NO315184B1 - Anvendelse av en sammensetning basert på fiskemelke for fremstilling av etpreparat som öker immunoglobulinproduksjonen - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse angår en ny anvendelse av et preparat

basert på fersk eller konservert fiskemelke som er anvendelig i fremstillingen av et preparat som øker immunoglobulinnivået i serum, spesielt IgG-nivået og derved styrker immunsystemet.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Helsen og ernæringsstatusen til barn i utviklingsland er langt fra tilfredsstillende. Underernæring i alle dens former og manifestasjoner forblir en global utfordring og et stort allment helseproblem i flere land i både industrialiserte land og utviklingsland. Størrelsen og alvorlighetsgraden for dens konsekvenser er alarmerende og ødeleggende for bedre levebetingelser, levestandard og økonomi i Afrika, Asia og Latin Amerika. I de industrialiserte landene ses først og fremst underernæring hovedsakelig blant yngre barn, eldre som lever alene og individer som er avhengig av stoff og alkohol.

Det er velkjent at underernæring påvirker immunsystemet og forårsaker immunsvikt. Selv om det er oppnådd betydelig progresjon i kunnskapen om immunsystemet og dets funksjon i løpet av de siste årene er det fortsatt lite som er kjent omkring interaksjon og mekanisme mellom ernæring og immunsystemet. Utvikling og forståelse av ernæringsmessige behov og ernæringens rolle i immunfunksjon er essensiell i forebyggingen og behandlingen av ernæringsrelatert immunkompromiss (Krenitsky, 1996, Nutrition and the immune system, AACN-Clin-Issues, 7(3): 359-69). Følgelig er det et betydelig behov for nye kosttilskudd for å bekjempe underernæring og styrke

immunsystemet.

Det er antatt at en god respons på vaksiner og andre medikamenter avhenger av et fungerende immunsystem. I tillegg til underernæring er det også flere tilstander og sykdommer hvor et sterkt immunsystem er svært viktig i forhold til å redusere utviklingen og øke sjansene for helbredelse av tilstanden eller sykdommen. Illustrerende men ikke begrensende kan nevnes tilstander eller sykdommer slik som henholdsvis AIDS, ulike typer godartede og/eller ondartede tumorer, bakterielle eller virale infeksjoner, transplantasjonsavstøtning. Følgelig er det et behov for kosttilskudd og fremgangsmåter for å forbedre responsen på vaksiner og styrke immunsystemet i individer som lider av eller har en risiko for å utvikle tilstander eller sykdommer som nevnt ovenfor heri.

Det er også et behov for kosttilskudd for å styrke immunsystemet i individer som har et behov for et sterkt immunsystem som følge av f.eks. ekstremt stress, slik som idrettsutøvere.

I løpet av de siste årene har det blitt rapportert om mange preparater basert på fiskemelke, se f.eks. henholdsvis europeisk patent nr. EP-A1-729710, russisk patent nr. RU 2091073, US patent nr. 5 552 889. Frem til i dag er imidlertid intet kjent omkring hvordan immunoglobulinnivået i serum kan økes, for derved f.eks. å tilveiebringe forbedret ernæringstilstand og respons på vaksiner og andre medisiner.

Neuman et al., (1972) undersøkte de kvantitative nivåene av immunoglobuliner i flere underernærte, moderat underernærte og kontrollbarn fra Ghana sammenlignet med alderstilpassede US-standarder. Nivåene av alle Ig'ene var høyere i de alvorlig underernærte barna enn i de moderat underernærte barna og kontrollbarna. Sammenlignet med alderstilpassede US-standarder hadde selv kontrollbarna fra Ghana høyere nivåer av alle Ig'ene. Lignende studier

rapportert i litteraturen ga sammenlignbare høyere nivåer av

. immunoglobuliner i underernærte barn enn i normale barn (Bell et al., 1976, "Serum and small intestinal immunoglobulin levels in undernourished children, Am. J. Clin, Nutrl., 29: 392-97 og Suskind et al., 1976, "Immunoglobulins and antibody response in children with protein-calorie-manutrition", Am. J. Clin. Nutrl. 29: 836-41).

Revillard and Cozon, 1990, "Experimental models and mechanisms of immune defencies of nutritional origin", Food Additives and Contaminants, Vol. 7, Suppl No. 1, sider S82-S86 rapporterer at spesifikk humoral immunitet endres på flere måter ved underernæring og at serumnivåene er IgM, IgG og IgA, og immunoglobulinsyntesen vanligvis er normal eller økt. Revillard og Cozon, 1990, indikerer også at den katabolske hastigheten av gammaglobuliner økes gjennom infeksjoner. Imidlertid blir den økte katabolske hastigheten kompensert for ved økt syntese. Videre returnerer immunoglobulin-nivåene til det normale etter ernæringsmessig rehabilitering og antimikrobiell terapi.

I en serie studier utført på barn fra Ghana ble det også vist at supplementering av lokal frokostblandingbaserte dietter med fiskepulver resulterte i en økning i IgG-, IgM- og IgA-konsentrasjoner i serum (Tetteh-Tuwor, 2000; Adu-Affawuah, 1998).

Videre har Navarro et al (1999), BioFactors, vol. 10, side 67-76 undersøkt effekten av nukleotidtilskudd i en melkesammensetning på lymfocyttnivået og nivået av IgG, IgM og IgA hos fortidlig fødte barn. Barna ble gitt et tilskudd omfattende ribonukleotider (CMP, AMP, UMP, GMP og IMP) og man søkte å etterligne mengden åv syreløselige nukleotider som finnes i human morsmelk. Resultatene frå denne undersøkelsen viste at ribonukleotidtilskudd ikke ga noen signifikant forskjell i IgG nivået.

Også Jyonouchi (1994) J. Nutrition, vol. 124, side 138-143 og Martinez-Augustin et al.(1997), Biol.Neon., vol. 71, side 215-223 har søkt å undersøke ribomikleotiders betydning for immunsystemet hos fortidlig fødte barn.

De foreliggende oppfinnere har nå overraskende funnet at kosttilskudd omfattende et preparat basert på fiskemelke anvendt ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer økte serumnivåer av immunoglobuliner. Videre har de foreliggende oppfinnere funnet at nevnte kosttilskudd gir høyere serumnivåer av immunoglobulin G (IgG).

Følgelig tilveiebringer tilsetting av et preparat omfattende en ■ sammensetning basert på fiskemelke anvendt ifølge den foreliggende oppfinnelse til dietten til underernærte mennesker et bedre immunforsvar vist gjennom sterkere immunrespons og høyere serumnivåer av immunoglobuliner slik som IgG. Videre tilveiebringer tilsetting av nevnte preparat ifølge den foreliggende oppfinnelse til dietten til underernærte mennesker en forbedret respons på vaksiner og andre farmasøytiske preparater.

Økningen i immunoglobulinnivået etter regulært inntak av en proteinrik diett supplementert med et preparat basert på fiskemelke anvendt ifølge den foreliggende oppfinnelse er overraskende siden

immunoglobulinnivået sank etter inntak av den samme dietten uten slik supplementering, og i betraktning av at dette siste resultatet er hva fagmannen på området ville ha forventet med henvisning til den tidligere publiserte litteraturen (Revillard og Cozon (1990)).

Definisjoner

Uttrykket "sammensetning basert på fiskemelke" anvendt heri betyr en sammensetning omfattende vesentlig rent DNA eller fragmenter derav og fysiologiske og farmasøytisk akseptable salter derav.

Uttrykket "DNA-pulver" anvendt heri nedenfor betyr en sammensetning basert på fiskemelke som definert ovenfor.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i en utførelsesform en ny anvendelse av en sammensetning basert på fiskemelke for fremstilling av et preparat for å øke immunglobulinproduksjonen i ikke-premature pattedyr.

In en foretrukket utførelsesform omfatter oppfinnelsen en anvendelse av en sammensetning basert på fiskemelke for fremstilling av et preparat for å øke IgG-produksjonen i ikke-premature pattedyr.

I en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny anvendelse hvori dyrets generelle helsetilstand/ernæringstilstand forbedres.

I ytterligere en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny anvendelse hvori dyrets vekt og utvikling reguleres.

I ytterligere en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny anvendelse hvori dyrenes respons på vaksiner eller andre farmasøytiske preparater økes.

I ytterligere en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny anvendelse hvori nevnte preparat fortrinnsvis inneholder hovedsakelig rent DNA eller fragmenter derav. Videre omfatter preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis omtrent 0,5 % DNA natriumsalt. Det er videre foretrukket at nevnte DNA-natriumsalt er vesentlig rent og/eller inneholder i det minste ikke mer enn 2 % protein.

I ytterligere en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny anvendelse hvori preparatet fortrinnsvis er et farmasøytisk preparat, henholdsvis et kosttilskudd, et matadditiv eller et foradditiv. 1 enda en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny anvendelse, hvori pattedyret er et menneske.

Eksempler

1. Materialer og metoder

1. 1 DNA- kilder

DNA-natirumsaltet oppnås fra naturlig forekommende kilder slik som milt eller melke fra fisk. DNA kan ekstraheres fra fiskemelke ved hjelp av isoleringsfremgangsmåter som er kjent i teknikkens stand hvilket gir et vesentlig rent produkt inneholdende DNA-natriumsalt med mindre enn 2 % protein. Produktet er et hvitt eller kremfarget pulver. Renhet målt ved hjelp av spektrometri gir OD260/OD28O= min. 1.7. DNA-natriumsaltet har en molekylvektsfordeling på 4 x IO<4>- 1 x IO<6>Daltons og en hyperkromisitet på OD2«>(denaturert)/OD26o(nativ) = maks. 1,05.

I studien beskrevet nedenfor heri ble 0,5 % DNA-natriumsalt fremstilt av Bjørge Biomarin A/S, Norge anvendt for å fremstille DNA-kosttilskuddet ifølge den foreliggende anvendelse i henhold til oppfinnelsen.

Studiedesign

Studien var en enkel blind randomisert befolkningsgruppebasert studie. Studiesetet var Nima, en omkringliggende urban slum nær Accra, hovedstaden i Ghana. Studiesubjektene var bam i alderen 3-5 år valgt ved tagning av vekt og høydemålinger. Bam som deltok i studien hadde vekt-for-høyde z-mål under eller lik -1SD. De kvalifiserte barna ble fordelt på to grupper ved hjelp av tilfeldig lagdeling ved hjelp av tilfeldige talls tabell. Lagdelingen ble utført for kjønn og alder. De to forskjellige gruppene var basert på de to ulike anvendte diettene indikert i tabellen nedenfor. Gruppe 1 bestod av 74 bam og gruppe 2 av 70 bam. Bjørge Biomarin A/S, Norge fremstilte fiskeproteinet og Na-DNA-pulvere anvendt ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Like porsjoner av tomat, løk, pepper og krydder ble stekt i like porsjoner

av vegetabilsk olje for å fremstille sausen for de to ulike gruppene. Den eneste forskjellen var at den første gruppen kun hadde fiskepulver mens gruppe 2 hadde DNA i tillegg til fiskepulver. Diettene ble fremstilt for i

det minste å tilveiebringe det anbefalte daglige inntaket (RDA) av protein for bam slik at den supplementerte maten ville tilveiebringe dagskravet om de ikke spiste noe protein i det hele tatt i løpet av dagen. Bama ble gitt mat til lunsj ad libitum. Matingen varte i 7 uker.

Proteininnholdet i fiskepulveret (gruppe 1) og blandingen av fisk og Na-DNA-pulvere (gruppe 2) var henholdsvis 88,96 % og 84,68 % på tørrstoffbasis. Proteininnholdet i dietten til gruppe 1 var mer (18,06 %)

enn i gruppe 2 (17,39) fordi fiskepulveret for gruppe 2 hadde lavere

proteininnhold som følge av tilsettingen av 5 % DNA. DNA i dietten tilfører nitrogeninnholdet generelt men ikke proteininnholdet i dietten.

Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i inntaket av diettene i de to gruppene.

1. 3 Immunologisk analyse av blodprøver

Venøst blod opptil 10 ml ble samlet fra høyre eller venstre arm på hvert barn ved hjelp av fem godt trenede og kvalifiserte blodprøvetakere og én lege fra universitetssykehuset, "Legon and Nugouchi Memorial Research Institute", Legon, Ghana. Blodprøvene ble umiddelbart sentrifugert og de høstede serumprøvene ble transportert under ispakker i en iskiste til "the Department of Nutrition and Food Science", universitetet i Ghana, Legon, hvor de ble fryst. Ved slutten av studien ble alle serumprøvene sendt til Broegelmans forskningslaboratorium for immunologi og

mikrobiologi, universitetet i Bergen, Norge, under, tørris i en iskiste og lagret ved -20°C inntil de ble analysert.

Omtrent 300 serumprøver ble sendt til laboratoriet for analyse. Prøvene ble analysert for ulike immunoglobuliner slik som IgG, IgA, IgM og IgE. I alle tilfellene ble en metode velkjent for fagmannen på området, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay, ELISA anvendt.

Ved hjelp av et dataprogram (Softmax for Macintosh, versjon 2,3, "Molecular Devices Corporation", Sunnyvale, CA, USA) var det mulig å plotte en standardkurve i fire parametermodus og resultater i optisk tetthet ble omdannet til immunoglobulinverdier. På denne måten ble serumimmunoglobulinene uttrykt i mg/ml. Alle prøver ble analysert i duplikat for hvert immunoglobulin. Prøver med koeffisientvariasjon mellom duplikater på 15 og over ble repetert for å sikre nøyaktige resultater.

2. Resultater

2. 1 Effekt på serumnivåer av immunoglobuliner

IgG-, IgM- og IgA-nivåer i serumprøver fra barn i nevnte studie ved basislinje var innenfor området som var rapportert for normale bam fra Ghana (Adu-Affawuah, 1998 og Neuman et al., 1975, "Immunologic respons in malnourished children", Am. J. Clin. Nutr., 28: 89-104). Siden Neumans studie involverte bam opp til 6 års alder som omfatter aldersområdet anvendt i den foreliggende studie kan resultatene av serumnivået til lg'ene nevnt ovenfor i de undersøkte barna ved basislinjen sies å være pålitelig. Dette uten hensyn til det faktum at ELISA-metoden som anvendes, som enhver annen analyttisk laboratoriemetode, var antatt å ha sine egne eller assosierte feil, men siden det ble utøvd stor forsiktighet gjennom analysen ble enhver slik feil redusert til nær sagt det minimale. Ved basislinjen ble gjennomsnittlig serum IgG-konsentrasjon til barn i gruppen som mottok kun fiskepulver funnet å være 12,087/ml + 2,68, og 10,91 mg/ml + 4,23 for barna som mottok fiske- og DNA-pulver. En signifikant studenfs t-test viste imidlertid at forskjellen ikke var statistisk signifikant (p>0,05). De gjennomsnittlige serumkonsentrasjonene av IgM og IgA var nesten sammenlignbare for begge grupper.

Den generelle helsen til bama i begge grupper forbedret seg dramatisk gjennom perioden med supplerende mating. Antallet barn som ble rapportert syke til klinikkene sank ettersom antallet uker med supplering økte. Det var en drastisk nedgang i antall barn med hudutslett og rennende nese ved slutten av den supplerende matingen. Det er følgelig ingen tvil om at supplering av ris med både fiskepulver og blandingen av fiske- og DNA-pulver forbedret helsestatusen til barna.

Det er viktig å bemerke at siden serumkonsentrasjonene av de ulike immunoglobulinene bestemt ved hjelp av ELISA-prosedyren ved basislinjen ble funnet å være pålitelig kan det med sikkerhet sies at resultatene etter supplering på samme måte er pålitelige og følgelig kan de anvendes for å konkludere. Siden bama i de to gruppene også ikke var signifikant forskjellige (statistisk) med hensyn til serumnivåene av immunoglobulinet ved basislinjen kan enhver forskjell i deres nivåer av immunoglobuliner etter supplementering være forårsaket av forskjellen i de supplerte diettene..

Som nevnt ovenfor tidligere har det i serier av studier utført med bam fra Ghana blitt vist at supplering av lokal frokostblandingbaserte dietter med fiskepulver resulterte i en nedgang i IgG-, IgM- og IgA-konsentrasjoner i serum (Tetteh-Tuwor, 2000Adu-Affawuah, 1998).

I studien rapportert heri ble supplering med fiskepulver alene funnet å resultere i en signifikant nedgang i IgG-konsentrasjon og dette er i overensstemmelse med resultatene av tidligere studier nevnt ovenfor.

Effekten av supplering på serumnivået av immunoglobuliner i gruppe 1 er sammenfattet i tabell 2 nedenfor.

I gruppen som bare fikk fiskepulver (gruppe 1) var det en signifikant nedgang (p<0,05) i gjennomsnitt i IgG-nivået, svarende til 14,3 % i

.forhold til basislinjenivået, en signifikant økning i det gjennomsnittlige IgM-nivået (p=0,03) og en ikke-signifikant økning i gjennomsnittlig

IgA- og IgE-nivåer (p>0,05).

I gruppe 2 ble en signifikant økning i serum IgG-konsentrasjonen demonstrert. Dette svarer til 25 % i forhold til basislinjenivået. Denne signifikante økningen i IgG-konsentrasjonen og økningen i nivåene av de andre lg'ene i serumprøvene til barna (selv om de ikke var statistisk signifikante) foret med dietten supplert med et preparat omfattende hovedsakelig DNA fra fiskemelke kan uten tvil sies å skyldes nærværet av DNA. Den eksakte mekanismen som forklarer dette fenomenet er foreløpig ikke kjent.

Effekten av suppleringen på serumnivåene av immunoglobuliner i

gruppe 2 er sammenfattet i tabell 3 nedenfor.

For alle de analyserte immunoglobulinene i denne studien var det høyere økning i nivåene i serumprøvene fra barn foret med DNA-pulver supplert diett (gruppe 2) enn de matet med ikke-DNA-pulverdiett (gruppe 1). En mer dramatisk observert forskjell, som var svært statistisk signifikant,

var nedgangen i IgG-nivået i gruppe 1 mens det var en økning av den lg i gruppe 2.

Den signifikante forskjellen mellom IgG-nivåer i de to gruppene etter supplering må være forårsaket av den ytterligere suppleringen av dietten for gruppe 2 omfattende DNA fra fiskemelke.

I gruppen som fikk DNA-pulver (gruppe 2) var det en signifikant økning i IgG-nivået (p>0,05) og økninger i IgM-, IgA- og IgE-nivåer som ikke var statistisk signifikante.

Mens det var en nedgang i IgG-konsentrasjonen i serumprøver fra barn i gruppe 1 var det en økning i gruppe 2. Den ikke signifikante økningen av IgA, IgM og IgE kan være forårsaket av lite prøvemateriale. Imidlertid hadde økningen av IgA-konsentrasjonen i barn i gruppe 2 en p-verdi på 0,0577. Dette betyr at man med 94 % sikkerhet kan si at økningen i IgA-konsentrasjonen i DNA-gruppen var signifikant.

Tabell 4 viser gjennomsnittlige endringer i serum

immunoglobulinkonsentrasjoner i barna i de to gruppene etter supplementert mating. Det er viktig å bemerke at mens det var en signifikant nedgang i IgG-nivået i ikke-DNA^gruppen var det en signifikant økning i nivået av det samme immunoglobulinet i DNA-gruppen.

En Studenfs t-test av forskjellene mellom de to gruppene viste en svært høy signifikant p-verdi som var under 0,01. Siden det ikke var noen forskjell mellom de to gruppene ved basislinjen med hensyn til IgG betyr det at forskjellen etter supplementert mating er forårsaket av forskjellene i diettene. Økningen i konsentrasjonene til de andre lg'ene (IgM, IgA og IgE) etter supplementert mating var fortsatt større i gruppe 2 enn i gruppe 1 selv om forskjellene ikke var statistisk signifikante i alle de tre tilfellene (p>0,05). Det økte IgA-nivået i barna i gruppe 2 hadde en p-verdi på 0,0577, tilsvarende til et konfidensnivå på 94 %.

Imidlertid er det verdt å nevne at tilsettingen av DNA-pulveret til dietten forårsaket en effekt i immunoglobulinnivåene og forskjellene mellom de to gruppene kunne ikke påvises statistisk i tilfelle av de andre tre immunoglobulinene sannsynligvis som følge av lite prøvemateriale.

Følgelig resulterte mating av bam med en

fiskeproteinpulversupplementert diett i 7 uker i en signifikant nedgang i deres serum IgG-konsentrasjon, mens mating av bam med et fiskeproteinpulver pluss en supplert diett omfattende DNA-pulver isolert ira fiskemelke resulterte i en signifikant økning i deres serum IgG-nivå;

sistnevnte indikerer at DNA-supplering forbedrer kroppens evne til å syntetisere antistoffer og indikerer et forbedret forsvar mot infeksjoner.

Resultatene som presenteres heri støtter at den foreliggende anvendelse av et preparat basert på fersk eller konservert fiskemelke ifølge oppfinnelsen er anvendelig for å øke immunoglobulinnivået i serum ifølge den. foreliggende oppfinnelse og følgelig styrke immunsystemet og responsen på vaksiner og/eller andre farmasøytiske preparater. Spesielt bekrefter disse resultatene den foreliggende oppfinnelses anvendelighet ved økning av serum IgG-nivået.

Claims (14)

1. Anvendelse av en sammensetning basert på fersk eller konservert fiskemelke for fremstilling av et preparat for økning av immunglobulinproduksjonen i ikke-premature pattedyr.

2. Anvendelse av en sammensetning basert på fersk eller konservert fiskemelke for fremstilling av et preparat for økning av IgG-produksjonen i et pattedyr.

3. Anvendelse ifølge kravene 1 og 2, hvorved dyrets generelle helsetilstand/ernæringstilstand bedres.

4. Anvendelse ifølge kravene 1 og 2, hvorved dyrets vekst og utvikling reguleres.

5. Anvendelse ifølge kravene 1 og 2, hvorved responsen på vaksiner eller andre farmasøytiske midler økes.

6. Anvendelse ifølge kravene 1-5, hvori nevnte sammensetningen fortrinnsvis inneholder hovedsakelig rent DNA eller fragmenter derav.

7. Anvendelse ifølge kravene 1-6, hvor nevnte sammensetning omfatter omtrent 0,5 % DNA-natriumsalt.

8. Anvendelse i følge krav 7, hvor nevnte DNA-natriumsalt er i det vesentlige rent.

9. Anvendelse i følge krav 8, hvor nevnte DNA-natriumsalt ikke inneholder mer enn omtrent 2 % protein.

10. Anvendelse ifølge kravene 1-10, hvor preparatet er et farmasøytisk preparat.

11. Anvendelse ifølge kravene 1-11, hvor preparatet er et kosttilskudd.

12. Anvendelse ifølge kravene 1-11, hvor der preparatet er et mat varetil s etningsmiddel.

13. Anvendelse ifølge kravene 1-12, hvor preparatet er et fortilsettingsmiddel.

14. Anvendelse ifølge hvilke som helst av de foregående krav hvor dyret er et menneske.