmembranene erholdt i henhold til Eksempel 4 ble underkastet en prosess for ekstraksjon av glycolipidfraksjonene. Lipidfraksjonene ble erholdt ved innvirkning av en 2:1 blanding av kloroform og methanol og en andre ekstraksjon med en 1:9 blanding av de samme løs-ningsmidler eller med 2:1:30 ternær blanding av kloroform, ethanol og aceton. De erholdte ekstrakter ble underkastet en mild alkalisk hydrolyse, etterfulgt av en ytterligere oppdeling og fraksjonering ved kromatografi på silicagel. Elueringen ble utført med blandinger av methanol (x vol) og kloroform (y vol) slik at x/y økte fra 1:9 til 20:1. The erythrocyte membranes obtained according to Example 4 were subjected to a process for extraction of the glycolipid fractions. The lipid fractions were obtained by the action of a 2:1 mixture of chloroform and methanol and a second extraction with a 1:9 mixture of the same solvents or with a 2:1:30 ternary mixture of chloroform, ethanol and acetone. The extracts obtained were subjected to mild alkaline hydrolysis, followed by further separation and fractionation by chromatography on silica gel. The elution was carried out with mixtures of methanol (x vol) and chloroform (y vol) so that x/y increased from 1:9 to 20:1.
Etter kjemisk hydrolyse eller en acetolys-behandling, muliggjorde kromatografiske metoder i henhold til en modifisert prosess beskrevet av A. Gunnarsson et al., i "Infection and Immunity", juli 1984, s. 41 - 46 å After chemical hydrolysis or an acetolysis treatment, chromatographic methods according to a modified process described by A. Gunnarsson et al., in "Infection and Immunity", July 1984, pp. 41 - 46 enabled
isolere de individuelle oligosaccharidstrukturer med en molekylvekt alltid større enn 1000. Utbyttet var ca. 1 %. Alle erholdte fraksjoner inneholdt i det minste enkle eller substituerte gal og gle. isolate the individual oligosaccharide structures with a molecular weight always greater than 1000. The yield was approx. 1%. All fractions obtained contained at least single or substituted gal and gle.
C. Antiadhesiner avledet fra biologiske væsker forskjellig fra blod C. Antiadhesins derived from biological fluids other than blood
Eksempel 7Example 7
Etter konsentrering gjennomgikk utgangsmaterialene en proteolytisk behandling i henhold til Eksempel 1 eller en glycolipidekstraksjonsprosess i henhold til Eksempel 6. Utbyttet var av størrelsesorden 0,5 - 1 %. After concentration, the starting materials underwent a proteolytic treatment according to Example 1 or a glycolipid extraction process according to Example 6. The yield was of the order of 0.5-1%.
D. Antiadhesiner erholdt fra pattedyrsekreter av forskjlelige animalske og/ eller humane arter D. Antiadhesins obtained from mammalian secretions of various animal and/or human species
Eksempel 8Example 8
Colostrum eller melken gjennomgikk en protelytisk behandling og rensing i henhold til Eksempel 1 og/eller en behandling for ekstraksjon av lipidstrukturene i henhold til Eksempel 6. The colostrum or the milk underwent a proteolytic treatment and purification according to Example 1 and/or a treatment for extraction of the lipid structures according to Example 6.
E. Antiadhesiner erholdt fra mucus fra animalske arter, eksemplifisert ved intestinal mucus E. Antiadhesins obtained from mucus of animal species, exemplified by intestinal mucus
Eksempel 9Example 9
Mucus fra duodenum, jejunum og ileum ble oppsamlet ved skrapning. Det suspenderte biologiske materiale ble befridd for forurensninger og cellebestanddeler ved sentrifugering ved 20 000 g. Etter dialyse utgjør løsningen av mucosale glucoproteiner, etter filtrering under sterile betingelser, subtratet for proteolysen i henhold til Eksempel 1. Mucus from the duodenum, jejunum and ileum was collected by scraping. The suspended biological material was freed from impurities and cell constituents by centrifugation at 20,000 g. After dialysis, the solution of mucosal glucoproteins, after filtration under sterile conditions, constitutes the substrate for the proteolysis according to Example 1.
F. Antiadhesiner avledet fra intestinale glycopeptider og glycolipider F. Antiadhesins derived from intestinal glycopeptides and glycolipids
Eksempel 10Example 10
Villi og epitel-cellene ble oppsamlet ved skrapning av duodenum, jejunum og ileum av det avlivede dyr og ble vasket ved sentrifugering. Etter homogenisering i en Potter homogenisator, eller delvis hydrolyse med trypsin The villi and epithelial cells were collected by scraping the duodenum, jejunum and ileum of the killed animal and were washed by centrifugation. After homogenization in a Potter homogenizer, or partial hydrolysis with trypsin
(15 minutter ved 37° C), ble lipidene ekstrahert med en (15 min at 37° C), the lipids were extracted with a
kloroform/methanol/vannblanding (4:8:3 v/v). Dette ga to fraksjoner: Lipider og glycolipider og lipid-frie celler. chloroform/methanol/water mixture (4:8:3 v/v). This gave two fractions: Lipids and glycolipids and lipid-free cells.
Glycolipidekstraktene ble behandlet ved fremgangsmåten ifølge Eksempel 6. De lipid-fri epitele celler ble hydrolysert ved metoden beskrevet i Eksempel 1. The glycolipid extracts were processed by the method according to Example 6. The lipid-free epithelial cells were hydrolysed by the method described in Example 1.
G. Antiadhesiner avledet fra plantesekreterG. Antiadhesins derived from plant secretions
Eksempel 11Example 11
Sekretene suspendert i en vandig eller organisk buffret løsning, avhengig av det bestemte tilfelle, gjennom-aikk en proteolytisk behandling og rensing i henhold til Eksempel 1 og 3 og/eller en behandling i henhold til Eksempel 6. The secretions suspended in an aqueous or organic buffered solution, depending on the specific case, undergo a proteolytic treatment and purification according to Examples 1 and 3 and/or a treatment according to Example 6.
H. Antiadhesiner avledet fra virusH. Antiadhesins derived from viruses
Eksempel 12Example 12
Virus erholdt fra infiserte fluida eller celler ble renset ved densitetsgradient-ultrasentrifugering. Viruses obtained from infected fluids or cells were purified by density gradient ultracentrifugation.
Glycoproteinene som bærer oligosaccharidstrukturene ble ekstrahert med butanol, etter behandling med membran-detergenter, ved en metode utledet fra metoden ifølge L.A. Hunt (Glycosidase analysis of large acidic-type glycopeptides from viral and cellular membrane glycoproteins, Biochem, J., 1983, 209, 659 - 667). The glycoproteins carrying the oligosaccharide structures were extracted with butanol, after treatment with membrane detergents, by a method derived from the method of L.A. Hunt (Glycosidase analysis of large acidic-type glycopeptides from viral and cellular membrane glycoproteins, Biochem, J., 1983, 209, 659 - 667).
Antiadhesinene ble erholdt ved ensymatisk oppslut-ning og ble renset i henhold til Eksempel 1 og 3. The antiadhesins were obtained by enzymatic digestion and were purified according to Examples 1 and 3.
I. Antiadhesiner avledet fra fagerI. Antiadhesins derived from phages
Eksempel 13Example 13
Fagene ble isolert fra forskjellig væskeformig gjødsel, gårdsgjødsel etc. ved metoden ifølge Smith and Huggins, 1982 (Successful treatment of experimental E. coli infections in mice using phage: its general superiority ever antibiotics, J. of General Bacteriology, 128, 307 - 318). Oligosaccharidene ble erholdt ved proteolysen ifølge eksempel 1. The phages were isolated from various liquid fertilizers, farmyard manure etc. by the method according to Smith and Huggins, 1982 (Successful treatment of experimental E. coli infections in mice using phage: its general superiority ever antibiotics, J. of General Bacteriology, 128, 307 - 318 ). The oligosaccharides were obtained by the proteolysis according to example 1.
J. Antiadhesiner erholdt fra bakterierJ. Antiadhesins obtained from bacteria
Eksempel 14Example 14
Bakteriene ble generelt dyrket ved 37° C i 24The bacteria were generally grown at 37°C for 24
timer på et medium egnet for utvikling av disse (eksempler er E. coli K88 på trypticase-soyamedium, E. coli K99 på hours on a medium suitable for their development (examples are E. coli K88 on trypticase soy medium, E. coli K99 on
Minca's medium, lactobacilli på Rogosas medium etc.).Minca's medium, lactobacilli on Rogosa's medium etc.).
De bakterielle ekstrakter ble erholdt ved ultra-sonisk oppbrytning, hvoretter de ble konsentrert og underkastet hydrolyse i henhold til Eksempel 1 og 3 eller ekstraksjon av lipidstrukturene i henhold til Eksempel 6. The bacterial extracts were obtained by ultrasonic digestion, after which they were concentrated and subjected to hydrolysis according to Examples 1 and 3 or extraction of the lipid structures according to Example 6.
K. Antiadhesjiner fra fungi, gjærK. Antiadhesions from fungi, yeast
Eksempel 15Example 15
Organismene ble isolert ved sentrifugering fra industrielle ekstrakter eller dyrkningsmedia anvendt for å mangfoldiggjøre disse. Ekstraktene ble underkastet proteolyse i henhold til Eksempel 1, 2, 3 eller 6. The organisms were isolated by centrifugation from industrial extracts or culture media used to multiply these. The extracts were subjected to proteolysis according to Example 1, 2, 3 or 6.
1. Antiadhesiner avledet fra alger, moser, lav, bregner Eksempel 16 1. Antiadhesins derived from algae, mosses, lichens, ferns Example 16
Plantene ble malt, glycoproteinene ble oppløst i en buffret løsning og underkastet hydrolyse i henhold til Eksempel 1, og antiadhesinene ble renset i henhold til Eksempel 3 eller 6. The plants were ground, the glycoproteins were dissolved in a buffered solution and subjected to hydrolysis according to Example 1, and the antiadhesins were purified according to Example 3 or 6.
M. Antiadhesiner ekstrahert fra høyere planterM. Antiadhesins extracted from higher plants
Eksempel 17Example 17
Plantene, tilgjengelige i tørr eller våt, fullstendig malt tilstand og som er i stand til å fraksjoneres i to komponenter, dvs. protein og lipidkomponenter, ble underkastet de fremgangsmåter som er beskrevet i Eksempel 1, 3 eller 6, etter oppløsning eller suspendering om nødvendig. The plants, available in a dry or wet, fully ground state and capable of being fractionated into two components, i.e. protein and lipid components, were subjected to the procedures described in Examples 1, 3 or 6, after dissolution or suspension if necessary .
N. Antiadhesiner isolert fra vev eller organerN. Antiadhesins isolated from tissues or organs
Eksempel 18Example 18
Glycolipidene og glycopeptidene ble erholdt ved maling av hele organer slik som hjerne, nyre, lever, lunger etc. Glycolipidene ble ekstrahert i henhold til Eksempel 6. Glycopeptidene ble erholdt ved hydrolyse i henhold til Eksempel 1 eller 2. Disse kan separeres fra glycosamino-glycanene ved utfelling av sistnevnte med cetylpyridinium-klorid, og behandles deretter i henhold til Eksempel 3. The glycolipids and glycopeptides were obtained by staining whole organs such as brain, kidney, liver, lungs, etc. The glycolipids were extracted according to Example 6. The glycopeptides were obtained by hydrolysis according to Example 1 or 2. These can be separated from the glycosamino-glycans by precipitation of the latter with cetylpyridinium chloride, and then treated according to Example 3.
0. Antiadhesiner isolert fra egg0. Antiadhesins isolated from eggs
Eksempel 19Example 19
Egg-glycoproteinene (slik som ovomucoid, avidin, ovalbumin) oppsamlet etter selektiv utfelling av lysozymet og kromatografiske separasjoner, ble underkastet proteolyse i henhold til Eksempel 1, og antiadhesinene ble konsentrert og renset i henhold til Eksempel 3. The egg glycoproteins (such as ovomucoid, avidin, ovalbumin) collected after selective precipitation of the lysozyme and chromatographic separations were subjected to proteolysis according to Example 1, and the antiadhesins were concentrated and purified according to Example 3.
Demonstrasjon av den inhiberende aktivitet overfor bakteriell adhesjon Demonstration of the inhibitory activity against bacterial adhesion
Følgende ble utført for å demonstrere aktiviteten av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen: - in vitro forsøk på mål som de studerte mikroorganismer fester seg på, - in vivo forsøk på dyr bevisst infisert med patogene mikroorganismer, The following was carried out to demonstrate the activity of the antiadhesins according to the invention: - in vitro experiments on targets on which the studied microorganisms attach, - in vivo experiments on animals deliberately infected with pathogenic microorganisms,
- kliniske forsøk.- clinical trials.
Den følgende prosedyre ble tilpasset for in vitro forsøkene: 1. Methodologi av aktivitetstesten på produktet som inhiberer adhesjon av mikroorganismen til målcellene The following procedure was adapted for the in vitro experiments: 1. Methodology of the activity test on the product that inhibits adhesion of the microorganism to the target cells
Adhesjon ble utført ved å bringe mikroorganismenAdhesion was performed by bringing the microorganism
i kontakt med de fri eller immobiliserte mål ved hjelp av inhibering. Med parametrene for konsentrasjon, pH, ione-styrke, ionekarakter, temperatur og testvarighet definert, ble adhesjonsinhiberingstesten utført enten ved preinkubering av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen med mikroorganismene, eller ved innføring av antiadhesinene i mediet inneholdende det mikrobielle middel og målstrukturen, fri eller immobilisert på en bærer. in contact with the free or immobilized targets by means of inhibition. With the parameters for concentration, pH, ionic strength, ionic character, temperature and test duration defined, the adhesion inhibition test was performed either by preincubating the antiadhesins according to the invention with the microorganisms, or by introducing the antiadhesins into the medium containing the microbial agent and the target structure, free or immobilized on a carries.
Adhesjonen og antiadhesjonen ble observert og/eller kvantifisert: - visuelt mulig, avhengig av det angjeldende system, - ved optisk mikroskopi, enten ved direkte avles-ning etter (eller uten) beising, eller ved fasekontrast, The adhesion and anti-adhesion were observed and/or quantified: - visually possible, depending on the system in question, - by optical microscopy, either by direct reading after (or without) staining, or by phase contrast,
- ved spéktrofotometri,- by spectrophotometry,
- ved måling av radioaktiviteten eller fluorescens av mikroorganismene festet til målet. - when measuring the radioactivity or fluorescence of the microorganisms attached to the target.
Den sistnevnte metode gir en bedre kvantifisering av fenomenet. The latter method provides a better quantification of the phenomenon.
2. Beskrivelse av en generell adhesjons- og anti-adhesjonstest basert på måling av radioaktiviteten av mikroorganismer bundet til målceller 2. Description of a general adhesion and anti-adhesion test based on measuring the radioactivity of microorganisms bound to target cells
PrinsippPrinciple
De undersøkte mikroorganismer ble dyrket og radio-aktivt merket ved innarbeidelse av forløpere inn i deres bestanddelmateriale. The investigated microorganisms were cultured and radio-actively labeled by incorporating precursors into their constituent material.
Sluttkonsentrasjonen av mikroorganismen ble justert i henhold til testbetingelsene. Målestrukturene, dvs. cellene og/eller deres mucus, ble preparert ved de forskjellige teknikker som er beskrevet i litteraturen for erholdelse av celler. Det etterstrebede kvalitetskriterium er den studerte mikroorganismes adhesjonsevne. The final concentration of the microorganism was adjusted according to the test conditions. The target structures, i.e. the cells and/or their mucus, were prepared by the various techniques described in the literature for obtaining cells. The sought-after quality criterion is the adhesion ability of the microorganism studied.
Test Test
Testcellene og/eller deres mucus ble immobilisert på en egnet bærer som muliggjorde at radioaktive mikroorganismer kunne bringes i kontakt med disse, i nærvær eller fravær av antiadhesinene. Etter suksessiv vasking ble det biologiske materiale (målceller pluss adherende radioaktive bakterier) fjernet fra bæreren ved hjelp av en egnet behandling, og radioaktiviteten i mediet ble tellet ved væskescintillasjon. The test cells and/or their mucus were immobilized on a suitable carrier which enabled radioactive microorganisms to be brought into contact with them, in the presence or absence of the antiadhesins. After successive washings, the biological material (target cells plus adherent radioactive bacteria) was removed from the support by means of a suitable treatment, and the radioactivity in the medium was counted by liquid scintillation.
I hvert forsøk uttrykker kontrollverdien 100 % adhesjon. Testen gjør det mulig å kvantifisere den biologiske aktivitet av antiadhesinene i forhold til deres enhets-masse. In each experiment, the control value expresses 100% adhesion. The test makes it possible to quantify the biological activity of the antiadhesins in relation to their unit mass.
3. Anvendelse av denne generelle test når det gjelder adhesjonen av E. coli K99 til målceller og/ eller deres mucus 3. Application of this general test to the adhesion of E. coli K99 to target cells and/or their mucus
E. coli K99 ble dyrket på et egnet medium inneholdende glucose og vitaminer, for eksempel Minca's medium (Guinée P.A.M., Jansen W.H., Agterberg CM., 1976), til hvilket en radioaktiv kjemisk forbindelse (aminosyre, pyrin eller pyrimidin nucleosid, natriumacetat etc.) var tilsatt, som er en forløper som er i stand til å inkorporeres i mikroorganismens bestanddelsmateriale. E. coli K99 was grown on a suitable medium containing glucose and vitamins, for example Minca's medium (Guinée P.A.M., Jansen W.H., Agterberg CM., 1976), to which a radioactive chemical compound (amino acid, pyrin or pyrimidine nucleoside, sodium acetate etc. ) was added, which is a precursor capable of being incorporated into the constituent material of the microorganism.
Etter 18 timers dyrkning, ved 37° C hvis syntese av K99 pili skal finne sted, eller ved 18° C hvis den ikke skal finne sted, ble bakteriene oppsamlet, vasket og suspendert i en konvensjonell bufferløsning ved pH 7,2 (HEPES-Hanks, saltvannfosfatbuffer etc.). After 18 hours of cultivation, at 37°C if synthesis of K99 pili is to take place, or at 18°C if it is not to take place, the bacteria were collected, washed and suspended in a conventional buffer solution at pH 7.2 (HEPES-Hanks , saline phosphate buffer etc.).
Bakterieantallet ble funnet ved måling av den optiske densitet (OD) mellom 420 og 662 nm (OD er en lineær funksjon av antall kolonier, OD = f(C)), og konsentrasjonen ble justert til 10 8 - 10 9 bakterie/ml. Kontroller ble ut-ført med hensyn til nærvær av K99 pili ved seroagglutinasjon med anti-K99 antistoffer og med hensyn til levedyktigheten av bakteriecellene ved fortynning av en alikot og dyrkning på et egnet medium. - Fremstilling av målceller og/eller mucus og immobiliseringsteknikker (i henhold til CD. Laux et al., 1984) . The number of bacteria was found by measuring the optical density (OD) between 420 and 662 nm (OD is a linear function of the number of colonies, OD = f(C)), and the concentration was adjusted to 10 8 - 10 9 bacteria/ml. Controls were carried out with regard to the presence of K99 pili by seroagglutination with anti-K99 antibodies and with regard to the viability of the bacterial cells by diluting an aliquot and culturing on a suitable medium. - Preparation of target cells and/or mucus and immobilization techniques (according to CD. Laux et al., 1984).
Mucus ble fremstilt ved skraping av tynntarmen av det avlivede dyr (mus, unge kaniner, smågris, lam, kalver etc.) og ble oppsamlet i en buffret løsning med pH 7,2. Sentrifugering ved 28 000 g i 15 minutter muliggjorde fullstendig fjerning av cellebestanddeler og materialer. Pro-teinkonsentrasjonen av hvert preparat ble sjekket og justert til minst 3,5 mg/ml. Mucus was produced by scraping the small intestine of the killed animal (mice, young rabbits, piglets, lambs, calves, etc.) and was collected in a buffered solution with pH 7.2. Centrifugation at 28,000 g for 15 min enabled complete removal of cell constituents and materials. The protein concentration of each preparation was checked and adjusted to at least 3.5 mg/ml.
Cellene ble fremstilt ved skraping av tynntarmen av dyret (mus med alder mellom 5 og 8 uker, én ukes gamle kaniner, smågris, lam, kalv under 5 dager) og ble oppsamlet i en bufferløsning som ble anvendt for konservering av cellene. Sentrifugering ved 1000 g fjernet vevbestanddeler, The cells were prepared by scraping the small intestine of the animal (mice aged between 5 and 8 weeks, one-week-old rabbits, piglets, lambs, calves under 5 days) and were collected in a buffer solution that was used for preserving the cells. Centrifugation at 1000 g removed tissue components,
og filtrering og sentrifugering ved 2000 g fjernet forurens-ningene. Cellene av tarm villi ble isolert ved trypsinering (0,1 % trypsin) eller dilacerering (Potter homogenisator nr. 18) og konsentrasjonen ble justert til mellom 10 6 - 10<8>celler/ml. and filtration and centrifugation at 2000 g removed the impurities. The cells of intestinal villi were isolated by trypsinization (0.1% trypsin) or dilaceration (Potter homogenizer no. 18) and the concentration was adjusted to between 10 6 - 10<8>cells/ml.
Cellen eller mucus-preparetet (0,25 ml) ble inn-ført i brønnene av~?vdyrkningsplater, ble inkubert over natten ved 4° C og ble vasket to ganger med en bufferløsning ved pH 7,2 fer å fjerne de ubundne proteiner eller celler. The cell or the mucus preparation (0.25 ml) was introduced into the wells of culture plates, was incubated overnight at 4° C. and was washed twice with a buffer solution at pH 7.2 to remove the unbound proteins or cells.
Cellene av dyrearter (etablerte cellelinjer eller primærkulturer) ble dyrket i et celledyrkningsmedium i nærvær av 10 % kalvefosterserum, penicillin og streptomycin. De ble inkubert i 24 - 48 timer ved 37° C i en kontrollert atmos-fære, under dannelse av en sammenløpende monocellulært lag i brønnene av dyrkningsplatene. Ved bruk ble cellene vasket for å fjerne ethvert spor av virkningsmedium. The cells of animal species (established cell lines or primary cultures) were grown in a cell culture medium in the presence of 10% fetal calf serum, penicillin and streptomycin. They were incubated for 24-48 hours at 37°C in a controlled atmosphere, forming a confluent monocellular layer in the wells of the culture plates. Upon use, the cells were washed to remove any traces of working medium.
- Adhesjon og inhibering av adhesjon- Adhesion and inhibition of adhesion
Bakteriene (0,25 ml, dvs. minimum 50 000 dpm inkor-porert) og 50 yl buffer ble innført i brønnene og inkubert ved 37° C med de immobiliserte celler og/eller mucus. The bacteria (0.25 ml, i.e. minimum 50,000 dpm incorporated) and 50 µl of buffer were introduced into the wells and incubated at 37° C. with the immobilized cells and/or mucus.
Etter vasking med adherende bakterier løsgjort ved"virkningen av 0,5 ml 0,5 % SDS eller en hvilken som helst annen detergent eller gelatineringsmiddel, i 2 timer ved 37° C. After washing with adherent bacteria dislodged by the action of 0.5 ml of 0.5% SDS or any other detergent or gelling agent, for 2 hours at 37°C.
De tatte prøver (0,25 ml) ble deretter analysert ved måling av radioaktiviteten ved væskescintillasjon. The samples taken (0.25 ml) were then analyzed by measuring the radioactivity by liquid scintillation.
Ved testen for inhibering av adhesjon, ble legemidlet ifølge oppfinenlsen innført i det ovenfor beskrevne medium i 50 yl av bufferen som ledsaget bakteriene. In the test for inhibition of adhesion, the drug according to the invention was introduced into the medium described above in 50 µl of the buffer accompanying the bacteria.
Angivelse av resultateneIndication of the results
Resultatene ble uttrykt som mengden av radioakti-vitet gjenvunnet fra brønnene under de ovenfor definerte betingelser og i forhold til kontrollverdiene, med hvilke 100 % adhesjon var bestemt. The results were expressed as the amount of radioactivity recovered from the wells under the conditions defined above and in relation to the control values, with which 100% adhesion was determined.
En standard kurve for de erholdte resultater er vist på fig. 8a og 8b ved hjelp av eksempler som imidlertid ikke medfører noen begrensning. Inhiberingen er en lineær funksjon av logaritmen av legemiddelkonsentrasjonen. Enkle sukkere med en molekylvekt i størrelsesordenen 200, eller oligosaccharider med en molekylvekt i størrelsesordenen 400, dvs. med en molekylvekt på mindre enn 1000, har bare en svak inhiberende virkning, om noen over hodet. A standard curve for the results obtained is shown in fig. 8a and 8b by means of examples which, however, do not entail any limitation. The inhibition is a linear function of the logarithm of the drug concentration. Simple sugars with a molecular weight of the order of 200, or oligosaccharides with a molecular weight of the order of 400, i.e. with a molecular weight of less than 1000, have only a weak inhibitory effect, if any overhead.
4. Test for inhibering av mannose- resistens hemagglutinasjon 4. Test for inhibition of mannose-resistance haemagglutination
Dette er en annen modell for å studere adhesjonen av mikroorganismer til en målcelle, This is another model for studying the adhesion of microorganisms to a target cell,
a) Prinsippa) Principle
Bakteriene (10 7 - 10 9 bakterie/ml), i en konsentrasjon lik 10 hemagglutinasjonsenheter (én enhet svarer til den høyeste fortynning av bakteriesuspensjonen som er i stand til å agglutinere de rød celler av den valgte art i nærvær av mannose), ble suspendert i 25 pl buffret isotonisk løsning (pH 6,8 - 7,2) og ble inkubert i nærvær av 50 yl legemidler ifølge oppfinnelsen, eller fravær av dette, i 10 minutter ved 4 C eller ved romtemperatur. Erythrocytene, The bacteria (10 7 - 10 9 bacteria/ml), in a concentration equal to 10 hemagglutination units (one unit corresponds to the highest dilution of the bacterial suspension capable of agglutinating the red cells of the selected species in the presence of mannose), were suspended in 25 µl of buffered isotonic solution (pH 6.8 - 7.2) and was incubated in the presence of 50 µl of drugs according to the invention, or the absence thereof, for 10 minutes at 4 C or at room temperature. The erythrocytes,
i en konsentrasjon på 3 % (v/v) ble deretter tilsatt i et volum på 25 yl til det inkuberte medium. Resultatene ble avlest (visuelt eller ved mikroskop, turbiditetsmeter eller spektrofotometer) efter en kontakttid på 30 minutter, at a concentration of 3% (v/v) was then added in a volume of 25 µl to the incubated medium. The results were read (visually or with a microscope, turbidity meter or spectrophotometer) after a contact time of 30 minutes,
b) Anvendelse på colibacillib) Application to colibacilli
De anvendte systemer er beskrevet i Tabell 1. The systems used are described in Table 1.
c) Anvendelse på E. coli K9 9 c) Application to E. coli K9 9
Den inhiberende kapasitet til legemidlet, nemlig The inhibitory capacity of the drug viz
den reciproke verdi av den minimale konsentrasjon som er i stand til å inhibere agglutinasjonen av rød saueceller ved E. coli K99, er proporsjonal med mengden av substansene ifølge oppfinnelsen (se fig. 9). 5. Test for adhesjon og aktivitet av anti- adhesinene utført på celler eller villi ved mikroskopisk observasjon Anvendelse på adhesjonen av E. coli K99 til kalve erythrocyter. the reciprocal value of the minimum concentration capable of inhibiting the agglutination of red sheep cells by E. coli K99 is proportional to the amount of the substances according to the invention (see fig. 9). 5. Test for adhesion and activity of the anti-adhesins carried out on cells or villi by microscopic observation Application to the adhesion of E. coli K99 to calf erythrocytes.
Villi eller celler erholdt ved den ovenfor beskrevne teknikk ble anvendt enten umiddelbart eller etter frysing ved -20° C i Hanks-medium eller et medium som er egnet for konservering av celler. I det tilfelle hvor fryste prepa-rater anvendes, fjernes additivene ved suksessiv vasking. Villi or cells obtained by the technique described above were used either immediately or after freezing at -20°C in Hanks medium or a medium suitable for the preservation of cells. In the case where frozen preparations are used, the additives are removed by successive washing.
Bakteriene (10 7 - 10 11/ml) ble bragt i kontakt med cellepreparatet (IO<7>celle/ml) i 40 minutter ved 20° C eller 37° C, avhengig av systemet, i et pH-område på 5,5 - 8,5, i nærvær eller fravær av legemiddel ifølge oppfinnelsen. The bacteria (10 7 - 10 11 /ml) were brought into contact with the cell preparation (10<7>cell/ml) for 40 minutes at 20° C or 37° C, depending on the system, in a pH range of 5.5 - 8.5, in the presence or absence of a drug according to the invention.
Adhesjonen er positiv når mere enn 15 bakterier festes til celleoverflaten. Inhiberingen uttrykkes ved formelen: Adhesion is positive when more than 15 bacteria attach to the cell surface. The inhibition is expressed by the formula:
Med 2 x IO<5>celler (200 yl) bragt i kotnakt med With 2 x 10<5> cells (200 yl) brought into cot night with
2 x 10 bakterier (200 yl) i 40 minutter ved 37° C i nærvær av 0,25 mg av produkt ifølge oppfinnelsen, var den observerte inhibering 60 - 65 % i forhold til kontrollverdien. 2 x 10 bacteria (200 µl) for 40 minutes at 37° C. in the presence of 0.25 mg of product according to the invention, the observed inhibition was 60 - 65% in relation to the control value.
Følgende prosedyre ble tilpasset in vivo-forsøkene: 1) Eksperimentell inokulering av unge mus med E. The following procedure was adapted to the in vivo experiments: 1) Experimental inoculation of young mice with E.
coli K99coli K99
GruppeEr av mus fra samme rase (SWISS, OFl, CD etc.) som var yngre enn 48 timer, ble infisert oralt med Groups of mice from the same breed (SWISS, OFl, CD etc.) that were younger than 48 hours were infected orally with
4 5 5 x 10 eller 10 E. coli K99. Forandringen i populasjon ble fulgt i 3 dager (D) etter en enkel oral administrering av legemidlet ifølge oppfinnelsen, 30 minutter etter infeksjon, eller uten behandling. Når det gjelder en LD^q„ infeksjon i 3 dager etter 4 5 inokulering (5 x 10 - 10 E. coli K99/individ) er beskyttel-sen av populasjonen vist i Tabell II: 2) Eksperimentell inokulering av nyfødte kalver med E. coli K99 Diaré ble reproduset ved den teknikk som er utledet fra hva som er beskrevet av H.W. Smith and S.S. Hall (1967). Kalvene som var yngre enn 8 timer gamle og frie for råmelk, ble infiset oralt med en lethal dose av 10 0 E. coli K99. Den ubehandlede kontrollgruppe døde i løpet av mindre enn 48 timer etter dehydrering. Testkalvene ble behandlet ved oral administrering av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen. 4 5 5 x 10 or 10 E. coli K99. The change in population was followed for 3 days (D) after a single oral administration of the drug according to the invention, 30 minutes after infection, or without treatment. In the case of an LD^q„ infection for 3 days after 4 5 inoculation (5 x 10 - 10 E. coli K99/individual) is the protection of the population shown in Table II: 2) Experimental inoculation of newborn calves with E. coli K99 Diarrhea was reproduced by the technique derived from what is described by H.W. Smith and S.S. Hall (1967). The calves, which were less than 8 hours old and free of colostrum, were infected orally with a lethal dose of 10 0 E. coli K99. The untreated control group died within less than 48 hours of dehydration. The test calves were treated by oral administration of the antiadhesins according to the invention.
Flere behandlingsmetoder viste seg å være effektive, etter administrering i 2 timer etter inokulering, eller så snart diaréen hadde startet. Alle de behandlede dyr ble restituert. Several methods of treatment were found to be effective, after administration within 2 hours of inoculation, or as soon as the diarrhea had started. All the treated animals recovered.
Den kliniske forbedring var hurtig og bedringen ble observert i løpet av mindre enn 48 timer. Effektiviteten av produktet viste seg ved en tilbakevending til det normale av de biokjemiske parametre slik som serum eller ekskresjons-ionogrammet, pH på feces og stansingen av vanntapet. Behandlede kalver holdt under observasjon i 90 dager viste ingen ytterligere gastroenteritisforstyrrelser og fortsatte å vokse normalt. The clinical improvement was rapid and improvement was observed in less than 48 hours. The effectiveness of the product was shown by a return to normal of the biochemical parameters such as the serum or the excretion ionogram, the pH of the faeces and the cessation of water loss. Treated calves kept under observation for 90 days showed no further gastroenteritis disturbances and continued to grow normally.
Antiadhesinaktiviteten ble vist ved å studere floraen som adherer til tarmveggen. The antiadhesin activity was demonstrated by studying the flora that adheres to the intestinal wall.
Bakteriemengder i duodenum, jejunum og ileum ble utført etter skraping av tarmveggen på kontrolldyr og behandlede dyr. For å gjøre dette og for å muliggjøre at den patogene flora kunne skilles fra enhver adherende coli-bakteriell intestinal flora som kan være tilstede, utviser inoculumet et antibioresistenskarakteristika. Resistensen overfor nalidixinsyre (Na£r) utgjør således markøren for E. coli K99-stammen. Bacterial amounts in the duodenum, jejunum and ileum were performed after scraping the intestinal wall of control animals and treated animals. To do this and to enable the pathogenic flora to be distinguished from any adherent coli-bacterial intestinal flora that may be present, the inoculum exhibits an antibioresistance characteristic. Resistance to nalidixic acid (Na£r) thus constitutes the marker for the E. coli K99 strain.
I de behandlede kalver avtar den adherende E. coli K99 Na£r patogene flora med minst to logaritmiske enheter In the treated calves, the adherent E. coli K99 Na£r pathogenic flora decreases by at least two logarithmic units
i forhold til floraen i ubehandlede kontrollkalver. De erholdte resultater er vist i Tabell III. compared to the flora in untreated control calves. The results obtained are shown in Table III.
3) Kliniske forsøk 3) Clinical trials
Ifølge oppfinnelsen vil feltforsøk gjøre det mulig å fastslå en etiologisk diagnose av infektiøs diaré av colibacillar, viral eller parasittisk opprinnelse ved hjelp av en systematisk sjekk utført på avføring oppsamlet før terapi. According to the invention, field trials will make it possible to establish an etiological diagnosis of infectious diarrhea of colibacillary, viral or parasitic origin by means of a systematic check carried out on faeces collected before therapy.
Effektiviteten av legemidlet ble sammenlignet med diagnosen. Kalver yngre enn 5 dager, som led av diaré og som var angrepet av positive K99 colibasiller, og de eldre kalver, ble leget i en høy prosent med antiadhesinene, som angitt ved resulttene i Tabell IV og V, erholdt i to forsøk og på 219 kalver. The effectiveness of the drug was compared with the diagnosis. Calves younger than 5 days, which suffered from diarrhea and were attacked by positive K99 colibacilli, and the older calves, were cured in a high percentage with the antiadhesins, as indicated by the results in Tables IV and V, obtained in two trials and on 219 calves.
Effektiviteten er større hvis antiadhesinene administreres tidlig og såsnart som de første symptoner på enterogastritis-forstyrrelsene kommer til syne. Det skal bemerkes at morsforing ikke ble stoppet. The effectiveness is greater if the antiadhesins are administered early and as soon as the first symptoms of the enterogastritis disorders appear. It should be noted that maternal feeding was not stopped.
Antiadhesinene er effektive med en curativ kapasitet under normale bruksbetingelser. 1 til 2 dagers administrering av legemidlet (1 til 10 x 60 mg) var den nødvendige periode for oppnåelse av effektiv behandling av diaré av colibacillær, viral eller parasitisk opprinnelse. The antiadhesins are effective with a curative capacity under normal conditions of use. 1 to 2 days of administration of the drug (1 to 10 x 60 mg) was the necessary period to achieve effective treatment of diarrhea of colibacillary, viral or parasitic origin.
4) Uskadelighet av legemidlet 4) Harmlessness of the medicine
I laboratoriet ble ingen mortalitet observert som et resultatinntak av legemidlet ifølge oppfinnelsen, enten av unge mus eller av kalver som mottok 120 mg pr. dag i 90 dager. Veksten av dyrene ble ikke påvirket. Ingen bi-virkninger ble observert etter forsøket. Dette legemiddel av biologisk opprinnelse som tilhører kategorien av anti-adhesiner, er fullstendig uskadelig når det administreres enten oralt eller intraperitonealt. In the laboratory, no mortality was observed as a result of intake of the drug according to the invention, either of young mice or of calves receiving 120 mg per day for 90 days. The growth of the animals was not affected. No side effects were observed after the trial. This drug of biological origin belonging to the category of anti-adhesins is completely harmless when administered either orally or intraperitoneally.
Forsøket ble utført på 219 kalver som led av diaré. De eneste dyr som ble observert som leget, var de som mottok antiadhesinene beskrevet ifølge oppfinnelsen, med unntak av en hvilken som helst annen behandling eller komplementær behandling som ble betraktet å være nødvendig av veterinæren eller oppdretteren. The experiment was carried out on 219 calves suffering from diarrhoea. The only animals observed to be cured were those that received the antiadhesins described in accordance with the invention, to the exclusion of any other treatment or complementary treatment deemed necessary by the veterinarian or breeder.
Dosering ved behandlingen: Antiadhesinene ble administrert som forlangt av oppdretteren, ofte etter at han hadde observert uthalt diaré, hvilket forklarer den langvarige administrering når det gjelder enkelte dyr. Dosage in treatment: The antiadhesins were administered as requested by the breeder, often after he had observed persistent diarrhoea, which explains the prolonged administration in the case of some animals.
Claims (10)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8506124A FR2580503B1 (en) | 1985-04-23 | 1985-04-23 | IMPROVEMENTS IN THE PREPARATION OF CELL ADHESION INHIBITORS, ANTI-ADHESINS THUS OBTAINED, AND MEDICINAL PRODUCTS AND FOODS CONTAINING THEM |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO861580L true NO861580L (en) | 1986-10-24 |
Family
ID=9318544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO861580A NO861580L (en) | 1985-04-23 | 1986-04-22 | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF CELL ADHESION INHIBITORS. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0201390B1 (en) |
| JP (1) | JPS61251623A (en) |
| AT (1) | ATE54255T1 (en) |
| AU (1) | AU594331B2 (en) |
| DE (1) | DE3672387D1 (en) |
| DK (1) | DK184886A (en) |
| ES (1) | ES8704349A1 (en) |
| FR (1) | FR2580503B1 (en) |
| IL (1) | IL78522A (en) |
| NO (1) | NO861580L (en) |
| NZ (1) | NZ215908A (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0380084A3 (en) * | 1989-01-27 | 1991-03-13 | The Biomembrane Institute | Method for the inhibition of cell-cell and cell substratum interactions by the blocking of carbohydrate-carbohydrate interactions |
| US6362003B1 (en) | 1992-02-24 | 2002-03-26 | Coulter Corporation | Hematological reference control composition containing leukocyte analogs, methods of making, and uses thereof |
| WO2016207353A1 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Ferring B.V. | Methods of purification and/or viral inactivation |
-
1985
- 1985-04-23 FR FR8506124A patent/FR2580503B1/en not_active Expired
-
1986
- 1986-04-16 IL IL78522A patent/IL78522A/en unknown
- 1986-04-16 AU AU56187/86A patent/AU594331B2/en not_active Ceased
- 1986-04-17 AT AT86400831T patent/ATE54255T1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-04-17 EP EP86400831A patent/EP0201390B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-17 DE DE8686400831T patent/DE3672387D1/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-22 NO NO861580A patent/NO861580L/en unknown
- 1986-04-22 DK DK184886A patent/DK184886A/en not_active Application Discontinuation
- 1986-04-22 NZ NZ215908A patent/NZ215908A/en unknown
- 1986-04-23 ES ES554299A patent/ES8704349A1/en not_active Expired
- 1986-04-23 JP JP61094374A patent/JPS61251623A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2580503B1 (en) | 1988-02-19 |
| DE3672387D1 (en) | 1990-08-09 |
| FR2580503A1 (en) | 1986-10-24 |
| JPS61251623A (en) | 1986-11-08 |
| AU594331B2 (en) | 1990-03-08 |
| ATE54255T1 (en) | 1990-07-15 |
| ES8704349A1 (en) | 1987-04-01 |
| EP0201390B1 (en) | 1990-07-04 |
| IL78522A (en) | 1991-07-18 |
| ES554299A0 (en) | 1987-04-01 |
| DK184886D0 (en) | 1986-04-22 |
| EP0201390A1 (en) | 1986-11-12 |
| DK184886A (en) | 1986-10-24 |
| AU5618786A (en) | 1986-10-30 |
| IL78522A0 (en) | 1986-08-31 |
| NZ215908A (en) | 1988-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hirsch | Phagocytin: a bactericidal substance from polymorphonuclear leucocytes | |
| Ordal et al. | Pathogenic myxobacteria | |
| Rigney et al. | Pathogenicity of Aeromonas hydrophila in red leg disease in frogs | |
| Allen et al. | A study of the attachment phase of phagocytosis by murine macrophages | |
| Kibenge et al. | Experimental reovirus infection in chickens: Observations on early viraemia and virus distribution in bone marrow, liver and enteric tissues | |
| Surendra et al. | Antimicrobial activity of crude venom extracts in honeybees (Apis cerana, Apis dorsata, Apis florea) tested against selected pathogens | |
| JPS58174327A (en) | Therapeutical and diagnostic composition | |
| Nozawa et al. | Inhibiton by glucocorticoids and choleragen of the conditional growth of poorly adherent mononuclear phagocytes of newborn hamster liver and lung (Hormonal control of macrophage growth) | |
| Smorodintsev | Basic mechanisms of nonspecific resistance to viruses in animals and man | |
| NO861580L (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF CELL ADHESION INHIBITORS. | |
| PL156487B1 (en) | Method of carrying on treponema hyodysenteriae culture and method of obtaining a treponema hyodysenteriae containing bacterin | |
| Smith et al. | A staphylococcal proteoglycan‐releasing factor | |
| Mojica et al. | Biological properties of lectin from sea cucumber (Holothuria scabra Jäger) | |
| CN104471054A (en) | Production and application of protozoa cultures of histomonas meleagridis (h. meleagridis) | |
| Shieh et al. | Blood changes in brook trout induced by infection with Aeromonas salmonicida | |
| RU2738671C1 (en) | Method for producing and purifying biologically active substance produced by bifidobacteria | |
| Feinberg | A method for the bulk growth of a parasitic protozoan | |
| US5846789A (en) | Process for preparing nontoxic lipopolysaccharides from acidiphilium species | |
| RU2043770C1 (en) | Method of preparing vaccine against necrobacteriosis in animals | |
| CN108653729A (en) | A kind of vaginal foam agent and its application | |
| RU2146935C1 (en) | Dry immunoprobiotic preparation for poultry farming | |
| Bayne | Gastropod cells in vitro | |
| JP4150631B2 (en) | Fish cold water vaccine | |
| RU2164940C2 (en) | Method of isolation of microalga axenic cultures | |
| Zagumennov et al. | Dynamics of immunological parameters of blood serum of calves in the treatment of keratoconjunctivitis using the drug ligfol. |