NO793362L - Fremgangsmaate til paavisning av ondartede tumorceller - Google Patents
Fremgangsmaate til paavisning av ondartede tumorcellerInfo
- Publication number
- NO793362L NO793362L NO793362A NO793362A NO793362L NO 793362 L NO793362 L NO 793362L NO 793362 A NO793362 A NO 793362A NO 793362 A NO793362 A NO 793362A NO 793362 L NO793362 L NO 793362L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tag
- malignin
- cells
- astrocyte
- tumor cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 97
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 99
- 108010031052 malignin Proteins 0.000 claims description 77
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 55
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 52
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 32
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 7
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 7
- 230000009876 antimalignant effect Effects 0.000 claims description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 79
- 239000000047 product Substances 0.000 description 71
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 70
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 61
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 60
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 49
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 23
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 12
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 12
- 108010090946 astrocytin Proteins 0.000 description 12
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 12
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 12
- -1 lycoproteins Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 8
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 7
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 5
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000007983 brain glioma Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 description 3
- 101000909516 Homo sapiens Contactin-2 Proteins 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-N (2s)-2-amino-5-[1-[(5s)-5-amino-5-carboxypentyl]-3,5-bis[(3s)-3-amino-3-carboxypropyl]pyridin-1-ium-4-yl]pentanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC[N+]1=CC(CC[C@H](N)C(O)=O)=C(CCC[C@H](N)C([O-])=O)C(CC[C@H](N)C(O)=O)=C1 VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-N 0.000 description 2
- HYLBTMZBXLEVCL-UWVGGRQHSA-N (2s)-2-amino-6-[[(5s)-5-amino-5-carboxypentyl]amino]hexanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNCCCC[C@H](N)C(O)=O HYLBTMZBXLEVCL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-hydroxy-3-[(4-nitrophenyl)diazenyl]-6-phenyldiazenylnaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=C(N=NC=3C=CC=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 2
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 238000003231 Lowry assay Methods 0.000 description 2
- 238000009013 Lowry's assay Methods 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021626 Tin(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O isodesmosine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC[N+]1=CC(CCC(N)C(O)=O)=CC(CCC(N)C(O)=O)=C1CCCC(N)C(O)=O RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108010057846 lysinenorleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000011150 stannous chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N (1,10,13-trimethyl-3-oxo-4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl) heptanoate Chemical compound C1CC2CC(=O)C=C(C)C2(C)C2C1C1CCC(OC(=O)CCCCCC)C1(C)CC2 TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 2-amino-2-deoxy-D-mannopyranose Chemical compound N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 4-diazoniobenzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=C([N+]#N)C=C1 UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 1
- 208000010470 Ageusia Diseases 0.000 description 1
- 206010002653 Anosmia Diseases 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 102000002710 Neurophysins Human genes 0.000 description 1
- 108010018674 Neurophysins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000019666 ageusia Nutrition 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003362 bronchogenic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000013110 gastrectomy Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 150000008273 hexosamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000554 physical therapy Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 230000005195 poor health Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000020129 regulation of cell death Effects 0.000 description 1
- 230000025053 regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004202 respiratory function Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000018316 severe headache Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000001119 stannous chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L tin(II) chloride (anhydrous) Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sn+2] AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en cellesamling in vitro eller in vivo, og.mer spesielt vedrører den en slik fremgangsmåte hvor det benyttes produkter, her kalt target-festende globuliner (TAG), produkter som er derivater av forbindelser som her kalles recogninger, og som er i stand til preferensielt å festes til kreftaktige eller ondartede tumorceller.
Recogniner blir dannet ved behandling av sykelige celler eller vev, f.eks. tumorceller eller kunstige kreftceller, og utskilling av de ønskede produkter. Ved uttrykket "recognin" menes, når det anvendes her og gjennom hele beskrivelsen, en forbindelse som er forbundet med sykelige, celler eller vev,, hvilken erkarakterisert ved:
(a) å være i stand til å danne en enkellinje-utfelling
med dens spesifikke antistoff ved kvantitative utfelningstester og Ouchterlony gel-diffusjonstest;
(b) å være løselig i vann og vandige løsninger ved sur
eller nøytral pH; (c) å være uløselig i vandige løsninger ved alkalisk pH; (d) å ha en spektrofotometrisk absorpsjons-spiss-bølgelengde•på 280 my;
(e) å ha en molekylvekt på fra 3000 til 25.000; og
(f) å ha en aminosyrerest-sammensetning hvori det er en stor andel med glutaminsyre og asparaginsyre i forhold til den totale aminosyrerest-sammensetning og et høyt forhold mellom disse syrer og histidin.
Recogninene kan. anvendes til å fremstille deres kjemoresiprokaler, dvs. ved å kontakte recogninene eller recogninene
. på en bærer, med legemsvæsker. Kjemoresiprokalene er nyttige for diagnostiske og terapeutiske formål, dvs. for diagnostisering og behandling av kreft. Kjemoresiprokalene er substanser som
reagerer med immunokjemisk-lignende spesifikitet med et recognin in vivo in vitro, dvs. ved kvantitativ utfellings-test, ved Ouchterlony dobbeltdiffusjon eller ved immunofluorescens.
Et recognin er astrocytin. Astrocytin blir dannet fra hjernetumorvev, fortrinnsvis hjernegliomatumorvev. Protein-fraksjoner inneholdende astrocytin-forløperen blir først ekstra-hert fra vevet. En foretrukket fremgangsmåte for utføring av ekstraheringen er å behandle vevet med en nøytral buffer under homog.eniseringsforhold eller ved andre teknikker, for å sønderdele cellene og vevet for å solubilisere protein-fraks joner som inneholder astrocytin-forløperen.
Ved dette punkt er astrocytin-forløperen fremdeles bundet til mange substanser med høy molekylvekt, innbefattet protein, lycoproteiner, lipoproteiner, nukleinsyrer og nukleoproteiner.
De solubiliserte proteiner blir så separert fra det resulterende vev-ekstrakt. Ekstrakt-løsningen fra vevet blir så gjort klar for å fjerne uløselige partikler. De lavmolekylære forurensninger blir så fjernet fra den resulterende løsning, ved en pre-inndampnings-konsentrerings-teknikk. Den løsning som oppnås, behandles så for å spalte astrocytin-forløperen fra andre forurensninger for å oppnå den protein-fraksjon har et et pK-område mellom 1 og 4. Således blir f.eks. løsningen anbragt på en kromatograferings-kolonne og eluert med løsningsmidler med økende surhetsgrad. Alle de fraksjoner som blir eluert i det nøytrale eller sure område ned til pK 4, blir kastet, og de
fraksjoner med pK-område på fra 1 til 4 blir oppsamlet. Eluatet blir så behandlet for å oppnå et produkt med en molekylvekt på
ca. 8000.. Dette blir f.eks. utført ved først å filtrere materialet for å fjerne lavmolekylære substanser, dvs. slike som har molekylvekt under 1000, og så filtrering igjen for å fjerne slike med molekylvekt over 25.000. Den fraksjon som har en molekylvekt mellom 1000 og 25.000 blir så behandlet videre, dvs. ved tynnskikt^-gel (TLG) kromatografi, for å oppnå astrocytin.
Astrocytin kan således fremstilles ved å ekstrahere hjernegliomatumorvev med en nøytral buffer, ved gjentatt homogenisering og sentrifugering med stor hastighet, fraskilling, fra det resulterende ekstrakt, av den fraksjon som har et pK-område fra 1 til 4, fraskilling, fira nevnte fraksjon, av de substanser som har høy molekylvekt, dvs. opptil ca. 230.000,bg derfra isolering av produktet astrocytin som har en molekylvekt på ca. 8000.
Produktet astrocytin fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå danne en enkelt-linje-utfelling med dets spesifikke antistoff ved kvantitative utfelningstester og Ouchterlony gel-diffusjonstester, ved å være løselig i vann og vandige løsninger med sur eller nøytral pH, og ved å være uløselig ved alkalisk pH, ved å ha en spektrofotometrisk absorpsjons-spiss-bølgelengde på 280 my og ved å ha en molekylvekt på ca. 8000.
Astrocytin er ogsåkarakterisert vedå ha et svært stort prosentinnhold av rester av glutaminsyre og asparginsyre og et svært høyt forhold mellom disse syrer og histidin. En ytterligere analyse av astrocytin er angitt nedenfor.
På en lignende måte som den beskrevet ovenfor, ble et annet recognin, kalt malignin, fremstilt fra kunstige kreftceller, dvs. kreftceller dyrket in vitro. Malignin har en molekylvekt på ca. 10.000 og en lignende, men forskjellig aminosyrerest-sammensetning som astrocytin, dvs. store mengdeforhold for glutaminsyre og asparginsyre, og høyt forhold mellom disse syrer og histidin. En ytterligere analyse av malignin er angitt nedenfor.
Malignin kan således fremstilles ved å ekstrahere
kunstige kreftceller dyrket i kultur med en nøytral buffer ved gjentatt homogenisering og sentrifugering med høy hastighet, separere fra det resulterende ekstrakt den fraksjon som har et. pK-område på ca. 1 til 4, separere fra nevnte fraksjon de substanser som har en høy molekylvekt, dvs. opptil ca. 230.000,
og derfra isolere produktet som har en molekylvekt på ca. 10.000.
Den mengde malignin som dannes ved kustig cellegjæring
og den prosent av total proteinmengde dannet ved kunstig cellegjæring som er malignin, kanøkes ved dyrkning av kunstig kreftcelle-kultur i store vekst-beholdere.
Malignin fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå danne en enkelt-linje-utfelling med dets spesifikke antistoff ved kvantitative utfellingstéster og Ouchterlony gel-diffusjoris-tester, ved å være løselig i vann og vandige løsninger med sur eller nøytral pl-l, og uløselig ved alkalisk pH,
ved å ha en spektrofotometrisk absorpsjons-spiss-bølgelengde på 280 my og ved å ha en molekylvekt på ca. 10.000.
Recogniner er dessutenkarakterisert vedå være i stand
til å danne komplekser med bromacetylcellulose for å danne brom-acetylcéllulose-recognin og danne de spesifikke antistoffer anti-recognin ved injeksjon i pattedyr, idet nevnte anti-recognin festes spesifikt til recognin-forløperen in situ og frembringer fluorescens på gliomaceller ved kobling med fluorescein, så som beskrevet mer detaljert nedenfor.
Et anti-recognin, anti-malignin, er toksisk for hjerne-tumorce.ller in vitro. Anti-recogniner er antistoffer for den gruppe av antigener som her kalles recogniner, og de danner en enkel-linje-utfelling med recogniner ved kvantitative utfellings-tester og Ouchterlony gel-diffusjons-test.
Recogniner, så som astrocytin, malignin og lignende substanser, er nyttige som produkter som kan innføres i et biologisk system for å redusere fremmed-reaksjoner, så som ved å belegge et materiale med et recognin. Et ytterligere eksempel kan være å innføre et recognin for å danne kjemoresiprokalene i det biologiske system. De kan også næringsmessig anvendes for å oppmuntre veksten av et spesielt biologisk system som de er en del av. En ytterligere anvendbarhet for recognin er ved fremstilling av Target-reagenser som omfatter kompleksene av recogninet med en bærer for å lette dets anvendbarhet i biologiske systemer. Komplekset befordrer således f.eks. de fysikalsk-kjemiske egenskaper til recognin selv. Bæreren bør velges fra slike som danner et kompleks med recogninet, og som er i alt vesentlig biologisk inert.
Enhver substans kjent i industrien som vil danne et stabiit kompleks med polypeptider eller proteiner, kan være nyttig, for kompleksdannelse med recogninet. Et eksempel er et cellulose-basert materiale, så som den forannevnte bromacetylcellulose.
I tillegg til å være inert i biologiske systemer, bør bæreren være slik at den ikke forandrer de spesifikke fysikalsk-kjemiske egenskaper til recogninet som er nyttige for formålene angitt her.
Kompleksene av recogninet og dets bærer er nyttige ved fremstilling, separering og identifisering av deres kjemoresiprokaler i ethvert biologisk system som de bringes i kontakt med. Recognin- . bærer-komplekset er også nyttig for å stimulere fremstillingen av dets kjemoresiprokal-forløper ved ethvert biologisk system som det innføres i.
Den gruppe av kjemoresiprokaler som kalles anti-recogniner, f.eks. anti-astrocytin og anti-malignin, kan dannes ved å injisere recogninet i et biologisk system. Således kan en immunologisk effektiv dose av recognin bringes i kontakt med . kroppsvev.eller -væsker på en måte som induserer en antistoff-respons, i samsvar med kjent teknikk i industrien, for fremstilling av antistoffer. Anti-recogninene kan anvendes for å overbringe materialer så som diagnostiske, nærende og terapeutiske midler til spesifikke celler eller steder i' et biologisk system, hvilket omfatter å innføre nevnte middel i kompleksdannet form; sammen med anti-recogninet i det biologiske system. Anti-recogninene er også nyttige for å diagnostisere nærværet av tumorceller i en histologisk del ved påføring av anti-recogninet konjugert med en merkesettende substans så som farvestoffer og radioaktive substanser, til nevnte del, hvorved flekksetting eller radioaktiv merkesetting bare foregår med tumorceller. Enda en annen anvendelse for anti-recogniner er for å øke utbyttet av andre nyttige kjemoresiprokale produkter (så som TAG, beskrevet nedenfor) fra et pattedyr, hvilken omfatter å injisere en immunologisk effekctiv dose med recognin i pattedyret, eller et annet biologisk system.
Før foreliggende oppfinnelse ble glykoprotein-komplekser fremstilt fra hjernevev, og det ble dannet antistoffer for dem. Separerte materialer kjent som 10B glykoproteiner fremstilt av Tay-Sachs' syk hjerne ble injisert i kaniner og det ble dannet antistoffer. Disse Tay-Sachs<1>antistoffer ble anvendt ved immunofluorescerings-studier av hjerneholdig tumor: bare reaktive normale ikke-tumor-glia, ikke tumor-glia, ble flekket med disse antistoffer.
Når derimot astrocytin ble fremstilt fra tumorvev, og antistoffer til astrocytin (anti-astrocytin) ble fremstilt og anvendt ved immunofluorescerings-studier av hjerne, ble bare tumor-glia, ikke normal (ikke-tumor) glia, flekket med anti-astrocytin. Således, ved opprinnelig vev og naturen av antistoffet, og også ved den spesifikke type av flekkede celler, var Tay-Sachs' antistoffer og anti-astrocytin klart forskjellige produkter.
En annen gruppe kjemoresiprokaler er Target-reagenser kompleksdannet med deres kjemoresiprokaler. F.eks. blir Target-produktet av astrocytin kompleksdannet med en bærer så som bromacetylcellulose, bragt i kontakt med anti-astrocytin. Denne forbindelsetype kan kompleksdannes og anvendes for overbringelse
av diagnostiske, nærende og terapeutiske midler til spesifikke
celler eller steder i et biologisk system. Disse forbindelser kan også anvendes ved renseprosesser. F.eks. kan anti-astrocytin dannes ved dekompleksering av bromacetylcellulose-astrocytin-anti-astrocytin ved hydrolytisk behandling med en syre eller et proteinase-enzym. Target-reagenser er også nyttige for å øke mengden av TAG-produkter (beskrevet nedenfor) i et biologisk system, så som ved å bringe en immunologisk effektiv dose med Target i kontakt med legems-vev. eller -væsker.
Ytterligere kjemoresiprokaler er TAG-reagenser (dvs.
Target-festende globuliner). TAG-produktene blir fremstilt ved
å bringe Target-reagensene i kontakt med legemsvæsker i varierende tidsperioder for å danne et kompleks og avspalte TAG derfra. To nyttige utgaver er S-TAG og F-TAG.
En fremgangsmåte for fremstilling av S-TAG (sakte-Target-festende globulin) omfatter å omsette blodserum eller annen legemsvæske med Target (f.eks. bromacetylcellulose-malignin) i tilnærmet to timer eller mer ved en lav temperatur, f.eks. ca.
4°C, og avspalte S-TAG fra det resulterende materiale, f.eks. med fortynnet syre i tilnærmet to timer ved en temperatur på ca. 37°C. Produktet S-TAG fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå være løselig i vandige bufrede løsninger, danne en enkel-linje-utfelling med dets korresponderende recognin ved Ouchterlony gel-diffusjonstest, være ikke-dialyserbar i cellofan-membråner, holdes tilbake med millipor-filtere som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over 25.000, ha molekyIvekter i forskjellige aggregat-tilstander, så som bestemt ved tynnskikt-gel-kromatografi, på tilnærmet 50.000, og multipla derav i makroglobulin-området,
og ha en spektrofotometer-absorpsjons-spiss-bølgelengde på .280 mu.
En fremgangsmåte for fremstilling av F-TAG (hurtig-Target-festende globulin) omfatter å omsette blodserum eller annen legemsvæske med Target (f.eks. bromacetylcellulose-malignin) i tilnærmet 10 minutter ved en lav temperatur, f.eks. ca. 4°C, og avspalte F-TAG fra det resulterende materiale, f.eks. med for-
tynnet syre i tilnærmet to timer ved en temperatur på ca. 37°C.
Produktet F-TAG fremstilt i samsvar med denne fremgangsmåte erkarakterisert vedå være løselig i vandige bufrede løsninger, danne en enkel-linje-utfelling med dets korresponderende recognin ved Oucherlony gel-diffusjons-tester, være ikke-dialyserbar i cellofan-membraner, holdes tilbake av millipor-filtere som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over 2 5.000, ha molekyl-vekter i forskjellige aggregasjons-tilstander, så som bestemt ved tynnskikt-gel-kromatografi, på tilnærmet 50.000, og multipla derav i makroglobulin-området, og ha en spektrofotometer-abosrpsjons-spiss-bølgelengde på 280 my.
TAG-produkter er nyttige for påvisning av kreft-tumorer i levende pattedyr, ved å bestemme konsentrasjonen av S-TAG og F-TAG produsert av et kjent volum av pattedyrets blodserum eller annen legemsvæske, og sammenholde denne konsentrasjon med mengder bestemt for å være indikative for kreft. TAG-produkter er også nyttige for å gi diagnose for nærvær av tumorceller i en histologisk del eller annen celle-samling, og dette omfatter å påføre TAG konjugert med en merkesettende substans, så som farvestoff eller radioaktiv substans, på nevnte del, hvorved flekking eller radioaktiv merking bare foregår med tumorceller. TAG-produkter er dessuten funnet å være cytotoksiske for tumorceller. TAG-produkter er også nyttige for å føre avleveringen av diagnostiske, nærende og terapeutiske midler til spesifikke celler eller steder ved å innføre nevnte midler i kompleksdannet form med TAG-produktet.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte til påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en celle-samling, hvilken omfatter å påføre et' anti-malignin TAG produkt festet til visible eller signal-emitterehde midler på nevnte celle-samling, hvorved nevnte anti-malignin TAG produkt preferensielt festes til kreftaktige eller ondartede celler, og påvise nevnte kreftaktige eller ondartede tumorceller ved hjelp av nevnte visible eller signal-emitterende midler.
Ved en foretrukket utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en celle-samling, hvilken omfatter å påføre på nevnte cellesamling et anti-malignin TAG-produkt, og derefter påføre f luoresceLnkon jugert anti-TAG derpå, hvorved det foregår fluorescens bare i de kreftaktige eller ondartede tumor-celler ved illuminasjon.
Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse
er anvendbar på både celie-samlinger in vivo og in vitro, og også for påvisning av både gliale og ikke-gliale tumorceller. Det er fordelaktig at TAG-produktet anvendt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, blir dannet ved omsetning av anti-malignin-serum med et malignin-basert reagens, fortrinnsvis bromacetylcellulose-malignin.
Det er foretrukket at TAG-produktet anvendt ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse i det minste partielt er fri for substanser som er lite eller ikke reaktive ved fluorescerende påvisning, ved anvendelse på kjente kreftaktige celler, og at dersom et signal-emitterende middel anvendes, så er dette en radioisotop.
Normal celledeling i planter eller dyr blir begrenset eller inhibert når cellene kommer til å oppta et spesielt rom fullstendig. Mekanismene (a) hvorved normale celler "rekognoserer" at de har fyllt det rom som er tilgjengelig for dem, og. (b) hvorved, operasjonen av denne rekognoseringsmekanisme på sin side inhiberer celledeling, har begge vært ukjente. Oppfinneren har dannet en gruppe forbindelser kalt recogniner hvis forløpere får øket konsentrasjon når det foregår normal rekognosering og læring, og som har forbindelse med rekognosering og læring av partikler og celler, og med tilknytningen av celler til hverandre. Ved forsøk på å produsere disse forbindelser fra normale kreft-celler, har det blitt oppdaget at de er fraværende som sådanne, og at forandringer i deres molekylstruktur har foregått samtidig med at kreftcellene har mistet sin evne (a) til å rekognosere at de har fyllt sitt normale volum, og/eller (b) til å stoppe deling når de har fyllt sitt normale volum.
Recogniner er forbindelser som har fysiokjemiske egenskaper som efterligner slike konfigurasjonsegenskaper til kreftceller uttrykt ved deres mangel på evne til å rekognosere og stoppe celledeling. Recogniner er nyttige for å tilveiebringe umiddelbare produkter og fremgangsmåter som selv er nyttige ved diagnostisering og behandling av kreft, og for å hindre kreft.
Det har også blitt oppdaget fremgangsmåter hvorved kunstig dyrkede celler kan anvendes til å produsere malignin for første gang. En fordel ved fremgangsmåtene oppdaget her er at maligniner og nye produkter fra dem nå kan fremstilles effektivt i
. virkelig ubegrensede mengder.
Foreliggende oppfinnelse er anvendbar for ethvert og alle biologiske systemer hvorved det er ønsket å influere på all vekst og metabolisme. Ved fremstilling av den spesielle forbindelse eller forbindelser av passende celletype i kunstig kultur, og den videre fremstilling av produkter fra disse substanser,
kan således for første gang spesifikk influering oppnås;,
på alle typer vev, celler, celle-organeller, sub-organelle-molekyler eller molekyl-aggregater i hvilket som helst levende system. Således kan spesifikk nærings-influering ved kritiske tider i utviklingen, spesifikke diagnostiske metoder, preventive og. behandlings-metoder, og konstruksjonen av kunstige bioelektriske systemer (som ved vev- og organtransplantasjoner) alle påvirkes. Disse kunstige bioelektriske systemer kan nå dannes slik at de bærer egenskapene til det spesifikke recognin, alignin eller deres kjemoresiprokaler i det normale vev eller en komponent som de vil nærme seg og således unngå å bli "rekognosert" som "fremmed",
og således unngå reaksjonene til fremmed-substanser, innbefattet utstøtelse.
Et aspekt ved denne oppfinnelse er fremstillingen fra biologiske væsker av to nye produkter, Target-festende globuliner (TAG) som kalles dette fordi de blir dannet ved to reaksjoner,, hvor det, ved den første, omsettes biologiske væsker med et syntetisk kompleks inneholdende fysiokjemiske konfigurasjoner som etterligner dem til maligninene og som kalles' Target, og hvor det,
ved den andre, fraspaltes det spesifikke TAG fra komplekset, og ved måling av det således dannede TAG oppnås en kvantitativ indikasjon fra de biologiske væsker i levende organismer på om det er til stede en tumor i den organismen, og dette er følgelig en diagnostisk test på tumor. På grunn av at TAG-produkter og anti-malignin er fysiokjemisk komplementære til maligniner, blir de kalt kjemoresiprokaler.
Det har videre blitt oppdaget at to kvantitativt og kvalitativt forskjellige TAG-produkter kan fremstilles, avhengig av den-tillatte tid for omsetning av serum med det spesifikke Target-reagens som anvendes,, og avhengig av den tillatte tid for av-spaltning av produktet som blir gjort komplekst.
Ef ter undersøkelse av mengdene av disse produkter som kunne dannes fra en rekke forskjellige individer med hjernetumor og forskjellige andre medisinske forstyrrelser, og også fra slike med ingen tilsynelatende sykdom, ble det klart at mengdene av disse to nye produkter som kunne dannes i et bestemt.individ, var en indikasjon på om dette individ hadde en hjernetumor, og dette er følgelig en serum-diagnostisk test på hjernetumor.
Anvendbarheten av disse nye produkter, i tillegg til deres anvendelse til å diagnostisere, fra serum og andre biologiske væsker, nærvær av hjernetumor og andre tumorer, blir illustrert ved demonstreringen av at TAG og anti-recognin-forbindelser festes preferensielt til gliale og ikke^gliale tumorceller i celle-samlinger, f.eks. histologiske deler av f.eks. hjernetumor og omgivende vev fjernet ved operasjon av hjernetumor. Denne preferensielle merking ved TAG og anti-recogniner av tumorceller blir f.eks. 'demonstrert ved standard immunofluorescerings-teknikker selv om signal-emitterende midler også kan anvendes. Det er således også tilgjengelig en ny metode for ved undersøkelse av celle-samlinger å bestemme med en ny grad av sikkerhet om tumorceller er til stede i det fjernede vev, og om disse tumor-celler har trengt igjennom helt til kantene av det fjernede vev, hvilket indikerer sannsynlighet for at det fremdeles er tilbake tumor i hjernen eller andre organer, eller at tumorceller er fraværende fra periferien av det fjernede vev, hvilket indikerer den mulighet at all tumor er fjernet fra hjernen eller annet organ. Dessuten er TAG og anti-maligniner fremstilt som beskrevet . funnet å være cytotoksiske for lioma-hjernetumorceller dyrket i vev-kultur in vitro. Denne høye affinitet for tumorceller i et annet medium, her dyrket i vev-kultur, er ytterligere bevis.på det spesifikke koblings-potensial til det nye produkt TAG. Videre tilveiebringer cytotoksisiteten til TAG og anti-recogniner for.tumorceller en ytterligere ny diagnostisk test for serum til pasienter som mistenkes for å lide av en tumor. Således blir f.eks. serumet eller annen legemsvæske fra disse pasienter omsatt med Target for å danne TAG og produktet TAG blir testet i vev-kultur-vekst av tumorceller for cytotoksisitet. Både den konsentrasjon av TAG og.den grad av cytotoksisitet som manifesteres av det TAG
<:>som kan dannes fra et gitt individs serum, kan være ikke bare diagnostisk, men kan også være av verdi ved ettersporing av for-løpet av sykdommen før og efter operasjon av en gitt pasient. Kobling av radioaktivitet- og farvestoff-spor til TAG tilveiebringer et nytt TAG produkt som f.eks. er nyttig in vivo ved diagnose av tumorer og deres nøyaktige beliggenhet. Således vil
f.eks. injeksjon av et passende merket TAG enten intraarterielt eller intravenøst, i den cerebrospinale væske, eller direkte i hjernevevet eller dets hulrom, gi anledning til å vise ved hjelp av slike radioaktive midler, eller ved visualisering av det koblede farvestoff, nærværet av en hjernetumor, for det er bare til tumorceller at TAG spesielt festes. Videre tillater denne metode nøyaktig visualisering av stedet, for h jernetumoren. Lignende metoder kan anvendes for andre typer av tumor. Dette kan sees å være en forbedring av den in vivo diagnostiske metode ved anvendelse av anti-astrocytin dannet i kaninblod for å merke hjernetumoren, på grunn av at ved anvendelsen av TAG dannet fra menneske-serum unngås muligheten for fremmede protein-reaksjoner. Siden TAG og anti-recogniner har den kjemiske spesifikitet som tillater preferensiell festing til astrocytin-forløper inneholdende tumorceller både in vitro og in vivo, kan disse produkter også anvendes terapeutisk, så vel som diagnostisk, når de er koblet, f.eks. med radioaktive, protori-inntagende midler, eller andre toksiske fysikalske eller kjemiske midler, slik at disse toksiske substanser kan lokaliseres preferensielt ved disse forbindelsers, spesifikitet for festing i tumorceller sammenlignet med deres normale nabo-celler. Denne selektivitet er universelt anerkjent som den avgjørende, eller i det minste en avgjørende faktor,
for oppnåelse av effektiv kjemisk eller fysikalsk terapi på tumorer. TAG har således vist at det er effektivt ved preferensiell festing til tumorcellene, og bør være lovende som nytt terapeutisk produkt av disse årsaker.
I serumet fra pasienter med ondartet tumor, kan, som det vil fremgå av eksemplene nedenfor, én type av TAG, sakte-TAG (S-TAG), til forskjell fra hurtig-TAG (F-TAG), fremstilles i relativt større mengder fra et gitt volum med serum enn i pasienter uten slik tumor. Dette tyder på at .en av TAG' s naturlig forekommende forløpere (P-TAG) har øket konsentrasjon eller at det foreligger andre faktorer som favoriserer den relative dannelse in vitro av S-TAG overfor F-TAG.
Det mulige slektskap mellom funksjonen av de aktuelle syntetiske produkter Target og TAG og deres forløpere, og videre mellom funksjoner av postulerte, men ikke demonstrerte celle-"Antigener" og sirkulerende "antistoffer" til dem som kan foreligge in vivo, har ennu ikke blitt klartlagt. Således danner f.eks.,
på antistoff-lignende måte, F-TAG og S-TAG enkle adskilte reaksjons-
linjer med astrocytin ved Ouchterlony gel-diffusjon, og injeksjon av Target i kaniner induserer enøkning i utbyttet av TAG-produkter fra kaninserum efter omsetning med Target. Den oppdagelse at det kan være en normal mengde med forløper-lignende sirkulerende anstistoffer til et celle-antigen som er skjult i den ikke-delende celle, reiser et spørsmål med hensyn til den mulige funksjon av paret. Det er her foreslått at TAG forløper (P-TAG) og Target-lignende substanser foreligger in vivo som funksjonerende ved regulering av celle-utbredelse og celle-død. Således kan f.eks. ' eksponering av en celle-bestanddel som normalt ikke er direkte eksponert for serum-proteiner forekomme under celledeling. Eksponeringen av denne celle-bestanddel kunne resultere i at bestanddelen ble omdannet til en Target-lignende substans hvortil festing av et P-TAG-lignende molkyl fra serum så kan forekomme, hvilket ville stimulere celle-deling eller inhibere den. Alternativt kan en ikke-delende celle som er skadet eller funksjonerer galt, blottlegge en Target-lignende substans hvortil festingen av P-TAG-lignende molekyler kan være reparerende. Imidlertid kan under visse celle-forhold festingen av P-TAG-lignende molekyler indusere ødeleggelse av cellen (f.eks. anti-glioma-TAG syntetisk dannet som her beskrevet, er klart cytotoksisk for glioma-tumorceller som dyrkes i vev-kultur). Dette kunne således representere et speil på en normal mekanisme for regulering av celledeling, og for enten reparering eller fjerning av.enkelte celler i legemet gjennom hele organismens liv. Dersom blottlegging av cellebestanddeler øker unormalt slik at det dannes unormalt store mengder av celle Target-lignende substanser, så som kan forekomme ved rask deling av kreftceller så som i hjerne-gliomaer, kan det induseres en økning av konsentrasjonen av en type av serum P-TAG i forhold til en annen.
Hva enn den virkelige funksjon av forløperne er, så er økningen av den relative mengde av overveiende en type av TAG, sakte-TAG (S-TAG), som kan dannes in vitro ved de fremgangsmåter som her er beskrevet fra serumet til pasienter med ondartet tumor, basis for den serum-diagnostiske test som beskrives i de eksempler som følger.
De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
Eksempel 1
Fremstilling av urenset astrocytin-forløper-holdig fraksjon.
Menneskelig hjerneglioma-tumorvev, fjernet ved operasjon, blir oppskåret så fritt som mulig for overflateblodkar og normalt hjernevev. For en typisk mengde oppskåret tumorvev på 11 g, blir vevet veidd i 6 aliquoter på 1,5 g og 2 på 1,0 g.. Hver aliquot blir så behandlet på den følgende måte.
Hver aliquot blir homogenisert i nøytral bufferløsning ved sonifisering eller annen mekanisk innretning. Hver aliquot blir f.eks. homogenisert i 100 cm 3 pr. g vev av 0,005M fosfat-bufferløsning, pH 7, i en Waring-blander. Homogeniseringen bør utføres kaldt for å hindre.denaturering av proteiner. Blanderen bør f .eks. kjøles på forhånd i et avkjølt rom ved 0-5°C, og den bør være i drift bare i ca. 3 minutter.
Homogenisatet blir så sentrifugert for å gjøre det klart, f.eks. ved 80.000 gangers gravitasjon i 30 minutter i en avkjølt ultrasentrifuge. Den løselige overflytende væske dekanteres og oppbevares kaldt. Den uløselige rest rehomogeniseres med
3 ytterligere 100 cm nøytral buffer og sentrifugeres som før, og det annet løselige ekstrakt kombineres med det første. De- beste utbytter oppnås når denne prosess med homogenisering og sentrifugering gjentas inntil mindre enn 50 mikrogram med protein.pr. ml løsning oppnås i den overflytende væske. For de fleste vev blir dette oppnådd ved den femte ekstraksjon.
De således oppnådde løsninger kombineres og konsentreres ved inndampning og efterfølgende dialyse, så som ved dialyse mot 0,005M fosfat-buffer i kalde omgivelser for å danne et volum på 15 ml. Volumet av denne løsning blir notert, en aliquot tas for total protein-analyse, og resten blir fraksjonert for å oppnå den protein-fraksjon som har et pK-område mellom 1 og 4. Den foretrukne fraksjonerings-fremgangsmåte er kromatografisk, som angitt i det følgende.
Løsningen blir fraksjonert i det kalde rom (4°C) på en DEAE cellulose (Cellex-D) kolonne, 2,5 x 11,0 cm, som er likevekts-behandlet med 0,005M natriumfosfat-buffer. Trinnvis eluerings-løsningsmiddel-forandringer foretas med følgende løsningsmidler (løsninger): løsning (1) 4,04 g NaH2P04og 6,50 g Na2HP04oppløses i 15 liter destillert H20 (0,005 molar, pH .7) ;
løsning (2) 8,57 g NaH2P04oppløses i 2480 ml destillert H20;
løsning (3) 17,1 g NaH2P04 oppløses i 2480 ml destillert H20
(0,05 molar, pH 4,7);
løsning (4) 59,65 g NaH2P04 oppløses i 2470 ml destillert H20 (0,175 molar);
løsning (5) 101,6 g NaH2P04oppløses i 2455 ml destillert H20
(0,3 molar, pH 4,3);
løsning (6) 340,2 g NaH2P04oppløses i 2465 ml destillert H20
(1,0 molar, pH 4,1);
løsning (7) 283,64 g 80%ig fosforsyre (H3P04) opptas i 2460 ml destillert H20 (1,0 molar, pH 1,0).
Tilsett ekstrakt av nervevev, 6 til 10 ml i volum. La det føres inn i kolonnen. Det overtrekkes så med løsning (1) og en beholder med 300 ml av løsning (1) festes slik at den drypper ned på kolonnen ved hjelp av tyngdekraften. Aliquoter på 3 ml
av effluent oppsamles ved hjelp av en automatisk fraksjons-samler. De efterfølgende elueringsløsninger skiftes trinnvis ved de følgende elueringsrørnummer. Løsning (2) ved rør 88, idet løsningen tilføres på kolonnen på harpiks toppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 50 ml av løsning (2). Løsning (2) ved rør 98, idet løsningen tilføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 75 ml av løsning (3). Løsning (4) ved rør 114, idet løsning tilføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 150 ml av løsning (4). Løsning (5) ved rør 155, idet løsning tilføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 125 ml av løsning (5). Løsning (6) ved rør 187, idet løsning innføres på kolonnen på harpikstoppen, og så overtrekkes med og festes en beholder med 175 ml av løsning (7). Det fortsettes med eluering inntil elueringen er fullført ved
rør 260- Det skal anvendes nyfremstilt harpiks for hvert nytt volum med vev-ekstrakt. Hvert efflueringsrør blir kvantitativt analysert på protein. Eluatene i rørene nummer 212 til 230 kombineres, og.de inneholder de. urensede produkter hvorfra astrocytin vil bli fremstilt.
Det har blitt publisert data om dette urensede materiale, kalt fraksjon 10B, i den senere tid, [Protein Metabolism of the Nervous System, s. 555-69 (Pleum Press, 1970), Journal of Neurosurgery, vol. 33, s. 281-286 (september 1970)], men nå har fraspaltningen fra fraksjon 10B av det spesifikke produkt som her kalles astrocytin blitt utført. Urenset fraksjon 10B kan fremstilles som et produkt i mengder mellom 0,1 og 10 mg pr. g av opprinnelig friskt nervesystemvev hvorfra det oppnås. I tillegg til en astrocytin-forløper inneholder det varierende mengder av kovalent
bundne karbohydratrester innbefattet en rekke heksoser, nemlig glukose, galaktose, mannose; heksosaminer, innbefattet glukosamin, galaktosamin og mannosamin; og av og,til andre. sukkere, så som fukose, ribose og kanskje rhamnose. Det inneholder også protein-produkter med høy molekylvekt, flere lipier og nukleinsyrer.
Eksempel 2
Fremstilling av renset astrocytin fra urenset astrocytin-forløper-holdig fraksjon.
Den astrocytin-forløper-holdige fraksjon blir videre isolert fra forurensninger. Ved de foretrukne utførelser blir materialet fra eksempel 1 kromatografert på Sephadex G^50 harpiks med en typisk kolonne som er 40 cm lang, 2,5 cm i diameter og har et volum på 196 ml. Det anvendte trykk er 40 mm Hg, strømnings-hastigheten er 35 ml pr. time og bufferen er 0,05 molar fosfat-buffer-løsning, pH 7,2. Den første (gjennomstrømning) spiss inneholder astrocytin-forløper sammen med forurensninger, mens etterfølgende spisser inneholder bare forurensninger.
Ved den foretrukne utførelse blir produktene ved ovennevnte første gjennornstrømnings-spiss så konsentrert på Sephadex G-15, så ført inn på en kolonne med Cellex-D med de samme løsninger.,
(1) til (7) som i eksempel 1, og de samme elueringstrinn som ut-ført i eksempel 1. Produktet astrocytin er til stede som en skarp
spi-s i de samme rør (nummer .212-230) som før, og opprettholder således dets oppførsel ved Cellex-D kromatografi uten nærvær av
et stort antall forurensninger.
Lavmolekylære forurensninger kan så fjernes ved teknikker som er kjent i industrien, så som ved millipor-skive-filtrering.
Ved den foretrukne metode blir produktet astrocytin gjort fri for salt og andre lavmolekylære forurensninger ved filtrering gjennom millipore-Pellicon-skive nr. 1000, 13 mm, som holder tilbake substanser med høyere molekylvékter enn 1000 og tillater gjennom- . føring av slike med molekylvékter mindre enn 1000. Produktet astrocytin blir værende på Pellicon-skiven, og blir utvunnet derfra ved vasking med løsning (1) fra eksempel 1.
Astrocytin blir så erholdt ved isolering av den forbindelse som har en molekylvekt på ca. 8000 fra ovennevnte løsning. Ved en foretrukket.fremgangsmåte anvendes tynnskikt-gel (TLG). kromatografi på følgende måte: Den anvendte apparatur er en kommersielt tilgjengelig utgave konstruert av Boehringer Mannheim GmbH; Pharmacia Fine . Chemicals og CAMAG (Sveits). Harpiksen, 2,5 g av superfin Sephadex G-200, blir tilvirket i 85 ml 0,5M NaCl i 0,02M Na2HP04KH2P04fosfat-buffer, pH 6,8 (6,6-7,0). Den tillates å svelle i 2 eller 3 dager ved romtemperatur med svak blanding av og til (magnetiske og andre rørere bør ikke anvendes). Den svellede gel stabiliseres i 3 uker ved kjøle-temperatur. Imidlertid kan bakteriell og fungal vekst interferere med den svellede gel. Dersom gelen skal beholdes i lengre tidsperioder, bør det tilsettes en liten mengde med bakteriostatisk middel
(natriumazid 0,02%). Det blir anvendt 2,5 g tørr gel for å. danne to glassplater, 20 x 20 cm og 0,5 mm tykke. Platene gis enten anledning til å tørke ved romtemperatur i 10 minutter og overføres til et fuktig rom hvor de kan lagres i ca. 2 uker, eller de anvendes umiddelbart efter passende pre-utbalansering (vanligvis natten over og minimum 12 timer). Hovedvirkningen ved utbalanseringen er å normalisere forholdet mellom de stasjonære og mobile fase-volumer. Med de pre-utbalanserte plater i horisontal stilling, påføres substanser som skal undersøkes med mikropipetter som flekker eller som en strek ved startlinjen. 10 til 20 ml med 0,2-2% protein-løsning anbringes på kanten av et mikroskopisk dekk-objektglass (18 x 18 m) og holdes mot gel-oyerflaten. På noen få sekunder vil løsningen synke inn i gelen. Aller prøver blir først dannet på dekk-objectglasset og blir så raskt påført. Desom det ikke blir anvendt tilstrekkelig med materiale, er det vanskelig å lokalisere individuelle flekker efter separering. Dersom for meget materiale påføres foregår det ingen definert separering. Prøvene fortynnes med buffer for å lette behandlingen, og separeringen av prøvene utføres ved en nedstigende teknikk med platen holdt ved en veinkel på 22°. En strømningshastighet på ca. 1-2 cm/time er mest egnet. Markerings-substanser . (så som cytokrom C, hemoglobin, myoglobin eller bromfenol blåmerket albumin) påføres på forskjellige steder tvers over platen for å få en kontroll på mulig variasjon av strømning tvers over platen, og tjener også som referanse-protein for beregning av relativ avstand (mobilitet) av ukjente. Efter påføring av prøvene blir platene satt tilbake i apparaturen og papirveken skyves svakt
nedover for å sikre god kontakt med gelskiktet. Papirveken må ikke dryppe. Overskudd av fuktighet tørkes vekk. Det flytende løsningsmiddel i beholderen holdes konstant på 1 cm fra den øvre ende av karet. Forsøkene fullføres vanligvis på 4 til 7 timer avhengig av utviklingen av separeringen. Med farvede substanser følger separeringen direkte. De separerte flekker av protein gjøres lett synlige ved å overføre dem til et ark kopipapir av. TLG plate efter at den kromatografiske separering er fullført, og ved å flekke dem på forhåndsvaskede områder, metanol + 1^0 + eddiksyre - 90:5:5, i 48 timer. Papirarket er 3 mm filtrerpapir. Et papirark, 20 x 18 cm, anbringes over gelskiktet og presses (valses) akkurat tilstrekkelig til å sikre kontakt med gelen. Det påses at det ikke innføres luft under papiret (kopien) og
at ikke gelskiktet forstyrres. Den flytende fase oppsuges fra gelskiktet med papiret og fjernes efter ca. 1 minutt, tørkes umiddelbart i en ovn ved en temperatur på 60°C i 15 minutter og flekkes på normal måte ved hvilken som helst av de rutinemessige flekke-prosesser. Flekking blir utført ved å sprøyte kopi-papiret med 0,03% diazotert sulfanilsyre i 10% natriumkarbonat (PauleyVs reagens). Flekking kan også utføres med en mettet løsning av amido-svart i metanol-eddiksyre (90:10 volum/volum blir anvendt), og flekkingstiden er 5-10 minutter. For avflekking skylles med to volumer av 90:10 løsningen av metanol og eddiksyre blandet med ett volum f^O. Det er vanskelig .å oppnå lav bakgrunns-flekking uten svært utstrakt vasking. Selve platene kan også. tørkes ved ca. 60°C (i en ovn med luft-sirkulering), men bare dersom astrocytin skal flekkes. For isbleringsformål bør platen bare lufttørkes ved romtemperatur. Overoppvarmning kan føres til sprekkdannelse, men dette kan vanligvis unngås ved en temperatur på 50-60°C hvorved en Sephadex G-200 plate tørkes på 15-20 minutter. De tørre plater gis anledning til å svelle i 10 minutter i en blanding av metanol + U^ O + eddiksyre (75:20:5) og flekkes i mettet amido-svart i samme løsningsmiddelsystem i 5 timer og vaskes derefter ved bading i 2 timer i det samme løsningsmiddel før de tørkes. For molekylvekt-bestemme Iser måles avstanden fra. utgangslinjen til midten av hver sone med en nøyaktighet på 0,05 mm enten direkte på trykksaken (kopien) eller densitogrammet. Resultatet uttrykkes med R -verdien definert som forholdet mellom
m migreri.ngs-dis tansen for det testede protein (d^) og den for cytokrom C eller myoglobin (dm) som anvendes som referanse-protein:
Forholdet mellom migrerings-distanse for testet substans til
standard er formelen (~Rm= ^ En rett kalibreringslinje oppnås ved å plotte logaritmen av molekylvekten for den anvendte standard mot -R . Fra denne linje kan molekylvekten til det uk jente . protein oppnås. For å få mest mulig eksakte resultater sammenlignes 6 like deler med proteinprøveløsning med standarden, i dette til-fellet cytokrom C, før påføring på platen. Ved TLG-prosessen ovenfor blir produktet astrocytin observert som en adskilt flekk med en avstand på tilnærmet 0,83 t 0,02 referert til cytokrom C standarden, og dette gir en tilnærmet molekylvekt på 8000 for astrocytin. Flere adskilte produkter blir ved denne fremgangsmåte skilt fra astrocytin på basis av små differanser i kjemisk struktur og store differanser i molekylvekt. Således har 3. produkter medført som forurensninger inntil dette punkt, med molekylvékter på tilnærmet 64.000, 148.000 og 230.000,'og en til-feldig med molekylvekt på 32-000, blitt påvist og fjernet ved TLG-metodene beskrevet ovenfor. Produktet astrocytin blir aspirert med gelen som det inneholdes i, i tørr form, og oppløses i
løsning (1) og gjøres fri for harpiks ved sentrifugering eller
på annen passende måte.
Produktet astrocytin som er blitt fremstilt ved dette
trinn, er løselig i destillert vann, løselig ved nøytral og sur pH
og uløselig ved alkalisk pH og har en spektrofotometrisk absorpsjonsspiss-bølgelengde ved 280 my. Det er et polypeptid med molekylvekt, som angitt ovenfor, på tilnærmet 8000. Dets kovalent bundne aminosyrer er vist med hydrolyse med 6N HC1 og
så kvantitativ automatisk bestemmelse, å ha følgende midlere sammensetning av aminosyrer:
Cysteinsyre, hydroksyprolin, norleucin, ammoniakk, isodesmosin, desmosin, hydroksylysin, lysinonorleucin og gamma-aminosmørsyre er alle fraværende i påvisbare mengder, men spor av glukosmain kan være til stede.
Fra 11 g av utgangs-hjernetumorvevet i eksempel.1,
dannes det tilnærmet 3 mg renset astrocytin ved ovennevnte fremgangsmåter.
Eksempel 3
Fremstilling av "skjelve" recognin
Skjelve-sykdom er en genetisk forstyrrelse med hvilken dyre ikke er i stand til å oppnå stabil koordinert motorisk aktivitet, og det dannes en skjelve-tilstand, på grunn av mangel på migrering av visse nerve-celler til et spesielt sted i hjernen, cerebellum, ved en spesiell utviklingstid. Spesielt har det vist seg med glial-celler, ved elektron-mikroskopiske undersøkelser, at de tilveiebringer vertikale stang-lignende akser langsetter hvilke nervecellene migrerer til deres nye stillinger i den normale tilstand. Den manglende evne for nervecellene til å gå opp langs disse glial-fibrer, ved skjelve-sykdom, har man tenkt skyldes visse forstyrrelser i nervecellene eller i glia eller i begge deler.
Ved å følge fremgangsmåtene fra eksemplene 1 og 2,
ble det dannet recognin fra muse-skjelve-hjerne, og dette ble sammenlignet med recognin dannet fra normal musehjerne. Molekylvekten av recogninet dannet fra alle områder i normal musehjerne var 8000. Molekylvekten av "skjelve"-recognin var 3600 til 5000.YSkjelve"-redognin er sykelig, så som det fremgår av dets meget lavere molekylvekt. Videre er den mengde med recognin som kan dannes fra cerebellumet i skjelvemusehjerne meget redusert sammenlignet med et som er normalt. Dette er vist i tabell I.
Tabell I viser at mens det er en klar minsking i konsentrasjonen av recognin i cerebellumet til skjelve-mus, så er.det like store eller større mengder av recogniner i andre områder av hjernen. Recogninet kan ikke flyttes fra de andre områder av hjernen til cerebellumet, eller den svake økning i andre områder av skjelve-hjerne kan reflektere en viss kompensasjonsvirkning.
Dette patologiske recognin i skjelvehjerne settes i samsvar med den manglende evne for migrerende hjerneceller til å gjøre de kontakter som de må for å oppnå riktig plassering, og dette bekrefter rollen til recogniner ved rekognosering og læring i celler.
Ved analogi kan anti-recogninene til recognin dannes fra mus-skjelve-hjerne og anvendes i mus på en lignende måte som anvendelsene av anti-astrocytin og anti-malignin, som beskrevet her.
Eksempel 4
Dannelse' av malignin-forløper i kunstig kreftcelle-kultur.
Det blir.generelt opprettholdt en ytterst samvittighetsfull
steril teknikk....
Alle løsninger (f.eks. Hank<1>s balanserte salt.(BSS), F-10 næringsmedium, foster-kalveserum, trypsin-løsning) blir inkubert ved ca. 35°C i et vannbad i tilnærmet 20 minutter eller mer før anvendelse.
Celler blir fjernet fra tumor-vev og dyrket in vitro
for mange generasjoner ved anvendelse av et passende medium, så som beskrevet nedenfor. Forhånds-skyIling av begerglass som skal anvendes, blir foretatt med en steriliserende løsning, f.eks. 12-proponal pluss amfyl- eller kreolin-løsning.
Ved den foretrukne utførelse blir de kunstige kreftceller (dvs. celler dyrket in vitro for mange generasjoner) alle dyrket, i 250ml kolber. Det flytende medium hvori cellene dyrkes kasseres i de forhånds-skyllede begerglass. Cellene vaskes så forsiktig med 5-10 ml av Hanks BSS eller annen lignende løsning i ca.. 30 sekunder. Agitasjon unngås. Alle vegger og overflater vaskes. Løsningen klargjøres for celler ved sentrifugering i kalde omgivelser i 10 minutter ved 3000 omdr. pr. minutt. Mediet helles inn i et begerglass som ovenfor. Det tilsettes en liten mengde bufret proteinase-enzym-løsning og skylles raskt for å unngå
digerering av cellene. Ved dert foretrukne metode tilsettes 1-2 ml trypsin-løsning (EDTA) og det skylles i bare 10 sekunder. Trypsin-løsningen helles bort.
Det tilsettes et lignende volum frisk trypsin-løsning ■ og inkuberes inntil det sees at cellene separeres fra veggene i rommene, ved mikroskopisk iakttagelse. Til dette kreves vanligvis 5-10 minutter. Det tilsettes et passende vekstmedium, så som 50 ml av en løsning av 7-10%ig løsning av fosterkalveserum i
100 ml av F-10 næringsmedium.
25 ml av det friske medium med celler overføres til et nytt vekst-rom for forplantning, og de resterende 25 ml holdes i det første rom for forplantning. Begge rom anbringes i en inkubator ved 35°C i tilnærmet 7 dager. Ved dette punkt ved fremgangsmåten ifølge dette eksempel, deles en kunstig kreftcelle-kultur til to friske kulturer tilnærmet hver 7. dag..Hele denne, fremgangsmåte kan gjentas så ofte som ønskes, med tilnærmet
7-dagers intervaller, for hvert vekst-rom. Således kan antallet av celler som dyrkes in vitro dobles tilnræmet hver 7. dag.
Cellene kan ekstraheres for dannelse av malignin efter tilnærmet 7 dagers vekst. F.eks. kan celler som dyrkes i hvert 250 ml rom, som beskrevet ovenfor, utvinnes på følgende måte.
Mediet overføres til et sentrifugerør og sentrifugeres
med 3000 omdr. pr. minutt i kalde omgivelser i 10 minutter. Mediet kastes. Cellene som er tilbake i vekst-kammeret, skrapes
av fra rom-veggene og vaskes inn i sentrifugérørene med nøytral buffer-løsning. Cellene vaskes to ganger med nøytral buffer-løsning, sentrifugeres igjen med 3000 omdr. pr. minutt i kalde omgivelser, og mediet kastes. De vaskede celler suspenderes i 10 ml nøytral fos fat-buffer inntil de er klare for ekstrahering av urenset malignin-forløper-holdig fraksjon.
. Eksempel 5
Fremstilling av urenset malignin-foroøper-holdig fraksjon.
Vaskede celler suspendert i nøytral buffer fra eksempel 3 sønderdeles mekanisk under forhold som unngår denaturering av de fleste proteiner. Ved den foretrukne metode behandles de vaskede celler i kalde omgivelser med et sonisk apparat i 20 sekunder.
Efter behandlingen i det soniske apparat sentrifugeres celle-restene ved 30.000 omdr. pr. minutt i 30 minutter, og den overflytende væske dekanteres. Aliquoter på 10 ml med buffer-løsning anvendes for å vaske gjenværende celler fra rommet og disse settes til resten av celle-restene. Det foretas sonisk behandling og sentrifugering som ovenfor, og de overflytende væsker kombineres. Fremgangsmåten gjentas en gang til.
De kombinerte overflytende væsker forhåndsinndampes for å redusere volumet på tilnærmet 30 ml til ca. 6-7 ml. Det tas én aliquot for total protein-analyse og resten fraksjoneres,
i samsvar med metodene i eksempel 1 for astrocytin-forløper.
Eksempel 6
Fremstilling av renset malignin-produkt fra urenset malignin-holdig fraksjon.
Produktet malignin blir ytterligere isolert fra forurensninger ved fremgangsmåtene i eksempel 2 for astrocytin.
Ved TLG-trinnet ved den foretrukne utførelse, blir produktet malignin iakttatt som en adskilt flekk med en avstand på tilnærmet 0,91 ± 0,02 med referanse til standard cytobrom C,
og dette gir en tilnærmet molekylvekt på 10.000 for malignin.
Produktet malignin som er dannet ved.dette trinn, er løselig i destillert vann, løselig ved nøytral eller sur pH og uløselig ved alkalisk pH, og har. en spektrofotometrisk absorps jons-spiss ved 280 my. Det er et polypeptid med molekylvekt på tilnærmet 10.000.
Molekylvektene for malignin dannet i gjærkulturer stabilisert i suksessive generasjoner av kulturer, så som fastsatt ved tyhnskikt-gelkromatografi-bestemmelser, er angitt i tabell II. Reproduktiviteten av molekylvekt-bestemmelsene er bemerkelsesverdig med henblikk på de indre begrensninger ved TLG-kromatografi.
Malignins kovalent bundne aminosyrer har ved hydrolyse med 6N HC1 og så kvantitativ bestemmelse, vist seg å bestå av følgende gjennomsnittlige sammensetning av aminosyrer: Aminosyrene cysteinsyre, hydroksyprolin, norleucin, ammoniakk, isodesmosin, desmosin, hydroksylysin, lysino-norleucin og gamma-aminosmøresyre er fraværende i påvisbare mengder.
Et typisk utbytte av rent malignin fra 12 reaksjonsrom på 250 ml fra eksempel 4, er tilnærmet 1 ml malignin.
De enestående strukturer av malginin og astrocytin ble bekreftet ved utstrakte computer-undersøkeIser som sammenlignet deres sammensetning med i virkeligheten alle kjente protein-substanser.
Aminosyre-sammensetningen i malignin og astrocytin, deres innhold av absolutte og relative mengder av hver aminosyre-komponent uttrykt som det totale antall av aminosyre-rester pr. mol, og deres innhold av absolutte og relative mengder av hver aminosyre-komponent uttrykt som molekylvekten av molekylet, ble underkastet matrise-computor-analyse mot den største kjente litteratursamling i verden om protein-struktur, den til National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. Det. ble ikke funnet noen struktur-identitet eller endog noen svært nær den til astrocytin eller malignin ved matrise-analysen sammenlignet med flere hundre tusen proteiner og protein-fragmenter.
De eneste proteiner som på noen måte var strukturelt, beslektet, er vist i tabell III med deres individuelle amino-sammensetning og molekylvékter for sammensetningen. Computeren blir programmert for å identifisere, fra de flere hundre tusen muligheter, og vise grad av likhet i struktur. Således vil f.eks. proteiner med molekylvekt mye større eller mindre ikke passe,
og heller ikke slike med mindre enn 85 eller mer enn 95.rester, og heller-ikke slike med mindre enn 6 eller mer enn 11 asparagin-rester, og så videre for hver av de to involverte aminosyrer.
Dette "fingeravtrykk" har således så som 22 individuelle
variable som skal passe. Noen substanser vil passe for 1, for 4 eller for 5 variable, men ingen vil passe for alle 22. I virkeligheten passer ingen bedre enn for 14 variable, og dette gir forskjell for 8 variable.
Den nærmest passende er således cytokrom b^(menneske). Som vist i tabell III skiller rest-antallet for alanin, argin, asparagin, asparaginsyre, cystein, glutamin, histidin, metionin og tyrosin og tryptofan alle seg merkbart til klart fra astrocytin og fra malginin. På grunn av at cytokrom b,- inneholder 7 histidin-rester, mens astrocytin og malginin inneholder bare 2, er det ikke mulig at de. har samme kjemiske struktur;
Det mest uvanlige ved sammensetningen til astrocytin og malignin er den høye konsentrasjon av glutaminsyre. Man skulle vente å finne bare 5 eller 6 rester av 89.
Andre nest-nærmest passende er ferrodoxinene av henholdsvis leucaene glauca og av alfalfa, men disse skiller seg også klart i henholdsvis 4 og 6 aminosyrer, og merkbart i 2 andre, og ved å ha henholdsvis 96 og 97 rester. De nest-nærmest passende er acylbærer-proteinet åv E. coli 26, men dette skiller seg også klart i 11 aminosyrer fra malignin og astrocytin, og har bare
77 rester.
Noen andre hjerneproteiner (neurofysin, storfe og svin
og gonadotropin. frigjørende hormon) er oppført i tabell III for
å illustrere hvor meget dårligere tilpasningen er for de gjenværende flere hundre tusen proteinfragmenter i computer-huske-banken.
Respirasjons-proteiner kan inneholde metaller og/eller heme-komponenter i deres in situ tilstand, men det isolerte protein-fragment, f.eks. for apocytokrom b,-, inneholder ingen. Ytterligere mikroanalyse av astrocytin og malignin har vist at
de er fri for jern, svovel, fosfor og magnesium (alle mindre enn 0,01%), og spektral-egenskapene viser typisk absorpsjon ved 280 my. Efter rekombinasjon av heme med apoprotein, gjenopprettes de
typiske absorpsjons-spektra mellom 400 og 450 m.
På tross av den enestående struktur til astrocytin og malignin, til forskjell fra andre proteiner og protein-fragmenter, er det bemerkelsesverdig og kanskje av stor betydning at respirasjons-proteinene har de nærmest-liggende strukturer. Det
er velkjent i industrien at det kan trekkes mange viktige be-slektede forhold fra de strukturtyper som representeres, både fra et utviklingsgenetisk synspunkt og fra et funksjonelt synspunkt. Dersom astrocytin og malignin er nye protein-produkter hvis in
situ strukturelle ekvivalenter representerer respirasjons-funksjoner, og disse proteiner, som nå vist, er knyttet til ondartethet, da er det funnet en åpning til å løse et av de største problemer ved kreft, hvilket er hvorledes energien tilfredsstilles for disse
•grådige, raskt reproduserende ondartede celler.
Bortsett fra den teoretiske betydning av denne oppdagelse, så er det meningsfullt når dataene ovenfor for økningen av prosent-innholdet av malignin i mer ondartede celler, og dataene tilveie-bragt nedenfor som viser at anti-malignin ikke bare festes til malignin-lignende kjemiske grupper av kre ft-celler, men også er cytotoksisk for.cellene når de er slik festet, sammenholdes. Dersom malignin-lignende in situ forbindelser i kreftceller er respirasjons-proteiner, og siden anti-malignin-produktene i henhold til denne oppfinnelse festes preferensielt til disse in situ forbindelser, så er det, dersom funksjonelle respirasjons-grupper er involvert i denne festing, lett å forstå hvorledes disse resulterer i død for kreftcellene.
De terapeutiske muligheter for anti-maligninene, og andre lignende kjemoresiprokaler, er meget styrket ved denne strukturelle informasjon om malignin og astrocytin, og også ved det demonstrerte forhold mellom mengde av malignin og grad av'ondartethet.
Eksempel 7
Demonstrasjon av øket utbytte, grad av ondartethet og mengder av malignin ved tilveiebringelse av større volum og overflateareal under gjæring.
Eksemplene 3 til 5 ble gjentatt ved anvendelse av 1000 ml kolber istedenfor 250 ml kolber. Alle mengder av reagenser ble øket til det tredobbelte.
Utbyttet av produktet amlignin efter 7 dagers vekst av inokulat ble øket til nesten det dobbelte ved økning av det til-gjengelige rom for malignin-cellevekst fra. 250 til 1000 ml.
Tabell IV viser utbyttet av totalt protein i mg, og det dannede malignin som prosent av totalt protein for suksessive gjærings-kultur-generasjoner i hver kolbestørrelse. Ved anvendelse av kolber på 250 ml av gjennomsnittlig dannelsen av totalt protein 17,5 mg. Ved anvendelse av kolber på 1000 ml var den gjennomsnittlige dannelse av totalt protein 40,4 mg.
Det var overraskende at mengden av ondartet cellevekst (grad av ondartethet) ble øket pr. 7 dagers vekstperiode ved å tilveiebringe større rom og overflate for cellevekst, og mengden av dannet malignin, som prosent av det totale protein, øket betydelig. Den prosent av det totale protein som er malignin øket fra et gjennomsnitt på 10,7% ved anvendelse av kolber på 250 ml til et gjennomsnitt på 28,3% ved anvendelse av kolber på 1000 ml ved en konstant vekstperiode på 7 dager.
Forholdet mellom mengden av dannet malignin og graden .av ondartethet (dvs. som en funksjon av mengden av ondartet cellevekst in vitro på 7 dager, målt som totalt dannet protein) er vist i figur I..
Figur I viser at den økede kolbe-størrelse resulterer
i tilnærmet tredobbelte mengder av dannet malignin.
Figur I viser også et forhold mellom malignin og ondartethet. Den brutte linje representerer et ideelt lineært forhold. Dette viste forhold er klart ikke trivielt siden - mengden av nærværende malignin øker eftersom cellene blir mer uhemmet (patologisk) i sin vekst. Den normale in situ recognin-funksjon vedrører, som tidligere angitt, kontakt-inhibering av vekst av celler. Desto mer patologisk veksten av de ondartede celler er, desto mindre virker kontakt-inhibering, og desto mer blir malignin det overveiende protein..
Eksempel 5A viser at vekst av kunstig kreftcellekultur
i store vekstbeholdere uventet resulterer i øket mengde av dannet malignin, det vil si at en økning i den prosent av det totale protein som er malignin. Vekstbeholdere av stor størrelse betyr, ved anvendelse her, beholdere.hvor forholdet mellom beholder-volum og volum av totalt medium med celler benyttet i samsvar med fremgangsmåtene i eksempel 3, er større enn ca. 8:1, f.eks. 7:1 til 10:1. Eksempel 5A viser et forhold på ca. 8:1.
Eksempel 8
Fremstilling av Target-reagenser fra recogniner.
Astrocytin, fremstilt som i eksempel 2 ovenfor, eller malignin, fremstilt som i eksempel 5 ovenfor, blir kompleksert med en bærer for å danne Target-reagens.
Ved den foretrukne utførelse oppløses astrocytin eller malignin i 0,15M Nal^PO^-ci trat-buf f er, pH 4,0. En bromacetyl-harpiks, f.eks. bromacetylcellulose (BAC) med 1,0 til 1,5 milli-ekvivalenter Br pr. gram cellulose, lagret i kalde omgivelser, blir fremstilt i 0,15M NaF^PO^-buf f er, pH 7,2. Bufferen overføres til pH 4 ved å helle vekk pH 7,2 bufferløsningen og tilsette 0,15M Naf-^PO^-citratbuffer, pH 4,0. Astrocytin- eller malignin-løsningen og BAC-løsningen røres sammen (10:1 forhold mellom BAC og recognin) i 30 timer ved romtemperatur, og sentrifugeres så.
Det er foretrukket at alle steder på BAC som er tilgjengelig for å bindes til recognin, blir bundet. Dette kan utføres som følger. Den overflytende væske fra det umiddelbart fore-gående trinn lyofiliseres og proteininnholdet bestemmes for å vise mengden av astrocytin eller malignin som ennu ikke har dannet kompleks med BAC. Det dannede kompleks av BAC-astrocytin
(eller BAC-malignin) resuspenderes i 0,IM bikarbonat-buffer,
pH 8,9, røres i 24 timer ved 4° for å tillate dannelse av kjemiske bindinger mellom BAC og astrocytin eller malignin.
Efter 24 timer sentrifugeres, og deri overflytende væske analyseres på protein. Komplékset BAC-astrocytin eller BAC-malignin resuspenderes nå i 0,05M aminoetanol - 0,IM bikarbonatbuffer,
pH 8,9, for å blokkere alt uomsatt brom. Suspensjonen sentrifugeres og den overflytende væske beholdes, men analyseres ikke på grunn av nærværet av aminoetanol. Fjerning av alt ubundet astrocytin eller malignin blir så utført ved sentrifugering og resuspendering for tre vaskinger i 0,15M NaCl inntil det ikke måles noen absorbering på spektrometeret ved 266 my.. BAC-astrocytin- eller BAC-malignin-komplekset røres nå inn i
8M urinstoff i 2 timer ved 38°C, sentrifugeres og vaskes så
(tre ganger er vanligvis tilstrekkelig) med 8M urinstoff inntil
det ikke vises noen absorbering for vaskevæskene ved 266 my. Komplekset vaskes så med 0,15M NaCl to ganger for å bli kvitt urin-stoffet. Komplekset, røres så ved 37°C i 0,25M eddiksyre i 2 timer for å vise dets stabilitet. Sentrifugering og avlesning for det overflytende ved 266 my - ingen absorbering bør være tilstede. Dette kjemiske kompleks BAC-astrocytin eller BAC-malignin er derfor stabilt og kan nå anvendes som en reagens ved fremgangsmåtene beskrevet nedenfor. I denne stabile reagens-form er det referert til som Target (Topographic-Antigen-like-Reagent-Tamplate) på
grunn av at det er et syntetisk dannet kompleks hvis fysikalske og kjemiske egenskaper etterligner den stabile celle-bundne forløper til astrocytin eller malignin når den er i en potensielt reaktiv tilstand med serum-komponenter. For lagring blir Target-reagensen . sentrifugert og vasket inntil den er nøytralisert med 0,15M Nat^PO^-buffer, pH 7,2.
Target-reagensene kan fremstilles fra bromacetyl-liganderte bærere som er forskjellige fra cellulose, så som brom-acetylerte harpikser eller endog filterpapir.
Eksempel 9
Fremstilling av. antisera for astrocytin, malignin og Target
Antisera for astrocytin, malignin eller Target-reagenser kan dannes ved indusering av en antistoff-respons i et pattedyr for dem. Den følgende fremgangsmåte er funnet å være .tilfreds-, stillende. 1 mg recognin (astrocytin eller malignin). injiseres i tåputene på hvite hann-kaniner med standard Freud<1>s adjuvans,
og så gjøres den samme injeksjon intraperitonealt 1 uke senere, igjen intraperitonealt 10 dager, og, om nødvendig, 3 uker senere. Spesifikke antistoffer kan påvises i blodserumet til disse kaniner så tidlig som 1 uke til 10 dager efter den første injeksjon. Den samme fremgangsmåte følges for Target-antigen ved injisering av samme mengde Target, hvilket inneholder 1 mg astrocytin eller malignin, sa som bestemt ved Folin-Lowry bestemmeIse av protein.
Det spesifikke antistoff til astrocytin kalles anti-astrocytin. Det spesifikke antistoff til malignin kalles anti-malignin. På lignende måte kalles det spesifikke antilegemet
. til Target .for anti-Target.
Disse antistoffer viser klart ved Standard Ouchterlony gel-diffusjons-test antigen-antistoff reaksjoner med spesifikt enkle skarpe reaksjonslinjer dannet med deres spesifikke antigen. Nærværet av spesifikke antistoffer i serum kan også . testes med standard kvantitativ utfellings-test for antigen-antistof f-reaks joner . Gode kvantitative utfellingskurver oppnås og mikrogrammene av spesifikke antistoffer kan beregnes derfra.
Ytterligere bevis for nærværet av spesifikke antistoffer i serum kan oppnås ved absorpsjon av det spesifikke antistof-fet anti-astrocytin på bromacetylcellulose-astrocytin (BAC-astrocytin) fremstilt ovenfor. Antiserumet inneholdende spesifikt anti-astrocytin kan omsettes medBAC-astrocytin. Når serumet føres over BAC-astrocytin bindes bare de spesifikke antistoffer for astrocytin til deres spesifikke antigen astrocytin. Siden astrocytin er kovalent bundet til bromacetylcellulose er det spesifikke antistoffet, anti-astrocytin, nå bundet til BAC-astrocytin for å danne BAC-astrocytin-anti-astrocytin (BACA-antiastrocytin). Dette bevises ved å teste resten av-serumet som er vasket fritt for BAC-astrocytin. Ved standard Ouchterlony diffusjon er det ikke tilbake noen antistoffer i serumet som vil omsettes med astrocytin. Det konkluderes derfor med at alle spesifikke antistoffer (anti-astrocytin) som tidligere er vist å være nærværende i serumet, er blitt absorbert på BAC-astrocytin. Videre, når antiastrocytin blir frigjort fra dets binding til BAC-astrocytin, blir det dermed isolert fritt for alle forurensende antistoffer. Denne frigivelse av anti-astrocytin kan utføres ved å vaske BAC-anti-astrocytinet koblet med 0,25M eddiksyre (4°C, 2 timer), hvilket, som er vist ovenfor,
ikke bryter BAC-astrocytin-bindingen.
Enda ytterligere bevis på nærværet av spesifikke antistoffer i serum kan oppnås ved absorpsjon av det spesifikke antistoffet anti-malignin på bromacetylcellulose-malignin (BAC-malignin) fremstilt ovenfor. Antiserumet inneholdende spesifikt anti-malignin kan omsettes med BAC-malignin. Når serumet føres over BAC-malignin bindes bare de spesifikke antistoffer til malignin. til deres spesifikke antigen malignin. Siden malignin er kovalent bundet til bromacetylcellulose er det spesifikke antistoffet, anti-malignin, nå bundet tilBAC-malignin for å danne BAC-malignin-anti-malignin (BACM-anti-malignin). Dette bevises ved å teste resten av serumet som vaskes fritt for BAC-malignin. Ved standard Ouchterlony diffusjon er det nå ikke tilbake noen antistoffer i serumet som vil omsettes med malignin. Det konkluderes derfor med at alle spesifikke antistoffer (anti-malignin) som tidligere er vist nærværende i serumet, er blitt absorbert til BAC-malignin. Videre, når anti-malignin blir frigjort fra dets binding til BAC-malignin, blir det derfor isolert fritt for alle forurensende antistoffer. Denne frigjøring av anti-malignin kan utføres ved vasking av BACM-anti-malignin-komplekset med 0,25M eddiksyre (4°C, 2 timer) hvilket, som vist ovenfor, ikke bryterBAC^malignin-bindingen.
Antistoffene til Target viser klart ved standard Ouchterlony gel-diffusjons-test for antigen-antistoff-reaksjoner spesifikke enkle reaksjonslinjer dannet med Target, hvilket viser en identitets-linje med reaksjons-linjen til anti-astrocytin eller anti-malignin antisera (dvs. slike dannet for injeksjonen av astrocytin eller malignin selv). Visse kaniner, har det blitt notert, har nivåer av anti-Target i blodet før de blir.injisert med Target. Disse anti-Target substanser, når de spesielt omsettes med Target-reagens så som beskrevet i tester på menneske-sera, fører til dannelse av tilnærmet ekvivalente mengder av de to typer av TAG, S-TAG og F-TAG (se senere eksempler).
Eksempel 10
Påvisning av ondartede tumorer ved kvantitativ dannelse in vitro av Target-festende blobuliner (TAG) fra biologiske væsker.
Target-reagens fremstilt i samsvar med eksempel 6,
vaskes for å fjerne alt ubundet recognin som kan være tilstede på grunn av beskadigelse. Den følgende fremgangsmåte er tilfredsstillende. Target-reagens røres i 2 timer ved 37°C med eddiksyre, sentrifugeres, den overflytende væske dekanteres og den optiske densitet til den overflytende væske avleses ved 266 mp. Dersom det er noen som helst absorbering, blir denne vasking gjentatt inntil det ikke solubiliseres ytterligere materiale. Target resuspenderes så i fosfat-bufret saltløsning, pH 7,2. ' (Standard S-TAG og F-TAG renset fra tidligere reaksjoner av menneske-serum ved fremgangsmåten beskrevet nedenfor kan anvendes, om tilgjengelig, som referanse-standarder for å teste Target-reagensen, og dette kan også kanin-serum som det er bestemt inneholder S-TAG og F-TAG ved andre Target-fremstillinger).
Sakte-bindings (S-TAG) bestemmelsen utføres som følger: Frosset serum lagret mer enn noen få dager bør ikke anvendes. Serum fremstilles omhyggelig fra friskt fullblod eller annen legemsvæske ved standard-fremgangsmåter i industrien. Den følgende fremgangsmåte er funnet å være tilfresstillende. Blod gis anledning til å størkne ved hensetting i 2 timer ved romtemperatur i et glass-testrør. De størknede klumper skilles fra veggene med en glass-rørestang og blodet- hensettes ved 4°C i minst 2 timer (eller natten over). De størknede klumper skilles fra serumet ved sentrifugering ved 20.000 omdr. pr. minutt ved 4°C i 45 minutter. Serumet dekanteres inn i et sentrifugerør og sentrifugeres igjen ved 2000 omdr. pr. minutt ved 4°C i 45 -minutter. Serumet dekanteres og en l%ig løsning av metiolat (1 g i 95 ml vann og 5 ml 0,2M bikarbonat-buffer, pH 10) tilsettes i en mengde av 1% av serum-volumet.
Serum-prøver, fremstilt ved den ovenfor angitte eller andre fremgangsmåter, på hver 0,2 ml settes til hver av 0,25 ml aliquoter av Target-suspensjonsreagens inneholdende 100-200 mikrogram recognin pr. 0,25 ml Target-reagens, ved duplikat-bestemmelser. Suspensjonen blandes ved 4°C slik at pellet-dannelse unngås.
F.eks. kan en liten hurtig-rister med gummihylster anvendes i
1-2 sekunder og så, med rørene svakt skrånende,, kan det ristes i en Thomas-rister i ca. 2 timer eller mer. Target-reagens.et og protein bundet til dette, separeres fra serumet. En av fremgangsmåtene som er funnét å være tilfredsstillende er følgende. Rørene sentrifugeres så ved 2000 omdr. pr. minutt i 20 minutter ved 4°C, den overflytende væske dekanteres, de pelleter som er dannet ved sentrifugering vaskes 3 ganger ved gjenblanding og risting ved romtemperatur med 0,2-0,3 ml av 0,15M. saltløsning,
det sentrifugeres og det overflytende kasseres.
Det protein som er tilbake festet til Target, fraspaltes derfra og bestemmes kvantitativt. Det tilsettes for eksempel 0,2.ml av 0,25M eddiksyre, suspensjonen ristes i 1 til 2 sekunder med en gummihylster-rister, så i en. Thomas-rister i ca. 2 timer i en inkubator ved 37°C. Rørene sentrifugeres ved. 2000 omdr. pr. minutt ved 4°C i 30 minutter. Det overflytende dekanteres forsiktig for å unngå overføring av partikler, og den optiske densitet til det overflytende avleses ved 2 80 mp. -Verdien av den optiske densitet deles med en faktor på 1,46 for å få resultater i mikrogram pr. ml serum-protein (S-TAG). Duplikat-bestemmelser bør ikke variere mer enn 5%. Hvilken som helst annen effektiv fremgangsmåte for bestemmelse av protein-innhold kan anvendes, så som Folin-Lowry-bestemmelsen, men standardene må være spesifisert til å bestemme reguleringsområdet og tumor-verdiene til S-TAG minus F-TAG-konsentrasjon.
Hurtig-bindings- (F-TAG) bestemmelsen utføres som følger: Frosset serum lagret mer enn noen få dager bør ikke brukes. Serum blir omhyggelig fremstilt fra friskt oppnådd fullblod eller annen legemsvæske ved standard fremgangsmåter i industrien. Fremgangsmåten gitt ovenfor i dette eksempel for serum-fremstilling er tilfredsstillende.
Serum-prøver, fremstilt ved den ovennevnte eller andre fremgangsmåter, hensettes ved 4°C i 10 minutter mindre enn den totale tid S-TAG serumsbestemmelsene ble gitt anledning til å være i kontakt med Target-reagens ovenfor (f.eks. 1 time og 50 minutter dersom en "to-timers" S-TAG bestemmelse ble utført).. Denne fremgangsmåte utligner temperatur-forskjellene til S-TAG og F-TAG-bestemmeIser.
Prøver på 0,2 ml av temperatur-utjevnet serum settes til hver av aliquoter på 0,25 ml med Target suspensjons-reagens inne holdende 100-200 mikrogram recognin pr. 0,25 ml Target-reagens, ved duplikat-bestemmelser. Suspensjonen blandes så ved 4°C i tilnærmet 10 minutter på en slik måte at pellet-dannelse unngås. F. eks., kan det anvendes et lite hurtig ristet gummihylster i 1-2 sekunder og så, med rørende svakt på skrå, kan det ristes i en Thomas-rister i.tilnærmet 10 minutter. Target-reagenset og protein bundet til dette, skilles fra serumet. En av fremgangsmåtene som er funnet tilfredsstillende er den følgende. Rørene sentrifugeres så ved 2000 omdr. pr. minutt ved 4°C, det overflytende dekanteres, pelletene som blir dannet ved sentrifugering vaskes 3 ganger ved gjenblanding og risting ved romtemperatur med 0,2-3,0 ml 0,15M saltløsning, det sentrifugeres og det overflytende kasseres.
Det gjenværende protein festet til Target spaltes derfra og bestemmes kvantitativt. Fremgangsmåten beskrevet ovenfor i dette eksempel for bestemmelse av S-TAG konsentrasjon er tilfredsstillende. Hvilken som helst annen fremgangsmåte som er effektiv for bewstemmelse av protein-innhold kan anvendes, så som Folin-Lowry-bestemmelse, men standardene må være spesifisert for å bestemme kontroll-området og tumor-verdiene til S-TAG minus F-TAG konsentrasjon.
De endelige resultater uttrykkes som TAG mikrogram pr. ml serum, og er like S-TAG minus F-TAG. TAG-verdier i ikke-hjernetumor-pasienter og andre kontroller ligger ofte i området fra null (eller et negativt tall) til 140 mikrogram pr. ml serum. TAG-verdier i hjernetumor-pasienter ligger ofte i området fra 141 til 500 mikrogram pr. ml serum. Ved den første "blind"-undersøkelse av 50 blodprøver i henhold til fremgangsmåtene i dette eksempel, ved benyttelse av Target-reagens fremstilt fra astrocytin og bromacetylcellulose, ble 11 av 11 hjernetumorer og 28 av 32 normale pasienter korrekt identifisert. En av de 4
antatt normal-kontroller (dvs. ikke-hjernetumor-kontroller) viste
seg å ha kreft i tyroid-kjertelen, hvilken tilsynelatende var behandlet med hell noen år tidligere. De 3 gjenværende normale kontroller var individer i alderen 60-70 som hadde dårlig helse, muligens ikke-diagnostisert kreft. Av de gjenværende 7 prøver ble 3 av 3 tilfeller Hodgkin's sykdom korrekt identifisert, Sn prøve i tumor-området (141-500 yg TAG/ml) tilsvarte en.pasient med en alvorlig gliosis, og 3 prøver i ikke-tumor-området.
(0-140 yg TAG/ml) tilsvarte pasienter med respektivt en
intrakranial masse-diagnose usikker, men ikke-tumor, og osteosarkom (ikke-hjerne tumor) og et melanotisk sarkom (ikke-hjerne tumor).
En etterfølgende undersøkelse i henhold til fremgangsmåtene i dette eksempel ved anvendelse av Target-reagens fremstilt fra malignin og bromacetylcellulose, identifiserte korrekt tre av tre ondartede hjernetumorer og alle-normal-kontroller. En enda ytterligere undersøkelse utført i henhold til fremgangsmåtene i dette eksempel, utvidet det totale antall med testede menneske-serum-prøver fra 50 til 114.. Anvendbarheten av disse produkter og fremgangsmåter er vist i tabell V som viser resultatene av disse tester.
Omfatter normal-kontroller, ikke-tumor-medisinske og
kirurgiske forstyrrelser.
I - svært syk, udiagnostisert; 2. - ekstra hjerne intrakranial masse, udiagnostisert; 3 - markert gliosis; 4 - ondartet melanom, 5 - osteosarkom; 6 - hjerne-blære væske; 7 - adenocarcinoma av tykktarm; 8 - gastrektomi; 9 - hodeverk; 10 - emfysem,
II - polymyalgi; 12 - tykktarmkreft, 13 - krampetrekninger;
14 - prostrat-kreft, sekundær til ben; 15- klinisk "normale",
18 måneder tidligere, når dette sykelige serum TAG ble.oppnådd: riy-utviklede alvorlige hodepiner, tap av smak og lukt.
Eksempel 11
Diagnose av tumorceller ved immunofluorescens.
Forbindelsene anti-astrocytin, anti-malignin og S-TAG
har vist at de preferensielt festes til tumorceller. Denne spesifikitet gir anledning til å anvende disse forbindelser til å diagnostisere tumorceller i histologideler ved å konjugere farvestoffer eller radioaktive substanser til anti-astrocytin, anti-malignin eller S-TAG. Det kan anvendes standard merketeknikker.
En fremgangsmåte ved anvendelse av S-TAG er som følger.
En fremgangsmåte som er funnet tilfredsstillende er en modifisert St. Marie prosess. Menneske-hjernetumor-prøver blir
frosset og så blir det skåret ut deler med en tykkelse på
5 mikron. Disse lagres i en fuktig beholder ved minus 70°C
i 4 til 8 uker før flekking. Konjugatet kan være et standard antiserum så som geit anti-kanin konjugat. Konjugatet merkes ved teknikker kjent i industrien med fluorescerende eller annen merkende substans. Fluorescerende merket.geit anti-kanin konjugat som er kommersielt tilgjengelig, kan anvendes. Det ble anvendt en fluoresceringsteknikk som var en standard hvorved en 1:200 til 1:400 løsning av TAG inkuberes i ca. 30 minutter eller mer på tumor-delen, fulgt av vasking for å fjerne ikke-festet TAG.
Tre vaskinger med fosfat-bufret saltløsning er funnet tilfredsstillende. Konugat-inkubéring med fluorescein-merket konjugat fulgt av vasking utføres så, fulgt av mikroskopisk undersøkelse. Normale celler og deres prosesser svikter med hensyn til flekking både for tumor-deler og ved kontroll-deler av normal ikke-tumor-hjerne. Fluorescens er klart til stede i tumor-glial-celler og deres prosesser.
Eksempel 12
Påvisning av ondartede ikke-hjerne-celler med fluorescerende signal fra TAG.
Anvendelsen av TAG-produkter koblet med en signal-utsender, så som et farvestoff eller et radioaktivt merke , . for å påvise kreftceller, er beskrevet her. I dette eksempel blir påvisning av ondartede ikke-hjerne-celler beskrevet.
Så som, beskrevet i eksempel 10 benyttes menneske-serum.
Ved bestemmelsen av TAG ble, efter at anti-malignin antistoff var bundet til det immobiliserte antigen og ikke-bundet serum-protein er vasket bort, antistoffet fraspaltet fra bindingen med 0,25M eddiksyre ved 37°C i 2 timer og Target-reagenset separert derfra ved sentrifugering. TAG-antistoff-løsningen ble kvantisert ved hjelp av dens absorpsjon ved 2 80 my. TAG-løsningene ble lagret ved 20°C, så tint og kombinert, bragt til pH 7 ved titrering med 6N NaOH, dialysert mot fosfat-bufret saltløsning med pH 7, filtrert og konsentrert på millipbre Pellicon 1000 membraner, sentrifugert til klart uløselig protein og immun-globulin-kompleksene ble konsentrert og frigjort for immunologisk ikke-aktive forbindelser med Cellex D og blå Sepharose CL6B (Pharmacia) kromatografi. Dette menneskelige anti-malignin antistoff reagerer med anti-menneske-gamma-globulin ved Ouchterlony dobbelt-diffusjon. Når TAG anvendes med fluorescerende middel konjugert til anti-menneskelig gamme- . globulin ved standard dobbel-skikts Coons immunofluorescens, flekker det ondartet glia, bryst-carcinoma, eggstokk-carcinoma, tykktarm-adenocarcinoma og andre typer av kreftceller i post-operative og biopsi vev-deler, og også i menneske-spytt,
bronkiale vaskevæsker, plevrale utstrømningsvæsker, gastrisk aspirat og blære-urin. Konsentrasjonen av protein i TAG som gir klar fluorescens når kontrollene er negative, er 1 til 10 yg pr. del.
Produksjonen av "renset" TAG ble foretatt ved å omsette sera fra pasienter med en rekke typer kreft med bromacetylcellulose-malignin ved metoder som tidligere er beskrevet (eksempel 10). Antistoffet bundet ved denne reaksjon ble spaltet med 0,25M eddiksyre, kvantisert ved måling ved O.D. 280 ved anvendelse av en omdanningsfaktor på 1,46 for gamma-globulin, frosset og lagret ved 20°C. Dette antistoffet ble funnet å inneholde immunoglobulin så som bestemt ved anti-menneskelig gamma-globulin antiserum spesifikt for gamma-kjeder (BioRad Laboratories, Inc.) og med anti-FAB og anti-Fe fragmenter (Miles Laboratories). Det reagerer også med kanin anti-menneskelig albumin (BioRad Laboratories).
Det ble funnet at mens 10 til 50 mikrogram protein TAG
er nødvendig for å danne spesifikk immunofluorescerende flekking
av celler som inneholder malignin, så kreves det bare 1 til 10 mikrogram renset protein TAG for denne spesifikke flekking i alle deler, og i noen få tilfeller er mindre enn ett mikrogram funnet
å være tilstrekkelig.
Det ble funnet at det mest aktive preparat av renset TAG er det som blir eluert med den høyeste ionestyrke, dvs. fra 0,15M til 1,5M. Hvilken som helst f rems ti l.lingsmetode som benytter seg av dette faktum, er nyttig. Tre foretrukne metoder er gitt nedenfor.
Metode I - Fraksjonering av TAG ved kromatografi med DEAE
cellulose (Cellex D, BioRad Laboratories) ble først anvendt ved trinnvis eluering med økende ione-styrke og avtagende pH, den samme sekvens av elueringsmidler som er angitt i eksempel I for fremstilling av urenset astrocytin-forløper-holdig fraksjon. Det ble oppnådd god separering av protein-massen til tre fraksjoner, spiss I oppnådd med løsning 1 (se eksempel 1) og spiss II oppnådd med løsning 6 og løsning 7. Ouchterlony dobbelt-diffusjon viste
at TAG ved spiss I fremdeles inneholder merkbart med protein med albumin-mobilitet> og selv om spiss II inneholdt det meste av albuminet kunne det påvises merkbart med IgG. Rekromatografering av spiss I ga et progressivt rent IgG inntil, efter den.
7, kromatografering, det i alt vesentlig ikke kunne påvises noe albumin (mindre enn 3%) ved Ouchterlony gel-diffusjon, ved
hvilken 5 til 10 mikrogram menneskelig albumin var påvisbart med kanin anti-menneskelig albumin. Den således oppnådde IgG var tilbøyelig til denaturering og .tap av immunologisk reaktivitet efter noen få dagers henstand ved 0-5°C.
Metode II - En annenfraksjonering av TAG ble foretatt med kromatografering på Sepharose CL-6B (Pharmacia, Inc.) ved å
starte med lav-molaritets buffer (0,005M fosfat) og fortsette i to trinn med 0,15M og 1,5M for å eluere resten av proteinet. Som med Cellex D, ble én gjennomgang funnet å være utilstrekkelig for separering, og recyklisering forbedret produktet sakte.
Igjen var den mest aktive fraksjon vis-a-vis anti-malignin antistoff i 1,.5M fraksjonen.
Metode III - Kromatografi med Sepharose CL-6B nærmest til den glass-frittede skive.og Cellex D lag over Sepharosen viste seg å være den mest tilfredsstillende metode.
Den grafiske fremstilling i figur 2 viser fraksjonene oppnådd ved kromatografi av TAG ved benyttelse av metode III.
Efter det første eluat på 200 ml, ble det oppsamlet under-fraksjoner på 50 ml eller mindre. Protein-innholdet i hvert
eluat ble bestemt ved den optiske densitet ved 2 80 mu med en lik faktor på 1,46 basert på gamm-globulin anvendt for å omdanne til mikrogram for beregning av det som utvinnes. Den absolutte mengde av protein må korrigeres for de fraksjoner hvori det er merkbart med albumin. De punkter hvorved de trinnvise løsnings-middelforandringer ble foretatt, er vist ved piler. Underfraksjonene er betegnet med romertall I til VIII.
Løsningsmidlene svarende til bokstavene A-F ved pilene,
var følgende:
A - 0,01M TRIS (pH.7,2)
B - 0,05M TRIS med 0,1M NaCl (pH 7,2)
C - PBS, 0,11M NaCl (pH 7,2)
D - PBS, 0,16 5M NaCl (pH 7,2)
E - PBS, 0,33M NaCl (pH 7,2)
F - 0,05M TRIS, 1,5M NaCl (pH 7,2).
I den følgende tabell er vist utvinningene fra hver fraksjon, en halv-kvahtitativ bestemmelse i hver av gamma-globulin og albumin i hver, og også aktiviteten til hver fraksjon ved den immunofluorescerende flekking av kreftceller.
(Pluss-tegnet betyr reaksjon, null ingen reaksjon og pluss/minus reaksjon i noen tilfeller).
Figur 3 er en fotografisk fremstilling av reaksjons-linjen mellom anti-menneskelig gamma-globulin spesifikk for gamma-kjeder for hver av fraksjonene I og II ovenfra (venstre.og under i fotografiet).
Figurene 3a og 3b er fotografier som viser anvendelsen
av TAG (fraksjon VIII ovenfra) for å flekke ondartede- ikke-hjerne celler. Figur 4a er en flekking av bronkogeniske carcinoma-celler
i de bronkiale vaskevæsker til en pasient. Fibur 4b er en flekking av lymfoma-celler i plevral-væsken til en pasient. Ikke-kreft-celler gir ikke fluorescens. TAB (1 til 10 pg i
0. 1 ml fosfat-bufret saltløsning (PBS)) påføres på overflaten av pakkede celler på en glass-skråplate inkubert 30 minutter,
vasket tre ganger med PBS og så belagt med fluorescein-konjugert anti-menneskelig IgG fortynnet inntil ikke-ondartet kontroll-vev gir i alt vesentlig ingen fluorescens. Cellene visualiseres med Zeiss fluorescerings-mikroskop ved anvendelse av en wolframlampe og filtere BG 23, BG 12 og 500.
Eksempel 13
Påvisning av kreftceller med radioisotope signaler fra TAG.
I dette eksempel er muligheten for festing av et radioaktivt merke tilTAG demonstrert. Dernest har injeksjonen i dyr av dette radio-merkede TAG blitt utført og vist som sikkert og effektivt. For det tredje ble det radio-merkede TAG lokalisert pre ferensielt i kreftvev ved sammenligning med normalt vev, og dette viser at spesifikiteten tidligere demonstrert in vitro på preferansen for kreftceller som befordres ved anvendelse av spesifikke anti-malignin TAG-produkter, er bekreftet in vivo.
9 9 m
Herkesetting av TAG med 99m technetium ( Tc)
Fremgangsmåte ved merking
1. To preparater av TAG ble anvendt, her betegnet TAG-1
og TAG-2. TAG-1 og TAG-2 (konsentrasjoner for hver 0,4 mg/0,5 ml) ble satt til separate sterile prøveglass.
2. Til hvert prøveglass ble det satt 0,1 ml av. en tinn(II)-klorid-løsning (10 mg SnCl2-2H20 i 100 ml av 0,01N HC1). Prøve-glassene ble blandet i 3-4 minutter.
99m 3. 0,1 ml (6mCi) av Tc-pertechnatat (natriumsalt) ble tilsatt og blandet i 2-3 minutter.
Fremgangsmåte for bestemmelse av merkesettings- effekten
9 9m 9 9m Prøver av Tc-TAG-1 og Tc-TAG-2 ble testet på merke-settingseffekt ved nedstrømmende papir-kromatografi ved anvendelse av Watman nr. 1 papir med 85 %ig"'metanol som løsningsmiddel. En lignende undersøkelse ble foretatt med natrium-pertechnetat- 9 9 mTc som virket som en kontroll. Efter 2 timer ble papirene fjernet fra kromatograferings-tanken og delt i 2 seksjoner: (1) 1 cm fra utspringet; (2) de gjenværende papirer opptil løsningsmiddel-fronten. Hver seksjon ble så opptelt i en gammabølge-gnistteller og dens innhold av radioaktivitet ble bestemt (cpm).
Tilnærmet 50 lambda ble plettert for hver papir-strimmel.
Fremgangsmåte for antigen- antistoff- reaksjon
En del av den merkedannede løsning ble også plettert på en Ouchterlony gel-plate for å bestemme dens evne til å reagere med malignin ved antigen-antistoff-reaksjonen. Efter en periode på 3 timer, ble de resulterende skarpe reaksjonslinjer fjernet fra gelen og deres innhold av radioaktivitet ble målt. En lik del av gelen som ikke var involvert i reaksjonen ble også fjernet og dens innhold av radioaktivitet ble også målt som bakgrunn.
Resultater
Merkedannings- effekt
Konklusjoner
Man kom frem til følgende•konklusjoner med hensyn til
de anvendte kvalitets-kontroll-tester:
9 9m 1. Tc-pertechnetat ble redusert av tinn (II)klorid til en mer effektiv oksydasjons-tilstand (+4+5). 2. Det reduserte pertechnetat dannet merker både med TAG-1 og TAG-2 preparatene. 3. 99mTc-TAG-2 ble testet med hensyn til dets evne til å
beholde sin aktivitet, og ble funnet å beholde evnen til å reagere immunologisk.
Anvendelsen av radio- merket TAG in vivo for å påvise kreftceller
Wistar-rotter ble injisert intracerebralt med cisglioma-tumorceller som tidligere hadde hatt gjennomgang i rotter og i vev-kultur. Rottene ble observert på de første tegn på vekst av tumor, så som svakhet, tremor eller ustøhet. Disse symptomer viste seg først 7 til 10 dager fra injeksjonen, og hurtig-voksende tumorer resulterte i døden innen 3 til 4 dager for mange dyr', og én uke for alle. Så snart som symptomene viste seg ble dyrene injisert med merket TAG intravenøst i hale-blodåren, og så ble dyrene bedøvet efter varierende tider, hjernen ble fjernet, tumoren ble skåret fri for normal hjerne, og radioaktiviteten i hver oppskåret prøve ble sammenlignet.
9 9m
Preliminært Tc- TAG- forsøk
Prøver av tumor og av normal hjerne ble opptalt natten over i gamma-bølge-telleren. Alle prøvene og standardene ble f o-r f allskorrigert for forenkling til det midlere antall for den første prøve i sekvensen.
Konklusjon
Den preferensielle lokalisering av radioaktivitet i tumor, sammenlignet med i normalt vev, er vist ovenfor.
Eksempel 14
Demonstrasjon av at anti-astrocytin, anti-malignin og S-TAG er cytotoksiske for tumorcelle-vekst i vev-kultur.
Det kan anvendes standard-tester for bestemmelse av cytotoksisitet. Vanligvis blir antall celler i et fast tellerom, vanligvis anordnet til å inneholde ca. 100 levende celler, opptellet. Disse, celler blir så behandlet med midlet som testes,
og antall celler som fremdeles er i live, blir opptellet.
Ved en standard-test på cytotoksisitet for S-TAG løsning oppnådd i samsvar med metodene i eksempel 10, mot celler i vev-kulturer som stammer fra en pasient med en gliblastoma grad III-IV, godtkarakterisertsom glial opprinnelse, frembragte S-TAG død for alle celler i telle-rommet endog i en høy fortynning på
1:100 og 1:1000, hvilket representerer så lite som 0,2 og 0,02 yg av S-TAG pr. ml løsning. Lignende resultater er oppnådd med høye fortynninger av anti-astrocytin og anti-malignin.
Både spesifikiteten vist i eksempel 11 og cytotoksisiteten vist i eksempel 12 er meget relevante for de terapeutiske muligheter til anti-astrocytin, anti-malignin og S-TAG for hjernetumorer hos mennesker. Mens disse terapeutiske anvendelser ligger i fremtiden, er det praktiske diagnostiske potensial for begge disse fenomener for tumorvev fjernet ved operasjon, men som krever diagnose ved histologi, allerede demonstrert her.
Eksempel 15
Hydrolytisk spaltning av recogniner.
En løsning av recognin, i dette tilfelle enten astrocytin eller malignin, ved pH mellom 1 og 2 hensettes i kaldt miljø. Efter 7 til 14 dager viser TLG kromatografi at produktet er blitt redusert i molekylvekt med tilnærmet 200. Når løsningen hensettes lenger, fraspaltes det ytterligere enheter med tilnærmet 200 i molekylvekt hver 7 til 10 dager. For astrocytin reduseres således molekylvekten fra 8000, og for malignin reduseres den fra 10.000, i hvert tilfelle med enheter på tilnærmet 200 sekvensielt.
De fysiokjemikalske spesifikiteter til astrocytin opp-rettholdes for hvert produkt ned til en molekylvekt på tilnærmet 4000. De fysiokjemikalske spesifikiteter til malignin opprett-holdes for hvert produkt ned til en molekylvekt på tilnærmet 5000. Dette er vist med Ouchterlony gel-diffusjonstest mot henholdsvis anti-astrocytin og anti-malignin.
Denne spaltning kan også utføres enzymatisk, så som med trypsin og andre proteinaser, med lignende resultater.
Molekylvektene av disse forbindelser fremstilt ved hydrolytisk spaltning av recogniner kan tilnærmet defineres med de følgende formler:
For produkter med de fysiokjemikalske spesifikiteter til astrocytin:
For produkter med de fysiokjemikalske spesifikiteter til malignin:
hvor y er molekylvekten til produktet og x er et helt tall fra 0 til 19.
Eksempel 16
Fremstilling av kunstig vev eller organ med recogniner.
Et stiv-vegget rør av plast, metall eller annet egnet stivt materiale dyppes inn. i eller impregneres med en høy-konsentrert (dvs. 10 mg/ml) viskøs løsning av recognin, i dette tilfelle enten astrocytin eller malignin, inntil alle overflater er fullstendig belagt med recogninet. Alternativt føres recognin-løsning gjennom og rundt røret under trykk inntil alle overflater er fullstendig belagt. Røret tørkes så i'luft eller i vakuum, eller lyofiliseres. Belegningsprosessen gjentas flere ganger for å bygge opp flere molekylar-skikt av recognin-belegning.
Røret er nå klart til å plasseres i et hulrom eller i et vev som inneholder astrocytin- eller malignin-lignende forløpere 1 nærliggende vev eller væske i et levende pattedyr. Dette kunstige vev eller organ kan anvendes for å minimalisere eller eliminere reaksjoner som fremmede substanser uten recognin-belegning ville anspore.
Kunstige vev eller organer av andre geometrier kan fremstilles på lignende måte.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede tumorceller i en cellesamling, som omfatter å påføre et anti-malignin TAG-produkt festet til visible eller signal-, emitterende midler på nevnte cellesamling hvorved nevnte anti-malignin TAG-produkt preferensielt festes til kreftaktige eller ondartede celler, og påvisning av nevnte kreftaktige eller ondartede tumorceller ved hjelp av nevnte visible, eller signal-emitterende midler.
2. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av kreftaktige eller ondartede, tumorceller i en cellesamling i henhold til krav 1, hvilken omfatter å påføre på nevnte cellesamling et anti-malignin TAG-produkt, og derefter påføre fluorescein-konjugert anti-TAG derpå, hvorved det foregår fluorescens bare i de kreftaktige eller ondartede tumorceller ved illuminasjon.
3. Fremgangsmåte i"henhold til krav 1 eller 2, hvorved de kreftaktige tumorceller er glial-tumorceller.
4. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 eller 2, hvorved de kreftaktige tumorceller er ikke-glial-tumorceller.
5. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvorved TAG-produktet blir dannet ved omsetning av anti-malignin-serum med et malignin-basert reagens.
6. Fremgangsmåte i henhold til krav 5, hvorved det malignin-baserte reagens er bromacetylcellulose-malignin.
7. Fremgangsmåte i henhold til krav 2, hvorved TAG-produktet i det minste delvis er blitt befridd for substanser som er lite eller ikke-reaktive ved fluorescerende påvisning når de påføres på kjente kreftaktige celler.
8. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, hvorved anti-malignin TAG-produktet er festet til et signal-emitteringsmiddel.
9. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, hvorved TAG-produktet er direkte festet til signa1-emitteringsmidlet.
10. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, hvorved TAG-pro.duktet ér indirekte festet til signal-emitteringsmidlet.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO793362A NO793362L (no) | 1979-10-18 | 1979-10-18 | Fremgangsmaate til paavisning av ondartede tumorceller |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO793362A NO793362L (no) | 1979-10-18 | 1979-10-18 | Fremgangsmaate til paavisning av ondartede tumorceller |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO793362L true NO793362L (no) | 1981-04-22 |
Family
ID=19885105
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO793362A NO793362L (no) | 1979-10-18 | 1979-10-18 | Fremgangsmaate til paavisning av ondartede tumorceller |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NO (1) | NO793362L (no) |
-
1979
- 1979-10-18 NO NO793362A patent/NO793362L/no unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4298590A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
Coons et al. | Localization of antigen in tissue cells: II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody | |
Goldstein et al. | Studies on fluorescent antibody staining: I. Non-specific fluorescence with fluorescein-coupled sheep anti-rabbit globulins | |
US5866690A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
US4486538A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
US4196186A (en) | Method for diagnosing malignant gliol brain tumors | |
Goldenberg et al. | Antigens associated with normal and malignant gastrointestinal tissues | |
JPS62190074A (ja) | ヒトの癌に付随したジフコガングリオシドを規定するハイブリド−マ抗体 | |
US4195017A (en) | Malignin, derived from brain tumor cells, complexes and polypeptides thereof | |
Neifakh et al. | Localization of ceruloplasmin biosynthesis in human and monkey liver cells and its copper regulation | |
EP0087898A1 (en) | Antibodies and antigens useful in the diagnosis and treatment of cancer | |
US4624932A (en) | Recognins and their chemoreciprocals | |
KR850001770B1 (ko) | 인체 암 항원에 대한 특이항체의 제조방법 | |
Halliday et al. | Isoferritin composition of tissues and serum in human cancers | |
EP0007214A1 (en) | Product for detecting the presence of cancerous or malignant tumor cells | |
KR950006170B1 (ko) | 사람과 동물에 있는 고리 모양의 입자 및 암의 존재를 진단하기 위한 시험관 내의 방법 및 프로브(probe) | |
US4840915A (en) | Method for diagnosing malignant tumors | |
US4976957A (en) | Process for the production of recognins and their chemoreciprocals | |
EP0015755B1 (en) | Recognins, their chemoreciprocals, target attaching globulins and processes for producing these products; methods of detecting cancer tumors | |
FI113205B (fi) | Immuunianalyysi, monoklonaalinen vasta-aine ja hybridooma | |
NO793362L (no) | Fremgangsmaate til paavisning av ondartede tumorceller | |
US4624931A (en) | Recognins and their chemoreciprocals | |
JP4392991B2 (ja) | 免疫不全症の処置のための組成物、およびその調製と使用のための方法 | |
Sulitzeanu | Antigenic components of rat connective tissue. | |
JPH01112163A (ja) | レコグニン類および関連物質 |