NO146287B

NO146287B - PHOTOLUMINESCENT MATERIALS AND PROCEDURES IN ITS MANUFACTURING.

Info

Publication number: NO146287B
Application number: NO763691A
Authority: NO
Inventors: Philippe Gravisse
Original assignee: Bric Bureau Rech Innovation Et
Priority date: 1975-10-31
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1982-05-24
Also published as: BE838306A; CA1086936A; GB1561530A; SE7612004L; DK490376A; MX150155A; NO146287C; NL7611969A; FR2329736A1; SE427285B; FR2329736B1; DE2649686C2; JPS5257088A; BR7607276A; OA05469A; DE2649686A1; CH617958A5; IT1121735B; NO763691L; GR61713B

Abstract

Fotoluminescerende materiale og fremgangsmåte ved dets fremstilling.Photoluminescent material and method of its preparation.

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av vaksine mot meslinger. Procedure for the production of vaccine against measles.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av en forbedret meslingvaksine. The present invention relates to a method for producing an improved measles vaccine.

Meslingvirus er av tidligere forskere med Measles virus is by previous researchers with

hell tilpasset (adapted) slik at det er i stand til å gro og formere seg i ikke-menneskelig vev eller cellekulturer. Stammer av meslingvirusen som er egnet til innpodning i mennes-ker, er vist å kunne erholdes ved svekkelse (attenuation) i slike ikke-menneskelige cellekulturer. successfully adapted so that it is able to grow and multiply in non-human tissue or cell cultures. Strains of the measles virus which are suitable for inoculation into humans have been shown to be obtainable by attenuation in such non-human cell cultures.

Klinisk prøvning av den tilpassede og svekkede, levende meslingvirus erholdt på Clinical testing of the adapted and attenuated live measles virus obtained at

denne måte, viste at den er i stand til å danne antistoffer i de innpodede personer og immuni-sere dem mot meslinginfeksjon. Uheldigvis utviklet det seg uønskede reaksjoner så som høy feber, hos en rekke av de innpodede personer. En stor del av barna som var innpodet med vaksiner fremstilt av den tilpassede og svekkede stamme av den meslingvirus som hittil har vært tilgjengelig, utviklet alvorlig utslett og andre reaksjoner som et resultat av innpodningen. this way, showed that it is able to form antibodies in the inoculated persons and immunize them against measles infection. Unfortunately, unwanted reactions such as high fever developed in a number of the inoculated persons. A large proportion of the children who were inoculated with vaccines made from the adapted and weakened strain of the measles virus that has been available to date developed severe rashes and other reactions as a result of the inoculation.

De uønskede bivirkninger kunne dempes The unwanted side effects could be mitigated

eller til en viss grad hindres ved at det samtidig ble injisert gammaglobulin som har en avgjort virkning når det gjelder å beskytte barna mot de mer alvorlige symptomer på de uønskede reaksjoner. Denne hindring av reaksjoner ved hjelp av den kombinerte anvendelse av meslingvaksine og gammaglobulin er tung-vint og kostbar og vanligvis ikke egnet til innpodningsprogrammer i stor målestokk. or to a certain extent prevented by the fact that gamma globulin was injected at the same time, which has a definite effect when it comes to protecting the children against the more serious symptoms of the unwanted reactions. This prevention of reactions by means of the combined use of measles vaccine and gamma globulin is cumbersome and expensive and usually not suitable for large-scale inoculation programs.

Det er nå funnet at vesentlige bivirkninger og uønskede symptomer kan hindres eller It has now been found that significant side effects and unwanted symptoms can be prevented or

i det minste reduseres meget hos den inkuberte person, hvis man for immuniseringen anvender en forbedret vaksine som er fremstilt av den såkalte Schwarz-stamme av levende meslingvirus. Denne nye vaksine krever ikke at det samtidig injiseres gammaglobulin. Like god eller bedre virkning når det gjelder hyp-pigheten og alvorligheten av reaksjoner hos de innpodede personer kan nå oppnåes ved å anvende den forbedrede meslingvaksine fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse alene. at least it is greatly reduced in the incubated person, if an improved vaccine prepared from the so-called Schwarz strain of live measles virus is used for the immunization. This new vaccine does not require gamma globulin to be injected at the same time. Equally good or better effect in terms of the frequency and severity of reactions in the inoculated persons can now be achieved by using the improved measles vaccine produced according to the present invention alone.

Schwarz-stammen av meslingvirus skilles fra de hittil kjente stammer av meslingvirus ved at vesentlig uønskede bivirkninger og reaksjoner ikke forekommer hos personer som innpodes med denne, og ved at de vanlige patologiske symptomer på meslinger ikke er til stede, uten at dette reduserer den immuni-serende evne og effektivitet. The Schwarz strain of measles virus is distinguished from the previously known strains of measles virus by the fact that significant unwanted side effects and reactions do not occur in people who are inoculated with it, and by the fact that the usual pathological symptoms of measles are not present, without this reducing the immune healing ability and efficiency.

Den forbedrede sikkerhet og virkning av Schwarz-stammen av meslingsvirus som et innpodningsmiddel kan oppnåes ved svekkelse av tilpasset meslingvirus på en slik måte at virusens ondartethet svekkes mer enn tilfelle er for de svekkelsesbehandlinger som hittil har vært anvendt. The improved safety and efficacy of the Schwarz strain of measles virus as an inoculant can be achieved by attenuating the adapted measles virus in such a way that the virulence of the virus is attenuated more than is the case with the attenuation treatments that have been used to date.

De nye, forbedrede vaksiner fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse som inneholder svekket, levende meslingvirus, kan lett fremstilles i henhold til foreliggende oppfinnelse ved å formere og dyrke Schwarz-stammen av meslingsvirus i et kulturmedium som omfatter levende dyreceller, og å atskille celle- og avfallsmaterialet fra kulturmediet. Vaksinen som erholdes på denne måte, kan anvendes direkte eller lagres, og de vanlige for-tynningsmidler, stabilisatorer osv., kan tilsettes til enhver tid. Lagringen lettes hvis vaksinen er frosset og blir holdt i denne tilstand til senere bruk. The new improved vaccines of the present invention containing attenuated live measles virus can be readily prepared in accordance with the present invention by propagating and culturing the Schwarz strain of measles virus in a culture medium comprising live animal cells, and separating cellular and the waste material from the culture medium. The vaccine obtained in this way can be used directly or stored, and the usual diluents, stabilizers, etc., can be added at any time. Storage is facilitated if the vaccine is frozen and kept in this condition for later use.

Hvis formeringen av Schwarz-stammen av meslingvirus utføres ved betingelser og temperaturer som medfører den mulighet at virusen går over til en mer ondartet form, er det en god forholdsregel at det ved fremstilling av kulturer av mikroorganismer (seed pools) fra den eksisterende Schwarz-stamme av virusen, inkluderes minst flere passeringer (pas-sages) ved betingelser som nedsetter ondartheten, f.eks. ved dyrkning av virusen ved flere passeringer ved temperaturer under 35 °C, og fortrinnsvis under 32 °C. Hvis Schwarz-stammen av virus skulle gå over i en mer ondartet form til tross for alle for-holdregler, er den ikke lenger et egnet utgangsmateriale for den foreliggende oppfin-nelses formål, og må erstattes med nytt materiale som er i overensstemmelse med defini-sjonen av Schwarz-stammen av meslingvirus angitt i det foregående. If the propagation of the Schwarz strain of measles virus is carried out under conditions and temperatures which entail the possibility of the virus changing to a more malignant form, it is a good precaution that when preparing cultures of microorganisms (seed pools) from the existing Schwarz strain of the virus, at least several passages (pas-sages) are included under conditions that reduce the malignancy, e.g. by culturing the virus by multiple passages at temperatures below 35 °C, and preferably below 32 °C. If the Schwarz strain of virus were to pass into a more malignant form despite all precautions, it is no longer a suitable starting material for the purposes of the present invention, and must be replaced with new material that conforms to the definition tion of the Schwarz strain of measles virus indicated above.

Avhengig av den ønskede bruk, kan vaksinene som er erholdt fra kulturmediet, fortynnes med et egnet fortynningsmiddel, fortrinnsvis med sterilisert, destillert vann. Alternativt kan vaksinen frysetørkes for lagring og rekonstitueres med et egnet fortynningsmiddel, fortrinnsvis ved tilsetning av sterilisert, destillert vann, før bruk. Depending on the desired use, the vaccines obtained from the culture medium can be diluted with a suitable diluent, preferably with sterilized, distilled water. Alternatively, the vaccine can be freeze-dried for storage and reconstituted with a suitable diluent, preferably by adding sterilized, distilled water, before use.

Det er ofte en fordel at det til vaksinen settes en stabilisator for denne. Lactose-gluta-matoppløsning har vist seg å være en utmer-ket stabilisator for dette formål. It is often an advantage that a stabilizer is added to the vaccine. Lactose-gluta food solution has proven to be an excellent stabilizer for this purpose.

Den levende Schwarz-stamme av meslingvirus, som er utgangsmaterialet for fremstilling av de forbedrede vaksiner ifølge oppfinnelsen, kan lett fremstilles ved tilpasning av meslingvirus slik at den er i stand til å gro i levende, ikke-menneskelig cellevev eller i medier som inneholder slike levende, ikke-menneskelige celler, og ved svekkelse av den tilpassede viru ved hjelp av flere passeringer gjennom et kulturmedium som omfatter levende, ikke-menneskelige dyreceller under betingelser som nedsetter ondartheten, og ved temperaturer under 35 °C, men ved en temperatur som er over den ved hvilken formering av virusen opphører. Istedenfor å tilpasse naturlig (native) meslingvirus, kan man som utgangsmateriale også anvende en tilpasset stamme av meslingvirus som f.eks. er erholdt ved tilpasning og svekkelse av tidligere forskere fra Edmonston-stammen av meslingvirus, som f.eks. Enders-stamme. Svekkelse av de tilgjengelige, tilpassede stammer ved hjelp av flere passeringer av virusen gjennom kultur-medier som inneholder levende, ikke-menneskelige dyreceller, på en måte som nedsetter ondartheten beskrevet i det foregående, frem-bringer Schwarz-stammen av meslingvirus. The live Schwarz strain of measles virus, which is the starting material for the preparation of the improved vaccines of the invention, can be easily prepared by adapting measles virus so that it is capable of growing in living, non-human cell tissue or in media containing such living , non-human cells, and by attenuating the adapted virus by means of multiple passages through a culture medium comprising living non-human animal cells under conditions that reduce virulence, and at temperatures below 35 °C, but at a temperature above the one at which multiplication of the virus ceases. Instead of adapting natural (native) measles virus, you can also use an adapted strain of measles virus as starting material, e.g. has been obtained by adaptation and attenuation by previous researchers from the Edmonston strain of measles virus, which e.g. Enders tribe. Attenuation of the available adapted strains by multiple passages of the virus through culture media containing live, non-human animal cells in a manner that reduces the virulence described above produces the Schwarz strain of measles virus.

Minst en del av inkuberingen under svek-kelsesbehandlingen utføres ved en temperatur under 35 °C, og mer hensiktsmessig under 32 °C. I det minste flere passeringer eller en del av et større antall passeringer bør utføres ved en temperatur under 35° C, og fortrinnsvis ved en temperatur fra 28 til 32°C. Eventuelt kan imidlertid alle passeringer for svekkelse av virusen utføres ved de angitte lavere temperaturer. At least part of the incubation during the weakening treatment is carried out at a temperature below 35 °C, and more suitably below 32 °C. At least several passes or part of a larger number of passes should be performed at a temperature below 35°C, and preferably at a temperature from 28 to 32°C. Optionally, however, all passages for weakening the virus can be carried out at the indicated lower temperatures.

Meslingvirusen kan lett tilpasses slik at den er i stand til å formere seg i kyllingsfos-tervev eller i et kulturmedium som inneholder levende celler av slikt vev. Dette samme vev eller næringsmedium som inneholder levende celler av slikt vev, kan også tjene som vekstmedium for fremstilling av vaksine fra Schwarz-stammen av virusen. The measles virus can be easily adapted so that it is capable of multiplying in chicken fetal tissue or in a culture medium containing living cells of such tissue. This same tissue or nutrient medium containing living cells of such tissue can also serve as a growth medium for the production of vaccine from the Schwarz strain of the virus.

Ved en foretrukket utførelsesform for fremgangsmåten til fremstilling av Schwarz-stammen av meslingvirus etableres vevkulturer av ikke-menneskelige dyrevev på vanlig måte i en næringsvæske, som er ikke-giftig for meslingvirus, og som underholder veksten av slikt vev, og innpodes med levende meslingvirus. De innpodede vevkulturer inkuberes deretter ved 35 til 37 °C for en viss tid, og virusen føres i seriepasseringer på det samme dyrevev i et antall av passeringer som er tilstrekkelig til å sikre at virusen er tilpasset til å gro på det spesielle vev som anvendes. På denne måte er det f.eks. funnet at meslingvirus kan tilpasses å gro på hundenyrevev, oksenyrevev, svinenyrevev og kyllingfostervev. Etter den foregående tilpasningskultur, føres virusen i serie i vevkultur, på det spesielle substrat til hvilket det er tilpasset, og inkubering av virusen utføres ved «undernormale» temperaturer fra ca. 28 til ca. 32°'C for å oppnå modifisering av virusen, hvorved den modifiserte virus, når den injiseres i barn som ikke er immune mot meslinger, er i stand til å stimulere fremstillingen av beskyttede mes-ling-antistoffer uten å frembringe nevneverdig utslett, høy feber eller andre vanlige patologiske symptomer på meslinger. Den foregående fremgangsmåte til dyrkning av meslingvirus, når den utføres på fuglevev, særlig kyllingfostervev, representerer en foretrukket utfø-relsesform av oppfinnelsen. In a preferred embodiment of the method for producing the Schwarz strain of measles virus, tissue cultures of non-human animal tissues are established in the usual way in a nutrient fluid, which is non-toxic to measles virus, and which sustains the growth of such tissue, and inoculated with live measles virus. The inoculated tissue cultures are then incubated at 35 to 37°C for a certain time, and the virus is serially passaged on the same animal tissue for a number of passages sufficient to ensure that the virus is adapted to grow on the particular tissue used. In this way, it is e.g. found that measles virus can be adapted to grow on dog kidney tissue, ox kidney tissue, pig kidney tissue and chicken fetal tissue. After the preceding adaptation culture, the virus is passed serially in tissue culture, on the special substrate to which it has been adapted, and incubation of the virus is carried out at "subnormal" temperatures from approx. 28 to approx. 32°C to achieve modification of the virus whereby the modified virus, when injected into children who are not immune to measles, is able to stimulate the production of protective measles antibodies without producing significant rash, high fever or other common pathological symptoms of measles. The preceding method for cultivating measles virus, when carried out on bird tissue, in particular chicken fetal tissue, represents a preferred embodiment of the invention.

Ved en ytterligere fremgangsmåte til fremstilling av Schwarz-stammen av meslingvirus innpodes den opprinnelige, levende meslingvirus i etablert dyrevevkultur og inkuberes ved undernormale temperaturer, som angitt ovenfor, uten foregående tilpasning til det særlige vev ved normale inkuberingstempera-turer. Seriepassering og inkubering ved nevnte undernormale temperaturer, fortrinnsvis fra ca. 28 til ca. 32 °C, fortsettes deretter i et tilstrekkelig antall passeringer til at man opp-når den ønkede svekkelse av virusen. In a further method for producing the Schwarz strain of measles virus, the original, live measles virus is inoculated into established animal tissue culture and incubated at subnormal temperatures, as stated above, without prior adaptation to the particular tissue at normal incubation temperatures. Serial passage and incubation at the aforementioned subnormal temperatures, preferably from approx. 28 to approx. 32 °C, is then continued for a sufficient number of passes to reach the desired attenuation of the virus.

Alternativt, når frisk, naturlig meslingvirus anvendes som utgangsmateriale, er det ofte ønskelig å bevirke den opprinnelige formering av virusen i en menneskevevkultur som f.eks. menneskenyre-vevkultur menneske-amnion-vevkultur eller menneskehjerte-vevkultur, eller i en dyrekultur som det er kjent er gunstig som vertsvev for formering av slik naturlig virus, som f.eks. i hundenyre-vevkultur. Ved slike prosesser kan det være ønskelig å fortsette virkningen på slikt menneske- eller hundevev i en rekke seriepasseringer inntil identiteten og renheten av den etablerte virus kan fastslåes. Tilpasning av virusen til andre ikke-menneskelige dyrevev, og svekkelse av nevnte virus ved inkubering ved lave temperaturer, utføres deretter ved hjelp av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte. Ved et-hvert tilpassende trinn før inkuberingen settes i gang ved undernormale temperaturer, vil det være åpenbart at mellomliggende passeringer til andre vev eller til befruktede egg ved hjelp av vanlig teknikk kan utføres uten at man går ut over rammen av foreliggende oppfinnelse. Det er også mulig å utføre svek-kelsen med eksisterende stammer av meslingvirus som er tilpasset til å gro i levende, ikke-menneskelige vev eller vekstmedier som inneholder celler av slikt vev, som f.eks. Enders-stamme av meslingvirus. Alternatively, when fresh, natural measles virus is used as starting material, it is often desirable to effect the original propagation of the virus in a human tissue culture such as human kidney tissue culture human amnion tissue culture or human heart tissue culture, or in an animal culture which is known to be favorable as a host tissue for propagation of such natural virus, such as e.g. in dog kidney tissue culture. In such processes, it may be desirable to continue the action on such human or dog tissue in a number of serial passages until the identity and purity of the established virus can be established. Adaptation of the virus to other non-human animal tissues, and attenuation of said virus by incubation at low temperatures, is then carried out using the above-described method. At any adaptive step before the incubation is started at subnormal temperatures, it will be obvious that intermediate passages to other tissues or to fertilized eggs by means of ordinary techniques can be carried out without going beyond the scope of the present invention. It is also possible to carry out the attenuation with existing strains of measles virus which are adapted to grow in living, non-human tissues or growth media containing cells of such tissues, such as e.g. Enders strain of measles virus.

Ved en utførelsesform av prosessen etableres kulturen av ikke-menneskelige dyrevev som angitt ovenfor, og så snart god vekst av vevet er åpenbar, erstattes den opprinnelige mengde næringsvæske med frisk næringsvæske, og kul-turene innpodes med levende meslingvirus. Under inkuberingen av virusen kan man anvende forsiktig bevegelse av kulturkarene, som f.eks. ved hjelp av en roterende trommel. Alternativt kan statiske dyrkningsmetoder anvendes forutsatt at man sørger for at vevcellene er neddykket i næringsvæsken. Formering av virusen fremgår vanligvis av en tydelig cytopatogen effekt på vevcellene som kan observeres under mikroskopet. I noen tilfelle imidlertid, særlig på de tidlige trinn av virusens tilpasning til en ny type vertsceller, kan en tydelig cytopatogen effekt først iakttaes etter en lang inkuberingsperiode, hvis den i det hele tatt kan iakttaes. I slike tilfelle kan imidlertid formering av virusen følges ved å titrere en del av den innpodede vevkultur-væske i en kultur av menneskevev, som f.eks. menneskeamnionvev, menneskehjertevev eller lignende, som er mottagelig overfor nevnte virus. Det sistnevnte viser tydelig en typisk cytopatogen effekt når det infiseres med meslingvirus. Ved den foretrukne utførelsesform passerer virusen i serie gjennom suksessive, friske dyrevevkulturer med inkubering ved 35°C i noen få, fortrinnsvis ca. 10, seriepasseringer for å sikre tilpasning til det særlige vev som anvendes. Ytterligere seriepasseringer i slik vevkultur gjennomføres deretter i alle tilfelle ved inkubering av virusen ved undernormale temperaturer, fortrinnsvis fra ca. In one embodiment of the process, the culture of non-human animal tissue is established as indicated above, and as soon as good growth of the tissue is evident, the original amount of nutrient fluid is replaced with fresh nutrient fluid, and the cultures are inoculated with live measles virus. During the incubation of the virus, you can use careful movement of the culture vessels, such as e.g. using a rotating drum. Alternatively, static cultivation methods can be used provided that it is ensured that the tissue cells are immersed in the nutrient liquid. Propagation of the virus is usually evidenced by a clear cytopathogenic effect on the tissue cells that can be observed under the microscope. In some cases, however, particularly at the early stages of the virus's adaptation to a new type of host cells, a clear cytopathogenic effect can only be observed after a long incubation period, if it can be observed at all. In such cases, however, propagation of the virus can be followed by titrating a portion of the inoculated tissue culture fluid in a culture of human tissue, such as e.g. human amnion tissue, human heart tissue or the like, which is susceptible to said virus. The latter clearly shows a typical cytopathogenic effect when infected with measles virus. In the preferred embodiment, the virus is serially passaged through successive fresh animal tissue cultures with incubation at 35°C for a few, preferably approx. 10, serial passes to ensure adaptation to the particular tissue used. Further serial passages in such tissue culture are then carried out in all cases by incubating the virus at subnormal temperatures, preferably from approx.

28 til ca. 32 °C, for å gjennomføre den ønskede 28 to approx. 32 °C, to carry out the desired

svekkelse av virusen. Det nøyaktige antall seriepasseringer som er nødvendig ved de lavere temperaturer, vil variere avhengig av slike faktorer som den særlige stamme meslingvirus som anvendes, dens tidligere dyrk-ningshistorie, og det særlige vev som anvendes i vevkulturen. I kyllingfoster-vevkultur er det oppnådd gode resultater med hensyn til svekkelse når man har anvendt ca. 40 seriepasseringer av virusen ved en inkuberingstemperatur fra 28 til 32 °C. weakening of the virus. The exact number of serial passages required at the lower temperatures will vary depending on such factors as the particular strain of measles virus used, its previous culture history, and the particular tissue used in the tissue culture. In chicken fetal tissue culture, good results have been achieved with regard to weakening when approx. 40 serial passages of the virus at an incubation temperature of 28 to 32 °C.

Når svekkelse av virusen er opnådd på den foregående måte, kan den ønskede, svekkede Schwarz-stamme av virus opprettholdes ved hjelp av vevkultur av den samme type vev til hvilken virusen er tilpasset, og med fortsatt inkubering ved temperaturer fra 28 til 32 °C. Generelt er det ønskelig, men ikke nød-vendig, å overføre virusen til friske vevkulturer når fra ca. 20 til 75 prosent, fortrinnsvis fra ca. 25 til 50 prosent, av cellene i en gitt mengde innpodet vevkultur viser en cytopatogen effekt. When attenuation of the virus has been achieved in the foregoing manner, the desired attenuated Schwarz strain of virus can be maintained by tissue culture of the same type of tissue to which the virus is adapted, and with continued incubation at temperatures from 28 to 32°C. In general, it is desirable, but not necessary, to transfer the virus to healthy tissue cultures when from approx. 20 to 75 percent, preferably from approx. 25 to 50 per cent, of the cells in a given amount of inoculated tissue culture show a cytopathogenic effect.

Lignende teknikk anvendes til å formere den svekkede virus for å oppnå lagre (pools) for vaksinefremstilling. Ved den sistnevnte prosess inkuberes kulturen inntil virusen har formert seg slik at man har fått en passende konsentrasjon derav, og væsken fra vevkul-turkarene oppsamles ved dekantering under aseptiske betingelser og klares ved sentrifugering, filtrering eller lignende. Det resulterende produkt kan anvendes direkte som en vaksine eller, avhengig av konsentrasjonen av virusen, det kan anvendes med et egnet, injiserbart fortynningsmiddel eller stabilise-rende oppløsning som er ikke-giftig for virusen, slik at man får en ferdig, flytende vaksine. Hvis en vesentlig del av vevcellene i kulturen ikke er gått i oppløsning som følge av den cytopatogene virkning av virusens vekst, tilsettes frisk væske, som f.eks. en passende vaksinestabiliseringsoppløsning, avbalansert saltoppløsning, friskt næringsmedium eller lignende, til kulturkarene etter den ovenfor-nevnte dekantering, og nevnte kar og innhold føres gjennom en fryse- og tineprosess slik at man får frigjort ytterligere virus fra vevcellene. Den resulterende væske oppsamles og lagres sammen med det tidligere oppsamlede slik at man får et vaksinekonsentrat. Dette frigjøres for vevceller og avfallsmaterialet på passende måte, som angitt ovenfor, og virus-innholdet standardiseres ved titrering som f.eks. mot menneskevevkulturceller. Deretter kan eventuet vaksinekonsentratet anvendes direkte til vaksinering av ikke-immune men-nesker, eller det kan fortynnes med en steril stabilisator som f.eks. lactose-glutamatopp-løsning, og lagres frosset, fortrinnsvis ved en temperatur fra —20 til —70 °C, før det skal brukes. Alternativt kan den stabiliserte vaksine frysetørkes slik at man får et tørt vak-sineprodukt som lett kan lagres og som kan rekonstitueres med sterilt vann eller lignende like før det skal anvendes. A similar technique is used to multiply the weakened virus to obtain stocks (pools) for vaccine production. In the latter process, the culture is incubated until the virus has multiplied so that a suitable concentration of it has been obtained, and the liquid from the tissue culture vessels is collected by decanting under aseptic conditions and clarified by centrifugation, filtration or the like. The resulting product can be used directly as a vaccine or, depending on the concentration of the virus, it can be used with a suitable injectable diluent or stabilizing solution that is non-toxic to the virus, so that a finished, liquid vaccine is obtained. If a significant part of the tissue cells in the culture has not disintegrated as a result of the cytopathogenic effect of the growth of the virus, fresh liquid, such as e.g. a suitable vaccine stabilization solution, balanced salt solution, fresh nutrient medium or the like, to the culture vessels after the above-mentioned decanting, and said vessels and contents are put through a freezing and thawing process so that further virus is released from the tissue cells. The resulting liquid is collected and stored together with the previously collected so that a vaccine concentrate is obtained. This is released from tissue cells and the waste material in an appropriate manner, as indicated above, and the virus content is standardized by titration such as against human tissue culture cells. Then, if necessary, the vaccine concentrate can be used directly for vaccination of non-immune people, or it can be diluted with a sterile stabilizer such as e.g. lactose-glutamate solution, and stored frozen, preferably at a temperature of -20 to -70 °C, before use. Alternatively, the stabilized vaccine can be freeze-dried so that a dry vaccine product is obtained which can be easily stored and which can be reconstituted with sterile water or the like just before it is to be used.

Selvom fortsatt inkubering ved de fore-skrevne undernormale temperaturer foretrek-kes for å sikre den ønskede svekkelse av virusen slik at man får Schwarz-stammen av virus med det minst mulige antall suksessive passeringer, kan mindre variasjoner innføres. Seriepasseringer ved 28 til 32 °C kan f.eks. avbrytes av én eller noen få passeringer ved høyere temperaturer, forutsatt at det totale antall passeringer ved den undernormale temperatur er tilstrekkelig til å bibringe den ønskede svekkelse. Etter den ønskede svekkelse er oppnådd kan på lignende måte én eller to formeringspasseringer for økning av vaksinelagre, gjennomføres ved passende høy-ere temperaturer, hvis man ønsker det. Although continued incubation at the prescribed sub-normal temperatures is preferred to ensure the desired weakening of the virus so that the Schwarz strain of virus is obtained with the least possible number of successive passages, minor variations can be introduced. Serial passages at 28 to 32 °C can e.g. interrupted by one or a few passes at higher temperatures, provided that the total number of passes at the subnormal temperature is sufficient to produce the desired weakening. After the desired attenuation has been achieved, one or two propagation passes for increasing vaccine stocks can be carried out in a similar way at suitable higher temperatures, if desired.

Eksempel 1. Example 1.

VEVKULTURTEKNIKK TISSUE CULTURE TECHNIQUES

Åtte til ti dager gamle kyllingfostere ble finhakket under aseptiske betingelser, etterat øynene var fjernet, og det resulterende, fin-hakkede vev ble vasket med fosfatbuffered saltoppløsning. Det vaskede vev ble trypsinert på vanlig måte i en Erlenmeyerkolbe omrørt med en magnetisk rører. Det trypsinerte vev ble sentrifugert ved 1000 omdreininger pr. min. i 3 minutter, og de resulterende konsen-trerte celler ble suspendert i et vekstmedium slik at man fikk 500 000 til 600 000 celler pr. milliliter. Vekstmediet bestod av Earle's basiske saltoppløsning (natriumklorid 6,8 g, ka-liumklorid 0,4 g, calciumklorid 0,2 g, magne-siumsulfatheptahydrat 0,2 g, surt natriumfos-fat 0,125 g, glucose 1,0 g, natriumbicarbonat 2,2 g og fenolrødt 0,02 g oppløst i vann slik at man tilsammen fikk 1000 milliliter) inne-holdende 5 prosent kalveserum og 0,5 prosent lactalbumin-hydrolysat og ytterligere inne-holdende 200 enheter penicillin og 200 mikro-gram streptomycin pr. milliliter. Den resulterende suspensjon ble innpodet i mengder på 1 milliliter i sterile rør og inkubert i 24 til Eight- to ten-day-old chick embryos were minced under aseptic conditions, after removing the eyes, and the resulting finely minced tissue was washed with phosphate-buffered saline. The washed tissue was trypsinized in the usual way in an Erlenmeyer flask stirred with a magnetic stirrer. The trypsinized tissue was centrifuged at 1000 rpm. my. for 3 minutes, and the resulting concentrated cells were suspended in a growth medium so that 500,000 to 600,000 cells per milliliters. The growth medium consisted of Earle's alkaline salt solution (sodium chloride 6.8 g, potassium chloride 0.4 g, calcium chloride 0.2 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g, acid sodium phosphate 0.125 g, glucose 1.0 g, sodium bicarbonate 2 .2 g and phenol red 0.02 g dissolved in water so that a total of 1,000 milliliters was obtained) containing 5 percent calf serum and 0.5 percent lactalbumin hydrolyzate and further containing 200 units of penicillin and 200 micrograms of streptomycin per milliliters. The resulting suspension was inoculated in 1 milliliter amounts into sterile tubes and incubated for 24 more

48 timer ved 35°C. En lignende fremgangsmåte ble også anvendt til fremstilling av større porsjoner ved å innføre 60 til 70 milli- 48 hours at 35°C. A similar procedure was also used for the preparation of larger portions by introducing 60 to 70 milli-

liter av suspensjonen i Blake eller Roux kul-turkolber. liters of the suspension in Blake or Roux flasks.

Etter den opprinnelige inkuberingsperiode for kyllingfoster-vevcellene, ble vekstmediet fjernet fra disse, cellene ble vasket to ganger med medium nr. 199 fra Morgan og Parker (Morgan et al., Proceedings of the Society for Experimenatl Biology and Medicine, 1950, 73, s. 1—8), og 2 milliliter av medium 199, uten serum og justert til en pH på 7—7,2, ble deretter tilsatt til hvert rør, eller 100 milliliter av nevnte medium til hver kolbe. Hvert rør ble deretter innpodet med 0,2 milliliter aktiv, levende meslingvirussuspensjon eller hver kolbe med 1 milliliter slik virussuspensjon, og de resulterende kulturer ble inkubert ved en temperatur fra 32 til 28°C i en tidsperiode som var tilstrekkelig til å bibringe formering av virusen. Generelt fremgikk virusens vekst av at cellene i vevkulturen oppviste en cytopatogen effekt, og seriepassering av virusen til nytt vevkulturmedium ble vanligvis utført når fra ca. 25 til 50 prosent av cellene i den innpodede kultur oppviste den cytopatogene effekt. Alternativt kan veksten av virusen i vevkulturen følges ved å titrere kulturmediet i en kultur av menneskevevceller, som f.eks. men-neskeamnion, menneskehjerte eller annet egnet vev ved den metode som er angitt i Schwarz og Zirbel, Proceedings of the Society for Experimentdl Biology and Medicine, 1959, vol. 102, s. 711—714. After the initial incubation period for the chick fetal tissue cells, the growth medium was removed from them, the cells were washed twice with medium No. 199 of Morgan and Parker (Morgan et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1950, 73, p . 1-8), and 2 milliliters of medium 199, without serum and adjusted to a pH of 7-7.2, were then added to each tube, or 100 milliliters of said medium to each flask. Each tube was then inoculated with 0.2 milliliters of active live measles virus suspension or each flask with 1 milliliter of such virus suspension, and the resulting cultures were incubated at a temperature of 32 to 28°C for a period of time sufficient to allow multiplication of the virus . In general, the growth of the virus was evident from the fact that the cells in the tissue culture exhibited a cytopathogenic effect, and serial passage of the virus into new tissue culture medium was usually carried out when from approx. 25 to 50 percent of the cells in the inoculated culture showed the cytopathogenic effect. Alternatively, the growth of the virus in the tissue culture can be followed by titrating the culture medium in a culture of human tissue cells, such as e.g. human amnion, human heart or other suitable tissue by the method set forth in Schwarz and Zirbel, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1959, vol. 102, pp. 711-714.

Etter tilstrekkelig passeringer som angitt ovenfor for å bibringe den den ønskede svekkelse av virusen, ble én eller noen få ytterligere passeringer i kyllingfoster-vevkultur ut-ført ved 32 til 28 °C i en stor nok målestokk til at virusen formerte seg tilstrekkelig slik at man fikk en beholdning av vaksinekonsentrat. Vaksinekonsentratet ble oppsamlet på vanlig måte ved dekantering, frysing og ti-ning, og vasking. Den oppsamlede vaksine ble klaret ved sentrifugering av kulturvæsken og vaskevæskene inntil alle vevceller og alt celle-avfall var fjernet. After sufficient passages as indicated above to produce the desired attenuation of the virus, one or a few additional passages in chicken fetal tissue culture were carried out at 32 to 28°C on a large enough scale that the virus multiplied sufficiently so that received a stock of vaccine concentrate. The vaccine concentrate was collected in the usual way by decanting, freezing and thawing, and washing. The collected vaccine was cleared by centrifugation of the culture fluid and the washing fluids until all tissue cells and all cell waste had been removed.

Eksempel 2. Example 2.

FREMSTILLING AV PRØVING AV PREPARATION OF TESTING OF

VAKSINE VACCINE

Ved fremstilling av en vaksine i henhold til den fortrukne utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, blir Edmonston-stammen av meslingvirus, som beskrevet av Enders et al., ved hjelp av seriepassering holdt i en kyllingfoster-vevkultur med inkubering ved 35 °C i 19 suksessive passeringer. Deretter ble denne kyllingfoster-tilpassede virus ført i serie ved hjelp av teknikken i henhold til eksempel 1 i 37 suksessive passeringer i kyllingfoster-vevkultur med inkubering ved 32 °C. Den resulterende, svekkede virus fra den 37. passering ble ført gjennom tre avsluttende, for-tynnings-kyllingfoster-vevkultur- passeringer, fulgt av to ytterligere passeringer i slik vevkultur for å formere virusen og frembringe en vaksinebeholdning. Ved hver av disse sistnevnte passeringer ble kulturen inkubert ved 32 °C. De resulterende vaksinekonsentrater ble atskilt fra vevcellene og avfallsmaterialet og fortynnet med et likt volum lactose-glutamat-oppløsning som en stabilisator. Lactose-glu-tamat-stabiliseringsopløsningen hadde følgen-de sammensetning: In the preparation of a vaccine according to the preferred embodiment of the present invention, the Edmonston strain of measles virus, as described by Enders et al., is maintained by means of serial passage in a chicken fetal tissue culture with incubation at 35°C for 19 successive passages . Then, this chick embryo-adapted virus was serialized using the technique of Example 1 in 37 successive passages in chick embryo tissue culture with incubation at 32°C. The resulting attenuated virus from the 37th passage was passed through three final dilution chick embryo tissue culture passages, followed by two additional passages in such tissue culture to propagate the virus and produce a vaccine stock. At each of these latter passages, the culture was incubated at 32°C. The resulting vaccine concentrates were separated from the tissue cells and waste material and diluted with an equal volume of lactose-glutamate solution as a stabilizer. The lactose-glutamate stabilization solution had the following composition:

Vann, slik at man tilsammen får 1 liter En del av den ferdige vaksine ble titrert mot menneskehjerte-vevceller. Vaksinene ble funnet å inneholde fra 103,5 til 104.:J> vevkultur-infeksjonsdoser 50 prosent (VKID5()) pr. 0,2 milliliter. Hver vaksinebeholdning ble prøvet ved hjelp av innpodning i thioglycolat-bakte-rienæringsmedium, ved intraperitoneal og sub-cutan innpodning i marsvin og mus og ved in-tramuskulær og intracerebral innpodning i cynomolge aper, og funnet å være uten for-urensninger. Ni barn som ikke var immune mot meslinger, ble innpodet med 0,2 milliliters doser av vaksinen, to intramuskulært og 7 subcutant. Ingen av de innpodede barn fikk meslingutslett og bare én viste en betydelig stigning i temperatur, som bare var midler-tidig, under observasjonsperioden etter vaksineringen. Water, so that you get a total of 1 liter A part of the finished vaccine was titrated against human heart tissue cells. The vaccines were found to contain from 103.5 to 104.:J> tissue culture infection doses 50 per cent (VKID5()) per 0.2 milliliters. Each vaccine stock was tested by inoculation in thioglycolate bacterial nutrient medium, by intraperitoneal and subcutaneous inoculation in guinea pigs and mice, and by intramuscular and intracerebral inoculation in cynomolgus monkeys, and found to be free of contaminants. Nine children who were not immune to measles were inoculated with 0.2 milliliter doses of the vaccine, two intramuscularly and 7 subcutaneously. None of the inoculated children developed a measles rash and only one showed a significant rise in temperature, which was only temporary, during the observation period after vaccination.

Eksempel 3. Example 3.

Seriepasseringer av virusen fra den 37. lav-temperaturpassering fra eksempel 2 ble fortsatt, som i eksempel 2, for i alt 65 passeringer ved 32 °C inkuberingstemperatur. Vaksinebe-holdninger med lactose-glutamatstabilisator ble fremstilt som tidligere og frysetørket. Den rekonstituerte vaksine fra dette frysetørkede materiale hadde en titer fra 102,r> til 104>5 VKID50 pr. 0,2 milliliter. En del av vaksinen ble også bevart ved direkte frysing. Vaksinen ble prøvet for sikkerhet som i eksempel 2. Serial passages of the virus from the 37th low-temperature passage of Example 2 were continued, as in Example 2, for a total of 65 passages at 32°C incubation temperature. Vaccine stocks with lactose-glutamate stabilizer were prepared as before and freeze-dried. The reconstituted vaccine from this freeze-dried material had a titer from 102,r> to 104>5 VKID50 per 0.2 milliliters. Part of the vaccine was also preserved by direct freezing. The vaccine was tested for safety as in example 2.

70 barn som var prøvet for mesling-komplementbindende og nøytraliserende antistoffer og som ikke viste noen slike antistoffer ved en 1:2 serumfortynning, ble innpodet subcutant med 0,2 milliliter av de ovenfor beskrevne vaksiner og deretter observert i flere uker av øvet medisinsk personell. Ingen lokale eller øyeblikkelige reaksjoner ble iakttatt hos noen av barna, bortsett fra én mild urticaria-reaksjon som fant sted ca. 4 timer etter vaksi- 70 children who had been tested for measles complement-binding and neutralizing antibodies and who showed no such antibodies at a 1:2 serum dilution were inoculated subcutaneously with 0.2 milliliters of the vaccines described above and then observed for several weeks by trained medical personnel. No local or immediate reactions were observed in any of the children, apart from one mild urticarial reaction which occurred approx. 4 hours after vaccination

neringen. Temperaturene ble tatt minst én gang daglig, og hos de fleste av barna to ganger daglig, under observasjonsperioden. En mild, febril reaksjon som varte ca. 2 dager kunne i noen tilfelle iakttaes 7 til 8 dager etter vaksineringen. Den gjennomsnittlige mak-simale rectumtemperatur for alle de vaksi-nerte barn var 38,2°C (110,7°F). Milde, mes-linglignende utslett ble iakttatt hos bare to barn på henholdsvis den 11. og 13. dag etter vaksinasjonen. Ingen alvorlige komplikasjoner av noen art fant sted under prøvene, og det ble ikke funnet noe som tydet på noen for-styrrelser i sentralnervesystemet. Tre til seks uker etter vaksineringen ble det tatt en blod-prøve av hvert av barna og prøvet for mes-ling-komplement-bindende og nøytraliserende antistoffer. 97,1 prosent av barna hadde utviklet like høyt antistoffinnhold i blodet som en naturlig meslinginfeksjon. the nering. Temperatures were taken at least once a day, and in most of the children twice a day, during the observation period. A mild, febrile reaction that lasted approx. 2 days could in some cases be observed 7 to 8 days after vaccination. The mean maximum rectal temperature for all vaccinated children was 38.2°C (110.7°F). A mild, measles-like rash was observed in only two children on the 11th and 13th days after vaccination, respectively. No serious complications of any kind took place during the tests, and nothing was found to indicate any disturbances in the central nervous system. Three to six weeks after vaccination, a blood sample was taken from each of the children and tested for measles complement-binding and neutralizing antibodies. 97.1 per cent of the children had developed as high an antibody content in the blood as a natural measles infection.

Eksempel J/.. Example J/..

Ved å følge fremgangsmåten fra eksempel 2 ble meslingvirus fra den 37. passering ved 32 °C fra nevnte eksempel, ført gjennom ti ytterligere passeringer med inkubering ved 32°'C fulgt av 15 passeringer med inkubering ved 28°C. Vaksiner fremstilt fra den 15. passering ved 28°C ble anvendt for innpodning av ikkeimmune barn. Deretter tydet observasjon og prøver av de innpodede barn på at virusens alvorlige reaksjon etter innpodning var svekket, uten at dette medførte noen merkbar nedsettelse av antigenitet. By following the procedure from example 2, measles virus from the 37th passage at 32°C from said example was passed through ten further passages with incubation at 32°C followed by 15 passages with incubation at 28°C. Vaccines prepared from the 15th passage at 28°C were used for inoculation of non-immune children. Subsequently, observation and samples of the inoculated children indicated that the severe reaction of the virus after inoculation was weakened, without this leading to any noticeable reduction in antigenicity.

På lignende måte kan meslingvirusen svekkes ved at den dyrkes på isolert vev ved en temperatur på ca. 28 til ca. 32 °C, under anvendelse av vev som f.eks. oksenyrevev. Ved fremstilling av vevkul turene kan andre egnede, proteolytiske enzymer anvendes istedenfor trypsin for å dispergere vevcellene. Andre kulturvæsker som f.eks. Eagle's basiske medium, medium nr. 199 med 5 til 10 prosent inaktivert hesteserum, eller en blanding be-stående av 8 deler av Earle's basiske saltopp-løsning, 1 del 5 prosent lactalbumin-hydrolysat og 1 del inaktivert heste- eller lammeserum, kan også anvendes. In a similar way, the measles virus can be weakened by growing it on isolated tissue at a temperature of approx. 28 to approx. 32 °C, using tissues such as ox kidney tissue. When preparing the tissue cultures, other suitable proteolytic enzymes can be used instead of trypsin to disperse the tissue cells. Other culture fluids such as Eagle's basic medium, medium No. 199 with 5 to 10 per cent inactivated horse serum, or a mixture consisting of 8 parts of Earle's basic saline solution, 1 part 5 per cent lactalbumin hydrolyzate and 1 part inactivated horse or lamb serum, may also are used.

Claims

Process for producing a measles vaccine from live, weakened measles virus by propagating and cultivating an adapted and weakened strain of measles virus in a culture medium comprising live animal cells and by separating the cell and waste material from the culture medium, characterized by using the Schwarz strain of measles virus that has been obtained, either by adaptation of natural measles virus, so that it is capable of

to grow in living, non-human cell tissue or in media containing such living, non-human cells and attenuation of the virus thus adapted, or by attenuation of already attenuated measles virus, such as the Enders strain, by several passages in series through a culture medium which includes living, non-human animal cells, at a temperature below 35 °C, but at a tempera-

trip which is above the one at which propagation of the virus ceases and preferably at a temperature between 28°-32°C, possibly interrupted by individual passages at temperatures between 35 and 37°C.