NO175218B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forsøkssammensetning for visuell bestemmelse av en analytt i en fluid prøve, en f orsøkssammensetning for visuell bestemmelse av glukose i en vandig flytende prøve, en forsøksinnretning for visuell bestemmelse av en analytt i en fluid prøve samt en flerlags-forsøksinnretning for visuell bestemmelse av glukose i en kroppsvaeskeprøve. Forsøkssammensetningene og forsøksinn-retningene ifølge oppfinnelsen er i stand til å generere forskjellige farger ved forskjellige analyttkonsentrasjoner.

Spesielt vedrører oppfinnelsen en selv-indikerende forsøks-innretning for bestemmelsen av analytter, f.eks. glukose, i kroppsvæske som viser regnbuens farger.

Kolorimetriske påvisninger anvendes hensiktsmessig som visuelle påvisninger hvorved relativt utrenet personell rutinemessig kan oppnå resultater ved enkel sammenligning med et egnet fargekart. Visuelle påvisninger er billige og hensiktsmessige idet ingen instrumentering er påkrevet. I dag anvendes visuelle påvisninger for rutinemessig undersøkelse av urinprøver vedrørende et antall diagnostisk viktige analytter, benyttes av diabetikere for hjemmeundersøkelse av urin eller blodglukose og benyttes innenfor andre felter, f.eks. undersøkelse av vann vedrørende jerninnhold.

De idag tilgjengelige visuelle påvisningene relaterer intensiteten av en spesiell farge med konsentrasjonen av analytten. F.eks. kan en forsøksinnretning endres fra fargeløs til lyse blå til mørkere nyanser av blått med økende konsentrasjon av glukose. Lettere visuell adskillelse, og derfor større nøyaktighet, er mulig når det tilveiebringes et område av farger fremfor forskjellige nyanser av en enkelt farge. Derfor vil en forsøkssammensetning som viser forskjellige farger ved forskjellige analyttkonsentrasjoner være enklere å benytte og vil gi mer nøyaktige visuelle resultater .

For å tillate visuell differensiering av høyere konsentrasjoner av glukose, benytter idag mange tilgjengelige produkter anvendelsen av to reagensputer, hvorav den ene gir bedre fargedifferensiering ved det høyere konsentrasjonsom-rådet. Slike produkter ville ellers vise bare meget svakt forskjellige nyanser av mørkeblått (eller mørkegrønt) over 150 mg/dl glukose. Derimot kan en forsøksinnretning ifølge foreliggende oppfinnelse gi dramatiske fargeendringer, blått til sjøgrønt til lysegult til rødt, over et område fra 0 til 800 mg/dl glukose.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer sammensetninger som kan benyttes til å produsere et område av farger, spesielt for klinisk viktige analytter. Spesielt er det angitt en forsøksinnretning som er i stand til å generere fargene i en fullspektret "RAINBOW", for bestemmelse av glukose i en kroppsvæske, så som fullblod.

US-patent nr. 4.490.465 beskriver et forsøkssystem for bestemmelse av glukose som har et utvidet måleområde. Systemet innbefatter minst en pyridin-bundet dehydrogenase og en ikke-pyridinbundet dehydrogenase. Et eksempel viser en bestemmelse av glukose med en koblet system av glukosedehydrogenase/nikot inadenindinukleotid/diaf or ase/ tetrazolium-salt og glukosedehydrogenase/diklorfenolindofenol. En gul komponent innføres i fargene som oppnås ved anvendelsen av et bakgrunnsfargestoff.

DE 32 11 167 beskriver minst to enzymsystemer hvorav hvert uavhengig er i stand til å katalysere den direkte eller indirekte omvandlingen av et substrat. Beskrivelsen definerer "uavhengig av hverandre" til å bety at, ved samtidig nærvær av systemet som reagerer med substratet, finner reaksjonen via det andre systemet sted bare etter at koenzymet for det første systemet er hovedsakelig forbrukt.

DE 32 47 894 beskriver et forsøkssystem og en fremgangsmåte for bestemmelse av redusert nikotinadenindinukleotid, som gir et utvidet måleområde for bestemmelsen av NAD(P)H eller substrater eller enzymer som reagerer under dannelse eller forbruk av NAD(P)H. Systemet er kjennetegnet ved at det inneholder samtidig flere stoffer med forskjellige elektro-kjemiske potensialer som fungerer uavhengig av hverandre som elektronakseptorer for NAD(P)H. Spesielle eksempler på elektronakseptorer innbefatter diklorfenolindofenol og INT, (2-(4-j odofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-fenyltetrazoliumklorid ). Beskrivelsen angir at forsøkssystemet kan impregneres i absorberende materialer. En gul komponent tilsettes til fargen som observeres ved innbefatning av et bakgrunnsfargestoff, titangult.

Japansk patentpublikasjon 59-106299 ble publisert 19. juni 1984. Publikasjonen beskriver en fremgangsmåte for å estimere NAD(P)H med oksydert glutation i nærvær av glutationreduktase og et fargedannende middel. Eksempler på angitte fargedannende midler er 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzosyre); N-(l-anilino-naftyl-4-maleimid; e-hydroksyetyl-2,4-dinitrofenyl-disulfid; 2,2-ditiopyridin; og benzimidazolylmaleimid.

Europeisk patentpublikasjon 0-153-872 beskriver en fremgangsmåte for bestemmelse av den reduserte formen av nikotinamid-adenindinukleotidfosfat som innbefatter omsetning av NAD(P)H med (1) peroksydase eller tioloksydreduktase og (2) diaforase eller en elektronbærer i nærvær av en kromogen og bestemmelse av pigmentet som derved dannes. Disse to reaksjonene virker ikke på et felles substrat.

Ingen av disse beskrivelsene angir et system bestående av to uavhengige katalytiske systemer, et i form av et disulfid-reduktasesystem, som tillater produksjon av en fullspektret "RAINBOW", innbefattende en gulkomponent generert in situ; hvor den spesielle endelige fargen som dannes avhenger av konsentrasjonen av analytten.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forsøkssammen-setning for visuell bestemmelse av analytt i en fluid prøve, kjennetegnet ved at den innbefatter: (a) et katalytisk system som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid fra analytten; (b) et første uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en redusert første indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid; og (c) et andre uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en redusert andre indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid, hvor genereringen av den reduserte første og andre indikatoren finner sted i det vesentlige samtidig, og hvor det andre uavhengige katalytiske systemet innbefatter (i) en disulfidreduktase;

(ii) et disulfidsubstrat; og

(iii) en tiolindikator; hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom redusert nikotinamidadenindinukleotid og disulfidsubstratet slik at det dannes et produkt som kan redusere tiolindikatoren slik at den reduserte andre indikatoren

dannes;

hvorved genereringen av de reduserte indikatorene kontrolleres slik at det tilveiebringes et område av farger, og hvor den spesielle endelige fargen som produseres av forsøks-sammensetningen avhenger av konsentrasjonen av analytten.

Fortrinnsvis produserer ett system en gul farge. I et foretrukket system reduseres tiolindikatoren slik at det produseres en gul andre indikator.

Sammensetningen kan oppløses slik at det tilveiebringes en forsøksoppløsning eller inkorporeres i en bærermatriks slik at det tilveiebringes en forsøksinnretning.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en forsøks-sammensetning for visuell bestemmelse av glukose i en vandig flytende prøve, kjennetegnet ved at den innbefatter: (a) et katalytisk system som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid ved reaksjon med glukose; (b) et første katalytisk system bestående av en katalysator som har diaforaseaktivitet, en oksydert første indikator og en oksydert tredje indikator som begge er i stand til å reagere med redusert niktotinamidadenindi-nukleotid i nærvær av katalysatoren slik at det dannes en redusert første og tredje indikator; og (c) et andre katalytisk system bestående av en disulfidreduktase, et disulfidsubstrat og en tiolindikator, hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom redusert nikotinamidadenindinukleotid og disulfidsubstratet slik at det dannes et produkt som reduserer tiolindikatoren slik at en redusert andre indikator produseres, hvor genereringen av den første og den andre reduserte indikatoren finner sted i det vesentlige samtidig;

hvorved generereringen av de reduserte indikatorene utføres slik at det tilveiebringes et område av farger, hvor den endelige fargen som produseres av forsøkssammensetningen avhenger av konsentrasjonen av glukose i prøven.

En foretrukket utførelse er en forsøksinnretning for glukose i fullblod som er i stand til å generere en regnbue med fullstendig spektrum, innbefattende en gul farge som genereres in situ, hvor den spesielle endelige fargen for forsøks-innretningen avhenger av konsentrasjonen av glukose i prøven.

Visuell fargesammensetning er hensiktsmessig og kan gi en akseptabelt nøyaktig bestemmelse av analyttkonsentrasjon uten behov for dyr instrumentering. Farge kan dekomponeres i komponenter så som metning, lyshet og kulør. Kulør betegnes vanligvis som "farge", f.eks. om noe "ser" blått, rødt eller gult ut. I foreliggende beskrivelse benyttes betegnelsen "farge".

Generelt er en farge forbundet med en form av en enkelt indikator. For derfor å generere et område av farger, er et antall forskjellige indikatormolekyler påkrevet. De mulige fargeendringene er tallrike. En indikator kan forandres fra en farge til en annen, fra en farge til fargeløs eller fra fargeløs til en farge. Det er også mulig at indikatoren selv ikke endrer farge, men utførelsen av en innretning innbefattende forsøkssammensetningen er slik at det forekommer en tilsynelatende endring i fargen av innretningen når denne bringes i kontakt med en prøve inneholdende analytten. F.eks. er det mulig at fargen av indikatoren ikke observeres før reaksjon mellom forsøkssammensetningen og analytten, men er synlig etterat denne reaksjonen har funent sted. Fordi det er ønskelig at fargeendringen som vises av forsøksinnretningen fra en analyttkonsentras jon til en annen er så klar for brukeren som mulig, har endringer fra fargeløs til en farge og en farge til fargeløs vært foretrukket. Når det anvendes to eller flere indikatorer, endres fortrinnsvis minst en indikatorkomponent fra en farge til fargeløs. Ellers vil den endelige fargen av forsøkssammensetningen eller -innretningen, bevege seg mot sort ettersom flere farger produseres.

Det er spesielt ønskelig å kontrollere produksjonen og/eller forsvinningen av indikatorer som i en form viser en av primærfargene: rød, gul, blå. Selv om en sammensetning inneholdende to indikatorkomponenter kan benyttes, er anvendelsen av tre indikatorkomponenter funnet å være fordelaktig.

Som eksempel betraktes en forsøkssammensetning inneholdende indikatorer som viser følgende fargeendringer i den angitte rekkefølgen.

Dersom indikatorene reagerer i rekkefølge, vil den tilsynelatende endelige fargen for forsøkssammensetningen være fra blå til fargeløs til oransje (gul + rød).

Dersom imidlertid indikator 2 endret farge samtidig med indikator 1, ville endringene i indikator 3 finne sted senere; den tilsynelatende endelige fargen for forsøkssammen-setningen ville være blå til grønn (blå + gul) til gul til oransje (gul + rød) til rød.

En lignende eksempel er:

Dersom indikatorene reagerte i rekkefølge, ville den tilsynelatende endelige fargen for forsøkssammensetningen være rød til fargeløs til gul til grønn (blå + gul). Dersom indikatorene reagerte som beskrevet ovenfor, samtidig og den tredje endringen forsinket, ville den tilsynelatende farge for f orsøkssammensetningen være rød til oransje (rød + gul) til gul til grønn (gul + blå) til blå.

Begge disse mulighetene, inneholdende samtidige fargeendringer, vil gi en "RAINBOW" med fullstendig spektrum. En slik "RAINBOW" vil være ønskelig fordi den tilveiebringer det hviteste området av farger som er synlige for øyet og kan benyttes for å gjøre adskillelsen av nivåer av analytt lettere å bedømme.

Problemet er tosidig: 1) å velge indikatorer som har endringer i farge indusert uavhengig av hverandre slik at den maksimale fargeendringen oppnås, og 2) å sikre at disse indikatorene reagerer i ordnet rekkefølge avhengig bare av konsentrasjonen av analytten.

Det er funnet at et område av farger kan produseres ved å anvende to uavhengige katalytiske systemer, hvert reaktivt med redusert nikotinamidadenindinukleotid (NÅDH) slik at det produseres en eller flere fargeendringer. Systemene reagerer i det vesentlige samtidig med NADH. Fargen som produseres ved en spesiell analyttkonsentrasjon kan kontrolleres ved den relative økningen eller reduksjonen av konsentrasjonene av komponentene og katalysatorene i forsøkssammensetningen.

Hvert uavhengige katalytiske system er et system som er i stand til å vekselvirke med en eller flere indikatorer i nærvær av NADH slik at det produseres en endring i farge for indikatoren(e). Ett system inneholder minst en oksydert indikator og en katalysator som er i stand til å lette reduksjonen av den oksyderte indikatoren i nærvær av NADH. Det andre systemet inneholder minst et disulfidsubstrat, en tiolindikator og en disulfidreduktase (katalysatoren). Disulfidreduktasesystemet kan fungere på tre generelle måter: l) tiolindikatoren kan vekselvirke med produktet som dannes ved reaksjonen mellom NADH og disulfidsubstratet slik at det produseres en fargeendring for den andre indikatoren; 2) tiolindikatoren kan reduseres slik at det dannes en redusert andre indikator; og 3) denne andre indikatoren, kan i et hvert tilfelle ha en gul farge. Det har vist seg spesielt vanskelig å generere en gul farge in situ.

Betegnelsene katalysator og katalytisk anvendes her i deres konvensjonelle betydninger. En "katalytisk" reaksjon er en reaksjon hvis hastighet endres ved tilsats av en "katalysator", men katalysatoren selv forblir uendret. De katalytiske reaksjonene som her beskrives er vanligvis enzymatiske, men kan også innbefatte ikke-enzymatiske reaksjoner, som f.eks. de som katalyseres med fenazinmetosulfat. Betegnelsen "uavhengig" betyr at den oksyderte indikatoren(e) som reduseres i ett katalytisk system ikke er i likevekt med den oksyderte indikatoren(e) som reduseres i det andre katalytiske systemet under den anvendte reaksjonstiden.

NADH genereres fra analytten av interesse ved hjelp av et katalytisk system som vanligvis er enzymatisk. Tabell 1 viser analytter av klinisk interesse og nyttige enzymatiske systemer som kan produsere NADH. Disse reaksjonene, og reaksjonskomponentene som kreves, er velkjente og danner i dag grunnlag for mange diagnostiske reaksjoner som genererer endringer i intensitet av en enkelt farge som respons på analyttkonsentrasjon. Enzymsystemet som er i stand til å generere en NADH fra analytten av interesse er vanligvis et dehydrogenasesystem, selv om et hvilket som helst system som i stand til å generere NADH kan benyttes.

Den reduserte formen av nikotinamidadenindinukleotid, NADH, er funnet å være et spesielt nyttige felles substrat. Selv om foreliggende beskrivelse refererer utelukkende til nikotinamidadenindinukleotid, NAD, og dets reduserte form NADH, skal det understrekes at beskrivelsen også kan anvendes med de fosforylerte formene NAD(P) og NAD(P)H.

Katalytiske systemer som er nyttige som felles substrat NADH, basert på diaforase eller katalysatorer som har diaforase-lignende aktivitet, så som fenazinmetosulfat og 1-metoksy-fenazinmetosulfat, skal beskrives i detalj. Diaforasesystemet er funnet å være nyttig som en reaksjons-måte idet to oksyderte indikatorer er lett tilgjengelige, disse viser distinkte fargeendringer. DCIP, 2,6-diklorindo-fenol, er en blå forbindelse som reduseres til en fargeløs form i nærvær av av diaforase og NADH. INT, 2-(4-jodofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-fenyltetrazoliumklorid, er fargeløs i oksydert form, men blir rød når den reduseres i nærvær av diaforase og NADH. De to fargeendringene er trinnvise. Andre indikatorer som er reaktive med diaforase og NADH kan benyttes. For eksempel kan N-(2,3-dimetyl-5-okso-l-fenyl-3-pyrazolin-4-yl)-2-klor-6-sulfo-4-iminobenzokinon, for enkelhets skyld betegnet som TR-1, og p-nitroblått tetrazol-iumklorid, heretter betegnet som NBT, benyttes i steden for DCIP og INT. Andre indofenoler og beslektede substituerte alkyl, nitro, halogen og pseudohalogenderivater kan anvendes i steden for DCIP, så vel som andre indikatorer med tilsvar-ende reduksjonspotensial som er i stand til å reduseres i nærvær av NADH. Andre tetrazoliumforbindelser kan benyttes i stedet for INT. Mange er kjente innen teknikken og er oppført i oversiktsartikler som "An Introduction to the Use of Tetrazolium Salts in Quantitative Enzyme Chemistry", F.P. Altman, Koch-light Laboratories, Ltd., Colnbrook, England, 1972; og "The Chemistry of Formazans and Tetrazolium Salts", A.W. Nineham, Chem. Rev., 55:355 (1955).

En andre parallell framgangsmåte tilveiebringes ved det andre uavhengige katalytiske systemet basert på en disulfidreduktase. Et antall reduktasesystemer er gjengitt i tabell 2 nedenfor.

Disulfidreduktasesystemet har tre komponenter: et disulfidsubstrat, en disulfidreduktase som er i stand til å lette reaksjonen mellom disulfidsubstratet og NADH, og en tiol-indikator som kan vekselvirke med produktet fra reaksjonen mellom disulfidsubstratet og NADH slik at det produseres fargeendring for den andre indikatoren. Et foretrukket disulfidsubstrat er lipoamid og analoger derav som kan benyttes med lipoamiddehydrogenase. Disulfidreduktasesystemet er funnet å være spesielt nyttig for innføring av gult i området av farger generert av forsøkssammensetningen.

Tiolindikatoren er et hvilket som helst stoff som vil vekselvirke med en tiol (-SH-forbindelse) og gi observerbar farge. Foretrukne tiolindikatorer er fargeløse indikatorer som ble gule ved vekselvirkning. Vanligvis er tiolindikatoren en oksydert indikator som reduseres i nærvær av produktet av reaksjonen mellom disulfidsubstratet og NADH slik at den reduserte andre indikatoren dannes som kan, men ikke nød-vendigvis må, være gul. Imidlertid kan også andre typer vekselvirkning som vil produsere farge anvendes. F.eks. kan tiolindikatorer være gelateringsmidler så som nitroprussid, som vil vekselvirke med produktet av disulfidsubstrat/NADH-reaksjonen slik at det produseres en rød farge. Et palladium-kompleks kan også anvendes for å produsere rødt. En gul farge kan genereres ved vekselvirkning mellom tiolindikatoren og produktet av disulfidsubstrat/NADH-reaksjonen ved alkylering dersom produktet er cystein. Alternativt kan et cystein-produkt omsettes med noradrenokrom slik at det produseres en gul farge.

En annen generell type tiolindikator er en kromofor av den ønskede fargen, fortrinnsvis gul, immobilisert bak en opak barriere.Ved reaksjon med produktet av disulfidsubstrat/NADH-reaksjonen frigjøres kromoforen fra sin tilknytning og er fri til å diffundere gjennom den opake barrieren til en posisjon hvor den er synlig for en observatør.

Vanligvis er tiolindikatorene som undergår reduksjon disul-fidforbindelser. Spesielt foretrukket er analoger av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre) her betegnet som DTNB, hvis struktur er angitt nedenfor:

DTNB beregnes vanligvis som Ellman's reagens. Endringer ved karboksylsyrehydroksylgruppen er funnet å være nyttige. Analoger av DTNB, som her defineres som innbefattende posisjonelle isomerer av DTNB, av strukturen angitt nedenfor er foretrukket:

R kan være forskjellige grupper, f.eks. grupper som tilveiebringer en ester- eller amidbinding, f.eks.

Selv om vannoppløseliggjørende grupper som de som er vist ovenfor er foretrukket i utførelser med gelatinmatriks kan vannuoppløselige analoger anvendes i utførelser med oppdeling i seksjoner uten innbyrdes forbindelse, som beskrives senere i beskrivelsen.

En foretrukket vannoppløselig analog forbindelse er 3-N-(3-dimetylaminopropyl)karboksamido-4-nitrofenyldisulfid, av strukturen vist nedenfor, hvis syntese er detaljert angitt i eksemplene.

Forbindelsen betegnes senere i beskrivelsen for enkelhets skyld som 3-ND. Denne forbindelsen er fargeløs i oksydert form og blir gul i nærvær av lipoamid, NADH og lipoamiddehydrogenase.

Farger av spesielt nyttige indikatorer er gjengitt i tabell 3 nedenfor.

Det er funnet at et farge-retardasjonsmiddel kan tilsettes til sammensetningen. Farge-retardasjonsmidlet har i det vesentlige ingen virkning på den synlige fargen for brukeren, men innbefatningen kan forsinke den katalytiske effekten av de uavhengige systemene, forsinke reduksjonen av de oksyderte indikatorene og derfor endre den endelige fargen som produseres for en spesiell konsentrasjon av analytt. Nyttige farge-retardasjonsmidler innbefatter kaliumferricyanid og 1-N-etyl-4-metylkinolinumjodid og analoger derav eller bland-inger av disse forbindelsene, kaliumferricyanid er foretrukket. Farge-retardasjonsmidler endrer effektivt måleom-rådet for sammensetningen.

Andre komponenter så som buffere, overflateaktive midler og polymerer, kan tilsettes til sammensetningen. pE-verdien velges generelt slik at det oppnås god virkning og stabilitet for reagensene, og den kontrolleres ved anvendelse av buffere. Anvendelsen av buffere er foretrukket idet enzymene fungerer bedre innenfor pH-området fra 6,0 til 8. Valg av en buffer ligger innenfor fagmannens kunnskapsområde. Nyttige buffere innbefatter, men er ikke begrenset til, N-2-hydroksy-etylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre (HEPES), 2-[tris(hydroksy-metyl)metyl]aminoetansulfonsyre (TES), 2-[N-morfolino]-etansulfonsyre (MES) og [3-(N-morfolino)propansulfonsyre]

(MOPS). Overflateaktive midler og polymerer kan være spesielt nyttige i sammensetninger inneholdende et kationisk tetrazol-iumsalt som en oksydert indikator idet overflateaktive midler

så som polyoksyetyleneter, og polymerer så som polyvinylalkohol og polyvinylpyrrolidon, synes å hjelpe oppløse-liggjørelsen av den kationiske indikatoren og forhindre vekselvirkning med de andre indikatorene i forsøkssammen-setningen. Overflateaktive midler synes også å forbedre fuktbarheten for innretningen i en utførelse i tørr fase. Enzymstabilisatorer, så som bovinserumalbumin, kan også tilsettes.

Forsøkssammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved å oppløse sammensetningen i en oppløsning, eller de kan inkorporeres i en baerermatr iks og festes til et bærerelement så som et polyesterbånd, slik at det tilveiebringes tørre reagensbånd som er velkjente innen diagnostisk teknikk. Disse båndene tilveiebringer en utførelse som er hensiktsmessig å frakte og å oppbevare og som er spesielt nyttig for bruk i hjemmet, f.eks. av diabetikere. Foretrukne sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse genererer en endelig farge som kan forbindes med en spesiell analyttkonsentrasjon, i løpet av mindre enn 10 minutter.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en forsøksinn-retning for visuell bestemmelse av en analytt i en fluid prøve, kjennetegnet ved at den innbefatter:

(a) en baerermatr iks; og

(b) en forsøkssammensetning inkorporert i denne, hvor f orsøkssammensetningen innbefatter: et katalytisk system som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid fra analytten; et første uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en redusert første indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid; og et andre uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en gul andre indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid, hvor genereringen av den første og den andre reduserte indikatoren finner sted i det vesentlige samtidig, og hvor det andre uavhengige katalytiske systemet innbefatter (i) en disulfidreduktase;

(ii) et disulfidsubstrat; og

(iii) en tiolindikator; hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom redusert nikotinamidadenindinukleotid og disulfidsubstratet slik at det dannes et produkt som kan vekselvirke med tiolindikatoren slik at det dannes en gul andre indikator; hvorved genereringen av de reduserte og gule indikatorene utføres slik at det tilveiebringes et område av farger, hvor den spesielle endelige fargen som produseres av forsøks-sammensetningen avhenger av konsentrasjonen av analytten. Endelig vedrører foreliggende oppfinnelse en flerlagsforsøks-innretning for visuell bestemmelse av glukose i en kropps-vaeskeprøve, kjennetegnet ved at den innbefatter (a) et inert bærerelement, og anbragt laminært i forhold til dette; (b) minst to lag bestående av en hydrofil bærer, et lag inneholdende en av den første eller tredje oksyderte indi-katorkomponenten og det andre laget inneholdende (i ) nikotinamidadenindinukleotid,

(ii) en glukosedehydrogenase som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid ved reaksjon

med glukose,

(iii) et disulfidsubstrat,

(iv) den andre av den oksyderte første indikatoren eller den oksyderte tredje indikatoren, (v) en katalysator som har diaforaseaktivitet som er i stand til å understøtte reaksjonen mellom den reduserte formen av nikotinamidadenindinukleotid og den oksyderte første og tredje indikatoren slik at

det produseres redusert første og tredje indikator,

(vi) en disulfidreduktase, og

(vii) en tiolindikator; hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom det genererte reduserte nikotinamidadenindinukleotidet og disulfidsubstratet slik at det produseres et produkt som kan

redusere tiolindikatoren;

hvorved innretningen er i stand til å generere et område av farger, hvor den spesielle endelige fargen som produseres i forsøksinnretningen avhenger av konsentrasjonen av glukose i prøven.

Baerermatriksen som anvendes kan være en hvilken som helst av de mange som er kjente innen industrien, så lenge som matriksen kan inkorpores med sammensetningen og ikke påvirker reaksjonene som er påkrevet for fargedannelsen. Disse innbefatter papir og filmer som f.eks. er fremstilt fra naturlige polymerer, latekser, polyuretaner, silikoner eller kombinasjoner av disse.

For å oppnå de klarest mulige fargene, er en klar bærermatriks foretrukket. Idet felles analytter for foreliggende oppfinnelse er vannoppløselige forbindelser, som f.eks. de som finnes i kroppsvæsker, er bærermatrikser som kan inne-holde vann, så som hydrofile bærere, foretrukket. Egnede hydrofile bærere innbefatter agarose, gelatin, poly(vinyl)-alkohol, poly(propylimin), karragenan og alginsyre. Andre bærere kan benyttes. Blandede flerlagsbærere bestående av en absorberende opak matriks, så som papir, og et hydrofilt (f.eks. gelatin) bærerlag kan med fordel anvendes når forsøkssammensetningene er oppdelt i seksjoner uten innbyrdes forbindelse.

I en foretrukket utførelse ble en oppløsning av 1,25$ karbodiimid benyttet for å kryssbinde en flerlags gelatin-bærermatriks. Dette gir en utgave som er egnet for en glukosepåvisning i fullblod som tillater blodprøven å fjernes fra f orsøksinnretningen ved at overflaten avstrykes. Andre beleggingsmaterialer, som er velkjente innen teknikken, kan benyttes for å gjøre det mulig å vaske eller avtørke innretningen for å fjerne en fargeprøve dersom dette er nødvendig.

Det hydrofile bærerlaget eller -lagene belegges på et fast baksidelag eller støtteelement så som polystyren, polyester og lignende. Baksidelaget kan være opakt eller transparent, selv om et opakt hvitt baksidelag normalt er foretrukket for visuelt avleste forsøk.

Antallet og typene av komponenter som kan benyttes i de uavhengige katalytiske systemene beskrevet ovenfor økes ved anvendelsen av oppdeling i seksjoner uten innbyrdes forbindelse av mulige inkompatible komponenter i en utførelse av forsøksinnretningen. Oppdelingen i seksjoner kan finne sted på mange måter. Komponenter kan separeres ved at noen plasseres i et separat lag, ved oppløseliggjørelse innenfor en fase av en emulsjon, ved utfelling, ved innkapsling osv. Noen av de tilgjengelige fremgangsmåtene er beskrevet i eksemplene.

En flerlagsgelatinbærer ble foretrukket for oppdeling i seksjoner uten innbyrdes forbindelse. INT kunne plasseres i et lag borte fra de andre indikatorkomponentene. Det ble også funnet at posisjonen av komponentene i forskjellige lag kunne endre den synlige fargen for brukeren ved en spesiell analyttkonsentrasjon og derfor ga en annen mulighet for kontroll av den genererte fargen. Den tilsynelatende fargen av innretningen kan endres ved å endre rekkefølgen eller tykkelsen av lagene.

Et spesielt eksempel som viser virkningen av oppdelingen i seksjoner for komponenter i forskjellige lag på den synlige fargen for brukeren, skal beskrives i detalj nedenfor.

En "RAINBOW"-forsøksinnretning for bestemmelse av glukose kan fremstilles med følgende uavhengige katalytiske reaksjoner:

NADH-genererende system:

glukose (analytt)

glukosedehydrogenase (enzym)

NAD (ekstra komponent)

første uavhengige katalytiske system

diaforase (katalysator)

DCIP (oksydert første indikator, blå)

INT (oksyderte tredje indikator, fargeløs)

DCIP ble først redusert av NADH. Derfor gir det første uavhengige katalytiske systemet en fargeendring fra blått til fargeløs og deretter en fargeendring fra fargeløs til rødt som er synlig for brukeren.

Andre uavhengig katalytisk system:

lipoamid (disulfidsubstrat)

1ipoamiddehydrogenase (disulfidreduktase)

DTNB (tiolindiaktor, oksydert andre indikator, fargeløs)

Oppdeling i seksjoner uten innbyrdes forbindelse av de oksyderte indikatorene, f.eks. plassering av indikatorene i forskjellige gelatinlag, kan effektivt endre fargen som observeres ved forskjellige glukosekonsentrasjoner selv om konsentrasjonene av forsøkskomponentene er de samme. Som et eksempel ble tre filmer fremstilt med indikatorene arrangert i forskjellige lag, men konsentrasjonen av komponentene i den samlede forsøkssammensetningen ble holdt konstante.

I gelatin er visse vannoppløselige molekyler, så som DNTB, i stand til å diffundere gjennom gelatinen etter kontakt med en vandig prøve, mens andre, så som INT ikke lett migrerer.

I film A reagerer glukose med enzymene. Deretter reagerer det produserte NADH med DCIP og DTNB. Imidlertid er reduksjonen av INT forsinket inntil NADH kan diffundere inn i det nedre laget av filmen. Ved 250 mg/dl glukose er film A gul-oransje.

I film B må glukosen diffundere gjennom INT-laget før den når enzymene og kan reagere og danne NADH. Med produksjonen av NADH vil DCIP reduseres, men reduksjonen av INT er forsinket idet NADH må diffundere tilbake til topplaget før INT kan reduseres. Derfor er, ved 250 mg/dl glukose, film B gul-grønn. Seksjonsoppdelingen av INT over enzymene og andre indikatorkomponenter har endret den observerte fargen ved denne spesielle glukosekonsentrasjonen.

I film C reagerer glukosen med enzymene i topplaget. Ettersom NADH migrerer gjennom INT-laget, forårsaker en liten mengde av redusert INT en svak rødfarge. Ettersom NADH migrerer gjennom til bunnlaget, reduseres DCIP og DTNB. Til sist, idet ikke all NADH har reagert på grunn av konsentrasjonen av komponentene som er valgt, vil NADH reagere med INT. Ved 250 mg/dl glukose er film C rød-oransje.

Det endelig målet med foreliggende oppfinnelse var å generere distinkt forskjellige farger ved forskjellige analyttkonsentrasjoner. Det er blitt vist at dette målet kan oppnås med forsøkssammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse med en rekke fremgangsmåter som sammenfattet nedenfor. 1) Det velges oksyderte indikatorer som vil generere den ønskede fargen eller blir fargeløse ved reduksjon. 2) Det velges indikatorer for reaksjon i et spesielt katalytisk system som har forskjellige reduksjonspotensialer som vil kontrollere rekkefølgen av reaksjonene i dette

systemet.

3) Mengdene av komponenter i de uavhengige katalytiske systemene kontrolleres slik at komponentene innbefattet i en reaksjonssekvens er i det vesentlige forbrukt ved

valgte analyttkonsentrasjoner.

4) Mengden av katalysator i et system økes (eller reduseres). Dette vil øke (eller redusere) hastigheten for vekselvirkning eller reduksjon av indikatorkomponentene ved dette systemet og derfor endre den tilsynelatende fargen ved en

spesiell analyttkonsentrasjon.

5) Komponentene av reaksjonssystemet oppdeles i seksjoner i en forsøksinnretning. Fordelene med oppdeling i seksjoner kan innbefatte evnen til å: endre den tilsynelatende endelige fargen av innretningen selv når komponentkonsen-trasjonene er de samme; anvende inkompatible indikatorer eller vannuoppløselige indikatorer; og anvende enzymsystemer som normalt inhibieres av tiolindikatorer. 6) Det tilsettes et farge-retardasjonsmiddel som vil forsinke reaksjonene for de uavhengige katalytiske systemene.

Fremgangsmåtene foreslått ovenfor kan kombineres.

Oppfinnelsen skal nedenfor illustreres ved hjelp av følgende eksempler:

Eksempler

Forkortelser

Eksempel 1: Fremstilling av forbindelser

A. N-( 2 , 3-dimetyl-5-okso-l-fenyl-3-pyrazolin-4-yl)-2-klor-6-sulfo-4-iminobenzokinon (TR-1)

TR-1 er en indikator som er rød i oksydert form og er fargeløs ved reduksjon. Den har et reduksjonspotensial svarende til DCIP og har vært benyttet for å .fremstille en "omvendt" "regnbue". TR-1 ble fremstilt på følgende måte: Ammoniumhydroksyd (IN, 10 ml) ble tilsatt til en blanding av 0,4 g (1,9 mmol) 4-aminoantipyrin og 0,5 g (1,7 mmol) 2-hydroksy-3,5-diklorbenzensulfonsyredinatriumsalt i 50 ml vann. Etter kort omrøring ble 1,3 g (3,8 mmol) kaliumferricyanid (K3Fe(CN)£,) tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i en time. Blandingen ble filtrert slik at det ble oppnådd 0,2 g ( 21%) av et mørkt brunt faststoff. Produktet var homogent ved tynnsjiktskromatografi (silikagel, med 4:1 kloroform/metanol) og var tilsynelatende en blanding av alkali- og ammoniumsalter.

Analyse: Beregnet for C^yHigClNsOsNa:

C, 47,54; H, 3,04; N, 9,72

Funnet: C, 46,10; H, 3,61; N, 11,00

<1>H NMR (D6DMS0) S: 7,80-7,20 (m, 7H), 3,40 (s, 3H), 2,53 (s,

3H),

IR (KC1): 1660, 1630, 1400 cm-<1>

B. 3-N - ( 3-dimetylaminopropyl)karboksamido-4-nitrofenyldlsul-fid (3-ND)

En vannoppløselig analog av 5 ,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre) ble fremstilt for anvendelse som en tiolindikator. Dette er en foretrukket indikator for anvendelse med disulfidreduktasesystemet som er fargeløs i oksydert form og blir gul ved reduksjon. Forbindelsen, 3-ND, ble fremstilt på følgende måte: En suspensjon inneholdende 7,93 g 3-karboksy-4-nitrofenyldi-sulfid (20 mmol), 1,2 ml tørr N,N-dimetylformamid (1,55 mmol), 11,7 ml tionylklorid (60,3 mmol), og 400 ml diklormetan (CHgClg) ble oppvarmet under tilbakestrømning i fire timer og ble deretter omrørt over natten ved romtemperatur. Den resulterende klare oppløsningen ble inndampet i vakuum (12 mm etterfulgt av 0,1 mm Hg) til et gult faststoff. Resten ble deretter plassert under en argonatmosfære, oppløst i 200 ml CH2CI2, avkjølt til 0°C, og deretter behandlet med 10,1 ml 3-dimetylaminopropylamin (80 mmol). Reaksjonsblandingen ble mørk oransje og en utfelling ble dannet. Den resulterende oppløsningen fikk oppvarmes til romtemperatur over natten. Reaksjonsblandingen ble deretter trinnvis ekstrahert fire ganger med 200 ml porsjoner av 5$ natriumbi-karbonatoppløsning, to ganger med 200 ml vann, og en gang med saltvannsoppløsning. Det organiske laget ble deretter tørket over magnesiumsulfat, filtrert, og konsentrert slik at det oppsto 9,39 g av en mørk oransje olje. Blandingen ble deretter flammekromatografert på 500 g Si02-60 (70-230 mesh) bragt til likevekt og eluert med 50:10:1 diklormetan/- metanol/konsentrert ammoniumhydroksydoppløsningsmiddel-blanding. Fraksjonene 110 til 205 inneholdende det rensede produktet ble samlet og konsentrert i vakuum slik at det oppsto 7,06 g av et oransje faststoff. Råproduktet ble rekrystallisert fra etylacetat ved anvendelse av en behandling med pulverisert kjønrøk, så som noritt, og diatomé-jord, et filtreringshjelpemiddel tilgjengelig under betegnelsen "Celite". Det ble oppnådd 5,47 g lysegule krystal-ler etter tørking ved 55 °C, 0,1 mm Hg. Utbytte = 48,4$. Smp. 152-156°C.

Analyse: Beregnet for C24<H>32<N>5O5S2:

C, 51,05; H, 5,71; N, 14,88

Funnet: C, 51,05; H, 5,56; N, 14,62

PMR (60 MHz, CDCI3) S: 1,73 (kvintett, J=6Hz, 4H); 2,17 (s, 12H); 2,45 (t, J= 6Hz, 4H); 3,53 (q, J=6Hz, 4H); 7,57 (s, 2H); 7,65 (dd, J=7Hz, 2Hz, 2H); 8,02 (m, 2H, N-H); 8,03 (d, J-7Hz, 2H)

IR(KBr) cm"<1>: 3260, 3060, 2940, 2870, 2820, 2790, 1650, 1560, 1530, 1470, 1345.

Massespektrum (FAB) m/e: 565 (M+l, 13,6$).

C. Dibutyl-5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoat) (EA1)

Denne forbindelsen, som her betegnes som EA1, er en lipofil analog av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre ). Den ble fremstilt for anvendelse som en tiolindikator på følgende måte: En suspensjon inneholdende 6,85 g (17,25 mmol) av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre), 3,6 ml tionylklorid, 0,346 ml N,N-dimetylformamid og 350 ml diklormetan ble oppvarmet til tilbakestrømning i 3 timer. Ytterligere tionylklorid (3,46 ml) og N,N'-dimetylformamid ble tilsatt og oppvarmingen til tilbakestrømning ble fortsatt i 2 timer. En klar, lys grønn oppløsning ble oppnådd, dette indikerer fullstendig omvand-ling til bissyrekloridet. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum og det resulterende lysegrønne faste stoffet ble plassert under en argonatmosfære. Resten ble deretter suspendert i 100 ml pyridin og behandlet med 20 ml n-butanol. En svakt eksoterm og en mørknet, men homogen reaksjon ble oppnådd, blandingen ble omrørt over natten. Reaksjonsopp-løsningsmidlene ble fjernet i vakuum og resten ble oppløst i 300 ml kloroform. Det organiske laget ble deretter trinnvis ekstrahert tre ganger med 200 ml 0,1 N HC1, to ganger med 200 ml 5$ Na HC03-oppløsning, og med 200 ml saltvannsoppløsning. Tørking (MgSC^), filtrering, og fjernelse av oppløsnings-middel ga 12,79 g av en olje som ble oppløst i etylacetat og adsorbert i vakuum på en liten mengde "Si02-60". Det impregnerte faste stoffet ble deretter plassert på toppen av en kolonne av 500 g "Si02-60" (230-400 mesh) som var pakket og bragt i likevekt med 8:1 heksan-etylacetat. Kolonnen ble deretter flashkromatografert ved anvendelse av denne oppløsningsmiddelblandingen og fraksjoner på 25 ml ble samlet. Fraksjonene 190-270 ble samlet og konsentrert slik at det -oppsto 8,07 g produkt som en olje som størknet ved en henstand (92$ utbytte).

Analyse: Beregnet for:

C, 51,96; H, 4,76; N, 5,08 Funnet: C, 52,49; H, 4,88; N, 5,45 PMR (60 MHz, CDC13) S: 0,97 (t, J=7Hz, 6H, CE3-CE2); 1,2-1,9 (m, 8E, -CE2-CH2-); 4,37 (t, J=6Hz, 4H, -0-CH2-CE2-) 7,77 (s, 2H, C6E); 7,83 (AB kvartett, J=8Hz, E, C3E, C4E) IR (KBr)cnT<1>: 1730

Massespektrum: E.I. (70 EV) m/e = 508 (37$, M<+>).

D. Dimety1-5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoat)

Denne forbindelsen er en lipofil analog av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre), som ble fremstilt for anvendelse som en tiol-indikator på følgende måte: En suspensjon inneholdende 7,93 g (20 mmol) av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre), 1,2 ml N,N-dimetylformamid, 11,7 ml tionylklorid, og 400 ml diklormetan ble oppvarmet under tilbakestrømning i 4 timer inntil det ble oppnådd en klart grønn oppløsning. Oppløsningsmidlene ble deretter fordampet i vakuum slik at det ble oppnådd et gult faststoff som deretter ble plassert under en argonatmosfære, oppløst i 200 ml diklormetan og avkjølt til 0°C. Den omrørte blandingen ble deretter behandlet med 4,03 ml tørr pyridin (50 mmol) og 30 ml metanol. Den resulterende blandingen fikk deretter oppvarmes til romtemperatur over natten, reaksjonsblandingen ble deretter suksessivt ekstrahert tre ganger med 300 ml 5$ NaHC03~oppløsning, tre ganger med 300 ml 1 M sitronsyre, og 300 ml saltvannsoppløsning. Tørking (MgSO,^), filtrering og fjernelse av oppløsningsmidlene ga 8,29 g av et gult faststoff som ble rekrystallisert i to porsjoner fra toluen som et lyst gult faststoff med 92$ utbytte. Smp. 103-104,5°C.

Analyse: Beregnet for: C, 45,28; H, 2,86; N, 6,60.

Funnet: C, 45,74; H, 3,01; N, 6,25.

PMR (60 MHz, CDC13) S: 3,93 (s, 6H, -O-CH3); 7,8 (s, 2H, CfcH); 7,83 (AB kvartett, J=8Ez, 4H, C3H, C4H).

IR (KRr) cm-<1>: 1740

Massespektrum: EI (70EV) m/e: 424,3 (M<+>, 67,7$).

E. 3,6-dioksaoktyl-5,5'-ditio-(2-nitrobenzoat)

Denne forbindelsen er en vannoppløselig analog av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre). Den ble fremstilt for anvendelse som en tiolindikator på følgende måte: En suspensjon inneholdende 7,93 g (10 mmol) 5,5'-ditio-(2-nitrobenzosyre), 1,17 g N,N-dimetylformamid, 11,7 ml tionylklorid, og 400 ml diklormetan ble oppvarmet til tilbakestrøm-ning under omrøring i 2 timer slik at det ble oppnådd en klar oppløsning. Oppløsningsmidlene ble fjernet i vakuum slik at det ble oppnådd et lyst grønt faststoff som ble plassert under argon, avkjølt til 0°C og suspendert under omrøring i 120 ml tørr pyridin. "Carbitol" (20 ml) ble deretter tilsatt, og den resulterende blandingen ble en oransje-rød homogen oppløsning etter 1 times reaksjonstid ("Carbitol" er kjemisk betegnet 2-(2-etoksyetoksy)etanol). Blandingen fikk deretter nå romtemperatur over natten. Prøven ble deretter fordampet i vakuum til en mørk olje og f lashkromatograf ert på 500 g "Si02-60" (230-400 mesh) pakket og eluert med en 0,5$ metanol-kloroformoppløsningsmiddelblanding. Fraksjoner på 25 ml ble samlet. Fraksjonene 150-186 ble samlet og konsentrert slik at det oppsto 7,86 g av én gul olje. Prøven ble deretter oppløst i eter, behandlet med 4 g "Norit", filtrert gjennom "Celite", og utfelt som en tett gul olje med heksan. Oppløs-ningsmidlene ble deretter avdekantert og de gjenværende oppløsningsmidlene ble fjernet i vakuum ved 40°C (0,1 mm) i 1 time slik at det oppsto 5,48 g av en viskøs, gul olje (44$ utbytte).

Analyse: Beregnet for: C, 49,67; H, 51,13; N, 4,46.

Funnet: C, 49,41; H, 5,09; N, 4,37.

PMR (60 MHz, CDC13) §: 1,2 (t, J=7Hz, 6H, CH3-CH2-0-); 3,5 (q, J=7Hz, 4H, CH3-CH2-0-); 3,6 (s, 8H, -CH2-CH2-0-); 3,8 (m, 4H) ,

; 4,5 (m, 4H, 7,8 (s, 2H, C6H); 7,82 (AB kvartett, J=8Hz, 4H, C3H, C4H). IR (CHCl3)cm-<1>: 1740

F. 3,6,9,12-tetraoksadodecyl-5,5'-ditio-(2-nitrobenzoat) og

1,12-cyklisk diester

Begge disse forbindelsene er vannoppløselige analoger av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre). De ble fremstilt for anvendelse som tiolindikatorer på følgende måte:

En suspensjon inneholdende 7,93 g (20 mmol) av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre), 11,7 ml tionylklorid, og 1,2 ml N,N-dimetylformamid ble oppvarmet til tilbakestrømning i 2 timer slik at det ble oppnådd en klar gul oppløsning. Oppløsnings-midlene ble fjernet i vakuum slik at det oppsto et lyst grønt faststoff som ble oppløst i en blanding av 50 ml diklormetan og 5 ml pyridin. Denne oppløsningen ble sakte tilsatt til en oppløsning ved 0°C av 34,5 ml (38,8 g, 200 mmol) av tetra-etylenglykol i 100 ml diklormetan under en argonatmosfære. Reaksjonsblandingen fikk nå romtemperatur over natten. Fordampning av oppløsningsmidlene i vakuum ga en brun olje som ble fordelt mellom kloroform og vann. Det vandige laget ble igjen ekstrahert med kloroform og de samlede organiske lagene ble vasket med saltvannsoppløsning og tørket (Na2S04). Filtrering og fordampning av oppløsningsmidlene i vakuum ga en oransje olje som ble flashkromatografert på 500 g "Si02-60" (230-400 mesh) pakket og eluert med en 5$ metanol-kloroformoppløsningsmiddelblanding. Fraksjoner på 25 ml ble samlet. Fraksjonene 24-38 ble samlet og konsentrert slik at det oppsto 2,21 g av et gult glass. Dette ble identifisert som 1,12-cyklisk-3,6,9,12-tetraoksaundecylesteren av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre). Utbyttet av den cykliske esteren var 20$. <13>C NMR (22,5 MHz, CDC13) S: 66,8, 68,3, 70,4 (alle -0-CH2-CH2-0-); 128,8, 142,4, 146,3 (aryl C); 164 ,3 IR (CHO^cnT1: 1730 cm"<1>

Fraksjonene 91-101 ble samlet og konsentrert slik at det oppsto 3,94 g av den ventede 3,6,9,12-tetraoksadodecyldi-esteren. (26$ utbytte).

<13>C NMR (22,5 MHz, CDCI3) S: 61,6, 65,6, 68,3, 70,2, 70,5, 72,4 (alle -0-CH2-CH2-0-); 129,0, 142,4, 146,5 (aryl C);

164 ,5

PMR (60 MHz, CDC13): integreringsforhold for alifatiske til aromatiske protoner =5,6.

IR (CHCl3)cm_<1>: 3600-3350 (-CH2-0H-tøyning):

1730

Eksempel 2: Glukosesammensetninger

Glukoseforsøksinnretninger som er nyttige for undersøkelse av fullblod kan fremstilles på følgende måte. Redusert nikotinamidadenindinukleotid var det felles substratet og ble generert fra glukose ved hjelp av glukosedehydrogenase. Den generelle kjemien for "RAINBOV-glukosesammensetningene er vist skjematisk på etterfølgende side. Tiolindikatoren, DTNB, betegnes vanligvis Ellman's reagens.

A. Alternativ 1: Diaforase/NBT/TR-1

Alternativ 2: Lipoamiddehydrogenase/lipoamid/DTNB

Fremgangsmåte: Komponentene av hver oppløsning ble blandet ved 40°C i angitt rekkefølge. Oppløsningene ble avgasset før belegging. Lag 1 ble påført på et polyester-baksidelag og tørket. Lag 2 ble påført på lag 1 og tørket og så videre. Den endelige innretningen besto av tre gelatinlag på et poly-esterbaksidelag. Karbodiimidbehandlingen kryssbinder gelatin-matriksen slik at det tilveiebringes en hårdere overflate som tillater avtørking av overflaten av innretningen.

Doserespons: Med økende glukosekonsentrasjon fra 50 til 600 mg/dl var fargesekvensen fra svakt rød til olivengrønn til blåsort.

B. Alternativ 1: MPMS/DCIP/INT

Alternativ 2: Glutationreduktase/glutation/DTNB

Fremgangsmåten som ble benyttet for fremstilling og undersøk-else av innretningen var analog fremgangsmåten i eksempel 2A.

Doserespons:

Fargene blå til rosa til burgunder kan lett adskilles visuelt.

C. Alternativ 1: MPMS/DCIP/INT

Alternativ 2: LipDH/lipoamid/DTNB

Fremgangsmåten som ble benyttet for fremstilling og undersøk-else av innretningen tilsvarte fremgangsmåten angitt i eksempel 2A.

Doserespons:

Fargene blå, grønn, gul, oransje kan lett adskilles visuelt.

D. Alternativ 1: DCIP/INT/MPMS

Alternativ 2: LipDH/lipoamid/3-ND

Fremgangsmåten som ble anvendt for fremstilling og undersøk-else av innretningen var fremgangsmåten angitt i eksempel 2Å.

Doserespons:

Med denne sammensetningen, ved anvendelse av DTNB-derivåtet 3-ND, var genereringen av den endelige fargen for forsøksinn-retningen, som var synlig for brukeren, fullstendig i løpet av 8 minutter.

E. Alternativ 1: MPMS/DCIP/INT

Alternativ 2: LipDH/lipoamid/3-ND

Doserespons:

Denne innretningen viser en "RAINBOW" med fullstendig spektrum, blå, grønn, gull, oransje og rød. Den fargen som er synlig for brukeren avhenger av konsentrasjonen av glukose og dannes i løpet av 7.til 8 minutter.

F. "RAINBOW-glukoseforsøksinnretning for fullblod Alternativ 1: Diaforase/DCIP/INT

Alternativ 2: LipDH/lipoamid/3-ND

Fremgangsmåten som ble anvendt for fremstilling av innretningen var fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2A. Forsøket ble utført med prøver av fullblod bragt til de ønskede glukosenivåene, analysert med en "YSI"-glukoseanalysator. Doseresponsresultatene er gjengitt nedenfor. Forsøksinn-retningen, inneholdende en forsøkssammensetning ifølge oppfinnelsen i oppdelte seksjoner ved lagdeling i en gelatinbærer, viste en fullspektret "RAINBOW" over en glukosekonsentrasjon fra 0 til 800 mg/dl. Sammensetningen var utformet for å gi en grønn farge over det normale blod-glukoseområdet.

Doserespons:

G. Regnbue: Varierende enzymkonsentrasjon.

Det følgende eksemplet ble utformet for å vise hvordan den endelige fargen som produseres kan kontrolleres ved å endre konsentrasjonen av enzymene.

Alternativ 1: Diaforase/DCIP/INT

Alternativ 2: LipDH/lipoamid/3-ND

Filmene ble fremstilt og undersøkt som beskrevet i eksempel 2A. Resultatene er gjengitt i den følgende tabellen.

Eksempel 3: " RAINBOW" av papir

Selv om flerlagsgelatin er en foretrukket matriks for en "RAINBOW-innretning kan det fremstilles en innretning ved anvendelse av papir som bærer. En oppløsning av følgende sammensetning, utført i den angitte rekkefølgen, ble fremstilt. Bufferen var TÅPSO, pH 7,4. Både polyvinylalkohol (PVA) og rekkefølgen for tilsetning av reagens var kritisk i dette eksemplet. En konsentrasjon på 1 til 1,5$ PVA forhindrer samutfelling av DCIP og INT i en papirmatriks.

"Whatman 31 ET"-papir ble impregnert med denne oppløsningen og tørket ved 50°C. Det tørkede papiret ble oppdelt og montert på et plastbaksidelag slik at det ble dannet forsøks-bånd. Forsøksbåndene ble analysert med NADH-oppløsning og resultatene er gjengitt nedenfor.

NADH- konsentras. ion ( mM)

Eksempel 4: NADH- genererende systemer inneholdende enzymer

som er følsomme for tiolreagenser

Et generelt problem med tioldeteksjonsreagenssystemet, foretrukket for anvendelse med NADH som et felles substrat, er at tiolindikatorene kan reagere med proteinsystemer, dette fører ofte til inaktivering av enzymer. Mange slike enzym-inhiberinger forårsaket av DTNB er beskrevet i litteraturen. Det finnes to generelle løsninger, begge innbefatter oppdeling i seksjoner av tiolreagensen: (1) utskillelse av tiolindikatoren i en organisk fase eller som uoppløselige partikler; (2) fysikalsk reparering av det følsomme enzymet og tiolreagensen ved immobilisering av sistnevnte.

A. Fremgangsmåte (1) - Adskillelse av reagensen.

En vannuoppløselig analog av DTNB, EA1 ble benyttet (for fremstilling se eksempel 1C).

Det finnes to fremgangsmåter for avsondring av reagensen: (a)

EA1 ble oppløst i en olje og dispergert som en emulsjon i en gelatinf ilm.

Organisk fase: EA1 (300 mM) ble oppløst i trikresylfosfat med trioktylamin (1$).

Oljefasen ble emulgert med den vandige fasen i en "Waring"-blander til en endelig konsentrasjon på 5$. Lipoamiddehydrogenase (13,3 U/ml) ble tilsatt til emulsjonen. Emulsjonen ble belagt på en plastbærer (170 pm) og tørket ved romtemperatur.

Behandling av den tørkede filmen med NADH/lipoamid (ca. ImM) ved pH 8,5 (tris-buffer) ga meget rask bleking av den blå fargen av DCIP og dannelsen av gul farge ved EAl-reagensen. Uten NADH var det ingen reaksjon.

Enzymet laktatdehydrogenase (LDH) som inhiberes av DTNB, ble undersøkt med denne filmen. LDH, ca. 150 U/ml, og lipoamid (ca. 1 mM) i ca. 25 0 mM laktat, pH 8,5, ga en gul farge i løpet av ca. 10 minutter. Blindprøven, uten LDH, var ufarget. Konklusjonen er at anvendelsen av en olje-oppløselig tiol-indikator, dersom den er oppdelt i seksjon en oljeemulsjon, tillater anvendelsen av enzymer som vanligvis antas å være følsomme for tiolreagenser.

b. EA1 avsatt direkte i papir

EA1 ble oppløst i toluen til en konsentrasjon på 5,7 mM. "Whatman 31 ET"-papir ble impregnert med denne oppløsningen og tørket ved 5°C. En andre oppløsning ble fremstilt med følgende bestanddeler:

(Tris)2~sulfat er tris-buffer regulert til den ønskede pH med svovelsyre.

Det tørkede papiret ble dyppet i den andre oppløsningen og tørket igjen ved 50°C og festet til en plastbærer.

Forsøksoppløsninger for LDE inneholdt L-laktat (167 mM), (tris)2-sulfat, pH 8,5, (0,33 M) og LDE-enzym (kaninmuskel), forsøksresultatene er angitt i den følgende tabellen.

LDE- konsentrasj on ( u/ ml)

Meget god fargeadskillelse ble oppnådd mellom de forskjellige nivåene av LDE.

Forsøksoppløsning for alkoholdeteks. ion

Denne oppdelte filmens evne til å håndtere analyser som krever anvendelsen av et enzym som er følsomt for tiolrea-gensene ble videre undersøkt ved anvendelse av alkoholdehydrogenase.

Det ble fremstilt forsøksoppløsninger som inneholdt forskjellige konsentrasjoner av etanol, (tris^-sulfatbuffer, 0,5 M, pH 8,5 og alkoholdehydrogenase (fra Baker's gjær, 22,5 U/ml ).

Det ble anvendt forsøksbånd fremstilt som beskrevet ovenfor. Resultatene er gjengitt i den følgende tabellen.

Etanolkonsentras. ion ( mg/ dl)

Meget god adskillelse mellom forskjellige nivåer av alkohol ble observert.

Fra disse forsøkene ble det konkludert med at "RAINBOW"-systemet med anvendelse av en tioldeteksjonsreagens kan benyttes med enzymer som er følsomme for tiolreagens.

B. Fremgangsmåte 2: Fysisk separasjon av tiolreagens-følsomt

enzym og tiolreagens ved immobilisering av sistnevnte. DTNB kan kovalent bindes til et stort molekyl eller kan fanges fysisk i en matriks så som gelatin, som bare tillater gjennomtrengning av små molekyler. Derfor ventes ingen direkte vekselvirkning mellom enzymet og tiolreagensen.

Fremstilling av immobilisert DTNB

DTNB ble bundet til humanserumalbumin ved karboksylfunksjonen ved anvendelse av en vannoppløselig karbodiimidreagens som angitt nedenfor.

En 30$ oppløsning av humant serum albumin ble fremstilt som 0,2M i nantriumf osf at, og pH ble regulert til 4,7. Den ble deretter fortynnet til 4,8$ albumin. DTNB (10,7 mM) og 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDAC, 10,7 mM) ble oppløst i en liten mengde etanol og under kraftig omrøring tilsatt til albuminoppløsningen som ble holdt ved 0°C. Etter 2 til 3 timer ble det lett gelerte materialet overført til dialyserør og dialysert grundig mot vann. Det ble deretter lyofilisert.

Det skorpeaktige gule faste stoffet ble pulverisert til et fint pulver og dispergert i 10$ gelatin til en konsentrasjon på 1$. Et belegg ble fremstilt og tørket ved romtemperatur.

Filmen ble vurdert med følgende forsøksblanding:

Når den ble bragt i kontakt med denne oppløsningen, ga filmen en klart gul farge i løpet av ett minutt. En kontrollopp-løsning, uten LDH, ga ingen farge.

Konklusjonen er at immobilisering av tiolreagensen tillater analyse med tiolreagens-følsomme enzymer.

Den samlede konklusjonen er at selvom mange enzymer, så som alkoholdehydrogenase og kolesteroldehydrogenase, inhiberes ved DTNB ifølge litteraturen, finnes det mange måter å unngå denne inhiberingen på. Følgelig er et andre katalytisk system som innbefatter tiolindikatorer generelt anvendelige ved analyser av NADH som et mellomtrinn og kan benyttes til å bestemme alkohol eller kolesterol som analytter.

Eksempel 5: Diffunderbar/ ikke- diffunderbar fargereaksjon

En annen fremgangsmåte for generering av en "regnbue" er hvor fargen av forsøkssammensetningen gjøres synlig for brukeren som et resultat av diffusjon. Dersom en indikator f.eks. er ute av stand til å diffundere fordi den er kovalent bundet til en matriks, og denne matriksen er dekket med et opakt lag vil indikatoren være usynlig fra toppen. Dersom, som et resultat av en reaksjon, den kovalente bindingen mellom indikatoren og matriksen brytes vil indikatoren kunne diffundere gjennom det opake dekklaget og bli synlig.

Som et eksempel ble det fremstilt en film som beskrevet i eksempel 4B, hvor DTNB var kovalent bundet til albumin og som deretter ble inkorporert med en gelatinmatriks. "Whatman 31 ET" ble impregnert med en oppløsning inneholdende:

Det impregnerte papiret ble tørket ved 50°C. Stykker av det tørkede papiret ble skåret og lagt på gelatinfilmen. Papiret var helt opakt. En NADH-oppløsning ble tilsatt til flerlags-innretningen fremstilt på denne måten og vann til en annen innretning som skulle benyttes som en kontroll. I løpet av ca. 20 sekunder begynte innretningen som ble bragt i kontakt med NADH å bli gul og utviklet raskt en dyp gulfarge. Kontrollpapiret viste ingen farge.

En LDH-analyse ble utført med følgende oppløsning:

LDH (ca. U/ml) ble tilsatt til denne oppløsningen og 30 pl av oppløsningen ble tilsatt til en av flerlagspapir/gelatin-innretningene beskrevet ovenfor.

Etter ca. 5 1/2 minutt viste LDH-papiret en svak, men definitiv gul farge. Kontrollpapiret, uten LDH, viste ingen farge.

Konklusjonen er at indikatorer virkelig kan gjøres diffunder-bare som en funksjon av analyttkonsentrasjon.

Ved denne fremgangsmåten er indikatormolekylet en kombinasjon av en fargebestemmende (kromofor) del og en reaktiv (spalt-bar) del. Disse kan isoleres elektronisk slik at spaltning av den sammenholdende bindingen ikke i betydelig grad endrer fargen av indikatoren. Mengden, eller intensiteten, av indikatoren kan kontrolleres ved aktiviteten av det katalytiske systemet innbefattet i' den reduserende spaltningen, og fargen som genereres bestemmes uavhengig av den kromofore delen av molekylet. Dette er en betydelig fordel idet det kan være vanskelig å finne indikatorer med en egnet kombinasjon av farge og henholdvis å generere den ønskede sluttfargen.

Andre matrikser hvortil en tiolindikator kan immobiliseres ved oksydasjon er: tiolagarose eller et hvilket som helst protein ved anvendelse av en bifunksjonell reagens, f.eks. Lomanfs reagens, ditiobis(suksinimidylpropionat).

Claims (16)

1. Forsøkssammensetning for visuell bestemmelse av analytt i en fluid prøve, karakterisert ved at den innbefatter: (a) et katalytisk system som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid fra analytten; (b) et første uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en redusert første indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid; og (c) et andre uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en redusert andre indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid, hvor genereringen av den reduserte første og andre indikatoren finner sted i det vesentlige samtidig, og hvor det andre uavhengige katalytiske systemet innbefatter (i) en disulfidreduktase; (ii) et disulfidsubstrat; og (iii) en tiolindikator; hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom redusert nikotinamidadenindinukleotid og disulfidsubstratet slik at det dannes et produkt som kan redusere tiolindikatoren slik at den reduserte andre indikatoren dannes; hvorved genereringen av de reduserte indikatorene kontrolleres slik at det tilveiebringes et område av farger, og hvor den spesielle endelige fargen som produseres av forsøks-sammensetningen avhenger av konsentrasjonen av analytten.

2. Forsøkssammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det første eller det andre uavhengige katalytiske systemet er i stand til å produsere en redusert tredje indikator.

3. Forsøkssammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 og 2,karakterisert ved at reduksjon av en indikatorkomponent gir en endring fra en farge til fargeløs.

4 . Forsøkssammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den i tillegg innbefatter et farge-retardasjonsmiddel.

5. Forsøkssammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert ved at genereringen av den endelige fargen av forsøkssammensetningen er i det vesentlige fullstendig i løpet av mindre enn 10 minutter.

6. Forsøkssammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den reduserte andre indikatoren er gul.

7. Forsøkssammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert ved at tiolindikatoren er et disulfid.

8. Forsøkssammensetning for visuell bestemmelse av glukose i en vandig flytende prøve, karakterisert ved at den innbefatter: (a) et katalytisk system som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid ved reaksjon med glukose; (b) et første katalytisk system bestående av en katalysator som har diaforaseaktivitet, en oksydert første indikator og en oksydert tredje indikator som begge er i stand til å reagere med redusert niktotinamidadenindi-nukleotid i nærvær av katalysatoren slik at det dannes en redusert første og tredje indikator; og (c) et andre katalytisk system bestående av en disulfidreduktase, et disulfidsubstrat og en tiolindikator, hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom redusert nikotinamidadenindinukleotid og disulfidsubstratet slik at det dannes et produkt som reduserer tiolindikatoren slik at en redusert andre indikator produseres, hvor genereringen av den første og den andre reduserte indikatoren finner sted i det vesentlige samtidig; hvorved generereringen av de reduserte indikatorene utføres slik at det tilveiebringes et område av farger, hvor den endelige fargen som produseres av forsøkssammensetningen avhenger av konsentrasjonen av glukose i prøven.

9. Forsøkssammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at reduksjonen av minst en av den første, tredje eller tiolindikatoren gir en endring fra en farge til fargeløs.

10. Forsøksinnretning for visuell bestemmelse av en analytt i en fluid prøve, karakterisert ved at den innbefatter: (a) en bærermatriks; og (b) en forsøkssammensetning inkorporert i denne, hvor forsøkssammensetningen innbefatter: et katalytisk system som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid fra analytten; et første uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en redusert første indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid; og et andre uavhengig katalytisk system som er i stand til å generere en gul andre indikator ved reaksjon med redusert nikotinamidadenindinukleotid, hvor genereringen av den første og den andre reduserte indikatoren finner sted i det vesentlige samtidig, og hvor det andre uavhengige katalytiske systemet innbefatter (i) en disulfidreduktase; (ii) et disulfidsubstrat; og (iii) en tiolindikator; hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom redusert nikotinamidadenindinukleotid og disulfidsubstratet slik at det dannes et produkt som kan vekselvirke med tiolindikatoren slik at det dannes en gul andre indikator; hvorved genereringen av de reduserte og gule indikatorene utføres slik at det tilveiebringes et område av farger, hvor den spesielle endelige fargen som produseres av forsøks-sammensetningen avhenger av konsentrasjonen av analytten.

11. Forsøksinnretning ifølge krav 10, karakterisert ved at det første eller andre uavhengige katalytiske systemet er i stand til å produsere en redusert tredje indikator.

12. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 10 og 11,karakterisert ved at reduksjonen av minst en av den første eller tredje oksyderte indikatoren gir en endring i fargen av denne indikatoren eller fra en farge til fargeløs.

13. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 10 og 12,karakterisert ved at minst en av de oksyderte indikatorene eller tiolindikatoren er anbragt adskilt inne i bærermatriksen.

14 . Flerlagsforsøksinnretning for visuell bestemmelse av glukose i en kroppsvæskeprøve, karakterisert ved at den innbefatter (a) et inert bærerelement, og anbragt laminaert i forhold til dette; (b) minst to lag bestående av en hydrofil bærer, et lag inneholdende en av den første eller tredje oksyderte indi-katorkomponenten og det andre laget inneholdende (i) nikotinamidadenindinukleotid, (ii) en glukosedehydrogenase som er i stand til å generere redusert nikotinamidadenindinukleotid ved reaksjon med glukose, (iii) et disulfidsubstrat, (iv) ~ den andre av den oksyderte første indikatoren eller den oksyderte tredje indikatoren, (v) en katalysator som har diaforaseaktivitet som er i stand til å understøtte reaksjonen mellom den reduserte formen av nikotinamidadenindinukleotid og den oksyderte første og tredje indikatoren slik at det produseres redusert første og tredje indikator, (vi) en disulfidreduktase, og (vii) en tiolindikator; hvori disulfidreduktasen er i stand til å katalysere reaksjonen mellom det genererte reduserte nikotinamidadenindinukleotidet og disulfidsubstratet slik at det produseres et produkt som kan redusere tiolindikatoren; hvorved innretningen er i stand til å generere et område av farger, hvor den spesielle endelige fargen som produseres i forsøksinnretningen avhenger av konsentrasjonen av glukose i prøven.

15 . Flerlagsforsøksinnretning ifølge krav 14, karakterisert ved at den hydrofile bæreren er gelatin og hvert lag er festet ved belegging.

16. Flerlagsforsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 14 og 15,karakterisert ved at et lag i tillegg innbefatter et farge-retardasjonsmiddel.