NO793362L - Fremgangsmaate til paavisning av ondartede tumorceller - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en cellesamling in vitro eller in vivo, og.mer spesielt vedrører den en slik fremgangsmåte hvor det benyttes produkter, her kalt target-festende globuliner (TAG), produkter som er derivater av forbindelser som her kalles recogninger, og som er i stand til preferensielt å festes til kreftaktige eller ondartede tumorceller.

Recogniner blir dannet ved behandling av sykelige celler eller vev, f.eks. tumorceller eller kunstige kreftceller, og utskilling av de ønskede produkter. Ved uttrykket "recognin" menes, når det anvendes her og gjennom hele beskrivelsen, en forbindelse som er forbundet med sykelige, celler eller vev,, hvilken erkarakterisert ved:

(a) å være i stand til å danne en enkellinje-utfelling

med dens spesifikke antistoff ved kvantitative utfelningstester og Ouchterlony gel-diffusjonstest;

(b) å være løselig i vann og vandige løsninger ved sur

eller nøytral pH; (c) å være uløselig i vandige løsninger ved alkalisk pH; (d) å ha en spektrofotometrisk absorpsjons-spiss-bølgelengde•på 280 my;

(e) å ha en molekylvekt på fra 3000 til 25.000; og

(f) å ha en aminosyrerest-sammensetning hvori det er en stor andel med glutaminsyre og asparaginsyre i forhold til den totale aminosyrerest-sammensetning og et høyt forhold mellom disse syrer og histidin.

Recogninene kan. anvendes til å fremstille deres kjemoresiprokaler, dvs. ved å kontakte recogninene eller recogninene

. på en bærer, med legemsvæsker. Kjemoresiprokalene er nyttige for diagnostiske og terapeutiske formål, dvs. for diagnostisering og behandling av kreft. Kjemoresiprokalene er substanser som

reagerer med immunokjemisk-lignende spesifikitet med et recognin in vivo in vitro, dvs. ved kvantitativ utfellings-test, ved Ouchterlony dobbeltdiffusjon eller ved immunofluorescens.

Et recognin er astrocytin. Astrocytin blir dannet fra hjernetumorvev, fortrinnsvis hjernegliomatumorvev. Protein-fraksjoner inneholdende astrocytin-forløperen blir først ekstra-hert fra vevet. En foretrukket fremgangsmåte for utføring av ekstraheringen er å behandle vevet med en nøytral buffer under homog.eniseringsforhold eller ved andre teknikker, for å sønderdele cellene og vevet for å solubilisere protein-fraks joner som inneholder astrocytin-forløperen.

Ved dette punkt er astrocytin-forløperen fremdeles bundet til mange substanser med høy molekylvekt, innbefattet protein, lycoproteiner, lipoproteiner, nukleinsyrer og nukleoproteiner.

De solubiliserte proteiner blir så separert fra det resulterende vev-ekstrakt. Ekstrakt-løsningen fra vevet blir så gjort klar for å fjerne uløselige partikler. De lavmolekylære forurensninger blir så fjernet fra den resulterende løsning, ved en pre-inndampnings-konsentrerings-teknikk. Den løsning som oppnås, behandles så for å spalte astrocytin-forløperen fra andre forurensninger for å oppnå den protein-fraksjon har et et pK-område mellom 1 og 4. Således blir f.eks. løsningen anbragt på en kromatograferings-kolonne og eluert med løsningsmidler med økende surhetsgrad. Alle de fraksjoner som blir eluert i det nøytrale eller sure område ned til pK 4, blir kastet, og de

fraksjoner med pK-område på fra 1 til 4 blir oppsamlet. Eluatet blir så behandlet for å oppnå et produkt med en molekylvekt på

ca. 8000.. Dette blir f.eks. utført ved først å filtrere materialet for å fjerne lavmolekylære substanser, dvs. slike som har molekylvekt under 1000, og så filtrering igjen for å fjerne slike med molekylvekt over 25.000. Den fraksjon som har en molekylvekt mellom 1000 og 25.000 blir så behandlet videre, dvs. ved tynnskikt^-gel (TLG) kromatografi, for å oppnå astrocytin.

Astrocytin kan således fremstilles ved å ekstrahere hjernegliomatumorvev med en nøytral buffer, ved gjentatt homogenisering og sentrifugering med stor hastighet, fraskilling, fra det resulterende ekstrakt, av den fraksjon som har et pK-område fra 1 til 4, fraskilling, fira nevnte fraksjon, av de substanser som har høy molekylvekt, dvs. opptil ca. 230.000,bg derfra isolering av produktet astrocytin som har en molekylvekt på ca. 8000.

Produktet astrocytin fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå danne en enkelt-linje-utfelling med dets spesifikke antistoff ved kvantitative utfelningstester og Ouchterlony gel-diffusjonstester, ved å være løselig i vann og vandige løsninger med sur eller nøytral pH, og ved å være uløselig ved alkalisk pH, ved å ha en spektrofotometrisk absorpsjons-spiss-bølgelengde på 280 my og ved å ha en molekylvekt på ca. 8000.

Astrocytin er ogsåkarakterisert vedå ha et svært stort prosentinnhold av rester av glutaminsyre og asparginsyre og et svært høyt forhold mellom disse syrer og histidin. En ytterligere analyse av astrocytin er angitt nedenfor.

På en lignende måte som den beskrevet ovenfor, ble et annet recognin, kalt malignin, fremstilt fra kunstige kreftceller, dvs. kreftceller dyrket in vitro. Malignin har en molekylvekt på ca. 10.000 og en lignende, men forskjellig aminosyrerest-sammensetning som astrocytin, dvs. store mengdeforhold for glutaminsyre og asparginsyre, og høyt forhold mellom disse syrer og histidin. En ytterligere analyse av malignin er angitt nedenfor.

Malignin kan således fremstilles ved å ekstrahere

kunstige kreftceller dyrket i kultur med en nøytral buffer ved gjentatt homogenisering og sentrifugering med høy hastighet, separere fra det resulterende ekstrakt den fraksjon som har et. pK-område på ca. 1 til 4, separere fra nevnte fraksjon de substanser som har en høy molekylvekt, dvs. opptil ca. 230.000,

og derfra isolere produktet som har en molekylvekt på ca. 10.000.

Den mengde malignin som dannes ved kustig cellegjæring

og den prosent av total proteinmengde dannet ved kunstig cellegjæring som er malignin, kanøkes ved dyrkning av kunstig kreftcelle-kultur i store vekst-beholdere.

Malignin fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå danne en enkelt-linje-utfelling med dets spesifikke antistoff ved kvantitative utfellingstéster og Ouchterlony gel-diffusjoris-tester, ved å være løselig i vann og vandige løsninger med sur eller nøytral pl-l, og uløselig ved alkalisk pH,

ved å ha en spektrofotometrisk absorpsjons-spiss-bølgelengde på 280 my og ved å ha en molekylvekt på ca. 10.000.

Recogniner er dessutenkarakterisert vedå være i stand

til å danne komplekser med bromacetylcellulose for å danne brom-acetylcéllulose-recognin og danne de spesifikke antistoffer anti-recognin ved injeksjon i pattedyr, idet nevnte anti-recognin festes spesifikt til recognin-forløperen in situ og frembringer fluorescens på gliomaceller ved kobling med fluorescein, så som beskrevet mer detaljert nedenfor.

Et anti-recognin, anti-malignin, er toksisk for hjerne-tumorce.ller in vitro. Anti-recogniner er antistoffer for den gruppe av antigener som her kalles recogniner, og de danner en enkel-linje-utfelling med recogniner ved kvantitative utfellings-tester og Ouchterlony gel-diffusjons-test.

Recogniner, så som astrocytin, malignin og lignende substanser, er nyttige som produkter som kan innføres i et biologisk system for å redusere fremmed-reaksjoner, så som ved å belegge et materiale med et recognin. Et ytterligere eksempel kan være å innføre et recognin for å danne kjemoresiprokalene i det biologiske system. De kan også næringsmessig anvendes for å oppmuntre veksten av et spesielt biologisk system som de er en del av. En ytterligere anvendbarhet for recognin er ved fremstilling av Target-reagenser som omfatter kompleksene av recogninet med en bærer for å lette dets anvendbarhet i biologiske systemer. Komplekset befordrer således f.eks. de fysikalsk-kjemiske egenskaper til recognin selv. Bæreren bør velges fra slike som danner et kompleks med recogninet, og som er i alt vesentlig biologisk inert.

Enhver substans kjent i industrien som vil danne et stabiit kompleks med polypeptider eller proteiner, kan være nyttig, for kompleksdannelse med recogninet. Et eksempel er et cellulose-basert materiale, så som den forannevnte bromacetylcellulose.

I tillegg til å være inert i biologiske systemer, bør bæreren være slik at den ikke forandrer de spesifikke fysikalsk-kjemiske egenskaper til recogninet som er nyttige for formålene angitt her.

Kompleksene av recogninet og dets bærer er nyttige ved fremstilling, separering og identifisering av deres kjemoresiprokaler i ethvert biologisk system som de bringes i kontakt med. Recognin- . bærer-komplekset er også nyttig for å stimulere fremstillingen av dets kjemoresiprokal-forløper ved ethvert biologisk system som det innføres i.

Den gruppe av kjemoresiprokaler som kalles anti-recogniner, f.eks. anti-astrocytin og anti-malignin, kan dannes ved å injisere recogninet i et biologisk system. Således kan en immunologisk effektiv dose av recognin bringes i kontakt med . kroppsvev.eller -væsker på en måte som induserer en antistoff-respons, i samsvar med kjent teknikk i industrien, for fremstilling av antistoffer. Anti-recogninene kan anvendes for å overbringe materialer så som diagnostiske, nærende og terapeutiske midler til spesifikke celler eller steder i' et biologisk system, hvilket omfatter å innføre nevnte middel i kompleksdannet form; sammen med anti-recogninet i det biologiske system. Anti-recogninene er også nyttige for å diagnostisere nærværet av tumorceller i en histologisk del ved påføring av anti-recogninet konjugert med en merkesettende substans så som farvestoffer og radioaktive substanser, til nevnte del, hvorved flekksetting eller radioaktiv merkesetting bare foregår med tumorceller. Enda en annen anvendelse for anti-recogniner er for å øke utbyttet av andre nyttige kjemoresiprokale produkter (så som TAG, beskrevet nedenfor) fra et pattedyr, hvilken omfatter å injisere en immunologisk effekctiv dose med recognin i pattedyret, eller et annet biologisk system.

Før foreliggende oppfinnelse ble glykoprotein-komplekser fremstilt fra hjernevev, og det ble dannet antistoffer for dem. Separerte materialer kjent som 10B glykoproteiner fremstilt av Tay-Sachs' syk hjerne ble injisert i kaniner og det ble dannet antistoffer. Disse Tay-Sachs<1>antistoffer ble anvendt ved immunofluorescerings-studier av hjerneholdig tumor: bare reaktive normale ikke-tumor-glia, ikke tumor-glia, ble flekket med disse antistoffer.

Når derimot astrocytin ble fremstilt fra tumorvev, og antistoffer til astrocytin (anti-astrocytin) ble fremstilt og anvendt ved immunofluorescerings-studier av hjerne, ble bare tumor-glia, ikke normal (ikke-tumor) glia, flekket med anti-astrocytin. Således, ved opprinnelig vev og naturen av antistoffet, og også ved den spesifikke type av flekkede celler, var Tay-Sachs' antistoffer og anti-astrocytin klart forskjellige produkter.

En annen gruppe kjemoresiprokaler er Target-reagenser kompleksdannet med deres kjemoresiprokaler. F.eks. blir Target-produktet av astrocytin kompleksdannet med en bærer så som bromacetylcellulose, bragt i kontakt med anti-astrocytin. Denne forbindelsetype kan kompleksdannes og anvendes for overbringelse

av diagnostiske, nærende og terapeutiske midler til spesifikke

celler eller steder i et biologisk system. Disse forbindelser kan også anvendes ved renseprosesser. F.eks. kan anti-astrocytin dannes ved dekompleksering av bromacetylcellulose-astrocytin-anti-astrocytin ved hydrolytisk behandling med en syre eller et proteinase-enzym. Target-reagenser er også nyttige for å øke mengden av TAG-produkter (beskrevet nedenfor) i et biologisk system, så som ved å bringe en immunologisk effektiv dose med Target i kontakt med legems-vev. eller -væsker.

Ytterligere kjemoresiprokaler er TAG-reagenser (dvs.

Target-festende globuliner). TAG-produktene blir fremstilt ved

å bringe Target-reagensene i kontakt med legemsvæsker i varierende tidsperioder for å danne et kompleks og avspalte TAG derfra. To nyttige utgaver er S-TAG og F-TAG.

En fremgangsmåte for fremstilling av S-TAG (sakte-Target-festende globulin) omfatter å omsette blodserum eller annen legemsvæske med Target (f.eks. bromacetylcellulose-malignin) i tilnærmet to timer eller mer ved en lav temperatur, f.eks. ca.

4°C, og avspalte S-TAG fra det resulterende materiale, f.eks. med fortynnet syre i tilnærmet to timer ved en temperatur på ca. 37°C. Produktet S-TAG fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå være løselig i vandige bufrede løsninger, danne en enkel-linje-utfelling med dets korresponderende recognin ved Ouchterlony gel-diffusjonstest, være ikke-dialyserbar i cellofan-membråner, holdes tilbake med millipor-filtere som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over 25.000, ha molekyIvekter i forskjellige aggregat-tilstander, så som bestemt ved tynnskikt-gel-kromatografi, på tilnærmet 50.000, og multipla derav i makroglobulin-området,

og ha en spektrofotometer-absorpsjons-spiss-bølgelengde på .280 mu.

En fremgangsmåte for fremstilling av F-TAG (hurtig-Target-festende globulin) omfatter å omsette blodserum eller annen legemsvæske med Target (f.eks. bromacetylcellulose-malignin) i tilnærmet 10 minutter ved en lav temperatur, f.eks. ca. 4°C, og avspalte F-TAG fra det resulterende materiale, f.eks. med for-

tynnet syre i tilnærmet to timer ved en temperatur på ca. 37°C.

Produktet F-TAG fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå være løselig i vandige bufrede løsninger, danne en enkel-linje-utfelling med dets korresponderende recognin ved Oucherlony gel-diffusjons-tester, være ikke-dialyserbar i cellofan-membraner, holdes tilbake av millipor-filtere som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over 2 5.000, ha molekyl-vekter i forskjellige aggregasjons-tilstander, så som bestemt ved tynnskikt-gel-kromatografi, på tilnærmet 50.000, og multipla derav i makroglobulin-området, og ha en spektrofotometer-abosrpsjons-spiss-bølgelengde på 280 my.

TAG-produkter er nyttige for påvisning av kreft-tumorer i levende pattedyr, ved å bestemme konsentrasjonen av S-TAG og F-TAG produsert av et kjent volum av pattedyrets blodserum eller annen legemsvæske, og sammenholde denne konsentrasjon med mengder bestemt for å være indikative for kreft. TAG-produkter er også nyttige for å gi diagnose for nærvær av tumorceller i en histologisk del eller annen celle-samling, og dette omfatter å påføre TAG konjugert med en merkesettende substans, så som farvestoff eller radioaktiv substans, på nevnte del, hvorved flekking eller radioaktiv merking bare foregår med tumorceller. TAG-produkter er dessuten funnet å være cytotoksiske for tumorceller. TAG-produkter er også nyttige for å føre avleveringen av diagnostiske, nærende og terapeutiske midler til spesifikke celler eller steder ved å innføre nevnte midler i kompleksdannet form med TAG-produktet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte til påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en celle-samling, hvilken omfatter å påføre et' anti-malignin TAG produkt festet til visible eller signal-emitterehde midler på nevnte celle-samling, hvorved nevnte anti-malignin TAG produkt preferensielt festes til kreftaktige eller ondartede celler, og påvise nevnte kreftaktige eller ondartede tumorceller ved hjelp av nevnte visible eller signal-emitterende midler.

Ved en foretrukket utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en celle-samling, hvilken omfatter å påføre på nevnte cellesamling et anti-malignin TAG-produkt, og derefter påføre f luoresceLnkon jugert anti-TAG derpå, hvorved det foregår fluorescens bare i de kreftaktige eller ondartede tumor-celler ved illuminasjon.

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse

er anvendbar på både celie-samlinger in vivo og in vitro, og også for påvisning av både gliale og ikke-gliale tumorceller. Det er fordelaktig at TAG-produktet anvendt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, blir dannet ved omsetning av anti-malignin-serum med et malignin-basert reagens, fortrinnsvis bromacetylcellulose-malignin.

Det er foretrukket at TAG-produktet anvendt ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse i det minste partielt er fri for substanser som er lite eller ikke reaktive ved fluorescerende påvisning, ved anvendelse på kjente kreftaktige celler, og at dersom et signal-emitterende middel anvendes, så er dette en radioisotop.

Normal celledeling i planter eller dyr blir begrenset eller inhibert når cellene kommer til å oppta et spesielt rom fullstendig. Mekanismene (a) hvorved normale celler "rekognoserer" at de har fyllt det rom som er tilgjengelig for dem, og. (b) hvorved, operasjonen av denne rekognoseringsmekanisme på sin side inhiberer celledeling, har begge vært ukjente. Oppfinneren har dannet en gruppe forbindelser kalt recogniner hvis forløpere får øket konsentrasjon når det foregår normal rekognosering og læring, og som har forbindelse med rekognosering og læring av partikler og celler, og med tilknytningen av celler til hverandre. Ved forsøk på å produsere disse forbindelser fra normale kreft-celler, har det blitt oppdaget at de er fraværende som sådanne, og at forandringer i deres molekylstruktur har foregått samtidig med at kreftcellene har mistet sin evne (a) til å rekognosere at de har fyllt sitt normale volum, og/eller (b) til å stoppe deling når de har fyllt sitt normale volum.

Recogniner er forbindelser som har fysiokjemiske egenskaper som efterligner slike konfigurasjonsegenskaper til kreftceller uttrykt ved deres mangel på evne til å rekognosere og stoppe celledeling. Recogniner er nyttige for å tilveiebringe umiddelbare produkter og fremgangsmåter som selv er nyttige ved diagnostisering og behandling av kreft, og for å hindre kreft.

Det har også blitt oppdaget fremgangsmåter hvorved kunstig dyrkede celler kan anvendes til å produsere malignin for første gang. En fordel ved fremgangsmåtene oppdaget her er at maligniner og nye produkter fra dem nå kan fremstilles effektivt i

. virkelig ubegrensede mengder.

Foreliggende oppfinnelse er anvendbar for ethvert og alle biologiske systemer hvorved det er ønsket å influere på all vekst og metabolisme. Ved fremstilling av den spesielle forbindelse eller forbindelser av passende celletype i kunstig kultur, og den videre fremstilling av produkter fra disse substanser,

kan således for første gang spesifikk influering oppnås;,

på alle typer vev, celler, celle-organeller, sub-organelle-molekyler eller molekyl-aggregater i hvilket som helst levende system. Således kan spesifikk nærings-influering ved kritiske tider i utviklingen, spesifikke diagnostiske metoder, preventive og. behandlings-metoder, og konstruksjonen av kunstige bioelektriske systemer (som ved vev- og organtransplantasjoner) alle påvirkes. Disse kunstige bioelektriske systemer kan nå dannes slik at de bærer egenskapene til det spesifikke recognin, alignin eller deres kjemoresiprokaler i det normale vev eller en komponent som de vil nærme seg og således unngå å bli "rekognosert" som "fremmed",

og således unngå reaksjonene til fremmed-substanser, innbefattet utstøtelse.

Et aspekt ved denne oppfinnelse er fremstillingen fra biologiske væsker av to nye produkter, Target-festende globuliner (TAG) som kalles dette fordi de blir dannet ved to reaksjoner,, hvor det, ved den første, omsettes biologiske væsker med et syntetisk kompleks inneholdende fysiokjemiske konfigurasjoner som etterligner dem til maligninene og som kalles' Target, og hvor det,

ved den andre, fraspaltes det spesifikke TAG fra komplekset, og ved måling av det således dannede TAG oppnås en kvantitativ indikasjon fra de biologiske væsker i levende organismer på om det er til stede en tumor i den organismen, og dette er følgelig en diagnostisk test på tumor. På grunn av at TAG-produkter og anti-malignin er fysiokjemisk komplementære til maligniner, blir de kalt kjemoresiprokaler.

Det har videre blitt oppdaget at to kvantitativt og kvalitativt forskjellige TAG-produkter kan fremstilles, avhengig av den-tillatte tid for omsetning av serum med det spesifikke Target-reagens som anvendes,, og avhengig av den tillatte tid for av-spaltning av produktet som blir gjort komplekst.

Ef ter undersøkelse av mengdene av disse produkter som kunne dannes fra en rekke forskjellige individer med hjernetumor og forskjellige andre medisinske forstyrrelser, og også fra slike med ingen tilsynelatende sykdom, ble det klart at mengdene av disse to nye produkter som kunne dannes i et bestemt.individ, var en indikasjon på om dette individ hadde en hjernetumor, og dette er følgelig en serum-diagnostisk test på hjernetumor.

Anvendbarheten av disse nye produkter, i tillegg til deres anvendelse til å diagnostisere, fra serum og andre biologiske væsker, nærvær av hjernetumor og andre tumorer, blir illustrert ved demonstreringen av at TAG og anti-recognin-forbindelser festes preferensielt til gliale og ikke^gliale tumorceller i celle-samlinger, f.eks. histologiske deler av f.eks. hjernetumor og omgivende vev fjernet ved operasjon av hjernetumor. Denne preferensielle merking ved TAG og anti-recogniner av tumorceller blir f.eks. 'demonstrert ved standard immunofluorescerings-teknikker selv om signal-emitterende midler også kan anvendes. Det er således også tilgjengelig en ny metode for ved undersøkelse av celle-samlinger å bestemme med en ny grad av sikkerhet om tumorceller er til stede i det fjernede vev, og om disse tumor-celler har trengt igjennom helt til kantene av det fjernede vev, hvilket indikerer sannsynlighet for at det fremdeles er tilbake tumor i hjernen eller andre organer, eller at tumorceller er fraværende fra periferien av det fjernede vev, hvilket indikerer den mulighet at all tumor er fjernet fra hjernen eller annet organ. Dessuten er TAG og anti-maligniner fremstilt som beskrevet . funnet å være cytotoksiske for lioma-hjernetumorceller dyrket i vev-kultur in vitro. Denne høye affinitet for tumorceller i et annet medium, her dyrket i vev-kultur, er ytterligere bevis.på det spesifikke koblings-potensial til det nye produkt TAG. Videre tilveiebringer cytotoksisiteten til TAG og anti-recogniner for.tumorceller en ytterligere ny diagnostisk test for serum til pasienter som mistenkes for å lide av en tumor. Således blir f.eks. serumet eller annen legemsvæske fra disse pasienter omsatt med Target for å danne TAG og produktet TAG blir testet i vev-kultur-vekst av tumorceller for cytotoksisitet. Både den konsentrasjon av TAG og.den grad av cytotoksisitet som manifesteres av det TAG

<:>som kan dannes fra et gitt individs serum, kan være ikke bare diagnostisk, men kan også være av verdi ved ettersporing av for-løpet av sykdommen før og efter operasjon av en gitt pasient. Kobling av radioaktivitet- og farvestoff-spor til TAG tilveiebringer et nytt TAG produkt som f.eks. er nyttig in vivo ved diagnose av tumorer og deres nøyaktige beliggenhet. Således vil

f.eks. injeksjon av et passende merket TAG enten intraarterielt eller intravenøst, i den cerebrospinale væske, eller direkte i hjernevevet eller dets hulrom, gi anledning til å vise ved hjelp av slike radioaktive midler, eller ved visualisering av det koblede farvestoff, nærværet av en hjernetumor, for det er bare til tumorceller at TAG spesielt festes. Videre tillater denne metode nøyaktig visualisering av stedet, for h jernetumoren. Lignende metoder kan anvendes for andre typer av tumor. Dette kan sees å være en forbedring av den in vivo diagnostiske metode ved anvendelse av anti-astrocytin dannet i kaninblod for å merke hjernetumoren, på grunn av at ved anvendelsen av TAG dannet fra menneske-serum unngås muligheten for fremmede protein-reaksjoner. Siden TAG og anti-recogniner har den kjemiske spesifikitet som tillater preferensiell festing til astrocytin-forløper inneholdende tumorceller både in vitro og in vivo, kan disse produkter også anvendes terapeutisk, så vel som diagnostisk, når de er koblet, f.eks. med radioaktive, protori-inntagende midler, eller andre toksiske fysikalske eller kjemiske midler, slik at disse toksiske substanser kan lokaliseres preferensielt ved disse forbindelsers, spesifikitet for festing i tumorceller sammenlignet med deres normale nabo-celler. Denne selektivitet er universelt anerkjent som den avgjørende, eller i det minste en avgjørende faktor,

for oppnåelse av effektiv kjemisk eller fysikalsk terapi på tumorer. TAG har således vist at det er effektivt ved preferensiell festing til tumorcellene, og bør være lovende som nytt terapeutisk produkt av disse årsaker.

I serumet fra pasienter med ondartet tumor, kan, som det vil fremgå av eksemplene nedenfor, én type av TAG, sakte-TAG (S-TAG), til forskjell fra hurtig-TAG (F-TAG), fremstilles i relativt større mengder fra et gitt volum med serum enn i pasienter uten slik tumor. Dette tyder på at .en av TAG' s naturlig forekommende forløpere (P-TAG) har øket konsentrasjon eller at det foreligger andre faktorer som favoriserer den relative dannelse in vitro av S-TAG overfor F-TAG.

Det mulige slektskap mellom funksjonen av de aktuelle syntetiske produkter Target og TAG og deres forløpere, og videre mellom funksjoner av postulerte, men ikke demonstrerte celle-"Antigener" og sirkulerende "antistoffer" til dem som kan foreligge in vivo, har ennu ikke blitt klartlagt. Således danner f.eks.,

på antistoff-lignende måte, F-TAG og S-TAG enkle adskilte reaksjons-

linjer med astrocytin ved Ouchterlony gel-diffusjon, og injeksjon av Target i kaniner induserer enøkning i utbyttet av TAG-produkter fra kaninserum efter omsetning med Target. Den oppdagelse at det kan være en normal mengde med forløper-lignende sirkulerende anstistoffer til et celle-antigen som er skjult i den ikke-delende celle, reiser et spørsmål med hensyn til den mulige funksjon av paret. Det er her foreslått at TAG forløper (P-TAG) og Target-lignende substanser foreligger in vivo som funksjonerende ved regulering av celle-utbredelse og celle-død. Således kan f.eks. ' eksponering av en celle-bestanddel som normalt ikke er direkte eksponert for serum-proteiner forekomme under celledeling. Eksponeringen av denne celle-bestanddel kunne resultere i at bestanddelen ble omdannet til en Target-lignende substans hvortil festing av et P-TAG-lignende molkyl fra serum så kan forekomme, hvilket ville stimulere celle-deling eller inhibere den. Alternativt kan en ikke-delende celle som er skadet eller funksjonerer galt, blottlegge en Target-lignende substans hvortil festingen av P-TAG-lignende molekyler kan være reparerende. Imidlertid kan under visse celle-forhold festingen av P-TAG-lignende molekyler indusere ødeleggelse av cellen (f.eks. anti-glioma-TAG syntetisk dannet som her beskrevet, er klart cytotoksisk for glioma-tumorceller som dyrkes i vev-kultur). Dette kunne således representere et speil på en normal mekanisme for regulering av celledeling, og for enten reparering eller fjerning av.enkelte celler i legemet gjennom hele organismens liv. Dersom blottlegging av cellebestanddeler øker unormalt slik at det dannes unormalt store mengder av celle Target-lignende substanser, så som kan forekomme ved rask deling av kreftceller så som i hjerne-gliomaer, kan det induseres en økning av konsentrasjonen av en type av serum P-TAG i forhold til en annen.

Hva enn den virkelige funksjon av forløperne er, så er økningen av den relative mengde av overveiende en type av TAG, sakte-TAG (S-TAG), som kan dannes in vitro ved de fremgangsmåter som her er beskrevet fra serumet til pasienter med ondartet tumor, basis for den serum-diagnostiske test som beskrives i de eksempler som følger.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av urenset astrocytin-forløper-holdig fraksjon.

Menneskelig hjerneglioma-tumorvev, fjernet ved operasjon, blir oppskåret så fritt som mulig for overflateblodkar og normalt hjernevev. For en typisk mengde oppskåret tumorvev på 11 g, blir vevet veidd i 6 aliquoter på 1,5 g og 2 på 1,0 g.. Hver aliquot blir så behandlet på den følgende måte.

Hver aliquot blir homogenisert i nøytral bufferløsning ved sonifisering eller annen mekanisk innretning. Hver aliquot blir f.eks. homogenisert i 100 cm 3 pr. g vev av 0,005M fosfat-bufferløsning, pH 7, i en Waring-blander. Homogeniseringen bør utføres kaldt for å hindre.denaturering av proteiner. Blanderen bør f .eks. kjøles på forhånd i et avkjølt rom ved 0-5°C, og den bør være i drift bare i ca. 3 minutter.

Homogenisatet blir så sentrifugert for å gjøre det klart, f.eks. ved 80.000 gangers gravitasjon i 30 minutter i en avkjølt ultrasentrifuge. Den løselige overflytende væske dekanteres og oppbevares kaldt. Den uløselige rest rehomogeniseres med

3 ytterligere 100 cm nøytral buffer og sentrifugeres som før, og det annet løselige ekstrakt kombineres med det første. De- beste utbytter oppnås når denne prosess med homogenisering og sentrifugering gjentas inntil mindre enn 50 mikrogram med protein.pr. ml løsning oppnås i den overflytende væske. For de fleste vev blir dette oppnådd ved den femte ekstraksjon.

De således oppnådde løsninger kombineres og konsentreres ved inndampning og efterfølgende dialyse, så som ved dialyse mot 0,005M fosfat-buffer i kalde omgivelser for å danne et volum på 15 ml. Volumet av denne løsning blir notert, en aliquot tas for total protein-analyse, og resten blir fraksjonert for å oppnå den protein-fraksjon som har et pK-område mellom 1 og 4. Den foretrukne fraksjonerings-fremgangsmåte er kromatografisk, som angitt i det følgende.

Løsningen blir fraksjonert i det kalde rom (4°C) på en DEAE cellulose (Cellex-D) kolonne, 2,5 x 11,0 cm, som er likevekts-behandlet med 0,005M natriumfosfat-buffer. Trinnvis eluerings-løsningsmiddel-forandringer foretas med følgende løsningsmidler (løsninger): løsning (1) 4,04 g NaH2P04og 6,50 g Na2HP04oppløses i 15 liter destillert H20 (0,005 molar, pH .7) ;

løsning (2) 8,57 g NaH2P04oppløses i 2480 ml destillert H20;

løsning (3) 17,1 g NaH2P04 oppløses i 2480 ml destillert H20

(0,05 molar, pH 4,7);

løsning (4) 59,65 g NaH2P04 oppløses i 2470 ml destillert H20 (0,175 molar);

løsning (5) 101,6 g NaH2P04oppløses i 2455 ml destillert H20

(0,3 molar, pH 4,3);

løsning (6) 340,2 g NaH2P04oppløses i 2465 ml destillert H20

(1,0 molar, pH 4,1);

løsning (7) 283,64 g 80%ig fosforsyre (H3P04) opptas i 2460 ml destillert H20 (1,0 molar, pH 1,0).

Tilsett ekstrakt av nervevev, 6 til 10 ml i volum. La det føres inn i kolonnen. Det overtrekkes så med løsning (1) og en beholder med 300 ml av løsning (1) festes slik at den drypper ned på kolonnen ved hjelp av tyngdekraften. Aliquoter på 3 ml

av effluent oppsamles ved hjelp av en automatisk fraksjons-samler. De efterfølgende elueringsløsninger skiftes trinnvis ved de følgende elueringsrørnummer. Løsning (2) ved rør 88, idet løsningen tilføres på kolonnen på harpiks toppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 50 ml av løsning (2). Løsning (2) ved rør 98, idet løsningen tilføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 75 ml av løsning (3). Løsning (4) ved rør 114, idet løsning tilføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 150 ml av løsning (4). Løsning (5) ved rør 155, idet løsning tilføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 125 ml av løsning (5). Løsning (6) ved rør 187, idet løsning innføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 175 ml av løsning (7). Det fortsettes med eluering inntil elueringen er fullført ved

rør 260- Det skal anvendes nyfremstilt harpiks for hvert nytt volum med vev-ekstrakt. Hvert efflueringsrør blir kvantitativt analysert på protein. Eluatene i rørene nummer 212 til 230 kombineres, og.de inneholder de. urensede produkter hvorfra astrocytin vil bli fremstilt.

Det har blitt publisert data om dette urensede materiale, kalt fraksjon 10B, i den senere tid, [Protein Metabolism of the Nervous System, s. 555-69 (Pleum Press, 1970), Journal of Neurosurgery, vol. 33, s. 281-286 (september 1970)], men nå har fraspaltningen fra fraksjon 10B av det spesifikke produkt som her kalles astrocytin blitt utført. Urenset fraksjon 10B kan fremstilles som et produkt i mengder mellom 0,1 og 10 mg pr. g av opprinnelig friskt nervesystemvev hvorfra det oppnås. I tillegg til en astrocytin-forløper inneholder det varierende mengder av kovalent

bundne karbohydratrester innbefattet en rekke heksoser, nemlig glukose, galaktose, mannose; heksosaminer, innbefattet glukosamin, galaktosamin og mannosamin; og av og,til andre. sukkere, så som fukose, ribose og kanskje rhamnose. Det inneholder også protein-produkter med høy molekylvekt, flere lipier og nukleinsyrer.

Eksempel 2

Fremstilling av renset astrocytin fra urenset astrocytin-forløper-holdig fraksjon.

Den astrocytin-forløper-holdige fraksjon blir videre isolert fra forurensninger. Ved de foretrukne utførelser blir materialet fra eksempel 1 kromatografert på Sephadex G^50 harpiks med en typisk kolonne som er 40 cm lang, 2,5 cm i diameter og har et volum på 196 ml. Det anvendte trykk er 40 mm Hg, strømnings-hastigheten er 35 ml pr. time og bufferen er 0,05 molar fosfat-buffer-løsning, pH 7,2. Den første (gjennomstrømning) spiss inneholder astrocytin-forløper sammen med forurensninger, mens etterfølgende spisser inneholder bare forurensninger.

Ved den foretrukne utførelse blir produktene ved ovennevnte første gjennornstrømnings-spiss så konsentrert på Sephadex G-15, så ført inn på en kolonne med Cellex-D med de samme løsninger.,

(1) til (7) som i eksempel 1, og de samme elueringstrinn som ut-ført i eksempel 1. Produktet astrocytin er til stede som en skarp

spi-s i de samme rør (nummer .212-230) som før, og opprettholder således dets oppførsel ved Cellex-D kromatografi uten nærvær av

et stort antall forurensninger.

Lavmolekylære forurensninger kan så fjernes ved teknikker som er kjent i industrien, så som ved millipor-skive-filtrering.

Ved den foretrukne metode blir produktet astrocytin gjort fri for salt og andre lavmolekylære forurensninger ved filtrering gjennom millipore-Pellicon-skive nr. 1000, 13 mm, som holder tilbake substanser med høyere molekylvékter enn 1000 og tillater gjennom- . føring av slike med molekylvékter mindre enn 1000. Produktet astrocytin blir værende på Pellicon-skiven, og blir utvunnet derfra ved vasking med løsning (1) fra eksempel 1.

Astrocytin blir så erholdt ved isolering av den forbindelse som har en molekylvekt på ca. 8000 fra ovennevnte løsning. Ved en foretrukket.fremgangsmåte anvendes tynnskikt-gel (TLG). kromatografi på følgende måte: Den anvendte apparatur er en kommersielt tilgjengelig utgave konstruert av Boehringer Mannheim GmbH; Pharmacia Fine . Chemicals og CAMAG (Sveits). Harpiksen, 2,5 g av superfin Sephadex G-200, blir tilvirket i 85 ml 0,5M NaCl i 0,02M Na2HP04KH2P04fosfat-buffer, pH 6,8 (6,6-7,0). Den tillates å svelle i 2 eller 3 dager ved romtemperatur med svak blanding av og til (magnetiske og andre rørere bør ikke anvendes). Den svellede gel stabiliseres i 3 uker ved kjøle-temperatur. Imidlertid kan bakteriell og fungal vekst interferere med den svellede gel. Dersom gelen skal beholdes i lengre tidsperioder, bør det tilsettes en liten mengde med bakteriostatisk middel

(natriumazid 0,02%). Det blir anvendt 2,5 g tørr gel for å. danne to glassplater, 20 x 20 cm og 0,5 mm tykke. Platene gis enten anledning til å tørke ved romtemperatur i 10 minutter og overføres til et fuktig rom hvor de kan lagres i ca. 2 uker, eller de anvendes umiddelbart efter passende pre-utbalansering (vanligvis natten over og minimum 12 timer). Hovedvirkningen ved utbalanseringen er å normalisere forholdet mellom de stasjonære og mobile fase-volumer. Med de pre-utbalanserte plater i horisontal stilling, påføres substanser som skal undersøkes med mikropipetter som flekker eller som en strek ved startlinjen. 10 til 20 ml med 0,2-2% protein-løsning anbringes på kanten av et mikroskopisk dekk-objektglass (18 x 18 m) og holdes mot gel-oyerflaten. På noen få sekunder vil løsningen synke inn i gelen. Aller prøver blir først dannet på dekk-objectglasset og blir så raskt påført. Desom det ikke blir anvendt tilstrekkelig med materiale, er det vanskelig å lokalisere individuelle flekker efter separering. Dersom for meget materiale påføres foregår det ingen definert separering. Prøvene fortynnes med buffer for å lette behandlingen, og separeringen av prøvene utføres ved en nedstigende teknikk med platen holdt ved en veinkel på 22°. En strømningshastighet på ca. 1-2 cm/time er mest egnet. Markerings-substanser . (så som cytokrom C, hemoglobin, myoglobin eller bromfenol blåmerket albumin) påføres på forskjellige steder tvers over platen for å få en kontroll på mulig variasjon av strømning tvers over platen, og tjener også som referanse-protein for beregning av relativ avstand (mobilitet) av ukjente. Efter påføring av prøvene blir platene satt tilbake i apparaturen og papirveken skyves svakt

nedover for å sikre god kontakt med gelskiktet. Papirveken må ikke dryppe. Overskudd av fuktighet tørkes vekk. Det flytende løsningsmiddel i beholderen holdes konstant på 1 cm fra den øvre ende av karet. Forsøkene fullføres vanligvis på 4 til 7 timer avhengig av utviklingen av separeringen. Med farvede substanser følger separeringen direkte. De separerte flekker av protein gjøres lett synlige ved å overføre dem til et ark kopipapir av. TLG plate efter at den kromatografiske separering er fullført, og ved å flekke dem på forhåndsvaskede områder, metanol + 1^0 + eddiksyre - 90:5:5, i 48 timer. Papirarket er 3 mm filtrerpapir. Et papirark, 20 x 18 cm, anbringes over gelskiktet og presses (valses) akkurat tilstrekkelig til å sikre kontakt med gelen. Det påses at det ikke innføres luft under papiret (kopien) og

at ikke gelskiktet forstyrres. Den flytende fase oppsuges fra gelskiktet med papiret og fjernes efter ca. 1 minutt, tørkes umiddelbart i en ovn ved en temperatur på 60°C i 15 minutter og flekkes på normal måte ved hvilken som helst av de rutinemessige flekke-prosesser. Flekking blir utført ved å sprøyte kopi-papiret med 0,03% diazotert sulfanilsyre i 10% natriumkarbonat (PauleyVs reagens). Flekking kan også utføres med en mettet løsning av amido-svart i metanol-eddiksyre (90:10 volum/volum blir anvendt), og flekkingstiden er 5-10 minutter. For avflekking skylles med to volumer av 90:10 løsningen av metanol og eddiksyre blandet med ett volum f^O. Det er vanskelig .å oppnå lav bakgrunns-flekking uten svært utstrakt vasking. Selve platene kan også. tørkes ved ca. 60°C (i en ovn med luft-sirkulering), men bare dersom astrocytin skal flekkes. For isbleringsformål bør platen bare lufttørkes ved romtemperatur. Overoppvarmning kan føres til sprekkdannelse, men dette kan vanligvis unngås ved en temperatur på 50-60°C hvorved en Sephadex G-200 plate tørkes på 15-20 minutter. De tørre plater gis anledning til å svelle i 10 minutter i en blanding av metanol + U^ O + eddiksyre (75:20:5) og flekkes i mettet amido-svart i samme løsningsmiddelsystem i 5 timer og vaskes derefter ved bading i 2 timer i det samme løsningsmiddel før de tørkes. For molekylvekt-bestemme Iser måles avstanden fra. utgangslinjen til midten av hver sone med en nøyaktighet på 0,05 mm enten direkte på trykksaken (kopien) eller densitogrammet. Resultatet uttrykkes med R -verdien definert som forholdet mellom

m migreri.ngs-dis tansen for det testede protein (d^) og den for cytokrom C eller myoglobin (dm) som anvendes som referanse-protein:

Forholdet mellom migrerings-distanse for testet substans til

standard er formelen (~Rm= ^ En rett kalibreringslinje oppnås ved å plotte logaritmen av molekylvekten for den anvendte standard mot -R . Fra denne linje kan molekylvekten til det uk jente . protein oppnås. For å få mest mulig eksakte resultater sammenlignes 6 like deler med proteinprøveløsning med standarden, i dette til-fellet cytokrom C, før påføring på platen. Ved TLG-prosessen ovenfor blir produktet astrocytin observert som en adskilt flekk med en avstand på tilnærmet 0,83 t 0,02 referert til cytokrom C standarden, og dette gir en tilnærmet molekylvekt på 8000 for astrocytin. Flere adskilte produkter blir ved denne fremgangsmåte skilt fra astrocytin på basis av små differanser i kjemisk struktur og store differanser i molekylvekt. Således har 3. produkter medført som forurensninger inntil dette punkt, med molekylvékter på tilnærmet 64.000, 148.000 og 230.000,'og en til-feldig med molekylvekt på 32-000, blitt påvist og fjernet ved TLG-metodene beskrevet ovenfor. Produktet astrocytin blir aspirert med gelen som det inneholdes i, i tørr form, og oppløses i

løsning (1) og gjøres fri for harpiks ved sentrifugering eller

på annen passende måte.

Produktet astrocytin som er blitt fremstilt ved dette

trinn, er løselig i destillert vann, løselig ved nøytral og sur pH

og uløselig ved alkalisk pH og har en spektrofotometrisk absorpsjonsspiss-bølgelengde ved 280 my. Det er et polypeptid med molekylvekt, som angitt ovenfor, på tilnærmet 8000. Dets kovalent bundne aminosyrer er vist med hydrolyse med 6N HC1 og

så kvantitativ automatisk bestemmelse, å ha følgende midlere sammensetning av aminosyrer:

Cysteinsyre, hydroksyprolin, norleucin, ammoniakk, isodesmosin, desmosin, hydroksylysin, lysinonorleucin og gamma-aminosmørsyre er alle fraværende i påvisbare mengder, men spor av glukosmain kan være til stede.

Fra 11 g av utgangs-hjernetumorvevet i eksempel.1,

dannes det tilnærmet 3 mg renset astrocytin ved ovennevnte fremgangsmåter.

Eksempel 3

Fremstilling av "skjelve" recognin

Skjelve-sykdom er en genetisk forstyrrelse med hvilken dyre ikke er i stand til å oppnå stabil koordinert motorisk aktivitet, og det dannes en skjelve-tilstand, på grunn av mangel på migrering av visse nerve-celler til et spesielt sted i hjernen, cerebellum, ved en spesiell utviklingstid. Spesielt har det vist seg med glial-celler, ved elektron-mikroskopiske undersøkelser, at de tilveiebringer vertikale stang-lignende akser langsetter hvilke nervecellene migrerer til deres nye stillinger i den normale tilstand. Den manglende evne for nervecellene til å gå opp langs disse glial-fibrer, ved skjelve-sykdom, har man tenkt skyldes visse forstyrrelser i nervecellene eller i glia eller i begge deler.

Ved å følge fremgangsmåtene fra eksemplene 1 og 2,

ble det dannet recognin fra muse-skjelve-hjerne, og dette ble sammenlignet med recognin dannet fra normal musehjerne. Molekylvekten av recogninet dannet fra alle områder i normal musehjerne var 8000. Molekylvekten av "skjelve"-recognin var 3600 til 5000.YSkjelve"-redognin er sykelig, så som det fremgår av dets meget lavere molekylvekt. Videre er den mengde med recognin som kan dannes fra cerebellumet i skjelvemusehjerne meget redusert sammenlignet med et som er normalt. Dette er vist i tabell I.

Tabell I viser at mens det er en klar minsking i konsentrasjonen av recognin i cerebellumet til skjelve-mus, så er.det like store eller større mengder av recogniner i andre områder av hjernen. Recogninet kan ikke flyttes fra de andre områder av hjernen til cerebellumet, eller den svake økning i andre områder av skjelve-hjerne kan reflektere en viss kompensasjonsvirkning.

Dette patologiske recognin i skjelvehjerne settes i samsvar med den manglende evne for migrerende hjerneceller til å gjøre de kontakter som de må for å oppnå riktig plassering, og dette bekrefter rollen til recogniner ved rekognosering og læring i celler.

Ved analogi kan anti-recogninene til recognin dannes fra mus-skjelve-hjerne og anvendes i mus på en lignende måte som anvendelsene av anti-astrocytin og anti-malignin, som beskrevet her.

Eksempel 4

Dannelse' av malignin-forløper i kunstig kreftcelle-kultur.

Det blir.generelt opprettholdt en ytterst samvittighetsfull

steril teknikk....

Alle løsninger (f.eks. Hank<1>s balanserte salt.(BSS), F-10 næringsmedium, foster-kalveserum, trypsin-løsning) blir inkubert ved ca. 35°C i et vannbad i tilnærmet 20 minutter eller mer før anvendelse.

Celler blir fjernet fra tumor-vev og dyrket in vitro

for mange generasjoner ved anvendelse av et passende medium, så som beskrevet nedenfor. Forhånds-skyIling av begerglass som skal anvendes, blir foretatt med en steriliserende løsning, f.eks. 12-proponal pluss amfyl- eller kreolin-løsning.

Ved den foretrukne utførelse blir de kunstige kreftceller (dvs. celler dyrket in vitro for mange generasjoner) alle dyrket, i 250ml kolber. Det flytende medium hvori cellene dyrkes kasseres i de forhånds-skyllede begerglass. Cellene vaskes så forsiktig med 5-10 ml av Hanks BSS eller annen lignende løsning i ca.. 30 sekunder. Agitasjon unngås. Alle vegger og overflater vaskes. Løsningen klargjøres for celler ved sentrifugering i kalde omgivelser i 10 minutter ved 3000 omdr. pr. minutt. Mediet helles inn i et begerglass som ovenfor. Det tilsettes en liten mengde bufret proteinase-enzym-løsning og skylles raskt for å unngå digerering av cellene. Ved dert foretrukne metode tilsettes 1-2 ml trypsin-løsning (EDTA) og det skylles i bare 10 sekunder. Trypsin-løsningen helles bort.

Det tilsettes et lignende volum frisk trypsin-løsning ■ og inkuberes inntil det sees at cellene separeres fra veggene i rommene, ved mikroskopisk iakttagelse. Til dette kreves vanligvis 5-10 minutter. Det tilsettes et passende vekstmedium, så som 50 ml av en løsning av 7-10%ig løsning av fosterkalveserum i

100 ml av F-10 næringsmedium.

25 ml av det friske medium med celler overføres til et nytt vekst-rom for forplantning, og de resterende 25 ml holdes i det første rom for forplantning. Begge rom anbringes i en inkubator ved 35°C i tilnærmet 7 dager. Ved dette punkt ved fremgangsmåten ifølge dette eksempel, deles en kunstig kreftcelle-kultur til to friske kulturer tilnærmet hver 7. dag..Hele denne, fremgangsmåte kan gjentas så ofte som ønskes, med tilnærmet

7-dagers intervaller, for hvert vekst-rom. Således kan antallet av celler som dyrkes in vitro dobles tilnræmet hver 7. dag.

Cellene kan ekstraheres for dannelse av malignin efter tilnærmet 7 dagers vekst. F.eks. kan celler som dyrkes i hvert 250 ml rom, som beskrevet ovenfor, utvinnes på følgende måte.

Mediet overføres til et sentrifugerør og sentrifugeres

med 3000 omdr. pr. minutt i kalde omgivelser i 10 minutter. Mediet kastes. Cellene som er tilbake i vekst-kammeret, skrapes

av fra rom-veggene og vaskes inn i sentrifugérørene med nøytral buffer-løsning. Cellene vaskes to ganger med nøytral buffer-løsning, sentrifugeres igjen med 3000 omdr. pr. minutt i kalde omgivelser, og mediet kastes. De vaskede celler suspenderes i 10 ml nøytral fos fat-buffer inntil de er klare for ekstrahering av urenset malignin-forløper-holdig fraksjon.

. Eksempel 5

Fremstilling av urenset malignin-foroøper-holdig fraksjon.

Vaskede celler suspendert i nøytral buffer fra eksempel 3 sønderdeles mekanisk under forhold som unngår denaturering av de fleste proteiner. Ved den foretrukne metode behandles de vaskede celler i kalde omgivelser med et sonisk apparat i 20 sekunder.

Efter behandlingen i det soniske apparat sentrifugeres celle-restene ved 30.000 omdr. pr. minutt i 30 minutter, og den overflytende væske dekanteres. Aliquoter på 10 ml med buffer-løsning anvendes for å vaske gjenværende celler fra rommet og disse settes til resten av celle-restene. Det foretas sonisk behandling og sentrifugering som ovenfor, og de overflytende væsker kombineres. Fremgangsmåten gjentas en gang til.

De kombinerte overflytende væsker forhåndsinndampes for å redusere volumet på tilnærmet 30 ml til ca. 6-7 ml. Det tas én aliquot for total protein-analyse og resten fraksjoneres,

i samsvar med metodene i eksempel 1 for astrocytin-forløper.

Eksempel 6

Fremstilling av renset malignin-produkt fra urenset malignin-holdig fraksjon.

Produktet malignin blir ytterligere isolert fra forurensninger ved fremgangsmåtene i eksempel 2 for astrocytin.

Ved TLG-trinnet ved den foretrukne utførelse, blir produktet malignin iakttatt som en adskilt flekk med en avstand på tilnærmet 0,91 ± 0,02 med referanse til standard cytobrom C,

og dette gir en tilnærmet molekylvekt på 10.000 for malignin.

Produktet malignin som er dannet ved.dette trinn, er løselig i destillert vann, løselig ved nøytral eller sur pH og uløselig ved alkalisk pH, og har. en spektrofotometrisk absorps jons-spiss ved 280 my. Det er et polypeptid med molekylvekt på tilnærmet 10.000.

Molekylvektene for malignin dannet i gjærkulturer stabilisert i suksessive generasjoner av kulturer, så som fastsatt ved tyhnskikt-gelkromatografi-bestemmelser, er angitt i tabell II. Reproduktiviteten av molekylvekt-bestemmelsene er bemerkelsesverdig med henblikk på de indre begrensninger ved TLG-kromatografi.

Malignins kovalent bundne aminosyrer har ved hydrolyse med 6N HC1 og så kvantitativ bestemmelse, vist seg å bestå av følgende gjennomsnittlige sammensetning av aminosyrer: Aminosyrene cysteinsyre, hydroksyprolin, norleucin, ammoniakk, isodesmosin, desmosin, hydroksylysin, lysino-norleucin og gamma-aminosmøresyre er fraværende i påvisbare mengder.

Et typisk utbytte av rent malignin fra 12 reaksjonsrom på 250 ml fra eksempel 4, er tilnærmet 1 ml malignin.

De enestående strukturer av malginin og astrocytin ble bekreftet ved utstrakte computer-undersøkeIser som sammenlignet deres sammensetning med i virkeligheten alle kjente protein-substanser.

Aminosyre-sammensetningen i malignin og astrocytin, deres innhold av absolutte og relative mengder av hver aminosyre-komponent uttrykt som det totale antall av aminosyre-rester pr. mol, og deres innhold av absolutte og relative mengder av hver aminosyre-komponent uttrykt som molekylvekten av molekylet, ble underkastet matrise-computor-analyse mot den største kjente litteratursamling i verden om protein-struktur, den til National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. Det. ble ikke funnet noen struktur-identitet eller endog noen svært nær den til astrocytin eller malignin ved matrise-analysen sammenlignet med flere hundre tusen proteiner og protein-fragmenter.

De eneste proteiner som på noen måte var strukturelt, beslektet, er vist i tabell III med deres individuelle amino-sammensetning og molekylvékter for sammensetningen. Computeren blir programmert for å identifisere, fra de flere hundre tusen muligheter, og vise grad av likhet i struktur. Således vil f.eks. proteiner med molekylvekt mye større eller mindre ikke passe,

og heller ikke slike med mindre enn 85 eller mer enn 95.rester, og heller-ikke slike med mindre enn 6 eller mer enn 11 asparagin-rester, og så videre for hver av de to involverte aminosyrer.

Dette "fingeravtrykk" har således så som 22 individuelle

variable som skal passe. Noen substanser vil passe for 1, for 4 eller for 5 variable, men ingen vil passe for alle 22. I virkeligheten passer ingen bedre enn for 14 variable, og dette gir forskjell for 8 variable.

Den nærmest passende er således cytokrom b^(menneske). Som vist i tabell III skiller rest-antallet for alanin, argin, asparagin, asparaginsyre, cystein, glutamin, histidin, metionin og tyrosin og tryptofan alle seg merkbart til klart fra astrocytin og fra malginin. På grunn av at cytokrom b,- inneholder 7 histidin-rester, mens astrocytin og malginin inneholder bare 2, er det ikke mulig at de. har samme kjemiske struktur;

Det mest uvanlige ved sammensetningen til astrocytin og malignin er den høye konsentrasjon av glutaminsyre. Man skulle vente å finne bare 5 eller 6 rester av 89.

Andre nest-nærmest passende er ferrodoxinene av henholdsvis leucaene glauca og av alfalfa, men disse skiller seg også klart i henholdsvis 4 og 6 aminosyrer, og merkbart i 2 andre, og ved å ha henholdsvis 96 og 97 rester. De nest-nærmest passende er acylbærer-proteinet åv E. coli 26, men dette skiller seg også klart i 11 aminosyrer fra malignin og astrocytin, og har bare

77 rester.

Noen andre hjerneproteiner (neurofysin, storfe og svin

og gonadotropin. frigjørende hormon) er oppført i tabell III for

å illustrere hvor meget dårligere tilpasningen er for de gjenværende flere hundre tusen proteinfragmenter i computer-huske-banken.

Respirasjons-proteiner kan inneholde metaller og/eller heme-komponenter i deres in situ tilstand, men det isolerte protein-fragment, f.eks. for apocytokrom b,-, inneholder ingen. Ytterligere mikroanalyse av astrocytin og malignin har vist at

de er fri for jern, svovel, fosfor og magnesium (alle mindre enn 0,01%), og spektral-egenskapene viser typisk absorpsjon ved 280 my. Efter rekombinasjon av heme med apoprotein, gjenopprettes de

typiske absorpsjons-spektra mellom 400 og 450 m.

På tross av den enestående struktur til astrocytin og malignin, til forskjell fra andre proteiner og protein-fragmenter, er det bemerkelsesverdig og kanskje av stor betydning at respirasjons-proteinene har de nærmest-liggende strukturer. Det

er velkjent i industrien at det kan trekkes mange viktige be-slektede forhold fra de strukturtyper som representeres, både fra et utviklingsgenetisk synspunkt og fra et funksjonelt synspunkt. Dersom astrocytin og malignin er nye protein-produkter hvis in

situ strukturelle ekvivalenter representerer respirasjons-funksjoner, og disse proteiner, som nå vist, er knyttet til ondartethet, da er det funnet en åpning til å løse et av de største problemer ved kreft, hvilket er hvorledes energien tilfredsstilles for disse

•grådige, raskt reproduserende ondartede celler.

Bortsett fra den teoretiske betydning av denne oppdagelse, så er det meningsfullt når dataene ovenfor for økningen av prosent-innholdet av malignin i mer ondartede celler, og dataene tilveie-bragt nedenfor som viser at anti-malignin ikke bare festes til malignin-lignende kjemiske grupper av kre ft-celler, men også er cytotoksisk for.cellene når de er slik festet, sammenholdes. Dersom malignin-lignende in situ forbindelser i kreftceller er respirasjons-proteiner, og siden anti-malignin-produktene i henhold til denne oppfinnelse festes preferensielt til disse in situ forbindelser, så er det, dersom funksjonelle respirasjons-grupper er involvert i denne festing, lett å forstå hvorledes disse resulterer i død for kreftcellene.

De terapeutiske muligheter for anti-maligninene, og andre lignende kjemoresiprokaler, er meget styrket ved denne strukturelle informasjon om malignin og astrocytin, og også ved det demonstrerte forhold mellom mengde av malignin og grad av'ondartethet.

Eksempel 7

Demonstrasjon av øket utbytte, grad av ondartethet og mengder av malignin ved tilveiebringelse av større volum og overflateareal under gjæring.

Eksemplene 3 til 5 ble gjentatt ved anvendelse av 1000 ml kolber istedenfor 250 ml kolber. Alle mengder av reagenser ble øket til det tredobbelte.

Utbyttet av produktet amlignin efter 7 dagers vekst av inokulat ble øket til nesten det dobbelte ved økning av det til-gjengelige rom for malignin-cellevekst fra. 250 til 1000 ml.

Tabell IV viser utbyttet av totalt protein i mg, og det dannede malignin som prosent av totalt protein for suksessive gjærings-kultur-generasjoner i hver kolbestørrelse. Ved anvendelse av kolber på 250 ml av gjennomsnittlig dannelsen av totalt protein 17,5 mg. Ved anvendelse av kolber på 1000 ml var den gjennomsnittlige dannelse av totalt protein 40,4 mg.

Det var overraskende at mengden av ondartet cellevekst (grad av ondartethet) ble øket pr. 7 dagers vekstperiode ved å tilveiebringe større rom og overflate for cellevekst, og mengden av dannet malignin, som prosent av det totale protein, øket betydelig. Den prosent av det totale protein som er malignin øket fra et gjennomsnitt på 10,7% ved anvendelse av kolber på 250 ml til et gjennomsnitt på 28,3% ved anvendelse av kolber på 1000 ml ved en konstant vekstperiode på 7 dager.

Forholdet mellom mengden av dannet malignin og graden .av ondartethet (dvs. som en funksjon av mengden av ondartet cellevekst in vitro på 7 dager, målt som totalt dannet protein) er vist i figur I..

Figur I viser at den økede kolbe-størrelse resulterer

i tilnærmet tredobbelte mengder av dannet malignin.

Figur I viser også et forhold mellom malignin og ondartethet. Den brutte linje representerer et ideelt lineært forhold. Dette viste forhold er klart ikke trivielt siden - mengden av nærværende malignin øker eftersom cellene blir mer uhemmet (patologisk) i sin vekst. Den normale in situ recognin-funksjon vedrører, som tidligere angitt, kontakt-inhibering av vekst av celler. Desto mer patologisk veksten av de ondartede celler er, desto mindre virker kontakt-inhibering, og desto mer blir malignin det overveiende protein..

Eksempel 5A viser at vekst av kunstig kreftcellekultur

i store vekstbeholdere uventet resulterer i øket mengde av dannet malignin, det vil si at en økning i den prosent av det totale protein som er malignin. Vekstbeholdere av stor størrelse betyr, ved anvendelse her, beholdere.hvor forholdet mellom beholder-volum og volum av totalt medium med celler benyttet i samsvar med fremgangsmåtene i eksempel 3, er større enn ca. 8:1, f.eks. 7:1 til 10:1. Eksempel 5A viser et forhold på ca. 8:1.

Eksempel 8

Fremstilling av Target-reagenser fra recogniner.

Astrocytin, fremstilt som i eksempel 2 ovenfor, eller malignin, fremstilt som i eksempel 5 ovenfor, blir kompleksert med en bærer for å danne Target-reagens.

Ved den foretrukne utførelse oppløses astrocytin eller malignin i 0,15M Nal^PO^-ci trat-buf f er, pH 4,0. En bromacetyl-harpiks, f.eks. bromacetylcellulose (BAC) med 1,0 til 1,5 milli-ekvivalenter Br pr. gram cellulose, lagret i kalde omgivelser, blir fremstilt i 0,15M NaF^PO^-buf f er, pH 7,2. Bufferen overføres til pH 4 ved å helle vekk pH 7,2 bufferløsningen og tilsette 0,15M Naf-^PO^-citratbuffer, pH 4,0. Astrocytin- eller malignin-løsningen og BAC-løsningen røres sammen (10:1 forhold mellom BAC og recognin) i 30 timer ved romtemperatur, og sentrifugeres så.

Det er foretrukket at alle steder på BAC som er tilgjengelig for å bindes til recognin, blir bundet. Dette kan utføres som følger. Den overflytende væske fra det umiddelbart fore-gående trinn lyofiliseres og proteininnholdet bestemmes for å vise mengden av astrocytin eller malignin som ennu ikke har dannet kompleks med BAC. Det dannede kompleks av BAC-astrocytin

(eller BAC-malignin) resuspenderes i 0,IM bikarbonat-buffer,

pH 8,9, røres i 24 timer ved 4° for å tillate dannelse av kjemiske bindinger mellom BAC og astrocytin eller malignin.

Efter 24 timer sentrifugeres, og deri overflytende væske analyseres på protein. Komplékset BAC-astrocytin eller BAC-malignin resuspenderes nå i 0,05M aminoetanol - 0,IM bikarbonatbuffer,

pH 8,9, for å blokkere alt uomsatt brom. Suspensjonen sentrifugeres og den overflytende væske beholdes, men analyseres ikke på grunn av nærværet av aminoetanol. Fjerning av alt ubundet astrocytin eller malignin blir så utført ved sentrifugering og resuspendering for tre vaskinger i 0,15M NaCl inntil det ikke måles noen absorbering på spektrometeret ved 266 my.. BAC-astrocytin- eller BAC-malignin-komplekset røres nå inn i

8M urinstoff i 2 timer ved 38°C, sentrifugeres og vaskes så

(tre ganger er vanligvis tilstrekkelig) med 8M urinstoff inntil

det ikke vises noen absorbering for vaskevæskene ved 266 my. Komplekset vaskes så med 0,15M NaCl to ganger for å bli kvitt urin-stoffet. Komplekset, røres så ved 37°C i 0,25M eddiksyre i 2 timer for å vise dets stabilitet. Sentrifugering og avlesning for det overflytende ved 266 my - ingen absorbering bør være tilstede. Dette kjemiske kompleks BAC-astrocytin eller BAC-malignin er derfor stabilt og kan nå anvendes som en reagens ved fremgangsmåtene beskrevet nedenfor. I denne stabile reagens-form er det referert til som Target (Topographic-Antigen-like-Reagent-Tamplate) på

grunn av at det er et syntetisk dannet kompleks hvis fysikalske og kjemiske egenskaper etterligner den stabile celle-bundne forløper til astrocytin eller malignin når den er i en potensielt reaktiv tilstand med serum-komponenter. For lagring blir Target-reagensen . sentrifugert og vasket inntil den er nøytralisert med 0,15M Nat^PO^-buffer, pH 7,2.

Target-reagensene kan fremstilles fra bromacetyl-liganderte bærere som er forskjellige fra cellulose, så som brom-acetylerte harpikser eller endog filterpapir.

Eksempel 9

Fremstilling av. antisera for astrocytin, malignin og Target

Antisera for astrocytin, malignin eller Target-reagenser kan dannes ved indusering av en antistoff-respons i et pattedyr for dem. Den følgende fremgangsmåte er funnet å være .tilfreds-, stillende. 1 mg recognin (astrocytin eller malignin). injiseres i tåputene på hvite hann-kaniner med standard Freud<1>s adjuvans,

og så gjøres den samme injeksjon intraperitonealt 1 uke senere, igjen intraperitonealt 10 dager, og, om nødvendig, 3 uker senere. Spesifikke antistoffer kan påvises i blodserumet til disse kaniner så tidlig som 1 uke til 10 dager efter den første injeksjon. Den samme fremgangsmåte følges for Target-antigen ved injisering av samme mengde Target, hvilket inneholder 1 mg astrocytin eller malignin, sa som bestemt ved Folin-Lowry bestemmeIse av protein.

Det spesifikke antistoff til astrocytin kalles anti-astrocytin. Det spesifikke antistoff til malignin kalles anti-malignin. På lignende måte kalles det spesifikke antilegemet

. til Target .for anti-Target.

Disse antistoffer viser klart ved Standard Ouchterlony gel-diffusjons-test antigen-antistoff reaksjoner med spesifikt enkle skarpe reaksjonslinjer dannet med deres spesifikke antigen. Nærværet av spesifikke antistoffer i serum kan også . testes med standard kvantitativ utfellings-test for antigen-antistof f-reaks joner . Gode kvantitative utfellingskurver oppnås og mikrogrammene av spesifikke antistoffer kan beregnes derfra.

Ytterligere bevis for nærværet av spesifikke antistoffer i serum kan oppnås ved absorpsjon av det spesifikke antistof-fet anti-astrocytin på bromacetylcellulose-astrocytin (BAC-astrocytin) fremstilt ovenfor. Antiserumet inneholdende spesifikt anti-astrocytin kan omsettes medBAC-astrocytin. Når serumet føres over BAC-astrocytin bindes bare de spesifikke antistoffer for astrocytin til deres spesifikke antigen astrocytin. Siden astrocytin er kovalent bundet til bromacetylcellulose er det spesifikke antistoffet, anti-astrocytin, nå bundet til BAC-astrocytin for å danne BAC-astrocytin-anti-astrocytin (BACA-antiastrocytin). Dette bevises ved å teste resten av-serumet som er vasket fritt for BAC-astrocytin. Ved standard Ouchterlony diffusjon er det ikke tilbake noen antistoffer i serumet som vil omsettes med astrocytin. Det konkluderes derfor med at alle spesifikke antistoffer (anti-astrocytin) som tidligere er vist å være nærværende i serumet, er blitt absorbert på BAC-astrocytin. Videre, når antiastrocytin blir frigjort fra dets binding til BAC-astrocytin, blir det dermed isolert fritt for alle forurensende antistoffer. Denne frigivelse av anti-astrocytin kan utføres ved å vaske BAC-anti-astrocytinet koblet med 0,25M eddiksyre (4°C, 2 timer), hvilket, som er vist ovenfor,

ikke bryter BAC-astrocytin-bindingen.

Enda ytterligere bevis på nærværet av spesifikke antistoffer i serum kan oppnås ved absorpsjon av det spesifikke antistoffet anti-malignin på bromacetylcellulose-malignin (BAC-malignin) fremstilt ovenfor. Antiserumet inneholdende spesifikt anti-malignin kan omsettes med BAC-malignin. Når serumet føres over BAC-malignin bindes bare de spesifikke antistoffer til malignin. til deres spesifikke antigen malignin. Siden malignin er kovalent bundet til bromacetylcellulose er det spesifikke antistoffet, anti-malignin, nå bundet tilBAC-malignin for å danne BAC-malignin-anti-malignin (BACM-anti-malignin). Dette bevises ved å teste resten av serumet som vaskes fritt for BAC-malignin. Ved standard Ouchterlony diffusjon er det nå ikke tilbake noen antistoffer i serumet som vil omsettes med malignin. Det konkluderes derfor med at alle spesifikke antistoffer (anti-malignin) som tidligere er vist nærværende i serumet, er blitt absorbert til BAC-malignin. Videre, når anti-malignin blir frigjort fra dets binding til BAC-malignin, blir det derfor isolert fritt for alle forurensende antistoffer. Denne frigjøring av anti-malignin kan utføres ved vasking av BACM-anti-malignin-komplekset med 0,25M eddiksyre (4°C, 2 timer) hvilket, som vist ovenfor, ikke bryterBAC^malignin-bindingen.

Antistoffene til Target viser klart ved standard Ouchterlony gel-diffusjons-test for antigen-antistoff-reaksjoner spesifikke enkle reaksjonslinjer dannet med Target, hvilket viser en identitets-linje med reaksjons-linjen til anti-astrocytin eller anti-malignin antisera (dvs. slike dannet for injeksjonen av astrocytin eller malignin selv). Visse kaniner, har det blitt notert, har nivåer av anti-Target i blodet før de blir.injisert med Target. Disse anti-Target substanser, når de spesielt omsettes med Target-reagens så som beskrevet i tester på menneske-sera, fører til dannelse av tilnærmet ekvivalente mengder av de to typer av TAG, S-TAG og F-TAG (se senere eksempler).

Eksempel 10

Påvisning av ondartede tumorer ved kvantitativ dannelse in vitro av Target-festende blobuliner (TAG) fra biologiske væsker.

Target-reagens fremstilt i samsvar med eksempel 6,

vaskes for å fjerne alt ubundet recognin som kan være tilstede på grunn av beskadigelse. Den følgende fremgangsmåte er tilfredsstillende. Target-reagens røres i 2 timer ved 37°C med eddiksyre, sentrifugeres, den overflytende væske dekanteres og den optiske densitet til den overflytende væske avleses ved 266 mp. Dersom det er noen som helst absorbering, blir denne vasking gjentatt inntil det ikke solubiliseres ytterligere materiale. Target resuspenderes så i fosfat-bufret saltløsning, pH 7,2. ' (Standard S-TAG og F-TAG renset fra tidligere reaksjoner av menneske-serum ved fremgangsmåten beskrevet nedenfor kan anvendes, om tilgjengelig, som referanse-standarder for å teste Target-reagensen, og dette kan også kanin-serum som det er bestemt inneholder S-TAG og F-TAG ved andre Target-fremstillinger).

Sakte-bindings (S-TAG) bestemmelsen utføres som følger: Frosset serum lagret mer enn noen få dager bør ikke anvendes. Serum fremstilles omhyggelig fra friskt fullblod eller annen legemsvæske ved standard-fremgangsmåter i industrien. Den følgende fremgangsmåte er funnet å være tilfresstillende. Blod gis anledning til å størkne ved hensetting i 2 timer ved romtemperatur i et glass-testrør. De størknede klumper skilles fra veggene med en glass-rørestang og blodet- hensettes ved 4°C i minst 2 timer (eller natten over). De størknede klumper skilles fra serumet ved sentrifugering ved 20.000 omdr. pr. minutt ved 4°C i 45 minutter. Serumet dekanteres inn i et sentrifugerør og sentrifugeres igjen ved 2000 omdr. pr. minutt ved 4°C i 45 -minutter. Serumet dekanteres og en l%ig løsning av metiolat (1 g i 95 ml vann og 5 ml 0,2M bikarbonat-buffer, pH 10) tilsettes i en mengde av 1% av serum-volumet.

Serum-prøver, fremstilt ved den ovenfor angitte eller andre fremgangsmåter, på hver 0,2 ml settes til hver av 0,25 ml aliquoter av Target-suspensjonsreagens inneholdende 100-200 mikrogram recognin pr. 0,25 ml Target-reagens, ved duplikat-bestemmelser. Suspensjonen blandes ved 4°C slik at pellet-dannelse unngås.

F.eks. kan en liten hurtig-rister med gummihylster anvendes i

1-2 sekunder og så, med rørene svakt skrånende,, kan det ristes i en Thomas-rister i ca. 2 timer eller mer. Target-reagens.et og protein bundet til dette, separeres fra serumet. En av fremgangsmåtene som er funnét å være tilfredsstillende er følgende. Rørene sentrifugeres så ved 2000 omdr. pr. minutt i 20 minutter ved 4°C, den overflytende væske dekanteres, de pelleter som er dannet ved sentrifugering vaskes 3 ganger ved gjenblanding og risting ved romtemperatur med 0,2-0,3 ml av 0,15M. saltløsning,

det sentrifugeres og det overflytende kasseres.

Det protein som er tilbake festet til Target, fraspaltes derfra og bestemmes kvantitativt. Det tilsettes for eksempel 0,2.ml av 0,25M eddiksyre, suspensjonen ristes i 1 til 2 sekunder med en gummihylster-rister, så i en. Thomas-rister i ca. 2 timer i en inkubator ved 37°C. Rørene sentrifugeres ved. 2000 omdr. pr. minutt ved 4°C i 30 minutter. Det overflytende dekanteres forsiktig for å unngå overføring av partikler, og den optiske densitet til det overflytende avleses ved 2 80 mp. -Verdien av den optiske densitet deles med en faktor på 1,46 for å få resultater i mikrogram pr. ml serum-protein (S-TAG). Duplikat-bestemmelser bør ikke variere mer enn 5%. Hvilken som helst annen effektiv fremgangsmåte for bestemmelse av protein-innhold kan anvendes, så som Folin-Lowry-bestemmelsen, men standardene må være spesifisert til å bestemme reguleringsområdet og tumor-verdiene til S-TAG minus F-TAG-konsentrasjon.

Hurtig-bindings- (F-TAG) bestemmelsen utføres som følger: Frosset serum lagret mer enn noen få dager bør ikke brukes. Serum blir omhyggelig fremstilt fra friskt oppnådd fullblod eller annen legemsvæske ved standard fremgangsmåter i industrien. Fremgangsmåten gitt ovenfor i dette eksempel for serum-fremstilling er tilfredsstillende.

Serum-prøver, fremstilt ved den ovennevnte eller andre fremgangsmåter, hensettes ved 4°C i 10 minutter mindre enn den totale tid S-TAG serumsbestemmelsene ble gitt anledning til å være i kontakt med Target-reagens ovenfor (f.eks. 1 time og 50 minutter dersom en "to-timers" S-TAG bestemmelse ble utført).. Denne fremgangsmåte utligner temperatur-forskjellene til S-TAG og F-TAG-bestemmeIser.

Prøver på 0,2 ml av temperatur-utjevnet serum settes til hver av aliquoter på 0,25 ml med Target suspensjons-reagens inne holdende 100-200 mikrogram recognin pr. 0,25 ml Target-reagens, ved duplikat-bestemmelser. Suspensjonen blandes så ved 4°C i tilnærmet 10 minutter på en slik måte at pellet-dannelse unngås. F. eks., kan det anvendes et lite hurtig ristet gummihylster i 1-2 sekunder og så, med rørende svakt på skrå, kan det ristes i en Thomas-rister i.tilnærmet 10 minutter. Target-reagenset og protein bundet til dette, skilles fra serumet. En av fremgangsmåtene som er funnet tilfredsstillende er den følgende. Rørene sentrifugeres så ved 2000 omdr. pr. minutt ved 4°C, det overflytende dekanteres, pelletene som blir dannet ved sentrifugering vaskes 3 ganger ved gjenblanding og risting ved romtemperatur med 0,2-3,0 ml 0,15M saltløsning, det sentrifugeres og det overflytende kasseres.

Det gjenværende protein festet til Target spaltes derfra og bestemmes kvantitativt. Fremgangsmåten beskrevet ovenfor i dette eksempel for bestemmelse av S-TAG konsentrasjon er tilfredsstillende. Hvilken som helst annen fremgangsmåte som er effektiv for bewstemmelse av protein-innhold kan anvendes, så som Folin-Lowry-bestemmelse, men standardene må være spesifisert for å bestemme kontroll-området og tumor-verdiene til S-TAG minus F-TAG konsentrasjon.

De endelige resultater uttrykkes som TAG mikrogram pr. ml serum, og er like S-TAG minus F-TAG. TAG-verdier i ikke-hjernetumor-pasienter og andre kontroller ligger ofte i området fra null (eller et negativt tall) til 140 mikrogram pr. ml serum. TAG-verdier i hjernetumor-pasienter ligger ofte i området fra 141 til 500 mikrogram pr. ml serum. Ved den første "blind"-undersøkelse av 50 blodprøver i henhold til fremgangsmåtene i dette eksempel, ved benyttelse av Target-reagens fremstilt fra astrocytin og bromacetylcellulose, ble 11 av 11 hjernetumorer og 28 av 32 normale pasienter korrekt identifisert. En av de 4

antatt normal-kontroller (dvs. ikke-hjernetumor-kontroller) viste

seg å ha kreft i tyroid-kjertelen, hvilken tilsynelatende var behandlet med hell noen år tidligere. De 3 gjenværende normale kontroller var individer i alderen 60-70 som hadde dårlig helse, muligens ikke-diagnostisert kreft. Av de gjenværende 7 prøver ble 3 av 3 tilfeller Hodgkin's sykdom korrekt identifisert, Sn prøve i tumor-området (141-500 yg TAG/ml) tilsvarte en.pasient med en alvorlig gliosis, og 3 prøver i ikke-tumor-området.

(0-140 yg TAG/ml) tilsvarte pasienter med respektivt en

intrakranial masse-diagnose usikker, men ikke-tumor, og osteosarkom (ikke-hjerne tumor) og et melanotisk sarkom (ikke-hjerne tumor).

En etterfølgende undersøkelse i henhold til fremgangsmåtene i dette eksempel ved anvendelse av Target-reagens fremstilt fra malignin og bromacetylcellulose, identifiserte korrekt tre av tre ondartede hjernetumorer og alle-normal-kontroller. En enda ytterligere undersøkelse utført i henhold til fremgangsmåtene i dette eksempel, utvidet det totale antall med testede menneske-serum-prøver fra 50 til 114.. Anvendbarheten av disse produkter og fremgangsmåter er vist i tabell V som viser resultatene av disse tester.

Omfatter normal-kontroller, ikke-tumor-medisinske og

kirurgiske forstyrrelser.

I - svært syk, udiagnostisert; 2. - ekstra hjerne intrakranial masse, udiagnostisert; 3 - markert gliosis; 4 - ondartet melanom, 5 - osteosarkom; 6 - hjerne-blære væske; 7 - adenocarcinoma av tykktarm; 8 - gastrektomi; 9 - hodeverk; 10 - emfysem,

II - polymyalgi; 12 - tykktarmkreft, 13 - krampetrekninger;

14 - prostrat-kreft, sekundær til ben; 15- klinisk "normale",

18 måneder tidligere, når dette sykelige serum TAG ble.oppnådd: riy-utviklede alvorlige hodepiner, tap av smak og lukt.

Eksempel 11

Diagnose av tumorceller ved immunofluorescens.

Forbindelsene anti-astrocytin, anti-malignin og S-TAG

har vist at de preferensielt festes til tumorceller. Denne spesifikitet gir anledning til å anvende disse forbindelser til å diagnostisere tumorceller i histologideler ved å konjugere farvestoffer eller radioaktive substanser til anti-astrocytin, anti-malignin eller S-TAG. Det kan anvendes standard merketeknikker.

En fremgangsmåte ved anvendelse av S-TAG er som følger.

En fremgangsmåte som er funnet tilfredsstillende er en modifisert St. Marie prosess. Menneske-hjernetumor-prøver blir

frosset og så blir det skåret ut deler med en tykkelse på

5 mikron. Disse lagres i en fuktig beholder ved minus 70°C

i 4 til 8 uker før flekking. Konjugatet kan være et standard antiserum så som geit anti-kanin konjugat. Konjugatet merkes ved teknikker kjent i industrien med fluorescerende eller annen merkende substans. Fluorescerende merket.geit anti-kanin konjugat som er kommersielt tilgjengelig, kan anvendes. Det ble anvendt en fluoresceringsteknikk som var en standard hvorved en 1:200 til 1:400 løsning av TAG inkuberes i ca. 30 minutter eller mer på tumor-delen, fulgt av vasking for å fjerne ikke-festet TAG.

Tre vaskinger med fosfat-bufret saltløsning er funnet tilfredsstillende. Konugat-inkubéring med fluorescein-merket konjugat fulgt av vasking utføres så, fulgt av mikroskopisk undersøkelse. Normale celler og deres prosesser svikter med hensyn til flekking både for tumor-deler og ved kontroll-deler av normal ikke-tumor-hjerne. Fluorescens er klart til stede i tumor-glial-celler og deres prosesser.

Eksempel 12

Påvisning av ondartede ikke-hjerne-celler med fluorescerende signal fra TAG.

Anvendelsen av TAG-produkter koblet med en signal-utsender, så som et farvestoff eller et radioaktivt merke , . for å påvise kreftceller, er beskrevet her. I dette eksempel blir påvisning av ondartede ikke-hjerne-celler beskrevet.

Så som, beskrevet i eksempel 10 benyttes menneske-serum.

Ved bestemmelsen av TAG ble, efter at anti-malignin antistoff var bundet til det immobiliserte antigen og ikke-bundet serum-protein er vasket bort, antistoffet fraspaltet fra bindingen med 0,25M eddiksyre ved 37°C i 2 timer og Target-reagenset separert derfra ved sentrifugering. TAG-antistoff-løsningen ble kvantisert ved hjelp av dens absorpsjon ved 2 80 my. TAG-løsningene ble lagret ved 20°C, så tint og kombinert, bragt til pH 7 ved titrering med 6N NaOH, dialysert mot fosfat-bufret saltløsning med pH 7, filtrert og konsentrert på millipbre Pellicon 1000 membraner, sentrifugert til klart uløselig protein og immun-globulin-kompleksene ble konsentrert og frigjort for immunologisk ikke-aktive forbindelser med Cellex D og blå Sepharose CL6B (Pharmacia) kromatografi. Dette menneskelige anti-malignin antistoff reagerer med anti-menneske-gamma-globulin ved Ouchterlony dobbelt-diffusjon. Når TAG anvendes med fluorescerende middel konjugert til anti-menneskelig gamme- . globulin ved standard dobbel-skikts Coons immunofluorescens, flekker det ondartet glia, bryst-carcinoma, eggstokk-carcinoma, tykktarm-adenocarcinoma og andre typer av kreftceller i post-operative og biopsi vev-deler, og også i menneske-spytt,

bronkiale vaskevæsker, plevrale utstrømningsvæsker, gastrisk aspirat og blære-urin. Konsentrasjonen av protein i TAG som gir klar fluorescens når kontrollene er negative, er 1 til 10 yg pr. del.

Produksjonen av "renset" TAG ble foretatt ved å omsette sera fra pasienter med en rekke typer kreft med bromacetylcellulose-malignin ved metoder som tidligere er beskrevet (eksempel 10). Antistoffet bundet ved denne reaksjon ble spaltet med 0,25M eddiksyre, kvantisert ved måling ved O.D. 280 ved anvendelse av en omdanningsfaktor på 1,46 for gamma-globulin, frosset og lagret ved 20°C. Dette antistoffet ble funnet å inneholde immunoglobulin så som bestemt ved anti-menneskelig gamma-globulin antiserum spesifikt for gamma-kjeder (BioRad Laboratories, Inc.) og med anti-FAB og anti-Fe fragmenter (Miles Laboratories). Det reagerer også med kanin anti-menneskelig albumin (BioRad Laboratories).

Det ble funnet at mens 10 til 50 mikrogram protein TAG

er nødvendig for å danne spesifikk immunofluorescerende flekking

av celler som inneholder malignin, så kreves det bare 1 til 10 mikrogram renset protein TAG for denne spesifikke flekking i alle deler, og i noen få tilfeller er mindre enn ett mikrogram funnet

å være tilstrekkelig.

Det ble funnet at det mest aktive preparat av renset TAG er det som blir eluert med den høyeste ionestyrke, dvs. fra 0,15M til 1,5M. Hvilken som helst f rems ti l.lingsmetode som benytter seg av dette faktum, er nyttig. Tre foretrukne metoder er gitt nedenfor.

Metode I - Fraksjonering av TAG ved kromatografi med DEAE

cellulose (Cellex D, BioRad Laboratories) ble først anvendt ved trinnvis eluering med økende ione-styrke og avtagende pH, den samme sekvens av elueringsmidler som er angitt i eksempel I for fremstilling av urenset astrocytin-forløper-holdig fraksjon. Det ble oppnådd god separering av protein-massen til tre fraksjoner, spiss I oppnådd med løsning 1 (se eksempel 1) og spiss II oppnådd med løsning 6 og løsning 7. Ouchterlony dobbelt-diffusjon viste

at TAG ved spiss I fremdeles inneholder merkbart med protein med albumin-mobilitet> og selv om spiss II inneholdt det meste av albuminet kunne det påvises merkbart med IgG. Rekromatografering av spiss I ga et progressivt rent IgG inntil, efter den.

7, kromatografering, det i alt vesentlig ikke kunne påvises noe albumin (mindre enn 3%) ved Ouchterlony gel-diffusjon, ved

hvilken 5 til 10 mikrogram menneskelig albumin var påvisbart med kanin anti-menneskelig albumin. Den således oppnådde IgG var tilbøyelig til denaturering og .tap av immunologisk reaktivitet efter noen få dagers henstand ved 0-5°C.

Metode II - En annenfraksjonering av TAG ble foretatt med kromatografering på Sepharose CL-6B (Pharmacia, Inc.) ved å

starte med lav-molaritets buffer (0,005M fosfat) og fortsette i to trinn med 0,15M og 1,5M for å eluere resten av proteinet. Som med Cellex D, ble én gjennomgang funnet å være utilstrekkelig for separering, og recyklisering forbedret produktet sakte.

Igjen var den mest aktive fraksjon vis-a-vis anti-malignin antistoff i 1,.5M fraksjonen.

Metode III - Kromatografi med Sepharose CL-6B nærmest til den glass-frittede skive.og Cellex D lag over Sepharosen viste seg å være den mest tilfredsstillende metode.

Den grafiske fremstilling i figur 2 viser fraksjonene oppnådd ved kromatografi av TAG ved benyttelse av metode III.

Efter det første eluat på 200 ml, ble det oppsamlet under-fraksjoner på 50 ml eller mindre. Protein-innholdet i hvert

eluat ble bestemt ved den optiske densitet ved 2 80 mu med en lik faktor på 1,46 basert på gamm-globulin anvendt for å omdanne til mikrogram for beregning av det som utvinnes. Den absolutte mengde av protein må korrigeres for de fraksjoner hvori det er merkbart med albumin. De punkter hvorved de trinnvise løsnings-middelforandringer ble foretatt, er vist ved piler. Underfraksjonene er betegnet med romertall I til VIII.

Løsningsmidlene svarende til bokstavene A-F ved pilene,

var følgende:

A - 0,01M TRIS (pH.7,2)

B - 0,05M TRIS med 0,1M NaCl (pH 7,2)

C - PBS, 0,11M NaCl (pH 7,2)

D - PBS, 0,16 5M NaCl (pH 7,2)

E - PBS, 0,33M NaCl (pH 7,2)

F - 0,05M TRIS, 1,5M NaCl (pH 7,2).

I den følgende tabell er vist utvinningene fra hver fraksjon, en halv-kvahtitativ bestemmelse i hver av gamma-globulin og albumin i hver, og også aktiviteten til hver fraksjon ved den immunofluorescerende flekking av kreftceller.

(Pluss-tegnet betyr reaksjon, null ingen reaksjon og pluss/minus reaksjon i noen tilfeller).

Figur 3 er en fotografisk fremstilling av reaksjons-linjen mellom anti-menneskelig gamma-globulin spesifikk for gamma-kjeder for hver av fraksjonene I og II ovenfra (venstre.og under i fotografiet).

Figurene 3a og 3b er fotografier som viser anvendelsen

av TAG (fraksjon VIII ovenfra) for å flekke ondartede- ikke-hjerne celler. Figur 4a er en flekking av bronkogeniske carcinoma-celler

i de bronkiale vaskevæsker til en pasient. Fibur 4b er en flekking av lymfoma-celler i plevral-væsken til en pasient. Ikke-kreft-celler gir ikke fluorescens. TAB (1 til 10 pg i

0. 1 ml fosfat-bufret saltløsning (PBS)) påføres på overflaten av pakkede celler på en glass-skråplate inkubert 30 minutter,

vasket tre ganger med PBS og så belagt med fluorescein-konjugert anti-menneskelig IgG fortynnet inntil ikke-ondartet kontroll-vev gir i alt vesentlig ingen fluorescens. Cellene visualiseres med Zeiss fluorescerings-mikroskop ved anvendelse av en wolframlampe og filtere BG 23, BG 12 og 500.

Eksempel 13

Påvisning av kreftceller med radioisotope signaler fra TAG.

I dette eksempel er muligheten for festing av et radioaktivt merke tilTAG demonstrert. Dernest har injeksjonen i dyr av dette radio-merkede TAG blitt utført og vist som sikkert og effektivt. For det tredje ble det radio-merkede TAG lokalisert pre ferensielt i kreftvev ved sammenligning med normalt vev, og dette viser at spesifikiteten tidligere demonstrert in vitro på preferansen for kreftceller som befordres ved anvendelse av spesifikke anti-malignin TAG-produkter, er bekreftet in vivo.

9 9 m

Herkesetting av TAG med 99m technetium ( Tc)

Fremgangsmåte ved merking

1. To preparater av TAG ble anvendt, her betegnet TAG-1

og TAG-2. TAG-1 og TAG-2 (konsentrasjoner for hver 0,4 mg/0,5 ml) ble satt til separate sterile prøveglass.

2. Til hvert prøveglass ble det satt 0,1 ml av. en tinn(II)-klorid-løsning (10 mg SnCl2-2H20 i 100 ml av 0,01N HC1). Prøve-glassene ble blandet i 3-4 minutter. 99m 3. 0,1 ml (6mCi) av Tc-pertechnatat (natriumsalt) ble tilsatt og blandet i 2-3 minutter.

Fremgangsmåte for bestemmelse av merkesettings- effekten

9 9m 9 9m Prøver av Tc-TAG-1 og Tc-TAG-2 ble testet på merke-settingseffekt ved nedstrømmende papir-kromatografi ved anvendelse av Watman nr. 1 papir med 85 %ig"'metanol som løsningsmiddel. En lignende undersøkelse ble foretatt med natrium-pertechnetat- 9 9 mTc som virket som en kontroll. Efter 2 timer ble papirene fjernet fra kromatograferings-tanken og delt i 2 seksjoner: (1) 1 cm fra utspringet; (2) de gjenværende papirer opptil løsningsmiddel-fronten. Hver seksjon ble så opptelt i en gammabølge-gnistteller og dens innhold av radioaktivitet ble bestemt (cpm).

Tilnærmet 50 lambda ble plettert for hver papir-strimmel.

Fremgangsmåte for antigen- antistoff- reaksjon

En del av den merkedannede løsning ble også plettert på en Ouchterlony gel-plate for å bestemme dens evne til å reagere med malignin ved antigen-antistoff-reaksjonen. Efter en periode på 3 timer, ble de resulterende skarpe reaksjonslinjer fjernet fra gelen og deres innhold av radioaktivitet ble målt. En lik del av gelen som ikke var involvert i reaksjonen ble også fjernet og dens innhold av radioaktivitet ble også målt som bakgrunn.

Resultater

Merkedannings- effekt

Konklusjoner

Man kom frem til følgende•konklusjoner med hensyn til

de anvendte kvalitets-kontroll-tester:

9 9m 1. Tc-pertechnetat ble redusert av tinn (II)klorid til en mer effektiv oksydasjons-tilstand (+4+5). 2. Det reduserte pertechnetat dannet merker både med TAG-1 og TAG-2 preparatene. 3. 99mTc-TAG-2 ble testet med hensyn til dets evne til å

beholde sin aktivitet, og ble funnet å beholde evnen til å reagere immunologisk.

Anvendelsen av radio- merket TAG in vivo for å påvise kreftceller

Wistar-rotter ble injisert intracerebralt med cisglioma-tumorceller som tidligere hadde hatt gjennomgang i rotter og i vev-kultur. Rottene ble observert på de første tegn på vekst av tumor, så som svakhet, tremor eller ustøhet. Disse symptomer viste seg først 7 til 10 dager fra injeksjonen, og hurtig-voksende tumorer resulterte i døden innen 3 til 4 dager for mange dyr', og én uke for alle. Så snart som symptomene viste seg ble dyrene injisert med merket TAG intravenøst i hale-blodåren, og så ble dyrene bedøvet efter varierende tider, hjernen ble fjernet, tumoren ble skåret fri for normal hjerne, og radioaktiviteten i hver oppskåret prøve ble sammenlignet.

9 9m

Preliminært Tc- TAG- forsøk

Prøver av tumor og av normal hjerne ble opptalt natten over i gamma-bølge-telleren. Alle prøvene og standardene ble f o-r f allskorrigert for forenkling til det midlere antall for den første prøve i sekvensen.

Konklusjon

Den preferensielle lokalisering av radioaktivitet i tumor, sammenlignet med i normalt vev, er vist ovenfor.

Eksempel 14

Demonstrasjon av at anti-astrocytin, anti-malignin og S-TAG er cytotoksiske for tumorcelle-vekst i vev-kultur.

Det kan anvendes standard-tester for bestemmelse av cytotoksisitet. Vanligvis blir antall celler i et fast tellerom, vanligvis anordnet til å inneholde ca. 100 levende celler, opptellet. Disse, celler blir så behandlet med midlet som testes,

og antall celler som fremdeles er i live, blir opptellet.

Ved en standard-test på cytotoksisitet for S-TAG løsning oppnådd i samsvar med metodene i eksempel 10, mot celler i vev-kulturer som stammer fra en pasient med en gliblastoma grad III-IV, godtkarakterisertsom glial opprinnelse, frembragte S-TAG død for alle celler i telle-rommet endog i en høy fortynning på

1:100 og 1:1000, hvilket representerer så lite som 0,2 og 0,02 yg av S-TAG pr. ml løsning. Lignende resultater er oppnådd med høye fortynninger av anti-astrocytin og anti-malignin.

Både spesifikiteten vist i eksempel 11 og cytotoksisiteten vist i eksempel 12 er meget relevante for de terapeutiske muligheter til anti-astrocytin, anti-malignin og S-TAG for hjernetumorer hos mennesker. Mens disse terapeutiske anvendelser ligger i fremtiden, er det praktiske diagnostiske potensial for begge disse fenomener for tumorvev fjernet ved operasjon, men som krever diagnose ved histologi, allerede demonstrert her.

Eksempel 15

Hydrolytisk spaltning av recogniner.

En løsning av recognin, i dette tilfelle enten astrocytin eller malignin, ved pH mellom 1 og 2 hensettes i kaldt miljø. Efter 7 til 14 dager viser TLG kromatografi at produktet er blitt redusert i molekylvekt med tilnærmet 200. Når løsningen hensettes lenger, fraspaltes det ytterligere enheter med tilnærmet 200 i molekylvekt hver 7 til 10 dager. For astrocytin reduseres således molekylvekten fra 8000, og for malignin reduseres den fra 10.000, i hvert tilfelle med enheter på tilnærmet 200 sekvensielt.

De fysiokjemikalske spesifikiteter til astrocytin opp-rettholdes for hvert produkt ned til en molekylvekt på tilnærmet 4000. De fysiokjemikalske spesifikiteter til malignin opprett-holdes for hvert produkt ned til en molekylvekt på tilnærmet 5000. Dette er vist med Ouchterlony gel-diffusjonstest mot henholdsvis anti-astrocytin og anti-malignin.

Denne spaltning kan også utføres enzymatisk, så som med trypsin og andre proteinaser, med lignende resultater.

Molekylvektene av disse forbindelser fremstilt ved hydrolytisk spaltning av recogniner kan tilnærmet defineres med de følgende formler:

For produkter med de fysiokjemikalske spesifikiteter til astrocytin:

For produkter med de fysiokjemikalske spesifikiteter til malignin:

hvor y er molekylvekten til produktet og x er et helt tall fra 0 til 19.

Eksempel 16

Fremstilling av kunstig vev eller organ med recogniner.

Et stiv-vegget rør av plast, metall eller annet egnet stivt materiale dyppes inn. i eller impregneres med en høy-konsentrert (dvs. 10 mg/ml) viskøs løsning av recognin, i dette tilfelle enten astrocytin eller malignin, inntil alle overflater er fullstendig belagt med recogninet. Alternativt føres recognin-løsning gjennom og rundt røret under trykk inntil alle overflater er fullstendig belagt. Røret tørkes så i'luft eller i vakuum, eller lyofiliseres. Belegningsprosessen gjentas flere ganger for å bygge opp flere molekylar-skikt av recognin-belegning.

Røret er nå klart til å plasseres i et hulrom eller i et vev som inneholder astrocytin- eller malignin-lignende forløpere 1 nærliggende vev eller væske i et levende pattedyr. Dette kunstige vev eller organ kan anvendes for å minimalisere eller eliminere reaksjoner som fremmede substanser uten recognin-belegning ville anspore.

Kunstige vev eller organer av andre geometrier kan fremstilles på lignende måte.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en cellesamling, som omfatter å påføre et anti-malignin TAG-produkt festet til visible eller signal-, emitterende midler på nevnte cellesamling hvorved nevnte anti-malignin TAG-produkt preferensielt festes til kreftaktige eller ondartede celler, og påvisning av nevnte kreftaktige eller ondartede tumorceller ved hjelp av nevnte visible, eller signal-emitterende midler.

2. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede, tumorceller i en cellesamling i henhold til krav 1, hvilken omfatter å påføre på nevnte cellesamling et anti-malignin TAG-produkt, og derefter påføre fluorescein-konjugert anti-TAG derpå, hvorved det foregår fluorescens bare i de kreftaktige eller ondartede tumorceller ved illuminasjon.

3. Fremgangsmåte i"henhold til krav 1 eller 2, hvorved de kreftaktige tumorceller er glial-tumorceller.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 eller 2, hvorved de kreftaktige tumorceller er ikke-glial-tumorceller.

5. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvorved TAG-produktet blir dannet ved omsetning av anti-malignin-serum med et malignin-basert reagens.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 5, hvorved det malignin-baserte reagens er bromacetylcellulose-malignin.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 2, hvorved TAG-produktet i det minste delvis er blitt befridd for substanser som er lite eller ikke-reaktive ved fluorescerende påvisning når de påføres på kjente kreftaktige celler.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, hvorved anti-malignin TAG-produktet er festet til et signal-emitteringsmiddel.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, hvorved TAG-produktet er direkte festet til signa1-emitteringsmidlet.

10. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, hvorved TAG-pro.duktet ér indirekte festet til signal-emitteringsmidlet.