NO332892B1 - Kitosanfremstilling - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte til fremstilling av kitosan hvor prosessen omfatter å svelle partikkelformet kitin med en vandig løsning over en periode på minst 36 timer, og deretter reagere det resulterende svellede partikkelformede kitinet med en alkalisk løsning ved forhøyet temperatur hvorved deacetylering skjer.

Description

Oppfinnelsen går en fremgangsmåte til fremstilling av kitosan og til nye

kitosanprodukter fremstilt derved såvel som deres anvendelser.

Kitin er et naturlig nitrogenøst mukopolysakkarid med formel (CgH^Ns),, som finnes i eksoskjelettet til invertebrater og også. hos sopp. Spesielt er det en viktig komponent i eksoskjelettet til krustacea så som reker, krabber, dypvannsreker og hummer. Mer spesielt er kitin poly N-acetyl-D-glukosamin. Således består kitin av.

(l->4)-koblet 2-acetamido-2-deoksy-P-D-ghikose (GlcNac; A-enheten). Den fysikalske strukturen til kitin har en stor grad av orden, og den vanligste formen er a-kitin som er tilgjengelig som avfallsmateriale fra skalldyrnæringsmiddelindustri. I a-kitin er kjedene antiparallelle og i stor grad hydrogenburidet. En annen form er p-kitin som kan isoleres fra, f.eks. skallet til blekkspruten Loligo og piggene til diatomet Thalassiosira Jluviatilis. I p-kitin er kjedene parallelle og kjedene er mindre hydrogenbundet sammenlignet med a-kitin.

Kitin er uoppløselig i vann selv ved sure pH-verdier og i de fleste organiske oppløsningsmidler. Dette har bidratt til å begrense anvendelsene som den kan brukes til.

N-acetylgruppene i kitin kari avspaltes for å gi produktet kjent som kitosan. Kitosan

har mange kjente anvendelser, f.eks. i farmasøytiske og kosmetiske sammensetninger og som fyllmaterialer absorberende midler bærere og understøttelsesmidler.

Kitosan kan betraktes som en familie av vannoppløselige polysakkarider som består av (1—>4)-koblede A-enheter og enheter av 2-amino-2-deoksy-p-D-glukose (GlcN;

D-enheten) i varierende relative tilgjengeligheter og sekvenser.

Skillet her mellom kitin og kitosan er basert på uoppløseligheten av kitin i fortynnede syreoppløsninger og oppløseligheten av kitosan i den samme fortynnede sure oppløsning (se Roberts, G.A.F., "Chitin Chemistry" (1991), sider 6-7).

Definisjonen av fullt vannoppløselig kitosan gitt på side 6 i Roberts (supra) er relatert til det faktum at kitosaner generelt er bare oppløselig i vann når de frie aminogruppene i D-enhetene er protonerte. Slik protonering kan oppnås ved tilsetting av en kontrollert mengde av en syre, f.eks. eddiksyre. Kitosan kan imidlertid også fremstilles i forskjellige saltformer, dvs. med en protonert aminogruppe i D-enhetene og et negativt ladet motion (f.eks. format, acetat, klorid eller et annet negativt ion), som gjør det oppløselig i vann uten tilsetting av en syre. Fremgangsmåte for fremstilling av slike kitosansalter er beskrevet i litteraturen (se f.eks. Draget et al., Biomaterials 13: 635-638 (1992), Vårum et al. Carbohydrate Polymers 28: 187-193 (1995), og US-A-5 599 916.

En parameter brukt til å karakterisere kitosanet er FA, den relative fraksjon av sakkaridenheter som er A- heller enn D-enheter.

For å illustrere strukturen til kitosan er følgende skjematiske representasjon av den kjemiske strukturen til tre forskjellige kitosaner, med varierende sammensetning av A- og D-enheter, gitt:

Del av et delvis N-acetylert kitosanmolekyl (FA = 0,50).

I et binært heteropolysakkarid så som kitosan er den kjemiske strukturen til molekylet ikke fullstendigkarakterisert vedkjennskap til den kjemiske sammensetningen (dvs. Fa) alene. Både sekvensen til de to monomerene langs kjedene og deres fordeling mellom kjedene må være kjent for å karakterisere fullt ut den kjemiske strukturen. En måte å karakterisere sekvensen på de to monomere enheter langs kjeden er å bestemme de riærmest-nabo frekvensene til de to monomere enheter, og sammenligne frekvensene med verdier oppnådd fra statistiske modeller. NMR-undersøkelser har således vist at vannoppløselige kitosaner fremstilt både homogent og heterogent har en tilfeldig fordeling av acetylerte og deacytylerte enheter langs kjeden (se Vårum ét al. Carbohydn Res. 21 1: 17-23 (1991) og 217: 19-27 (1991)).

Nærværet av én monomerresidu med en hydrofil og protoniserbar aminogruppe og én annen monomerresidu med en hydrofob acetylgruppe, hvor de relative mengder av de to monomerer kan varieres, kan påvirke kitosanet fysikalske egenskaper i oppløsning og i geltilstand og faststofftilstand, så vel som dets interaksjoner med andre molekyler, celler og annet biologisk og ikke-biologisk materiale. Den kommersielle anvendelse av kitosån har imidlertid så langt blitt begrenset til kitosanprøver med en lav fraksjon av acetylerte enheter (Fa. < 0,15) delvis på grunn av mangel på billige fremgangsmåter til å fremstille andre kitosaner i stor skala, og delvis på grunn av den begrensede vitenskapelige forståelse av de funksjonelle egenskaper til kitosaner med en høyere Fa-

Det skal bemerkes at ved siden av deacetylering, i produksjonen av kitosan fra kitin, kan også depolymerisering skje og kitosan kan produseres med et stort område av grader av acetylering og et stort område av molekylvekter. Generelt er imidlertid et gjenværende problem med kommersielt tilgjengelig kitosan dets uoppløselighet ved fysiologiske pH-verdier.

Produksjonen av kitosan fra kitin er generelt utført enten som en homogen reaksjon eller som en heterogen reaksjon. I den homogene reaksjonen blir kitin suspendert i alkali og suspensjonen blir avkjølt med is for å bringe kitinene i oppløsning; i den heterogene reaksjonen blir partikkelkitin dispergert i en varm alkalisk oppløsning, generelt natriumhydroksid. I tilfelle av den homogene reaksjonen er FA til det oppnådde kitosan generelt 0,3-0,7.1 tilfelle av den heterogene reaksjonen er FA til det oppnådde kitosan generelt i området 0-0,15. Der hvor kitosan med en forskjellig grad av deacetylering er krevet kan det være nødvendig å reacetylere kitosanet. I tilfelle av den homogene reaksjonen er de gjenværende N-acetylgrupper generelt tilfeldig lokalisert langs den polymere ryggraden til kitosanproduktet. I tilfelle av den heterogene reaksjonen er en liten fraksjon av uoppløselig kitin-liknende materiale oftest tilstede i produktet sammen med en syreoppløselig fraksjon med en nesten tilfeldig fordeling av acetylgruppe langs de polymere strengene.

Beskrivelser av kjent teknikk med hensyn på deacetyleringsfremgangsmåter kan finnes i: US-A-4 195 175; Vårum et al., sider 127-136 i "Advances in chitin chemistry", red. C.J. Brine, 1992; Ottøy et al., Carbohydrate Polymers 29: 17-24 .

(1996); Sannanet al., Macromol. Chem. 176: 1191-1195 (1975); Sannan et al., Macromol. Chem. 177: 3589-3600 (1976); Kurita et al., Chemistry Letters 1597-1598 (1989); og CA-A-2 101 079..

Forbedret yteevne er i flere applikasjoner nylig blitt funnet for kitosanfraksjoner som er mer acetylert (se Smidsrød et al., sider 1-11 i "Chitin and Chitosan - Chitin and Chitosan in Life Science"; red. T. Uragami et al., Kodansha Scientific, Japan

(2001) (ISDN 4-906464-13-0). Av viktighet er øket oppløselighet ved nøytrale pH-verdier, en kontrollerbar degraderingshastighet ved lysosymer, sterke interaksjoner med hydrofobe overflater (f.eks. fettpartikler og celleoverflater) for derved å gi forhøyede fettbindingsegenskaper og flokkulering, forsterkede destabiliseringsvirkninger på olje-i-vann-emulsjoner, og utstrakt anvendbarhet i et antall av kosmetiske, ernæringsmessige og biomedisinske anvendelser.

Høyere acetylerte kitosaner har også nylig blitt vist å flokkulere bakterielle celler mer effektivt (se Strand et al., Biomacromolecules 2: 126-133 (2001)).

De kjente fremgangsmåter for fremstilling av mer acetylerte kitosaner lider imidlertid av ulemper som gjør dem uegnet for oppskalering til industriell produksjon.

Således er det for den heterogene deacetyleringsprosess uten svelling nødvendig å ekstrahere produktet med en syre for å separere det ureagerte kitin fra det vannoppløselige kitosan; dette omfatter fjerning av vann i tillegg til redusert utbytte av det meget acetylerte kitosanprodukt.

Reacetylering av et meget deacetylert kitosan, i tillegg til deacetyleringstrinnet, omfatter solubilisering av kitosanet, anvendelse av organiske kjemikalier så som eddiksyreanhydrid og metanol og isolering av det endelige produkt.

Den homogene deacetyleringsprosedyre involverer solubilisering av kitinet ved tilsetting av is, og isolering av kitosanet fra oppløsningen. Videre for å unngå at kitinoppløsningen har altfor høy viskositet, er store volumer av flytende lut nødvendig i reaksjonsmediet. Denne homogene deacetyleringsprosessen resulterer, derfor i et mer kostbart produkt sammenlignet med produktet fra en heterogen deacetyleringsfremgangsmåte.

Vi har nå overraskende funnet at hvis kitinet i en heterogen deacetyleringsreaksjon først ble utsatt for en forlenget lavtemperatur alkalisk svelletrinn kan et kitosanprodukt oppnås med en mer tilfeldig fordeling av residual N-acetylgrupper langs de polymere kjeder, med en grad av deacetylering som kan være lav eller høy som ønsket, med en grad av depolymerisering som kan, hvis ønsket være lavere enn i de konvensjonelle produkter og hvis ønsket med en forhøyet vannoppløselighet ved fysiologiske pH-verdier.

Således i én side tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av kitosan hvor fremgangsmåten omfatter å svelle partikkelkitin med en vandig oppløsning, fortrinnsvis en vandig alkalisk oppløsning, ved en temperatur under 30°C og over en periode på minst 36 timer, og deretter reagere det resulterende svellede partikkelformedé kitinet med en alkalisk oppløsning ved en forhøyet temperatur hvorved det forårsakes at deacetylering skjer, f.eks. til en forutbestemt ønsket FA-verdi, og hvis ønsket gis som utbytte en fullt vannoppløselig kitosan.

Kitinet brukt i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er fortrinnsvis kitin ekstrahert fra invertebrateksoskjelett, f.eks. ved deproteinisering og demineralisering. Således er kitinet fortrinnsvis a-kitin. Særlig fortrinnsvis er dette kitinet ekstrahert fra krepsdyreksoskjelett, særlig reke, krill, hummer og krabbeeksoskjelett og muslingskall. Betegnelsen reke er brukt heri for å beskrive alle typer reker så vel som liknende arter så som scampi. Betegnelsen hummer er brukt heri for å beskrive både hummer og kreps og langouster. Eksoskjelett fra den arktiske reke (Pandalus borealis) er spesielt foretrukket. Slike krepsdyreksoskjelett --er tilgjengelig som avfallsprodukt i næringsmiddelindustrien. Skjønt kitinet brukt som utgangsmateriale fortrinnsvis er isolert fra krepsdyrskall (f.eks. reker, musling, krill, krabbe og hummerskall), kan andre kitinkilder anvendes i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, f.eks. B-kitin fra kilder så som blekksprutskall og diatomer. Videre kan andre kitiner, så som y-kitin også anvendes. Kitinutgangsmateriale kan være i rå eller forbehandlet form, f.eks. eventuelt tørket og videre mekanisk og/eller kjemisk modifisert. Kitinet er imidlertid fortrinnsvis i flak eller pulverform, og har f.eks. en modus partikkelstørrelse på 5-1000 um, særlig 50-500 \ im. Slike pulvere er ønskelig hovedsakelig ensartet i partikkelstørrelse.

Partikkelkitinet svelles i en vandig oppløsning, fortrinnsvis en alkalisk oppløsning, f.eks. en minst 10 N alkalisk oppløsning, og/eller en oppløsning som inneholder oppløste elektrolytter/salter som er i stand til å bryte ned den krystallinske strukturen i kitinet. Oppløsningen har fortrinnsvis et polart eller protisk oppløsningsmiddel, f.eks. vann, en alkohol (f.eks. metanol), dimetylsulfoksid, dimetylformamid, dimetylacetamid eller acetonitril. En vandig alkalisk oppløsning er spesielt foretrukket anvendt idet belastningen på omgivelsene er mindre. Det anvendte alkali kan være ethvert alkali i stand til å deacetylere kitin, mén er fortrinnsvis et uorganisk alkali, særlig et alkalisk eller jordalkalisk metallhydroksid, f.eks. kaliumhydroksid men spesielt natriumhydroksid. Således er det alkaliske middel fortrinnsvis en såkalt sterk base. Lut er spesielt fordelaktig anvendt. Den alkaliske oppløsning har ønskelig en pH-ekvivalent til eller større enn den til vandig 10 M NaOH, mer fortrinnsvis den til 15 M NaOH. Typisk vil minst 15 M natriumhydroksid, særlig minst 18 M natriumhydroksid anvendes, f.eks. 15-25 M, mer fortrinnsvis 18-22 M. Den alkaliske oppløsningen vil generelt brukes i et vektforhold relativt til partikkelkitinet på 100:1 til 1:1, fortrinnsvis 50:1 til 4:1, mer fortrinnsvis 30:1 til 8:1.

I én foretrukket utforming blir kitinet bragt i kontakt med en væske som omfatter et organisk løsningsmiddel i hvilke kitinet er oppløselig. Væsken kan inneholde vann som et samoppløsningsmiddel og vann kan tilsettes til den flytende kitinblandingen for å utfelle det oppløste kitin som svellede amorfe partikler. Slik væske er ønskelig alkalisk men kan inneholde andre oppløste komponenter f.eks. elektrolytter/salter, som er i stand til å avbryte de krystallinske strukturer i kitinet. En slik væske som kan anvendes i denne forbindelse er vandig metanolisk oppløsning av kalsiumklorid.

Svellingstrinnet i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen blir fortrinnsvis utført ved en temperatur på opptil 30°C, f.eks. -6 til 30°C. mer fortrinnsvis 0-30°C, særlig 15-25°C, spesielt opp til 20°C. Mens kitinet i den konvensjonelle homogene kitindeacetyleringsreaksjonen blir bragt i oppløsning ved avkjøling til istemperaturer, hvor svellingen i henhold til fremgangsmåten som angitt i oppfinnelsen blir utført ved temperaturer på 5°C eller lavere, blir den avsluttet før kitinet oppløses og materialet som er utsatt for den alkaliske deacetylering ved hevet temperatur er et partikkelformet, uoppløst svellet kitin.

Svellingstrinnet blir fortrinnsvis utført i minst 48 timer (f.eks. 48-75 timer), mer fortrinnsvis minst 54 timer, særlig 60-120 timer, eller mer spesielt 65-75 timer. Idet svelleperioden blir utvidet økér prosentandel utbytte av syreoppløselig kitosan fremstilt i en påfølgende deacetylering; over 75 timer er ytterligere økning i utbyttet liten. Generelt vil svelletiden som er nødvendig for B-kitin være mindre enn den for a-kitin.

Svellingen av kitinet kan aksepereres ved å eksponere kitinet under svelling til trykk eller bestråling, f.eks. ved å knuse eller ekstrudere fuktig kitin eller ved mikrobølge eller ultralydbestråling. Dette er en ny side av kitin til kitosan konversjon og således sett fra en ytterligere side tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av kitosan hvor fremgangsmåten omfatter å svelle partikkelformet kitin med en vannoppløsning (fortrinnsvis en alkalisk oppløsning) ved en temperatur under 30°C og med anvendelse av trykk eller bestråling for å akselerere svellingen, og påfølgende reaksjon av det resulterende svellede partikkelformede kitin med en alkalisk oppløsning ved en forhøyet temperatur hvorved deacetylering forårsakes å skje.

Ønskelig er svelletiden valgt til å være en tid tilstrekkelig for at kitinet skal bli svellet amorft kitin, dvs. kitin hovedsakelig fri for krystallinske domener. Dette kan. verifiseres eksperimentelt ved røntgendiffraksjon. Generelt er kitinene i den svellede amorfe tilstand når det har svellet i volum med minst 1,4 ganger volumet kitinet har i destillert vann, fortrinnsvis minst 1,5 ganger.

Den alkaliske deacetylering av amorft kitin er i seg selv ny og danner en ytterligere side ved foreliggende oppfinnelse. Sett fra denne side tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av kitosan som omfatter å reagere partikkelformet amorft kitin, fortrinnsvis svellet med en vandig alkalisk oppløsning, med en vandig alkalisk oppløsning ved en forhøyet temperatur, f.eks. over 30°C, fortrinnsvis omver 40°C. Det amorfe kitin brukt i denne fremgangsmåten kan fremstilles ved svelling som beskrevet heri eller ved utfelling av oppløst kitin.

Etter svellingen blir det svellede kitinet utsatt for alkalisk deacetylering ved en høyere temperatur enn den som ble brukt i celletrinnet, f.eks. minst 5°C høyere, fortrinnsvis minst 25°C høyere. Typisk er temperaturen i deacetyleringstrinnet minst 40°C opp til kokepunktet for oppløsningen (f.eks. opptil 130°C), fortrinnsvis minst 45°C, f.eks. i området 45-120°C, mer spesielt 50-70°C, særlig 55-65°C. Effekten av å øke temperaturen er å redusere tiden som er nødvendig for å produsere en ønsket grad av deacetylering. Siden prosessen i henhold til oppfinnelsen fortrinnsvis blir utført slik at det gir en kitosan som har en forutbestemt FA-verdi, vil prosessen normalt omfatte eksponering til de økede deacetyleringstemperaturene i en forutbestemt tid. Generelt vil deacetyleringsreaksjonen kjøres fra 30 min. til 10 timer, fortrinnsvis 45 min. til 4 timer.

Den alkaliske oppløsning brukt i deacetyleringstrinnet kan være den samme som oppløsningen brukt i svelletrinnet, eventuelt med ytterligere alkali som tilsettes eller med overskudd alkali som fjernes.

Alternativt kan det svellede kitin gjenvinnes og bringes i kontakt med frisk alkalisk oppløsning. Slik ytterligere eller frisk alkalisk oppløsning kan være som beskrevet ovenfor for svelletrinnet. Begrunnet med egnethet og økonomi vil deacetyleringstrinnet generelt utføres ved å bruke den samme alkaliske oppløsning som svelletrinnet, eventuelt med ytterligere alkalisk oppløsning tilsatt.

Deacetyleringen blir fortrinnsvis utført slik at det gir et kitosanprodukt som har en FA på 0,2-0,7, særlig 0,45-0,6.

Etter deacetyleringen vil kitosanproduktet generelt vaskes og eventuelt tørkes, og males, f.eks. som i konvensjonelle kitosanproduksjonsprosesser. Hvis ønsket kan det separeres fra ethvert restkitin ved sur ekstraksjon og utfelling; igjen kan dette utføres som i konvensjonelle kitosanproduksjonsprosesser.

Vaskingen av kitosanproduktet vil typisk utføres med varmt vann (f.eks. 30-70°C) og fortsettes inntil vaskeoppløsningen når nøytral pH-verdi. Vasking med kaldt vann bør generelt unngås idet geldannelse kan skje.

Således i én foretrukket utforming av oppfinnelsen er fremgangsmåten en fremgangsmåte til produksjon av et fullt vannoppløselig kitosan, med en forutbestemt fraksjon av acetylerte aminogrupper (Fa), ved svelling og påfølgende deacetylering,karakterisert vedat den omfatter: a) utstrakt svelling i minimum 36 timer av kitin ved temperaturer lavere enn 30°C, i mer enn 10 M konsentrert lut, og b) deacetylering av det svellede kitin ved å øke temperaturen til over 45°C i en forutbestemt tid, og c) isolering av kitosanet ved å vaske det deacetylerte kitin fra trinn (b) med vann inntil vaskeoppløsningen blir nøytral, og eventuell tørking og maling av

kitosanproduktet.

En viktig forskjell mellom fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse og de heterogene prosedyrer beskrevet i den kjente teknikk er implementering av et utvidet svelletrinn. Forskjellen mellom prosessen i henhold til foreliggende oppfinnelse og den homogene deacetyleringsprosedyren beskrevet i kjent teknikk er helt klar, og inkluderer at det følgende unngås: a) solubilisering av kitinet med den resulterende begrensning i konsentrasjonen på grunn av viskositet; og b) utfelling av kitosanproduktet (med høy til lav fraksjon av acetylerte enheter).

Det signifikant reduserte arbeidsvolumet i deacetyleringstrinnet sammen med fravær av utfellingstrinn for å isolere produktet er en grunngivende fordel i fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse sammenlignet med de homogene deacetyleringsfremgangsmåter i henhold til kjent teknikk, idet det gjør fremgangsmåten industrielt anvendbar.

Med hensyn på den tidligere nevnte heterogene deacetyleringsprosess er et essensielt adskillende trekk ved foreliggende oppfinnelse at det er mulig å fremstille et produkt som er fullt vannoppløselig, som unngår behovet for å ekstrahere produktet med en syre og adskille det ureagerte kitinet fra det vannoppløselige kitosanet.

Med "fullt vannoppløselig kitosan" som brukt heri er det ment et kitosan som oppløses fullstendig, som er mer enn 97 vekt% oppløst i en fortynnet sur oppløsning, f.eks. som en 1 % vekt/volum oppløsning av kitosanet i 1 % vekt/volum eddiksyre. For gitte alkaliske oppløsninger kan temperaturene og varighetene av svelle- og deacetylerihgstrinnene som er nødvendig for å produsere kitosan som har en ønsket grad av deacetylering, bestemmes ved rutineeksperimentering. Som et eksempel ved å benytte 20 M NaOH, svelling av a-kitin fra Pandalus borealis ved 20°C i 66-100 timer, etterfulgt av deacetylering ved 50°C i 3 timer eller 60°C il time oppnås kitosan med en Fa på ca. 0,5.

Således vil fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen typisk involvere svelling i en , forutbestemt tid ved en forutbestemt temperatur etterfulgt av deacetylering i en forutbestemt tid ved en forutbestemt temperatur, for å produsere et produkt med ønsket Fa- Alternativt kan imidlertid tidene og temperaturene justeres i et feedback kontrollsystem som involverer å overvåke egenskapene til reaksjonsmediet, f.eks. ved prøvetaking og testing.

Vi har også overraskende funnet at hvis svellingen i den alkaliske oppløsning blir utført for en signifikant utvidet periode, f.eks. 65 timer eller mer, begynne kitindeacetylering å skje til og med uten påfølgende behandling ved forhøyde temperaturer. Graden av deacetylering er avhengig av tidsperioden for hvilke svellingen er forlenget, og nyttige kitosanprodukter kan gjenvinnes fra kitin svellet på denne måten i 65-1000 timer, fortrinnsvis 70-400 timer, mer fortrinnsvis 100-300 timer." Dette danner en ytterligere side av oppfinnelsen. Sett fra denne side tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av kitosan hvor fremgangsmåten omfatter å svelle partikkelformet kitin med en alkalisk oppløsning ved en temperatur under 30°C i en periode på minst 65-1000 timer, og påfølgende ekstrahering av kitosanet fra reaksjonsblandingen.

Lavtemperatursvelling omformer kitinet fra dens naturlige tilstand som inneholder krystallinske regioner adskilt av amorfe regioner til én hvori kitinet er essensielt totalt amorft. Denne omformingen, f.eks. ved 10-25°C i 10-25 N alkalioppløsning

(f.eks. 20 M NaOH), tar generelt ca. 36-80 timer. Fremgangsmåten kan følges ved å overvåke svellingen av kitinet eller ved røntgenstrålediffraksjon. Idet svellingen avsluttes begynner deacetyleringen. Generelt med én gang svelling avsluttes tar det ca. 90 timer mer for Fa å nå ca. 0,5, ca. 250 timer å nå 0,3 og ca. 600 timer å nå 0,05. Følgelig kan prosessen utføres slik at det oppnås en krevet grad av deacetylering ganske enkelt ved å selektere pH, temperatur og varighet av behandlingen med alkalisk middel. Det essensielt amorfe kitin produsert som et mellomprodukt i denne fremgangsmåten er i seg selv nytt og danner en ytterligere side av oppfinnelsen. Sett fra denne side tilveiebringer oppfinnelsen amorft (dvs. ikke-krystallinsk) kitin, særlig svellet amorft kitin. Sett fra enda en ytterligere side tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av kitosan som omfatter å reagere amorft kitin med et vandig alkalisk middel.

Kitosaner med en grad av deacetylering som er i det midtre området, fremstilt ved å bruke fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har på denne måten forhøyet vannoppløselighet ved fysiologisk eller nær fysiologisk pH og danner en ytterligere side av oppfinnelsen. Slike kitosaner kan adskilles fra de produsert ved konvensjonelle fremgangsmåter ved størrelseseksklusjonskromatografi av produktene fra deres hydrolyse med konsentrert syre. Dette er illustrert i fig. 1 og 2 1 de vedlagte tegninger i hvilke fig. 1 er et størrelseseksklusjonskromatogram av syrehydrolyseproduktet til et kitosan fremstilt ved homogen deacetylering, mens fig. 2 er et størrelseseksklusjonskromatogram av det sure hydrolyseprodukt av et kitosan fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse. Som det kan ses for produktet i henhold til kjent teknikk korresponderer toppene til monomer, dimer, trimer, etc. med progressiv reduksjon i størrelse. I kontrast viser produktet i henhold til oppfinnelsen et blokkmønster. Således sett fra en ytterligere side tilveiebringer oppfinnelsen en kitosan som har en grad av acetylering på 0,45-0,7 som-ved sur hydrolyse med 12 M HCl i 9 timer ved 40°C gir en monomer og oligomer blanding som ved størrelseseksklusjonskromatografi ikke utviser et mønster med progressivt mindre topper som korresponderer til monomerer, dimerer, trimerer, tetramerer, pentamerer og heksamerer.

Kitosanet fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes som produsert eller den kan utsettes for ytterligere kjemisk eller fysisk modifikasjon, f.eks. depolymerisering, deacetylering, acetylering, saltdannelse eller annen kjemisk derivatisering, maling, geldannelse, dannelse av oppløsning, fraksjonering, syreekstraksjon etc. Typiske eksempler på kitosanderivatisering er i stor grad beskrevet i den vitenskapelige litteratur og patentlitteraturen. Konvensjon til saltform, f.eks. ved konvensjonelle teknikker, er en foretrukket fast produksjonsbehandling. Kitosanproduktet eller modifisert produkt kan deretter anvendes i enhver av de anvendelsesområdene tidligere foreslått for kitosaner, f.eks. til fremstilling av teknologiske, landbruks-, næringsmiddel (inkludert humane næringsmidler og dyrefor og fortilsetninger), nutrasøytiskl, farmasøytiske, biomedisinske, veterinær- og kosmetiske produkter. Det er imidlertid spesielt egnet som et farmasøytisk middel eller veterinærsammensetning, næringsmiddel eller kosmetisk tilsetting.

Således sett fra en ytterligere side tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av et

kitosanprodukt i henhold til fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse til fremstilling av teknologiske, landbruks-, næringsmiddel-, nutraceutical,

farmasøytiske, biomedisinske, veterinær- og kosmetiske produkter. Sett fra enda en ytterligere side tilveiebringer oppfinnelsen et teknologisk, landbruks-, næringsmiddel-, nutraceutical, farmasøytisk, biomedisinsk, veterinær- eller kosmetisk produkt som inneholder et kitosanprodukt fra fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Publikasjonene referert til heri er herved inkorporert ved referanse.

Oppfinnelsen skal nå beskrives ytterligere med referanse til de følgende ikke-begrehsende eksempler.

Eksempel 1

Produksjon av en svreoppløselig kitosan med fraksjon av acetylerte enheter på ca.

0, 5 som en funksjon av svelletiden

Kitin isolert fra arktiske rekeskall og tilgjengelig fra Primex Ingredients ASA (Haugesund, Norge) ble brukt som råmateriale. Fremgangsmåten ble utført som følger: 1. Til 2,5 g av fint malt kitin (malt i en hammermølle til partikler mindre enn 1 mm) ble det tilsatt 43 ml 20 M NaOH. Kitinet ble deretter tillatt å svelle ved 20°C i 0-95 timer. 2. Det svellede kitin ble deacetylert i 1 time ved 60°C i natriumhydroksid

brukt for svellingen.

3. Dispersjonen ble overført til et sintret glass og vasket med varmt vann

(50-80°C) til nøytral pH.

4. Kitosanet ble tørket, veiet og analysert med hensyn på sitt innhold av syreoppløselig kitosan, som beskrevet i Ottøy et al. (supra). I tillegg ble den kjemiske sammensetningen (FA) av den syreoppløselige fraksjonen bestemt ved proton nmr-spektroskopi. Den indre viskositeten til den syreoppløselige fraksjonen ble bestemt ved pH 4,5 og en ionisk styrke på 0,1 M, som beskrevet i Draget et al.

(supra).

Resultatene er fremlagt i tabell 1 nedenfor.

Som det kan ses øker utbyttet (målt ved prosent syreoppløselig fraksjon) fra 42 % med ingen svelling til 98 % med 66 timers svelling.

Eksempel 2

Produksjon av fullt vannoppløselige kitosan med høv fraksjon av acet<y>lerte enheter

Kitinet var det samme som brukt i eksempel 1, og ble svellet som beskrevet i eksempel 1 ved 20°C i 66 timer.

Det svellede kitin ble deacetylert ved 50°C og deacetyleringstiden ble variert fra 1 -7 timer. Innholdet av syreoppløste kitosan (dvs. i 1 % vekt/volum eddiksyre), FA av dén syreoppløselige fraksjon, og den indre viskositeten til den syreoppløselige fraksjonen ble bestemt. Resultatene er fremsatt i tabell 2 nedenfor.

Som det kan ses kan den kjemiske sammensetningen (Fa) av kitosanet kontrolleres ved hjelp av deacetyleringstriden, og at produktet er hovedsakelig fullt vannoppløselig når tiden for deacetylering er tilstrekkelig til å oppnå en Fa på ca. 0,5 eller mindre.

Eksperimentet ble gjentatt med økning av deacetyleringstemperaturen til 60°C med deacetyleringstider på 1, 2 og 3 timer. Innholdet av syreoppløselig kitosan, Fa til den syreoppløselige fraksjonen, og den indre viskositeten til den syreoppløselige fraksjonen ble bestemt. Resultatene er vist i tabell 3 nedenfor.

Som det kan ses kan en fullt vannoppløselig kitosan med en høy grad av acetylering (FA = 0,51) oppnås med en deacetyleringstid på 1 time, sammenlignet med tre timer krevet ved 50°C.

Eksempel 3

Produksjon av fullt vannoppløselige kitosaner med en lav grad av deacetylering Kitinflak levert av Primex Ingredients (Finnsnes, Norge) for industriell produksjon av kitosaner ble valgt som utgangsmateriale. Det benyttede kitin var flaklignende partikler med et areal på opptil 1 -2 cm<2>og en flaktykkelse varierende mellom 20 og 200 pm. Tørrstoffinnholdet av kitinflakene var 20 vekt% mens vannfasen hadde en pH-verdi på 12 på grunn av innholdet av NaOH (akv.).

Den utførte prosedyren var som følger:

1. Kitinflak ble satt til 50 % (vekt/vekt) NaOH (akv.) ved 22°C ved et kitin:NaOH (akv.) forhold på 1:8 og svellet ved 22-27°C (idet temperaturen øket under tilsetting av kitin med lavere alkalikonsentrasjon enn 50 % (vekt/vekt) i 70 timer. 2. Det svellede kitinet ble deacetylert i 1 time ved 60°C i det samme

alkaliske middel.

3. Dispersjonen ble overført til en sikt og vasket med varmt vann (50-80°C)

til nøytral pH.

4. Kitosanet ble tørket og FA til den syreoppløselige fraksjonen ble bestemt ved 'H-NMR spektroskopi. Den indre viskositet av den syreoppløselige fraksjonen ble bestemt ved pH 4,5 og en ionestyrke på 0,1 M, som beskrevet i Draget et al.

(supra).

Resultatene er gitt i tabell 4 nedenfor.

Eksempel 4

Produksjon av fullt vannoppløselige kitosaner med en høv erad av deacetylering Kitosanflakutgangsmaterialet var det samme som brukt i eksempel 1. 1. Kitinflak ble satt til 50 % (vekt/vekt) NaOH (akv.) ved 22°C med et kitin:NaOH (akv.) forhold på 1:8. Det alkaliske middel ble presset av for å oppnå et kitin:NaOH (akv.) forhold på 1:4.

2. Kitin/alkalisk masse ble svellet i 91 timer.

3. Det svellede kitin ble deacetylert i 1 time ved 60°C ved å tilsette den presvellede kitin/alkalimasse til 50 % (vekt/vekt) NaOH (akv.) i et forhold på 1:8. 4. Den resulterende dispersjon ble overført til en sikt og vasket med varmt vann (50-80°C) til nøytral pH-verdi. 5. Kitosanet ble tørket og Fa til den syreoppløselige fraksjonen ble bestemt ved 'H-NMR-spektroskopi. Den indre viskositeten til den syreoppløselige fraksjonen ble bestemt ved pH 4,5 og en ionestyrke på 0,1 M, som beskrevet i Draget et al. (supra).

Resultatene er gitt i tabell 5 nedenfor.

Eksempel 5

Fremstilling av fullt vannoppløselige kitosaner med en lav grad av acetylering Dette eksemplet tjener til å demonstrere at fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan brukes til å produsere kitosaner sammenlignbare med de produsert ved å bruke konvensjonelle fremgangsmåter.

Kitin (som brukt i eksempel 1) blir svellet i 66 timer ved 20°C som i eksempel 1. Det svellede kitin og usvellede kitin ble deretter deacetylert i 20 M NaOH (som i eksempel 1) ved 70, 90 og- 120°C.

Resultatene er gitt i tabell 6-8 nedenfor.

Eksempel 6

Størrelseseksklusionskromatografi av hvdrolvseprodukter

Kitosan med FA 0,43 fremstilt ved den homogene deacetyleringsmetoden til Sannan et al. Macromol. Chem..177: 3589-3600 (1976) og kitosan med FA 0,46 fremstilt i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1-4 ble hydrolysen i 12 M HC1 ved 40°C i 6-11 timer. Hydrolyseproduktet ble deretter utsatt for størrelseseksklusjonskromatografi (som beskrevet av Tømmeraas et al., Carbohydrate Res. 333: 137-144 (2001)). Resultatene er vist i fig. 1 og 2 og viser et markert forskjellig mønster i topphøyde over området av topper som tilsvarer mono til heksasakkaridfragmenter. Toppene markerte 1, 2, 3, 4, 5 og 6 tilsvarende henholdsvis monosakkarid- til hepasakkaridfragmentene.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av kitosan,karakterisertved at den omfatter: a) svelling av partikulært kitin med en alkalisk løsning ved en temperatur i området -6<*>til 30 °C over en periode på minst 24 timer hvis trykk og/eller bestråling anvendes eller over en periode på minst 36 timer hvis trykk og/eller bestråling ikke anvendes; og b) deretter omsette det resulterende svellede partikulære kitin med en alkalisk løsning ved en temperatur som er minst 5 °C høyere enn nevnte svelletemperatur men ikke høyere enn kokepunktet til løsningen, hvorved deacetylering skjer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat svelling blir utført over en periode som er tilstrekkelig til å gjøre det partikulære kitinet amorft.

3. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-2,karakterisert vedat nevnte partikulære kitin er svellet med en minst 10 M alkalisk løsning.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3,karakterisert vedat nevnte partikulære kitin er svellet med en vandig minst 10 M natriumhydroksid løsning.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat nevnte partikulære kitin er svellet med en vandig minst 18 M natriumhydroksid løsning.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat nevnte partikulære kitin er svellet over en periode på 48 til 75 timer.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-6,karakterisert vedat nevnte partikulære kitin er deacetylert ved en temperatur på 45 ° til 120 °C.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-7,karakterisert vedat nevnte partikulære kitin er er a-kitin.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-8,karakterisert vedat kitosan produktet har en FA på 0.2 til 0.7.

10. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-9,karakterisert vedat kitosan produktet gjenvinnes ved vasking og eventuelt tørking av deacetyleringsproduktet.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat prosessen omfatter: a) svelling av partikulært kitin med en minst 10 M alkalisk løsning ved en temperatur i området -6 ° til 30 °C over en periode på minst 36 timer; b) økning av temperaturen til en temperatur på 45<0>til 120 °C for en forhåndsbestemt periode hvorved deacetylering skjer; c) isolering av kitosan ved vasking av det deacetylerte kitinet fra trinn b) med vann til vaskeløsningen blir nøytral; og d) eventuelt tørking og oppmaling av kitosan produktet.

12. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-11,karakterisert vedat kitosan produktet deretter er kjemisk eller fysisk modifisert.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakt nevntekitosanproduktomdannestiletkitosansalt. ' ' * ' ' < V e d «

14. Partikulært amorft kitin, karakter" . er t v e d fremstilt ved fremgangsmåten ifølge W la.atd*er