NO122281B - - Google Patents

Description

Diagnostisk middel for forstyrrelses-

fri påvisning av sukkere i legemsvæsker.

Foreliggende oppfinnelse angår et diagnostisk middel for forstysrelsesfri påvisning av sukkere i legemsvæsker, fortrinnsvis i urin..

Påvisningen av sukkere som glucose og galaktose i legemsvæsker med det koblede enzym- og indikatorsystem glucosecxydase/ peroxydase/farvestoffdanner, respektive galaktoseoxydase/peroxydase/ farvestoffdanner, i opplosninger eller på testpapir har lenge vært kjent. Da urin ofte inneholder stoffer som forstyrrer ovennevnte reaksjon, gir testpapir på basis av ovennevnte enzymreaksjon forst utslag ved forholdsmessig hoye, signifikante patologiske sukker-, konsentrasjoner. Som forstyrrelsesstoff i urin virker fremfor alt bestemte reduksjonsmidler som urinsyre og den leilighetsvis opptredende ascorbinsyré. Ved den meget utbredte profylaktiske, respektive terapeutiske anvendelse av hoyere doser av ascorbinsyre i form av styrkemidler, fruktsafter og tabletter, er forholdsmessig hoye ascorbinsyrekonsentrasjoner i menneskelig urin ikke lenger noen sjeldenhet. Forstyrrelsene av den enzymatiske påvisnings-reaksjon for sukkere er derfor meget betydningsfulle, da der av

de forskjelligste grunner må stilles hoye krav til nøyaktigheten og påliteligheten av testen:

1. Den gunstige prognose av Diabetes mellitus stiger med en tidligst mulig erkjennelse av stoffvekselsykdommen. Det er derfor overordentlig viktig i rett tid og nbyaktig å kunne påvise selv bare svakt forhoyede glucosurier. 2. Ved hjelp av en hbyomfintlig teststrimmel er man i stand til å bestemme selv det lille, fysiologiske glucoseinnhold i normalurin. Av en negativ reaksjon av de meget omfintlige teststrimler kan sluttes at patogene kim har forbrukt glucosen og en signifikant infeksjon av urinveiene foreligger. 3. Galactoseutskillelser i urinen tillater slutninger om stort stoffvekselforstyrrelser hos nyfodte og leversykdommer hos voksne, hvis folger kan forhindres ved oppdagelse i rett tid.

Av den medisinske litteratur i de siste år fremgår at latente urinveissykdommer, særlig Pyelonephritis, forekommer lang"; hyppigere enn man hittil har antatt. Disse sykdommer påvises, for det meste ad bakteriologisk vei, d.v.s. ved bestemmelse av kim-tallet. På grunn av det betraktelige .tidsforbruk kan rekkeundersokelser med disse midler ikke utfores. Også de forskjellige på-visninger som beror på reduksjonen av trifenyltetraazoliniumklorid (TTC) av patogene kim, er for omstendelig til å kunne anvendes i ved rekkeundersokelser, se Mittlg. Lebensmitt. Unters. Hyg. ]+2, s. 191-99 (1956), Mschft. Kinderh. IT}, s. 569-72 (1965). Hurtig-bestemmelsen av nitritt i urin muliggjor påvisningen av de patogene kim som reduserer nitrat som er tilstede i urinen. Da ikke alle urinveisinfeksjoner fremkalles av nitratreduserende kim, opp-trer i visse tilfelle falske negative resultater, som innskrenker brukbarheten av denne test, Dtsch. Med. J. 18, s. 3^3-^7 (1967).

I

Til forbedring av den enzymatiske sukkerpåvisning har det j vært anbefalt å 1jerne de reduserende forstyrrende stoffer i j urinen ved at proven som skal undersbkes,forst sendes gjennom en; kolonne fylt med en anionutbytter, og at den derpå unde rsokes .'på | sitt sukkerinnhold. Det sier seg selv at slike undersokelses-metoder ikke er anvendbar for rekkeundersokelser av et meget stort antall personer.

En viss forbedring av dette prinsipp er oppnådd ved at man kombinerer det vanlige testpapir med et ionebyttepapir, slik at den sukkerholdige væske forst efter vandring gjennom ionebyttepapiret kan komme inn i den egentlige påvisningssone, jevnfor norsk patent nr. 115.686. De adskilt anordnede soner krever en noyaktig hånd-tering av opplært personale. Til en bredt anlagt rekkeundersokelse er de neppe brukbare. Skal f.eks. hele storbyer eller landområder undersokes på Diabetes mellitus eller Bakteriura, er det nødvendig at påvisningen kan utfores riktig også av legfolk. I praksis betyr det at teststrimlene selv ved én klosset behandling (f.eks. ved fullstendig neddykning i urinen) ikke må gi gale resultater. Teststrimlene ifolge norsk patent nr. 115.686 har dessuten den ulempe at de må fremstilles ved en nbyaktig arbeidende fremgangsmåte med spesialmaskiner, hvilket betinger hoye omkostninger pr. teststrimmel.

Det har nu vist seg at man kan få teststrimler for enkel og forstyrrelsesfri påvisning av sukkere, når man impregnerer en oppsugningsdyktig bærer med ioneutbyttende egenskaper med glucose-, respektive galactoseoxydase, peroxydase og en farvestoffdanner.

Dette resultat kunne ikke forutsees og er særlig overraskende av følgende grunner: Efter tidligere oppfatning kan små glucose-, respektive galåctosekonsentrasjoner kun påvises med testpapir når alle forstyrrelsesstoffer er fjernet på forhånd. Det har tidligere vært antatt at rensning og påvisning må utfores i to adskilte skritt, da man antok at det hydrogenperoxyd som ble frigjort i de.t forste reaksjonstrinn av påvisningen, straks ville bli oppfanget av de tilstedeværende sterkt reduserende stoffer som urinsyre og ascorbinsyre, og således ikke stå til disposisjon for farvestoff-dannelse. Det har nu mot det man skulle vente vist seg at ved teststrimlene iftJlge oppfinnelsen den ved dypning i urinprbven umiddel-bart fuktede sone eventuelt ikke oppviser noen farveforandring, mens der i det tilgrensende område, i hvilket væsken derefter trenger inn, inntrer en tydelig og overordentlig bmfintlig farvereaksjon. Uavhengig av ømfintligheten av testpapirene ifolge oppfinnelsen overfor de vandige oppløsninger av det tilsvarende sukker, oppviser de overraskende nok en jevn, av konsentrasjonen av forstyrrelsesstoff ene nesten uavhengig ømfintlighet overfor de samme sukkere i urin»

Da det ikke skaper noen vanskeligheter ved valg av papir-sprtene, enzymkon sen tr asj onene, pH-verdiene, etc, å gjore de hittil vanlige enzymatiske testpapirer forskjellig omfintlig, kan man også gi de nye testpapirer ifolg.e oppfinnelsen av ionebyttepapirer forskjellig ømfintlighet. For den nbyaktige påvisning av forhbyet Glucosuria hos diabetikere anvendes papirer av middels ømfintlighet, som forst reagerer over 20 - 30 mg % glucose. Betegnelsen "mg %" som benyttet i den foreliggende beskrivelse skal bety "mg pr. 100 ml" av vedkommende opplbsning. For påvisning av urinveiinfeksjon trenger man derimot resepter som forer til hoybmfintlige og hoyst bmfintlige papirer og som tillater påvisning av fysiologiske glucosemengder på 2 - 20 mg %. Det må betraktes som særlig overraskende at testpapirene ifolge oppfinnelsen er i stand til å fjerne forstyrrelsene av reduserende stoffer som urinsyre og ascorbinsyre, selv om ione-utbytteren ikke som ved papirene ifolge norsk patent nr. 115.686 foreligger i den basiske form, men ved anvendelse av pufferblandinger (fortrinnsvis i pH-område h -7,5) delvis eller helt foreligger i saltform. Det kunne ikke forutsees at en ioneutbytter i dette pH-område overhode ville muliggjbre fraskillelsen av forstyrrelses-stoffene, og at renselsestrinnet og påvisningsreaksjonen under slike betingelser dessuten kunne kombineres med hverandre.

Den ifolge oppfinnelsen mulige kombinasjon av renselses-

og påvisningsoperasjonen i en oppsugningsdyktig bærer er særiig fordelaktig og tillater en ytterst sparsom anvendelse av tildels dyre reagenser. Det er f.eks. således mulig å skjære et med glucoseoxydase-peroxydase og en farvestoffdanner impregnert, oppsugningsdyktig papirstrimmel med ioneutbytténde egenskaper, i 5 mm brede strimler, forsegle dem ifolge norsk patent nr.111.602 mellom to plastfolier og skjære dette i hendige 5 mm bréde teststrimler, slik at hver strimmel bare inneholder eri 5 x 5 mm stor påvisningssone. Disse soner behover ikke å være sveiset til foliene, men det er- tilstrekkelig når de er lost omhyllet. Det har ved denne utfbrelsesform vist seg særlig fordelaktig ytterligere svakt å hydrofobere overflaten av réagensstrimmelen. Som hydro-foberingsrniddel kan f. eks, paraffin eller siliconolje i et-lett flyktig organisk opplosningsmiddel anvendes. Denne utførelse av det diagnostiske middel ifolge oppfinnelsen er særlig rimelig, og sikker og kan lett anvendes av enhver. Denne test kan enten i middels omfintlig form anvendes til påvisning av Diabetes mellitus

eller i den hoyst omfintlige form til påvisning av urinveiinfek-sjoner. Til utforelse av testen er det tilstrekkelig med en kort-varig neddypning i urinen eller en fuktning i urinstrålen.

Det diagnostiske middel til forstyrrelsesfri påvisning av sukkere i legemsvæsker, fortrinnsvis i urin, bestående av en oppsugningsdyktig bærer, som er impregnert med glucoseoxydase, respektive galactoseoxydase, peroxydase og en farvestoffdanner, er kjennetegnet ved at hele den oppsugningsdyktige bærer har ioneutbyttende egenskaper.

Som oppsugningsdyktig bærer med ioneutbyttende egenskaper kan der fremfor alt anvendes i handelen værende papirer som dessuten inneholder finpulveriserte utbytteharpikser med kvartære ammoniumgrupper eller primære, respektive sekundære aminogrupper i teksturen, f.eks. "Amberlite IRA hOO" i kloridformen (kvalitet SB 2), eller ioneutbyttepapirer som er fremstilt av modifisert cellulose, f.eks. Whatman Papir "Chromedia ET 81" eller anion-utbyttepapirene "MN 827 SB 35", "MN 520 SB","MN hhO SB" og "MN 818 SB 35" fra firmaet Macherey, Nagel & Co, Dtiren. Andre oppsugningsdyktige bærere med ioneutbyttende egenskaper er veker, små staver eller strimler. Fortrinnsvis blir den oppsugningsdyktige bærer forseglet på plaststrimler eller mellom plastfolier. Det er selv-følgelig også mulig å kombinere teststrimlene ifolge oppfinnelsen med andre teststrimler (f.eks. for eggehvite- og pH-bestemmelse) eller teststrimler med andre omfintlighetsområder. Som farvestoffdanner kommer alle vanlige forbindelser som o-tolidin, benzidin, o-dianisidin, osv. på tale, såvel som forbindelser av den generelle formel:

<:> j I hvor R-^ er en hydroxy- eller aminogruppe, som eventuelt bærer en j alifatisk, aralifatisk, cycloalifatisk, heterocyclisk eller aromatisk rest som er substituert en eller flere ganger med hydroxy-,, amino- og alkoxygrupper, ' R0, R^ og R^ er hydrogen eller en amino-, hydroxy- eller alkoxy- j ; gruppe, og j < R^ er hydrogen eller gruppen R-^; eller en forbindelse av den j fenerelle formel: I hvor rt-j^ er en aminogruppe, en eventuelt 1- eller flersubstituert •alifatisk, aralifatisk, aromatisk, respektive ueterocyclisk rruppe, eller gruppen

hvor Rp er hydrogen, eller en en- eller flersubstituert alifatisk, aromatisk eller heterocyclisk rruppe,

R. er hydrogen, en alkyl- eller eventuelt en- eller flersubstituert 1'enylgruppe,

ih cr en amino-, hydroxy- eller alkoxy^ruppe,

dr; og d^ er hydrogen, amino, hydroxy-, alkoxy- eller alkylgruppe,

a er oxygen, svovel eller er. eventuell K^-substitnert iminogruppe, n er 0 eller 1,

idet X sammen med R-p respektive R-^ sammen med R^, respektive R-^ sammen med R^ kan danne en eventuelt substituert ring; eller en forbindelse av den generelle formel:

hvor

R-^ er en lavere alkylgruppe,

R2 er hydrogen, en sulfonsyregruppe eller en alkalisulfonatgruppe, R^ er hydrogen eller en lavere alkylgruppe,

X er et svovelatom, en vinylen- eller en irainogruppe, som eventuelt er substituert med lavere alkylgrupper eller arylgrupper,

Y er et nitrogenatom eller en rnethingruppe, som også sammen med R, danner en benzenring substituert med R2.

I de efterfblgende eksempler (ei de diagnostiske midler ifolge oppfinnelsen beskrevet nærmere.

Eksempel 1

"Amberlite"-papir S3 2 fra firmaet Serva, ble impregnert efter hverandre med folgende reagensopplosninger:

Dyppes et slikt testpapir i normalurin får man ingen farvereaksjon. Dypper man det delvis i en urin som inneholder 50 mg % glucose og samtidig JO mg % ascorbinsyre, så viser en tydelig gronnfarvning i den ikke-neddyppede del av testpapiret nærvær av glucose. Med vanlige glucosetestpapir av handelskvalitet får man ingen farvereaksjon.

Eksempel 2

Et testpapir fremstilt ifolge eksempel 1, ble efterimpreg-vnert med en O,25 %-ig opplosning av paraffin i petrolether, opp-skåret og forseglet mellom to folier ifolge norsk patent nr. 111.602 på en slik måte at papiret var lost omhyllet av folien.

Dykkes en slik teststrimmel i normalurin får man ingen i farvereaksjon. Dypper man den i en urin som inneholder 50 mg glucose og samtidig 50 mg % ascorbinsyre, viser en tydelig gronn-|

i farvning nærværet av glucose. Med vanlige glucoseteststrimler av \ handelskvalitet får man ingen farvereaksjon.

Eksempel 3

Anionutbyttepapir"MN 827 SB 35"fra firmaet Macherey, Nagel åt Co. ble impregnert efter hverandre med folgende reagensopplosninger:

Dypper man et slikt testpapir i normalurin med et glucose-innhold på 2 - 20 mg %, får man i lopet av et minutt en tydelig gronnfarvning.

Eksempel 4

Et testpapir, fremstilt ifolge eksempel 3, ble efterimpreg-nert med en 0,25 %-ig opplosning av paraffin i petrolether, opp-skåret og forseglet mellom to folier ifolge, norsk patent nr. 111.602, på en slik måte at papiret var lost omhyllet av folien.

Dyppes et slikt papir i normalurin med et glucose-innhold på 2 - 20 mg %, får man i lopet av et minutt en tydelig gronnfarvning.

Claims (1)

1. Diagnostisk middel for forstyrrelsesfri påvisning av sukkere i legemsvæsker, fortrinnsvis i urin, bestående av en sugedyktig bærer, som er impregnert med glucoseoxydase-, respektive galactoseoxydase, peroxydase og en farvestoffdanner, karakterisert ved at hele den oppsugningsdyktige bærer har ioneutbyttende egenskaper.