NO165446B - Fremgangsmaate for aa generere eller forsterke is-kjernedannelsesaktivitet hos prokaryote mikroorganismeceller. - Google Patents

Abstract

DNA-sekvenser som koder for is-kjernedannelses-aktivitet.isoleres og innfres i encellede verter. De modifiserte verter demonstrerer is-kjernedannelses-aktivitet analog med DNA-kilde-verten. De cellulære produkter finner anvendelse ved inhibering av underkjøling.

Description

Genetisk utvikling har muliggjort en ekstraordinær orden

av biologiske muligher i naturen. De forskjellige organismer eller celler oppnår disse forsjellige funksjoner ved å produsere et bredt utvalg av proteiner, hvorav mange på sin side kan produsere et bredt utvalgt av ikke-protein-molekyler. Disse naturlig forekommende forbindelser kan samvirke med sitt miljø og modifisere miljøet både på godt og ondt.

Det er funnet at visse organismer har evne til kjernedannelse ved dannelse av is. Kjernedannelse av is er av vesentlig kommersiell interesse som en faktor med hensyn til å indusere frostskader på planter, i atmosfæriske utfellingsprosesser og i kommersiell snefremstilling. Derfor kan evnen til å styre is-kjernedannelses-evnen hos mikroorganismer eller å fremstille produkter som har slik kjernedannelses-evne, anvendes i et stort område av landbruks-, kommersielle-, rekreasjons- eller miljø-messige situasjoner. De is-kjernedannende mikroorganismer kan anvendes for å forhindre underkjøling av vann, i snefremstillings-maskiner, i isbaner eller andre situasjoner hvor underkjøling er energi-ineffektivt.

En rekke artikler er publisert vedrørende effekten av bakterier på is-kjernedannelse. Det henvises f.eks. til Lindow et al., Proe. Am. Phytopathol. Soc. (1977) 4.1976:169; Arny et al., Nature (1976) 262:282-283; Lindow et al. Phytophato-logy (1978) 68:523-528; Lindow et al., Appl. Environ. Microbiol.

(1978) 36:831-838; Lindow et al., Proe. Am. Phytopathol. Soc.

(1977) 3.1976:224. Videre henvises til US-patenter nr. 4.045.910, 4.161.084 og 4.200.228. Dessuten henvises dét til den ;samtidige US-søknad nr. 294.604, innlevert 20. august 1981 og referanser angitt deri.

DNA-sekvenser som koder for substanser som har is-kjernedannelses-aktivitet, tilveiebringes. Sekvensene har evne til å bli klonet i en vert som er fremmed for kilden til DNA-sekvensen, og å medføre is-kjernedannelses-aktivitet til en slik vert. DNA-sekvenser, plasmider og transformanter beskrives.

Foreliggende oppfinnelse innebærer isolering av DNA-segmenter som koder for is-kjernedannelses-aktivitet (INA) , og disse DNA-segmenter kan innføres i en egnet vektor. Vektoren kan være et plasmid, virus eller annet selv-replikerende ekstra-kroraosomalt element som kan anvendes for konjugasjon, transformasjon, transduksjon eller transfeksjon for innføring av INA-akti-viteten i en encellet mikroorganismevert. Verten kan deretter dyrkes og klones og INA<+->kloner isoleres. De INA-positive kloner- eller subcellulære deler eller ekstrakter som er avledet fra dem, kan anvendes for is-kjernedannelse ved fremstilling av sne (se US-patent nr. 4.200.228), som kilde for det eller de proteiner som kodes av INA-kodegenet eller -genene, som kilde for andre cellulære substanser som resulterer fra ekspresjon av nevnte gen(er), eller i andre situasjoner hvor vannunderkjøling er uønsket. Oppfinnelsen fremgår av de vedlagte krav.

For å oppnå den DNA-sekvens som koder for INA, kan en organisme anvendes som er kjent for å tilveiebringe is-kjernedannelse. Bekvemt kan forskjellige arter av Pseudomonas, f.eks. syringae, coronafaciens, pisi, tabaci eller fluorescens, Xanthomonas, Xanthomonas, f.eks. translucens, eller Erwinia, f.eks. herbicola, eller én annen organisme som har is-kjernedannelses-aktivitet, anvendes som kilde for fremstilling av et genomisk bibliotek. Forskjellige restriksjons-enzymer kan anvendes som tilveiebringer segmenter med opp til 25kb ved fullstendig eller ufullstendig oppslutning. Disse fragmenter kan deretter klones.

Forskjellige vektorer kan anvendes som har forskjellige spesifisiteter. Plasmider, viruser eller cosmider kan anvendes, som muliggjør insetning av fragmentene fra det genomiske bibliotek for tilveiebringelse av et funksjonelt selv-replikerende ekstrakromosomalt element. Derfor må vektoren ha et passende restriksjonspunkt, eller man må være i stand til å innføre et slikt punkt, som muliggjør en egnet innsetning av de genomiske bibliotek-fragmenter. Det er ønskelig at vektoren kan sørge for et hjelpemiddel for utvelgelse og/eller sortering, via antibio-tisk utvelgelse, forpakningskrav, inaktivering av et gen, eller ved andre hjelpemidler.

Av spesiell interesse er en cosmid-vektor, mer spesielt pLAFRl, som har et unikt EcoRI-punkt. Denne vektor er et derivat av vektoren pRK290 (Tc<r>) som inneholder cos-punktene til fag X for forpakning in vitro. Den er en oligokopivektor med bredt vertsområde, hvor det unike EcoRI-punkt er utenfor Tc-genet. Det er ingen utvelgelse eller sortering for innsetningsinaktivering i pRK290, men pLAFRl-derivåtet er svært nyttig fordi forpakning selekterer for innsetninger automatisk, der hvor innset-ningene har en lengde på ca. 20kb ± lOkb.

Avhengig av valget av vektor kan DNA-sekvensen som koder for INA innføres i et bredt utvalg av encellede mikroorganisme-verter, inklusive bakterier, sopp, gjær, alger, protosoer o.l. Valget av vert vil avhenge av tilgjengeligheten av en vektor, formålet med å innføre INA i verten, samt den måte som verten skal anvendes på. Avhengig av vektorens natur kan forskjellige tenikker anvendes for innføring av vektoren pluss en DNA-innsetning i verten. Transformasjon kan oppnås på konvensjonelle måter ved anvendelse av kalsiumutfelt DNA i et egnet løsnings-middel. Transfeksjon kan oppnås ved å bringe celler i kontakt i næringsmedium med en modifisert virus eller dens DNA for å bevirke transfeksjon eller transduksjon av cellene avhengig av integrering av den sekvens som koder INA. Konjugasjon kan også anvendes, der hvor plasmidet innføres i én organisme, som så kan overføre plasmidet til en annen organisme som enten er i stand til å mobilisere i kraft av seg selv eller i tilknytning til et mobiliserende plasmid.

Ved isolering av organismene som mottar den eksogene DNA fra det genomiske bibliotek, er det ønskelig å anvende en INA - organisme, hvorved et resulterende klon som er vist å være INA<+ >er trolig å ha hatt en DNA-feekvens som koder for INA innført i organismen. Mange organismer har naturligvis ikke INA-kapabili-tet, slik at eventuelle kloner som viser is-kjernedannelses-evne ville ha måttet motta den DNA som koder for INA.

Siden det nå er vist at de gener som koder for INA kan overføres til organismer som på forhånd ikke hadde vist is-kjernedannelses-evne, så kan disse organismer nå anvendes for sortering av DNA-segmenter for INA-aktivitet. Klonene kan sor-teres ved en enkel teknikk hvor kolonier utplates på egnede, faste næringsmedier og overføres til fløyelsputer som replika-trykkes på ark av aluminiumfolie forhåndsbelagt med et tynt paraffinsjikt. Ved å anbringe arkene på overflaten av et sirkulerende alkohol-bad forhåndskjølt til temperaturer under null og atomisering av vann over arkene, slik at mikrodråper kommer i kontakt med cellene, så fryser INA -celler mikrodråpene og gir et rimet utseende til INA<+->kolonier. På denne måte kan INA<+->kolonier identifiseres.

Det er funnet at de gener som koder INA-aktivitet kan lokaliseres på et enkelt fragment av mindre enn ca. 10kb. Således er det funnet at de gener som er involvert med INA ikke fordeles ved en rekke forskjellige punkter i kromosomet, og heller ikke krever det produkt som kodes av slike gener for INA-aktivitet den spesifikke natur av- membranen assosiert med naturlig forekommende mikroorganismer som har is-kjernedannelses-aktivitet. Videre forsterkes is-kjernedannelses-evnen ved anvendelse av en multikopivektor, slik at det synes som om is-kjernedannelses-aktiviteten er assosiert med forsterket ekspresjon av de gener som koder for INA.

For å demonstrere foreliggende oppfinnelse ble følgende eksperimenter utført.

METODER

Tre stammer ble anvendt som kilder for DNA som koder for INA: Pseudomonas syringae (to stammer:cit-7 og 31rif-l) og Erwinia herbicola(én stamme:26SR6-2). DNA fra stammene ble ekstrahert, renset ved to sykluser med CsCl-etidiumbromid-tett-hetsgradient-sentrifugering, befridd' for etidiumbromid, dialysert mot egnede puffere, delvis oppsluttet med EcoRI og fraksjonert ved en 5-25 nøytral sukrosegradient-sentrifugering. Den parti-elle oppslutning anvendte 0,3 enhet EcoRI pr. lyg DNA idet retningslinjene fra leverandøren ble fulgt, og reaksjonen ble stanset etter en halv time ved oppvarming ved 65°C i 2 min. Fraksjoner oppnådd fra sukrosegradienten ble analysert ved agarosegel-elektroforese, og de som var rike på fragmenter i området 18-25kb ble oppsamlet og ligert til cosmidvektoren pLAFRl, på forhånd linearisert med EcoRI.

Plasmidet pLAFRl er et derivat av vektoren pRK290 (Tc<r>)

som inneholder cos-punktene til fag1 X for pakking in vitro. pLAFRl ble oppnådd ved innsetning av, et BglII-fragment fra pHC79 (Hohn and Collins, Gene (1980), 11:291-298) i Bglll-punkt av pRK290. Plasmidet er en oligokopivektor med bredt vertsområde, med et enkelt EcoRI-punkt utenfor Tc-genet. Det er ingen utvelgelse eller sortering med hensyn til innsetningsinaktivering i pRK290. Imidlertid er pLAFRl-derivåtet meget nyttig fordi det krever innsetninger av minimal størrelse for forpakning og derfor automatisk utvelger for innsetninger på ca. 18-30kb i lengde.

Ligering av DNA-fragmentene i pLAFRl oppnås under anvendelse av T4-ligase ved å følge veiledningen fra leverandøren.

Et relativt høyt forhold mellom fremmede DNA-fragmenter og linearisert vektor anvendes, ca. 3-4:1, for å minimalisere dimerisering av vektoren. Ca. 3-4 yg av DNA-fragmenter anvendes pr. lyg av linearisert pLAFRl.

DNA-fragmentene ligeres i puffer som er bragt til lOul med vann, etter oppvarmning i 5 minutter ved 65°C, 30 minutter ved 42°C og deretter tillatt å stivne i 2 timer ved romtemperatur. Den varmebehandlede blanding gjøres til lmM ATP- og 1 enhet T4-ligase tilsettes og blandingen inkuberes ved 12°G'natten over.

Den ligerte blanding ble forpakket in vitro og transdusert til E. coli HB101. Forpakning oppnås i overensstemmelse med den fremgangsmåte som er beskrevet av Hohn, M: In Vitro Packaging of X and Cosmid DNA, Wu ed. Methods in Enzymology, vol. 68, Academic Press, N.Y., s. 299-309, 1979. Tilnærmet 30ul X-hoder og 20ul X-haler kombineres med 2yl IM ATP og 5yl ligeringsreak-sjonsblanding, og den resulterende blanding inkuberes i 1 time ved romtemperatur. Til blandingen settes så lOmM tris-puffer, pH 7,6, lOmM MgC^ for tilveiebringelse av fag-forråd som anvendes for transduksjon.

Transduksjonen ble utført ved å kombinere 0,1 ml av fag-forrådet med 0,5 ml av E. coli HB101 (107-108 celler/ml, midt-log-vekst) Luria-buljong 0,4% maltose, og inkubering i 1 time ved 37°C. Blandingen ble fortynnet med 2 ml Luria-buljong og inkubert i 1,5-2 timer. Cellene ble deretter utplatet på agar-medium (Luria agar) supplert med tetracyklin (10yg/ml) og inkubert i 1-2 dager.

Koloniene på flere av platene ble sortert med hensyn til is-kjernedannelses-aktivitet (INA) ved overføring til fløyels-puter som ble replika-trykt på ark av aluminiumfolie forhåndsbelagt med et tynt belegg av paraffin. Foliene ble bøyd oppover på kantene, anbragt på et sirkulerende alkoholbad, justert til -5° og -9°C og cellené på den paraffinbelagte folie dusjet med vannmikrodråper. Mikrodråpene som er i kontakt med INA<+->celler fryser, og gir et rimet utseende til INA<+->kolonier. Flere INA<+->kolonier ble identifisert i hvert bibliotek og renset.

Spektret eller profilen av is-kjerner overfor temperatur bestemmes ved å anbringe et flertall av bakterieholdige vann-dråper (10yl) på en paraffinbelagt teraperaturstyrt aluminium-blokk, hvor temperaturen langsomt senkes <«l<*>0,2<o>C/inin) og det kumulative antall dråper som fryses, telles. Antall celler pr. dråpe kan variere ved seriefortynning. Antall is-kjerner bereg-nes fra antall frosne dråper ved hver temperatur og avsettes mot temperatur ved forskjellige cellekonsentrasjoner. Logg-verdien til is-kjerner/celle avsettes mot temperaturen og viser vanligvis to platåer, det ene i området fra -4°C til

-7°C og det annet under -9°C.

RESULTATER

Alle INA<+> E. coli-transduktanter inneholdt rekombinant-plasmider, som hvert hadde et annet slags EcoRI-fragment, men med ett felles fragment som tilsvarte den vektor som ble anvendt i plasmidkonstruksjonen. Noen av rekombinantplasmidene ble innført i E. coli (SK1592) og HB101, og til INA~-mutanter av "DNA-kildestammen" som ble anvendt i deres konstruksjon

(P. syringae, cit-7 og E. herbicola 26SR6-2) ved transformasjon og/eller mobilisering. I alle tilfeller ble det oppnådd INA<+->progeni. De ovennevnte resultater viser at de klonede DNA-fragmenter koder for ekspresjon av INA<+->fenotypen i stammene av opprinnelse og har evne til ekspresjon av fenotypen i et hetero-logt INA~-cellulært miljø, f.eks. E. coli.

Et spesielt plasmid pC-1 ble isolert og anvendt i en rekke eksperimenter. pC-1 inneholdt<et 23,2kb delvis oppsluttet EcoRI-fragment fra stammen P. syringae cit-7 og innsatt i det unike EcoRI-punkt i pLAFRl. Is-kjernedannelses-spektret (se under Metoder) til E. coli som bærer plasmidet pC-1 ble sammenlignet med det tilsvarende for P. syringae cit-7-stammen og spektrene funnet å være i det vesentlige identiske. Et 10 kb EcoRI-fragment fra pC-l-innsetning ble subklonet i det unike EcoRI-punkt hos multikopivektoren pBR325. Dette punkt er i kloramfenikol-acetyltransferase-genet. Det resulterende plasmid, betegnet pClBRl etter EcoRI-restriksjon viste de res-triks jonsfragmen ter som var ventet fra pBR325 som bar en eneste EcoRI-innsetning (tilnærmet lOkb) som var til stede i pC-1 og overfører INA<+->fenotype til E. coli. Hyppigheten av is-kjernedannelse . (celler/kjerner) ved E. coli HB101 (pC-1) og E. coli HB101 (pClBRl) etter vekst ved 23°C (optimum for ekspresjon av INA i stammer av vill-type) og ved 37°C ble sammenlignet. (Selv om vill-type P.. syringae ikke vokser ved 37°C, er det kjent at veksttemperaturer høyere enn 24°C sterkt reduserer is-kjernedannelses-hyppigheten.) Celler ble undersøkt med hensyn til is-kjernedannelses-hyppighet etter 24 og 49 timers vekst (ekspresjon av INA vill-type-INA<+->stammer øker svært meget ved sene stadier i vekstsyklusen). Følgende tabell indikerer resultatene.

Ovenstående data indikerer at: (1) ekspresjonen av INA-aktivitet i E. coli er under lik temperatur og temporalkontro11 som i vill-typestammer; og (2) kloning i en multikopivektor resulterer i vesentlig større is-kjernedannelses-hyppighet (dvs. at man får en meget større andel av celler med aktive is-kjerner). Basert på disse eksperimenter kan denne innvirkning utelukkende tilskrives "kopitalleffekten", som resulterer i mer effektiv ekspresjon av de klonede gener.(EcoRI-fragment og pClBRl innføres i kloramfenikol-acetyltransferasen som koder for sekvensen til pBR325) eller til fjerning av regulerende elementer av repressor-type under subkloningen av det aktive fragment fra pC-1. Ekspresjonsnivået for INA i E. coli HB101 (pClBRl) er to celler/kjerner, hvilket tangerer undersøkelsesmetodenes følsomhet.

Det fremgår klart av ovenstående resultater at is-kjernedannelses-aktivitet kan overføres til et bredt område av verter som på forhånd ikke hadde denne evnen. Dette utelukker ikke innføring av de nevnte DNA-fragmenter til INA -verter for å oppnå f.eks. øket ekspresjon av INA ved anvendelse av en multikopivektor. Et relativt lite DNA-fragment kreves som lett kan innføres i et bredt område av organismer og celler, enten i enkelt- eller multikopiform, enten gjenværende ekstrakromosomalt eller integrert, og som tilveiebringer INA<+->fenotype. Således kan organismer som har et stort utvalg av økologiske nisjer modifiseres slik at det tilveiebringes is-kjernedannelses-aktivitet i nye omgivelser og/eller med høyere effektivitet. Organismer som er mer effektive med hensyn til INA-ekspresjon er også attraktive kandidater for anvendelse ved modifikasjon av været.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for å generere eller forsterke is-kjerne- dannelsesaktivitet hos prokaryote mikroorganismeceller, 'karakterisert ved at den består i: å isolere fra en donorcelle som har is-kjernedannelses-evne en DNA-sekvens som koder for is-kjernedannelses-evne, hvor DNA-sekvensen er i stand til å danne et homodupleks med is-kjernedannelses-evne-kodende DNA som stammer fra Pseudomonas, Erwinia eller Xanthomonas; å innføre nevnte DNA-sekvens i en vektor med evne til å transformere vertcellen for å danne en rekombinant vektor; å innføre i nevnte vertcellen nevnte rekombinante vektor; og å dyrke celler som inneholder nevnte.DNA-sekvens under betingelser hvor nevnte DNA-sekvens eksprimeres og is-kjernedannelses-evne i vertcellen genereres eller forsterkes.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som vertcelle anvendes E. coli.

3. Fremgangsmåte for å forhindre underkjøling av et vandig medium, karakterisert ved å innføre celler fremstilt ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 2 i nevnte vandige medium for å danne en cellesuspensjon ved eller før det tidspunkt da nevnte vandige medium avkjøles til en temperatur ved eller under frysepunktet.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at den inkluderer å blåse cellesuspensjonen ved eller under frysepunktet inn i atmosfæren for å danne sne.