NO144636B - Fremgangsmaate til fremstilling av encelle-protein fra metanol ved dyrking av mikroorganismer i en skumkultur - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av éncelle-protein ved dyrking av mikroorga-

nismer og angår nærmere bestemt en fremgangsmåte til aerob dyrking av en egnet mikroorganisme som kan assimilere alkohol som sin hovedkilde for karbon. Verdensomspennende matvare-knappheter har oppmuntret forskning og utvikling når det gjelder fremgangsmåter til fremstilling av mikrobielt protein, f.eks. éncelle-protein, av høy kvalitet og til lav kostnad for å avhjelpe matvareknappheten. Betydelig utviklingsarbeid med slike gjæringsprosesser har angått bruken av hydrokarboner og andre karbonholdige materialer som vanligvis vil bli brent eller skaffet av veien på annen måte ved jordoljeraffinering. Bruken av metanol som hovedkilde for karbon har vært særlig attraktivt som følge av de fordeler dette medfører. Disse fordeler omfatter bl.a. at metanol er blandbart med vann,

enkelt og lett kan fremstilles fra et stort antall hydrokar-bonmaterialer, enkelt kan fremstilles praktisk talt hvor som helst i verden hvor der foreligger en eller annen form for fossile brenselkilder, og er kjennetegnet ved fravær av poten-sielt kreftfremkallende polycykliske hydrokarboner.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse erkarakterisert vedat dyrkingssonen holdes hovedsakelig skumfylt, at dyrkingsblandingen, hovedsakelig fullstendig i form av et skum som inneholder en oksygenholdig gass, sirkuleres kontinuerlig i dyrkingssonen, og at der som alkohol anvendes metanol. Skuminnhpldet i dyrkingssonen (fermenteringsbeholr deren) kan beskrives som en dispersjon av gassfasen i væskefasen eller som en emulgert gassfase eller rett og slett som en emulsjon av gass- og væskefåsene, hvor der fås Økt over-flateberøring mellom gass- og væskefasen for forsterkning av gjæringsprosessen. Det er spesielt funnet at gjæringsproduk-tiviteten (gram celler pr. liter blanding pr. time) er vesentlig høyere når der anvendes en skum-fermenteringsbeholder,

enn når der anvendes en vanlig gjæringstank med skovlomrøring.

DE-PS 681 847 viser en gjæringsbeholder hvis nedre parti inneholder et væskeskikt. Hvis væskeskiktet ikke forelå i gjæringsbeholderen, ville det beskrevne apparat ikke virke som beskrevet. Ifølge det tyske patentskrift blir luftingen utført ved utblåsing av luft i væskeskiktet gjennom dyserør C. Hvis væskeskiktet ikke forelå, ville der ikke kunne oppnås noen lufting på den viste måte. Et annet tegn på at gjæringsbeholderen B ikke er hovedsakelig skumfylt, er det forhold at en pumpe K står i forbindelse med det nedre parti av gjæringsbeholderen A for å pumpe væske fra det nedre parti opp til en dysering G som ved utsprøyting av væske bevirker nedbryting av det skum som strømmer ut fra toppen av beholderen.

De to viktigste trekk i den foreliggende oppfinnelse er

1. at dyrkingsprosessen (gjæringen) utføres i en hovedsakelig fullstendig skumfylt dyrkingssone, og 2. at dyrkingsblandingen sirkuleres inne i gjærings-sonen.

Som det vil ses av de forbedrede mikroorganismeutbytter som oppnås i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (se eksemplene), fås der fremragende vekstbetingelser for de mikrobielle celler. Dette oppnås ved frembringelse av intern sirkulering av skumkulturen. Der sørges med andre ord for fremstilling, nedbrytning og fornyet dannelse av skum inne i fermenteringsbeholderen. Kraftig blandevirkning frembringer "nytt" skum og bringer samtidig det "gamle" skum til å falle sammen. Når nytt skum dannes, blir luft innlemmet i skumboblene. Da oksygen tas opp fra skumboblene av mikroorga-nismene og karbondioksyd avgis til boblene, står de mikrobielle celler i fare for å kveles av karbondioksyd. Som det vil ses av eksemplene, finner imidlertid cellene usedvanlig gode vekstbetingelser, noe som menes å skyldes de to foran nevnte trekk med sirkulasjon og stadig nydannelse av skum.

Gjæringstanker som er egnet for fremstilling og vedlikehold av en skummet tilstand av innholdet, er kjent i gjæringsteknikken. Dette er generelt tanker som skaffer en kraftig omrøring av innholdet med samtidig innføring i blandingen av et eller annet stoff som inneholder fritt oksygen. Ved utførelse av oppfinnelsen kan små mengder av overflateaktivt middel også anvendes for å bistå ved dannelse og vedlikehold av skummet. Vanligvis er dette imidlertid ikke nødvendig, idet det er kjent at mange mikrobielle vekstprosesser omfatter dannelse av materialer ( celleformede eller ikke-celleformede), som har overflateaktive egenskaper og således bevirker skumdannelse. I visse gjæringsprosesser er det i virkeligheten ofte nødvendig å ty til bruk av antiskummemidler for å beherske graden av skumdannelse under gjæringsprosessen.

På tegningen er der vist en typisk gjærings-reaktor eller fermenteringsbeholder av kjent type, som utgjøres av et hus 1 med et hult indre. Et gjennomstrømningsrør 2 er anordnet inne i huset 1 og skaffer en strømningsbane for det medium som er inneholdt i huset 1, for derved å bidra til å skaffe sirkulasjon. I den nedre ende av gjennomstrømningsrøret 2 er der en pumpe, f.eks. en turbin 3, som bidrar til å skaffe strømning nedover gjennom gjennomstrømningsrøret 2 og gjennom emulgerings-sil-åpninger 4 til det ytre av gjennomstrømningsrøret 2 og videre opp langs dette. Nær toppen av huset 1 er der anordnet en skumbryter 5, som kan betjenes for å bryte det skum som samler seg i det øvre parti av huset 1. Et utløp 7 er anordnet nær den nedre ende av huset 1 for avtapping av en del av innholdet for videre behandling. Utløpet 7 er fortrinnsvis en ledning som forbinder det nedre parti av huset 1 med etterfølgende behandlingsutstyr som ikke er vist. Et innløp 8 er anordnet ved den øvre ende av huset 1 og er innrettet til å levere porsjoner av det medium som anvendes ved gjæringsprosessen. Kraftorganer som f.eks. motorer 9 og 10 er drivforbundet med turbinen 4 resp. skumbryteren 5. En lédning 11 står i forbindelse med det indre av huset 1 og er innrettet til å inn-føre en kilde for oksygen, f.eks. luft, i mediet.

Den mikroorganisme som anvendes i gjæringsprosessen, er istand til å assimilere metanol som sin kilde for karbon og energi ved vekst eller formering av mikroorganismen. Egnede mikroorganismer kan velges fra bakterier, gjær og sopp.

Egnede gjærsopper er arter av slektene Candida, Hansenula, Torulopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Lipomyces, Cryptococcus, Nematospora og Brettanomyces. -De foretrukne slekter omfatter Candida, Hansenula, Torulopsis, Pichia og Saccharomyces. Eksempler på egnede arter er:

Candida boidinii

Candida mycoderma

Candida utilis

Candida stellatoidea

Candida robusta

Candida claussenii

Candida rugosa

Brettanomyces petrophilium Hansenula minuta

Hansenula saturnus

Hansenula californica

Hansenula mrakii

Hansenula silvicola

Hansenula polymorpha

Hansenula wickerhamii

Hansenula capsulata

Hansenula glucozyma

Hansenula henricii

Hansenula nonfermentans

Hansenula philodendra

Torulopsis candida

Torulopsis bolmii

Torulopsis versatilis

Torulopsis glabrata

Torulopsis molishiana

Torulopsis nemodendra

Torulopsis nitratophila

Torulopsis pinus

Pichia farinosa

Pichia polymorpha

Pichia membranaefaciens

Pichia pinus

Pichia pastoris

Pichia trehalpphila

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces fragilis

Saccharomyces rosei

Saccharomyces acidifaciens Saccharomyces elegans

Saccharomyces rouxii

Saccharomyces lactis

Saccharomyces fractum

Egnede bakterier omfatter arter fra slektene Bacillus, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Pseudomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Methylococcus, Arthrobacter, Methylomonas, Brevibacterium, Acetobacter, Micrococcus, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Microbacterium, Achromobacter, Methylobacter, Methylosinus og Methylo-cyctis. Foretrukne slekter er Bacillus, Pseudomonas, Protaminobacter, Micrococcus, Arthrobacter og Corynebacterium.

Eksempler på egnede arter er:

Bacillus subtilus

Bacillus cereus

Bacillus aureus

Bacillus acidi

Bacillus urici

Bacillus coaculans

Bacillus mycoides

Bacillus circulans

Bacillus megaterium Bacillus licheniformis Pseudomonas methanolica Pseudomonas ligustri Pseudomonas orvilla Pseudomonas methanica Pseudomonas fluorescensPseudomonas aeruginosa Pseudomonas oleovorans Pseudomonas putida Pseudomonas boreopolis Pseudomonas pyocyanea Pseudomonas methylphilus Pseudomonas brevis Pseudomonas acidovorans Pseudomonas methanoloxidans Pseudomonas aerogenes Protaminobacter ruber Corynebacterium simplex Corynebacterium hydrocarbooxydans Corynebacterium alkanum Corynebacterium oleophilus Corynobacterium hydrocarboclastus Corynobacterium glutamicum Corynobacterium viscosus Corynobacterium dioxydans Carynobacterium alkanum Microcuccus cerificansMicrococcus rhodius Arthrobacter rufescensArthrobacter parafficum Arthrobacter simplexArthrobacter citreus Methanomonas methanica Methanomonas methanooxidans Methylomonas agile Methylomonas albusMethylomonas rubrum Methylomonas methanolica Mycobacterium rhodochrous Mycobacterium phlei Mycobacterium brevicale Nocardia salmonicolor Nocardia minimus Nocardia corallina Nocardia butanica Rhodopseudomonas capsulatus Microbacterium ammoniaphilum Archromobacter coagulans Brevibacterium butanicum Brevibacterium roseum Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium paraffinolycitum Brevibacterium ketoglutamicum Brevibacterium insectiphilium Egnede sopper omfatter arter fra slektene^pergillus, Monilia, Rhizopus, Penicillium, Mucor, Alternaria og Helmin-thosporium.

Eksempler på egnede sopparter er: Aspergillus niger Aspergillus glaucus Aspergillus flavus Aspergillus terreus Aspergillus itconicus Penicillium notatum Penicillium chrysogenum Penicillium glaucum Penicillium griseofulvum Penicillium expansum Penicillium digitatum Penicillium italicum Rhizopus nigricans Rhizopus oryzae Rhizopus delemar Rhizopus arrhizus Rhizopus stolonifer Mucor mucedo Mucor genevensis Veksten av mikroorganismen er følsom for driftsbetin-gelsene i fermenteringsbeholderen, og hver bestemt mikroorga nisme har en optimal veksttemperatur. Et bredt temperaturom-råde for gjæringsprosessen ifølge den foreliggende oppfinnelse vil være fra ca. 30°C til 65°C eller mere, og fortrinnsvis 35°C - 60°C. Den målte temperatur vil vanligvis avhenge av den mikroorganisme som anvendes ved fremgangsmåten, idet mikro-organismene vil ha et noe forskjellig forhold mellom temperatur og veksthastighet.

Ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse tilføres et egnet næringsmedium til fermenteringsbeholderen for å skaffe næringsstoffer, f.eks. en assimilerbar kilde for nitrogen, fosfor, magnesium, kalsium, kalium, svovel og natrium, samt spormengder av kobber, mangan, molybden, zink, jern, bor, jod og selen. Slikt det er vel kjent i gjæringsteknikken, kan forholdet mellom mengdene av de ovennevnte næringsstoffer variere avhengig av den mikroorganisme som velges for fremgangsmåten. Dessuten kan næringsmediet også inneholde vitaminer, slik det er kjent i faget, når man vet at nærværet av slike vitaminer erønskelig for formeringen av visse mikroorganismer. Mange gjærsopper synes f.eks. å kreve nærvær av ett eller begge av vitaminene biotin og tiamin for riktig formering. Et typisk eksempel på et egnet næringsmedium er det følgende:

En liter vandig oppløsning

Oppløsningen av spormineraler i den ovennevnte oppskrift fremstilles etter følgende oppskrift: En liter vandig oppløsning

(Oppløsning av spormineraler)

Ved anvendelse av det ovenfor beskrevne næringsmedium

blir assimilerbart nitrogen tilsatt ved separat tilsetning av vandig ammoniakk (NH^OH) til gjæringstanken. Den tilsatte mengde NH^OH vil avhenge av denønskede pH-verdi av reaksjons-blandingen. Uten tilsetning av NH^OH vil pH-verdien ligge

på ca. 2 i næringsmediet. For bruk av sopper eller gjærsopper i gjæringsprosessen bør pH-verdien fortrinnsvis ligge på 3-5, og ved anvendelse av bakterier bør pH-verdien fortrinnsvis ligge i området 6-7,5.

Gjæringsreaksjonen er en aerob prosess hvor det oksygen som kreves for prosessen, kan tilføres fra en kilde for fritt oksygen, f.eks. luft, som hensiktsmessig tilføres gjæringstanken med et trykk på 1-100 atm, fortrinnsvis 1-10 atm. En god kilde for oksygen er oksygen-anriket luft. Gjæringsreaksjonen påvirkes ofte i gunstig retning ved anvendelse av trykk innenfor de ovennevnte brede og foretrukne områder.

Gjæringsprosessen ifølge den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis av kontinuerlig art, men kan utføres som en satsvis prosess. Ved den satsvise prosess blir gjæringstanken først sterilisert og deretter podet med en kultur av den ønskede mikroorganisme i nærvær av alle deønskede næringsmidler, her-under oksygen og karbon-kilden. Ved den kontinuerlige fremgangsmåte blir oksygenkilden eller luften kontinuerlig ført

inn sammen med en kontinuerlig tilførsel av næringsmedium, en nitrogenkilde (hvis denne tilsettes separat) og metanol med en

hastighet som enten er fastlagt på forhånd eller avpasset etter behovet, som kan fastslås ved overvåking av faktorer som alkoholkonsentrasjon, oppløst oksygen, og oksygen eller karbondioksyd i det gassformede utløp fra fermenteringsbeholderen. Matningshastigheten av de forskjellige materialer kan endres slik at der fås en raskest mulig cellevekst som er forenlig med en effektiv utnyttelse av den innmatede metanol, dvs. et høyt vektutbytte av celler pr. enhet av innmatet metanol.

Som kjent i faget er det viktig å beherske innmatnings-hastigheten av metanolen, idet høye konsentrasjoner av alkohol faktisk kan hindre cellevekst og endog kan drepe mikroorganismen. Matningshastigheten for metanolen blir derfor innstilt slik at metanolen forbrukes av mikroorganismen med hovedsakelig samme hastighet som den tilføres fermenteringsbeholderen med. Når denne tilstand er oppnådd, vil der naturligvis være lite eller ingen metanol i det utløp som kontinuerlig tappes av fra fermenteringsbeholderen ved kontinuerlig utførelse av fremgangsmåten. Tilfredsstillende drift kan imidlertid oppnås med opptil ca. 0,5 volumprosent metanol i utløpet. For høy celle-produktivitet eller -veksthastighet bør konsentrasjonen av alkohol i det materiale som mates inn i fermenteringsbeholderen, ligge på ca. 7-30 volumprosent.

Ved enten satsvis eller kontinuerlig utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bør konsentrasjonen av metanol i fermenteringsbeholderen ligge i området 0,001 - 5 % (v/v) og fortrinnsvis på 0,005 - 0,5 %. Det er naturligvis mulig og kan i visse tilfeller endog være ønskelig å tilsette utgangsmate-rialet i små porsjoner til en gjæringsprosess som forøvrig er en typisk satsvis prosess.

Det er vel kjent i faget at der finnes instrumenter som kan måle celletetthet, pH-verdi, oppløst oksygen og alkoholkonsentrasjon i fermenteringsbeholderen såvel som i strømmene av innmatet og utstrømmende materiale for å skaffe en relativt fullstendig overvåkning av gjæringsprosessen, idet instrumen-teringen er innrettet til å styre innløpshastighetene slik at prosessen optimaliseres. De materialer som tilføres fermenteringsbeholderen, underkastes fortrinnsvis sterilisering, slik det vanligvis gjøres i faget, for å hindre forurensning av den ønskede gjæringsblanding med uønskede levedyktige mikroorganismer .

Den utløpsstrøm som fjernes fra gjæringstanken, behandles på egnet måte for separering av de mikrobielle celler, som inneholder éncelle-protein. Den vanlige behandlingsmetode er vel' kjent for fagfolk og omfatter bruk av varme og/eller kjemiske reagenser, f.eks. syrer, for å drepe de mikrobielle celler og bidra til deres separering fra den vandige fase ved koagulering eller flokkulering av cellene. Etter denne behandling blir blandingen så sentrifugert for fjerning av meste-parten av væskefasen, hvoretter de separerte celler tørkes ytterligere, f.eks. i trommeltørker eller forstøvningstørker. Hvis gjær anvendes som kultur, kan den ovennevnte rekkefølge av trinn modifiseres ved at utløpsstrømmen først sentrifugeres for fraskilling av cellene, som deretter drepes ved varme før eller under et etterfølgende tørketrinn. Etter separering og tørking er cellene, som inneholder en høy andel protein, parate eller tilgjengelige for anvendelse som en matvarekilde for dyr eller mennesker.

Det éncelle-protein som produseres ved den ovennevnte fremgangsmåte, har en spesiell viktig anvendelighet i verden idag. Som det i stadig større grad er blitt understreket i senere år, er en tilstrekkelig tilførsel av rikelig og billig protein som er tilgjengelig for menneskelig eller animalsk forbruk, f.eks. fiskemel og soyabønnemel, blitt stadig vanskeligere som følge av en stadig økende verdensbefolkning og nylige reduksjoner i fremstilling av visse proteintyper, f.eks. fiskemel basert på ansjosfiske. Produksjonen av éncelle-protein (SCP) skaffer en måte til å avhjelpe denne situasjon ved å skaffe en protein-kilde som er egnet for innlemmelse i for for fjærkre, griser og storfe, som direkte eller indirekte skaffer protein for mennesker. De mikrobielle celler som fremstilles i henhold til den ovennevnte fremgangsmåte, er egnede éncelle-protein-kilder og kan således anvendes for matvareformål. Det er kjent at det protein som fremstilles ved fremgangsmåten, kan anvendes på andre områder, f.eks. ved fremstilling av proteinholdige limforbindelser.

EKSEMPEL I

Tre gjæringsforsøk ble utført med metanol som karbon- og energikilde i en fermenteringsbeholder som arbeidet under hovedsakelig skumfylte betingelser. Fermenteringsbeholderen var av den generelle art som er beskrevet ovenfor. Volumet av fermenteringsbeholderen var ca. 1500 liter. I hvert forsøk ble temperaturen holdt på 39°C og pH-verdien på 6,6. Ved hvert forsøk ble der praktisk talt ikke oppdaget noe metanol i ut-løpet fra fermenteringsbeholderen, og metanolkonsentrasjonen i det innmatede materialet var 10 volumprosent. Det næringsmedium som ble anvendt under disse forsøk, var det tidligere beskrevne. Den mikroorganisme som ble anvendt i forsøkene, var en bakterie av Pseudomonas-arten og var Pseudomonas methanica, identifisert ved sitt deponeringsnummer NRRL B3449. De i tabell 1 angitte data ble fastslått etterat prosessen i hvert forsøk hovedsakelig hadde nådd likevektstilstanden (etter ca. 12 timers kontinuerlig drift). Forsøkene ble utført ved tre forskjellige trykk, som vist i tabellen.

Resultatene av disse forsøk viser de fremragende produkti-vitetsresultater av den kontinuerlige gjæringsprosess under anvendelse av en hovedsakelig skumfylt fermenteringsbeholder med en oksygenoverføringskapasitet på ca. 1000 mmol pr. liter pr. time flytende gjæringsreaksjonsblanding.

EKSEMPEL II

(Sammenligningsforsøk)

Et kontinuerlig gjæringsforsøk (forsøk nr. 4) ble også ut-ført under anvendelse av den samme bakteriekultur, det samme næringsmedium og den samme metanol-konsentrasjon i det innmatede materiale som i forsøkene i henhold til eksempel I. Temperaturen (40°C) og pH-verdien (6,3) lå også meget nær de tilsvarende verdier som ble anvendt i forsøkene i eksempel I.

I forsøk nr. 4 ble der imidlertid som gjæringstank anvendt en

vanlig, stor tank forsynt med en enkel skovlrører og drevet ved atmosfærisk trykk. Volumet av gjæringsblandingen var ca. 1125 liter. Ingen metanol ble oppdaget i utløpet fra fermenteringsbeholderen. En tørrcellevekt på 19,1 g/l ble oppnådd ved dette forsøk.

Produktivitetsresultatet fra dette forsøk er markert dår-ligere enn resultatet av forsøk 1 i eksempel I, som er et sammenlign-bart forsøk under anvendelse av en skumfylt fermenteringsbeholder.

EKSEMPEL III

Ytterligere to kontinuerlige metanol-gjæringsforsøk ble utført under anvendelse av den skumfylte fermenteringsbeholder som ble anvendt i eksempel I, og under anvendelse av det samme næringsmedium som i eksempel I, men med en gjærkultur identifisert som Hansenula polymorpha.

Disse forsøk anvendte en metanol-konsentrasjon på 10 volumprosent i det innmatede materiale, og ingen metanol ble oppdaget i utløpet fra fermenteringsbeholderen. Begge forsøk ble utført ved atmosfæretrykk.

Ved utførelsen av forsøk nr. 5 ble det oppdaget at gjæringsblandingen var blitt forurenset med en trådformet sopp. Denne forurensning ble ikke ansett å ha hatt noen vesentlig virkning på arbeidsdataene for forsøket, men reak-torsystemet ble sterilisert før forsøk 6, som ble gjennomført uten noen synlig forurensning.

Data fra forsøkene 5 og 6 er angitt i tabell II. De viste data anses som typiske for kontinuerlig gjæring av metanol under de viste betingelser.

Disse resultater viser bruken av en gjær for den kontinuerlige gjæring av metanol i en skumfylt fermenteringsbeholder for fremstilling av éncelle-protein.

Da gjær har en iboende lavere veksthastighet enn bakterier, er den i tabell II viste produktivitet lavere enn hva som ble oppnådd ved anvendelse av bakterier.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av éncelle-protein ved dyrking av mikroorganismer i en skumkultur med en alifatisk alkohol som hovedkilde for karbon, .karakterisert vedat dyrkingssonen holdes hovedsakelig skumfylt, at dyrkingsblandingen, hovedsakelig fullstendig i form av et skum som inneholder en oksygenholdig gass, sirkuleres kontinuerlig i dyrkingssonen, og at det som alkohol anvendes metanol.