NO175534B - Analogifremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt derivat av GHL - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt derivat av GHL;Cu med den generelle formel:

[X-L-histidyl-L-lysin-C(=0)-R] : kopper(II),

hvori X er glycyl, og R er Ci-C^ alkoksy, C6-C12-aryloksy, L-prolyl-L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin eller L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin.

Mekanismer for sårhelende reparasjon av vev i mennesker og andre pattedyr er ofte utilfredstillende og ufullstendige. Forsinket helbredelse øker markert hospitaliseringskostnadene, og såret fortsetter ofte som et kronisk sår som krever utstrakt tilsyn og medisinsk omsorg for å kontrollere infeksjon og nekrose av vev. Selvom slike sår til slutt heles, er "sår-området" ofte uten evne til å reagere på følbare stimuli, og blir ofte fyllt for store avleiringer av kollagen som fører til permament arrdannelse. Behovet for forbedrede sårhelingsblandinger omfatter også sår som skyldes kirurgisk behandling. For eksempel, skjønt kosmetisk kirurgi er et av de raskest voksende medisinske spesialitetsområdene, er resultatet av slike fremgangsmåter begrenset av hvor god helingen er i det typisk voksne og eldre klientellet.

Dessuten mislykkes ofte hårtransplantasjoner p.g.a. util-strekkelige blodforsyninger omkring transplantatet. Øket heling og neovaskularisering av transplantatet ville øke etableringen av innpodingen.

Hurtigheten av gjenetableringen av et biologisk dekke på sårflåtene er et kritisk element i helingsprognosen. Naturlige åpne sår blir først dekket av blod og plasma som tørker for å danne den opprinnelige "ruen" som dekker et sår. Dette skorpe-aktige laget danner et korttids-beskyttende dekke mot fremmede elementer, mens helingen foregår under dette dekket.

For langtids-dekking av store sår tyr kirurgene ofte til transplantering, hvori et tynt stykke av overflatehud (som

kalles en "hud-innpoding med splittet tykkelse") blir innpodet over såret for å danne øyer av hudceller som kan gro over hele overflaten. Dypere hudsår krever ofte en større hudtransplan-

tering (som kalles en "hudlapp av full tykkelse") hvori den komplette huden ned til muskellagene blir flyttet for å dekke et sår. Hudlapper av splittet tykkelse hemmes av den lave graden av kirurgisk "take". Typisk vil bare omlag 20 til 40 % av den transplanterte huden reetablere seg med hell på det nye stedet. Hudlapper med full tykkelse er ennu vanskeligere å reetablere på et nytt sted. Kirurgene blir vanligvis tvunget til å etterlate den ene enden av hudlappen knyttet til en blodforsyning, mens den andre enden blir strukket til det nye stedet for å syes på plass. Bare etter at den transplanterte enden av hudlappen har skaffet seg en ny blodforsyning, blir den andre enden av hudlappen flyttet til det nye stedet for å gjøre transplanteringen fullstendig. Slike fremgangsmåter resulterer ofte i utstrakt tap av vev og ytterligere smerter og lidelser for pasienten.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å øke dannelsen av en naturlig biologisk bandasje, sammensatt i det vesentlige av serumproteiner. De bringes en terapeutisk aktiv mengde på såret.

På liknende måte kan man øke reetableringen av frie hudinnpodinger med full tykkelse hos varmblodige dyr eller øke etableringen av hudinnpodinger med splittet tykkelse hos varmblodige dyr.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen administreres da til hudinnpodingen.

Videre kan de fremstilte forbindelser brukes for å øke hastigheten av sårlukkingen hos varmblodige dyr. Det administreres til såret en effektiv mengde av en blanding omfattende et derivat av GHL-Cu som beskrevet ovenfor.

Når blandingene infiltreres eller injiseres med fysiologisk saltløsning som beskrevet heri, vil en passende konsentrasjon omfatte fra omlag 0,1 til 5 mg GHL-Cu-derivat pr. ml bærer.

Forbindelsene fremstilles ifølge oppfinnelsen ved at

a) når R er valgt fra C^-C^ alkoksy eller C6-C12 aryloksy,

1) kopling av en beskyttet lysinester eller -keton til

et beskyttet histidin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av en beskyttet histidyl-lysin-ester eller

-keton,

2) kopling av den beskyttede histidyl-lysin-ester eller -keton til et beskyttet glycin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av en 'beskyttet glycyl-histidyl-lysin-ester eller -keton,

3) fjerning av beskyttelsesgruppene under dannelse av

en glycyl-histidyl-lysin-ester eller -keton, og

4) kompleksering av dette med kopper(II), eller

b) når R er valgt fra L-prolyl-l-valyl-L-fenylalanyl-L-valin eller L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin, 1) kopling av et beskyttet valin med et beskyttet fenylalanyl ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet fenylalanyl-valin, 2) kopling av det beskyttede fenylalanyl-valin med et beskyttet valin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet valyl-fenylalanyl-valin, 3) eventuelt kopling av det beskyttede valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet prolin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, 4) kopling av enten det beskyttede valyl-fenylalanyl-valin eller det beskyttede prolyl-valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet lysin ved bruk av et koplingsmiddel under dannelse enten av et beskyttet lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et beskyttet lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, 5) kopling av enten det beskyttede lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller det beskyttede lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet histidin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet histidyl-lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et beskyttet histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, 6) kopling av det beskyttede histidyl-lysyl-valyl-

fenylalanyl-valin eller det beskyttede histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet glycin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av enten et beskyttet glycyl-histidyl-lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et beskyttet glycyl-histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin,

7) fjerning av beskyttelsesgruppene under dannelse av

enten et glycyl-histidyl-lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et glycyl-histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, og

8) kompleksering av dette med kopper (II).

Andre aspekter av den foreliggende oppfinnelsen vil frem-komme ved referanse til den følgende detaljerte beskrivelsen og vedlagte tegninger. Figur IA er et fotografi av et biologisk dekke over et kirurgisk sår. Figur IB er et fotografi av et biologisk dekke over et kirurgisk sår behandlet en representativ blanding fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 1C er et fotografi av et sårdekke over en huddefekt i full tykkelse, i en kontrollgruppe av mus. Figur ID er et fotografi av et sårdekke over en huddefekt av full tykkelse i en gruppe mus behandlet med en representativ blanding. Figurene 2A og 2B er fotografier av hudinnpodinger i full tykkelse; Figur 2A er en kontroll (hvor hudinnpodingen ikke lyktes), og 2B er en hudinnpoding behandlet med en representativ blanding. Figurene 3A og 3B er fotografier som illustrerer etablering av hudinnpodinger med splittet tykkelse hos varmblodige dyr; Figur 3A er en kontroll og 3B er en hudinnpoding behandlet med en representativ blanding. Figur 4 er et diagram som illustrerer virkningen av representative blandinger på hastigheten av sårlukkingen. Figur 5 er et diagram som illustrerer den aksellererte hastigheten av sårlukkingen hos mus behandlet lokalt med krem som inneholder de fremstilte forbindelser. Figurene 6 og 7 demonstrerer helingshastigheten for vene-stasesår og diabetiske sår hos mennesker, behandlet lokalt med kremer som inneholder de fremstilte forbindelser. Figur 8 er et fotografi som illustrerer det tykkere biologiske dekket og sårlukkingen som fremkalles i en hest ved lokal behandling med en krem som inneholder glycyl-L-histidyl-L-lysin:Cu. Anvendelsen av GHL-Cu-derivater beskrevet heri er nyttige ved (a) etablering av et tykkere biologisk dekke over sår; (b) reetablering av frie hudlapper med full tykkelse; (c) etablering av hudinnpodinger med splittet tykkelse; og (d) øking av hastigheten ved sårlukkingen.

GHL-Cu-derivatene beskrevet heri kan også anvendes sammen med andre faktorer som er rapportert å skulle forbedre andre sider ved helingen. På denne måten kan oppnås en synergistisk virkning som gir en klinisk effektivitet som er bedre enn den som er oppnås med en hvilken som helst enkelt faktor. Dessuten, mens de blandingene som er beskrevet heri vil stimulere et spektrum av helingsprosesser, vil kliniske sår ofte variere betydelig i sine egenskaper og helingsmønstre, hvilket leder en til å utnytte en kombinasjon av en blanding beskrevet heri, og andre faktorer. For eksempel er nerve-regenereringen ødelagt i mange brannsår, og man kan derfor tilsette en spesiell nervevekst-faktor til GHL-Cu-derivatet, for å øke gjenveksten av nervene til det brente området.

Eksempler på faktorer med andre rapporterte helende egenskaper omfatter epidermal vekstfaktor, fibroblast vekstfaktor, nervevekstfaktor, de transformerende vekstfaktorene a og /?, en hvilken som helst av flere angiogene vekstfaktorer, heparin, fibronektin, fibrin, blodplateavledet vekstfaktor, enzymatisk superoksyd-dismutase, ekstrakter av blod eller faktorer fra blodet, og andre lignende faktorer. I tillegg kan GHL-Cu-derivater også anvendes til å hjelpe til med in vivo etableringen av biologiske kulturer av hudceller.

Med de foreliggende derivater kan man anvende et forhold av GHL-derivat til kobber på 1:1 eller 2:1. Innenfor en foretrukket utførelse forekommer optimal heling imidlertid med et forhold på 0,50:0,75 kobberatomer pr. GHL molekyl. Kobber i molart overskudd i forhold til GHL (>1,00) er løst bundet, og kan forsinke helingen siden det antas at frie kobbersalter tiltrekker seg betennelsesceller så som neutrofiler.

I sår som er behandlet med GHL-Cu-derivater fremstilt heri er det et større flytende (serumlignende) eksudat over sårene. De behandlede sårene har et "fuktigere" utseende, og det skorpe-aktige laget som danner seg over såret er vesentlig tykkere. Dette fenomenet opptrer etter lokal injeksjon, og også når høye konsentrasjoner tilføres lokalt til en nylig dannet kirurgisk defekt. I teorien kan man forestille seg at et slikt fenomen kunne komplisere helingen av brannsår ved å øke skorpedannelsen over såret. Imidlertid er noen av de beste resultatene blitt observert ved heling av brent (100°C) vev. Dette skyldes sannsynligvis for en stor del det faktum at GHL-Cu-derivatene forårsaker tiltrekning av makrofager som hjelper til å fjerne brannskorpen, til tross for det økte eksudatet over det brente området. Dessuten, siden migrer-ingen av hvite celler inn i såret blir forsinket i brent vev, kan en tilstrekkelig innstrømming av hvite celler være mere kritisk ved helingen av brannsår, enn mengden av eksudat.

Som bemerket ovenfor, er forbindelsene fremstilt i den foreliggende oppfinnelse nyttige til å etablere et tykkere biologisk dekke over sårene. Det første dekket over et friskt sår er et tynt dekke som dannes av det blod og serum som tørker over såret. Siden det ofte tar flere døgn før et tykt biologisk dekke danner seg over et sår eller et skrubbsår, er forbindelsene verdifulle til å beskytte såret for infeksjon og ytterligere blodtap, ved dannelsen av et tykkere biologisk dekke.

Bruk av GHL:Cu-derivatene til å øke dannelsen av en tykk, beskyttende skorpe ved lokal anvendelse, kan være nyttig ved helingen av hester med piggtråd-kutt, hvor sårene er svært vanlige og den tynne huden på hestene gjør det svært.vanskelig å sy. Hos mennesker vil anvendelsen av disse forbindelsene på et åpent sår av "skrubbsårtypen" frembringe en tykkere, mer beskyttende skorpe over såret.

I tillegg er de foreliggende forbindelser også nyttige ved reetablering av frie hudlapper av full tykkelse hos varmblodige dyr. Hudlapper av full tykkelse er nødvendig ved mange rekonstruktive kirurgiske prosedyrer. På grunn av vanskelighetene ved å flytte hudlapper av full tykkelse, er den vanlige fremgangsmåten å etterlate en ende av hudlappen knyttet til en blodforsyning, mens den andre enden av lappen blir sydd fast til den kroppsdelen som skal dekkes. Bare etter at den flyttede delen av hudlappen har etablert en ny blodforsyning, kan deri andre enden av hudlappen flyttes til det nye stedet. Disse omstendelige metodene er kirurgisk vanskelige, og deler av de transplanterte hudlappene dør ofte før nye blodkar kan mate de transplanterte hudlappene på tilstrekkelig måte. De fremstilte forbindelser øker betydelig effektiviteten av hudlapp-transplantasjoner, og har derfor betydelig praktisk verdi.

På lignende måte er forbindelsene nyttige ved etablering av hudinnpodinger med splittet tykkelse. Slike innpodinger anvendes til å overføre deler av huden fra en del av pasientens kropp til et område hvor huden er blitt ødelagt ved forbrenning, skrubbsår eller annen skade. Vanligvis blir imidlertid bare en liten del av den transplanterte huden etablert på det nye området. Forbindelsene øker i vesentlig grad mengden av etablert hud ved denne typen av transplan-ter ing.

Effektiviteten av de blandingene som er beskrevet heri ved tranplantering av hudinnpodinger med splittet tykkelse og hudlapper av full tykkelse, gjør disse blandingene verdifulle også ved transplantering av andre typer av organer, så som nyrer og hjerter. Andre forbindelser med superoksyddismutase-aktivitet, så som proteinsuperoksyddismutase, et protein med en molekylvekt på 32.000 er blitt brukt for å forbedre trans-planter ingen av hudlapper, hjerter, nyrer og andre organer. Proteinsuperoksyddismutase virker til å forbedre transplante-rings-"take", ved å beskytte vevet fra en ischemia/reper-fusjonsskade etter gjenopprettelsen av blodstrømmen til vevene. Kort fortalt, når hypoksisk vev gjenoppretter normal blodstrøm, vil det overprodusere superoksydanion ("toksisk oksygen"), og forbindelser med superoksyddismutase-aktivitet kan detoksifisere dette toksiske oksygenet før det forårsaker celleødeleggelse. Disse resultatene antyder dessuten at GHL-Cu-derivater også ville beskytte mot midlere grader av vevs-ødeleggelse p.g.a. ischemia/reperfusjonsskader, så som de som opptrer etter myocardialt infarkt, skader i bløtt vev, akutte skader i ryggsøylen og hemming av blodstrømmen til andre organer i kroppen.

Farmasøytiske preparater som inneholder GHL:Cu-derivater fremstilt ifølge oppfinnelsen kan være i form av væsker, lotioner, kremer eller geler. En effektiv dosering av preparatet omfatter omlag 0,05 til omlag 10 vekt% av GHL:Cu-derivater. Det foretrukne området er omlag 0,1 til 0,5 vekt%.

Det farmasøytiske preparatet kan inneholde 0,5 % til 5 % av et emulgerende eller overflateaktivt middel. Ikke-ioniske overflateaktive midler foretrekkes. Eksempler på egnede ikke-ioniske overflateaktive midler omfatter nonylfenoksypoly-etoksyetanol (Nonoxynol-9), polyoksyetylenoleyleter (Brij-97), forskjellige polyoksyetylenetere (Tritoner) og blokk-kopoly-merer av etylenoksyd og propylenoksyd med forskjellige molekylvekter (f.eks. Pluronic-68). I tillegg til, eller i stedet for, de emulgerende eller overflateaktive midlene, kan de farmasøytiske preparatene inneholde omlag 1 til omlag 20 % av et penetrasjonsøkende middel. Eksempler på penetrasjons-økende midler omfatter dimetylsulfoksyd (DMSO) og urea. I tilfelle et flytende farmasøytisk preparat som skal anvendes lokalt, kan konsentrasjonen av et penetrasjonsøkende middel, så som dimetylsulfoksyd (DMSO), omfatte omlag 30 til omlag 80 % av det farmasøytiske preparatet. Resten av det farmasøyt-iske preparatet omfatter en inert, fysiologisk akseptabel bærer eller fortynner. Denne bæreren virker fortrinnsvis ikke sammen med de aktive bestanddelene, og reduserer heller ikke effektiviteten av GHL:Cu-derivatene.

Egnede bærere omfatter, men er ikke begrenset til, vann, fysiologisk saltløsning, bakteriostatisk saltløsning (salt-løsning som inneholder 0,9 mg/ml benzylalkohol), og petrolat-baserte kremer, USP hydrofile salver og lignende kremer, f.eks. Unibase, Parke-Davis).

De følgende er representative eksempler på egnede farma-søytiske preparater, som kort beskrevet ovenfor:

Farmasøytisk preparat A:

Farmasøytisk preparat B:

Farmasøytisk preparat C:

Lokal administrering av de farmasøytiske preparatene kan utføres ved å tilsette en mindre mengde av blandingen direkte til såret og området omkring såret. I det vesentlige er en hvilken som helst mengde av preparatet som er tilstrekkelig til å dekke sårområdet, vanligvis effektiv, og behandlingen kan gjentas så ofte som fremgangen i helingen krever.

Alternative fremgangsmåter for anvendelse omfatter påsprøyting på eller injeksjon av løsninger av GHL:Cu-derivatene (som beskrevet ovenfor), i akseptable farmasøytiske preparater, til såret og området omkring såret.

For å sammenfatte eksemplene som følger, illustrerer eksempel 1 syntesen av glycyl-L-histidyl-L-lysinbenzylester: kobber(II).

Eksempel 2 viser syntesen av glycyl-L-histidyl-L-lysin n-oktylester: kobber(II).

Eksempel 3 illustrerer (A) syntesen av glycyl-L-histidyl-L-lysin n-stearylester: kobber(II), og (B) dens syntese ved en alternativ fremgangsmåte. Basert på hvilken som helst av fremgangsmåtene kan en spesi-alist på området substituere n-palmitylakohol (16 karbon-atomer) i stedet for en stearylalkohol (18 karbonatomer) for å få glycyl-L-histidyl-L-lysin n-stearylester: kobber(II).

Eksempel 4 illustrerer syntesen av glycyl-L-histidyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin: kobber(II) og glycyl-L-histidyl-L-lysyl-L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin: kobber(II). Så følger eksempler på anvendelser av de fremstilte forbindelser.

Eksempel 5 demonstrerer etableringen av et tykkere biologisk dekke over et sår.

Eksempel 6 demonstrerer gjenopprettelsen av frie hudinnpodinger av full tykkelse.

Eksempel 7 demonstrerer gjenopprettelsen av hudinnpodinger med splittet tykkelse.

Eksempel 8 demonstrerer økning av hastigheten av sår-lukkingen hos varmblodige dyr.

Eksempel 9 og 10 viser fremgangsmåter til å aksellerer sårlukkingen hos varmblodige dyr ved bruk av kremer for lokal anvendelse.

Eksempel 11 demonstrerer anvendelsen av en representativ blanding fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen ved behandling av sår hos hester.

EKSEMPLER

Fremstillin<g> av GHL- Cu for anvendelse på dyr

GHL ble renset ved oppløsning i glass-destillert vann (50 mg/ml), deretter sentrifugering ved 20.000 x g i 1 timer ved 3°C. Dette fjerner dårlig vannløselig materiale som skriver seg fra den syntetiske fremgangsmåten. Supernatanten lyofiliseres, og passeres deretter gjennom en Sephadex G-10 kolonne ved 3°C i et løsningsmiddel av 0,5 % eddiksyre. Hovedtoppen som eluerer bak løsningsmiddeltronten (målt ved absorpsjon ved 2 54 nanometer) lyofiliseres til tørrhet. GHL-Cu ble fremstilt ved å kombinere renset GHL med ekvimolare mengder av kobber(II)-acetat og natriumhydroksyd, deretter utfelling ved bruk av etanoltilsetning og lav temperatur ifølge publiserte metoder (Perkins et al., Inorg. Chim. Acta 67: 93-99, 1984).

Alternativt kan man fremstille renset glycyl-L-histidyl-L-lysin:kobber eller et derivat derav i et hvilket som helst mol-forhold ved tilsetning av den nødvendige molmengden ultrarent kobber(II)-klorid (Ultralog 99,999 % tilgjengelig fra Chemical Dynamics, N.J., f.eks.) til glycyl-L-histidyl-L-lysin eller derivatene, i løsning i destillert vann. Etter tilsetningen av kobber(II)-kloridet justeres pH i løsningen til omlag nøytralitet. Eventuelt dannet bunnfall kan fjernes ved sentrifugering og filtrering ved hjelp av midler vel kjent på området.

Kilder for kjemikalier. Kjemikalier og peptid-mellompro-dukter som anvendes i de følgende eksemplene kan skaffes fra følgende leverandører: Sigma Chemical Co., (St. Louis, Mo.); Peninsula Laboratories (San Carlos, Calif.); Aldridge Chemical Co. (Milwaukee, Wis.); Vega Biochemicals (Tuscon, Ariz.); Pierce Chemical Co. (Rockford, 111.); Research Biochemicals (Cleveland, Ohio); Van Waters and Rogers (South San Francisco, Calif.); Bachem, Inc. (Torrance, Calif.).

EKSEMPEL 1

Syntese av qlycyl- L- histidyl- L- lvsin- benzvlester: kobber( II)

Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysin-benzylester ble løst i 1:1 heksan-etylacetat og koplet til Na<->t-butyloksykarbonyl-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidin ved å bruke dicykloheksylkarbodiimid som koplingsmiddel. Natriumbikarbonat (10 %) ble tilsatt, pg produktet ekstrahert over i det organiske laget. Produktet, Na<->t-butyloksykarbonyl-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidyl-Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysin-benzylester, ble krystallisert fra løsningen. Den N-terminale gruppen i det blokkerte dipeptidet ble fjernet ved omrøring i 50 % trifluoreddiksyre i diklormetan i 3 0 minutter, og deretter vakuum-inndampet. Produktet, N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidyl-Ne-benzoyl-karbonyl-L-lysin-benzylester, ble koplet til benzyloksy-karbonylglycin med dicykloheksylkarbondiimid som koplings-middel. Blokkerende grupper ble fjernet ved katalytisk hydrogenering ved bruk av 10 % palladium på karbon i iseddiksyre. Etter lyofilisering ble produktet glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester, løst i vann, og renset ved ionebytte-kromatografi på Dowex 50 X-4 kationbytte-harpiks, og eluering med 0,1 M ammoniumhydroksyd, idet eluatet øyeblikk-elig ble nøytralisert med eddiksyre. En ytterligere passasje gjennom en ionebytte-kolonne BioRex 63 ved nøytral pH fjernet nedbrytningsprodukter med frie karboksylsyregrupper.

Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylesteren ble løst i vann som var tilsatt ekvimolar kobberacetat. pH ble hevet til nøytralitet med natriumhydroksyd. Løsningen ble sentrifugert ved 20.000 x g i 1 time ved 3°C for å fjerne svakt vannløselig materiale. Supernatanten ble lyofilisert for å oppnå glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester:kobber(II).

EKSEMPEL 2

Syntese av qlvcvl- L- histidyl- L- lysin- n- oktylester:kobber fII)

En blanding av ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysin, n-oktanol, benzen, og p-toluensulfonsyremonohydrat ble oppvarmet med tilbakeløp over natten ved bruk av en Dean-Stark felle for å fjerne vann. Etter avkjøling ble tilsatt tørr etyleter. Løsningen fikk deretter bunnfelle seg ved 0°C over natten. En del av det utfelte faste stoffet ble tilsatt til 50 ml kalium-karbonatløsning og 50 ml diklormetan.

Etter ekstraksjon ble lagene separert, og den organiske fasen vasket med vann og saltløsning, og deretter tørket med vannfritt magnesiumsulfat. Filtrering, inndamping og rensing ved flash-kolonne-kromatograf i ga n-oktyl-Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysinat. Produktet ble løst i tetrahydrofuran og blandet med Na<->t-butyloksykarbonyl-L-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidin, isobutyl-kloroformiat og N-metylmorfolin. Etter inndamping ble vann og etylacetat tilsatt. Produktet ble ekstrahert over i den organiske fasen, som ble tørket med vannfritt magnesiumsulfat. Filtrering, inndamping og rensing ved f lash-kolonne-kromatograf i ga n-oktyl-Na<->t-butyloksy-karbonyl-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidyl-Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysinat.

Produktet ble løst i 50 % trifluoreddiksyre i diklormetan i 30 minutter, og deretter inndampet, under dannelse av n-oktyl-N^-benzyloksydkarbonyl-L-histidyl-J^-benzyloksykarbonyl-L-lysinat. Dette ble løst i tetrahydrofuran, og isobutylklorformiat, N-butylmorfolin og benzyloksykarbonylglycin ble tilsatt for å danne n-oktyl-benzyloksykarbonylglycyl-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidyl-Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysinat. Dette ble løst i iseddik og hydrogenert over natten.

Den resulterende n-oktylesteren av glycyl-L-histidyl-L-lysin ble omdannet til kobberkomplekset ved tilsetning av en ekvimolær mengde kobberdiacetat. pH ble hevet til nøytralt med natriumhydroksyd. Løsningen ble sentrifugert ved 20.000 g i 1 time ved 3°C for å fjerne 1te vannløselig materiale. Supernatanten ble lyofilisert for å oppnå glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-oktylester:kobber(II).

EKSEMPEL 3

A. Syntese av qlycyl- L- histidyl- L- lvsin- n- stearylester:kobber( II)

En blanding av Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysin, n-stearylalkohol, benzen, og p-toluensulfonsyre-monohydrat ble oppvarmet ved tilbakeløp over natten ved bruk av en Dean-Stark-felle for å fjerne vann. Etter avkjøling ble tilsatt tørr propyleter for å øke det samlede volumet 6 ganger. Produktet fikk bunnfelles ved 0°C over natten og ble filtrert. En del av filtratet ble tilsatt til 50 ml kaliumkarbonat og 50 ml diklormetan. Etter ekstraksjon ble lagene separert, og den organiske fasen ble vasket med vann og saltløsning, og deretter tørket med vannfritt magnesiumsulfat. Filtrering, inndamping og rensing ved flash kolonne-kromatografi ga n-stearyl Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysinat. Produktet ble løst i tetrahydrofuran og blandet med Na<->t-butyloksykarbonyl-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidin og isobutylklorformiat og N-metylmorforlin. Etter inndamping ble tilsatt vann og propyl-acetat, og produktet ble ekstrahert over i den organiske fasen, og deretter tørket med vannfritt magnesiumsulfat. Filtrering, inndamping og rensing ved flash-kolonnekromato-grafi ga n-stearyl Na<->t-butyloksykarbonyl-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidyl-Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysinat.

Produktet ble løst i 50 % trifluoreddiksyre i diklormetan i 30 minutter, og deretter inndampet under dannelse av n-stearyl N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidyl-Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysinat, som ble løst i tetrahydrofuran, isobutyl-klorformiat, N-metylmorfolin og benzyloksykarbonylglycin for å danne n-stearyl-benzyloksykarbonylglycyl-N<im->benzyloksykarbonyl-L-histidyl-Ne<->benzyloksykarbonyl-L-lysinat. Produktet ble løst i 50 % trif luoreddiksyre i diklormetan i 30 minutter, deretter inndampet under dannelse av n-stearylester-glycyl-L-histidyl-L-lysin.

Det resulterende molekylet, glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester, ble omdannet til kobber-komplekset ved tilsetning av en ekvimolær mengde av av kobber-diacetat. pH ble hevet til nøytral med natriumhydroksyd for å få et produkt som kan brukes til dyrestudier.

Ved å substituere n-palmitylalkohol i stedet for n-stearyl-alkoholen, kan på lignende måte syntetiseres glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-palmitylesteren.

B. Alternativ syntese av qlycyl- L- histidvl- L- lysin n- stearvlester_ : kobber( II )

N(e)-benzyloksykarbonyl-L-lysin, n-stearylalkohol, p-toluensulfonsyre-monohydrat, og benzen blir oppvarmet sammen med tilbakeløp ved bruk av en Dean-Stark-felle for å fjerne det utviklede vannet azeotropisk. Etter avkjøling til romtemperatur og deretter tilsetning av tørr etyleter, blir n-stearyl N(e)-benzyloksykarbonyl-L-lysinat p-toluensulfonat-saltet oppsamlet ved filtrering, behandlet med 2 M vandig kaliumbikarbonatløsning, og ekstrahert over i diklormetan. Inndamping i de frie aminet, som løses på nytt i tørr tetrahydrofuran (THF) og tilsettes til en omrørt løsning av N(a)-t-butyloksykarbonyl-N(im)-benzyloksy-karbonyl-L-histidin, N-metylmorf ol in, og isobutylklorf ormiat i tørr THF ved -15°C. Den resulterende fullstendige beskyttede dipeptidesteren behandles med 1/1 trifluoreddiksyre/diklormetan ved romtemperatur, nøytraliseres med mettet vandig natrium-bikarbonatløsning, og ekstraheres over i etylacetat. Inndamping gir det delvis deblokkerte dipeptidet, som løses igjen i tørr THF og tilsettes til en omrørt løsning av benzyloksykarbonyl-glycin, N-metylmorfolin og isobutyl-klorformiat i tørr THF ved -15°C. Den dannede fullstendig beskyttede tripeptidesteren blir fullstendig deblokkert ved behandling med hydrogengass i iseddiksyre ved romtemperatur i nærvær av Pd-C katalysator. Filtrering, inndamping og rensing på en mikrokrystallinsk cellulose-kolonne etterfulgt av lyofilisering ga den ønskede tripeptidesteren i form av triacetat-saltet.

Det resulterende molekylet, glycyl-L-histidyl-L-lysin n-stearylesteren, ble omdannet til kobber-komplekset ved tilsetning av en ekvimolær mengde kobberdiacetat. pH ble hevet til nøytralitet med natriumhydroksyd for å få et produkt som kan anvendes til dyrestudier.

Ved å substituere n-palmityl-alkohol i stedet for n-stearyl-alkoholen, kan på lignende måte syntetiseres glycyl-L-histidyl-L-lysin n-palmitylesteren.

EKSEMPEL 4

Syntese av glycvl- L- histidyl- L- lysyl- L- prolyl- L- valyl- L-fenylalanvl- L- valin: kobber( II) og av glycyl- L- histidvl- L-lysvl- L- valyl- L- fenylalanyl- L- valin: kobber( II).

Disse peptidene syntetiseres ved standard fastfase-metoder som vanlige på peptidområdet (J. Steward og J. Young, Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 1984). Kort fortalt ble Boc-Val-O-Resin skrittvis koblet med andre blokkerte aminosyrer ved å bruke dicykloheksylkarbodiimid som reaksjonsmiddel. Beskyttede aminosyrer, harpikser for fastfasesyntese, og koblingsmidler ble skaffet fra Peninsula Laboratories, San Carlos, California. Blokkerte aminosyrer ble tilsatt i sekvens-rekkefølge for. å oppnå det ønskede peptidet. Det endelige peptidet deblokkeres ved å bruke hydrogenfluorid. Det endelige peptidet løses i 0,5 % eddiksyre og renses ved passasje gjennom en Sephadex G-I5 kolonne (Pharmacia). Tilsetning av ekvimolær kobberacetat, etterfulgt av lyofilisering, frembringer det aktive molekylet.

EKSEMPEL 5

Etablering av et tykkere biologisk dekke over sår.

A. Sår hos mus ble indusert ved fjerning av en 1,5 cm diameter sirkulær hudlapp fra ryggen. GHL-Cu-derivater ble penslet på det friske såret. Som vist i figur IA (kontroll) er det bare et tynt biologisk dekke 12, med ny hud 14 ennu ikke synlig. Dessuten er fettcellene 16 nær muskelen 18 ikke blitt fullstendig erstattet. Som vist i figur IB har imidlertid anvendelse av GHL-Cu-derivater markert øket mengden av serumlignende eksudat over såret og tykkelsen av det biologiske dekket 12 over såret. Med referanse igjen til figur IB har blandingene indusert dannelsen av tykkere ny hud 14 og flere fettceller 16. De mest effektive konsentrasjonene var i området på 4 til 20 mg GHL-Cu-derivat pr. ml vann eller fysiologisk saltløsning.

B. Et tykkere biologisk dekke over en defekt av full tykkelse kan også dannes ved lokal behandling med en krem som inneholder et GHL-Cu-derivat. Huddefekter med full tykkelse ble laget på grupper av mus. En gruppe ble behandlet med en krem inneholdende 0,4 % GHL-Cu, mens den andre tjente som kontroll, og ble behandlet med bare kremen. Figur 1C viser sårdekket på gruppen av kontroll (krembehandlede) mus. Figur ID viser det dekket som ble oppnådd med den gruppen av mus som var behandlet med GHL-Cu-derivat holdig krem. Alle fotografiene ble tatt på dag 7 etter behandlingen med 3 påføringer av kremene. En sammenligning av figur 1C (kontroll) med figur ID (behandlet med GHL-Cu) illustrerer det tykkere biologiske dekket som er dannet ved anvendelse av GHL-Cu.

EKSEMPEL 6

Reetablering av frie hudlapper med full tykkelse.

Selvom det også er svært vanskelig å etablere hudinnpodinger med full tykkelse uten vidtgående nekrose, har GLH:Cu-derivatene markert forbedret levedyktigheten, og "take" andelen av slike innpodninger er beskrevet i mere detalj i det følgende.

Mus ble anestetisert med pentobarbital, barbert, og en 1,5 cm x 1,5 cm sirkel markert midt på ryggen. Den sirkulære hudlappen med full tykkelse, ble forsiktig fjernet fra dyret, og deretter sydd tilbake med 4 like lange sting. 3 0 /xg GHL-Cu eller et derivat derav ble infiltrert inn i senteret av den frie lappen etter inngrepet og etter 24 timer.

Kontroll-lappene (figur 2A) ble raskt harde, og falt av i løpet av 4 til 6 døgn, mens de behandlede lappene (figur 2B) ble på plass, etablerte seg og det grodde hår på dem. I de lappene som kom seg, var forbedringen histologisk åpenbar etter 12 døgn, men fortsatte fremdeles med lav hastighet. I noen hudlapper ble hele lappen helet, mens i andre bare en signifikant del av lappens areal kom seg. Det vil være åpen-bart for en spesialist på området at to behandlinger ikke behøver å være nødvendig i dette tilfelle. Infiltrering, av fra 5-30 jug/cm<2> overflateareal er egnet for anvendelse heri.

Resultatene av histologisk farging og patologisk analyse av de reetablerte muselappene viste at muselappene var godt vaskularisert, uten tegn på nekrose. Ved 12 døgn etter operasjonen viste hudlappene en normal helingsprosess knyttet til skadet hud, karakterisert ved tilstedeværelse av granula-sjonsvev og med lite fibrøs arrdannelse. Hudlappen, bortsett fra de reaktive prosessene, ligner det nærliggende naturlige vevet, og er godt festet til det naturlige vevet. Inkludert blandt de elementene som viser levedyktighet var skjelett-muskler i dypere deler, levedyktig epidermisk og levedyktige vedheng av hud. I området mellom innpodingen og det naturlige vevet var det et kontinuerlig nekrotisk avfall med utstrakte infiltrater, som representerte materiale som vanligvis finnes på helende hud. Lite kollagen eller ruedannelse ble observert untatt i et begrenset antall kantområder på hudlappen.

EKSEMPEL 7

Hud- inn<p>odinger med splittet tykkelse

"Take" for hudinnpoding med splittet tykkelse blir forbedret, når GHL-Cu blir tilført til liposomer, og anvendt en gang etter innpodingen. I Yorkshire-griser ble hud og under-liggende fett fjernet fra en 2,5 cm firkant for å danne et sår. En hudinnpoding med splittet tykkelse ble fremstilt fra en annen del av dyret, og sydd over sårområdet. GHL-Cu ble formulert i liposom-vesikler ved standard fremgangsmåter ved anvendelse av fosfatidyl-cholin/cholat i et molforhold på 0,625. De GHL-Cu-holdige liposomene (0,1 ml liposomer inneholdende 50 mikrogram GHL-Cu) ble innfiltrert i vevet under innpodingen, mens kontroll-innpodinger (figur 3A) fikk liposomer uten GHL-Cu. Ved 15 døgn etter innpodingen hadde hudinnpodings-gruppen som var behandlet med GHL^Cu-holdige liposomer (figur 3B) et jevnt dekket sårområde, og gikk jevnt over i den nærliggende huden. I motsetning, uten GHL-Cu, var det bare midtpartiet av den påsydde hudinnpodingen som var etablert, og kantene av sårområdet var fremdeles dekket med arret vev. Det gjennomsnittlige området for nyetablert hud var 1,2 (± 0,3) cm<2> i kontrolldyrene, mot 4,3 (± 0,7) i de GHL-Cu-behandlede dyrene (p-verdien av differansen <0,001).

EKSEMPEL 8

Akselerasjon av sårlukkingen

Dette eksempelet bruker fjerning av en sirkulær hudlapp fra ryggen av en mus, mens helingen måles ved hastigheten av re-epiteliseringen og lukkingen av såret.

Kvantifiseringen av virkningen av GHL-Cu-derivatene på hastigheten for sålhelingen etter det kirurgiske innsnittet, er ved reduksjonen i både omkretsen av såret og reduksjonen av det ikke-helte sårområdet, sammen med fremstillingen av representative histologiske vevsprøver. Hastigheten for sårlukkingen og re-epiteliseringen er en relativt enkel og direkte undersøkelse av helingen, og er avhengig av hvor godt blodforsyningen og næringsstrømmen kan reetableres til det ødelagte vevet.

Det eksperimentet som er beskrevet heri, anvendte Swiss-Webster mus (25 mg). På eksperimentets dag 0 ble alle musene behandlet med intraperitonealt barbiturat, tilstrekkelig til å frembringe en dyp og langvarig anestesi for å lage såret. En rund plate (1,5 cm diameter) ble brukt for å markere grensene for å den huden som skulle fjernes fra den øvre overflaten av ryggen umiddelbart bak forlemmene. Huden og subkutant vev på innsiden av den markerte sirkelen, ble presist skåret ut, ned til lumbo dorsal fascia, og huden innenfor sirkelen ble fjernet for å frembringe området med et åpent sår.

I en gruppe mus ble kantene av huden omkring det sirkulære såret, infiltrert med intradermal infiltrering av GHL-Cu eller et derivat derav i 0,03 ml buffret saltløsning. Kontrollmusene fikk bare den buffrete saltløsningen. Hver 5. dag i 25 døgn ble såret renset til en skarp sårmargin og fotografert med en målestav. Omkretsen og arealet for hvert sår ble målt med en EDB-styrt integrator, og resultatene er vist i figur 4.

EKSEMPEL 9

Akselerasjon av sårlukkingen hos mus med lokal- kremer som inneholder GHL- Cu eller et derivat derav.

Dette eksempelet bruker et lignende eksperimentelt system som det beskrevet i eksempel 8. I dette eksempelet ble defektene med full tykkelse på grupper av mus behandlet med en petrolatum-basert krem inneholdende enten 0,4 % glycyl-L-histidyl-L-lysin: kobber(II) eller glycyl-L-histidyl-L-lysin-oktyl-ester:kobber(II). I hvert tilfelle var molforholdet mellom peptid eller peptidderivat og kobber 2:1. Musene ble behandlet en gang pr. dag i 3 døgn, og størrelsen på såret ble bestemt ved 14 døgn. Kontrolldyrene ble behandlet bare med krem. Figur 5 viser de gjennomsnittlige resultatene som ble oppnådd fra en serie eksperimenter. Det totale antallet dyr i hver eksperimentgruppe var 50. Disse data illustrerer at behandling med en krem som inneholder enten glycyl-L-histidyl-L-lysin: Cu eller et derivat derav, i betydelig grad akseler-

erer lukkingen av såret.

EKSEMPEL 10

Akselerasjon av sårlukkingen hos mennesker behandlet med lokalkremer som inneholder GHL- Cu.

Lukkingen av "ikke-helende" sår hos mennesker blir også akselerert ved lokal behandling med glycyl-L-histidyl-L-lysin: Cu-inneholdende kremer. Pasienter med følgende sår er blitt behandlet: A-en gruppe på 7 pasienter med venestase-sår på leggene B-en gruppe på 5 pasienter med diabetiske sår

Sårene ble behandlet med en petrolatum-basert krem inneholdende 0,4 % (w/w) glycyl-L-histidyl-L-lysin:Cu (molforholdet 2:1). Venesårene ble behandlet med kremen en gang pr. dag i 5 døgn etterfulgt av hver andre dag i opptil 30 døgn.

De diabetiske sårene ble behandlet under en forkortet proto-koll som involverte anvendelse av kremen på dagene 1, 2, 3, 5, 7 og 9. Sårene ble fotografert periodisk under den 30 dagers behandlingen, skjønt noen ikke ble fulgt under hele perioden. Hastigheten av sårlukkingen ble bestemt ved å sammenligne forandringen i re-epiteliseringen som en funksjon av tiden. Pasient-slider ble omdannet til fotografier, og deretter foto-kopiert. Sårområdet ble opptegnet, og forstørrete fotokopier ble laget. Det opptegnete arealet på de forstørrete foto-kopiene ble kuttet ut og veiet for å bestemme det forholds-messige arealet. For å normalisere disse data, ble arealene korrigert for å kompensere for forskjeller i forstørrelse av de originale fotografiene. Arealene av de diabetiske sårene ble målt av vakthavende lege på det tidspunktet da fotografiene ble tatt.

De data som ble oppnådd med venestase-sårene er presentert som en prosent av det opprinnelige sårarealet, og vist i figur 6. Som man kan se har alle sårene reagert med signifikant sårlukking i løpet av den 3 0 døgns perioden, noen i løpet av 2 uker. Den gjennomsnittlige prosenten av opprinnelige sårarealer som fremdeles var tilstede ved 25 - 3 0 døgn, var 30 ± 17 % (n=6, sår som ble redusert til denne

prosentsats før dag 25, er ikke inkludert).

De data som ble oppnådd med de diabetiske sårene er presentert i figur 7. Alle pasientene reagerte med målbar sårlukking i løpet av 9 døgnsperioden i behandlingsproto-

kollen, hos 4 av de 5 pasientene var det en signifikant reduksjon i løpet av den første uken av behandlingen. Dette svarer til bare 4 anvendelser av den glycyl-L-histidyl-L-lysin: Cu-holdige kremen.

EKSEMPEL 11

Dette eksempelet demonstrerer bruken av blandingene ved behandling av sår hos hester. Et antall hester med kroniske sår p.g.a. tilfeldige skader ble behandlet med lokal krem inneholdende glycyl-L-histidyl-L-lysin: Cu (molforhold 2:1).

I alle tilfellene ble helingen, målt ved dannelsen av et biologisk dekke (rue) over såret og sårlukkingen akselerert ved behandling med kremen, sammenlignet med konvensjonell terapi.

Figur 8 viser fotografier av et representativt verkende dypt sår i benet på en hest før og etter 12 døgns behandling med en petrolatum-basert krem inneholdende 0,4 % glycyl-L-histidyl-L-lysin: Cu.

Claims (4)

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt derivat av GHL;Cu med den generelle formel: [X-L-histidyl-L-lysin-C(=0)-R] : kopper(II), hvori X er glycyl, og R er C-^- C^ alkoksy, C6-C12-aryloksy, L-prolyl-L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin eller L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin, karakterisert ved ata) når R er valgt fra Cj-C^ alkoksy eller C6-C12 aryloksy, 1) kopling av en beskyttet lysinester eller -keton til et beskyttet histidin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av en beskyttet histidyl-lysin-ester eller -keton, 2) kopling av den beskyttede histidyl-lysin-ester eller -keton til et beskyttet glycin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av en beskyttet glycyl-histidyl-lysin-ester eller -keton, 3) fjerning av beskyttelsesgruppene under dannelse av en glycyl-histidyl-lysin-ester eller -keton, og4) kompleksering av dette med kopper(II), ellerb) når R er valgt fra L-prolyl-l-valyl-L-fenylalanyl-L-valin eller L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin,1) kopling av et beskyttet valin med et beskyttet fenylalanyl ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet fenylalanyl-valin,2) kopling av det beskyttede fenylalanyl-valin med et beskyttet valin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet valyl-fenylalanyl-valin, 3) eventuelt kopling av det beskyttede valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet prolin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, 4) kopling av enten det beskyttede valyl-fenylalanyl-valin eller det beskyttede prolyl-valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet lysin ved bruk av et koplingsmiddel under dannelse enten av et beskyttet lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et beskyttet lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, 5) kopling av enten det beskyttede lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller det beskyttede lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet histidin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av et beskyttet histidyl-lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et beskyttet histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, 6) kopling av det beskyttede histidyl-lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller det beskyttede histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin til et beskyttet glycin ved bruk av et koplingsreagens under dannelse av enten et beskyttet glycyl-histidyl-lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et beskyttet glycyl-histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, 7) fjerning av beskyttelsesgruppene under dannelse av enten et glycyl-histidyl-lysyl-valyl-fenylalanyl-valin eller et glycyl-histidyl-lysyl-prolyl-valyl-fenylalanyl-valin, og 8) kompleksering av dette med kopper (II).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av glycyl-L-histidyl-L-lysin-L-prolyl-L-valyl-L-fenylalanyl-L-valiri: kopper (II),karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av glycyl-L-histidyl-L-lysin-L-valyl-L-fenylalanyl-L-valin: kopper (II), karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av glycyl-L-histidyl-L-lysin-R: kopper (II), hvori R er en Ci-C^ alkoksyrest, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.